JPH09503652A - Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産 - Google Patents

Ｈｍｇ２プロモーター発現系ならびに植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産

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JPH09503652A JP7506056A JP50605695A JPH09503652A JP H09503652 A JPH09503652 A JP H09503652A JP 7506056 A JP7506056 A JP 7506056A JP 50605695 A JP50605695 A JP 50605695A JP H09503652 A JPH09503652 A JP H09503652A
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エル． ウェイッセンボーン，デボラ
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Abstract

(57)【要約】 植物HMG2 HMGR遺伝子のプロモーター要素について記述する。HMG2プロモーター要素は病原体感染、害虫侵入、損傷、またはエリシターもしくは化学薬品処理に対して応答する。また、HMG2要素は花粉や成熟した果実を含めた植物の特殊な組織において活性を示す。HMG2プロモーター要素およびHMG2由来のプロモーターを用いて疾病および害虫耐性遺伝子の発現を誘導することができ、その結果、こうした遺伝子構築物を保有するトランスジェニック植物は標的疾病および害虫に対して耐性となろう。特に、HMG2遺伝子発現系は線虫耐性植物の開発に利用しうる。HMG2プロモーター要素およびHMG2由来のプロモーターはまた、植物において目的の遺伝子産物の収穫後発現を引き出すためにも有利に用いられ、その際、目的の遺伝子産物の発現は、植物を収穫する直前、途中または直後に全植物組織の機械的損傷および／またはエリシター処理によりその発現を誘導するまで延長される。さらに、HMG2プロモーター要素およびHMG2由来のプロモーターは、植物細胞培養物において目的の遺伝子産物の発現を引き出すためにも有利に用いられ、その場合、目的の遺伝子産物の発現は、機械的損傷またはエリシター処理によりその発現を誘導するまで延長される。

Description

【発明の詳細な説明】 HMG2プロモーター発現系ならびに 植物および植物細胞培養物における遺伝子産物の収穫後生産 本出願は、参照として全体をここに組み入れている、1993年8月2日に出願され た、同時係属中の米国特許出願第08/100,816号の一部継続出願である。 １．序論 本発明は部分的に、HMG2プロモーター、その活性な断片、および異種遺伝子の 発現を引き出すためのそれらの使用に関する。異種遺伝子をコードするＤＮＡ配 列をHMG2プロモーターまたはHMG2 cis-調節要素で修飾したプロモーターに連結 することにより発現ベクターを構築することができる。そのような構築物は、植 物細胞発現系におけるエリシター(elicitor)または化学的誘導に応答しての、あ るいは植物における損傷、病原体の感染、害虫の侵入、およびエリシターまたは 化学的誘導に応答しての、タンパク質およびＲＮＡの発現に使用できる。 本発明はまた、収穫された植物組織および培養物における遺伝子産物の生産方 法に関する。「収穫後」生産方法は、所望のタンパク質およびＲＮＡ産物をコー ドする配列に機能しうる形で結合させた誘導可能なプロモーターを含む発現構築 物を用いて遺伝子工学的に作製したトランスジェニック植物または植物細胞由来 の組織または培養物をそれぞれ使用する。適切な誘導物および／または誘導条件 を用いた、収穫した組織または培養物の処理は、所 望の遺伝子産物の高レベルの発現を起こす。収穫後生産方法は、不安定で、揮発 性で、または毒性の、または植物の生長あるいは発生にとって有害な遺伝子産物 またはその代謝物を生産するのに有利に使用しうる。 本発明のこの側面は、興味のあるコード配列に機能しうる形で結合させた誘導 可能なプロモーターからなる発現構築物を用いて遺伝子工学的に作られるトラン スジェニック植物の作製を記述する実施例であって、かつ、そのようなトランス ジェニック植物由来の収穫後数日または数週間たった組織が、興味のある遺伝子 産物を高レベルで誘導生産する能力を持ちつづけることを示す実施例によって、 明示される。 ２．発明の背景 真菌、細菌、ウイルス、および線虫病原体によって引き起こされる植物の病気 は、米国および全世界において重大な損害および作物損失を引き起こしている。 病害防除への現在のアプローチは、病害耐性を付与するための品種改良、化学農 薬の散布、および輪作等の病害管理プラクティスを含む。植物バイオテクノロジ ーにおける最近の進歩は、植物害虫および病原体に対する耐性を強化するために 遺伝子工学的に作製されたトランスジェニック植物の開発をもたらした。これら の成功は、バイオテクノロジーは将来生産農業に重大な衝撃を与え、遺伝子的耐 性を示す改良された作物をもたらしうることを示す。増強された病害耐性という この作用機構は、農薬の使用を減少させることによって生産コストを低下させ、 また環境に建設的に働きかけるという可能性を有する 。 植物バイオテクノロジーの最近の進歩はまた、新しい機能および特性の発現の ために遺伝子工学的に作製されたトランスジェニック植物の開発をもたらした。 そのような遺伝子工学的作製は、新規な合成能力を有するトランスジェニック植 物を作り出した。これらの成功は、バイオテクノロジーが化学物質、医薬品、ポ リマー、酵素等の生産体としての植物の役割を強化しうることを示している。新 規な合成能の遺伝子工学的作製は作物の価値を高めるとともにタバコ等の作物の 新しい用途を作りだす可能性を有する。 ２．１．植物の防御応答 高等植物は病原体、捕食動物および環境ストレスに対する防御のための種々の 構造的および化学的武器を進化させてきた。病原体および害虫に対する耐性の発 現は、特異的防御関連化合物の蓄積をもたらす遺伝子の迅速な誘導を含む(Dixon ら，1990，Adv．Genet．28:165-234)。これらの応答は、ファイトアレキシン抗 生物質の蓄積、リグニン様物質の沈着、ヒドロキシプロリンの豊富な糖タンパク 質の蓄積、およびキチナーゼ、グルカナーゼ等の加水分解酵素の増加を含む。 ファイトアレキシンは病原体による攻撃の結果蓄積する低分子量化合物である 。ファイトアレキシンは抗菌活性を有し、またいくつかの植物対病原体相互作用 における病害耐性において決定的に重要であることが立証された(Darvillら，19 84，Annu．Rev．Plant Physiol．35:243; Dixonら，1990，Adv．Genet．28:165- 2 34; およびKucおよびRush，1895，Arch．Biochem．Biophys．236:455-472)。テ ルペノイドファイトアレキシンは、植物防御化合物の主要なクラスの１つであり 、針葉樹、単子葉殖物および双子葉植物を含む広範な植物種にわたって存在する 。テルペノイドファイトアレキシン生合成の調節がナス科植物（例えば、トマト 、タバコ、ジャガイモ）において最も広範に研究されてきたが、非常に重要な作 物種はみな病害耐性においてこの経路を使用する。 よく特徴付けられた植物対微生物相互作用において、病原体への耐性は防御応 答が活性化される速度に依存する(DixonおよびHarrison，1990，Adv．Genet．28 :165-234)。両立しない相互作用において、病原体は過敏抵抗(HR)と呼ばれる、 侵入部位に限定された、非常に迅速な応答の引き金を引く。感受性宿主において は、重大な損傷が宿主組織に加えられるまで防御応答の誘導は全く見られない。 ファイトアレキシン蓄積を含む防御応答は、「エリシター」と呼ばれる化合物 （例えば植物病原体の細胞壁に由来する成分）によっても植物細胞培養物中に誘 導されうる（Cramerら，1985，EMBO J．4:285-289; Cramerら，1985，Science 2 27:1240-1243; Dronら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:6738-6742) 。タバコ細胞培養物において、真菌性エリシターはセスキテルペンファイトアレ キシン生合成酵素の整合的な増加、およびそれに伴う、イソプレン中間体をステ ロール生合成に向かわせるスクアレンシンセターゼの減少を引き起こす(Chappel lおよびNable，1987，Plant Physiol．85:469-473; Chappellら，1991，Plant P hysiol．97:693-698; ThrelfallおよびWhitehead，1988，Phytoch em．27:2567-2580)。 ２．２．植物におけるHMGRの生理的役割 ファイトアレキシン生合成に関与する、そしてそれゆえ病害および害虫に対す る植物防御に関与する重要な酵素は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAレダ クターゼ(HMGR; EC 1.1.134)である。HMGRは3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルC oAのメバロン酸への変換を触媒する。メバロン酸は、ファイトアレキシン等の防 御化合物を含む広範なイソプレノイドの生合成における中間体である。 ファイトアレキシン生合成に加え、メバロン酸／イソプレノイド経路は生物的 に重要な他の化合物の多様な一群を生産する（図１参照）。これらは、生長調節 物質、色素、防御化合物、UV-防御物質、植物毒素、およびタキソール、ゴム等 の特殊化されたテルペノイド、および昆虫誘引、芳香、風味、摂食阻害物質、お よび遠隔作用に関連する化合物を含む。これらの化合物の多くは、膜生合成、電 子伝達、タンパク質プレニル化、ステロイドホルモン合成、細胞間シグナル伝達 、光合成および再生、等の細胞および生物的機能において決定的な役割を有する 。 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAのメバロン酸への変換は、イソプレノイ ド生合成の律速段階のように思われる。したがって、HMGR発現の調節は、防御応 答を含む多様な植物過程の主要な制御ポイントの役割を果たす。植物のHMGRレベ ルは、光、植物生長調節物質、損傷、病原体の攻撃および外因性ステロールを含 む種々の外部刺激に応答して変化し(BrookerおよびRussell，1979 ，Arch．Biochem．Biophys．198:323-334; RussellおよびDavidson，1982，Bioc hem．Biophys．Res．Comm．104:1537-1543; Wongら，1982，Arch．Biochem．Bio phys．216:631-638およびYangら，1989，Mol．Plant-Microb．Interact．2:195- 201)、そして組織間および植物生長における発達段階により劇的に変動する(Bac hら，1991，Lipids 26:637-648およびNaritaおよびGruissem，1991，J．Cell．B iochem．15A:102(Abst))。この複雑さを反映して、植物には示差的に調節され、 かつ別個のオルガネラ位置に向けて標的設定されうる多数のHMGRアイソザイムが 存在する。ミクロソームに位置するほかに、植物HMGRアイソザイムはミトコンド リアおよび葉緑体膜に存在することが分かっている(BrookerおよびRussell，197 9，Arch．Biochem．Biophys．167:730-737; およびWongら，1982，Arch．Bioche m．Biophys．216:631-638)。 ２．３．植物HMGR遺伝子 いくつかの植物種についてHMGRのゲノムまたはｃＤＮＡ配列が報告されている 。それらは、トマト(NaritaおよびGruissem，1989，Plant Cell 1:181-190; Par k，1990，Lycopersicon esculentum Mill．Ph.D．学位論文，Virginia Polytech nic Institute and State University，Blacksburg，VA)、ジャガイモ(Choiら， 1992，Plant Cell 4:1333-1344およびStermerら，1991，Physiol．Mol．Plant P athol．39:135-145)、カブ(Bachら，1991，American Oil Chemists Society，Ch ampaign，IL pp．29-49)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)(C aellesら，1989， Plant Mol．Biol．13:627-638; LearnedおよびFink，1989，Proc．Natl．Acad． Sci．U.S.A．86:2779-2783)、ニコチアナ・シルベストリス(Nicotiana sylvestr is)(Genschikら，1992，PlantMol．Biol．20:337-341)、カサランタス・ロゼウ ス(Catharanthus roseus)(Maldonado-Mendozaら，1992，Plant Physiol．100:16 13-1614)、パラゴムノキ(Chyeら，1991，Plant Mol．Biol．16:567-577)および コムギ(Aoyagiら，1993，Plant Physiol．102:622-638)を含む。イネ(Nelsonら ，1991，Abstract 1322，3rd Intl．Cong．Intl．Soc．Plant Mol．biol.，Tucs on，AZ)およびトマト(Naritaら，1991，J．Cell．Biochem 15A:102(Abst))由来 のさらなるHMGR遺伝子のクローニングが報告されたが、これらのHMGR遺伝子につ いてのＤＮＡ配列情報は全く公表されていない。これまでに研究されたすべての 植物において、HMGRは２つ（アラビドプシス）またはそれ以上のメンバー（トマ ト、ジャガイモ、パラゴムノキ）からなる小さい遺伝子ファミリーによってコー ドされている。植物HMGR遺伝子に関する公表された情報の要約については、表１ を参照されたい。 ２．４．トマトHMGR遺伝子 トマトHMGR遺伝子は、酵母HMG1 ｃＤＮＡ配列を用いてトマトゲノムライブラ リーより直接釣り上げることにより単離された(Cramerら，1989，J．Cell．Bioc hem．13D:M408; Park，1990，Lycopersicon esculentum Mill．Ph.D．学位論文 ，Virginia Polytechnic Institution and State University，Blacksburg，VA) 。トマトHMG2と称するこれらの遺伝子の１つは、さらに特徴付けられ、コード領 域の配列が報告された(Parkら，1992，Plant Mol．Biol．20:327-331; GenBank M63642)。トマトHMG2の核酸配列は他の植物HMGRの核酸配列と比較された。HMGR タンパク質をコードする領域内における配列比較は、69から96%の同一性を示す 。最も密接に関連している配列は、ジャガイモHMG2の部分ｃＤＮＡ配列（Ｃ末端 コード領域の744塩基について96%の配列同一性）およびニコチアナ・シルベスト リス由来のHMGRｃＤＮＡ（89%配列同一性；全コード領域）である。トマトHMG2 遺伝子は、Ｎ末端をコードする領域内において78%の配列同一性を示して、トマ トHMG1と異なっている（1067塩基を比較；図２参照）。コード領域の外の配列（ 例えば、５’非翻訳リーダー配列）の比較は、互いに異なる種の間で配列保存が 殆ど無いこと、およびナス科のHMGR遺伝子間の限定された相同性を明らかにして いる。トマトHMG2は、81塩基の長さにわたって、N.シルベストリスリーダー配列 との間に75%未満の配列同一性を示す。図２は、トマトHMG1とHMG2の5'リーダー 配列の比較を含む。 トマトHMG2遺伝子のコード領域は３個のイントロンによって中断され、64,714 という計算上の分子質量を有するタンパク質をコ ードする(Parkら，1992，Plant Mol．Biol．20:327-331)。表２はトマトHMG2の 得られたアミノ酸配列と、他の生物のHMGRとの比較を示す。トマトHMG2 HMGRの Ｎ末端膜ドメインは、酵母または動物の膜貫通ドメインより有意に小さく、配列 類似性を全く示さず、そして、非植物HMGRにおいて仮定される7〜8個に較べて、 1〜2個の潜在的な膜にまたがる領域(membrane spanning regions)を含有する(Ba ssonら，1988，Mol．Cell．Biol．8:3797-3808; Liscumら，1985，J．Biol．Che m．260:522-530)。この膜貫通ドメインもまた、実際の膜にまたがる残基は全く 保存されているが、植物種の間で、また同一種内のHMGR同質遺伝子(isogene)間 で高度に多様化している。トマトHMG2 HMGRと他の植物HMGRのＮ末端200残基のア ミノ酸配列比較は、44〜85%の配列同一性を示す（表２参照）。トマトHMG1とHMG 2は、この領域において75%の同一性を示すのみである。Ｃ末端の400アミノ酸内 に位置するトマトHMG2の触媒ドメインは、酵母(56%同一性；75%類似性)およびヒ ト(55%同一性；75%類似性)HMGRと有意な配列相同性を示す。このドメインは植物 種の間で高度に保存されている：トマトHMG2 HMGR（残基200〜602）と他の植物H MGRの比較は、74〜90%のアミノ酸同一性を示す（表２参照）。 植物HMGRコード配列に関して得られる情報とは対照的に、植物HMGRプロモータ ーの構造については比較的わずかしか知られていない。実際、今日までだだ１つ の植物HMGRプロモーター配列が報告されているのみである(Chyeら，1991，Plant Mol．Biol．16:567-577)。 上段：膜ドメイン（1〜200アミノ酸）; 下段: 触媒ドメイン(201〜600アミノ酸 ）。植物種およびhmgr同質遺伝子（名前がある場合は）を示す：L．エスクレン タム(esculentum)[トマトhmg1（不完全な配列）およびhmg2: Tom1，Tom2]，S． ツベロサム(tuberosum)[ジャガイモ: Pot1，Pot3(不完全な配列)]，N.シルベス トリス(sylvestris),(Nic,同質遺伝子は知られていない)，A．タリアナ(thalian a)hgm1(Aral)，H．ブラシリエンシス(brasiliensis)(ゴムノキ: Hev1，Hev3)，C ．ロゼウス(roseus)(Car，同質遺伝子は知られていない),およびR．サティブス( sativus)(カブ: Rad1，Rad2)。比較はGenBankより入手可能な配列に基づく 。 Euphorb:トウダイグサ科(Euphoriaceae)、Apo:キョウチクトウ科(Apocynaceae) ２．５．異なるHMGR遺伝子の機能および発現パターン 特定の植物HMGRの同質遺伝子は、発生の間および病原体の感染または害虫の侵 入に応答して、非常に異なる調節パターンを示す(Caellesら，1989，Plant Mol ．Biol．13:627-638; Choiら，1992，Plant Cell 4:1333-1344; Chyeら，1992， Plant Mol．Biol．19:473-484; NaritaおよびGruissem，1989，Plant Cell 1:18 1-190; Parkら，1992，Plant Mol．Biol．20:327-331; Park，1990，Lycopersic on esculentum Mill．Ph.D.学位論文，Virginia Polytechnic Institute and St ate University，Blacksburg，VA; Yangら，1991，Plant Cell 3:397-405)。 ナス科においては、ファイトアレキシン抗生物質の病原体誘導合成は、ミクロ ソーム結合HMGRの誘導によるものである(ShihおよびKuc，1973，Phytopathology 63:826-829およびStermerおよびBostock，1987，Plant Physiol．84:404-408) 。培養された細胞において、誘導は病原体微生物の細胞壁から単離したエリシタ ーの添加によって起こる(Chappellら，1991，Plant Physiol．97:693-698および StermerおよびBostock，1987，Plant Physiol．84:404-408)。典型的には、エリ シターによる処理は、植物における転写的に制御された防御遺伝子の代表である HMGRのｍＲＮＡレベルの顕著な、一過性の増大をもたらす(Cramerら，1985，EMB O J．4:285-289; DixonおよびHarrison，1990，Adv．Genet．28 :165-234; Yangら，1991，Plant Cell 3:397-405)。 病原体に誘導された急速なHMGR発現は、HMG2 HMGR同質遺伝子によってコード されているように思われる。このことは、エリシターで処理したトマト細胞(Par k，1990，Lycopersicon esculentum Mill．Ph.D.学位論文，Virginia Polytechn ic Institute and State University，Blacksburg，VA)および軟腐病細菌エルウ ィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)に感染させたジャガイモ塊茎（Yang ら，1991，Plant Cell 3:397-405）において証明された。ジャガイモ塊茎におい て、HMG2 ｍＲＮＡレベルは細菌接種後14時間以内に20倍に増加したが、病原体 の不在下で傷をつけた場合には誘導されなかった（Yangら，1991，Plant Cell 3 :397-405）。 HMG2発現は、病害耐性にとって決定的に重要であることが示された。エリシタ ーの１つであるアラキドン酸は、HMG2 ｍＲＮＡの増加を含む防御応答を誘導し 、したがってジャガイモ塊茎におけるファイトアレキシン合成を誘導する（Ster merおよびBostock，1987，Plant Physiol．84:404-408およびYangら，1991，Pla nt Cell 3:397-405）。エルウィニア・カロトボーラ接種の48時間前にアラキド ン酸で処理した塊茎は、腐敗に対して完全に耐性であった。メビノリン（HMGR特 異的競合阻害剤）によってHMGR活性を阻害された塊茎は、有意に増大した腐敗を 示した(Yangら，1991，Plant Cell 3:397-405)。 類似体発現パターンに基づくトマトHMG2 HMGR同質遺伝子の相同体が、別の植 物に存在する。例えば、ジャガイモHMG2およびHMG3 ｍＲＮＡもまた、損傷、エ リシターおよび細菌性病原体に応 答して誘導される(Choiら，1992，Plant Cell 4:1333-1344およびYangら，1991 ，Plant Cell 3:397-405)。ニコチアナ・シルベストリスより単離されるHMGR同 質遺伝子は、ウイルス接種および防御エリシターによって誘導される(Genschik ら，1992，Plant Mol．Biol．20:337-341)。同様に、イネのHMGR同質遺伝子もま た損傷およびエリシターによって誘導され(Nelsonら，1991，Abst 1322，3rd In t．Cong．Intl．Soc．Plant Mol．Biol.，Tucson，AZ)、防御特異的HMG2相同体 が単子葉植物にも存在することを示唆している。しかし、コムギから単離した３ つのHMGR ｃＤＮＡは明らかに傷によって誘導可能ではない(Aoyagiら，1993，Pl ant Physiol．102:623-628)。ＤＮＡ配列は単離されていないが、細菌性または 真菌性病原体に応答してのHMGR酵素活性の増大が多数の他の植物種について記述 されており、HMG2同質遺伝子が植物のあいだに広く存在することを示唆している 。 トマトHMG2は核酸レベルにおいてトマトHMG1同質遺伝子とは全く別である（図 ２参照）。HMG1 HMGR同質遺伝子は、HMG2遺伝子の発現を誘導する状況とは異な る状況下で発現されるように思われる。NaritaおよびGruissemは、トマトHMG1が 、分析した全てのトマト組織において低レベルで発現され、また急速生長期の未 成熟果実において高度に発現されることを示した(NaritaおよびGruissem，1989 ，Plant Cell 1:181-190; Naritaら，1991，J．Cell．Biochem 15A:102(Abst)) 。したがって、トマトHMG1はステロール合成および膜の生合成において機能して いるのかもしれない。Choiらは、傷をつけることによってジャガイモ塊茎にジャ ガイモHMG1発現が誘導されるが、この発現は防御エリシターまたは細 菌性病原体によって抑制されることを示した(Plant Cell 4:1333-1344)。これら のデータは、HMG1によってコードされるHMGRがステロール生産に関与する生合成 分岐に関連していることを示唆している。配列または発現パターンの類似性（例 えば、構成的低レベル発現、エイリシターまたは微生物による抑制、急速細胞分 裂期における高い発現）に基づいて、パラゴムノキHMG3、ジャガイモHMG1、アラ ビドプシスHMG1、およびカブHMG2は、おそらくこのHMG1 HMGR同質遺伝子クラス に属する。 ２．６．植物HMGRプロモーター 植物HMGR遺伝子のプロモーターについては殆ど知られていない。今日まで、植 物HMGRプロモーターの構造を分析（例えば、欠失分析、DNaseIフットプリント分 析、ＤＮＡ-タンパク質結合／ゲル遅滞分析、等）した研究の公表された文献は 知られていない。１つの論文(Chyeら，1991，Plant Mol．Biol．16:567-577)が 約1.5kbのパラゴムノキHMG1遺伝子の上流配列を記述している。この配列は、こ こに開示するトマトHMG2プロモーターの類似領域に対し、有意な相同性を全く示 さない。別の報告書が、トランスジェニックタバコにおけるジャガイモHMGR13（ おそらくHMG1の相同体）プロモーター：β-グルクロニダーゼ(GUS)融合体の発現 を大雑把に記述したが(Stermerら，1992，Phytopathology 82:1085)、使用した プロモーターについても、融合体の構築についても、詳細は明らかにしていない 。 ２．７．植物における所望の遺伝子産物の生産 所望の遺伝子産物を生産するためにトランスジェニック植物を使用するという 概念は、決して新しいものではない。実際、今日までトランスジェニック植物の 遺伝子工学的作出を報告する全ての例は、「構成的」プロモーター、特にカリフ ラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターまたはそれを強化したものを利 用して、トランスジェニック産物の生産を引き出してきた。以下に記述するのは 、CaMV 35Sプロモーターまたはその誘導体を使用して植物において生産された多 数の哺乳動物治療用タンパク質の代表的なリストである。マウス免疫グロブリン 鎖の発現は、タバコの葉片を、マウスハイブリドーマ細胞系由来のγまたはκ鎖 ｃＤＮＡを用いて形質転換することにより達成された(Hiattら，1989，Nature 3 42:76-78; Heinら，1991，Biotechnol．Prog．7:455-461)。γまたはκ鎖を発現 する形質転換植物を遺伝子的に交配し、組み立てられた、機能性抗体（「プラン ティボディー(plantibody)」と呼ばれる）の生産をもたらした。ヒト血清アルブ ミン(Sijmonsら，1990，Bio/Technology 8:217-221)、ウサギ肝シトクロム P450 (Saitoら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:7041-7045)、ハムスター3 -ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAレダクターゼ(Chappellら，1991，Plant Ph ysiol．96:127)およびＢ型肝炎表面抗原(Masonら，1992，Proc．Natl．Acad．Sc i．U.S.A．89:11745-11749)を生産するトランスジェニックタバコもまた報告さ れている。植物プレプロシグナル(prepro-signal)を有する融合タンパク質とし て生産されるHSAは、本物の成熟ヒトタンパク質と区別できない分泌HSAタンパク 質をもたらした(Sijmonsら，1990，Bio/Technology 8:217-221)。Ｂ型肝炎抗原 を発現 する植物は、ヒト血清由来のHBsAg粒子および酵母（現在のヒトワクチンの供給 源）において生産されるHBsAg粒子に類似の物理的特性および抗原特性を有する 球状のHBsAg粒子を蓄積した。植物ウイルスによって媒介されるヒトタンパク質 （ヒトインターフェロン、α−およびβ−ヘモグロビン、およびメラニンを含む ）の植物における発現もまた示されている(Fraley，R.，1992，Bio/Technology 10:36-43; de Zoetenら，1989，Virology 172:213-222)。 しかし、所望の遺伝子産物の構成的発現は、所望の遺伝子産物が 1）不安定な とき、2）トランスジェニック植物または培養系の生長または発生にとって有害 なとき、3）トランスジェニック植物を偶然食べるヒト、家畜、動物、または昆 虫にとって毒性であるとき、4）現実に、または可能性として環境に対して害に なるとき、または 5）遺伝子産物の極めて高い価値のために保護について危険が あるとき、には不利である。さらに、CaMV 35S等の構成的プロモーターは植物が 成熟するにつれ、活性が衰える。このような活性喪失は、生産系としての宿主植 物の非効率的な利用に帰着する。なぜなら成熟した、または成熟しつつある植物 は、生合成能力の多くを通常の生長および発生機能に用いるようにプログラムさ れているより若い植物に較べ、より大きいバイオマスを有し、またしばしば「外 来の」所望の遺伝子産物の生産のためのより大きい過剰生合成能力を有するから である。 上記の通常のアプローチに較べ、本発明の収穫後生産法は、所望の遺伝子産物 を植物において生産するはるかに効率的で生産的な手段でありうる。収穫後生産 法を用いると、所望の遺伝子産物 は植物組織または細胞培養物が収穫され、誘導されるまで、生産されない。これ は、所望の遺伝子産物が植物または培養系の生長期に存在することから生じる任 意の問題を回避する。 ３．発明の概略 本発明の一側面は、傷、病原体の感染、害虫の侵入、およびエリシターまたは 化学的誘導物に反応する植物のプロモーター配列の使用に関する。本発明のこの 側面は、タンパク質およびＲＮＡ産物の植物および植物細胞における発現を制御 するための、3-ヒドロキシメチル-3-グルタリル CoAレダクターゼ（HMGR）遺伝 子のプロモーター配列、特にトマトHMG2(HMGR2)プロモーター要素および他の植 物種由来のその相同体の使用に関する。本発明はさらに、トマトHMG2プロモータ ー要素またはその相同体由来の配列を使用して、植物の活性なプロモーターを修 飾または構築することに関する。そのようなプロモーターは次に植物および植物 細胞におけるタンパク質およびＲＮＡの発現を制御するために使用できる。 トマトHMG2プロモーター要素およびその相同体は、種々の植物細胞発現系、植 物培養物、または安定に形質転換された高等植物種において、異種遺伝子を発現 または過剰発現することを含むが、それだけに限定されない多様な用途を有する 。異種遺伝子産物の発現は、エリシターまたは化学的誘導によって植物細胞発現 系において、あるいは傷、病原体の感染、害虫の侵入およびエリシターまたは化 学的誘導に応答して植物において誘導しうる。 ここに記述する、植物を遺伝子工学的に作出するためのプロモ ーター因子の使用は、特別な価値を有しうる。非制限的な例として、病原体感染 または害虫侵入に対する耐性を付与する遺伝子を制御するHMG2またはHMG2相同体 プロモーター要素またはそこから誘導されたプロモーターを用いて、耕種学的に 重要な植物を安定に形質転換することが可能である。そのような植物が病原体ま たは害虫の侵入をうけると、侵入はHMG2またはHMG2相同体プロモーター因子によ って制御されている耐性遺伝子の発現の引き金を引き、侵入部位において植物を 次第に度を増して耐性にする。 本発明の第２の側面は、収穫した植物組織および植物細胞培養物において遺伝 子産物を生産する方法に関する。この方法は、興味のある遺伝子のコード配列に 機能しうる形で連結された誘導性プロモーターからなる発現構築物を用いて、遺 伝子工学的に作製したトランスジェニック植物の組織または形質転換植物細胞を 使用する。遺伝子工学的に作製した植物または培養系からそれぞれ収穫した組織 または培養物は、適切な誘導物または誘導条件で処理することにより、コードさ れたタンパク質またはＲＮＡを生産するように誘導することができる。 ここに記載する実施例に示されるように、タンパク質またはＲＮＡをコードす る配列に機能しうる形で連結された誘導性プロモーター(HMG2プロモーター等） を含む発現構築物を用いて、植物を遺伝子工学的に作製することができる。作製 した植物から収穫した組織は、適切な誘導物または誘導条件で処理することによ り、コードされたタンパク質またはＲＮＡを発現するように誘導することができ る。収穫後生産法を用いるならば、誘導性プロモーターを用いた発現構築物によ って生産されるコードされた遺伝子 産物の量は、強力な構成的プロモーターを用いた発現構築物によって生産される 量を上回る。さらに、そのような収穫された植物組織は、収穫後２週間まで、発 現構築物にコードされた遺伝子産物の強力な誘導生産能力を維持する。 本発明の収穫後生産法は、植物または植物細胞の生長または発生に有害な、所 望の遺伝子産物を生産するのに有利に使用できる。所望の遺伝子産物をコードす る配列に機能しうる形で連結された誘導性プロモーターからなる発現構築物を用 いて、遺伝子工学的に作製した植物または植物細胞においては、所望の、しかし 植物には有害な遺伝子産物の発現は、植物または培養系が生長する間は休止した ままである。したがって、作製された植物または培養系の生産的で効率的な栽培 または培養を可能とする。作製された植物または培養系が収穫または加工に最適 の条件に達したとき、適切な誘導物または誘導条件を用いた処理により、所望の 遺伝子産物の発現を人工的にスタートさせる。HMG2プロモーターを含む発現構築 物を用いる場合は、上記の処理は機械的傷またはエリシターまたは化学的誘導に よる。次に、短い発現期間を与えた後、誘導遺伝子にコードされたものであるか 、または誘導遺伝子産物によって生産される化合物である所望の産物を誘導され た植物、収穫した植物組織、または培養系から抽出する。 本発明の収穫後生産法は、不安定な遺伝子産物、または不安定な化合物を合成 する遺伝子産物を生産するのに有利に使用できる。所望の遺伝子産物をコードす る配列に機能しうる形で連結された誘導性プロモーターを含む発現構築物を用い て遺伝子工学的に作製した植物または植物細胞においては、不安定な遺伝子産物 ま たは化合物の発現は、上記植物または培養物の収穫にとって、または、所望の産 物または化合物の加工にとって最適な条件が得られるまで延期される。次に、適 切な誘導物または誘導条件を用いた処理により所望の産物の合成を植物または培 養物中に誘導することができる。そして、短い発現期間を与えた後、所望の遺伝 子産物または合成された化合物を誘導した植物または培養物から能率良く抽出す ることができる。 本発明のこの側面は、収穫された植物組織は植物体から切除した後も誘導性遺 伝子を発現する重要な能力を維持している、そしてそのような能力は若干の保存 時間がたつと実際に増大することがある、という驚くべき発見に部分的に基づい ている。 ３．１．定義 本明細書に用いる以下の用語は、下記に指示する意味を持つものである。 35S = 35S転写物のためのカリフラワーモザイクウイルスプロモーター CAT = クロラムフェニコールアセチルトランスェラーゼ ｃＤＮＡ = 相補的ＤＮＡ cis-調節要素 = そのような要素を含有するプロモーターに特異的調節応答を付 与する、TATAボックスの5'上流にあるプロモーター配列。１個のプロモーターは 、それぞれが特定の調節応答に関与する１つ、またはそれ以上のcis-調節要素を 持ちうる。 ＤＮＡ = デオキシリボ核酸 機能性部分 = プロモーターの機能性部分とは、連結させた遺伝子配列の転写を 引き起こしうる任意のプロモーター部分、例えば、両端を切ったプロモーターで ある。 遺伝子融合体 = 異種遺伝子に機能しうる形で連結したプロモーターを含んでな る遺伝子構築物で、該プロモーターが異種遺伝子の転写を制御する、遺伝子構築 物。 遺伝子産物 = 遺伝子配列によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質 GUS = 1,3-β-グルクロニダーゼ 異種遺伝子 = 遺伝子構築物との関連において、異種遺伝子とは自然状態では連 結していないプロモーターに連結した遺伝子を意味する。異種遺伝子は、該プロ モーターを提供した生物に由来しても、由来しなくてもよい。異種遺伝子はメッ センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコード することができる。 HMGR = 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAレダクターゼ HMG2相同体 = 選択的に公知のHMG2プロモーター（例えば、ここに開示するトマ トHMG2プロモーター因子）とハイブリダイズする植物プロモーター配列、または HMG2プロモーターと同一の調節応答を示すHMGR遺伝子のプロモーター（すなわち 、傷、病原体感染、 害虫侵入、またはエリシター処理によりプロモーター活性が誘導される）。 相同的プロモーター = 参照プロモーターの配列と選択的にハイブリダイズする プロモーター ｍＲＮＡ = メッセンジャーＲＮＡ 遺伝子産物の産物 = 遺伝子産物によって生産される産物、例えば二次代謝物。 機能しうる形で連結 = 遺伝子配列の転写がプロモーターによって制御されてい る、プロモーターと遺伝子配列の間の連結。 ＲＮＡ = リボ核酸 ＲＮａｓｅ = リボヌクアーゼ ４．図の説明 図１：植物におけるメバロン酸／イソプレノイド経路。PGR、植物生長調整物 質。 図２：トマトHMG2（配列番号１）とトマトHMG1（配列番号２）の核酸配列の比 較。両配列はSmithおよびWatermanのアルゴリズム(algorithm)によって並べてあ る(Devereuxら，1984，Nucl．Acid Res．12:387-395)。配列の並べ方を最適にす るため、点々で示すギャップを挿入している。転写開始部位を、+1および矢印で 示す。翻訳開始コドンおよびTATAボックスを下線で示す。比較は、各遺伝子の第 １イントロンで終了する。曖昧な塩基は小文字で示す。 図３：トマトHMG2プロモーターの図。 パネルＡ．pTH295というトマトHMG2ゲノムＤＮＡ挿入配列。 パネルＢ．一般的なpDW101を作製するのに使用されたpTH295の2.5kbのEcoRI断片 。pTH295は、細菌プラスミドpSP6/T7（BRL）のマルチクローニング領域のHindII I部位に挿入された最初のλゲノムクローン由来の約7kbのHindIII断片を含有す る。pDW101は、プラスミドBluescript SK-(Stratagene)のEcoRI部位に挿入され た、pTH295の2.5kbのEcoRI断片を含有する。制限エンドヌクレアーゼ: Ac，AccI ; Av，AvaI; Bg．BglII; E，EcoRI; Ev，EcoRV; H，HindIII; K，KpnI; P，PstI ; T，TaqI; X，XbaI．黒く塗った四角は、HMG2タンパク質をコードする４つのエ キソンを表す。pDW101の下の断片は、図４、５および６に記載のHMG2プロモータ ー配列の位置を示す。HMG2配列２の周りのカッコは、この領域内の正確な位置が まだ確定されていないことを示す。 図４：HMG2プロモーター配列Ｉの核酸配列（配列番号３）。この1388 bpの配 列（配列番号３）は、pDW101の2.5kb EcoRI挿入配列の3'末端から始まる。転写( +1)および翻訳(ATG)開始部位を示す。TATAボックス、PCRプライマー位置、およ び該当する制限酵素部位を下線で示す。小文字は曖昧な塩基を示す。 図５：HMG2プロモーター配列IIの核酸配列（配列番号４）。この480 bpの配列 （配列番号４）は、pDW101の2.5 kb EcoRI挿入配列の内部領域から始まる。この 領域は、HMG2翻訳開始部位の上流にある約-1,039から-2,000塩基対にまたがる。 この領域内の上記配列の正確な位置はまだ確定していない。２つのＡＴ繰り返し モチーフを下線で示す。Ｘは不明の塩基を示す。小文字は曖昧な塩基である。 図６：HMG2プロモーター配列IIIの核酸配列（配列番号５）。この415 bpの配 列（配列番号５）は、pDW101の2.5 kb EcoRI挿入配列の5'末端から始まる。23塩 基のパリンドローム配列を下線で示す。小文字は曖昧な塩基を示す。 図７：pBI101におけるプロモーター欠失クローンpDW201、pDW202およびpDW203 の図式的表示。白抜きの四角は、トマトHMG2プロモーター由来の挿入断片を示す 。RBおよびLBは、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列である。各HMG2プロモーター領域に隣 接する5'HindIIIおよび3'BamHI部位は、これらの挿入配列をPCR増幅するために 使用したプライマーの配列内に作出された。 図８：プラスミドpSLJ330.1の制限地図。 HMGAは、pDW101由来のEcoRI/BglII HMG2 プロモーター断片；GUSは、β-グルク ロニダーゼコード配列; ocs 3'は、A.ツメファシエンス(A．tumefaciens)オクト ピンシンテターゼ遺伝子由来の3'領域およびポリアデニル化部位; p35Sは、カリ フラワーモザイクウイルス35S転写物; NPTは、カナマイシン耐性を付与するネオ マイシンホスホトランスフェラーゼをコードするNPTII遺伝子; LB、RBは、アグ ロバクテリウムから植物細胞へＤＮＡを移送するのに必要なTiプラスミドの左お よび右ボーダー配列。 図９：プラスミドpSLJ1911の制限地図。このプラスミドは、その活性が種々の HMG2:GUS構築物の基準の役割を果たした35S:GUS構築物を用いて植物を形質転換 するのに使用された。略語は図８に記載の通りである。 図１０：トランスジェニックタバコおよびトマト植物体におけるHMG2プロモー ター発現の組織特異性。青色はGUSが活性な領域 を示す。 パネルＡ．35S:GUS構築物の約および花粉と比較したHMG2:GUS構築物の葯および 花粉（植物体は、それぞれpSLJ330.1またはpSLJ1911を用いて形質転換した）。 パネルＢ．十分膨張させたタバコの葉の毛状体（形質転換ベクターpSLJ330.1） 。 パネルＣ．pSLJ330.1を用いて形質転換したトマト苗の根の部分。苗を寒天培地 で無菌的に栽培した。矢印は側根の開始位置を示す。 図１１：pSLJ330.1を用いて形質転換したタバコにおける防御関連HMG2プロモ ーター発現。 パネルＡ．傷をつけ、水（Wと表示、モック）または軟腐病細菌エルウィニア・ カロトボーラssp.カロトボーラEC14株(ECと表示)を接種して24時間後の葉組織（ 左の２個のウエル）および48時間後の葉組織。 パネルＢ．矢印で示した部位でリゾクトニア(Rhizoctonia)に感染したカラスム ギの種を茎に直接接するように置いて接種後、24および48時間後のタバコ苗（無 菌鉢植えミックスを用いて栽培した発芽後14日の苗）。 パネルＣ．圃場栽培のタバコの葉切片で、自然の昆虫による捕食により、壊死部 位の周辺にGUS活性を示している。輪の外側エッジの青い色素沈着は、傷への応 答によるものである。 図１２：HMG2:GUSトランスジェニックトマト(pSLJ330.1を用いて形質転換した )の線虫への応答。トマト苗にメロイドジン・ハプラ(Meloidogyne hapla)の第２ 期幼虫を接種した。接種後の 指示された時期に、根を収穫し、X-Gluc中で一晩インキュベートしてGUS活性に ついて染色し、次に線虫を可視化するため酸フクシンで対比染色した。 パネルＡ．接種２日後の根先端を潰したもの(squash)。 パネルＢ．接種３日後の根の部分。矢印は最初のGUS活性を示す。 パネルＣ，ＤおよびＥ．特徴的な線虫によって誘導された膨潤を示す、接種７日 後の根先端部。パネルＥにおいて、感染していない根先端部がGUS活性を全く示 さないことに留意されたい。 図１３：トランスジェニックタバコ葉組織(pSLJ330.1またはpSLJ1911を用いて それぞれ形質転換した)における、HMG2プロモーター（線を引いた棒）とCaMV 35 Sプロモーター（白抜きの棒）によって引き出されたGUS遺伝子の収穫後発現の比 較。０日目に葉を植物体から取り除き、切り傷をつけて傷誘導し、指定の時期に 収穫するまで湿条件下で保存した。本明細書に記述するようにGUS活性を測定し た。 図１４：HMG2:GUS発現構築物の収穫後発現。グラフは、新たに収穫した葉およ び収穫して4℃で2週間保存した後の葉から生産されたGUSの量の比較を示す。HMG 2:GUS遺伝子構築物を含有する、成熟した、圃場で栽培した植物の葉を、葉柄で 切り取ることにより収穫した。発生上の類似性を確実にするために、比較は同一 の植物体由来の隣接した対をなす葉の間で行なった。１組の葉（「新鮮な」サン プル）を、収穫のすぐ後で傷を付ける（例えば、剃刀の刃で葉にきつく刻み目を 入れる）ことにより加工した。もう１絹の葉（「２週目」サンプル）は、新たに 収穫した葉について 記述したように傷つける前に、ジッパーを閉めた袋に入れて４℃で２週間保存し た。傷ついた葉におけるGUS活性を傷つけた直後（「非誘導」サンプル）、また は室温で48時間インキュベートした後（「48時間誘導」サンプル）に測定した。 GUS活性は、タンパク質１μｇあたり１分間に放出されるメチルウンベリフェロ ン(MUG)のモル数nMとして表わされる。保存した葉組織由来の誘導GUS活性は、新 たに収穫した葉組織由来のそれと一貫して同じか、またはそれを上回った。形質 転換されていない親品種の同等な、新鮮な葉組織のGUS活性も示す（「UNT」サン プル）。 図１５：HMG2:GUS発現構築物の収穫後発現に及ぼす保存の効果。グラフは、収 穫後２または６週間４℃または室温で保存された葉から生産されたGUSの量の比 較を示す。HMG2:GUS遺伝子構築物を含有する、成熟した、圃場で栽培したトラン スジェニックタバコ植物体の葉を、葉柄で切り取ることにより収穫した。各植物 体由来の隣接する葉を処理群に分けて保存した。すなわち、プラスチックの袋に 入れ４℃で保存する（「４℃」サンプル）群、または室温で黄麻布袋に入れて保 存する（「室温乾燥」サンプル）群である。指定の時間に、保存した葉組織のサ ンプルに傷を付けて加工し、傷つけてから０時間および48時間後のサンプルにお けるGUS活性を測定した。GUS活性は、タンパク質１μｇあたり１分間に放出され るメチルウンベリフェロン(MUG)のモル数nMとして表わされる。保存した葉由来 の誘導GUS活性は、６週間の保存後においてもなお、新たに収穫した葉のそれと 同等、またはそれより高かった。 ５．発明の説明 本発明の一態様は、病原体感染、害虫侵入または機械的損傷に対する植物応答 に関与するHMG2プロモーターおよびその相同体、ならびに異種遺伝子の発現を引 き出すためのその使用に関するものである。 トマトのHMG2プロモーターおよびその相同体は、植物における3-ヒドロキシ-3 -メチルグルタリルCoAレダクターゼ(HMGR)イソ酵素の発現を制御している。HMGR はメバロン酸の生成を触媒しており、メバロン酸は植物の防御反応ならびに植物 の生育において重要な役割を果たしている種々の二次代謝産物の生合成の中間体 である。大部分の植物組織では、トマトHMG2プロモーターとその相同体は、その 活性が病原体感染、害虫侵入または機械的損傷によって誘導されるまで、活動停 止状態にある。HMG2および相同プロモーターの誘導は、幾分かは、植物の構成成 分に由来するいわゆる「エリシター」化合物（Darvill and Albersheim，1984， Annu．Rev．Plant Physiol．35:234）または植物病原体の細胞壁もしくは表面成 分によって媒介される。誘導されると、HMG2プロモーターおよびその相同体は、 それらの制御下にある遺伝子を速やかにかつ強力に発現させる。HMG2および相同 プロモーターの著しい構成的発現の欠如ならびに速誘導性かつ強力な発現特性ゆ えに、それらは様々なタイプの異種遺伝子の発現を制御するための理想的な要素 となりうる。こうした遺伝子として、2,3の名を挙げると、病原体および害虫に 対する耐性機能、植物の発育に直接的または間接的に害を及ぼす産物、不安定な 産物、または不安定な化合物の生合成に関与する産物をコードするものがある。 本発明のこの態様によると、異種遺伝子はトマトHMG2もしくは相同プロモータ ー要素またはそれらから誘導されるプロモーター（全て本明細書中に記載される ）の制御下に置かれ、そして細胞培養物発現系またはトランスジェニック植物の 遺伝子工学的操作に用いられる。異種遺伝子の発現は病原体感染、害虫侵入、機 械的損傷、または化学薬品もしくはエリシターによる処理に応答して誘導される だろう。例えば、植物細胞培養物または植物における異種遺伝子の誘導は、植物 病原体の細胞壁抽出物、かかる抽出物に含まれる純化エリシター、またはこのよ うなエリシターの合成機能類似体で処理することにより行うことができる。また 、植物における異種遺伝子の発現は各種の細菌または真菌植物病原体の感染によ っても誘導しうる。同様に、上記の誘導は昆虫や線虫といった害虫の植物内への 侵入が引き金になることもある。 本発明の第二の態様は、植物組織および細胞培養物における遺伝子産物の生産 方法に関するものである。この方法は、目的の遺伝子産物をコードする配列に機 能しうる状態で連結された誘導プロモーターを含む発現構築物により遺伝子操作 された植物組織または植物細胞培養物を利用する。本発明のこの態様によると、 目的の遺伝子産物は、収穫に続いて適当な誘導物質または誘導条件下での処理に より誘導した後の植物組織および培養物により生産される。 本発明は、HMG2およびHMG2由来のプロモーターを含むファミリーならびに植物 組織および培養物による遺伝子産物の収穫後生産に関するものであるが、説明の ために、本発明を次のようないくつかの段階に分けて記述することにする。すな わち、(a)収穫後 生産のための植物または植物細胞の遺伝子操作に使用しうる誘導プロモーター； (b)このようなプロモーター配列（HMG2の配列を含む）の単離、同定および特性 づけ；(c)他の植物プロモーター配列を調節しうる誘導プロモーター内のシス調 節要素（HMG2プロモーターのものを含む）の同定および特性づけ；(d)誘導プロ モーターまたはその誘導体に機能しうる状態で連結された対象の異種遺伝子を含 む発現ベクター（HMG2または誘導体プロモーターを含む発現ベクターを含む）の 構築；(e)植物または植物細胞への発現ベクターの導入；(f)このような発現構築 物の発現誘導および植物組織または細胞培養系による対象遺伝子産物の生産；な らびに(g)収穫後生産法を用いて、より特定的には、HMG2プロモーター要素およ びHMG2由来のプロモーターの制御下で、有利に生産され得る異種遺伝子産物の種 類；である。 ここに示した本発明の様々な実施態様は単なる例示であって、本発明の限定を 意味するものではない。 5.1. 誘導プロモーター 本発明の収穫後生産法の発現ベクターにおいて使用しうる誘導プロモーターは 、その活性を宿主植物内で誘導することのできるどのようなプロモーターであっ てもよい。有用なプロモーターとしては、その活性を化学薬品、生物学的エリシ ター、高温、低温、塩ストレス、光線、損傷、乾燥、ホルモン、病原体感染また は害虫侵入により誘導されるものがあるが、これらに限らない。表３には、その プロモーターを本発明の方法において使用することのできる誘導可能な植物遺伝 子のいくつかの例をまとめてある。 有用なプロモーターは収穫した植物組織においてその発現を誘導し得る天然ま たは組換え型のプロモーターである。かかる能力をもつプロモーターは当技術分 野で公知の方法を用いて調べることができる。例えば、プロモーターをGUSのご ときアッセイ可能なマーカー遺伝子に機能しうる状態で連結させ、この構築物で 宿主植物を遺伝子操作し、そして収穫した組織のマーカー遺伝子発現を引き出す 該プロモーターの能力および活性を様々な条件下でアッセイする。 有用なプロモーターは組織特異的てありうる。しかし、非組織特異的プロモー ター（すなわち、誘導後あらゆる組織で発現されるもの）も好ましいものである 。さらに非誘導状態では活性が全くないか、ごくわずかしかないプロモーターが より好適である。最も好ましいものは、誘導後に非常に高い活性を有するプロモ ーターである。 特定の実施態様において、誘導プロモーターはHMG2プロモーターとその誘導体 である。HMG2および誘導体プロモーターは、本発明の生産法において有用である ほかに、本発明のHMG2プロモーター発現系においても有用である。本発明のこの 態様も詳しくここに記述される。 5.2. プロモーターの単離および特性づけ 本発明によれば、ここに記述されるプロモーターの機能性部分とは、植物また は細胞培養物の生活環のある時点（組織または培養物を収穫した後を含む）で誘 導物質または誘導条件に応答して、機能的に連結された遺伝子の転写を促進する ことができる核酸配列の領域を指す。HMG2プロモーターの場合、その機能性部分 は植物の全発育パターンの間中、損傷、病原体感染、害虫侵入または化学薬品／ エリシター処理に応答して連結遺伝子の転写を引き出すことができる領域である 。 本明細書中で用いる相同ヌクレオチド配列とは、互いと選択的にハイブリダイ ズすることができる核酸配列を意味する。「選択的にハイブリダイズする」は、 ここでは、ある配列由来の50塩基またはそれ以上の長さのＤＮＡまたはＲＮＡプ ローブがストリン ジェント条件（例えば、0.1xSSC/0.1% SDS中、68℃で少なくとも１時間の洗浄） 下で「相同」配列にハイブリダイズすることを意味する(Ausubelら編集，1989， Current Protocols in Molecular Biology，Vol．I，Greene Publishing Associ ates，Inc．and John Wiley & Sons，Inc.，New York，2.10.3頁)。 ここに記述されるトマトHMG2プロモーターに相同のヌクレオチド配列とは、ハ イブリダイゼーションアッセイでpDW101（NRRL受託番号 ）の約2.2kb のEcoRI-BglII断片に含まれる核酸配列と選択的にハイブリダイズすることがで きる核酸配列、または塩基配列決定によって相同であり（100塩基対の長さを含 み、そのうち少なくとも75％のヌクレオチドがここに示した配列と同一である） かつHMG2の活性と同一であるか非常に似ているプロモーター活性（すなわち、損 傷、エリシター、病原体などによる誘導可能性）を有する核酸配列を指す。この ようなプロモーターは正確な地図を作成することができ、当技術分野で公知の方 法、例えば欠失分析、マーカー遺伝子の発現、ＲＮアーゼ保護、マーカー遺伝子 に機能的に連結された相同プロモーターを含む植物組織から得られたｍＲＮＡ調 製物のプライマー伸長分析など、によりその活性を確かめることができる。 相同ヌクレオチド配列は、多様な植物種の天然プロモーター要素およびここに 記述されるプロモーター要素の遺伝子工学的に操作された誘導体を含むがこれら に限らないヌクレオチド配列のことである。 ここに記述されるHMG2プロモーターを含めた誘導プロモーター配列の合成、単 離、分子クローニング、特性づけおよび操作に用 いられる方法は当業者に公知である。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd．Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spri ng Harbor，New York(1989)に記載される技法を参照されたい。 本発明によると、ここに記述されるHMG2プロモーターを含めた誘導プロモータ ーの配列またはその一部は、適当な植物源から、誘導プロモーター配列または該 プロモーター配列を含む遺伝子配列を保有する細胞系または組換えＤＮＡ構築物 から、そして／またプロモーター配列が既知である場合は化学合成法によって得 ることができる。例えば、当業者に公知の化学合成法を用いて、図４、５および ６（それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５）に示したHMG2配列を合成し うる。合成した配列はプロモーター要素として使用するためにクローニングして 増やすことができる。また、こうした合成配列をハイブリダイゼーションプロー ブとして用いて、適当な植物および細胞源から所望のプロモーター配列を同定し て単離することも可能である。 また、所望のプロモーター要素は遺伝子ライブラリーのスクリーニングによっ て同定し、単離することもできる。例えば、既知の誘導遺伝子（例：HMGR遺伝子 ）または誘導プロモーター配列（例：HMGRプロモーター）に相同の配列を含むク ローンについてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。 標準方法によりゲノムＤＮＡライブラリー中の相同クローンを同定するにあたっ て、例えば、誘導遺伝子をコードするゲノムまたはｃＤＮＡクローン由来の配列 または誘導タンパク質の既知のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプロ ーブがハイブリダ イゼーションプローブとして用いられる。かかる方法として、例えば、バクテリ オファージライブラリーに関してはBenton and Davis(Science 196:180(1977)) に記載された方法、そしてプラスミドライブラリーに関してはGrunstein and Ho gness(Proc．Nat．Acad．Sci．USA 72:3961-3965(1975))に記載された方法があ る。 プローブおよびライブラリーの種起源が、単子葉と双子葉の両方にまたがるよ うに、広く分岐している場合、プローブは誘導タンパク質の高度に保存されたア ミノ酸残基をコードする領域に由来するものであることが好ましく、また、ハイ ブリダイゼーションおよび洗浄を中程度のストリンジェンシー（例えば、0.2xSS C/0.1% SDS中、42℃で洗浄）で行うことが有利である(Ausubelら，1989，前掲) 。相同遺伝子配列は、このような条件下でプローブによって検出され、かつプロ ーブ供給源の遺伝子によりコードされるタンパク質と75％またはそれ以上のアミ ノ酸相同を有するタンパク質をコードしているものである。HMG2相同遺伝子を単 離する際に有用なハイブリダイゼーション条件は詳述されている。Parkら，1992 ，Plant Mol．Biol．20:327-331を参照されたい。 相同の誘導遺伝子配列を含むクローンは、期待される誘導因子または条件によ って誘導されるｍＲＮＡ転写物を高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ ン条件で検出するその能力によって、他の同質遺伝子とは区別しうる。例えば、 HMG2相同遺伝子は、ハイブリダイズするｍＲＮＡ転写物が損傷、病原体感染、害 虫侵入またはエリシター処理の後に速やかに出現することにより同定 できる（このような分析の例については、Yangら，1991，PlantCell 3:397-405 を参照されたい）。また、HMG2クローンは既知のHMG1およびHMG2（例えば、図３ に示した2.5kbのEcoRI断片）遺伝子の5'非翻訳領域または5'上流領域と中程度ま たは高度のストリンジェンシー条件でハイブリダイズするその能力を試験するこ とによっても同定しうる。HMG2クローンはHMG1プローブの場合よりもHMG2プロー ブを用いる場合に強いシグナルを示すものとして同定される。 プローブとライブラリーの種起源が、密接に関連した植物同士のように、広く 分岐していない場合には、ライブラリーのスクリーニングに用いるプローブは、 誘導タンパク質のN-末端の200ほどのアミノ酸をコードする制限断片もしくはヌ クレオチド配列（例えば、トマトHMG2 HMGRの場合にはParkら，1992，PlantMol ．Biol．20:327-331を参照）、その一部またはそれに相同のヌクレオチド配列で ありうる。その後、取り出したクローンは当技術分野で公知の方法にしたがって 制限断片マッピングおよび配列決定法により分析される。 もう一つの方法として、誘導プロモーターの制限断片もしくはヌクレオチド配 列、その一部またはそれに相同の配列を用いてゲノムライブラリーをスクリーニ ングすることにより、上記の標準方法を使って相同プロモーター配列を含むゲノ ムクローンを同定することができる。 一つの実施態様では、ゲノムライブラリーをスクリーニングして相同プロモー ター配列を含むゲノムクローンを同定するために、図３、図４、図５および図６ に示したトマトHMG2プロモーター要 素、その一部またはそれに相同の配列が用いられる。例えば、このような目的に は、プラスミドpDW101中のトマトHMG2プロモーターを含む2.5kbのEcoRI断片また はその一部を使用することができる。 上記の二方法において、相同プロモーター配列を含むクローンの同定に用いら れるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、スクリーニングされるゲノムラ イブラリーとプローブとの種起源間の進化の関係により変化しうる。より遠縁の 植物は中程度のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を必要とするだろう。使 用し得る２つの洗浄条件については上記を参照されたい。 誘導プロモーター要素を単離するための別の方法では、誘導プロモーターの既 知のオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のプライマーと して用いて、どのような植物種由来のプロモーター配列も生成することができる 。ハイブリダイゼーション法と同様に、増幅法は標的生物とプライマー源生物と の進化の関係に応じて調整しうる。その調整には、縮重プライマーの使用と、相 同配列を増幅するための当技術分野で公知のプロトコールの使用が含まれる。Ｐ ＣＲ法に関しては、例えば、Gelfind，1989, PCR Technology．Principles and Applications for DNA Amplification ，H.A．Erlich編，Stockton Press，N.Y. およびCurrent Protocol in Molecular Biology, Vol．2，Ch．15，Ausubelら編 ，John Wiley & Sons，1988を参照されたい。 誘導プロモーターの内部配列のみが知られている場合は、このような配列に隣 接する配列（フランキング配列）を逆ＰＣＲ法に よって得ることができる（Trigliaら，1988，Nucl．Acids Res．16:8186）。そ の後、フランキング配列は、誘導プロモーターの全体を包含する配列を構築する ために、標準組換えＤＮＡ法を用いて内部プロモーター配列に連結される。 上記のごとく単離した配列内の誘導プロモーターの位置は当技術分野で公知の 方法を用いて確認できる。例えば、プロモーターの3'末端は、ＲＮアーゼ保護（ Liangら，1969，J．Biol．Chem．264:14486-14496）、プライマー伸長（Weissen born and Larson，1992，J．Biol．Chem．267:6122-6131）、逆転写／ＰＣＲの ような方法によって決定しうる転写開始部位の所在位置を突き止めることにより 確認できる。プロモーターの3'末端の位置は、配列決定およびコンピューター解 析を用いて、一般的には50〜60塩基対(bp)であって転写開始部位から5'側上流25 〜35 bpにあるプロモーターの普遍的なAGGAまたはCATおよびTATAボックスを調べ ることにより確認しうる。5'末端プロモーターは、プロモーターの5'末端からの 配列を含む断片を欠失させ、その切除断片とリポーター遺伝子との転写または翻 訳融合体を構築し、そしてトランスジェニック植物におけるキメラ遺伝子の発現 特性を調べることにより定めることができる。この目的に用いられるリポーター 遺伝子としては、GUS、CAT、ルシフェラーゼ、β- ガラクトシダーゼ、Clおよび アントシアニン生産を制御するＲ遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。 本発明によると、誘導プロモーター要素は、植物または植物細胞内で機能的に 連結された遺伝子に次の性質を付与するものである。すなわち、1)大多数の植物 組織での最小の発現、および2)プ ロモーターまたはその起源遺伝子の発現を誘導することが知られている誘導物質 または誘導条件下での処理の後に誘導される発現、である。 一つの実施態様において、HMG2プロモーター要素は、植物または植物細胞内で 機能的に連結された遺伝子に次の性質、すなわち、1)大多数の植物組織での最小 の発現、および2)損傷、病原体感染、害虫侵入または化学薬品／エリシター処理 の後に誘導される発現、を付与するものである。さらに、HMG2プロモーター要素 は花粉、成熟果実組織、側生根発生部位の根組織といった部位での特定的発育発 現を付与しうる。トマトHMG2プロモーターと他の既知の植物HMGRプロモーターの 発現特性の比較を示す表１を参照されたい。 本発明によると、プロモーター要素は誘導性の遺伝子の転写開始部位から上流 -2,500 bpから+1 bpにある領域または該領域の一部を含むものである。特定の実 施態様において、HMG2プロモーター要素はトマトHMG2遺伝子の5'上流領域の-2,3 00位と+1位の間の領域を含む（図３参照）。HMG2プロモーター要素のもう一つの 実施態様は、トマトHMG2遺伝子の5'上流領域の-891位と+1位の間の領域を含む。 HMG2プロモーター要素の他の実施態様は、トマトHMG2遺伝子の5'上流領域の-347 位と+1位の間の領域を含む。HMG2プロモーター要素の更なる実施態様は、トマト HMG2遺伝子の5'上流領域の-58位と+1位の間の領域を含む。本発明の更なる実施 態様において、HMG2プロモーター要素は+1位から始まって、図４、図５または図 ６に示したヌクレオチド配列の全体も含めた5'上流まで続く配列を包含するもの である。 5.3. プロモーターのシス調節要素 本発明によれば、誘導プロモーター内のシス調節要素は当技術分野で知られた 方法を用いて同定することができる。例えば、ＤＮアーゼまたは化学的フットプ リント法（Meierら，1991，Plant Cell 3:309-315）またはゲル遅延(Weissenbor n and Larson，1992，J．Biol．Chem．267:6122-6131; Beato，1989，Cell 56:3 35-344; Johnsonら，1989，Ann．Rev．Biochem．58:799-839)のような方法を用 いて、誘導プロモーター内のシス調節要素の位置を同定しうる。さらに、シス調 節要素の位置を定めるのに切除実験を採用してもよい。例えば、制限酵素または エキソヌクレアーゼ消化を用いて5'または3'末端から誘導プロモーター含有断片 を切除しうる。 誘導プロモーターを含む配列内のシス調節要素の位置を決めるにあたっては、 5'- もしくは3'- 切除断片、誘導プロモーター含有配列の内部断片、またはフッ トプリント法やゲル遅延により同定された誘導プロモーター断片含有配列を、末 端切断型の植物プロモーターの5'末端に融合させ、次にトランスジェニック植物 におけるキメラプロモーターの活性を上記第5.2.節に記載したごとく試験する。 この目的に適する末端切断型プロモーターは、転写開始部位付近から始まって5' 上流150 bp以下まで延びる配列を含むものである。これらの末端切断型プロモー ターは概ね不活性であるか、最小限にしか活性を示さない。末端切断型の植物プ ロモーターの例として、とりわけ、その5'末端が転写開始部位に対して-46 bpの 位置で終わっている「最小」CaMV 35Sプロモーター(Skriverら，Proc．Nat．Aca d．Sci．USA 88:7266-7270)、X- GUS-90ベクター中に含まれる末端切断型「-90 35S」プロモーター（Benfey and Chua，1989，Science 244:174-181）、ノパリンシンターゼプロモーターに由来 する末端切断型「-101 nos」プロモーター（Aryanら，1991，Mol．Gen．Genet． 225:65-71）、およびpADcat 2中に含まれる末端切断型トウモロコシAdh-1 プロ モーター(Ellisら，1987，EMBO J．6:11-16)が挙げられる。 本発明によれば、誘導プロモーターのシス調節要素とは、末端切断型プロモー ターに元の誘導プロモーターの誘導特性を１以上付与しうるプロモーター配列の ことである。例えば、HMG2シス調節要素は、植物または植物細胞内での機能的に 連結された遺伝子の発現に際して、末端切断型プロモーターに１以上の次の特性 を付与しうるHMG2プロモーター配列である。すなわち、1)損傷後の誘導発現、2) 病原体感染後の誘導発現、3)害虫侵入後の誘導発現、4)化学誘発物質処理後の誘 導発現、または5)花粉、成熟果実またはHMG2を発現すると確認された他の発育限 定組織における発現、である。さらに、HMG2シス調節要素は、上記の特性に加え て、植物プロモーターの構成的活性を抑制する能力を付与することができる。 5.4. 誘導プロモーター作動発現ベクター その核酸配列の特性は、種々の可能性のある宿主植物細胞の遺伝的構成がさま ざまであるように、一様ではない。本発明の好ましい実施態様は、当業者が絶対 に必要というわけではないが、明らかに有利であると認める、多くの特性を記述 するだろう。これらには単離方法、遺伝子構築物の合成または構築方法、植物細 胞 に導入される遺伝子構築物の操作方法、遺伝子構築物のいくつかの特徴、そして 遺伝子構築物と関連したベクターのいくつかの特徴が含まれる。 さらに、本発明の遺伝子構築物はＤＮＡまたはＲＮＡ分子でコードされ得る。 本発明によれば、標的植物の所望遺伝子型の安定した変更は、外因的に導入され た核酸構築物、特に組換えＤＮＡ構築物、のゲノム組込みにより行われることが 好適である。しかしながら、本発明によれば、自律的に複製可能で、体細胞内で も生殖細胞内でも安定しているエピソーム（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入によっ て遺伝子型を変更してもよい。導入された核酸構築物がＲＮＡからなる場合は、 植物形質転換または該構築物からの遺伝子発現は逆転写により生産されたＤＮＡ 中間体を介して進行する。 本発明は、誘導プロモーター断片、その機能性部分、またはそれに相同のヌク レオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物の使用を提供する。本明細書中で用いる プロモーターの機能性部分およびプロモーター相同配列とは、どちらも誘導プロ モーターとして機能することができるものである。こうした配列の機能性は当技 術分野で公知の方法を用いて簡単に確かめることができる。かかる方法は、例え ば、該配列を含む発現ベクターを構築し、それらが機能的に連結された遺伝子に 誘導発現を付与するか否かを調べることを含む。特定の実施態様において、本発 明は図３、４、５および６に示したトマトHMG2プロモーター断片または配列、そ の機能性部分、およびそれに相同のヌクレオチド配列の使用を提供する。 本発明の誘導プロモーター要素は、目的のタンパク質を発現させたり、あるい は「アンチセンス」ＲＮＡやリボザイムを含むがこれらに限らないＲＮＡ産物を 発現させるために用いられる。このような組換え構築物は一般に、目的の異種遺 伝子産物をコードする核酸配列に連結された、天然の誘導プロモーターまたはそ れに由来する組換え誘導プロモーターを含んでいる。 組換え誘導プロモーターとは、本明細書中では、天然誘導プロモーターの機能 性部分を含むプロモーターまたは誘導プロモーター由来の調節要素によって修飾 された天然プロモーター配列を含むプロモーターを意味する。例えば、特定の実 施態様において、HMG2プロモーター由来の組換え誘導プロモーターは、pDW201、 pDW202およびpDW203のそれぞれ約0.17 kb、0.46 kbまたは1.0kbのHindIII-BamHI トマトHMG2プロモーター断片を含みうる（図７参照）。また、HMG2プロモータ ー由来の組換え誘導プロモーターは、１以上のHMG2シス調節要素の結合により修 飾された全長または末端切断型植物プロモーターを含むキメラプロモーターであ りうる。 キメラプロモーターの構築方法は当技術分野で公知である。このような構築に 使用しうる方法の例に関しては、上記の第5.3.節およびFluhrら，1986，Science 232:1106-1112; Ellisら，1987，EMBO J．6:11-16; Strittmatter and Chua，1 987，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 84:8986-8990; Poulsen and Chua，1988，Mol ．Gen．Genet．214:16-23; Comaiら，1991，Plant Molec．Biol．15:373-381; A ryanら，1991，Mol．Gen．Genet．225:65-71を参照されたい。 本発明により、目的タンパク質の発現に誘導プロモーターまたは組換え誘導プ ロモーターが用いられる場合は、タンパク質コード配列がプロモーターの下流の 転写開始コドンと同じ読み枠（inphase）で連結されるようにＤＮＡ構築物を設 計する。プロモーター断片が5'-リーダー配列を欠失している場合は、タンパク 質とその5'ＲＮＡリーダー配列の両方をコードするＤＮＡ断片を転写開始部位の すぐ下流に連結させる。また、プロモーターとタンパク質コード配列を橋渡しす るために無関係の5'ＲＮＡリーダー配列を用いてもよい。このような場合には、 タンパク質コード配列が該リーダー配列中に存在する開始コドンと同じ読み枠で 連結されるように設計すべきであり、また、いかなる開始コドンも転写開始部位 とタンパク質の最初のメチオニンコドンの間に介在しないように連結すべきであ る。 さらに、タンパク質発現構築物には追加のＤＮＡ配列を含めることが望ましい かもしれない。追加のＤＮＡ配列の例として、3'非翻訳領域、転写終結およびポ リアデニル化シグナル、イントロン、シグナルペプチド（タンパク質分泌を促進 する）、またはトランジットペプチド（核、葉緑体、ミトコンドリアまたは液胞 のような特定の細胞区画にタンパク質を向かわせる）をコードする配列が挙げら れるが、これらに限らない。 5.5. 組換えＤＮＡ構築物 本発明の組換え構築物は該構築物増殖用の選択マーカーを含むことができる。 例えば、細菌内で増殖される構築物は、カナマイシン、テトラサイクリン、スト レプトマイシンまたはクロラムフ ェニコールに対する耐性を付与するような抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ま しい。構築物増殖用の適当なベクターには、2,3の名を挙げると、プラスミド、 コスミド、バクテリオファージまたはウイルスが含まれる。 その上に、組換え構築物は該構築物によって形質転換された植物細胞を単離、 同定または追跡するための植物発現可能、選択可能またはスクリーニング可能な マーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカーとしては、抗生物質耐 性（例えば、カナマイシンまたはヒグロマイシン耐性）または除草剤耐性（例え ば、スルホニル尿素、ホスフィノトリシンまたはグリフォセート耐性）を付与す る遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。スクリーニング可能なマーカーと しては、β- グルクロニダーゼ(Jefferson，1987，Plant Molec．Biol．Rep 5:3 87-405)、ルシフェラーゼ(Owら，1986，Science 234:856-859)、アントシアニン 色素生産を調節するＢタンパク質（Goffら，1990，EMBO J 9:2517-2522）をコー ドする遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。 植物を形質転換するためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte rium tumefaciens)系を利用する本発明の実施態様（下記参照）では、組換え構 築物はさらに、植物細胞を形質転換するＤＮＡ配列に隣接して、少なくとも右側 のT-DNAボーダー配列を含みうる。また、組換え構築物はＤＮＡ配列に隣接して 右側と左側のT-DNAボーダー配列を含んでいてもよい。このようなT-DNAをベース とする形質転換ベクターの適切な設計および構築は当業者に公知である。 5.6. トランスジェニック植物および植物細胞の作製 本発明によると、望ましい植物または植物細胞は、ここに記述される核酸構築 物で植物細胞を形質転換することにより得ることができる。ある場合には、植物 または植物細胞を数種の異なる遺伝子構築物で操作することが望ましいかもしれ ない。こうした遺伝子操作を行うには、所望の遺伝子構築物の全部を用いて同時 に植物または植物細胞を形質転換する。また、遺伝子操作を順次行ってもよい。 すなわち、１つの遺伝子構築物で形質転換を行い、選択およびスクリーニング後 に目的の形質転換体を収穫し、収穫した形質転換体を第二の遺伝子構築物で形質 転換する、といった具合に行う。 本発明の実施態様では、植物に遺伝子構築物を導入するためにアグロバクテリ ウムが用いられる。このような形質転換には二元アグロバクテリウムT-DNAベク ター（Bevan，1984，Nuc．Acid Res．12:8711-8721）および同時培養法(Horsch ら，1985，Science 227:1229-1231)を使用することが好ましい。一般に、アグロ バクテリウム形質転換系は双子葉植物の遺伝子操作に利用される（Bevanら，198 2，Ann．Rev．Genet 16:357-384; Rogersら，1986，Methods Enzymol．118:627- 641）。また、アグロバクテリウム形質転換系は単子葉植物および植物細胞への ＤＮＡの移入にも利用される（Hernalsteenら，1984，EMBO J 3:3039-3041; Hoo ykass-Van Slogterenら，1984，Nature 311:763-764; Grimsleyら，1987，Natur e 325:1677-1679; Boultonら，1989，Plant Mol．Biol．12:31-40; Gouldら，19 91，Plant Physiol． 95:426-434を参照されたい）。 その他の実施態様では、植物および植物細胞に組換え核酸構築物を導入するた めに、種々の変法が用いられる。こうした他の方法は標的が単子葉植物または植 物細胞のときに特に有用である。その他の遺伝子移入および形質転換法としては 、裸のＤＮＡのカルシウム-、ポリエチレングリコール(PEG)-またはエレクトロ ポレーション- 媒介取込みによるプロトプラスト形質転換(Paszkowskiら，1984 ，EMBO J 3:2717-2722，Potrykusら，1985，Molec．Gen．Genet．199:169-177; Frommら，1985，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 82:5824-5828; Shimamoto，1989， Nature 338: 274-276)および植物組織のエレクトロポレーションがあるが、これ らに限らない。植物細胞形質転換の更なる方法としては、マイクロインジェクシ ョン、シリコンカーバイド媒介ＤＮＡ取込み(Kaepplerら，1990，Plant Cell Re porter 9:415-418)およびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（micro projectilebombardment）（Kleinら，1988，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 85:430 5-4309; Gordon-Kammら，1990，Plant Cell 2:603-618）が挙げられる。 本発明により、多種多様の植物および植物細胞系は、本発明の核酸構築物およ び上記の各種形質転換法を用いて、ここに記述される希望の生理的および農業的 形質へと遺伝子操作することができる。好ましい実施態様では、遺伝子操作され る標的植物および植物細胞にはトウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、トマト、 タバコ、ニンジン、落花生、ジャガイモ、サトウダイコン、ヒマワリ、ヤムイモ 、アラビドプシス(Arabidopsis)、アブラナおよび ペチュニアが含まれるが、これらに限らない。 5.7. 形質転換された植物および植物細胞の選択ならびに同定 本発明によると、目的の植物および植物細胞は、ここに記述される遺伝子構築 物をいろいろな植物細胞型（プロトプラスト、組織培養細胞、組織および器官移 植片、花粉、胚および全植物を含むが、これらに限らない）に導入することによ って得られる。本発明の一実施態様では、遺伝子操作された植物材料は下記の手 順および方法にしたがって形質転換体（すなわち、導入した遺伝子構築物を組み 込んでいるもの）について選択またはスクリーニングされる。単離した形質転換 体はその後植物へと再生させることができる。また、これとは別に、遺伝子操作 された植物材料を植物または苗に再生させてから、誘導された植物または苗をマ ーカー遺伝子特徴の選択またはスクリーニングに付してもよい。マーカー遺伝子 の選択またはスクリーニングの前か後に、植物細胞、組織または器官から植物を 再生させる方法は当業者に公知である。 形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、遺伝子操作された植物 材料を、形質転換用ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によりコードされる特性 について選択またはスクリーニングすることによって同定し単離しうる。例えば 、遺伝子操作された植物材料を、阻止量の抗生物質または除草剤（形質転換用マ ーカー遺伝子構築物はこれに対する耐性を付与する）を含有する培養基上で生育 させることにより選択できる。さらに、形質転換された植物および植物細胞は、 本発明の組換え核酸構築物上に存在しうる目視可能なマーカー遺伝子（例：β- グルクロニダーゼ、 ルシフェラーゼ、ＢまたはCl遺伝子）の活性をスクリーニングすることによって も同定できる。こうした選択およびスクリーニングの方法論は当業者に公知であ る。 本発明の遺伝子構築物を保有する植物または植物細胞形質転換体を同定するに あたって、物理的および生化学的方法も使用できる。これらの方法として、1)組 換えＤＮＡ挿入物の構造を検出して決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅 、2)遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出して試験するためのノーザンブロット 、S-1 RNアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素−ＰＣＲ増幅、3)酵素ま たはリボザイム活性を検出するための酵素検定法（かかる遺伝子産物が遺伝子構 築物によりコードされる場合）、4)タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッ ト法、免疫沈降または酵素結合イムノアッセイ（遺伝子構築物の産物がタンパク 質である場合）、5)導入された遺伝子構築物の発現の結果として産生された化合 物の生化学的測定、を挙げることができるが、これらに限らない。さらに、in s itu ハイブリダイゼーション、酵素染色、免疫染色といった別の手法も特定の植 物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出する際に使用で きる。上記アッセイの実施方法はすべて当業者に公知である。 5.8. トランスジェニック植物による異種遺伝子産物の発現 本発明は、さまざまな遺伝子産物の発現を誘導するために有利に用いられる。 これらの遺伝子産物として、タンパク質、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム が含まれるが、これらに限定されない。 本発明の実施態様では、誘導プロモーターまたは組換え誘導プロモーターは、 植物および植物細胞培養物に価値の高い各種タンパク質産物（医薬用、治療用の 酵素およびタンパク質を含むがこれらに限らない）を発現させるために、収穫後 生産において用いられる。こうしたタンパク質産物には、例えば、各種ペプチド ホルモン、サイトカイン、成長因子、抗体、血液タンパク質およびワクチンが含 まれる。さらに、これらのプロモーター要素は植物および細胞培養物に複雑な生 合成経路の多数の酵素類を発現させるためにも使用され、それらの誘導は宿主植 物または植物細胞に複雑な生化学的薬剤および生物学的薬剤を産生する能力を付 与するだろう。このような産物の例として、アルカロイド、抗生物質、色素、ス テロイドなどの二次代謝産物および完全または欠陥ウイルスもしくはウイルス粒 子のような複雑な生物学的構造体が挙げられる。加えて、これらのプロモーター 要素はいろいろなタイプの溶解およびプロセシング酵素を発現させるためにも使 用され、かかる酵素は、さもなくば不安定なものまたは低品質の植物化合物また は構成成分を、有用なまたは高品質の化合物もしくは化学原料に変換し得るもの である。このような産物の例として、セルラーゼ、リグナーゼ、アミラーゼ、プ ロテアーゼ、ペクチナーゼ、フィターゼなどが含まれる。その上に、誘導プロモ ーターまたは組換え誘導プロモーターはアンチセンスＲＮＡやリボザイムのごと きＲＮＡ産物の発現にも用いることができる。特定の実施態様では、損傷誘導性 および／またはエリシター誘導性の遺伝子発現を付与するHMG2またはHMG2由来の プロモーター要素が上記の産物の発現に用いられる。 上記の実施態様において、誘導プロモーターまたは組換え誘導プロモーター（ 損傷- および／またはエリシター- 特異性HMG2およびHMG2由来のプロモーターを 含む）は、目的とする直接または間接遺伝子産物の「収穫後」生産および蓄積を 引き出すために有利に用いられる。すなわち、目的産物の生産は植物または細胞 培養物の通常の発育中には起こらないで、植物または細胞培養物（例：カルス培 養物）を機械的にマセレーション（解離）させたり、かつ／またそれらを収穫す る直前、途中または直後にエリシターで処理した後にのみ起こる。（ここに開示 される「収穫後」生産法とともに使用しうる植物細胞培養法を記述している一般 的な文献として、Handbook of Plant Cell Culture，Vol．4，Techniques and A pplications，etc.，Evans，D.A.，Sharp，W.R.and Ammirato，P.O.，1986，Mac mi1lan Pub1.，New York，New Yorkを参照されたい。） ここに記述される発現構築物で遺伝子操作された植物組織または植物細胞の培 養系はどれも、目的とする直接または間接遺伝子産物の生産に使用することがで きる。有用な植物組織（および器官）には葉、茎、根、花、果実および種子が含 まれるが、これらに限らない。 目的の間接遺伝子産物、例えば二次代謝産物、の生産に２以上の遺伝子機能が 必要な場合は、宿主植物または植物細胞を数種の発現構築物で操作することが有 利である。その場合、各構築物は必要とされる全ての遺伝子機能の同等の発現を 可能とするようにそれぞれの遺伝子機能の発現を制御する同一の誘導プロモータ ーを含む。 遺伝子操作植物および細胞から収穫された組織および培養物の誘導は、当技術 分野で知られた方法を用いて、発現構築物に用いられている特定の誘導プロモー ターに対して行われる。例えば、HMG2またはHMG2由来プロモーターを含む発現構 築物ベクターから発現を引き出すには、収穫した組織または培養物をマセレーシ ョンにより物理的に損傷させたり、生物学的エリシターで処理したり、適当な病 原体に感染させたりしうる。 収穫した植物組織または培養物の誘導は収穫直後に行ってもよいし、また、収 穫した組織または培養物をいったん貯蔵し、その後に誘導を行ってもよい。収穫 した植物組織または培養物の貯蔵は、遺伝子発現を最善に保つ当技術分野で知ら れた任意の方法を用いて行う。 特定の実施態様では、目的とする遺伝子産物の発現を誘導する前に、収穫した 葉を密封容器に入れて４℃でまたは空気透過性容器に入れて室温で最長６週間貯 蔵することができる。好ましくは、貯蔵した葉は収穫後約２週間で誘導を行う。 誘導した組織または培養物は、誘導遺伝子の発現および目的の直接または間接 遺伝子産物の蓄積を可能とするために室温で最長１週間インキュベートし、その 後直接または間接遺伝子産物を単離すべく該組織または培養物を加工処理する。 特定の実施態様において、誘導した葉組織は葉組織の加工処理に先立って室温で 約48時間インキュベートする。 上述した種類の産物を生産させるための誘導プロモーターまたは組換え誘導プ ロモーターの適用は、多くのこうした産物が不安定であったり、細胞代謝や植物 の発育にとって有害であったりす る場合に、とくに重要となる。かくして、それらの効率的で最大の生産は、多く の場合に、収穫後誘導法と結びつけた誘導プロモーター、特に損傷−誘導性また はエリシター−誘導性のプロモーター、を使用することによって最もよく達成さ れる。先に説明したように、その後の使用のために植物または植物部分を収穫す ることは、それらを望ましい環境条件下に維持する限り、通常は植物組織を死滅 させたり害したりすることはない。 別の実施態様では、病原体−誘導発現を付与するHMG2またはHMG2由来のプロモ ーターを、病原体の感染中にさまざまな疾病耐性遺伝子を発現させるために用い てもよい。このような耐性遺伝子の例として、抗ウイルス防御用のウイルス外被 タンパク質、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム遺伝子（Gadaniら，1990，Ar ch．Virol 115:1-21）；抗細菌防御用のリゾチーム、セクロピン、マガニンまた はチオニン；抗真菌防御用のグルカナーゼやキチナーゼのような発病関連(PR)タ ンパク質；が挙げられる。 更なる実施態様において、害虫侵入−誘導発現を付与するHMG2またはHMG2由来 のプロモーターは、昆虫や線虫の侵入中にさまざまな害虫耐性遺伝子を発現させ るべく使用しうる。線虫や昆虫を防除するのに有用な遺伝子産物の例として、バ シラス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の内毒素、プロテアーゼ 阻害剤、コラゲナーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、レクチン、グリコシダーゼ および神経毒が挙げられる。 HMG2およびHMG2由来のプロモーターは、それらを病原体および害虫耐性遺伝子 の発現に特に適するようにならしめる多くの特徴を備えている。これらの特徴の 中に、植物の大部分の非誘導組織 における該プロモーターのきわめて低いバックグラウンド活性、ひとたび誘導さ れたときの迅速な誘導および強力な活性、そして誘導応答の比較的部位特異的な 性質がある。これらの特徴が組み合わさって、最大限に効を奏する時期および場 所（すなわち、病原体または害虫の侵入部位）に植物の耐性応答を制限すること により、HMG2- 制御耐性機能は非常に効率のよいものとなる。 さらに他の実施態様では、花粉特異性発現を付与するHMG2およびHMG2由来のプ ロモーターが雄性不稔植物の遺伝子操作に用いられる。花粉特異性HMG2またはHM G2由来のプロモーターは、遺伝子発現、細胞分裂、代謝といった生細胞過程を妨 げる遺伝子機能を発現させるために使用しうる。こうした機能の例として、ＲＮ アーゼ、ＤＮアーゼ、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムが挙げられる。花粉 特異性HMG2またはHMG2由来のプロモーターの使用により、花粉組織に対して有害 な機能の発現が正常な植物発育の他の側面に影響を及ぼすことなく抑制されるだ ろう。 ６．０ 実施例：トマトHMG2プロモーターの単離および特性づけならびにHM G2遺伝子融合体 トマトHMG2プロモーターの単離を以下に説明する。開示された方法は、一般的 に、クローン化されたいかなるプロモーターとも相同な物の単離に応用すること ができ、とりわけ、他の植物種から上記トマトHMG2プロモーターの相同体を単離 するのに適している。上記方法は、HMGRのコード領域を含む遺伝子配列を、低ス トリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、ゲノムライブラリーをス クリーニングするために使用した。本実施例においては、使用されたプローブは 、ハムスターHMGRのアミノ酸配列を高度に保存していることを示す酵母HMGRの領 域を含む断片であった。陽性クローンを単離し、必要に応じてサブクローン化し 、ハイブリダイズする領域をフランキング配列に沿って配列を決定する。HMG2遺 伝子を含む配列を、既知のHMGR遺伝子とのヌクレオチド配列比較および既知のHM G1遺伝子からのそれらの分岐に基づいて同定した（Parkら，1992年，Plant Mol ．Biol．20巻： 327-331頁）。 プロモーター：リポーター遺伝子融合体を、HMGRコード領域の5'上流側のクロ ーン化された配列の範囲内にHMG2プロモーター要素を、局在させるためにここで 使用した。上記分析の１つの目標は、2.3kbのHMG2プロモーターが、機能し得る 状態で連結された異種遺伝子に与える組織特異性、防御関連および収穫後誘導性 を証明することにある。上記分析の第二の目標は、トランスジェニック植物にお いて、HMG2遺伝子の調節応答の完全なアレイを与えるはずの最も小さい5'上流側 の断片を決定することにある。かく して、HMG2転写開始部位の5'上流側の2.5キロ塩基対（bp）の断片から始めると 、上記2.5kbの断片の5'端から次第に大きな領域を欠失させるPCRを用いて、より 小さなプロモーター要素断片が生成される。遺伝子融合体は、上記2.3kb EcoRI/ BglII断片とより小さなPCRで生成された断片をβ−グルクロニダーゼ(GUS)リポ ーター遺伝子とをつなぐことによって構築した。上記融合遺伝子の活性をトラン スジェニック植物において試験して、HMG2プロモーターの所在を決定した。 ６．１． 材料及び方法 ６．１．１ 植物および真菌材料 トマト(Lycopersicon esculentum cvs．Gardener and Vendor)およびタバコ(N icotiana tobacum cvs．Xanthi and NC95)植物を温室条件下で育てた。形質転換 実験のための苗を以下に記載するように無菌的に育てた。懸濁培養した植物細胞 をエリシター処理するために、トマトEP7細胞を修飾ＭＳ培地中で暗室にて維持 した。Martha Mutshchler博士(Cornell University，Ithaca，NY)より提供され たバーティシリウム・アルボアトラム(Verticillium alboatrum，種１）および フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum，種１）を2.4%ポテトデキス トロース寒天上に維持し、細胞壁単離のために2.4%液体培地中で増殖させた。真 菌のエリシター、単離された菌糸体の壁から加熱遊離される高分子量物質を得て 、報告されたように測定した(Ayersら、1976年、Plant Physiol．57巻:760-765 頁)。リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)株RS51およびR992は、Charles Hagedorn博士(Virgi nia Polytechnic Institute and State University)から提供された。 ６．１．２ ゲノムライブラリーのスクリーニング ラムダシャロン35で構築したトマトゲノムＤＮＡライブラリ(L．esculentum c v．VFNT Cherry)の組換クローン(500,000)をプラークハイブリダイゼーションで スクリーニングした。ハイブリダイゼーションプローブにはpJR326の1.75kbのEc oRI断片(Jasper Rine博士、University of California，Berkley，CAより提供さ れた）を用いた。この断片は、ハムスターのHMGRを最も良く保存しているサッカ ロミセス・セレビシアエ(S.serevisiae)HMG1の領域を含んでいる(Bassonら、198 6年、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83 巻:5563-5567頁)。最初のスクリーニング を低ストリンジェンシー条件下（例えば、30%ホルムアミド、6 x SSC、5 Xデン ハルト溶液、0.1% SDS、100 μｇ/mlのサケ精子ＤＮＡ、37°Ｃ、24時間；最終 洗浄条件は、0.2 x SSC、室温）で行った。陽性のハイブリダイゼーションシグ ナルを与えたプラークを、さらに特性づけを行う前に、少なくとも３回の精製を 行った。１つのクローン（TH29と命名）の７kbのHindIII断片を転写ベクターpSP 6/T7のHindIII部位にサブクローンし(Bethesda Research Laboratories(BRL)，G aOthersburg，MD)、pTH295と命名した（図３）。 ６．１．３ 核酸の単離 全ＤＮＡをDraperおよびscottの方法(Plant Genetic Transfo rmation and Gene Expression，1988年，Draperら編、Blackwell Scientific，P alo Alto，CA，211-214頁)に従ってトマトの葉から単離した。ＲＮＡの単離のた めに、エリシター処理した懸濁培養トマト細胞、創傷処理（カミソリの刃で１ｍ ｍの切片とし、乳棒で押しつぶす）した健常根、茎、葉、または様々な生育段階 にある無傷の果実を-70°Ｃで保存した。液体窒素中ですりつぶした組織の湿重 量１−３ｇから全ＲＮＡを単離し、記載されたよう(Haffnerら、1978年、Can．J ．Biochem．56巻:7229-7233頁)にフェノール：0.1Mトリス(pH9.0)エマルジョン 中で直接ホモジナイズした。 ６．１．４ ハイブリダイゼーション分析 ゲノムのサザン分析のために、10μｇ/レーンの全ＤＮＡを制限エンドヌクレ アーゼで消化し、0.8%アガロースゲル上で分離し、製造者(Schleicher and Schu ell，Keene，NH)により推奨された条件でナイロン膜に移行させた。ノーザン分 析のために、全ＲＮＡ（5 -20μｇ/レーン）をゲル分析用1.2%アガロースゲル中 での電気泳動に先立って、またはスロットブロッティング装置を用いてニトラン (Nytran)膜上に直接のせる前にグリオキサールで処理し変性させた。HMGR遺伝子 ファミリーの全メンバーを明らかにすることを目的としたハイブリダイゼーショ ンのために、複数の種の間で最もよく保存されている遺伝子の3'端から得られた プローブ（Bassonら、1988年、Mol．Cell．Biol．８巻:3797-3808頁）を用いた 。pTH295（図３;Yangら、1991年、Plant Cell，５巻:397-405頁）の1.5kbのEcoR I断片またはpCD1（NRRL受託番号 ）から得られたこの領域からの486bpのHMG2のｃＤＮＡクローンのい ずれかをランダム−プライマー法(Multi-prime Labeling System，Amersham，U. K.)で32Ｐ−標識した。標識プローブの不存在下で膜を終夜プレハイブリダイズ し、32Ｐ−標識プローブの存在下に、24〜48時間、42°Ｃで、40%ホルムアミド 、６ x SSC、５ｘデンハルト溶液、５mM EDTA、0.1% SDS、100μｇ/mlのサケ精 子ＤＮＡ(Sigma)を含む溶液中にてハイブリダイズした。最終洗浄条件は、0.1 x SSC、0.1% SDS、室温１時間であった。pTH295でコードされるHMG2同質遺伝子(i sogene)に対してのみ特異的な配列のハイブリダイゼーションをモニターするこ とにねらいを定めた分析のために、上記遺伝子の5'非翻訳領域と5'端をコードす る0.7kbのAvaI-EcoRI断片、またはこの断片から得られた上流領域を欠いている3 40bpのより小さなサブクローンを使用した。ハイブリダイゼーション条件は、50 %ホルムアミドと５ x SSCを用いることを除いて上述した通りであった。ハイブ リダイゼーションに続いて、膜を洗浄し（最終洗浄は0.1 x SSC、50°Ｃ、１時 間で行った）、Ｘ−線フィルム感光の前に未結合の標識体を除去した。 ６．１．５ HMG2プロモーター：リポーター遺伝子融合体 HMG2含有クローンpTH295の2.5kbのEcoRI断片をBluescript SKベクター(Strata gene)のEcoRI部位に挿入し、pDW101と命名した（図３；NRRL受託番号 ）。このベクターをEcoRIとBglIIで消化したところ、約2.3kbの断片が得られ 、この断片は、HMG2 HMGRの最初の５つのＮ−末端アミノ酸をコードする配 列を含み、これらのコード配列の5'上流約2.3kbまで延びる配列を含んでいた。 この断片をGUS遺伝子にNcoI部位でライゲートしてGUSのATG開始コドンと同じ読 み枠で融合させ、修飾されたpRK290プラスミド中に挿入してpSLJ330.1を生成し た（図８）。このプラスミドは、Jonathan Jones博士より提供された形質転換ベ クターを用いて、Jones博士と共同研究を行っているJohn Innes Institute(Norw ich，U.K.)のSainthbury研究室で構築された。ついで、HMG2プロモーター構築物 をpBI系列(Clontech)の植物形質転換／発現ベクター中に挿入した。融合遺伝子 を含むpSLJおよびpBIプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agro bacterium tumefaciens)LBA4404株(Clontech)に、ヘルパープラスミドpRK2013を 用いて三親交配で導入した。 ６．１．６ HMG2プロモーター欠失体の配列決定 pDW101に含まれているHMG2の2.5kbのプロモーター領域の3'および5'端から累 積的に大きくなる欠失を、Stratagene(La Jolla，CA)から購入したエキソヌクレ アーゼIII/ヤエナリ(Mung Bean)ヌクレアーゼ反応キットを用いて生じさせた。 二本鎖pDW101をBamHIおよびSacIを用いて消化し（両酵素はプラスミドのベクタ ー部分中で切断する）、5'および3'に突き出した部分(overhang)を有するＤＮＡ の線状片を得た。フェノール:CHCl3抽出により制限酵素を除去した後、上記ＤＮ Ａを100%エタノールで沈殿させ、乾燥した。消化された上記ＤＮＡをその後、20 単位のエキソヌクレアーゼIII/μｇＤＮＡで処理して一本鎖ＤＮＡのセグメント を作製した。上記反応液の一部を４５秒毎に取り出し、ヤエナリヌク レアーゼ緩衝液を含む試験管に加えた。その後、ヤエナリヌクレアーゼを用いて 上記ＤＮＡの一本鎖部分を消化した。この方法は、各測定時点ごとに約300bpを 除去すると計算された。上記酵素を塩化リチウムで処理して抽出し、上記ＤＮＡ を酢酸ナトリウムとエタノールを添加して沈殿させた。この処理に続いて、クレ ノウ断片を用いて、修復(fill-in reaction)を行い、次のライゲーションのため の平滑末端を確保した。得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した。二本鎖Ｄ ＮＡの配列を、シークエナーゼ2.0(Sequenase 2.0，United States Biochemical ，Cleveland，OH)を用いて、製造者により提供された取扱説明書にしたがって決 定した。５％ ハイドロリンク・ロング・レンジャー(HydroLink long Ranger) アクリルアミドゲル(AT Biochem，Malvern，PA)上で、電気泳動を行った。 ６．１．７ GUS遺伝子とHMG2プロモーター欠失体との融合体 HMG2プロモーターの欠失を、PCR法により作製した。使用したプライマー（図 ４に示した）、および得られた断片の概その大きさは次の通りであった。すなわ ち、プライマー＃22および＃18は、1000bp；プライマー＃20および＃18は、460b p；プライマー＃19および＃18は、170bpであった。プライマー＃19、＃20、＃21 は隣接するHindIII部位をつくり出した。プライマー＃18は、隣接するBamHI部位 をつくり出した。PCR反応には、1.5mMのMgCl2、200μＭの各dNTP、2.5単位のＴ ａｑポリメラーゼ、１ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液、100ngのpDW101、および約4 0pmolの各 プライマーが含まれる。３サイクルを実施した：サイクル１（１ｘ）：95°Ｃ− ５分、72°Ｃ−５分、58°Ｃ−２分、72°Ｃ−15分、最初の72°Ｃのインキュベ ーションの後、Ｔａｑポリメラーゼを添加する；サイクル２（40 x）：95°Ｃ− １分、58°Ｃ−２分、72°Ｃ−３分；サイクル３（１ｘ）：72°Ｃ−15分。生成 されたＤＮＡ断片を、1.4%アガロースゲル上で電気泳動にかけ、大きさを調べた 。ポリアクリルアミドゲルで精製した断片を、制限酵素HindIIIおよびBamHIで消 化した。その後、これらの断片を同様に消化した二元ベクターpBI101中にライゲ ートした（図７）。生じたプラスミド、pDW201（NRRL受託番号 ）、 pDW202（NRRL受託番号 ）、pDW203（NRRL受託番号 ）で 大腸菌DH5α株を形質転換し、それらの配列を調べた。上記二元プラスミドをア グロバクテリウム(Agrobacterium)株LBA4404に、三親交配を用いて導入した。 ６．１．８ 遺伝子構築物での植物の形質転換 上記HMG2プロモーター：リポーター遺伝子融合体で、Horshらのリーフディス ク形質転換法(Horschら，1985年、Science，227巻: 1229頁）にしたがって、タ バコを形質転換した。適当に遺伝子操作されたアグロバクテリム・ツメファシエ ンスと共存培養する前に、無菌的に生育させたタバコ苗から切り出したリーフデ ィスクを、フィーダープレート（Nitschビタミン類、100mg/Ｌのミオイノシトー ル、30gm/Lのショ糖、１mg/Lの2,4-D、0.4mg/LのBAP、８gm/Lの寒天を含む修飾 ＭＳ培地）上に播種した培養タバコ「ナース(nurse)」細胞の層(lawn)上に重ね た菌濾紙上で８時 間インキュベーションした。共存培養は、上記リーフディスクをA.tumefaciens の１ｘ109個/ml濃度の懸濁液中に沈めて行い、ついで真空浸潤(vacuum infiltra tion)させた（３ｘ１分）。その後、上記リーフディスクを、上記ナースプレー トに戻し、間接照明で25°Ｃで48時間インキュベートした。その後ディスクを、 カルベニシリン(500μｇ/ml)および形質転換選択用の適当な抗生物質を含む選択 ／再生プレート（ＭＳ塩、Nitschビタミン類、100mg/Lのミオイノシトール、20g m/Lのショ糖、２mg/Lのゼアチン、４gm寒天/L）に移した。プレートを生育チャ ンバーに戻した（25°Ｃ、18時間照明）。得られた苗のシュート(shoots)を切り 出し、発根培地(rooting media; ＭＳ塩、Nitschビタミン類、100mg/Lのミオイ ノシトール、30g/Lのショ糖、４gm/Lの寒天、および各々終濃度10μＭと１μＭ のIAAとカイネチン)に移した。その後、根が出た植物を土に植え、温室に移動さ せた。 トマトの形質転換を、組織源を除いて同様の方法で行った。無菌的に生育させ たトマトの苗から切り取った子葉を、滅菌した外科用メスで水流下で0.5 −1.0c mの外植片に切断した。その後、形質転換に先立って、外植片をフィーダープレ ート上で８時間インキュベートした。 ６．１．９ トランスジェニック植物中でのGUS発現試験 トランスジェニック植物組織におけるGUS活性の組織化学的な分析を、公知の 標準的な方法で行った。ルーチン分析のために、植物の器官または組織切片を50 mMのリン酸緩衝液(pH7)および0.1%のTriton X-100中に１mMのX-glucを含む溶液 に沈めた。上記基 質の浸潤を、３ｘ１分の真空浸潤により促進させた。真空湿潤の量を、試験すべ き組織の厚みおよび固さに基づいて変えた。組織を４−12時間37°Ｃでインキュ ベートした。ついで、GUS染色の展開後、葉組織を普通にエタノールで処理し（ ２分間95％エタノールで煮沸または95％エタノールで終夜インキュベート）、葉 緑素を除去した。GUS活性はまた、無細胞抽出液中で、標準的手順(Jefferson，1 987年，Plant Mol．Biol．Rep．５巻:387-405頁)により蛍光基質MUGを用いてモ ニターした。GUS活性を、nmol MU/min/μｇタンパク質で表した。ここで、タン パク質量は、標準試料としてBSAを用いるBradford法(Pierce Coomassie Plus Pr otein Assay Reagent)により定量した。 ６．１．１０ HMG2プロモーター活性の細菌感染誘導 エルウィニア・カロトボラ ｓｓｐ．カロトボラ(Erwinia carotovora ssp．c arotovora)、EC14株、すなわち軟腐病の病原体の培養液５mlをLB培地中にて25° Ｃでシングルコロニーから終夜増殖させた。上記培養液を遠心分離し、１mlの蒸 留水に再懸濁した（OD600＝3.54−3.82）。HMG2：GUS構築物を有する温室で育て たトランスジェニックタバコの長さ６−８インチの葉を葉柄で切り取り、大きな ペトリ皿中に入れた水で湿らせた濾紙上に置いた。マイクロピペッターの先端用 いて、２μｌの蒸留水（模擬接種）またはEC14懸濁液を沈積しながら葉の最表層 をそっと傷つけた。プレートに蓋をし、密閉できる蓋のついたプラスチック容器 （たとえば、タッパーウェア）中に入れ、水をたっぷり含ませた紙タオルととも に並べて、暗室中にて28°Ｃでインキュベートした 。穴開けパンチまたはコルクーボーラーを用いて接種部位を取り囲む葉の切片を ２４時間間隔で切取って試料を入手し、上述したように組織化学的な分析のため に処理した。 ６．１．１１ HMG2プロモーター活性の真菌感染誘導 トランスジェニックタバコの種子を、30％の漂白剤中に浸漬して表面滅菌し、 滅菌水で４回すすぎ、４ｘ４インチのプラントコン(PlantCons，ICN Biomedical s，Inc，Irvine，CA)中に入れたオートクレーブ滅菌した鉢植え用ミックス(ProM ix BX; Premier Brands，Inc，Stamford，CT)にて発芽させた。真菌が寄生した カラスムギの種子を置いて上記苗の胚軸と接触させることにより、真菌を接種さ せた。リゾクトニア・ソラニ株RS51よびR992を、湿った滅菌カラスムギの種子中 に寒天プラグとして接種し、植物に接種する前に室温で８日間育てた。24時間の 間隔で、接種部位近くの苗の損傷を最小限に抑えるため葉同士の接触を制限すよ うに注意しながら苗を取り出し、水中に根を浸して洗って土を除去した。その後 、１−２インチの長さになった苗全体を上述したような組織化学的GUS定量のた めに処理した。寒天（１/10ｘＭＳ塩プラス１％寒天）上で生育させたトマトの 苗にも、プレートで生育させたリゾクトニア・ソラニの小さな寒天プラグを接種 した。この接種方法は、上記寒天培地が活発な真菌の増殖を支持するので、土で 生育させた苗の方法よりも効果的ではなかった。 ６．１．１２ HMG2プロモーター活性の線虫寄生誘導 トマト苗のT1世代を、４ｘ４インチのプラントコンに入れた種 子の発芽培地（１/10ｘＭＳ塩、および10mg/Lミオイノシトール、３gm/Lのショ 糖、６gm/Lの寒天）上で10日間生育させた。約2000匹の線虫(Melodigyne incogn itaまたはM．hapla)を上記培地上にのせた。その後、プラントコンを25°Ｃの生 育チャンバー中に置いた。接種後、１、２、３、５、および７日目に、上記寒天 からゆっくり苗を引っ張って抜き、根から寒天をそっと除去し、苗の頭頂部を清 潔に保って切断した。根をGUS発現のために組織化学的に分析した。 ６．１．１３ HMG2プロモーター活性の収穫後損傷誘導 約８インチの葉をHMG2：GUSおよび35S:GUSタバコ植物から除去し、カミソリの 刃で深く傷をつけた。各葉の切片を速やかに切り出し、秤量し、その後液体窒素 中にて凍結させ、−70°Ｃで保存した。別の切片を葉から切り出し、秤量して、 収穫の24時間および48時間後に凍結した。葉抽出物をMUG抽出緩衝液(Jefferson ，1987年，Plant Mol．Biol．Rep．５巻:387-405頁)中にてモーターと乳棒を用 いてすりつぶして得た。タンパク質濃度をBradford法にて定量した。MUGアッセ イをJeffersonの方法にしたがって行った（Jefferson，1987年，同上）；活性を nmol MU/min/μｇタンパク質で表した。 ６．１．１４ HMG2：GUS 遺伝子融合体を含むトランスジェニック植物の圃場 性能 高レベルの損傷誘導性HMG2：GUS活性を示す２つの栽培変種（XantiおよびNC− 95）各々の２つの独立した形質転換体の種子を 初期の圃場試験に使用した。35S:GUS構築物(SJL1911，図９)を有するトランスジ ェニックタバコの苗も育てて、対照として使用した。トランスジェニック苗を圃 場に移植するに先立って、約４週間温室で生育させた。試験Ｉには、バージニア (Virginia)州のブラックストーン(Blackstone)にあるバージニア テック サザ ン ピードメント アグリカルチュアル エキスペリメント ステーション(Vir ginia Tech Southern Piedment Agricultural Experiment Station)にて植えら れた（自動化プランター）300個の植物体（７つの遺伝子型）が含まれた。試験I Iには、バージニア州のブラックスバーグ(Blacksburg)にあるバージニア テッ ク(Virginia Tech)での実験計画でランダム化ブロックとして植えられた175個の 植物体（７つの遺伝子型）が含まれた。葉原料を生育期（上記植物の通常の摘花 直前およびその２週間後を含む）の様々な時点で採取し、基底HMG2プロモーター 活性の屋外レベルおよび導入遺伝子活性の収穫後誘導を測定した。天然の病原体 圧力（以下のものを含むが、これらに限られものではない；シスト線虫症、アブ ラムシ類、甲虫およびスズメガの幼虫による捕食、タバコモザイクウイルス）に 応答するHMG2:GUSの発現を、組織化学的分析によりモニターした。 ６．２ 結果 ６．２．１ HMG2プロモーター活性 HMG2発現の制御を描写するために、2.3kbのHMG2の上流配列を、プラスミドpSJ L330.1中のGUSリポーター遺伝子に融合し、アグロバクテリウム・ツメファシエ ンス(Agrobacterium tumefacie ns)が仲介する植物の形質転換に使用した。この構築物またはプラスミドpSJL191 1（図９；JOnathan Jones博士、John Innes Institute，Norwich，U.K．より提 供された）による形質転換で生成された35S:GUS対照構築物を１〜４コピー含む2 0を越える独立のGUSを発現するタバコ形質転換体得られた。上記35Ｓプロモータ ーは、カリフラワーモザイクウイルス(Benfeyら，1989年，EMBO J．８巻:2195 −2202頁;Fangら，1989年，Plant Cell １巻:141−150頁)由来の高レベルの構 成性植物プロモーターである。 ６．２．２ HMG2プロモーター活性の組織特異性 植物が発現する上記HMG2:GUS構築物は、HMG2発現の組織特異性を評価するため の強力な道具を提供する。GUS活性の組織化学的分析は、HMG2が苗の胚軸領域（ 土を貫通する苗条の領域）中、毛（昆虫、病原抵抗性にとって重要な葉表面の植 物の毛;Gershenzonら、1992年、Anal．Biochem．200巻:130−138頁）中、花粉中 （図10）にて、ストレスのかかっていない植物で発現される。これらの組織にお ける発現は、防御に関連し得るはずである。かなりの防御関連遺伝子が花粉中で 高まっていることが既に報告されている(Kononowicz，1992年，Plant Cell４巻: 513-524頁)。しかしながら、若いトマトの苗の一次根中における有意なレベルの GUS活性もまた、後に根が出る部位で観察された。この発現の重要性は現在のと ころ知られていない。GUS発現が根の頂端における細胞分裂の帯域ではGUSの発現 がまったく見られないため、それが細胞分裂に関連しているとは思われない。HM G2：GUS構築物の活性を、トランスジェニックトマト植０の成熟果実中におい ても定量した。成長期の様々な段階における果実を採取し、無細胞系抽出液中で GUS活性を試験し、あるいは組織化学的アッセイを用いて組織特異性を分析した 。未成熟の果実(0.5から1.5cm)は、HMG2：GUSの発現を示さなかった。しかしな がら、より大きな果実（３−５cm）、熟した緑色の果実（完全に成長しているが 、カロテノイドを含んでいない）、ブリーカー（breaker）果実（カロチン生成 （carotenogenesis）が進んでいる）および完全に熟した果実はGUS活性を示した 。組織化学的分析より、上記GUS活性は、本来成長している種および果実の脈管 構造中に局在していることが同定された。上記果実は、劇的な創傷誘導性HMG2： GUS活性を示した。HMG2：GUS活性はまた、タバコの種の莢の中にある成長してい る種に局在していた。 明確な制御回路が、誘導可能なHMG2発現対成長を制御するHMG2発現を仲介する 可能性がある。未成熟の花における別の（雄性配偶体を産生する器官）成長の期 間に、創傷は高レベルのGUSを誘導したが、未成熟の花粉は活性を示さなかった 。花粉が成熟すると、上記花粉はGUSを発現するが、約はもはや創傷誘導性活性 を示さない。 ６．２．３ HMG2プロモーターの防御関連活性 切断または押しつぶしによる創傷は、１−12時間以内に生じる速やかなGUS活 性の上昇の引きがねとなった。この反応は、タバコの成熟した約（既に議論した ）を除いて、試験したすべての組織で見られた。HMG2:GUS構築物の著しい創傷誘 導性活性化を示す組織には、タバコとトマトの苗の根、胚軸、および葉；成熟し た タバコとトマト植物の根、茎、葉柄、小花柄、広がっている葉のすべての領域お よび成熟した葉、成長している果実および莢、成熟した果実および莢、そして花 弁が含まれるが、これらに限定されるものではない。 苗または切断した葉に和合性の細菌性病原体を接種すると、特異的なHMG2:GUS の発現を引起し、細菌性病変を直接取り囲んでいる細胞に局在させる。この応答 は、図11のパネルＡに示したように、接種後24時間（モニターされた最も早い時 間）で有意であった。真菌の病原体、リゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solan i)もまた、接種されたタバコおよびトマトの苗のいずれにおいてもHMG2:GUS活性 の劇的な上昇を引き起こした（図11のパネルＢ）。これら大きく異なる微生物病 原体が、いずれも非常によく似たHMG2活性化という事件の引き金となるため、他 の細菌性または真菌性の病原体が同様の応答を生じさせることがあり得る。リゾ クトニアの感染期間の後期には、真菌は植物の脈管系に蔓延しこれら組織におけ る有意なHMG2:GUS活性と関連していた。このことは、HMG2の防御−活性化特性が 脈管の病原体（例えば、立枯れ病誘導病原体）にも同様に働くことを示唆するも のである。 ６．２．４ HMG2プロモーターの線虫活性 GUSに融合された2.3kbのHMG2プロモーターを含むトランスジェニック植物を、 線虫を接種した後にのGUSについて分析した。無菌的に寒天培地上で発芽させた トマトの苗を、根瘤病の原因病原体であるメロイドーニ・インコグニータ(Meloi dogyne incognita)またはＭ．ハプラ(M.hapla)のいずれかの第二期幼生を加え ることにより接種した。トランスジェニック品種は、両方の種に感受性であった 。幼生の接種前および幼生を付加した後の様々なときに、根を除去し、組織化学 的にGUS活性をアッセイし、フクシン酸を用いて線虫を染色した。接種していな い根、および移植後24時間および48時間経過後の根は、根の根端（線虫がつく部 位）上ではGUS活性を示さなかった。しかし、側根派生帯および茎が除去された 上記創傷部位では明確に示された。接種して24時間後および48時間後において、 幼生を含む根はGUS活性の兆候を全く示さないことが観察された（図12、パネル Ａ）。接種後72時間までには、いくつかの根が、（茎に向かって）幼生に近接す る細抱および最も近い細胞において低レベルのGUS活性を示した（図１２、パネ ルＢ）。接種後５日までに、摂食を開始した線虫（線虫の形態における変化で特 徴づけられる）の周囲で高レベルのGUS活性が明らかになった。５〜７日までに 、感染した根の先端は目に見えて腫れ上がった。これは、非常に高レベルのGUS が発現して組織が瘤になったためである（図12、パネルＣ、ＤおよびＥ）。M．i ncognitaおよびM．haplaに対する応答には、有意な相違はなかった。多数の根お よび植物試料の観察から、HMG2活性化の始まりは、摂食行動の確立と非常に関連 があることが示唆された。このことは、このプロモーターを線虫の成長に毒性を 示すかまたはその成長を阻害する導入遺伝子タンパク質の発現を促すために利用 することが、病気の進行に有意に影響を与えるであろうということが示唆された 。時間的なまたは空間的な発現パターンは、いずれも殺線虫性または線虫抑制剤 を速やかに、かつ非常に局在した場所に移送するために適している。 ６．２．５ HMG2プロモーターの天然捕食者による活性化 圃場で生育したトランスジェニックタバコ植物の自然の補食に対するHMG2:GUS 発現を試験した。昆虫または微生物の損傷によって局在する壊死周辺部位の葉の 切片を切り取り、HMG2:GUSの局在された発現を試験した。損傷を受けていない葉 組織はGUS活性を示さなかった。しかしながら、損傷に極めて近接する周辺領域 では、強いGUS染色が示された（図11、パネルＣ）。トランスジェニックタバコ 植物は、自然の線虫感染に対するHMG2応答を評価するために、タバコシスト線虫 (Globodera tobacum ssp．solanaceara)によって葉の疾病を非常に起こしやすい ことで知られるバージニア州のブラックストーンで圃場に植えられた。 ６．２．６ HMG2プロモーターの解剖 防御特異的発現および組織特異的発現を仲介する要素を局在化するために、一 連の5'プロモーター欠失を生成するための努力が払われた。HMG2プロモーターの 中央部分には、図５に示したように、この領域を通るエキソヌクレアーゼ消化を 妨げると思われる幾つかのＡＴの連続部分がある。エキソヌクレアーゼを用いて 繰り返し行った試みが不首尾に終わった後、PCRに基づく別の戦略を用いて、HMG 2プロモーターの欠失を生成した（図７参照）。これら切断型プロモーターを植 物の発現プラスミドであるpBI101(clontech)のレポーター遺伝子に融合し、タバ コに導入した。−981から＋110までのプロモーター領域は、創傷及び微生物病原 体応答の両方並びに糸状体および花粉の発現の両方をも与えた（表 ４）。しかしながら、多数の別個の形質転換されたタバコ植物の分析から、この プロモーターによって促される導入遺伝子の発現レベルは、より大きなプロモー ター（例えば-2.3kbまで）またはより小さなプロモーター（例えば-347bpまで） でなされるよりも低いことが示唆された。このことは、この領域に「サイレンサ ー」が含まれており、そして891の上流域に別のエンハンサー型の要素が含まれ ているのかもしれないということを示唆する。HMG2の上流にある転写開始部位の 58bpのみを含む構築物を含めて、すべての欠失は、花粉中における導入遺伝子の 発現を促すものであり、成長の制御が防御と関連する制御と区別されることを示 唆する。 ６．２．７ HMG2シス調節要素 HMG2プロモーター内にある特異的シス調節要素を、機能分析およびＤＮＡ−タ ンパク相互作用に基づいて同定した。例えば、塩基-58と-347との間の領域には 、強い創傷および病原性誘導を指揮する１またはそれ以上の要素が含まれる。上 記-58から-347までの断片は、プライマー21とプライマー19に相補的なプライマ ーとを用いてPCRにより生成した（図４参照）。この領域の範囲内にある配列に 基づいて合成された他の3'および5'オリゴヌクレオチドプライマーは、調節活性 の分析のためのサブフラグメントを生成するだろう。機能分析は、これらの断片 を最小の35Ｓプロモーター（５．２節および５．３節で議論した）などのレポー ター遺伝子に融合した適当な「最小の」植物プロモーターへの融合、得られた構 築物の植物または植物細胞中への導入および発現を必要とする。十分に機能する HMG2シス調節要素を含んでいる領域は、創傷誘導、病原性誘導、害虫誘導、エリ シター誘導性により、またはGUS発現のHMG2配列依存的成長パターンの生成によ り決定されるようなこの最小プロモーター上のHMG2−特異的調節を与える。特異 的シス調節要素をさらに、ゲルシフトまたはフットプリント／ＤＮａｓｅ感受性 アッセイで描写した。PCR増幅によって生成された−58から−347断片、または他 のHMG2プロモーター断片を、対照からの核抽出液よび防御エリシター細胞ととも にインキュベートした。例えば、核を、未処理のトマト懸濁培養細胞(Elliotら 、1985年、Plant Cell １巻:681−690頁)、および真菌のエリシターまたはアラ キドン酸で処理して、６−８時間の後 の細胞から単離した(Park，1990年，Lycopersican esculentum Mill.，Ph．D．D issertion，Virginia Polytechnic Institute and State University; Yangら、 1991年，Plant Cell ３巻:397−405頁)。ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお ける減少した移動度に基づいて、またはDNaseIで消化し、シーケンスゲル上のDN ase −非感受性の領域を分析をすることにより、核成分と相互作用するPCR断片 を同定した。防御応答要素は、対照対エリシター処理抽出液との相互作用におけ る異なるパターンを示すかもしれず、示さないかもしれない。ＤＮＡ−タンパク 質相互作用を有するとして同定されたプロモーター領域を、さらに、例えば「最 小の」３５Ｓプロモーターとともにキメラ構築物をつくることにより試験し、ト ランスジェニック植物または植物細胞中の異種遺伝子発現におけるシス調節要素 の効果を測定した。この戦略は、特異的HMG2プロモーター機能（例えば、病原体 の導入による創傷、または成長調節からの防御）を分離し、そして別のHMG2プロ モーター要素あるいは新規なHMG2プロモーター要素を描写するかもしれない。 ６．２．８ 線虫抵抗性植物開発へのHMG2プロモーターの使用 本発明の他の重要な用途は、線虫抵抗性植物の開発である。このような抵抗性 植物は、HMG2プロモーターを用いることにより開発され、線虫に対して毒性であ るか、または阻害的である異種遺伝子、あるいはその産物が線虫に対して毒性で あるか、または阻害的である異種遺伝子の発現が制御される。この目的のために HM G2発現系を用いる上で鍵となる利点は、１）異種遺伝子産物は、病気に関連する ストレスを被っている組織に本質的に限られるであろうということ、そして２） 異種遺伝子は上記組織の移入により強力に活性化されるであろうということであ り、かくして線虫に有意な「供与量」をもたらす。 ジャガイモ プロテイナーゼ インヒビター ＩまたはIIのコード領域(Johns onら、1989年，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86巻:9871 −9875頁)を適当な制 限酵素で切り出し、植物発現ベクター中の、HMG2プロモーターまたはHMG2プロモ ーターの活性シス調節要素を含んでいるキメラプロモーターの下流に挿入した。 適当な酵素部位またはリンカー断片を、転写および翻訳開始部位を有するコード 領域の正確な位置を確認するために用いた。上記プラスミドpDW202（図７）をSm aIおよびSstIで消化し、ゲル精製し、切り出されたGUSコード領域を含んでいる 断片とは別に上記ベクター／HMG2プロモーター断片を得た。その後、適当に消化 されそして処理されたジャガイモ プロテイナーゼ インヒビターＩ遺伝子をSm aI/SstI部位にライゲートした。得られたプラスミドで大腸菌DH5α株を形質転換 し、三親交配によってAgrobacterium LBA4404株に導入する前に、シーケンスし て挿入および方向が正確がどうかを確認した。その後、遺伝子操作されたLBA440 4をタバコ葉ディスク共存培養に使用し、そして形質転換されたタバコを続いて 成熟植物に再生した。 ジャガイモ プロテイナーゼ インヒビター Ｉのトランスジェニック植物中 における酵素的あるいは免疫的検出は、上述の方法を用いて行った(Johnsonら、 1989年，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 86巻:9871 −9875頁)。植物：線虫の相互作用における導入されたHMG2：プ ロテイナーゼ インヒビター構築物の効果を、移植された苗、例えば、根瘤(Mel oidogyne incognita，M.halpa)またはシスト(Globodera tobacum)線虫で試験す るか、あるいは公知の疾病の圧力がある圃場で苗を植えて試験した。植物は、全 体の健康状態、摂食している雌の線虫数、腫れの数および重篤度、そして線虫の 卵の産卵数でモニターした。 別の戦略においては、HMG2プロモーターが促進したアンチセンスＲＮＡの発現 を、寄生的な線虫に必要とされる植物化合物の生産を止めるために使用してもよ い。例えば、根瘤およびシスト線虫は成長と再生産のために植物ステロールに依 存する。かくして、トマトHMG1（ステロール特異的）同質遺伝子（例えば、HMG1 には特異的であるが、他のHMGR同質遺伝子には特異的でないＮ−末端を有する領 域）、あるいはトマト スクアレン合成酵素遺伝子を、上記SmaI/SscI消化ベク ター中に導入し、相補的なＲＮＡ鎖を産生させるようにする。トランスジェニッ クトマト中におけるこれらの遺伝子構築物が発現することにより、植物細胞にお けるステロール産生が減少したり、止まったりする。ここで、HMG2プロモーター は活性であり、そしてこうして線虫の増殖および成長が減少するか、妨げられる 。 ７．０ 実施例：興味のある遺伝子に操作可能に連結されたトマトHMG2を含む 発現構築物を用いる収穫後の生産 収穫された植物組織および培養物における所望の遺伝子産物の収穫後の産生は 、導入された遺伝子の発現についてコンピテント 性を維持するための収穫された物質の能力に依存する。十分であった。以下に記 載する実験により、採取された葉組織におけるこうした能力が証明された。さら に、収穫された葉において、HMG2プロモーター活性は、頻用される構造的なCaMV 35 プロモーターのそれよりも優れていた。 これらの実験において使用された植物は、HMG2:GUSまたはCaMv35S:GUSで形質 転換した上記６．２．１節に記載のタバコ植物から得られたものである。 ７．１ 収穫後の生産においてはHMG2プロモーターがCaMV35Sプロモーターよ りも優れている 特異的導入遺伝子、β−グルクロニダーゼ（GUS）の収量を、HMG2:GUS構築物 を含んでいるトランスジェニック植物対35S:GUS構築物を含んでいるそれらとの ために比較した。カリフラワーモザイクウイルスからの上記３５Ｓプロモーター は、多くの組織中で高レベルの導入遺伝子発現を示すため、トランスジェニック 植物研究において広く使用されている(Benfeyら、1989年，EMBO J． ８巻:2195 −2202頁)。葉の材料は、温室で育てた植物から採取し、かみそりの刃で刻み目 をつけて傷をつけた。GUS活性用に、組織を採取／傷をつけた直後、乾燥を防ぐ ためにファスナー付きの袋に入れて室温で24時間および48時間保存した後に抽出 した。図13に示したように、35S:GUS構築物を含む葉は、収穫後24時間以内にGUS 活性を50％以上失うことが示された。高い価値のタンパク質を生物学的に生産す るためのトランスジェニックタバコの産業上の有用性にとっては、この損失は非 常に重要である。 対照的に、HMG2:GUS構築物は採取直後には活性は低かったが、48時間までには、 保存前の35S:GUSレベルに匹敵する創傷誘導導入遺伝子産物の蓄積を示した。価 値ある産物をコードしている異種遺伝子を有しているトランスジェニック植物、 例えば、HMG2プロモーターに融合合された薬学的な価値を有するヒトの治療用タ ンパク質は、トランスジェニック植物（例えばタバコ）の成長サイクル全体を通 じて、比較的低いレベルで発現されるはずである。こうして、導入遺伝子の発現 は、バイオマスの収量に影響をを与えそうもない。最適なバイオマスの産生には 、上記植物を収穫し（例えば、刈り取りによって）、そして上記葉材料を実験室 または処理装置に移す。HMG2が促進する異種遺伝子発現は、機械的な傷つけまた は傷つけプラス化学的処理またはエリシター処理によって引き金となり、そして 上記導入遺伝子産物をその後、さらに蓄積して処理するために回収した。産物の 蓄積の時間的範囲は、一般には、採取と導入との間の時間および条件、特異的異 種遺伝子産物の安定性に依存し、24ないし72時間であるが、これらの範囲内に限 定されるものではない。 植物の成長または勢いに有害である異種遺伝子産物の産生または高レベルの蓄 積は、HMG2プロモーターの収穫後誘導特性を利用することによっても同様に生じ させることができる。非常に毒性の強い産物にとっては、上記プロモーターをさ らに詳細に分析し、成長における発現を最小限にすることが、創傷とエリシター 誘導応答を保持することを除いて有利である。プロモーターの欠失分析（表４） は、多数のシス調節要素が上記プロモーター中に存在することを示唆し、そして 発達上の機能（例えば、花粉）は、 防御特異的機能（例えば、創傷、病原性応答）から切り離すことが可能である。 これらの分析は、上記創傷よび病原性応答要素が花粉の発現を仲介するこれらの 要素に遠位にあることを示唆した。 ７．２ 収穫された植物組織は誘導可能な遺伝子の発現を維持する 目的の遺伝子産物の収穫後生産の有用性は、幾分かは、収穫後のある時間にわ たって誘導可能な遺伝子発現を維持する植物組織または培養物の能力によるもの である。このような能力は、収穫直後に植物の組織または培養物を誘導しかつ加 工処理することが常に実際的であるとは限らないので、本発明の方法は大いに産 業上有用であることを意味している。例えば、収穫した材料は誘導または加工処 理のために遠隔地に輸送する必要がるかもしれない。 HMG2:GUS構築物で遺伝子操作された成長したタバコの葉を収穫し、収穫直後ま たは密封した容器内で４°Ｃで２週間後貯蔵後に誘導した。図14に示した結果か ら、保存された葉はHMG2:GUS構築物の誘導された発現にとって適切であったばか りでなく、実際に、収穫したての葉よりも約40−50％以上高い活性を発現するこ とがわかる。図14はまた、誘導された遺伝子産物の発現を可能とするためには、 誘導された物質が、室温で多少のインキュベーション時間、最長48時間までを必 要とすることを示した。 図15は、収穫された葉が４°Ｃで密閉容器または室温で空気透過性のある容器 に６週間まで保存することができること、そして 誘導遺伝子の発現に関して、収穫直後の材料と等しい能力を未だ有することを示 した。 本発明についてそれらの特定の実施態様を参照しつつ詳細に説明したが、機能 的に等しい改変が本発明の範囲内において可能であることが理解されるであろう 。実際、ここで示され記載された発明の実施態様に加えて、様々な改良があるこ とは、上述の発明の詳細な説明および添付図面より当業者においては明らかにな るであろう。このような改良は、添付の請求の範囲内に含まれるものである。 様々な刊行物をここで引用したが、それらの開示内容は、そのまま、参考とし てここに組み入れられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ (72)発明者 ウェイッセンボーン，デボラ エル. アメリカ合衆国 24060 バージニア州 ブラックスバーグ，ホワイトホーン ロー ド 5091番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．HMG2プロモーター要素またはその機能性部分を含む組換えＤＮＡ分子。 ２．HMG2プロモーター要素がトマトHMG2プロモーターまたはトマトHMG2プロモー ターと選択的にハイブリダイズする配列である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ 分子。 ３．HMG2プロモーター要素がpDW101の約2.3kbのEcoRI-BglII制限断片、該断片の 機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである、 請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ４．HMG2プロモーター要素がpDW201の約0.17kbのHindIII-BamHI制限断片、該断 片の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものであ る、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ５．HMG2プロモーター要素がpDW202の約0.46kbのHindIII-BamHI制限断片、該断 片の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものであ る、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．HMG2プロモーター要素がpDW203の約1.0kbのHindIII-BamHI制限断片、該断片 の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである 、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。 ７．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れたHMG2プロモーター要素またはその機能性部分を 含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記のHMG2プロモーター要素の制御下にある 、遺伝子融合体。 ８．HMG2プロモーター要素がトマトHMG2プロモーターまたはトマトHMG2プロモー ターと選択的にハイブリダイズする配列である、請求項７に記載の遺伝子融合体 。 ９．HMG2プロモーター要素がpDW101の約2.3kbのEcoRI-BglII制限断片、該断片の 機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである、 請求項７に記載の遺伝子融合体。 10．HMG2プロモーター要素がpDW201の約0.17kbのHindIII-BamHI制限断片、該断 片の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものであ る、請求項７に記載の遺伝子融合体。 11．HMG2プロモーター要素がpDW202の約0.46kbのHindIII-BamHI制限断片、該断 片の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものであ る、請求項７に記載の遺伝子融合体。 12．HMG2プロモーター要素がpDW203の約1.0kbのHindIII-BamHI制限断片、該断片 の機能性部分または該断片と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである 、請求項７に記載の遺伝子融合体。 13．HMG2プロモーターのシス調節要素を含む配列に連結された植物プロモーター または末端切断型プロモーターを含んでなるキメラプロモーターであって、 ｉ）末端切断型プロモーターが上記のHMG2プロモーターに由来するものでは なく、 ii）上記の配列が末端切断型プロモーターの5'上流側または植 物プロモーターの調節領域内に連結されており、そして iii）キメラプロモーターの転写活性が上記の配列によって調節されるもの である、 ことを特徴とするキメラプロモーター。 14．HMG2プロモーターがトマトHMG2プロモーターである、請求項13に記載のキメ ラプロモーター。 15．シス調節要素を含む配列が図４に示したヌクレオチド残基番号-35から-1,03 6までのトマトHMG2プロモーター配列、該配列の一部、または図４に示した該配 列と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである、請求項13に記載のキメ ラプロモーター。 16．シス調節要素を含む配列が図５に示した480bpのトマトHMG2プロモーター配 列、該配列の一部、または図５に示した該配列と選択的にハイブリダイズする配 列を含むものである、請求項13に記載のキメラプロモーター。 17．シス調節要素を含む配列が図６に示した515bp配列、該配列の一部、または 図６に示した該配列と選択的にハイブリダイズする配列を含むものである、請求 項13に記載のキメラプロモーター。 18．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れた請求項13のキメラプロモーターを含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記の キメラプロモーターの制御下にある、遺伝子融合体。 19．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れた請求項14のキメラプロモーターを含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記の キメラプロモーターの制御下にある、遺伝子融合体。 20．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れた請求項15のキメラプロモーターを含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記の キメラプロモーターの制御下にある、遺伝子融合体。 21．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れた請求項16のキメラプロモーターを含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記の キメラプロモーターの制御下にある、遺伝子融合体。 22．異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結さ れた請求項17のキメラプロモーターを含んでなり、該異種遺伝子の転写が上記の キメラプロモーターの制御下にある、遺伝子融合体。 23．請求項７〜12および18〜22のいずれかに記載の遺伝子融合体を含む組換えＤ ＮＡベクター。 24．植物細胞が請求項７〜12および18〜22のいずれかに記載の遺伝子融合体を含 むものである、植物細胞培養物。 25．請求項７〜12および18〜22のいずれかに記載の遺伝子融合体を含んでなる植 物。 26．植物細胞培養物において異種遺伝子によりコードされる産物を生産する方法 であって、請求項24の植物細胞培養物を培養し、損傷させるかまたはエリシター で処理することにより形質転換植物細胞内での遺伝子融合体の発現を誘導し、そ して発現された異種遺伝子産物を形質転換植物細胞から回収することを含んでな る方法。 27．植物において異種遺伝子によりコードされる産物を生産する方 法であって、請求項25の植物を生育させ、植物内での遺伝子融合体の発現を損傷 、エリシター処理、病原体感染または害虫侵入により誘導し、そして使用のため にまたは発現された異種遺伝子産物を植物から抽出するために植物原料を加工処 理することを含んでなる方法。 28．植物を収穫する直前、途中または直後に遺伝子融合体の発現を誘導する、請 求項27に記載の方法。 29．上記遺伝子融合体の異種遺伝子が微生物疾病耐性遺伝子をコードしており、 そして上記の植物がHMG2プロモーター要素またはHMG2シス調節要素を含むキメラ プロモーターの制御下にある該耐性遺伝子の発現ゆえに微生物疾病に対して耐性 である、請求項25に記載の植物。 30．上記遺伝子融合体の異種遺伝子が害虫耐性遺伝子をコードしており、そして 上記の植物がHMG2プロモーター要素またはHMG2シス調節要素を含むキメラプロモ ーターの制御下にある該耐性遺伝子の発現ゆえに植物害虫に対して耐性である、 請求項25に記載の植物。 31．植物細胞において異種遺伝子によりコードされる産物を生産する方法であっ て、 a)異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結 された誘導プロモーター要素またはその機能性部分を含んでなる発現ベクターを 構築し（ここで、該誘導プロモーター要素または該要素の機能性部分は該異種遺 伝子配列の転写を制御するものである）、 b)該発現ベクターにより植物細胞を遺伝子工学的に操作し、 c)操作した植物細胞を培養し、 d)操作した植物細胞を収穫し、 e)該異種遺伝子の発現を誘導し、そして f)発現された異種遺伝子産物を該植物細胞から回収する、 ことを含んでなる方法。 32．収穫した植物組織において異種遺伝子によりコードされる産物を生産する方 法であって、 a)異種遺伝子をコードする第二のヌクレオチド配列に機能しうる状態で連結 された誘導プロモーター要素またはその機能性部分を含んでなる発現ベクターを 構築し（ここで、該誘導プロモーター要素または該要素の機能性部分は該異種遺 伝子配列の転写を制御するものである）、 b)該発現ベクターにより植物を遺伝子工学的に操作し、 c)操作した植物を栽培し、 d)操作した植物から組織を収穫し、 e)該異種遺伝子の発現を誘導し、そして f)発現された異種遺伝子産物を該植物から回収する、 ことを含んでなる方法。 33．上記の誘導プロモーター要素がHMG2プロモーターである、請求項31または32 に記載の方法。 34．上記の誘導プロモーターがトマトHMG2プロモーターまたはトマトHMG2プロモ ーターの相同体である、請求項33に記載の方法。 35．損傷させるかまたはエリシターで処理することにより上記の異種遺伝子の発 現を誘導する、請求項33に記載の方法。 36．損傷させるかまたはエリシターで処理することにより上記の異 種遺伝子の発現を誘導する、請求項34に記載の方法。 37．収穫した組織が葉、茎、根、花、種子または果実である、請求項32に記載の 方法。 38．収穫した組織が葉である、請求項37に記載の方法。
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