JP2002540793A

JP2002540793A - 病原体誘導性プロモーター

Info

Publication number: JP2002540793A
Application number: JP2000609577A
Authority: JP
Inventors: レオシェールドメルヘルス，; ジェロームフベルティーナヘンリクスフィクトルクステルス，
Original assignee: シンジェンタモーヘンビー．ブイ．
Priority date: 1999-04-02
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2002-12-03
Also published as: EP1165794A1; WO2000060086A1; AR023258A1; CA2365413A1; AU4396400A; EP1041148A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａより単離された病原体誘導性プロモーターを記載する。また記載されるのは、キメラ構築物であり、この病原体誘導性プロモーターは、抗病原性タンパク質の発現または敏感な応答を誘発し得るタンパク質の発現を駆動する。本発明者らはまた、植物に再導入される際に、ＤＮＡ配列に関連する病原体誘導性の転写を促進し得、そしてその植物は配列番号６の４２１〜１４２４のヌクレオチド配列、または配列番号１４に示されるその相補的な配列あるいはこれらの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするその一部または改変体を含むことを特徴とする、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａより得られるＤＮＡフラグメントに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、特に植物生物工学の分野における病原体誘導性プロモーターおよび
このプロモーターを含むキメラＤＮＡ配列の分野に関する。

【０００２】（背景技術）誘導性プロモーターは、インデューサーへの曝露に応答して、所定の遺伝子に
より生成される遺伝子産物の量を増大させうる任意のプロモーターを含む。イン
デューサーの非存在下では、ＤＮＡ配列は転写されない。代表的には、誘導性プ
ロモーターに特異的に結合して転写を活性化させる因子は、不活性形態で存在し
、次いで、これは、インデューサーによる活性形態へ直接的または間接的に変換
される。このインデューサーは、タンパク質、代謝産物（糖、アルコールなど）
、増殖レギュレーター、除草剤もしくはフェノール化合物のような化学的薬剤ま
たは物理的ストレス（熱、塩、創傷、毒性物質などにより直接的に、またはウイ
ルスのような病原体もしくは因子の作用を介して間接的に課される）であり得る
。誘導性プロモーターを含む植物細胞は、例えば、噴霧、給水（ｗａｔｅｒｉｎ
ｇ）、加熱または類似の方法により細胞にインデューサーを外部から適用するこ
とによりインデューサーに曝される。誘導性プロモーターは、当業者に公知であ
り、そしていくつかは、おそらく本発明の遺伝子の発現を駆動するために使用さ
れうる。誘導性プロモーターの例としては、以下が挙げられる：Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの誘導性７０ｋＤ熱ショックプロモーター（
Ｆｒｅｅｌｉｎｇ，Ｍ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９，２９７−３２
３）およびエタノールにより誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼプロモータ
ー（Ｎａｇａｏ，Ｒ．Ｔ．ら，Ｍｉｆｌｉｎ，Ｂ．Ｊ．（編）ＯｘｆｏｒｄＳ
ｕｒｖｅｙｓｏｆＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌＢ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３．，３８４−４３８頁，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐ
ｒｅｓｓ，１９８６）。単一の化学物質により誘導されるプロモーターの例は、
ＷＯ９０／０８８２６，ＷＯ９３／２１３３４、ＷＯ９３／０３１２９４および
ＷＯ９６／３７６０９に記載されるプロモーターである。

【０００３】誘導性プロモーターの重要なサブクラスは、植物において病原体感染の際に誘
導されるプロモーターである。病原体誘導性プロモーターの例として、ジャガイ
モから得られ得るＰＲＰ１プロモーター（ｇｓｔ１プロモーターとも名付けられ
た）（Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｎ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６
３，１７９−１８６）、Ｆｉｓ１プロモーター（ＷＯ９６／３４９４９）、Ｂｅ
ｔｖ１プロモーター（Ｓｗｏｂｏｄａ，Ｉ．ら，Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌａ
ｎｄＥｎｖ．１８，８６５−８７４，１９９５）、Ｖｓｔ１プロモーター（Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆＨｏｈｅｎ
ｈｅｉｍ，１９９４；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．ら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３４，４１７−４２６，１９９７）、セスキテルペンシクラーゼプロモータ
ー（Ｙｉｎ，Ｓ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１５，４３７−４５１，
１９９７）およびｇｓｔＡ１プロモーター（Ｍａｕｃｈ，Ｆ．およびＤｕｂｌｅ
ｒ，Ｒ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２，１１９３−１２０１，１９９
３）が言及され得る。これらのプロモーターうちのいくつかについての欠点は、
それが構成的にも活性であるか、またはそれらが病原体の特定の型に反応しない
ことである。さらに、病原体感染後すぐに（すなわち、可能な限り短い誘導時間
で）発現を調節するプロモーターを有することは有利である。

【０００４】従って、先行技術の欠点を克服する病原体誘導性であるプロモーターが未だに
必要である。

【０００５】（発明の要旨）本発明者らは、今やＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａから得られ、
植物に再導入された場合に、関連するＤＮＡ配列の病原体誘導性転写を促進し得
るＤＮＡフラグメントを見出した。このＤＮＡフラグメントは、配列番号６の４
２１〜１４２４のヌクレオチド配列または配列番号１４に示されるようなその相
補配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列にハイブリダイズする
それらの部分もしくは改変体を含むことを特徴とする。

【０００６】好ましくは、このヌクレオチドは、配列番号６の２２２〜１４２４のヌクレオ
チド配列、またはその相補配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配
列に結合するそれらの部分もしくは改変体を含む。そしてより好ましくは、この
ヌクレオチドは、配列番号６に示される１〜１４２４のヌクレオチド配列、また
はその相補配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列に結合するそ
の部分もしくは改変体を含む。

【０００７】本発明の実施形態は、転写の方向で、上記のＤＮＡフラグメントのいずれか１
つに従うＤＮＡフラグメントおよびその転写制御下で発現され、そして天然には
上記ＤＮＡフラグメントの転写制御下にないＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ配列
である。

【０００８】好ましい実施形態は、発現されるＤＮＡ配列が抗病原性タンパク質の生成を引
き起こすこのようなキメラＤＮＡ配列である。この抗病原性タンパク質は、好ま
しくは、以下からなる群より選択される：キチナーゼ、グルカナーゼ、オスモチ
ン、マゲイニン、レクチン、ヘキソースオキシダーゼのようなサッカリドオキシ
ダーゼ、オキサレートオキシダーゼ、オキサレートデカルボキシラーゼ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の毒素、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊｏ
ｌａｐａ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｓｉ
ｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃｎｉｃｕｓ、Ｌａｔｈ
ｙｒｕｓ、Ｃｌｉｔｏｒｉａ、Ａｌｌｉｕｍ種子、ＡｒａｌｉａおよびＩｍｐａ
ｔｉｅｎｓから単離された抗真菌タンパク質、ならびにアルブミン型タンパク質
（例えば、チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎｅ）、ナピン（ｎａｐｉｎ）、オオムギト
リプシンインヒビター、穀類グリアジンおよびコムギ−α−アミラーゼ）。

【０００９】本発明のキメラＤＮＡタンパク質の別の実施形態は、発現されるＤＮＡ配列が
タンパク質の生成を引き起こすキメラＤＮＡ配列である。このタンパク質は、高
感受性応答を誘導し得、好ましくは、以下からなる群より選択される：トマト由
来のＣｆ、Ｂｓ３およびＰｒｆタンパク質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌ
ｉａｎａ由来のＲｐｍ１およびＲｐｓ２、タバコ由来のＮタンパク質、Ｃｌａｄ
ｏｓｐｏｒｉｕｍｆｌｕｖｕｍ由来のａｖｒタンパク質、Ｅｒｗｉｎｉａ由来
のハルピン（ｈａｒｐｉｎ）ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓもしくはＸａｎｔ
ｈｏｍｏｎａｓ由来の（ａｖｒＢｓ３、ａｖｒＲｐｍ１、ａｖｒＲｐｔ２由来の
）エリシタータンパク質。

【００１０】本発明のさらなる一部は、上記のキメラＤＮＡ配列を含むレプリコンである。
このキメラＤＮＡ配列は、好ましくは、上記ＤＮＡフラグメントの制御下で発現
されるＤＮＡ配列を挿入するための制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１つの
認識部位を有する。

【００１１】このようなレプリコンを含む微生物、上記に従うキメラＤＮＡ配列がゲノム中
に組み込まれた植物細胞、および本質的に上記の細胞からなる植物もまた、本発
明に含まれる。このような植物は、好ましくは、双子葉植物である。種子、花、
塊茎、根部、葉部、果実、花粉および材（ｗｏｏｄ）から選択される上記植物の
一部もまた、本発明の一部を形成する。

【００１２】本発明のなお別の実施形態は、植物における病原体誘導転写を促進しうるホモ
ログを同定するための、上記のＤＮＡフラグメントの使用に関する。

【００１３】さらに、植物を形質転換するための本発明に従うキメラＤＮＡ配列の使用およ
びハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製するための本発明に従うＤＮＡフラグメン
トの部分もしくは改変体の使用は、本発明の一部である。

【００１４】本発明の別の目的は、植物に病原体耐性を付与するための、上記のキメラＤＮ
Ａ配列の使用である。

【００１５】（発明の詳細な説明）本発明の主要な局面は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａに天然に
存在する調節配列である。病原体感染の際に、調節配列の調節制御下の遺伝子は
、高度に発現されることが見出された。このことは、病原体誘導性であることを
示している。病原体誘導性プロモーターは、生物工学的耐性操作において非常に
価値がある。

【００１６】以下の実施例４において単離されるような調節配列のゲノム環境は、最近利用
可能になった（ＬｉｎＸ．ら、ＥＭＢＬ登録番号ＡＣ００９３２６、１９９９
年８月１７日）。実施例４において見出され、そして実施例５においてｕｉｄＡ
オープンリーディングフレームの前にクローニングされるような配列は、約３８
３アミノ酸の推定上のセリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードし、そし
てそのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が配列番号１０（または配列番
号１２）で与えられる、オープンリーディングフレーム（ＭＺＢ１０．４と指定
される）の前で、インサイチュでの逆の配向において、使用される。このタンパ
ク質またはその変異形態の過剰発現は、植物において増強された病原体抵抗性を
導くことが、予測される。

【００１７】タンパク質は、いくつかの作用によって、その抗病原体機能を生じさせ得る。
まず第一に、このタンパク質自体が、病原体の増殖またはその再生を遅延または
妨害する機能を有し、これによって感染を遅延または停止させることが、可能で
ある。推定される機能は、ここで、病原体の生理学または病原体の生殖周期の阻
害を妨害し得る。第二の可能な機能は、このタンパク質が、植物における病原体
防御をもたらすカスケードに参加することであり得る。病原体防御の特定の形態
は、過敏性の応答（ＨＲ）である。これは、病原体から生じるエリシター分子の
認識で開始し、そして植物細胞における多数の酵素的反応によって、その細胞の
アポトーシスを最終的に引き起こす事象の、カスケードである。このカスケード
の間にまた、植物のさらなる防御機構が開始に切り替えられ、これによってこの
植物は、広い範囲の抗病原体化合物を産生する。タンパク質の第三の可能な機能
は、病原体により産生される毒素の無毒化に存在し得る。これは、死んだ組織を
摂食するネクロトロフィック（ｎｅｃｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）病原体に関して最も
重要である。次いで、無毒化は、細胞の生存をもたらし、従って病原体に対する
材料の供給を低減する。

【００１８】病原体感染による誘導性がプロモーターの配向により影響を受けないことがま
た、確立された。実験項において、本発明のプロモーターにより本質的に調節さ
れるプロテインキナーゼの発現が、病原体感染の際に誘導されることが示される
。しかし、ｇｕｓ−酵素をコードするＯＲＦをプロモーターと共に逆方向に挿入
した場合に、本発明のプロモーターはまた、病原体感染による誘導性を示した。
このことから、誘導性は、実際の転写開始領域とは独立であるが、プロモーター
の上流領域（エンハンサー領域）に限定されるということになる。エンハンサー
から、これらが二方向に機能することが一般に公知である。

【００１９】この記載において、用語「調節配列」および「プロモーター」は、交換可能に
使用され、そしてこれが制御するＯＲＦの発現を駆動するために使用される全配
列を含む。すなわち、最小プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメン
トおよび５’ＵＴＲを含む。

【００２０】本発明はまた、ストリンジェントな条件下で配列番号１２または配列番号６の
配列とハイブリダイズする配列を有するプロモーターの改変体または部分に及ぶ
。この場合には、ストリンジェントな条件とは、代表的に、１％ＳＤＳを含む０
．３強度クエン酸緩衝化生理食塩水中での６０℃と６５℃との間の温度での反応
、および引き続く０．１％ＳＤＳを含む０．３強度クエン酸緩衝化生理食塩水で
の同じ温度でのすすぎである。

【００２１】本発明は、とりわけ、本発明によるＤＮＡフラグメントを含むキメラＤＮＡ配
列を提供する。発現キメラＤＮＡ配列とは、本質的に天然には見出されないＤＮ
Ａ配列を含むあらゆるＤＮＡ配列を含むことを、意味するべきである。例えば、
キメラＤＮＡとは、植物ゲノムが通常その天然の染色体位置において調節領域の
コピーを含むという事実にもかかわらず、この植物ゲノムの非天然の位置におい
て病原体により誘導される調節領域を含むＤＮＡを含むことを、意味するべきで
ある。同様に、上記調節領域は、この調節領域が天然には見出されない植物ゲノ
ム、またはこの調節領域が天然には見出されないレプリコンもしくはベクター（
例えば、細菌プラスミドもしくはウイルスベクター）に取り込まれ得る。キメラ
ＤＮＡは、宿主において複製可能なＤＮＡ分子に限定されるべきではなく、レプ
リコンに連結され得る（例えば、本発明による調節領域に物理的に連結される特
定のアダプター配列による）ＤＮＡもまた含むことを意味するべきである。この
調節領域は、その天然の下流オープンリーディングフレームに連結されてもよく
、連結されなくてもよい。

【００２２】本発明の病原体誘導性調節配列により発現が駆動される遺伝子のオープンリー
ディングフレームは、ゲノムライブラリーに由来し得る。この後者において、本
発明によるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構築するエ
キソンを分離する、１つ以上のイントロンを含み得る。このオープンリーディン
グフレームはまた、１つの連続的なエキソン、または本発明によるタンパク質を
コードするｍＲＮＡへのｃＤＮＡにより、コードされ得る。本発明によるキメラ
ＤＮＡ配列はまた、１つ以上のイントロンが人工的に除去または付加された配列
を含む。これらの改変体の各々は、本発明に包含される。

【００２３】病原体に対する増強された抵抗性はまた、本質的に本発明のプロモーターの制
御下にあるタンパク質の過剰発現により、操作され得る。このタンパク質は、推
定上のセリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、好ましくは、配列番号１
０に示される配列を含む遺伝子により、コードされる。高度に相同性の配列は、
コムギおよびイネにおいて見出され得ることが、（配列データベースでの相同性
検索により）見出された。これらの配列もまた、本発明の一部を構成する。

【００２４】タンパク質の抗病原体機能を及ぼすために、このタンパク質は活性な状態で利
用可能であるべきであることが、さらに予測される。阻害性調節に無反応である
と考えられる変異体が、作製され得る。目的の配列を同定するために通常使用さ
れる手順は、当業者に公知である。Ｐｒｏｓｉｔｅ（公知の改変部位を含む）の
ようなデータベース検索が、頻繁に使用される。大部分のプロテインキナーゼ（
例えば、ｎｄｒ１およびＸａ２１）において、推定のＣＤＰＫ（Ｃａ２＋依存性
プロテインキナーゼ）および／またはＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）のリン酸
化部位が同定され得、これは、適切な変異体を検索する良好な出発点を提供し得
る（Ｓｕｂａｒａｍａｎｉａｎら、１９９７、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９、６５
３−６６４）。スレオニン残基およびセリン残基の、アスパラギン酸残基および
グルタミン酸残基への変異は、リン酸化により活性が調節される多くのタンパク
質（例えば、ＭＡＰＫ活性化タンパク質（Ｅｎｇｅｌら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２７２１３−２７２２１）およびＭＡＰ−キナーゼ−キ
ナーゼタンパク質（Ｈｕａｎｇら、１９９５Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ６
、２３７−２４５））において見られたように、頻繁に活性化をもたらす。これ
らのタンパク質のＣ末端およびＮ末端、ならびに内部欠失変異体もまた、適切な
変異体について試験され得る。

【００２５】構成的な活性が誘導される、目的の変異体を同定するための、より指向されて
いない方法は、いわゆるＥ．ｃｏｌｉ「ミューテーター」株におけるタンパク質
コードＤＮＡの増殖による。

【００２６】ＨＲ応答を生成して植物における病原体抵抗性を増加させる際に使用するため
の、変異タンパク質の適用性のさらなる例示は、ＷＯ９９／４５１２９に見出さ
れ得、これは、本明細書中に参考として援用される。この刊行物を参照すると、
構造的に活性な変異タンパク質の発現が、過敏性応答を引き起こすことが明らか
である。従って、トランスジェニック植物において使用するために、変異タンパ
ク質は、病原体誘導プロモーターの制御下にあるべきである。好ましくは、この
プロモーターは、本質的にタンパク質の発現を駆動するプロモーターである。す
なわち、本発明のプロモーターである。あるいは、当該分野において利用可能で
あるかまたは利用可能となり、そしてとりわけＷＯ９９／４５１２９に記載され
る、他の病原体誘導プロモーターが、使用され得る。

【００２７】宿主細胞において発現され得るために、本発明によるキメラＤＮＡ構築物は、
通常、転写開始領域、ならびにリボソームの認識および付着のための翻訳開始領
域を含み、この転写開始領域は、選択される宿主細胞において発現され得る任意
の遺伝子から適切に誘導され得る。真核生物細胞において、発現カセットは、通
常、上記オープンリーディングフレームの下流に位置する転写終止領域をさらに
含み、転写が終始し、そして一次転写物のポリアデニル化が生じることを可能に
する。さらに、コドンの用法は、選択される宿主の認容されるコドンの用法に適
合され得る。さらに、シグナル配列がしばしばコードされ得、これは、非細胞画
分のための遺伝子発現産物の標的化の原因となる。選択された宿主細胞における
キメラＤＮＡ構築物の発現を支配する原理は、当業者に通常理解され、そして発
現可能なキメラＤＮＡ構築物の構築は、原核生物であれ真核生物であれ、あらゆ
る種類の宿主細胞に関して現在慣用的である。

【００２８】キメラＤＮＡ配列が宿主細胞において維持されるために、通常、選択された宿
主細胞により認識および複製されるＤＮＡに連結した、本発明による上記キメラ
ＤＮＡ配列を含むレプリコンの形態で、提供される。従って、レプリコンの選択
は、大部分には、選択される宿主細胞により決定される。このような原理は、特
定の選択された宿主細胞に適したレプリコンの選択を支配するので、十分に当業
者の範囲内である。

【００２９】レプリコンの特別の型は、それ自身またはその部分を別の宿主細胞（例えば、
植物細胞）に移動させ、それによって本発明に従うオープンリーディングフレー
ムを植物細胞に同時に移動させることができるレプリコンである。そのような能
力を有するレプリコンは、本明細書中においてベクターとしていわれる。そのよ
うなベクターの例は、Ｔｉプラスミドベクターである。このＴｉプラスミドベク
ターは、適切な宿主（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）に存在する場合、いわゆるＴ領域である自己の部分を植物細胞に移動す
ることができる。異なる型のＴｉプラスミドベクター（ＥＰ０１１６７１
８Ｂ１を参照のこと）は、現在、キメラＤＮＡ配列を植物細胞またはプロトプ
ラストに移動させるために（これらから、ゲノム中にそのキメラＤＮＡを安定に
組み込む新規植物が産生され得る）慣用的に使用されている。Ｔｉプラスミドベ
クターの特に好ましい形態は、いわゆる二元性ベクター（ＥＰ０１２０５
１６Ｂ１および米国特許第４，９４０，８３８号に主張されるようなベクター
）である。本発明に従うＤＮＡを植物宿主に導入するために使用され得る他の適
切なベクターは、ウイルスベクター（例えば、非組み込みの植物ウイルスベクタ
ー（例えば、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）および一本鎖ウイルスか
ら誘導される）、ジェミニウイルスなど）から選択され得る。このようなベクタ
ーの使用は有利であり得、特に植物宿主を安定に形質転換することが困難な場合
に有利である得る。これは、木質種（特に、木および蔓植物）を用いる場合であ
り得る。

【００３０】表現「本発明に従うキメラＤＮＡ配列をそのゲノム中に組み込む宿主細胞」は
、キメラＤＮＡをそのゲノム中に安定に組み込み、それによってキメラＤＮＡを
保持し、そして好ましくはそのようなキメラＤＮＡのコピーを子孫の細胞に有糸
分裂または減数分裂を介して伝達する、細胞ならびにそのような細胞を含む多細
胞生物またはそのような細胞から基本的になる多細胞生物を含むことを意味する
べきである。本発明の好ましい実施形態に従って、１つ以上のキメラＤＮＡをそ
のゲノム中に組み込む細胞から基本的になる植物、およびコピーをそれらの子孫
に（好ましくはメンデル様式で）伝達し得る植物が提供される。いくつかまたは
全ての植物細胞における本発明に従うキメラＤＮＡの転写および翻訳によって、
上記の調節領域を含むこれらの細胞は、病原体攻撃に応答し、従って、調節領域
の制御下であるオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質
を産生する。本発明の特定の実施形態において、このタンパク質は、病原体感染
に対する耐性を与え得る抗病原性タンパク質である。

【００３１】当業者に周知のように、植物遺伝子の調節領域は、遺伝子発現に関して目的の
特性を有する異なるサブ領域からなる。本明細書中で意味されるようなサブ領域
の例は、転写のサイレンサーおよびエンハンサーである。これらのエレメントは
、一般的（構成的）な様式で作用し得るか、または組織特異的様式で作用し得る
。欠失は、本発明に従う調節ＤＮＡ配列中に作製され得、そしてサブフラグメン
トが、関連するＤＮＡの発現パターンに対して試験され得る。そのようにして得
られた種々のサブフラグメントまたはそれらの組合せでさえ、植物中の病原体耐
性を操作する方法において有用であり得るか、または植物中の異種ＤＮＡの発現
に関与する他の適用において有用であり得る。機能的サブ領域を同定するための
本発明に従うＤＮＡ配列の使用、および植物中で遺伝子発現を促進または抑制す
るためのそれらの引き続く使用がまた、本発明によって含まれ得る。

【００３２】転写終了領域の必要性に関して、一般的に、転写終了領域は、植物細胞におけ
る転写の信頼性ならびに効率を増強すると考えられている。従って、転写終了領
域の使用は、本発明の背景において非常に好ましい。

【００３３】本発明に従う調節領域と組み合わせて使用され得る１つの抗病原性タンパク質
は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（これは、天然には、上記の領域ま
たはその構成的に活性な変異体による制御下である）である。使用され得る他の
タンパク質のさらなる例としては、以下：オオムギ（ＳｗｅｇｌｅＭら、Ｐｌ
ａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２、４０３−４１２，１９８９；Ｂａｌａｎｃｅ
Ｇ．Ｍ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．ＰｌａｎｔＳｃｉ．５６、４５９−４６６、１９
７６；ＨｏｊＰ．Ｂ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２３０、６７−７１、１９８
８；ＨｏｊＰ．Ｂ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３、３１−４２、
１９８９）、マメ（ＢｏｌｌｅｒＴ．ら、Ｐｌａｎｔａ１５７，２２−３１
，１９８３；ＢｒｏｇｌｉｅＫ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８３、６８２０−６８２４、１９８６；ＶｏｇｅｌｉＵ．ら、
Ｐｌａｎｔａ１７４、３６４−３７２、１９８８）；ＭａｕｃｈＦ．および
ＳｔａｅｈｅｌｉｎＬ．Ａ．、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１、４４７−４５７、
１９８９）；キュウリ（ＭｅｔｒａｕｘＪ．Ｐ．およびＢｏｌｌｅｒＴ．、
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．２８、１６１−１６９、
１９８６）；西洋ニラネギ（ＳｐａｎｕＰ．ら、Ｐｌａｎｔａ１７７、４４
７−４５５、１９８９）；トウモロコシ（ＮａｓｓｅｒＷ．ら、Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１、５２９−５３８、１９８８）、カラスムギ（Ｆｉｎｋ
Ｗ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８、２７０−２７５、１９８８）、
エンドウマメ（ＭａｕｃｈＦ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．７６、６０
７−６１１、１９８４；ＭａｕｃｈＦ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８
７、３２５−３３３、１９８８）、ポプラ（Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｔ．Ｊ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、７８９５−７８９９、１９
８９）、ポテト（ＧａｙｎｏｒＪ．Ｊ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
６、５２１０、１９８８；ＫｏｍｂｒｉｎｋＥ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、７８２−７８６、１９８８；Ｌａｆｌａｍｍｅ
Ｄ．およびＲｏｘｂｙＲ．、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３、２４９
−２５０、１９８９）、タバコ（例えば、ＬｅｇｒａｎｄＭ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、６７５０−６７５４、１９８７；
ＳｈｉｎｓｈｉＨ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
４、８９−９３、１９８７）、トマト（ＪｏｏｓｔｅｎＭ．Ｈ．Ａ．およびＤ
ｅＷｉｔＰ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８９、９４５−
９５１、１９８９）、コムギ（ＭｏｌａｎｏＪ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５４、４９０１−４９０７、１９７９）から得られ得るβ−１，３−グルカ
ナーゼおよびキチナーゼ、マゲイニン、レクチン、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓから単離された毒素、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ（
ＥＰ０５７６４８３）およびＡｍａｒａｎｔｈｕｓ（ＥＰ０５９３
５０１および米国特許第５，５１４，７７９号）から単離された抗真菌タンパク
質、アルブミン型タンパク質（例えば、チオニン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、オオ
ムギトリプシンインヒビター、穀物グリアジンおよびコムギ−α−アミラーゼ、
ＥＰ０６０２０９８）、ＲａｐｈａｎｕｓＢｒａｓｓｉｃａ、Ｓｉｎａ
ｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃｎｉｃｕｓ、Ｌａｔｈｙｒ
ｕｓおよびＣｌｉｔｏｒｉａから単離されたタンパク質（ＥＰ０６０３２
１６）、オキサレートオキシダーゼ（ＥＰ０６３６１８１およびＥＰ０
６７３４１６）、サッカリドオキシダーゼ（ＰＣＴ／ＥＰ９７／０４９２
３）、Ａｌｌｉｕｍ種子から単離された抗微生物タンパク質ならびにＡｒａｌｉ
ａおよびＩｍｐａｔｉｅｎｓ由来のタンパク質（ＷＯ９５／２４４８５）などが
挙げられるが、これらに限定されない。

【００３４】誘導性プロモーターの別の使用は、遺伝子に対する遺伝子耐性の相互作用（ｇ
ｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）
において役割を果たすタンパク質を駆動することである（例えば、ＷＯ９１／１
５５８５に記載されるように）。例えば、そのようなタンパク質は、Ｋａｒｒｅ
ｒ，Ｅ．Ｅ．ら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６、６８１−６９０、１９
９８）に開示されるような植物タンパク質、活性化ｎｄｒ１および活性化ｅｄｓ
１、Ｃｆ−タンパク質、トマト由来のＢＳ３タンパク質およびＰｔｏタンパク質
、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ由来のＲｐｍ１およびＲｐｍ２タ
ンパク質、タバコ由来のＮ遺伝子、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ由
来のａｖｒ−誘発物（ａｖｒ−ｅｌｉｃｉｔｏｒ）タンパク質、Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ由来のａｖｒＢｓ３、Ｅｒｗｉｎｉａ由来のハルピン（ｈａｒｐｉｎ）
およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のａｖｒＰｔｏタンパク質である。

【００３５】本発明の実際の適用性は、特定の植物種に限定されないが、形質転換される植
物種は、好ましくはＣｒｕｃｉｆｅｒａｅファミリー由来である。いくつかの形
態の病原体攻撃に供される任意の植物種は、本発明に従うキメラＤＮＡ配列を用
いて形質転換され得、調節領域が病原体感染によって誘導されることを可能にし
、それによって、いくつかまたは全ての植物細胞中で産生される抗病原性タンパ
ク質の産生を誘発する。

【００３６】本発明のいくつかの実施形態は、（例えば、いくつかの植物種が今のところ遺
伝子形質転換が困難であるので）現在のところ実施可能でないかもしれないが、
そのような植物種における本発明の実施は、短に時間の問題であり、原理の問題
ではない。なぜなら、そのような遺伝子形質転換に対する従順は、本発明の根底
にある実施形態に関連がないからである。

【００３７】植物種の形質転換は、今や、莫大な数の植物種（Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａ
ｅならびにＭｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅの両方を含む）に関して慣用であ
る。原則として、細胞が全体の植物に再生され得る限り、任意の形質転換方法が
、本発明に従うキメラＤＮＡを適切な祖先細胞に導入するために使用され得る。
これらの方法は、以下から適切に選択され得る：プロトプラストに対するカルシ
ウム／ポリエチレングリコール方法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
２９６，７２−７４，１９８２；ＮｅｇｒｕｔｉｕＩ．ら、ＰｌａｎｔＭｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．８、３６３−３７３、１９８７）、プロトプラストのエレクトロ
ポレーション（ＳｈｉｌｌｉｔｏＲ．Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３，
１０９９−１１０２，１９８５）、植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃ
ｒｏｓｓｗａｙＡ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２，１７９−１８
５，１９８６）、種々の植物材料のＤＮＡ（またはＲＮＡで覆われた）粒子ボン
バードメント（ＫｌｅｉｎＴ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２７、７０、１９８
７）、（非組み込みの）ウイルスを用いた感染など。本発明に従う好ましい方法
は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介ＤＮＡ移入を含む。特に好ましいのは、Ｅ
ＰＡ１２０５１６および米国特許第４，９４０，８３８号に開示されるよ
うな、いわゆる二元性ベクター技術の使用である。

【００３８】トマトの形質転換は、好ましくは、基本的にＶａｎＲｏｅｋｅｌら（Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２、６４４−６４７、１９９３）によって記載され
るように実施される。ポテトの形質転換は、好ましくは、基本的にＨｏｅｋｅｍ
ａら（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７、２７３−
２７８、１９８９）によって記載されるように実施される。

【００３９】一般的に、形質転換の後、植物細胞または細胞グループは、本発明に従うタン
パク質をコードする核酸配列と共に同時移入された植物発現可能な遺伝子によっ
てコードされる、１つ以上のマーカーの存在に対して選択される。この後、形質
転換された物質が植物全体で再生される。

【００４０】遺伝子形質転換に対するより困難さをいくらか考慮したが、単子葉植物は、形
質転換を受けやすく、そして稔性トランスジェニック植物は、形質転換された細
胞もしくは胚、または他の植物材料から再生され得る。現在、単子葉植物の形質
転換に関する好ましい方法は、胚、外植体または懸濁された細胞の微粒子銃ボン
バードメントおよび直接的なＤＮＡ取り込みまたはエレクトロポレーションであ
る（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３３８、２７４−２７６、１９８９
）。トランスジェニックトウモロコシは、フォスフィノスリシンアセチルトラン
スフェラーゼ（除草剤フォスフィノスリシンを不活性化する酵素）をコードする
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｂａｒ遺伝子を微粒
子銃ボンバードメントによってトウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞に導入する
ことによって得られた（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２，
６０３−６２８，１９９０）。遺伝物質の、コムギおよびオオムギのような他の
単子葉植物作物のアリューロン（ａｌｅｕｒｏｎｅ）プロトプラストへの導入は
、報告されている（Ｌｅｅ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２１−３０
，１９８９）。コムギ植物は、老齢コンパクト（ａｇｅｄｃｏｍｐａｃｔ）お
よび胚形成懸濁培養物を樹立するための結節性胚形成カルス組織のみを選択する
ことによって、胚形成懸濁培養物から再生された（Ｖａｓｉｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ．８，４２９−４３４，１９９０）。これらの作物に関する形質転換系
の組み合わせは、単子葉植物に対する本発明の適用を可能にする。

【００４１】コメおよびコーンのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物はまた、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種によってＤＮＡ移入を受けやすい（ＷＯ９４／００９
７７；ＥＰ０１５９４１８Ｂ１；ＧｏｕｌｄＪら、ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ．９５，４２６−４３４，１９９１）。

【００４２】ＤＮＡ移入および再生の後、形質転換されたと推定される植物は、例えばサザ
ン分析を用いて、本発明に従うキメラＤＮＡの存在、コピー数および／またはゲ
ノム組織に関して評価され得る。さらに、またはあるいは、新規に導入されたＤ
ＮＡの発現レベルが、ノーザン分析および／またはウエスタン分析、当業者に周
知の技術を用いて行なわれ得る。最初の分析（これは、必要に応じてである）の
後、所望のコピー数および新規に導入された本発明に従うキメラＤＮＡの発現レ
ベルを示す形質転換された細胞は、病原体に対する耐性レベルに関して試験され
得る。あるいは、選択された植物は、例えば、耐性レベルを増強するためまたは
耐性を広げるために、さらなる遺伝子を導入するために別の回の形質転換に供さ
れ得る。

【００４３】他の評価としては、屋外条件下における病原体耐性、稔性の検査、収量および
他の特徴の試験が挙げられる。そのような試験は、現在、当業者によって慣用的
に実施される。

【００４４】そのような評価の後、形質転換された植物は、直接生育され得るが、通常これ
らは、新規な変異体の育種またはハイブリッドの作製などにおける親系統として
使用され得る。

【００４５】１より多くのキメラ遺伝子を構成的に発現し得るトランスジェニック植物を得
るために、以下を含む多くの代替が利用可能である：Ａ．選択可能なマーカー遺伝子に物理的に結合した多数の改変された遺伝子を
用いた、ＤＮＡ（例えば、二元性プラスミド上のＴ−ＤＮＡ）の使用。この方法
の利点は、キメラ遺伝子が物理的に結合され、従って単一メンデル遺伝子座とし
て移動することである。

【００４６】Ｂ．各々がすでに１つ以上のキメラ遺伝子（好ましくは選択可能なマーカー遺
伝子に結合されている）を発現し得るトランスジェニック植物の、別の選択可能
なマーカーに結合した１つ以上のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物由
来の花粉を用いた他花受粉。あとに、この交雑によって得られた種子は、２つの
選択可能なマーカーの存在に基づいてか、またはキメラ遺伝子それ自身の存在に
基づいて選択され得る。選択された種子から得られた植物は、そのあと、さらな
る交雑に使用され得る。原理的に、キメラ遺伝子は単一座上ではなく、従って、
その遺伝子は独立座位として分離し得る。

【００４７】Ｃ．各々が１つ以上のキメラ遺伝子および選択可能マーカーを有する、多くの
複数キメラＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の使用。同時形質転換の頻度が高
い場合、１つのマーカーのみに基づく選択で十分である。別の場合、１つより多
くのマーカーに基づく選択が好ましい。

【００４８】Ｄ．トランスジェニック植物（これは、すでに、新規キメラＤＮＡを有する第
１、第２（など）のキメラ遺伝子を含み、必要に応じて選択可能なマーカー遺伝
子を含む）の継続的な形質転換。方法Ｂのように、キメラ遺伝子は、原理的に単
一座上ではなく、従って、そのキメラ遺伝子は独立座位として分離し得る。

【００４９】Ｅ．上記の戦略の組み合わせ。

【００５０】実際の戦略は、容易に決定され得るようないくつかの考慮（例えば、親系統の
目的（直接的な生育、育種のプログラムにおける使用、ハイブリッドを産生する
ための使用））に依存し得るが、本発明に関して重要ではない。

【００５１】この文脈において、すでにキメラＤＮＡを含む植物が、例えば、抗病原性物質
の産生を増強し、それによって耐性レベルを増強するために本発明に従うさらな
るキメラＤＮＡを導入するための、適切な遺伝背景を形成し得ることを強調すべ
きである。調節ＤＮＡフラグメントと組み合わせて適切に使用され得るタンパク
質に対応する他の遺伝子のクローニングおよびそれらを相対的に過剰発現し得る
トランスジェニック植物の獲得、ならびに植物中（ｉｎｐｌａｎｔａ）におけ
る病原体耐性にたいするそれらの能力の評価は、今や当業者の範囲内である。

【００５２】病原体に対する改善された耐性を有する植物は、屋外、温室もしくは室内また
はどこかで生育され得る。植物またはそれらの食用部分は、動物の飼料またはヒ
トの消費物として使用され得るか、または食物、飼料または農業または産業に関
する任意の形態の他の目的物に加工され得る。農業は、園芸、樹芸、花の培養な
どを意味する。本発明に従う植物材料から恩恵を受け得る産業としては、薬学産
業、紙およびパルプ製造産業、砂糖の製造産業、飼料および食品産業、酵素の製
造業などが挙げられるが、これらに限定されない。

【００５３】本発明に従う植物または植物部分の利点は、殺虫剤処理の必要性を減少するこ
とであり、従って、材料、労力および環境汚染の経費を削減し、またはそのよう
な植物の生成物（例えば、果実、種子など）の有効期間を延長する。本発明の目
的に関する植物は、光合成可能かついくつかの形態の病原体攻撃に供される、多
細胞生物を意味する。これらには、少なくとも被子植物および裸子植物、単子葉
植物および双子葉植物が挙げられる。

【００５４】（実施例１）（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐＭＯＧ５５３プロモータータグ化ライブラリー
の構築）プロモータータグ化（ｐｒｏｍｏｔｅｒｔａｇｇｉｎｇ）構築物ｐＭＯＧ５
５３のＴ−ＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬデーターベースの登録番号Ｘ８４１０５にて
入手可能である。

【００５５】この構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系統Ｍ
ＯＧ１０１に導入し、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣ２
４の根の形質転換に使用した。１１００より多くのトランスジェニック植物を作
製し、生育させ、自家受精させ、そして生じたＳ１種子を収穫した。

【００５６】（実施例２）（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａを用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の感染）３週間齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ実生を５．５ｃｍポットの中の鉢植え用土
に移し、そしてさらに１週間１８℃で生育させた。植物の接種のちょうど前に、
植物の葉のサンプルを採取し、そして組織化学的ＧＵＳ染色をＧｏｄｄｉｊｎら
（ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ（１９９３）４（５）：８６３−８７３
）に記載されるように実施した。１．２×１０⁶胞子／ｍｌのＢｏｔｒｙｔｉｓ
ｃｉｎｅｒｅａの胞子懸濁液を用いて植物を噴霧した。２４時間および４８時
間後、病害の徴候を示した葉を収集し、そして再び、組織化学的ＧＵＳ染色を実
施した。系統番号４８８は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ感染部位のちょうどまわりのＧＵ
Ｓ遺伝子の発現を示す（図１を参照のこと）。

【００５７】（実施例３）（逆ＰＣＲによるＢｏｔｒｙｔｉｓ誘導プロモーターの単離）５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の単離のために、ゲノムＤＮＡを、ｐＭＯＧ５５３系
統番号４８８の葉から単離した。このゲノムＤＮＡを、５つの異なる酵素（Ｅｃ
ｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｌｕＩおよびＮｓｐＩ）を用
いて、制限酵素消化に供した。各反応について、約２μｇのＤＮＡを、１×濃度
の適切な反応緩衝液および３０ユニットの制限酵素における、１００μｌの水中
にて、１６時間３７℃で消化した。この反応混合物を、１容積のフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を用いて抽出し
、そして２．５容積の９６％エタノールを用いて沈殿し、７０％エタノールを用
いて洗浄し、そして５０μｌの水に溶解した。

【００５８】混合物の２５μｌを、１×ＴＢＥ緩衝液中の０．８％アガロースゲル上で分離
し、そして０．４ＭＮａＯＨを用いたキャピラリーブロッティングを使用して
、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）膜に移
した。このブロットを、プローブとして³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識された５６０ｂｐ
のＧＵＳフラグメント（配列番号１；ＡＴＧ開始コドン上のＮｃｏＩ部位から
最初のＥｃｏＲＶ部位まで）を用いてハイブリダイズした（１６時間、６５℃
）。次いで、このブロットを０．２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳのストリジェンシー
で、６５℃にて洗浄した。サザンブロットの結果（図２および表１を参照こと）
は、Ｔ−ＤＮＡが、ある単一のコピーでのみ存在することを示した。（表１：使用された各制限酵素に対する、算出されたプロモーターサイズを用い
たサザンブロットおよび逆ＰＣＲの結果）

【００５９】

【表１】（−増幅されないことを意味する）残りの２５μｌを、２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
）を用いて、１４℃にて１６時間、１００μｌ１×ライゲーション緩衝液中で
ライゲーションのために使用した。反応混合物を、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールを用いて再び抽出し、そしてＤＮＡをエタノールを用いて
沈殿した。次いで、このライゲーションＤＮＡを、ＳｎａＢＩを用いて直鎖化
し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、エタノ
ールを用いて沈殿し、そして２５μｌの水に溶解した。５μｌのこのＤＮＡサン
プルを、全ての反応において、プライマーＧＵＳＩＮＶ５：５’ＣＴＴＴＣＣＣ
ＡＣＣＡＡＣＧＣＴＧＡＴＣ３’（配列番号２）を用いたＰＣＲ反応のテンプレ
ートとして、ならびにＥｃｏＲＩ反応のための第２のプライマーＧＵＳ８５
’ＣＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣ３’（配列番号３）として、お
よび他の反応のための第２のプライマーＧＵＳ７５’ＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡ
ＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧ３’（配列番号４）として使用した。２５ｐｍｏｌの各プ
ライマー、０．５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ溶液、０．５ユニットのＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、プロモーターフラグメン
トを増幅した（１サイクル：５’９５℃、５’５５℃、５’７２℃；２５サイク
ル：１’９５℃、１’５５℃、２’７２℃；１サイクル：１’９５℃、１’５５
℃、１０’７２℃）。このＰＣＲ反応の結果を、表１に列挙した。

【００６０】０．６ｋｂのＨｉｎｃＩＩフラグメントを切り出し、アガロースゲルから精
製し、そして製造者により記載されるように、Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ
ａｄｉｓｏｎＷＩ、ＵＳＡ）中にクローン化した。クローン化されたＰＣＲフ
ラグメントの同一性を、ＤＮＡ配列分析により確認した。

【００６１】（実施例４）（ゲノムのプロモーターフラグメントの単離）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム由来の大きいプロモーターフラグメントの単離
のために、ゲノムＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣ２４野生型ラ
イブラリーをスクリーニングした。このライブラリー構築のために、ゲノムＡｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓＣ２４ＤＮＡを、ＳａｕＩＩＩａを用いて部分的に消化
し、サイズ選択し、そして宿主ベクターλ ＧＥＭ１１中にクローン化した。

【００６２】ゲノムライブラリーのスクリーニングを、完全な手順の間、０．６ｋｂＰＣ
Ｒフラグメントを有するＴベクタークローン（実施例３において記載される）由
来の４０１ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメント（配列番号５
）を用いて行った。

【００６３】このゲノムライブラリーは、７．５×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌを含んだ。最初のス
クリーニングのラウンドの後、４２個の陽性プラークを得た。２０個のプラーク
の寒天プラグを、１ｍｌのＳＭ緩衝液および１滴のクロロホルム中に集収した。
希釈（１０^-3および１０^-4倍）を行い、Ｅ．ｃｏｌｉＫＷ２５１細胞と組み合
わせ、そして寒天上にプレーティングした。２０枚のプレートのうち１８枚のプ
レートから、単一のプラークを含む各２個の寒天プラグを取り出した。各プラグ
の溶出物の１０^-2倍および１０^-5倍の希釈液を、Ｅ．ｃｏｌｉＫＷ２５１と組
み合わせ、そして寒天上にプレートした。プレートの溶解産物を、１０個の純粋
プラークから調製した。λＤＮＡを、１０個のクローンから単離して、そしてＥ
ｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＳｓｔＩを用いる制限酵素分析によってそれ
らの挿入について分析した。アガロースゲル上での分離後、ＤＮＡを陽性に荷電
したナイロン膜に移し、そして４０１ｂｐの４８８プローブ（配列番号５）を用
いてハイブリダイズした。２つの異なるサブクローンの±４ｋｂのハイブリダイ
ズしたバンド（ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩフラグメント）を単離し、そして高いコ
ピーのクローニングベクターｐＵＣ１８中にサブクローン化し（Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９
８５）Ｇｅｎｅ３３，１０３−１１９）、これをまたＳｓｔＩを用いて消化
した。正しいサイズ（４ｋｂ）の挿入物を含むクローンを選択し、そして制限酵
素分析、サザンブロッティング分析、および４０１ｂｐ４８８プローブ（配列
番号５）を用いたハイブリダイゼーションに供した。２．３ｋｂのハイブリダイ
ズしたＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、高いコピーのクローニングベ
クターｐＢＫＳ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化して、そしてＳ
ｓｔＩ−ＥｃｏＲＶを用いて消化した。正しいサイズの挿入物を含むクロー
ンを選択し、そして挿入物のＤＮＡ配列を決定した（配列番号６）。このゲノム
クローンは、本来の４００ｂｐ４８８ＰＣＲフラグメント、Ｔ−ＤＮＡ挿入物
の下流の５００ｂｐ領域および約１４００ｂｐ末端プロモーター配列と同一の領
域を含んだ。Ｔ−ＤＮＡ挿入部位は、おそらく配列番号６の１８１３位におそら
く位置した。このＤＮＡ配列を、関連する相同性を見出し得ないＥＭＢＬデータ
ーベースおよびＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検索において用い
た。

【００６４】（実施例５）（プロモーター−ｇｕｓ融合物の構築）４００ｂｐのプロモーターフラグメントを、ｕｉｄＡオープンリーディングフ
レームに融合して、本来の植物系統５５３−４８８とほぼ同一である融合物を保
持した。ある改変を行い、ＵｉｄＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の
ＡＴＧ開始コドンと重複するＮｃｏＩ制限部位を導入した。プライマーを、Ａ
ｒａｂｉｄｐｓｉｓゲノム由来のフラグメントの増幅のために開発した：ＡＴＧ
開始コドンと重複するＮｃｏＩ制限部位を導入するプライマーＬＳ２５９（５
’ＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＣＣ３’、配列番号８）および４００
ｂｐプロモーターフラグメントの上流にＳｓｔＩ制限酵素部位を導入するプラ
イマーＬＳ２６０（５’ＡＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴ
ＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＣ３’、配列番号９）。このプロモターを、２５ｐｍｏ
ｌの両方のプライマー、１μｌ２０ｍＭｄＮＴＰおよび５ユニットのｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、１’９５℃、１’３７℃、２’７２℃で５サイ
クル；１’９５℃、１’５５℃、２’７２℃で３０サイクルおよび１’９５℃、
１’５５℃、１０’７２℃で１サイクルの間、増幅した。得られたＰＣＲ産物を
精製し、ＳｓｔＩおよびＮｃｏＩを用いて消化し、そしてＧＵＳイントロン
を含む、ＳｓｔＩ、ＮｃｏＩ消化したクローニングベクター（Ｊｅｆｆｅｒ
ｓｏｎら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：３９０１−３９０７）、その後に続
いてポリアデニル化のために必要とされる配列（Ａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ
ｃｅｌｌ１，１１５−１２２）を含む、ジャガイモプロテイナーゼインヒビ
ターＩＩ遺伝子の３’未翻訳領域（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら、１９８７、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，７４４−７４８）中に連結した
。得られたプラスミドを、ｐＭＯＧ１０３９と名付けた。次いで、この完全な発
現ユニットを、制限酵素ＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、バイナリーベ
クターｐＭＯＧ８００（１９９３年８月１２日にＣＢＳ４１４．９３下で、Ｃ
ｅｎｔｒａｌＢｕｒｅａｕｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，
Ｂａａｒｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄに寄託された）に移した。この得ら
れたプラスミドを、ｐＭＯＧ１０４０と命名した（図３）。

【００６５】１８００ｂｐの４８８プロモーターの構築のために、このプロモーターの１４
００ｂｐ上流のフラグメントをＨｉｎｃＩＩ制限部位を用いて４００ｂｐのフ
ラグメントに融合した。従って、４００ｂｐプロモーターをＢａｍＨＩおよび
ＨｉｎｃＩＩを用いてベクターｐＭＯＧ１０３９から切除し、そして同様に消
化されたクローニングベクターｐＢＫＳ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結し
た。次いで、この得られたベクターを、ＨｉｎｃＩＩを用いて消化し、そして
配列番号６由来の１４００ｂｐ上流のＨｉｎｃＩＩフラグメントを、このベク
ター中に連結した。適切な方法で融合されたプロモーターエレメントを有するク
ローンを、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そしてＸｈｏＩお
よびＢａｍＨＩを用いて消化されたバイナリーベクターｐＭＯＧ１０４０中に
連結して、バイナリーベクターｐＭＯＧ１０５６を得た（図４）。

【００６６】両方のバイナリーベクターを、エレクトロポレーションによって、ジャガイモ
およびトマトの形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ系統ＥＨＡ１０５に、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌ
ｉａｎａの形質転換のために系統ＭＯＧ１０１に、ならびにＢｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓの形質転換のために系統ＭＯＧ３０１に移した。

【００６７】（実施例６）（４８８プロモーターｇｕｓ構築物の、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＢ．ｎａ
ｐｕｓへの形質転換）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ形質転換）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いて、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｃｖ．Ｃ２４の根セグメントの形質転換のた
めに使用する方法を、以下に記載する。この形質転換方法のためのバイナリーベ
クターは、上記のベクターと同一である。

【００６８】６ｍｇのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの種を、液体Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ培地を
含むフラスコにおいて、８０ｒｐｍ下で、２４℃にて１６時間の明期（１７００
ｌｕｘ）、および２１℃にて８時間の暗期で発芽した（種々の培地の内容物が、
表Ｘにおいて見出され得る）。９日目の実生の根を、滅菌ペトリ皿中に単離し、
そして１滴のＧｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＧＭ）の中に回収した。
根を、およそ３〜５ｍｍのセグメントに切り、そしておよそ１００個の外植片を
、ＣａｌｌｕｓＩｎｄｕｃｉｎｇＭｅｄｉｕｍ（ＣＩＭ）を含むプレート上
に置かれたナイロン膜（Ｏ８ｃｍ）上に均一に広げた。このプレートを、上記
のように同じ条件下で３日インキュベートした。

【００６９】この研究において使用されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系統は、Ｃ５８染色
体のバックグラウンドにおいて、リファンピシン選択マーカーを有した（ｈａｒ
ｂｏｕｒ）。このヘルパー系統ＭＯＧ１０１の構築は、Ｈｏｏｄら（１９９３）
により記載される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、抗生物質（リファンピシン２
０ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ培地中で、一晩増殖した
。一晩培養した物を、抗生物質なしのＬＢ中に１：１０で希釈し、そしておよそ
３時間増殖した。細菌懸濁物を、１６００×ｇで、１５分間、室温にて遠心分離
した。細菌を、ＧＭ中に再懸濁し、そしてＯＤ６００＝０．１に調整し、そして
共培養のために用いた。

【００７０】およそ１００個の外植片を含む膜を、２分間、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸
濁液と共にインキュベートして、そして滅菌濾紙上で乾燥して余分な細菌を除去
した。外植片を含む膜を、４８時間、ＣＩＭプレート上で培養する。液体ＧＭを
用いて膜および外植片をリンスした後、これらを、いくつかの濃度のシアナミド
またはカナマイシンを有するＳｈｏｏｔＩｎｄｕｃｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（
ＳＩＭ）プレート上でインキュベートした。５日後、この外植片を含む膜を、同
じ培地（ＳＩＭ）にサブカルチャーのために移した。第２のサブカルチャーは２
週間後であった。共培養後およそ４週間で、カナマイシン濃度あたり６０個の苗
条を切り出し、そして３０ｍｇ／ｌのシアナミドを含むＳｈｏｏｔＥｌｏｎｇ
ａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ＳＥＭ）と共にプレート上に置いた。根付くのが可
能な苗条を、組織化学的ＧＵＳアッセイを用いてｇｕｓ遺伝子の発現について、
小葉および花を試験することによってそれらのトランスジェニック形質に関して
試験した。

【００７１】Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓの形質転換を、ＢａｄｅＪ．Ｂ．およびＤａ
ｍｍ，Ｂ．：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎｏｆｒａｐｅｓｅｅｄ．、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．およびＳ
ｐａｎｇｅｎｅｂｅｒｇ，Ｇ．（編）ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌ
ａｎｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒｖｅｒｌａｇ，ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９５
，頁３０〜３８に記載されるように実施した。（表ＡＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣ２４根形質転換のため
に必要とされる培地）

【００７２】

【表Ａ】

（実施例７）（真菌感染後のトランスジェニック植物におけるプロモーターｇｕｓ融合物の
発現プロフィール）４００ｂｐのプロモーターｇｕｓ構築物（ｐＭＯＧ１０４０）および１８００
ｂｐのプロモーターｇｕｓ構築物（ｐＭＯＧ１０５６）を有するトランスジェニ
ックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を、実施例１に記載されるようにＢｏｔｒｙｔ
ｉｓｃｉｎｅｒｅａを用いて感染した。ｐＭＯＧ１０４０構築物からの３３個
体の植物を、Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａを用いた感染後に試験した。４００ｂｐのプロ
モーターエレメントを有するトランスジェニック系統は、真菌感染部位の近くで
、任意の誘導ＧＵＳ発現を示さなかった。ｇｕｓの前に、１８００ｂｐのプロモ
ーターエレメント（ｐＭＯＧ１０５６）を有する４７個体のＡｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ植物のうち１４個体が、Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａを用いた感染後、誘導ｇｕｓ発
現を示す。

【００７３】Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ温室植物を、摘み取った葉に関して感染した。
葉を摘み取り、そして湿った草花栽培発泡体（ｆｏａｍ）に置いた。小さい切開
を作り、そしてＢ．ｃｉｎｅｒｅａ胞子懸濁液の小さい液滴を、切開領域に適用
し、真菌が植物により容易に入ることを可能にした。真菌感染を、１８℃にて、
および高い相対湿度（±９０％）にて進行させた。（表２：Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａを用いた感染後のｐＭＯＧ１０５６
構築物を有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ植物（摘み取
った葉）においてモニターされた真菌誘導ＧＵＳ発現）

【００７４】

【表２】注記：＋＝ＧＵＳ発現、−＝ＧＵＳ発現が検出されない、ｎｔ＝試験されていな
い。

【００７５】いくつかの系統において、バックグラウンドの発現が注目された。なぜなら、
植物全体においてバックグラウンドが検出されなかったからである（図３）。こ
の現象は、プロモーターもまた創傷誘導性であるという事実によって説明され得
る。

【００７６】小さなガラス管内で生長したインビトロ小植物で、同様の感染アッセイを行っ
た。植物にＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ病原体、Ｐｈｏｍａｌｉｎｇａｍの
胞子懸濁液を播種した。胞子懸濁液の小滴を葉に直接に適用し、そして病害を６
日間発達させた。小さな損傷が見られた際に、植物から葉を除去し、そしてＧＵ
Ｓ遺伝子の発現について試験した。約５０％のトランスジェニック系統が、真菌
感染のすぐ付近の部位でのＧＵＳ遺伝子の誘導性発現を示す（例を図５に示す）
。茎の損傷が発達するまで、Ｐｈｏｍａｌｉｎｇａｍの感染を進行させておい
た（播種の後、約２週間）。損傷を含む茎セグメントを除去し、そして染色した
。いくつかの系統における茎の損傷周囲の発現が見られた（例を図６に示す）。

【００７７】（実施例８完全４８８プロモーターのＤＮＡ配列の分析）２．３ｋｂのゲノムクローンの完全配列を、ＥＭＢＬデータベースに対するＢ
ＬＡＳＴ相同性検索に使用した。ＢＡＣＭＺＢ１０（Ｌｉｎら、ＥＭＢＬＡ
Ｃ００９３２６）およびＢＡＣＴ１６０１１（Ｌｉｎら、ＥＭＢＬＡＣ０１
０８７１）の配列に、ほぼ正確なヒットを見出した。両方のＢＡＣ配列は、ＢＡ
Ｃ配列のＳＰ６部位で１７４５０ｂｐのオーバーラップを有し、そしてＡｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓ第ＩＩＩ染色体上の分子マーカーＣＩＣ７Ａ１２Ｒ（ＹＡＣＣ
ＩＣ７Ａ１２）の付近に位置する。

【００７８】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統、５５３−４８８におけるｐＭＯＧ５５３プロモ
ータータグ化構築物のＴ−ＤＮＡを、ＢＡＣＭＺＢ１０の第３オープンリーデ
ィングフレームと第４オープンリーディングフレームとの間に挿入する。この挿
入部位の位置は、第３ＯＲＦ（ＭＺＢ１０．３）（未知の機能のタンパク質）の
３９８ｂｐ下流であり、そして推定レセプターセリンスレオニンプロテインキナ
ーゼの翻訳部位である、第４のＯＲＦ（ＭＺＢ１０．４）の１５９１ｂｐ上流で
ある。Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーがＭＺＢ１０．４部位に、そして左ボーダーがＭＺ
Ｂ１０．３部位に位置するような方向で、Ｔ‐ＤＮＡを挿入する（図７Ａ）。

【００７９】（表３：Ｐｈｏｍａｌｉｎｇａｍでの（インビトロ）感染後のｐＭＯＧ１０
５６構築物を保有するトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ植物に
おいてモニターされた真菌誘導性ＧＵＳ発現）

【００８０】

【表３】。

【００８１】ｐＭＯＧ５５３のＴ−ＤＮＡを、ＢＡＣＴ１６０１１の配列内の同一の位置
に配置した。ＢＡＣＭＺＢ１０およびＢＡＣＴ１６０１１内の両方の領域の
ＤＮＡ配列が比較された場合、これらの配列は、推定レセプターセリンスレオニ
ンキナーゼ（ＭＺＢ１０．４／Ｔ１６０１１．３）の全体の領域にわたって同一
であると思われる。コンピューターに基づいたオープンリーディングフレームの
予測および引き続くアミノ酸配列への翻訳は、両方の登録（ＭＺＢ１０．４、Ｌ
ｉｎら、ＡＣ００９３２６およびＴ１６０１１．３、Ｌｉｎら、ＡＣ０１０８７
１）の間の差を明らかにした。この差は、２つの異なるタンパク質配列を生じる
イントロン５とエキソン６との間のスプライシング部位の予測において見出され
た。

【００８２】ＭＺＢ１０．４推定レセプターセリンスレオニンプロテインキナーゼのアミノ
酸配列（配列番号１１）は、３８３Ａａのサイズであり、そしてプロテインキナ
ーゼＡＴＰ結合領域（配列番号１１におけるＡａ４２〜６３）、プロテインキナ
ーゼ活性部位（配列番号１１のＡａ１５８〜１７０）、ロイシンジッパーモチー
フ（配列番号１１のＡａ２４９〜２７０）およびαイソプロピルマレート／ホモ
シトレートシンターゼ酵素において見出されるモチーフに類似性を有する領域（
配列番号１１のＡａ５４〜６４）を含む。

【００８３】Ｔ１６０１１．３推定プロテインキナーゼのアミノ酸配列は、３８４Ａａのサ
イズであり、そしてプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域（配列番号１３のＡａ４
２〜６４）、プロテインキナーゼ活性部位（配列番号１３のＡａ１５８〜１７０
）およびαイソプロピルマレート／ホモシトレートシンダーゼ酵素において見出
されるモチーフと類似性を有する領域（配列番号１３のＡｓ５４〜６４）を含む
。Ｔ１６０１１．３推定プロテインキナーゼは、Ａａ２５４位と２５９位（配列
番号１１）との間でのＭＺＢ１０．４とは異なり、ロイシンジッパーモチーフの
破壊を引き起こす。ロイシンジッパーモチーフは、Ｔ１６０１１．３ではなく、
ＭＺＢ１０．４において（類似性に基づいて）予測される。ロイシンジッパーは
、タンパク質、しばしば転写因子のホモ二量体化またはへテロ二量体化に関与す
ることが公知である。

【００８４】Ｔ−ＤＮＡ挿入物とＭＺＢ１０．４コード領域の開始との間の調節領域は、な
ぜならプロモータータグ化系統５５３〜４４８およびｐＭＯＧ１０５６構築物で
形質転換されたトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはＢｒａｓｓｉ
ｃａｎａｐｕｓ植物において観察されるように、病原体誘導発現の原因である
。

【００８５】ｐＭＯＧ１０４０において使用され、そして実施例６において記載される短縮
型プロモーターフラグメントは、トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植
物における真菌誘導発現を与えなかった。これらの実験より、本発明者らは以下
のように結論する。４８８プロモーターの病原体誘導性配列に必要なエレメント
は、４００ｂｐのプロモーターエレメント（Ｔ−ＤＮＡ挿入物に相対的）の上流
に位置し、そしてＭＺＢ１０．４推定セリンスレオニンレセプターキナーゼのミ
ニマルプロモーター（ＴＡＴＡボックス、転写開始および５’非翻訳領域）であ
ると結論する。コンピューターアルゴリズムの予測では、ミニマルプロモーター
は、約２００塩基対（配列番号６のヌクレオチド４２１〜２２３の間の相補的な
鎖）にわたる。病原体誘導性発現に必要なエレメントを含む領域の配列は、配列
番号１４に示される。

【００８６】（実施例９ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＭＺＢ１０．４ＲＴ−ＰＣＲ）第２のイントロンにわたるＭＺＢ１０．４遺伝子の第２および第３のエキソン
上にプライマーのセットを設計した。プライマーＦＲ−ＭＺＢ１０．４−５６２
（５’ＧＡＴＴＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧ３’配列
番号１５）およびＦＲ−ＭＺＢ１０．４−５６３（５’ＧＧＴＡＣＴＣＡＴ
ＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＧ３’配列番号１６）を、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｃ．ｖ．Ｃ２４由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲにお
いて使用した。３８１ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅し、そしてｐＧＥＭ−Ｔ
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。

【００８７】野生型の種子をＭＳＢ５培地上で発芽させた。苗をポットに移し、そして３週
間２０℃で、かつ８０％の相対湿度で生育させた。植物にＢ．ｃｉｎｅｒｅａ胞
子懸濁液（１０．０×１０⁶胞子／ｍｌあるなしでの０．８％ＫＨ₂ＰＯ₄および
０．２％スクローズ）をスプレーすることによって播種した。症状がサンプルを
発達させ始めた３日後に取り出し、そして液体窒素で凍結し、そして−８０℃に
保存した。

【００８８】ＱｕｉｃｋｐｒｅｐＭｉｃｒｏｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋ
ｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌ
ａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ポリＡ⁺ＲＮＡを抽出した。等量のｍＲＮＡを
使用し、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴ−ｐｒｉｍｅｄＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎ
ｄｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐ
ｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してｃＤＮＡを調製した。５μまたは２μの第
１のストランドｃＤＮＡをＰＣＲ反応において使用した。このＰＣＲ反応は、２
５ｐｍｏｌの各々のプライマー、ＲＦ‐ＭＺＢ１０．４−５６２およびＦＲ−Ｍ
ＺＢ１０．４−５６３、０．５μｌの２０ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ）、２．５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用し、９２℃で３０”、５５℃で３０”、そ
して７２℃で３０”の２２、２４、２６、２８または３０サイクルに供した。等
量を、２．０％アガロースゲル上で分析し、そしてエチジウムブロマイドで染色
した。コントロールとして、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａアクチ
ン遺伝子内の相同領域でプライマーのセットを展開した。プライマー、ＦＲ−ア
クチンー５８６（５’ＧＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧ
ＧＣＡＴＡＣＣＣ３’、配列番号１７）およびＦＲ−アクチン−５８７（
５’ＣＡＣＡＡＴＡＣＣＧＧＴＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＣ３’、配
列番号１８）を、同一な条件下での同じｃＤＮＡサンプルのコントロールＰＣＲ
において使用した。ＲＴ−ＰＣＲの結果の写真を図８に示す。

【００８９】（実施例１０ＭＺＢ１０．４プロモーターの単離およびクローニング）ＰＣＲによるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムからのＭＺＢ１０．４プライマー
の単離のためのプライマーを設計した。プライマーＦＲ−ＭＺＢ１０．４−５５
９（５’ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＧＡＴＡＡＧＡＡＴＣＴＣ
ＣＡＧ３’、配列番号１９）およびプライマーＦＲ−ＭＺＢ１０．４−５６０
（５’ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＴＣＣＧＡＡＧＣ３’配
列番号２０）を、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｃｖＣ２４由
来のゲノムＤＮＡのＰＣＲにおいて使用した。１．６ｋｂのフラグメントを増幅
し、そしてｐＭＯＧ１０５２にクローン化した。ｐＭＯＧ１０５２は、ＳａｃＩ
およびＮｃｏＩで消化され、ＧＵＳイントロンプロモーター遺伝子に融合され（
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：３９０１−３９０７）、
ジャガイモプロテイナーゼインヒビターＩＩ遺伝子の３’非翻訳領域に続く（Ｔ
ｈｏｒｎｂｕｒｇら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８４、７４４−７４８）。このフラグメントは、ｐＭＯＧ１６００を生じる
ポリアデニル化に必要な配列を含む（Ａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔｃｅｌｌ
１，１１５−１２２）。制限部位ＳａｃＩおよびＫｐｎＩに隣接した全体のキ
メラ遺伝子は、次いでｐＭＯＧ８００に移される（ＣｅｎｔｒａａｌＢｕｒｅ
ａｕｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｅｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｕｎｄｅｒＣＢＳ４１４．９３に１９９３年８月
１２日に寄託された）。ｐＭＯＧ８００は、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化され
、ｐＭＯＧ１６０１を生じる。植物は、構築物を用いて基本的に実施例６に記載
される方法と同じ方法を使用して移される。次いで発現プロフィ−ルを基本的に
実施例７に記載される同じ方法に従って作製する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明は、実施例および以下の図面を参照して例示される。

【図１】図１は、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａに感染したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓｔｈａｌｉａｎａ系統５３３−４８８の葉部の組織化学的ＧＵＳ染色の写真
を示す。

【図２】図２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ系統５３３−４８８のＧ
ＵＳプローブでハイブリダイズしたゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。

【図３】図３は、プラスミドｐＭＯＧ１０４０の模式的マップを示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＭＯＧ１０５６の模式的マップを示す。

【図５】図５は、Ｐｈｏｍａｌｉｎｇａｍに感染したｐＭＯＧ１０５６トランスジェ
ニックＢｒａｓｓｉｃａｎａｐａｓ葉部のＧＵＳ染色の写真を示す。

【図６】図６は、Ｐｈｏｍａｌｉｎｇａｍに感染したｐＭＯＧ１０５６トランスジェ
ニックＢｒａｓｓｉｃａｎａｐａｓ茎部のＧＵＳ染色の写真を示す。

【図７】図７Ａは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ染色体ＩＩＩのＢＡＣＭＺＢ１０上のオ
ープンリーディングフレーム３とオープンリーディングフレーム４との間の領域
の組織化を示す。図７Ｂは、示したｐＭＯＧ５５３のＴ−ＤＮＡを挿入したこと
を除いて、図１Ａに示したものと同じ領域を示す。

【図８】図８は、それぞれのレーンにおいて以下を有するアガロースゲルの写真を示す
：Ｍ＝１ｋｂＰＬＵＳＤＮＡラダー、接種していない＝接種していないコン
トロールＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉部、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ接種＝Ｂｏｔｒｙｔｉ
ｓｃｉｎｅｒａの胞子懸濁物を接種したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉部、アクチ
ン＝アクチンプライマーでのＰＣＲ、ＭＺＢ１０．４＝ＭＺＢ１０．４プライマ
ーでのＰＣＲ、２０−３３＝行ったＰＣＲサイクルの数。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA80 CA01 DA01 FA02 GA11 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 BA01 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａより得られ得る
ＤＮＡフラグメントであって、植物に再導入される際に、関連するＤＮＡ配列の
病原体誘導性の転写を促進し得、該植物は配列番号６の４２１〜１４２４のヌク
レオチド配列、または配列番号１４に示されるその相補的な配列あるいはこれら
の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそれらの一部または改
変体を含むことを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡフラグメントであって、配列番号６
の２２２〜１４２４のヌクレオチド配列、またはその相補的な配列あるいはスト
リンジェントな条件下でこれらの配列にハイブリダイズするそれらの一部または
改変体を含むことを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。
【請求項３】請求項１に記載のＤＮＡフラグメントであって、配列番号６
に示される１〜１４２４のヌクレオチド配列、またはその相補的な配列あるいは
ストリンジェントな条件下でこれらの配列にハイブリダイズするそれらの一部ま
たは改変体を含むことを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。
【請求項４】キメラＤＮＡ配列であって、請求項１〜３のいずれか１項に
記載のＤＮＡフラグメントおよびその転写制御下で発現されるＤＮＡ配列を転写
の方向に含み、天然では該ＤＮＡフラグメントの転写制御下でない、キメラＤＮ
Ａ配列。
【請求項５】前記発現されるＤＮＡ配列が、抗病原性タンパク質の産生を
引き起こす、請求項４に記載のキメラＤＮＡ配列。
【請求項６】請求項５に記載のキメラＤＮＡ配列であって、前記抗病原性
タンパク質が、キチナーゼ、グルカナーゼ、オスモチン、マガイニン、レクチン
、サッカリドオキシダーゼ、オキサレートオキシダーゼ、オキサレートデカルボ
キシラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の毒素、Ｍｉ
ｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂ
ｒａｓｓｉｃａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃ
ｎｉｃｕｓ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ、Ｃｌｉｔｏｒｉａ、Ａｌｌｉｕｍの種子、Ａｒ
ａｌｉａおよびＩｍｐａｔｉｅｎｓより単離された抗真菌タンパク質、ならびに
アルブミン型タンパク質（例えば、チオニン、ナピン、オオムギトリプシンイン
ヒビター、シリアルグリアジンおよびコムギαアミラーゼ）からなる群より選択
される、キメラＤＮＡ配列。
【請求項７】請求項４に記載のキメラＤＮＡ配列であって、発現される該
ＤＮＡ配列が、過敏な応答を誘導し得るタンパク質の産生を引き起こし、好まし
くはトマト由来のＣｆ、Ｂｓ３、およびＰｔｏタンパク質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓｔｈａｌｉａｎａ由来のＲｐｍ１およびＲｐｓ２、タバコ由来のＮ−タン
パク質、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｎ由来のａｖｒタンパク質、Ｅ
ｒｗｉｎｉａ由来のｈａｒｐｉｎ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＸａ
ｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のエリシタータンパク質（ａｖｒＢｓ３、ａｖｒＲｐｍ
１、ａｖｒＲｐｔ２）からなる群より選択される、キメラＤＮＡ配列。
【請求項８】請求項４〜７のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ配列を含
む、レプリコン。
【請求項９】レプリコンであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡフラグメントを転写の方向で含み、そして該ＤＮＡフラグメントの制御下
で発現されるＤＮＡ配列の挿入のための制限エンドヌクレアーゼのための少なく
とも１つの認識部位を含む、レプリコン。
【請求項１０】請求項８または９のいずれか１項に記載のレプリコンを含
む、微生物。
【請求項１１】請求項４〜７のいずれか１項に記載のキメラＤＮＡ配列を
そのゲノムに組み込んでいる、植物細胞。
【請求項１２】請求項１１に記載の細胞から本質的になる、植物。
【請求項１３】双子葉植物である、請求項１２に記載の植物。
【請求項１４】Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅファミリーに属する、請求項１１〜
１３のいずれか１項に記載の植物。
【請求項１５】請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の植物より得られ
る種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉および材から選択される植物の一部。
【請求項１６】植物において病原体誘導性の転写を促進し得る相同体を同
定するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントの使用。
【請求項１７】植物を形質転換するための請求項４〜７のいずれか１項に
記載のキメラＤＮＡ配列の使用。
【請求項１８】ハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製するための、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の一部または改変体の使用。
【請求項１９】植物に病原体抵抗性を与えるための請求項４〜７のいずれ
か１項に記載のキメラＤＮＡ配列の使用。