JPH08501923A

JPH08501923A - 根特異的又は根に高率の遺伝子発現のためのアブラナ属調節配列

Info

Publication number: JPH08501923A
Application number: JP5517837A
Authority: JP
Inventors: バスジクジンスキー，クリス・ジエイ; フオーリス，リン; ベルマール，ギイ; ボイビン，ロドルフ
Original assignee: パイオニア・ハイ−ブレツド・インターナシヨナル・インコーポレイテツド
Priority date: 1992-07-16
Filing date: 1993-07-12
Publication date: 1996-03-05
Also published as: EP0651813B1; AU4673893A; NZ254577A; AU672618B2; DE69318558T2; US5401836A; EP0651813A1; ATE166108T1; CA2140014A1; WO1994002619A1; MX9304285A; CA2140014C; DE69318558D1; BR9306737A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｂｒａｓｓｉｃａ種で根に高率の発現を示す単離プロモーターエレメントに関する。プロモーターエレメントは、罹病性根に病害免疫又は抵抗性を付与する異種構造タンパク質の転写を誘起するのに特に有用である。「病害」なる用語は植物自体以外の生物（例えば菌類、細菌及び昆虫）により植物に誘発される有害状態を意味する。プロモーターを組み込んだプラスミドも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】根特異的又は根に高率の遺伝子発現のためのアブラナ属調節配列産業上の利用分野本発明は根に高率の遺伝子発現のための単離プロモーターに関する。より詳細には本発明は更に、異種構造遺伝子、好ましくは植物の根で発現された場合に病害に対する免疫又は抵抗性を植物の根に付与するタンパク質又はペプチドをコードする異種遺伝子と共に単離プロモーターを含む複合遺伝子に係る。本発明は形質転換可能な植物の根に病害に対する免疫又は抵抗性を遺伝的に付与するためのプロモーター及び方法を提供するという点で有用である。発明の背景カノラ及び他の作物では、植物の根に現れる種々の菌類病及び害虫病が存在する。植物の根は地下に位置するが、根病害を予防又は防除するための従来の処理方法は地上で実施される。これらの従来の処理は散布液、粒剤等により種々の化学物質を施用することにより実施される。これらの従来の処理は労力と費用がかかる。多くの場合は、根に局在させるべき化学物質を作物の露出した可食部に施用する。場合によっては、従来の処理では施用した化学物質を地中に浸透させる必要がある。他方、植物の根を損傷しないように注意を払わなければならない。従来の処理は地上から行うので、施用点から最も遠い根ゾーンの部分に有効濃度を維持するためには過剰量の化学物質を施用しなければならない。本発明の目的は、根が菌類病又は害虫病に罹病し易い植物に菌類病又は害虫病に対する免疫又は抵抗性を一般的又は特異的に付与するための手段を提供することである。本発明の別の目的は、従来の処理を実施せずに、植物の可食果実又は葉部分における発病を最小限又は根絶するように、食用作物の根に病害抵抗性を付与するための成分及び方法を提供することである。植物における組織及び器官発生プロセスは、組織又は器官の最終構造及び機能をもたらす細胞分裂、伸長及び分化のパターンを決定する大きい遺伝子組の時間及び空間的発現を含む。例えば、Ｋａｍａｌａｙ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ（Ｃｅｌｌ１９：９３５，１９８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：２８０１，１９８４）は、２５，０００個にも及ぶ種々の遺伝子がタバコ葯で発現され得ると推定した。このうち１０，０００個が葯特異的である。これらの多数の遺伝子が各器官に固有である訳ではないが、数種からの多数の組織型がこれまでに研究され、固体組織で固有又は主に発現されると思われる数組の遺伝子が明らかにされている。Ｂｒａｓｓｉｃａ種における組織特異的発現に関連する遺伝子の同定及び単離はあまり行われていないが、組織又は段階依存発現を示す数種の遺伝子が単離及び特徴付けされている。これらの遺伝子は、種子（Ｓｉｍｏｎら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１９１，１９８５；Ｓｃｏｆｉｅｌｄ及びＣｒｏｕｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２２０２，１９８７；Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ及びＦａｌｌｉｓ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ１４：６３３，１９９０）、葉（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：４７３２，１９８８；Ｂｏｉｖｉｎらの作成中文献）、柱頭（Ｎａｓｒａｌｌａｈら，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ−Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５５５１，１９８８；Ｔｒｉｃｋ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２０３，１９９０）、小胞子及び花粉（Ａｌｂａｎｉら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６０５，１９９０；Ａｌｂａｎｉら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５０１，１９９１）及び最近では根（Ｆａｌｌｉｓ及びＢａｓｚｃｚｙｎｓｋｉの未公開文献；Ｂｅｒｇｅｒｏｎらの作成中文献）に固有又は高率の遺伝子を含む。過去数年間にプロモーターがリポーター又は分子形質転換のための他の耕種遺伝子に融合され、発現の程度及び特異性が測定されている。例えば、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７９４３，１９８７）；Ａｎら（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７，１９８８）；Ｅｌｌｉｓら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０３，１９８８）；Ｇｕｅｒｒｅｒｏら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１６１，１９９０）；Ｏｈｌら（Ｃｅｌｌ２：８３７，１９９０）；ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９５，１９９０）；Ｖｏｒｓｔら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４９１，１９９０）；Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉら（Ｐｒｏｃ．３ｒｄＩＳＰＭＢＩｎｔｅｒｎａｔ．Ｃｏｎｇｒ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ａｂｓｔｒ．４３０，１９９１）；Ｔａｋａｉｗａら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４９，１９９１）；ｖａｎｄｅｒＺａａｌら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９８３，１９９１）を参照されたい。主に根組織で遺伝子の発現を誘起するか又は根を含む数種の組織で発現する配列が数件の報告に記載されている（Ｔｉｎｇｅｙら，ＥＭＢＯＪ．６：１，１９８７；Ａｎら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７，１９８８；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら，Ｇｅｎｅ６３：８７，１９８８；Ｃｏｎｋｌｉｎｇら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９３：１２０３，１９９０；Ｏｈｌら，Ｃｅｌｌ２：８３７，１９９０；ｖａｎｄｅｒＺａａｌら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９８３，１９９１）。米国特許第４，８０３，１６５号（Ａｐｐｌｅｂａｕｍ）は、Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのｎｉｆプロモーターの制御下でＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質を発現させるために、窒素固定生物Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍの形質転換を教示している。米国特許第５，００８，１９４号（Ｒｏｌｆｅら）は更に、Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのｎｉｆＨプロモーターの制御下でＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質を発現させるために、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍの形質転換を教示している。Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅの形質転換窒素固定菌は、実際にマメ科植物の根粒に限られた共生的関係を有するので、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅは世界の非マメ科植物には適用できない。更に、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅはいずれも共生的生物を形質転換しており、植物自体を形質転換している訳ではない。従って、形質転換生物に感染したマメ科植物の種子は親植物の根粒中で細菌により発現される遺伝子を有することができない。従って、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅの発明を利用するためには、マメ科種子の購入者はその土壌を感染させるために適当な形質転換窒素固定生物も購入する必要がある。本発明の目的は、罹病性植物の根に病害に対する免疫又は抵抗性を付与するための手段を提供することである。本発明の別の目的は、各次世代の植物の種子で根病害に対する免疫又は抵抗性を継承することである。発明の要約本発明は、形質転換後の植物の根が菌類病又は害虫病に対する免疫又は抵抗性を提供する毒素又は物質を発現するように、菌類病又は害虫病に罹病性の根を有する植物、特に食用作物を遺伝的に形質転換するための成分及び方法に係る。本発明は数種の態様を有する。第１の態様によると、本発明は根に高率の発現を示す単離プロモーターエレメントに係る。本発明の単離プロモーターエレメントは、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）及び図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有する機能的に等価のヌクレオチド配列を含む。別の態様によると、本発明は更に、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）又は図７の配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有する機能的に等価のヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子に係る。本発明は更に、図７のヌクレオチド配列又は図７のヌクレオチド配列との間に少なくとも９５％の相同度を有する機能的に等価のヌクレオチド配列を含む、ベクターとして機能することが可能な組換えＤＮＡプラスミドに係る。本発明のプラスミドの２例はｐＴＺ１１ＧＵＳ及びｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇである。本発明は更に、罹病性植物の根に病害に対する抵抗性又は免疫を付与するための方法に係り、該方法は、ａ．根に高率の発現を有する遺伝子からのプロモーターと、植物の根を冒す害虫及び／又は菌類病に対する免疫又は抵抗性を付与することが可能なタンパク質又はペプチドをコードする異種ＤＮＡフラグメントとを任意の順序で単離する段階と、ｂ．前記異種ＤＮＡフラグメントが前記プロモーターの下流に配置され且つ発現可能な制御下におかれるように前記プロモーターに対して方向付けられるように、段階（ａ）からの単離プロモーター及び異種ＤＮＡフラグメントを個々に又は組み合わせてベクターに挿入する段階と、ｃ．形質転換後の植物の根が、同一種の非形質転換植物には存在しない病害免疫又は抵抗性を根に付与するタンパク質又はペプチドを発現するように、罹病性植物種、植物細胞又は植物組織プロトプラストを前記ベクターで形質転換する段階とを含む。図面の簡単な説明図１．葉（Ｌ）、花芽（Ｂ）又は根（Ｒ）ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの逆転写から作成した１本鎖ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、低（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４０℃）（上段）及び高（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃）（下段）ストリンジェンシー下で洗浄し、夫々１２及び４８時間オートラジオグラフィーにかけた根ｃＤＮＡクローンＧ１−３ｂの再画線コロニーからの２２個の単離物のドットブロット分析。下段右のドットは、対照としてスポットしたｐＴＺ１８Ｒベクターに対応する。図２．葉（Ｌ）、種子（Ｓ）、花芽（Ｂ）、開いた花（Ｆ）、根（Ｒ）、花弁（Ｐ）、葯（Ａ）及び柱頭（Ｔ）組織からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。ブロットをＧ１−３ｂｃＤＮＡクローンからのＰＣＲ増幅インサートでプローブし、高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，６３℃）下で洗浄し、３．５日間オートラジオグラフィーにかけた。根ＲＮＡでは１．２ｋｂバンドとの強いハイブリダイゼーションが観察され、花弁及び葯組織では類似寸法バンドとの弱いハイブリダイゼーションが観察された。これらの条件下で葉、種子、花、芽又は柱頭組織にシグナルは観察されなかった。図３．鋳型としての全Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ根ＲＮＡ１０μｇと、明細書に要約するようなプライマーとしてのオリゴヌクレオチドＰＥＧ２２を使用したプライマー伸長実験の結果。プライマー伸長産物（Ｐ）の寸法を決定するために、隣接ウェル内の配列決定用ゲルに充填した公知配列のＤＮＡサンプルで配列決定反応を行った。３５、３６、３８及び３９ヌクレオチド（下から上）の寸法を有する４個のバンド（矢印）が得られた。図４．ゲノムクローンＧ１１Ｆの完全ヌクレオチド配列（配列番号１）であり、推定ＡＴＧ翻訳開始部位（囲み部分）及び終結部位（点線の下線）、転写物の寸法及びプライマー伸長産物に基づく予想転写開始部位（矢印）、並びに推定ＣＡＴ及びＴＡＴＡ調節配列（実線の下線）を示す。図５．Ｇ１１Ｆの上流領域のＰＣＲ増幅に使用した合成オリゴヌクレオチドＡ及びＢ。配列５’ＴＡＴＧＧＣＴ．．３’から開始するオリゴヌクレオチドＡ（配列番号２）は、センス鎖上のヌクレオチド−５１８〜−４９６に部分的に対応し、５’ＧＴＴＴＣＡＣ．．．３’から開始するオリゴヌクレオチドＢ（配列番号３）は、プロモーター領域のアンチセンス鎖上のヌクレオチド−１〜−２４に部分的に対応する。各オリゴヌクレオチドの５’末端の付加的ヌクレオチドは、平滑末端化ＤＮＡフラグメントを使用するクローニングに選択する以外に、クローニングのための（指示するような）制限部位を提供する。図６．ＰＣＲ増幅後に得られた最終「プロモーター」領域のヌクレオチド配列（配列番号４）。（配列決定の初期のエラーにより、オリゴヌクレオチドプライマーの合成以前に内部ＸｂａＩ部位を検出することができなかったので）このフラグメントをＨｉｎｄIII単独で消化し、こうして得られたＨｉｎｄIII切断５’末端及び平滑３’末端を有するフラグメントをｐＡＬＬＴＫＲｅｐのＨｉｎｄIII ／ＳｍａＩ切断ベクターフラグメントにクローニングし、図８に示すベクターを生成した。図７．Ｇ１１Ｆにおけるプロモーターの５１８ｂｐヌクレオチド配列（配列番号５）。プロモーターは、図４に示すＡＴＧ開始部位からすぐ上流の５１８塩基対に対応する。図８．根プロモーターをバイナリーベクターｐＡＬＬＴＫＲｅｐ中のＧＵＳリポーター遺伝子の前にクローニングしたバイナリーベクターｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇの地図。図９．ｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇの根プロモーター−ＧＵＳ遺伝子カセットを含む２．７ｋｂＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII切断ｐＴＺ１８Ｒベクターに移入したベクターｐＴＺ１１ＧＵＳの地図。図１０．タバコモザイクウイルスＯ’リーダー配列、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン配列（ＡｄＨ）、ＧＵＳ遺伝子及びジャガイモプロテイナーゼインヒビター遺伝子ターミネーター（ＰｉｎII）を含むリポーター遺伝子カセットの前にＰＣＲ増幅根プロモーターをクローニングしたベクターＤＰ２５５４の地図。このリポーターカセットはトウモロコシで良好に発現することが先に認められた。図１１．リポーター遺伝子としてトウモロコシＲ’遺伝子を含む以外はＤＰ２５５４（図１０）と構造的に類似するベクターＤＰ２５５３の地図。このリポーターカセットもトウモロコシで良好に発現することが先に認められた。図１２．組織化学的ＧＵＳアッセイの結果であり、ｐＡＬＬＴＫＲＴＩＧベクター（Ａ〜Ｄ）又はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの後ろにＧＵＳ遺伝子を含むベクター（Ｅ、陽性対照）で形質転換したトランスジェニックカノラ植物に由来するＲ１実生の根及び根毛では陽性ＧＵＳ発現（暗色又は黒色セクション）が示され、非形質転換Ｂ．ｎａｐｕｓ植物の根（Ｆ、陰性対照）又はｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇトランスジェニック植物の葉（Ｇ）もしくは葉柄（Ｈ）組織では活性は検出されない。発明の詳細な説明本発明は複数の態様を有する。その最も単純な態様によると、本発明は図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有する単離プロモーターに係る。図７のプロモーターは、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（栽培品種Ｗｅｓｔａｒ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＣａｎａｄａ，Ｓａｓｋａｔｏｏｎ））の根に高率の発現を有する構造遺伝子から単離した。本発明の第２に態様によると、単離したプロモーターエレメントを異種構造遺伝子β−グルクロニダーゼ遺伝子と連結し、プロモーターの発現の機能性及び特異性を示すことが可能な複合遺伝子を形成した。本発明のこの態様は、罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与することが可能なタンパク質又はペプチドをコードする異種構造遺伝子と、このプロモーターを併用すると適切であることを立証するものである。本明細書中で使用する「病害」なる用語は、植物の成長速度又は発芽力を悪化させる植物自体以外の生物に起因する有害状態を意味する。植物の根の最も一般的な病源は昆虫、昆虫幼虫又は菌類である。本明細書中で使用する「植物」なる用語は、美観又は商業的価値を含む望ましい特性を有する植物を意味する。特に好適な植物は商業的に有用な作物（食用作物及びタバコを含む）を提供する植物である。単離プロモーターエレメントが外来構造遺伝子の発現を制御するためには、外来構造遺伝子はプロモーターの「下流」即ち３’側に位置しなければならない。第２に、プロモーターの機能的エレメント即ち転写開始部位と翻訳（ＡＴＧ）開始部位との間の塩基対（ｂｐ）距離も発現に影響する。最適距離はプロモーターの機能的エレメントと構造遺伝子のＡＴＧ開始部位のと間の距離を実験的に変化させることにより得られる。一般に、プロモーターと異種構造遺伝子との間の距離がプロモーターと該プロモーターにより通常制御される天然遺伝子との間の距離に類似する場合に妥当な作動性が得られる。本発明では、図７の単離プロモーターは、その天然遺伝子のＡＴＧ開始部位の上流の全塩基を含む。従って、本発明の単離プロモーターに連結することが可能な全異種遺伝子で妥当な作動性が期待される。本発明の単離プロモーターの作動性を試験するために、標準クローニング法を使用してバイナリーベクター中に既に存在するリポーター遺伝子にプロモーターを連結し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ混合培養によりＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓの組織外植片の形質転換に適切なベクター中で複合遺伝子を形成した。得られた形質転換カノラ植物を、リポーター遺伝子の発現について試験した。その結果、Ｂ．ｎａｐｕｓの根は異種リポーター遺伝子の産物を首尾よく発現することができた。ｃＤＮＡライブラリーの構築及びスクリーニングＣａｓｈｍｏｒｅ（Ｍｅｔｈ．Ｃｈｌｏｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ３８７−３９２，１９８２）に従って６〜７日齢Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（栽培品種Ｗｅｓｔａｒ）実生の初生根１０ｇから全ＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーにより精製し、Ｂｅｌｌｅｍａｒｅら（Ｇｅｎｅ５２：１１−１９，１９８７）の方法に従って定方向プラスミドをベースとするｃＤＮＡライブラリーを作成するために使用した。得られたｃＤＮＡライブラリーを２〜４×１０³細胞／プレートの密度で１２個のプレートにプレーティングし、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８２）に従ってコロニーを釣菌した。各プレートのレプリカを作成し、多重プロービングを行った。フィルターを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ）１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５００μｇ／ｍｌヘパリン、０．１％ピロリン酸ナトリウム及び０．１ｇ／ｍｌデキストラン硫酸中で２〜６時間４２℃でプレハイブリダイズした。「１×ＳＳＰＥ」は、ｐＨ７．４の１０ｍＭ硫酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡの溶液を意味する。根、葉、種子又は花芽組織から予め単離したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの逆転写から作成した１本鎖ｃＤＮＡをプローブとして含む同一溶液中で、レプリカブロットのハイブリダイゼーションを一晩実施した。ブロットを高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ中６５℃）下で洗浄し、プラスチックラップに包み、オートラジオグラフィーにかけた。「１×ＳＳＣ」は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の１５ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液を意味する。根ｃＤＮＡでプローブしたブロット上には陽性ハイブリダイゼーションシグナルを発生するが、他の組織のｃＤＮＡプローブではこのようなシグナルを発生しないコロニーをマスタープレートに移した。レプリカを作成し、上述のようにスクリーニングを更に２回行った。推定陽性クローンを選択した。次に陽性クローンを再プレーティングし、新しい独立コロニーを単離し、元のコロニー中に２個以上のコロニーが存在しないようにした。次に、１本鎖ｃＤＮＡプローブを使用して単離コロニーからのＤＮＡをドットブロット分析した。ドットブロットにより分析した１個のコロニーＧ１ −３ｂからの２２個の単離物から、高ストリンジェンシー洗浄（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃）下で根特異的ハイブリダイゼーシヨンを示す１３個のクローンが得られた。クローンＧ１−３ｂ＃１２（以下、Ｇ１−３ｂと呼称する）を選択して更に特徴付けした。このクローンからのＤＮＡの制限消化物は３１１ヌクレオチドのみのインサートをもたらした。Ｇ１−３ｂの特異性を更に立証するためにノーザンブロット分析を実施した（図２）。図２のノーザンブロットでは、葉、種子、花芽、開いた花、根、花弁、葯及び柱頭組織の各々からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（８〜９μｇ）をゲル上で分離し、ブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８２）。その後、ブロットをＧ１−３ｂｃＤＮＡクローンからのＰＣＲ増幅インサートでプローブし、高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，６３℃）下で洗浄した。洗浄したブロットを３．５日間オートラジオグラフィーにかけた。根ＲＮＡでは１．２ｋｂバンドとの強いハイブリダイゼーションが観察され、花弁及び朽組織では類似のバンドとの弱いハイブリダイゼーションが観察された。葉、種子、花、芽又は柱頭組織ではこれらの条件下でシグナルは観察されなかった。ゲノムクローンの単離及び特徴付けｃＤＮＡクローンＧ１−３ｂからのインサートを切り出し、ｐＴＺ１８Ｒ（Ｍｅａｄら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．１：６７，１９８６）との間に相同性をもたないベクターであるｐＤＢ２１（Ｂｉｏｖｉｎ及びＢｅｌｌｅｍａｒｅ，ＧＡＴＡ８：１８１，１９９１）に移入した。得られたプラスミドを使用して、４２サブフラクションとして構築したｐＴＺ１８Ｒをベースとするゲノムライブラリー（Ｎａｎｔｅｌら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９５５，１９９１）をスクリーニングした。ｐＤＢ２１中のＧ１−３ｂをプローブとして使用した処、２個のサブフラクションが陽性のハイブリダイゼーションシグナルを生じた。これらの２つのサブフラクションを使用して引き続き上述のようにコロニーハイブリダイゼーションを行った。独立ゲノムサブフラクションからの２個のクローンＧ１１Ｆ及びＧ３８Ｆを単離し、Ｓａｎｇｅｒ（ＳａｎｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３，１９７７）の方法を使用して配列決定した。元のＧ１−３ｂｃＤＮＡクローンもＳａｎｇｅｒの方法を使用して配列決定した。独立して構築したＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ根ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするためにｐＤＢ２１中のＧ１−３ｂインサートを使用し、多数の同種クローンを生成した後、配列決定及び特徴付け（Ｂｅｒｇｅｒｏｎらの作成中文献）し、ゲノムクローン中の５’調節配列を同定するのに利用した。プライマー伸長予想ＡＴＧ開始部位の１５５ヌクレオチド下流の２１ｂｐ配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマーＰＥＧ２２（５’−ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡ）（配列番号６）２００ｎｇを交換反応により放射性標識した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８２）。根全ＲＮＡ１０μｇを標識化オリゴヌクレオチドプライマー８０ｎｇの存在下で８０℃で３分間変性させた。逆転写緩衝液（最終濃度１００ｍＭＴｒｉｓ− ＨＣｌｐＨ８．３，２ｍＭＭｇＣｌ₂，５０ｍＭＫＣｌ）を加え、混合物を４５分間５７℃でインキュベートした。その後、全４×ｄＮＴＰ（各々最終濃度０．５ｍＭ）及びＲＮＡアーゼＨ^-マウスＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス（Ｍ −ＭＬＶ）逆転写酵素（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２００Ｕを混合物に加え、更に４５分間５０℃でインキュベートした。０．３ＭＮａＯＨの存在下で３７℃で３０分間インキュベートすることによりＲＮＡを分解し、溶液をｐＨ７．５の０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び０．３ＭＨＣｌで中和した。フェノール抽出後、核酸をエタノール沈殿させた。６％配列決定用ゲルに反応混合物の２分の１を充填し、公知寸法の配列ラッダーと共に泳動させた。根「プロモーター」の同定及び単離新しい根ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより回収した数個のＧ１−３ｂ近縁ｃＤＮＡクローンのうちで、１．２ｋｂの予想転写物寸法に基づいて完全長であると思われるクローンは皆無であった。ゲノムクローンＧ１１Ｆの配列（図４）から推定ＡＴＧ翻訳開始部位を同定した。開始部位の同定は転写物の寸法、イントロンなしの仮定、並びにこのＡＴＧから短距離上流のＣＡＴ及びＴＡＴＡ様配列の存在に基づいて実施した。ＡＴＧ開始部位の位置を確認するために、全ＲＮＡ及び推定ＡＴＧの１５５ヌクレオチド下流の配列とハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチドを使用してプライマー伸長を実施した。４個の鮮明な同強度のバンド（推定ＡＴＧの５’側の３９、３８、３６及び３５ヌクレオチド）がオートラジオグラフィー上で観察された（図３）。本発明者らは、転写物リーダー配列の長さが僅かに異なる多重同種転写物の存在（この根クローンは同一遺伝子族の一部である）又は逆転写酵素の早期停止に２個以上のバンドの存在が起因するとみなす。他方、得られたプライマー伸長産物の寸法から、Ｇ１１Ｆにおける予想翻訳開始部位は実際に図４のヌクレオチド配列上に指示するような真の開始部位であることが確認された。ＡＴＧ開始部位の５’側の有効な配列に基づき、２つの相補的オリゴヌクレオチド夫々オリゴヌクレオチドＡ及びＢを合成し、Ｇ１１Ｆの上流領域のＰＣＲ増幅に使用した。第１のオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドＡ（配列番号２）は３４ｂｐ合成オリゴヌクレオチドである。配列５’ＡＴＧＧＣＴ．．．３’から開始するオリゴヌクレオチドＡは、センス鎖上のヌクレオチド−５１８〜−４９６に対応する。図５に示すように、オリゴヌクレオチドＡは更に、センス鎖上の塩基対−５１８に対応するヌクレオチドのすぐ上流の位置にＨｉｎｄII I制限部位ＡＡＧＣＴＴを含む。オリゴヌクレオチドＢ（配列番号３）は３５ｂｐ合成オリゴヌクレオチドである。５’ＧＴＴＴＣＡＣ．．．３’から開始するオリゴヌクレオチドＢは、プロモーター領域のアンチセンス鎖上のヌクレオチド−１〜−２４に対応する。図５に示すように、オリゴヌクレオチドＢは更に、ＸｂａＩ制限部位に対応する６個のヌクレオチドＴＣＴＡＧＡを含む。こうして得られた５’及び３’末端に夫々ＨｉｎｄIII 及びＸｂａＩ制限部位を有するプロモーターを図６（配列番号４）に示す。ＸｂａＩ制限部位はプロモーターフラグメントから下流に外来構造遺伝子又は外来ＤＮＡフラグメントを加えることができる。ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ制限部位のみを挙げたが、当業者は他の制限部位も同様に使用できることを理解されよう。参考資料として本明細書の一部とする以下の文献：Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（１９８２）“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．９８−１０６；並びにＢｅｌｌｅｍａｒｅ，Ｇ．及びＰｏｔｖｉｎ，Ｃ．（１９９０）．“ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅ−II ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓａｎｄＣｌｏｎｉｎｇｏｆＮｏｎ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌＣｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄＦｒａｇｍｅｎｔｓＷｉｔｈｏｕｔＳｅｌｆ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＮｏｎｐａｌｉｎｄｏｒｏｍｉｃＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｄａｐｔｅｒｓ，”Ｇｅｎｅ１０１：６７−７４は、当業者に使用可能な多数の制限部位を挙げている。本発明の５１８ｂｐプロモーターのヌクレオチド配列（図７、配列番号５）及び種々の制限部位における塩基の教示に基づき、当業者は５’及び３’末端に種々の同等の制限部位を有する本発明のプロモーター（配列番号５）をクローンすることができよう。従って、最も単純な態様によると本発明は図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む単離プロモーターエレメントに係る。当業者はプロモーターエレメントの各ｂｐがプロモーター活性の保持に必須ではないことを理解されよう。非有効量の塩基対を除去又は置換しても、プロモーター活性は失われない。本発明者らは、図７の配列（配列番号５）との間の相同度の損失が５％であるならばプロモーター活性を損なわないと想定する。従って、図７のプロモーター配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有しており且つ該配列と可能的に等価の単離プロモーターも本発明の範囲に含まれる。最後に、本発明はＢｒａｓｓｉｃａ種で根に高率の発現を示す遺伝子のプロモーターと図７の配列（配列番号５）とを含む組換えＤＮＡ分子に係る。複合遺伝子別の態様によると、本発明は更に図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有するプロモーターと、該プロモーターの制御下におかれた異種構造遺伝子、好ましくは罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与することが可能な構造遺伝子とを含む複合遺伝子に係る。本発明の根プロモーターの制御下の構造遺伝子の選択は、植物根が罹病し得る病害に依存する。例えば、植物根が鱗翅目幼虫により消耗される場合には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質（δ−エンドトキシンとしても知られる）が有効であると報告されている。Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８；１９６０（１９８３）参照。参考資料として本明細書の一部とするＷｏｎｇらの文献は、結晶タンパク質配列の９９９ｂｐをコードするＤＮＡ配列と１７６ｂｐの５’フランキング配列を開示している。ｐＥＳＩ（ＡＴＣＣＮｏ．３１９９５）からのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質遺伝子の単離を教示する米国特許第４，８０３，１６５号も参考資料として本明細書の一部とする。ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからのＣｒｙIIＢ結晶タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する精製単離遺伝子を教示する米国特許第５，０７３，６３２号；及び新規Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び関連殺虫組成物を教示する米国特許第５，０８０，８９７号も参考資料として本明細書の一部とする。本発明のプロモーターと該プロモーターの制御下の結晶タンパク質遺伝子とを有する本発明の複合遺伝子は、図６のプロモーター（配列番号４）のクローニングについて上述した方法を使用して結晶タンパク質遺伝子をクローニングすることにより作成される。核酸セグメントにいずれも固有であるという条件でプロモーターの３’末端及び結晶タンパク質遺伝子の５’末端に同一の制限部位を選択することにより、プロモーターの３’末端と結晶タンパク質遺伝子の５’末端を適当な制限エンドヌクレアーゼ消化後に連結することができる。得られた複合遺伝子において、結晶タンパク質の発現は図７のプロモーターの制御下におかれる。プロモーターと結晶タンパク質遺伝子との間の距離を変えることにより、当業者は結晶タンパク質の発現を最適化することができる。この距離を変えるには、３’末端に付加的又はより少数の塩基対を有するプロモーターをクローニングするなどの従来のクローニング技術を使用することができる。延長又は短縮したプロモーターを次に構造遺伝子の５’末端の適当な制限部位に連結する。あるいは、プロモーターの３’末端に遺伝子を連結するために使用される制限部位よりも下流で且つＡＴＧ開始部位の上流に付加的塩基をクローニングすることにより、プロモーターと構造遺伝子との間の距離を延長することもできる。コドン利用を最適化するための塩基修飾又はエンハンサー配列の付加等のような他の改変により、構造遺伝子の発現を更に改善することができる。上記記載は、本発明のプロモーターの制御下の完全結晶タンパク質遺伝子を有する複合遺伝子を教示するものである。もっとも、完全タンパク質遺伝子の代わりに部分タンパク質遺伝子、即ち結晶タンパク質の殺虫毒性フラグメントをコードする遺伝子を使用することが有利な場合もある。本明細書中で使用する「殺虫毒性」なる用語は、タンパク質であるかポリペプチドであるかに拘わらず、毒性のフラグメント又は昆虫消化管内で１種以上の酵素により毒性にされ得るフラグメントを包含する。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質をコードするこのような部分タンパク質遺伝子は、参考資料として本明細書の一部とするＳｃｈｎｅｐｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：６２７３−８０１９８５に開示されている。部分遺伝子の構築及び毒性保持試験はいずれも当業者に周知の技術である。本発明は更に、植物における根病害の第２の主要な病源である菌類にも関する。植物の根が菌類病に罹病性である場合、本発明の単離プロモーターの制御下の構造遺伝子は、静菌又は殺菌剤をコードする。静菌又は殺菌剤なる用語は、夫々菌類を抑制又は死滅させる化学物質、典型的にはタンパク質又はペプチドを意味する。ベクター構築別の態様によると、本発明は図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む、ベクターとして機能することが可能な組換えＤＮＡプラスミドに関する。１例として、図６に対応するプロモーター領域（配列番号４）を精製し、バイナリー植物形質転換ベクターｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇの構築に使用した。図８に示すように、ｐＡＬＬＴＫＲｅｐの固有のＨｉｎｄIII及びＳｍａＩ部位を使用して、バイナリーベクターｐＡＬＬＴＫＲｅｐ中のβ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（「ＧＵＳリポーター遺伝子」）の上流に、ＨｉｎｄIII制限部位を５’末端に有しており且つＰＣＲ増幅「プロモーター」領域の天然３’末端に対応する平滑末端を３ ’末端に有するプロモーターをクローニングした。ベクターｐＡＬＬＴＫＲｅｐの構築のために、ｐＢ１１０１．３（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）のＮｈｅＩ／ＣｌａＩベクター成分及びｐＡＬＬＮＰＴ１（Ａｒｎｏｌｄｏら，１９９１の記載に従って構築したｐＡＬＬＫａｎｌに本質的に等価のベクター）のＸｂａＩ／ＳｍａＩインサート成分を精製し、４×ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）の存在下で室温で２５分間インキュベーション後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で１５℃で一晩連結することによりオーバーハング末端を「充填」した。Ａｒｎｏｌｄｏら（１９９２）“ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓＵｎｄｅｒＦｉｅｌｄＣｏｎｄｉｓｉｏｎｓ，” Ｇｅｎｏｍｅ３５：５８−６３。制限酵素でＤＮＡを分析することにより、適正な向きのインサートを含むクローンを選択した。ｐＡＬＬＴＫＲ１Ｇの根プロモーター−ＧＵＳ遺伝子カセットを含む２．７ｋｂＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを除去し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 切断ｐＴＺ１８ベクターに挿入することにより、第２のベクターｐＴＺ１１ＧＵＳ（図９）も構築した。ｐＴＺ１８ベクターはＰｈａｒｍａｃｉａＰ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から市販されている。その後、ＰＴＺ１１ＧＵＳ構築物を使用してプロモーター−遺伝子接合体を配列決定し、ＰＣＲ増幅又はクローニング中に誘発され得る突然変異の不在を確認した。ゲノムクローンの対応配列との相違は認められなかつた。植物形質転換本発明は更に、罹病性植物根に病害抵抗性又は免疫を付与するための方法に係り、該方法は、ａ．根に高率の発現を有する遺伝子からのプロモーターと、植物の根を冒す害虫及び／又は菌類病に対する免疫又は抵抗性を付与することが可能なタンパク質又はペプチドをコードする異種ＤＮＡフラグメントとを任意の順序で単離する段階と、ｂ．前記異種ＤＮＡフラグメントが前記プロモーターの下流に配置され且つ発現可能な制御下におかれるように前記プロモーターに対して方向付けられるように、段階（ａ）からの単離プロモーター及び異種ＤＮＡフラグメントを個々に又は組み合わせてベクターに挿入する段階と、ｃ．形質転換後の植物の根が、同一種の非形質転換植物には存在しない病害免疫又は抵抗性を前記根に付与するタンパク質又はペプチドを発現するように、罹病性植物種、植物細胞又は植物組織プロトプラストを前記ベクターで形質転換する段階とを含む。本発明において、形質転換植物の種子は、根病害に対する免疫又は抵抗性を付与する遺伝子を有する。本発明の植物の形質転換方法は多くの場合には、形質転換すべき罹病性植物が単子葉植物として分類されるか双子葉植物として分類されるかにより異なる。発芽種子が単一の葉を有する場合には植物は単子葉植物である。例えば単子葉植物はトウモロコシ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、モロコシ、コメ、イネ科牧草等を含む。発芽種子が２枚の葉を有する場合には植物は双子葉植物である。双子葉植物は果樹、つる植物及び低木、並びに大部分の野菜及び花卉類を含む。単子葉植物と双子葉植物の形質転換の機序は相互に異なる。双子葉植物の大部分と少数の単子葉植物（ユリ及びアスパラガス）は、無制御の細胞増殖をもたらす腫瘍が病巣部位に出現するクラウンゴール病に罹病し得る。腫瘍は土壌伝染細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの感染に起因する。クラウンゴール病に罹病し得る双子葉植物は、無傷のＴｉ（腫瘍誘発）プラスミドを担持するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して形質転換することが可能である。罹病性双子葉植物を形質転換するにはまず最初に、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの非必須領域又はＴ−ＤＮＡを挿入したプラスミド（例えばｐＢＲ３２２）に、発現させるべき遺伝子（例えば本発明の複合遺伝子）を挿入する。このような遺伝子挿入技術は当業者に周知であり、例えば参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする以下の文献：Ｓｃｈｅｌｌら，１９８３“ＴｈｅＴｉＰｌａｓｍｉｄｓａｓＮａｔｕｒａｌａｎｄＰｒａｃｔｉｃａｌＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＰｌａｎｔｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：１７５−１８０；Ｈｅｒｒｅｒａ − Ｅｓｔｒｅｌｌａら，１９８４“Ｌｉｇｈｔ−ＩｎｄｕｃｉｂｌｅａｎｄＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａＣｈｉｍｅｒｉｃＧｅｎｅＩｎｔｒｏｄｕｃｅｄＩｎｔｏＮｉｃｏｔｉａｎａＴｏｂａｃｕｍＵｓｉｎｇａＴｉＰｌａｓｍｉｄＶｅｃｔｏｒ，” Ｎａｔｕｒｅ３１０：１１５−１２０；Ｐｅｒａｌｔａら，１９８５ “Ｔ−ＤＮＡＢｏｒｄｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅｓＲｅｑｕｉｒｅｄＦｏｒＣｒｏｗｎＧａｌｌＴｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２；５１１２− ５１１６；及びＢａｒｔｏｎら，１９８３“ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＩｎｔａｃｔＴｏｂａｃｃｏＰｌａｎｔｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＦｕｌｌＬｅｎｇｔｈＣｏｐｉｅｓｏｆＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴ−ＤＮＡ，ａｎｄｔｈｅＴｒｎａｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＴ−ＤＮＡｔｏＲ１Ｐｒｏｇｅｎｙ，” Ｃｅｌｌ３２：１０３３−１０４３に記載されている。次に、Ｔ−ＤＮＡの非必須領域に本発明の複合遺伝子を含むプラスミドを、無傷のＴｉプラスミドを担持する細菌Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに導入する。植物の病巣部位にこれらの細菌を感染させた後、無傷のＴｉプラスミド上のｖｉｒ領域の遺伝子産物は組換えＴ−ＤＮＡを移動させ、該ＤＮＡは植物ゲノムに組み込まれる。当業者に周知の植物再生技術を使用して、形質転換植物細胞又は部分を形質転換植物に再生させる。例えば、参考資料として本明細書の一部とするＥｌｌｉｓら，“ＴｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｅａｌｅｇｕｍｉｎｇｅｎｅｉｎｓｅｅｄｓｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ，” ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０３−２１４（１９８８）を参照されたい。この技術により再生される植物は体細胞と生殖細胞の両者に本発明の複合遺伝子を有する。従って、本発明に従って形質転換した植物は図７のプロモーター（配列番号５）の制御下の異種構造遺伝子を発現できるのみならず、その形質を子孫に継承することが可能である。プロモーターがＧＵＳリポーター遺伝子を発現する能力を試験するために、Ｍｏｌｏｎｅｙら，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．８：２３８−２４２（１９８９）の記載にほぼ従って、子葉外植片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ混合培養により、ｐＡＬＬＴＫＲＴ１ＧベクターをＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓに導入した。再生植物からの自殖種子を採取し、ＧＭ培地（ＭＳ有機物、３％スクロース、０．２％Ｇｅｌ−ｒｉｔｅ）上で７〜２０日間発芽させた。小植物のクローンを培地に維持し、１組のクローンを温室内で土壌に移し、Ｒ２集団分析のために成熟トランスジェニック植物及び種子を回収した。０．５ｍＭＫ₃［Ｆｅ（ＣＮ）₆］，０．５ｍＭＫ₄［Ｆｅ（ＣＮ）₅］，１ｍＭＥＤＴＡ及び２ｍＭＸ −Ｇｌｕｃ（Ｘ−Ｇｌｕｃは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−グルクロニドであり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている）を含有するｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中でインキュベートすることにより、培養中のカナマイシン抵抗性実生から切除した根のβ−グルクロニダーゼ活性をアッセイした。初生根と側根の接合部では青色染色のパッチとして、側根では画線としてＧＵＳ活性が検出され、根毛も青色に染色した（図１２Ａ〜Ｄ）。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより誘起したＧＵＳ遺伝子を含むベクターで形質転換した実生は根が青色染色し（陽性対照、図１２Ｅ）、ｉ）非形質転換実生からの根（図１２Ｆ）、又はii）ｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇ形質転換植物に由来する実生からの葉もしくは葉柄組織（図１２Ｇ〜Ｈ）ではＧＵＳ活性は検出できなかった。これは、このプロモーターの根特異性を立証するものである。バイナリーベクターｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇは上述のようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系による双子葉植物の形質転換に主に有用であるが、このベクター及び非バイナリー誘導体は、粒子撃ち込み（Ｗａｎｇら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４３３−４３９，１９８８；Ｃｈｉｂｂａｒら，Ｇｅｎｏｍｅ３４：４５３−４６０，１９９１）、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５８２４−５８２８，１９８５；Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：２０４−２０７，１９８８）、又は他の非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに基づくシステム（Ｃｕｔｌｅｒら，Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１７：２９−４０，１９８４；Ｒｅｉｃｈら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１００１−１００４，１９８６；ｄｅｌａＰｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ３２５：２７４−２７６，１９８７）のような直接ＤＮＡ形質転換方法でも有用であり、上記全文献は参考資料として本明細書の一部とする。上述のように、２種の単子葉植物（ユリ及びアスパラガス）のみはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染及び形質転換が可能である。従って、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ、エンバク、モロコシ等のような経済的に重要な単子葉植物を形質転換するためには、上記直接ＤＮＡ形質転換法のような種々の技術が必要である。本発明のプロモーターが単子葉植物における組織特異的遺伝子発現に有用であるか否かを試験するために、別の２種のベクターを構築した。第１のベクターはＤＰ２５５４（図１０）である。図１０の地図に示すように、ＤＰ２５５４は、タバコモザイクウイルスＯ’リーダー配列、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン配列（ＡｄＨ）、ＧＵＳ遺伝子、及びジャガイモプロテイナーゼインヒビター遺伝子ターミネーター（ＰｉｎII ）を含むリポーター遺伝子カセットの前に本発明のＰＣＲ増幅根プロモーターを含む。このリポーターカセットはトウモロコシ及び単子葉植物一般で良好に発現することが先に認められており、参考資料として本明細書の一部とする同時係属米国特許出願第０７／３８７，７３９号により詳細に記載されている。第２のベクターはＤＰ２５５３（図１１）である。図１１の地図に示すように、ＤＰ２５５３はそのリポーターカセットがＧＵＳ遺伝子の代わりにトウモロコシＲ’遺伝子を含むという点を除き、ＤＰ２５５４と構造的に類似する。このリポーターカセットは同じく本願出願人名義の同時係属米国特許出願第０７／３８７，７３９号に記載されている。これらのリポーターカセットの成分は、その効力は低いと思われるが単子葉植物でも作用し得ると考えられる。単に上述のように成分を組み合わせることにより、導入プロモーターが弱いプロモーターであったとしても該プロモーターからのリポーター遺伝子発現の検出確率を最大にすることができる。上記技術以外に、植物又は植物細胞にベクターを導入するために当業者に公知の他の形質転換技術により本発明の複合遺伝子を発現させるために罹病性植物を形質転換することができ、このような公知技術の非限定的な例としては、リン酸カルシウム共沈法、リポソーム、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション又はマクロインジェクション及びウイルス感染を挙げることができる。配列表配列番号：１配列の長さ：１５０５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ株名：Ｗｅｓｔａｒ分化の程度：体細胞組織の種類：根配列配列番号：２配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ株名：Ｗｅｓｔａｒ分化の程度：体細胞組織の種類：根配列配列番号：３配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ株名：Ｗｅｓｔａｒ分化の程度：体細胞組織の種類：根配列配列番号：４配列の長さ：５４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ株名：Ｗｅｓｔａｒ分化の程度：体細胞組織の種類：根配列配列番号：５配列の長さ：５１８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセティカル：ＮＯアンチセンス：ＮＯ起源生物名：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ株名：Ｗｅｓｔａｒ分化の程度：体細胞組織の種類：根配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年６月２４日【補正内容】１９９０）、小胞子及び花粉（Ａｌｂａｎｉら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６０５，１９９０；Ａｌｂａｎｉら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５０１，１９９１）及び最近では根（Ｆａｌｌｉｓ及びＢａｓｚｃｚｙｎｓｋｉの未公開文献；Ｂｅｒｇｅｒｏｎらの作成中文献）に固有又は高率の遺伝子を含む。過去数年間にプロモーターがリポーター又は分子形質転換のための他の耕種遺伝子に融合され、発現の程度及び特異性が測定されている。例えば、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７９４３，１９８７）；Ａｎら（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７，１９８８）；Ｅｌｌｉｓら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０３，１９８８）；Ｇｕｅｒｒｅｒｏら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１６１，１９９０）；Ｏｈｌら（Ｃｅｌｌ２：８３７，１９９０）；ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９５，１９９０）；Ｖｏｒｓｔら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４９１，１９９０）；Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉら（Ｐｒｏｃ．３ｒｄＩＳＰＭＢＩｎｔｅｒｎａｔ．Ｃｏｎｇｒ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ａｂｓｔｒ．４３０，１９９１）；Ｔａｋａｉｗａら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ１．１６：４９，１９９１）；ｖａｎｄｅｒＺａａｌら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９８３，１９９１）を参照されたい。主に根組織で遺伝子の発現を誘起するか又は根を含む数種の組織で発現する配列が数件の報告に記載されている（Ｔｉｎｇｅｙら，ＥＭＢＯＪ．６：１，１９８７；Ａｎら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７，１９８８；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら，Ｇｅｎｅ６３：８７，１９８８；Ｃｏｎｋｌｉｎｇら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９３：１２０３，１９９０；Ｏｈｌら，Ｃｅｌｌ２：８３７，１９９０；ｖａｎｄｅｒＺａａｌら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：９８３，１９９１）。例えば、Ｃｒｏｙら（国際公開明細書第ＷＯ９１／１３９９２号）は伸長遺伝子を調節するプロモーターをＢｒａｓｓｉｃａから単離しており、ｄｅＦｒａｍｏｎｄ（ヨーロッパ特許出願公開第０４５２３６９号）はメタロチオネイン様遺伝子を調節するトウモロコシプロモーターを単離している。しかしながら、ｄｅＦｒａｍｏｎｄのプロモーターは葉及び茎組織と根で異種遺伝子の発現を調節することが示されているものの、Ｃｒｏｙらは伸長プロモーターが異種遺伝子を根特異的に調節し得ることを示していない。本明細書中に記載するように、異種遺伝子の発現を根特異的又は根で高率に調節することが可能なプロモーターは、菌類病に対する抵抗性を付与するために使用することができる。例えば、菌類細胞壁の一体部分を形成する多糖を分解するキチナーゼの合成を誘起するためにこのようなプロモーターを使用することができる。Ｂｒａｇｌｉｅら（国際公開明細書第ＷＯ９０／０７００１号）は、病原菌類に対する抵抗性を付与するために使用可能な植物キチナーゼ遺伝子の単離を記載している。あるいは、根特異的又は根に高率のプロモーターを使用して殺虫毒素遺伝子の発現を調節することもできる。このような遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質をコードするＤＮＡ遺伝子を含む。例えば、特定型のエンドトキシンをコードする遺伝子を使用して鱗翅目昆虫幼虫（Ｗｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１９６０（１９８３））及び鞘翅目（Ｖａｅｃｋら，ヨーロッパ特許公開明細書第０３０５２７５号）に対する抵抗性を付与することができる。従って、根特異的又は根に高率のプロモーターとＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシン遺伝子とからなる複合遺伝子を使用して害虫病からの保護を提供することができる。米国特許第４，８０３，１６５号（Ａｐｐｌｅｂａｕｍ）は、Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのｎｉｆプロモーターの制御下でＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質を発現させるために、窒素固定生物Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍの形質転換を教示している。米国特許第５，００８，１９４号（Ｒｏｌｆｅら）は更に、Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのｎｉｆＨプロモーターの制御下でＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質を発現させるために、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍの形質転換を教示している。Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅの形質転換窒素固定菌は、実際にマメ科植物の根粒に限られた共生的関係を有するので、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅは世界の非マメ科植物には適用できない。更に、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅはいずれも共生的生物を形質転換しており、植物自体を形質転換している訳ではない。従って、形質転換生物に感染したマメ科植物の種子は親植物の根粒中で細菌により発現される遺伝子を有することができない。従つて、Ａｐｐｌｅｂａｕｍ及びＲｏｌｆｅの発明を利用するためには、マメ科種子の購入者はその土壌を感染させるために適当な形質転換窒素固定生物も購入する必要がある。本発明の目的は、罹病性植物の根に病害に対する免疫又は抵抗性を付与するための手段を提供することである。本発明の別の目的は、各次世代の植物の種子で根病害に対する免疫又は抵抗性を継承することである。請求の範囲１．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有しており且つ該配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を含む、根における遺伝子発現を増進するための単離プロモーターエレメント。２．前記プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む請求項１に記載のプロモーター。３．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）から構成される単離プロモーターエレメント。４．Ｂｒａｓｓｉｃａ種で根に高率の発現を示す遺伝子のプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子であって、前記プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む組換えＤＮＡ分子。５．ベクターとして機能することが可能であり、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有しており且つ該配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡプラスミド。６．プラスミドが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む請求項５に記載のプラスミド。７．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有するプロモーターと、異種構造遺伝子とからなる複合遺伝子。８．異種構造遺伝子が罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与することが可能である請求項７に記載の複合遺伝子。９．異種構造遺伝子が１種以上の昆虫に対して毒性であるタンパク質をコードする請求項７に記載の複合遺伝子。１０．異種構造遺伝子が１種以上の菌類に対して毒性であるタンパク質をコードする請求項７に記載の複合遺伝子。１１．異種構造遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質又はその殺虫毒性フラグメントをコードする請求項９に記載の複合遺伝子。１２．罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与するための方法であって、前記根における高率の発現が可能であり且つ図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有するプロモーターと、前記免疫又は抵抗性を付与するタンパク質又はペプチドをコードする異種構造遺伝子とからなる複合遺伝子で罹病性根を有する植物を形質転換することからなる方法。１３．異種構造遺伝子が１種以上の昆虫に対して毒性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする請求項１２に記載の方法。１４．異種構造遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質又はその殺虫毒性フラグメントをコードする請求項１３に記載の方法。１５．異種構造遺伝子が１種以上の菌類に対して毒性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする請求項１２に記載の方法。１６．罹病性植物の根が、カノラ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ、エンバク、モロコシ及びタバコの根からなる群の１員である請求項１２に記載の方法。１７．罹病性植物の根が、カノラ、モロコシ及びタバコの根からなる群の１員である請求項１６に記載の方法。１８．罹病性植物の根が、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ及びエンバクの根からなる群の１員である請求項１６に記載の方法。１９．罹病性植物の根に病害に対する抵抗性又は免疫を付与するための方法であって、ａ．根に高率の発現を有する遺伝子に由来し、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との相同度が少なくとも９５％であるヌクレオチド配列を有するプロモーターと、植物の根を冒す害虫又は菌類病に対する免疫又は抵抗性を付与することが可能なタンパク質又はペプチドをコードする異種ＤＮＡフラグメントとを任意の順序で単離する段階と、ｂ．段階（ａ）からの単離プロモーター及び異種ＤＮＡフラグメントを個々に又は組み合わせてベクターに挿入し、前記異種ＤＮＡフラグメントが前記プロモーターの下流に配置され且つ発現可能な制御下におかれるように前記プロモーターに対して方向付けられたハイブリッドベクターを形成する段階と、ｃ．形質転換後の植物の根が、同一種の非形質転換植物には存在しない病害免疫又は抵抗性を前記根に付与するタンパク質又はペプチドを発現するように、罹病性植物種、植物細胞又は植物組織プロトプラストを前記ハイブリッドベクターで形質転換する段階とを含む方法。２０．プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む請求項１９に記載の方法。２１．プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）から構成される請求項２０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者ベルマール，ギイカナダ国、ケベツク・ジー・１・テイー・１・エイ・９、シルリー、バーボンニール・2181 (72)発明者ボイビン，ロドルフカナダ国、ケベツク・ジー・15・２・エヌ・７、ケベツク、チヤーチ・セント・フオイ・1439、アパートメント・47

Claims

【特許請求の範囲】１．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む、根における遺伝子発現を増進するための単離プロモーターエレメント。２．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）から主に構成される、単離プロモーターエレメント。３．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有しており且つ該配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を含む、根における遺伝子発現を増進するための単離プロモーターエレメント。４．Ｂｒａｓｓｉｃａ種で根に高率の発現を示す遺伝子のプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子であって、前記プロモーターが図７の配列（配列番号５）を含む組換えＤＮＡ分子。５．ベクターとして機能することが可能であり、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む組換えＤＮＡプラスミド。６．前記ベクター機能がｐＴＺ１８Ｒ及びｐＡＬＬＴＫＲｅｐからなる群から選択されるプラスミドにより提供される請求項５に記載の組換えＤＮＡプラスミド。７．ｐＺ１１ＧＵＳを含む請求項５に記載の組換えＤＮＡプラスミド。８．ｐＡＬＬＴＫＲＴ１Ｇを含む請求項５に記載の組換えＤＮＡプラスミド。９．ベクターとして機能することが可能であり、図７のヌクレオチド配列（配列番号５）との間に少なくとも９５％の相同度を有しており且つ該配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡプラスミド。１０．図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有するプロモーターと、外来構造遺伝子とからなる複合遺伝子。１１．外来構造遺伝子が罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与することが可能である請求項１０に記載の複合遺伝子。１２．外来構造遺伝子が１種以上の昆虫に対して毒性であるタンパク質をコードする請求項１１に記載の複合遺伝子。１３．外来構造遺伝子が１種以上の菌類に対して毒性であるタンパク質をコードする請求項１１に記載の複合遺伝子。１４．外来構造遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒性結晶タンパク質又はその殺虫毒性フラグメントをコードする請求項１２に記載の複合遺伝子。１５．罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与するための方法であって、前記根における高率の発現が可能であり且つ図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を有するプロモーターと、前記免疫又は抵抗性を付与するタンパク質又はペプチドをコードする外来構造遺伝子とからなる複合遺伝子で罹病性根を有する植物を形質転換することからなる方法。１６．外来構造遺伝子が１種以上の昆虫に対して毒性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする請求項１５に記載の方法。１７．外来構造遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶タンパク質又はその殺虫毒性フラグメントをコードする請求項１６に記載の方法。１８．外来構造遺伝子が１種以上の菌類に対して毒性であるタンパク質又はポリペプチドをコードする請求項１５に記載の方法。１９．罹病性植物の根が、カノラ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ、エンバク、モロコシ及びタバコの根からなる群の１員である請求項１５に記載の方法。２０．罹病性植物の根が、カノラ、モロコシ及びタバコの根からなる群の１員である請求項１９に記載の方法。２１．罹病性植物の根が、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、オオムギ及びエンバクの根からなる群の１員である請求項１９に記載の方法。２２．罹病性植物の根に病害抵抗性又は免疫を付与するための方法であって、ａ．根に高率の発現を有する遺伝子からのプロモーターと、植物の根を冒す害虫及び／又は菌類病に対する免疫又は抵抗性を付与することが可能なタンパク質又はペプチドをコードする異種ＤＮＡフラグメントとを任意の順序で単離する段階と、ｂ．段階（ａ）からの単離プロモーター及び異種ＤＮＡフラグメントを個々に又は組み合わせてベクターに挿入し、前記異種ＤＮＡフラグメントが前記プロモーターの下流に配置され且つ発現可能な制御下におかれるように前記プロモーターに対して方向付けられたハイブリッドベクターを形成する段階と、ｃ．形質転換後の植物の根が、同一種の非形質転換植物には存在しない病害免疫又は抵抗性を前記根に付与するタンパク質又はペプチドを発現するように、罹病性植物種、植物細胞又は植物組織プロトプラストを前記ハイブリッドベクターで形質転換する段階とを含む方法。２３．プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む請求項２２に記載の方法。２４．プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）から主に構成される請求項２３に記載の方法。２５．プロモーターが図７のヌクレオチド配列（配列番号５）と少なくとも９５％の相同度を有しており、該配列に少なくとも機能的に等価である請求項２２に記載の方法。