DE112010002275T5 - Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und/oder gesteigerter Toleranz gegenüberabiotischem Stress und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX(leucoanthocyanidindioxygenase-)Polypeptid codiert, einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, einer Nukleinsäure, die für ein CK1-(Caseinkinase-Typ-I-)Polypeptid codiert, einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches (basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12) Polypeptid codiert, einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert oder einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und bislang unbekannte, für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäuren bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX(Leucoanthocyanidindioxygenase-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
• Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein YRP5 codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein YRP5 codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Steigerung verscbiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CK1-(Caseinkinase-Typ-I-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches (basisches Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12) Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Steigerung verschiedener Ertragsmerkmale in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
• Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
• Die stetig wachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenswerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
• Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
• Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
• Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf viele Arten gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht für eine Auswahl an diversen Genotypen wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
• Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprossen bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea Mais L.)Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
• Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
• Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das einer verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressfaktoren können durch Trockenheit, Salzgehalt, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstiger Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
• Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
• Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegen.
• Ein Ansatz zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
• Es wurde jetzt gefunden, dass sich verschiedene Wachstumscharakteristika in Pflanzen verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer in einer Pflanze für ein LDOX-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
• Weiterhin wurde jetzt auch gefunden, dass sich verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer in einer Pflanze für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
• Weiterhin wurde jetzt auch gefunden, dass sich die Toleranz gegenüber verschiedenen abiotischen Stressfaktoren in Pflanzen verbessern lässt, indem man in einer Pflanze die Expression einer in einer Pflanze für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
• Hintergrund
• 1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Flavonoide stellen eine große Gruppe sekundärer Pflanzenmetabolite dar, die Flavonole, Isoflavone, Proanthocyanidine und Anthocyanine umfassen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Pflanzenbiologie, wie Signalgebung für Pollenüberträger oder samenverbreitende Tiere, Pflanzenhormonsignalvermittlung, Pollenschlauchbildung oder UV-Schutz.
• Von den Flavonoiden sind die Anthocyanine sekundäre Metaboliten, die neben anderen Funktionen den Blütenblättern, Fruchtschalen und Samenhüllen Farbe verleihen. Anthocyanine werden über den Phenylpropanoidpfad produziert, ausgehend von der Umwandlung von Phenylalanin in Zimtsäure durch Phenylalaninammoniaklyase (PAL). Der Pfad spaltet sich dann in verschiedene Zweige auf, von denen einer der Flavonoidpfad ist, bei dem Chalconsynthase (CHS) die Bildung des Flavonoidgrundgerüsts katalysiert und anschließend zu Flavonol-, Cyanidin- und Anthocyaninsynthese führt. Einen Überblick über die Anthocyaninsynthese findet sich in Abrahams et al. (Plant J. 35, 624–636, 2003), wiedergegeben in 1. Bei der Leucoanthocyanidindioxygenase (LDOX) handelt es sich um ein Enzym, das an den späteren Stufen der Biosynthese von Flavonoiden beteiligt ist, es spielt eine Rolle bei der enzymatischen Reaktion, die Leucocyanidin in Cyanidin umwandelt, wobei Cyanidin eine Vorstufe von Anthocyanin und Epicathecin ist. Letzteres wird darin zu Proanthocyanidinen polymerisiert. Das für LDOX codierende Gen ist bei Arabidopsis Teil einer Multigenfamilie.
• Es wurde gezeigt, dass die Anthocyaninproduktion in Pflanzen durch eine Vielzahl verschiedener biotischer und abiotischer Stressfaktoren wie Pathogenbefall, Verletzungen, UV-Licht, niedrige Temperaturen, Schwermetallbelastung und Nahrungsstressfaktoren wie Phosphor-(Pi-)Mangel induziert wird (Steyn et al., New Phytologist 155, 349–361, 2002; Gould, J. Biomed. Biotechnol. 2004, 314–320, 2004). Flavonoide haben als Nahrungsmittelzusatzstoffe (natürliche Farben) Bedeutung erlangt und können bei pharmazeutischen Anwendungen als Antioxidationsmittel eingesetzt werden. Sie können außerdem das Risiko von Diabetes und Krebs verringern.
• 2. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Die Caseinkinase-1-Familie (EC 2.7.11.1) von Proteinkinasen sind serin/threoninselektive Enzyme, die bei den meisten eukaryontischen Zelltypen als Regulatoren von Signalübertragungswegen fungieren.
• Es wurde gefunden, dass eine Caseinkinaseaktivität in den meisten Zelltypen vorhanden ist und mit mehreren Enzymen assoziiert ist. Die Typ-1-Caseinkinasefamilie verwandter Genprodukte wird nun z. B. als ”Caseinkinase 1” bezeichnet. Für Xenopus- und Drosophilazellen wurde nahegelegt, dass Caseinkinase 1 eine Rolle beim Wnt-Signalpfad spielt. CK1gamma ist mit der Zellmembran assoziiert und bindet an LRP. Es wurde gefunden, dass CK1gamma für die Wnt-Signalvermittlung über LRP benötigt wird. Davidson et al. 2005. Nature Band 438, Seiten 867–872).
• Bei Pflanzen sind Caseinkinasen mit Plasmodesmata assoziiert (Lee 2005, Plant Cell. 17; 2817–2831).
• 3. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• Basische Helix-Schleife-Helix-Proteine (bHLH) sind eine Gruppe eukaryontischer Transkriptionsfaktoren, die einen bestimmenden Einfluss auf verschiedene Entwicklungspfade ausüben. Diese Transkriptionsfaktoren sind durch eine evolutionär hochkonservierte bHLH-Domäne charakterisiert, die eine spezifische Dimerisierung vermittelt. Sie ermöglichen bei den entsprechenden Entwicklungsstufen die Umwandlung inaktiver Monomere in transaktivierende Dimere. Die bHLH-Proteine lassen sich in unterschiedliche Kategorien einteilen. Eine solche Unterteilung gemäß Dimerisierungs-, DNA-Bindungs- und Expressioncharakteristika definiert sieben Gruppen. Klasse-I-Proteine bilden Dimere innerhalb der Gruppe oder mit Klasse-II-Proteinen. Klasse II kann nur Heterodimere mit Klasse-I-Faktoren bilden. Klasse-III-Faktoren sind durch das Vorhandensein eines der bHLH-Domäne benachbarten Leucin-Zippers gekennzeichnet. Klasse-IV-Faktoren können Homodimere oder Heterodimere mit Klasse-III-Proteinen bilden. Klasse-V- und Klasse-VI-Proteine fungieren als Regulatoren von Klasse-I- und Klasse-II-Faktoren und Klasse-VII-Proteinen mit einer PAS-Domäne.
• bHLH-Domänen sind im Stand der Technik gut bekannt und lassen sich vom Fachmann leicht identifizieren. Die Familie ist durch eine bHLH-Signaturdomäne definiert, die aus etwa 60 Aminosäuren mit zwei funktionell unterschiedlichen Regionen besteht. Eine basische Region, die sich am N-terminalen Ende der Domäne befindet, ist an der DNA-Bindung beteiligt und besteht aus etwa 15 Aminosäuren mit einer hohen Anzahl basischer Reste. Eine HLH-Region am C-terminalen Ende fungiert als Dimerisierungsdomäne und besteht hauptsächlich aus hydrophoben Resten, die zwei amphipathische Helices bilden, die durch eine Schleifenregion variabler Anordnung und Länge getrennt sind.
• Heim et al. teilten 2003 die Pflanzen-bHLH-Proteine anhand struktureller Ähnlichkeiten in Gruppen und Untergruppen ein. Es wurde vorgeschlagen, dass bHLH-Proteine in einer Pflanze ähnliche biologische Funktionen erfüllen (Heim et al. 2003, Mol. Biol. Evol. 20(5): 735–747. 2003).
• Vor kurzem wurden drei Mitglieder der Gurppe XII, AtbHLH044/BEE1, AtbHLH058/BEE2 und AtbHLH050/BEE3 (BR Enhanced Expression) aus A. thaliana mit der Brassinosteroidsignalvermittlung in Verbindung gebracht (Friedrichsen et al. 2002, Genetics 162: 1445–1456.). Diese eng miteinander verwandten bHLHs wirken redundant als positive Regulatoren beim frühen Brassinosteroid-(BR-)Signalpfad und beeinflussen auch die Signalvermittlung durch Abscisinsäure (ABA), einem bekannten Antagonisten von BR.
• 4. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Die MDR-(Medium-chain Dehydrogenase/Reductase-)Superfamilie umfasst die Familie der Alkoholdehydrogenasen (ADH). Alkoholdehydrogenase (EC: 1.1.1.1) katalysiert die reversible Oxidation von Alkoholen zu ihrem entsprechenden Acetaldehyd oder Keton mit der damit einhergehenden Reduktion von NAD: Alkohol + NAD = Aldehyd oder Keton + NADH.
• Gegenwärtig sind drei strukturell und katalytisch unterschiedliche Typen von Alkoholdehydrogenase bekannt:
• 1. zinkhaltige ”langkettige” Alkoholdehydrogenasen;
• 2. ”kurzkettige” Alkoholdehydrogenasen vom Insektentyp;
• 3. eisenhaltige Alkoholdehydrogenasen.
• In Pflanzen gibt es zwei Arten von ADH: Klasse-III-ADH (glutathionabhängige Formaldehyddehydrogenase) und Pflanzen-ADH. ADH2 codiert für die GSH-abhängige Formaldehyddehydrogenase (FALDH), die auch als Klasse-III-ADH bekannt ist. Von diesem Enzym wurde gezeigt, dass es sich um die S-Nitrosoglutathionreduktase (GSNOR) handelt. Siehe Rusterucci et al: Plant Physiol. 2007 März; 143(3): 1282–1292. Lee et al., 2008 (The Plant Cell, Band 20: 786–802) berichteten ebenfalls, dass die evolutionär konservierte GSH-abhängige Formaldehyddehydrogenase (FALDH), eine Typ-III-Alkoholdehydrogenase, GSNOR-Aktivität hat.
• 5. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Bhat, R. et al. (The Plant Journal. 2003, 33, 455–469) offenbaren die von Histonacetyltransferase (HAT), GCN5, bei der transkriptionellen Coaktivierung in Hefe und Säugetieren gespielte Rolle. Zu diesem Zweck klonierten und exprimierten die Autoren das Muster von Zmgcn5, dem Maishomologon, und beobachteten, dass die Inhibierung der Histondeacetylierung mit TSA von einer Abnahme der Konzentration an ZmGCN5-Acetylaseprotein, jedoch von Zunahmen bei der Konzentration an mRNAs für die Histone H2A, H2B, H3 und H4 begleitet ist. Die erhöhten Konzentrationen an Histon-mRNA spiegelten sich nicht in erhöhten Histon-Proteinkonzentrationen wieder, was nahelegt, dass aus der TSA-Behandlung hervorgehende hyperacetylierte Histone bevorzugt abgebaut und durch de novo synthetisierte Histone substituiert werden. Das ZmGCN5-Antisense-Material zeigte eine Suppression des endogenen ZmGCN5-Transkripts, und die Profilanalyse deckte erhöhte mRNA-Konzentrationen für H2A, H2B und H4 auf.
• Benhamed, M. et al. (The Plant Cell. 2006, 18, 2893–2903) konzentriert sich auf die Erfordernis der Histonacetyltransferase TAF1/HAF2 aus Arabidopsis thaliana zur Lichtregulierung von Wachstum und Genexpression, und dass Histonacetyltransferase GCN5 und Histondeacetylase HD1/HDA19 ebenfalls an einer solchen Regulierung beteiligt sind. Die Autoren haben beobachtet, dass die Mutation von GCN5 zu einem Phänotyp mit langem Hypokotyl und einer reduzierten lichtinduzierbaren Genexpression führte, während die Mutation von HD1 gegenteilige Wirkungen induzierte. Die Doppelmutante gcn5 hd1 stellte wieder einen normalen photomorphogenen Phänotyp her. Im Gegensatz dazu führte die Doppelmutante gcn5 taf1 zu einem weiteren Verlust an lichtgesteuerter Genexpression. gcn5 reduzierte die Acetylierung der Histone H3 und H4, hauptsächlich an den Kernpromotorregionen, während hd1 die Acetylierung sowohl am Kern als auch an weiter stromaufwärts befindlichen Promotorregionen erhöhte. GCN5 und TAF1 wurden beide für die H3K9-, H3K27- und H4K12-Acetylierung an den Zielpromotoren benötigt, die H3K14-Acetylierung hing jedoch nur Von GCN5 ab. Sie schlussfolgerten außerdem, dass GCN5 direkt mit den lichtempfindlichen Promotoren assoziiert ist.
• Bertrand C. et al. (The Journal of Biological Chemistry. 2003, 278, 30 28246–28251) offenbaren die regulatorische Funktion des GCN5-Gens (AtGCN5) bei der Steuerung der Blütenmeristemaktivität durch Charakterisieren einer Mutation im Arabidapsis-Gen. Die Autoren beobachteten, dass diese Mutation zusätzlich zu den pleiotropen Wirkungen auf die Pflanzenentwicklung auch zur Produktion terminaler Blüten führt, und dass AtGCN5 zur Regulierung der Blütenmeristemaktivität über den WUS/AG-Pfad benötigt wird.
• Benhamed, M. et al. (The Plant Cell. 2008, 56, 493–504) konzentrierten sich auf die Arabidopsis-thaliana-Promotorregionen. Die Authoren beobachteten, dass die Arabidopsis-Histonacetyltransferase GCN5 mit 40% der getesteten Promotoren assoziiert war. An den meisten Bindungsstellen hing die Bindung nicht von der Integrität der GCN5-Bromodomäne ab, das Vorhandensein der Bromodomäne war jedoch für eine Bindung an 11% der Promotorregionen erfolderlich und korrelierte mit der Acetylierung von Lysin 14 von Histon H3. Sie schlussfolgerten außerdem, dass bei diesen Promotoren GCN5 zusätzlich zu seiner transkriptionellen Aktivierungsfunktion eine wichtige Rolle beim Vorbereiten der Aktivierung induizierbarer Gene unter Bedingungen ohne Induktion spielen kann.
• Nagy, Z. und Tora, L. (Oncogene. 2007, 26, 5341–5357) offenbaren die vor kurzem erfolgte Entwicklung beim Verständnis der Funktion von zwei Histonacetyltransferasen (ATs) aus tierischen Organismen: GCN5 und PCAF und ihre Rolle bei der eukaryontischen Transkription. Es wird außerdem darauf verwiesen, dass es sich bei tierischem GCN5 um eine Untereinheit von wenigstens zwei Typen von Multiproteinkomplexen handelt, einem mit einem Molekulargewicht von 2 MDa (SPT3-TAF9-GCN5-Acetyltransferase/TATA-Bindungsprotein(TBP)-freier-TAF-Komplex) und einem zweiten Typ mit einer Größe von etwa 700 kDa (ATAC-Komplex). Diese Komplexe haben eine globale Histonacetylierungsaktivität und artspezifische Koaktivatorfunktionen zusammen mit einer AT-Aktivität auf Nichthistonsubstrate. Die Autoren zogen weiterhin die Schlussfolgerung, dass ihrer biologischen Funktionen einen weiten Bereich von Aufgaben abdecken und sie unentbehrlich für die normale Funktion von Zellen sind, und dass außerdem die Deregulierung der globalen und/oder spezifischen AT-Aktivitäten dieser Komplexe eine krebsartige Transformation der Zellen zur Folge hat.
• Kurze Darstellung der Erfindung
• 1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag und einer erhöhten Jungpflanzenvitalität, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• 2. YRP5-Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung der Toleranz von Pflanzen gegenüber verschiedenen abiotischen Stressfaktoren im Vergleich zu Toleranz von Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• 3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein CK1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein CK1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• 4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche)Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• 5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• 6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
• Definitionen
• Polypeptid(e)/Protein(e)
• Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
• Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
• Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
• Homolog(e)
• ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
• Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
• Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, IacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
• Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen und können im Bereich von 1 bis 10 Aminosäuren liegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen mit konservativen Substitutionen sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

  Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
  Ala	Ser	Leu	Ile; Val
  Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
  Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
  Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
  Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
  Cys	Ser	Thr	Ser; Val
  Glu	Asp	Trp	Tyr
  Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
  His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
  Ile	Leu, Val

• Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
• Derivate
• ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nichtnatürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nichtnatürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
• Ortholog(e)/Paralog(e)
• Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
• Domäne, Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
• Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
• Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, können aber ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
• Es gibt Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hubo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
• Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
• Reciprocal BLAST
• In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet. Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Wie man den E-Wert berechnet, ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
• Hybridisierung
• Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
• Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb von T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
• Der T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplices. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Der Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
• 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
• 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
• 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(I_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(I_n)
^a oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.
^b nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
^c L = Länge des Duplex in Basenpaaren.
^d Oligo, Oligonukleotid; I_n = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
• Nichtspezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) und/oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Zum Beispiel umfassen typische Hochstringeriz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1x SSC oder bei 42°C in 1x SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3x SSC. Beispiele für Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4x SSC oder bei 40°C in 6x SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2x SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen bestimmt werden. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5x Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
• Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
• Spleißvariante
• Der Begriff ”Spfeißvariante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Spleißvarianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleißvarianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
• Allelische Variante
• Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
• Endogenes Gen
• Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
• Genshuffling/gerichtete Evolution
• Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
• Konstrukt
• Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Kontrollsequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
• Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
• Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
• Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
• Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit einer CCAAT-Box-Sequenz oder ohne), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression als Reaktion auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
• Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
• Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors mit einem Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Konzentrationen oder durch Vergleich von mRNA-Konzentrationen der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Konzentrationen von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, untersucht werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al., 1996 Geriome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripten, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 355-CaMV-Promotors erhalten wird.
• Funktionsfähig verbunden
• Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
• Konstitutiver Promotor
• Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele für konstitutive Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren

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  OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
  SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
  SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
  nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
  V-ATPase	WO 01/14572
  Super-Promotor	WO 95/14098
  G-Box-Proteine	WO 94/12015

• Ubiquitärer Promotor
• Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
• Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
• Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
• Induzierbarer Promotor
• Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf eine Chemikalie (ein Übersichtsartikel findet sich bei Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
• Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
• Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
• Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren

  Genquelle	Literaturstelle
  RCc3	Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
  Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
  Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
  Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
  wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
  Tabakauxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
  β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
  tabakwurzelspezifische Gene	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
  B. napus G1-3b-Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
  SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
  LRX1	Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
  BTG-26 Brassica napus	US 20,050,044,585
  LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol, 153: 386–395, 1991.
  KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
  TobRB7-Gen	W Song (1997) Doktorarbeit, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
  OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
  ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
  NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

• Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch. sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) beschrieben, deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wäre. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren

  Genquelle	Literaturstelle
  samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
  	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
  	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
  Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
  Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
  	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
  Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
  napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
  Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989
  Weizen SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
  Weizen, α, β, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
  Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
  Gerste Bi, C, D, Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
  Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
  blz2	EP99106056.7
  synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
  Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
  Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
  Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
  Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
  Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
  Reis-Oleosin	Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998
  Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
  PRO0117, putatives Reis 40S-ribosomales Protein	WO 2004/070039
  PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
  PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
  PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
  PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
  PRO005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
  Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

  Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren

  Genquelle	Literaturstelle
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22 Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
  Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
  Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90 Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
  Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
  Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
  Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
  Gerste B1, C, D, Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62;
  	Muller et al. (1993) Plant Cell 4: 343–55 Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
  Gerste DOF	Mena et al., (1998) Plant J. 116(1): 53–62
  blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
  synthetischer Promoter	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
  Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
  Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33: 513–522
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
  Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
  Sorghum Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

  Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:

  Genquelle	Literaturstelle
  Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
  PRO0151	WO 2004/070039
  PRO0175	WO 2004/070039
  PR005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039

  Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:

  Genquelle	Literaturstelle
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
  Cathepsin β-like-Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579-89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

• Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promoter, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.
• Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promotoren

  Gen	Expression	Literaturstelle
  Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
  Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
  Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
  Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
  Reis, beta-Expansin EXBP9	sprossspezifisch	WO 2004/070039
  Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
  Erbse RBCS3A	blattspezifisch

• Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

  Genquelle	Expressionsmuster	Literaturstelle
  Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
  Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
  WAK 1 & WAK 2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

• Terminator
• Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
• Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
• Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (grünfluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
• Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben).
• Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter das/die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
• Transgen/Transgen/Rekombinant
• Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
• (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
• (b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft ist/sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
• (c) a) und b),
nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nichtnatürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
• Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Hinblick auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
• Modulierung
• Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt.
• Expression
• Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließender Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
• Erhöhte Expression/Überexpression
• Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Art von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
• Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
• Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
• Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994).
• Verringerte Expression
• Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
• Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
• Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Abstandhalter (nichtcodierende DNA), einkloniert ist.
• In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nichtcodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) befindet sich zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Details siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
• Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
• Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches abgeschaltet werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nichtcodierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nichtcodierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
• Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werde, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h. die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
• Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an für ein Polypeptid codierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkamplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können Zellen auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren zugeführt werden.
• Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
• Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591)) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al. US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al. US-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B. Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
• Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
• Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
• Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Targeting von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
• Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
• Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werde.
• Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nichtcodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen wider.
• Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
• Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen für die Transformation monokotyler Pflanzen, und aus dikotylen Pflanzen für die Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in dieselbe Spezies eingeführt. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
• Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
• Transformation
• Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotylmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
• Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet., 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Trasformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelte Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielhaft ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden soll/sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf. bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
• Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”Floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”Floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nichttransgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastide in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht findet man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol. 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid trasformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
• Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werde.
• Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nichttransformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
• Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
• Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nichttransformierten Zellen; klonale Transformanten (wobei z. B. alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nichttransformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nichttransformierten Spross gepropft wird) sein.
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder ein Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gene durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der insertierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
• TILLING
• Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianlen können eine höhere Aktivität aufzeigen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.) Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cald Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods in Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
• Homologe Rekombination
• Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
• Ertragsmerkmale
• Ertragsmerkmale umfassen eine oder mehrere aus Ertrag, Biomasse, Samenertrag, Früh-Wuchskraft, Grünheitsindex, erhöhter Wachstumsrate, verbesserten agronomischen Eigenschaften (wie verbesserter Wasserausnutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE, Stickstoffausnutzungseffizienz (Nitrogen Use Efficiency, NUE) usw. ausgewählte Eigenschaften.
• Ertrag
• Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
• Nimmt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem in einem oder mehreren der Folgenden zeigen: einer Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, einer Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, einer Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Nimmt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als Erhöhung eines oder mehrerer der Folgenden zeigen: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl von Rispen pro Pflanze, Rispenlänge, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), einer Erhöhung des Tausendkerngewichts. Bei Reis kann auch eine Toleranz gegenüber Untertauchen zu einem erhöhten Ertrag führen.
• Früh-Wuchskraft
• ”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, gut ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzling-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
• Erhöhte Wachstumsrate
• Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann so verstanden werden, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimschnelligkeit, Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, alle innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate lässt sich durch Ableiten verschiedener Parameter aus den Wachstumskurven bestimmen, wobei es sich bei den Parametern unter anderem um die folgenden handeln kann: T-Mid (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 50% ihrer Maximalgrösse benötigen) und T-90 (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 90% ihrer Maximalgrösse benötigen).
• Stressresistenz
• Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starker Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30%, oder 25%, weiter bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Trockenheit oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Trockenheit), Salzstress, oxidativem Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
• Insbesondere können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Trockenheit durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Trockenheit, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Trocken-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Trockenheit und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Trockenheit oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress” bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
• Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
• Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
• Erhöhen/Verbessern/Steigern
• Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
• Samenertrag
• Erhöhter Samenertrag kann eines oder mehrere der Folgenden sein: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samenfüllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), was aus der Anzahl gezählter gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
• Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Ertrag kann auch zu modifizierter Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur auftreten.
• Grünheits-Index
• Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Trockenheit gemessen.
• Markerunterstützte Züchtungsprogramme
• Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von Allelvarianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
• Verwendung als Sonden beim Genkartieren
• Die Verwendung von für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Diese Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
• Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinaheisogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
• Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
• In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
• Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
• Pflanze
• Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
• Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus otficinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp, Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus app., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
• Kontrollpflanze(n)
• Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteile.
• Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
• Weiterhin wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Toleranz gegenüber verschiedenen abiotischen Stressfaktoren in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Stress selektiert.
• Weiterhin wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein CK1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein CK1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
• Weiterhin wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
• Weiterhin wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
• Weiterhin wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
• Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure ist die Einführung und Expression einer für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes LDOX-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches LDOX-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”LDOX-Nukleinsäure” oder ”LDOX-Gen” bezeichnet wird.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes YRP5-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches YRP5-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”YRP5-Nukleinsäure” oder ”YRP5-Gen” bezeichnet wird.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes CK1-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches CK1-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”CK1-Nukleinsäure” oder ”CK1-Gen” bezeichnet wird.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches bHLH12-ähnliches Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”bHLH12-ähnliche Nukleinsäure” oder ”bHLH12-ähnliches Gen” bezeichnet wird.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes ADH2-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches ADH2-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”ADH2-Nukleinsäure” oder ”ADH2-Gen” bezeichnet wird.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes GCN5-ähnliches Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches GCN5-ähnliches Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden. beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”GCN5-Nukleinsäure” oder ”GCN5-Gen” bezeichnet wird.
• Ein wie hier definiertes ”LDOX-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Leucoanthocyanidindioxygenasepolypeptid, welches eine Isopenicillin-N-synthase-Domäne (PRINTS-Eintrag PR00682) und eine 2OG-Fe(II)-oxygenase-Domäne (PFAM-Eintrag PF03171) umfasst.
• Vorzugsweise umfasst das LDOX-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive:
  Motiv 1, (SEQ ID NR: 173):
  W[VIY]T[VA]K[CP][HV]P[DHN][AS][IFL]I[VM][HN][IV]GD[QT]I[EQ]ILSN[GS][KT]YKS[VI][EL]HR[GV][LI]VN[KS][ED]K[VE]R[VI]S[WL]A[VF]F[CY][EN]
  Motiv 2, (SEQ ID NR: 174):
  [ED][DNE][LI][LG][AL][QC][LM][KR][IV]NYYP[KP]CP[RQ]P[ED]L[AT]LG[VL][ES][AP]H[ST]D[PMV][SG][AG][LM]T[FI][LI]L[PH][ND][DEM]
  Motiv 3, (SEQ ID NR: 175):
  WG[FV][FM][QH][VL]VNHG[IV][PSK]P[ED]L[MI][DE][RA][AV][RQ][EK][AVN][GW][RK][EA]FF[HE][LM]PV[NE][AE]KE[KT]Y[AS]N[DS][PQ]
  Motiv 4, (SEQ ID NR: 176):
  [DHG][AS][FL][VI]VN[IV]GD[QT][IL][EQ]IL[ST]N[GS][RT][YF][KR]SV[LE]HR[VA][VIL]VN
  Motiv 5, (SEQ ID NR: 177):
  WGFFQ[VL]VNHG[VI][PKS]xEL[ILM][DE][RA]
  wobei x für eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise ein Prolin, steht;
  Motiv 6, (SEQ ID NR: 178):
  LG[LV][GS][PA]H[TS]DP[GS]x[LMI]T[IL]L
  wobei x für eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise ein Glycin, steht.
• Besonders bevorzugt umfasst das LDOX-Polypeptid auch wenigstens eines der folgenden Motive:
  Motiv 7 (SEQ ID NR: 179):
  Pxx[YF][IV][KQR]
  wobei x für eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise ein Prolin und ein Arginin in Position 2 bzw. 3, steht;
  Motiv 8, (SEQ ID NR: 180):
  V[QE][SAT][LIV]
  Motiv 9, (SEQ ID NR: 181):
  [EQ]GYG[ST]
• Die Aminosäuren in Klammern stehen für Alternativen für die betreffende Position. Weiterhin bevorzugt umfasst das LDOX-Polypeptid mit zunehmender Präferenz wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7, wenigstens 8 oder alle 9 Motive.
• Alternativ dazu hat das Homolog eines LDOX-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 2, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem LDOX-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu den Motiven gemäß SEQ ID NR: 173 bis SEQ ID NR: 181 (Motive 1 bis 9).
• Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen.
• Ein wie hier definiertes ”YRP5-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches Orthologe und Paraloge der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen.
• YRP5-Polypeptide und Orthologe und Paraloge davon haben typischerweise mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von YRP5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe. Werkzeuge und Techniken zum Erstellen und zur Analyse von phylogenetischen Bäumen sind im Stand der Technik gut bekannt.
• Ein wie hier definiertes ”CK1-Polypeptid” bezieht sich auf eine beliebige Proteinkinase der Caseinkinase-1-Familie (IUBMB-Enzymnomenklatur: EC 2.7.11.1). Caseinkinase-1-Proteine sind im Stand der Technik allgemein bekannt. CK1-Polypeptide katalysieren die Reaktion: ATP + ein Protein = ADP + ein Phosphoprotein.
• Alternativ dazu kann man ein ”CK1-Polypeptid” als ein Polypeptid definieren, welches ein Proteinmotiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der folgenden Motive:
• (i) Motiv 10: HIPYRENKNLTGTARYAS(VM)NTHLG(IV)EQSRRDDLESLGYVL(ML)YFLRGSLPW (SEQ ID NR: 273),
• (ii) Motiv 11: PSLEDLFN(YF)C(NSG)RK(FL)SLKTVLMLADQ(ML)INR(VI)E(YF)(VM)HS(KR)(SG)FLHRDIKP (SEQ ID NR: 274),
• (iii) Motiv 12: C(KR)(SG)YP(ST)EFASYFHYCRSLRF(DE)D(KR)PDY(SA)YLKR(LI)FRDLFIREG(FY)QFDYVF (SEQ ID NR: 275) umfasst,
wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen.
• Alternativ dazu kann man ein ”CK1-Polypeptid” als ein Polypeptid definieren, welches eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
• (i) Motiv 10: HIPYRENKNLTGTARYAS(VM)NTHLG(IV)EQSRRDDLESLGYVL(ML)YFLRGSLPW (SEQ ID NR: 273),
• (ii) Motiv 11: PSLEDLFN(YF)C(NSG)RK(FL)SLKTVLMLADQ(ML)INR(VI)E(YF)(VM)HS(KR)(SG)FLHRDIKP (SEQ ID NR: 274),
• (iii) Motiv 12: C(KR)(SG)YP(ST)EFASYFHYCRSLRF(DE)D(KR)PDY(SA)YLKR(LI)FRDLFIREG(FY)QFDYVF (SEQ ID NR: 275)
wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen, und wobei, mit zunehmender Präferenz, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 und 25 Aminosäuren jedes Motivs durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise eine konservative Aminosäure (gemäß Tabelle 1), ersetzt sind.
• Darüber hinaus umfasst ein ”CK1-Polypeptid”:
• A. ein Proteinmotiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der folgenden Motive:
• (i) Motiv 13: KANQVY(IV)ID(YF)GLAKKYRDLQTH(KR)HIPYRENKNLTGTARYASVNTHLG(VI)EQ (SEQ ID NR: 276),
• (ii) Motiv 14: CKSYPSEF(VTI)SYFHYCRSLRFEDKPDYSYLKRLFRDLFIREGYQFDYVFDW (SEQ ID NR: 277),
• (iii) Motiv 15: PSLEDLFNYC(NS)RK(FL)(ST)LKTVLMLADQ(LM)INRVEYMHSRGFLHRDIKPDNFLM (SEQ ID NR: 278) wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen; oder
• B. eines oder mehrere der folgenden Motive:
• (i) Motiv 13: KANQVY(IV)ID(YF)GLAKKYRDLQTH(KR)HIPYRENKNLTGTARYASVNTHLG(VI)EQ (SEQ ID NR: 276),
• (ii) Motiv 14: CKSYPSEF(VTI)SYFHYCRSLRFEDKPDYSYLKRLFRDLFIREGYQFDYVFDW (SEQ ID NR: 277),
• (iii) Motiv 15: PSLEDLFNYC(NS)RK(FL)(ST)LKTVLMLADQ(LM)INRVEYMHSRGFLHRDIKPDNFLM (SEQ ID NR: 278) wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen, und wobei, mit zunehmender Präferenz, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 und 25 Aminosäuren jedes Motivs durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise eine konservative Aminosäure (gemäß Tabelle 1), ersetzt sind.
• Die Motive 10, 11 und 12 entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in Caseinkinasepolypeptiden pflanzlichen Ursprungs wiedergeben. Die Motive 13, 14 und 15 entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptiden pflanzlichen Ursprungs wiedergeben. Es versteht sich, dass die hier bezeichneten Motive 10, 11, 12, 13, 14 und 15 die Sequenz des homologen Motivs umfassen, wie sie in einem speziellen Caseinkinase-I-Polypeptid, vorzugsweise in einem Caseinkinase-I-Polypeptid der Tabelle A3, besonders bevorzugt in SEQ ID NO: 195, vorkommt. Methoden zum Identifizieren des homologen Motivs von Motiven 10 bis 15 in einem Polypeptid sind im Stand der Technik gut bekannt. So kann man zum Beispiel das Polypeptid mit dem Motiv vergleichen, indem man ihre jeweilige Aminosäuresequenzen abgleicht, um Regionen mit einer ähnlichen Sequenz zu identifizieren, wobei man sich eines Algorithmus wie Blast (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) bedient.
• Alternativ dazu hat das Homolog eines CK1-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 195.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
• Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines mit den Sequenzen aus Tabelle A3 konstruierten phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von CK1-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß einem der folgenden: A.thaliana_AT5G44100.1, A.thaliana_AT4G14340.1, B.napus_BN06MC08360_42724797@8337, H.vulgare_TA34160_4513, O.sativa_LOC_Os02g56560.1, P.trichocarpa_scaff XIII.465, S.officinarum_TA30972_4547, Z.mays_TA179031_4577, besonders bevorzugt von A.thaliana_AT5G44100.1 (SEQ ID NO: 195 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Die Erfindung stellt außerdem bisher unbekannte, für das CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren sowie CK1-Polypeptide bereit.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
• (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268;
• (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268;
• (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A3, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (vi) eine Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
• (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269;
• (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
• (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
• Ein wie hier definiertes ”bHLH12-ähnliches Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches eine basische Domäne umfasst, an die sich eine HLH-Domäne anschließt (HMMPFam PF00010, ProfileScan PS50888, SMART SM00353), wodurch eine basische Helix-Schleife-Helix-Domäne (Interpro IPR001092) gebildet wird, und welches ein Proteinmotiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz eines oder mehrerer der folgenden Motive umfasst:
  Motiv 16 (SEQ ID NR: 404): YIHVRARRG;
  Motiv 17 (SEQ ID NR: 405): (S/E)P(P/K)(K/E)DYIHVRARRGQ, wobei eine der ersten 4 Aminosäuren oder die letzte Aminosäure durch eine beliebige Aminosäure ersetzt sein kann; vorzugsweise handelt es sich bei Motiv 17 um (S/E)P(P/K)(K/E)DYIHVRARRGQ, wobei eine der ersten 4 Aminosäuren oder die letzte Aminosäure durch eine konservierte Aminosäure ersetzt sein kann;
  Motiv 18 (SEQ ID NR: 406): (R/N/C)QVE(F/N)LSMKL(S/A/T)(V/A)(N/S), wobei Aminosäuren in Position 1, 5 und 11 durch eine beliebige Aminosäure ersetzt sein können; vorzugsweise handelt es sich bei Motiv 18 um (R/N/C)QVE(F/N)LSMKL(S/A/T)(V/A)(N/S), wobei Aminosäuren in Position 1, 5 und 11 durch eine konservierte Aminosäure ersetzt sein können.
  Motiv 19 (SEQ ID NR: 407): AD- -FVERAARYSC, wobei ”-” für eine Lücke, in der sich keine Aminosäure befindet, oder eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise P oder G, steht. Motiv 19 kann insbesondere eines der Motive ADFVERAARYSC, ADXXFVERAARYSC oder ADXFVERAARYSC sein, wobei es sich bei X um eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise P oder G, handeln kann.
• bHLH-Domänen sind im Stand der Technik gut bekannt und in Proteindomänendatensammlungen wie Interpro, ProfileScan, PFam und SMART eingetragen. Alternativ dazu umfasst ein bHLH12-ähnliches Polypeptid eine bHLH-Domäne mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäure der bHLH-Domäne gemäß SEQ ID NR: 403: ATDSHSLAERVRREKISERMKFLQDLVPGCNKVTGKAVMLDEIINYV QSL.
• Alternativ dazu umfasst ein bHLH12-ähnliches Polypeptid eine bHLH-Domäne gemäß SEQ ID NR: 403: ATDSHSLAERVRREKISERMKFLQDLVPGCNKVTGKAVMLDEIINYVQS, wobei mit abnehmender Präferenz 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise eine konservierte Aminosäure, ersetzt sein können.
• Alternativ dazu handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen bHLH12-ähnlichen Nukleinsäure um eine beliebige Nukleinsäure, die für ein Polypeptid codiert, welches zur Gruppe XII (12) zählt, wie von Heim et al. 2003 definiert und um ein beliebiges homologes Molekül, vorzugsweise ein Paralog oder ein Ortholog davon, vorzugsweise mit einer äquivalenten biologischen Funktion, zum Beispiel der Steuerung der Expression des gleichen Gens. Unter die Definition fallende Nukleinsäuren müssen nicht aus einem natürlichen Organismus stammen, sondern können eines beliebigen Ursprungs sein, zum Beispiel chemisch synthetisiert sein. Die homlogen bHLH12-ähnlichen Nukleinsäuren, die von der Erfindung umfasst werden, codieren für ein Polypeptid, welches, wenn man es bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorziIgsweise innerhalb BEE3, bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Ein als eine 5-9-13-Konfiguration bezeichnetes Muster von Aminosäuren findet sich an drei Positionen innerhalb der basischen Region der bHLH-Domäne (siehe 4 von Heim et al., 2003 (Mol. Biol. Evol. 20(5): 735–747). Ein bHLH12-ähnliches Polypeptid umfasst vorzugsweise eine 5-9-13-Konfiguration, die durch die Aminosäuren H-E-R wiedergegeben wird, die sich in der bHLH-Domäne befinden, typischerweise in der basischen Region der Domäne. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass, obwohl es sich dabei um die am häufigsten vorkommende Konfiguration handelt, auch andere Konfigurationen erlaubt sind.
• Erfindungsgemäße bHLH12-ähnliche Polypeptide binden vorzugsweise an einen Promotor, der mindestens 1, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 10 oder mehr E-Motive gemäß SEQ ID NR: 408 (CANNTG) umfasst, wobei N für A, T, G oder C steht.
• Alternativ dazu hat des Homolog eines für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbaren bHLH12-ähnlichen Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A4, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 280 oder gemäß SEQ ID NR: 396, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem homologen Protein um ein wie hier definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid handelt.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
• Die Erfindung stellt außerdem bisher unbekannte, für das bHLH12-ähnliche Polypeptid codierende Nukleinsäuren sowie bHLH12-ähnliche Polypeptide bereit.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe. bereitgestellt:
• (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335;
• (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335;
• (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 2 und 58 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A4, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
• (vi) eine Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
• (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336;
• (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
• (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
• Ein wie hier definiertes ”ADH2-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches Domäne 1 und Domäne 2 und gegebenenfalls Domäne 3 umfasst:
• (i) GROES-Domäne (Domäne 1): AGEVRVKILFTALCHTDHYTWSGKDPEGLFPCILGHEAAGVVESVGEGVTEVQPGDHVIPCYQAECKECKFCKSGKTNLCGKVRGATGVGVMMNDMKSRFSVNGKPIYHFTGTSTFSQYTVVHDVSVAKI (SEQ ID NR: 442), oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 1; und
• (ii) Domäne der zinkbindenden Dehydrogenase (Domäne 2): AGSIVAVFGLGTVGLAVAE GAKAAGASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVNPKDHDKPIQQVLVDLTDGGVDYSFECIGNVSVMRAALECCHKDWGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGFKSRTQVPWLVD (SEQ ID NR: 443), oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 2; und gegebenenfalls zusätzlich
• (iii) DUF61-Domäne (Domäne 3): VDKYMNKEVK (SEQ ID NR: 444), oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3.
• Darüber hinaus kann ein ADH2-Polypeptid manchmal eines oder mehrere der Motive 20 bis 30 oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne 3 einer der Motive 20 bis 30 umfassen.
  Motiv 20: HYTWSGKDP (SEQ ID NR: 445);
  Motiv 21: PCYQAECK (SEQ ID NR: 446);
  Motiv 22: GKTNLCGKVRGATGVGVMMND (SEQ ID NR: 447);
  Motiv 23: YHFMGTSTFSQYTVVHDVSVAKINPQAPLDKVCLLGCGVPTGLG (SEQ ID NR: 448);
  Motiv 24: WNTAKVEAGSIVAVFGLGTVGLAVAEG (SEQ ID NR: 449);
  Motiv 25: GASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVN (SEQ ID NR: 450);
  Motiv 26: KDHDKPIQLVLVDIAD (SEQ ID NR: 451);
  Motiv 27: SVRRAAEEC (SEQ ID NR 452);
  Motiv 28: WGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGF (SEQ ID NR 453);
  Motiv 29: KVDEYITH (SEQ ID NR: 454);
  Motiv 30: MLKGESIRCIITM (SEQ ID NR: 455).
• Das ADH2-Polypeptid hat mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 und umfasst vorzugsweise die Domänen 1 und 2 und gegebenenfalls Domäne 3.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol, Biol 147(1); 195–7).
• Vorzugsweise bildet die ADH2-Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von ADH2-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Das wie hier definierte ”GCN5-ähnliche Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches zwei Domänen mit den PFam-Zugangsnummern PF00583 bzw. PF00439 mit durchschnittlich 76 bzw. 84 Aminosäuren umfasst. Weiterhin umfasst das GCN5-ähnliche Polypeptid auch die folgenden Motive:
  
  Motiv 31: LKF[VL]C[YL]SNDGVD[EQ]HM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[ST]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 501) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 31.
  
  Motiv 32: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HY]ARD[AV]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 502) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 32.
  
  Motiv 33: H[AP]DAWPFKEPVD[SA]RDVPDYYDIIKDP[IM]DLKT[MI]S[KR]RV[ED]SEQYYVTLEMFVA (SEQ ID NR: 503) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 33.
• Vorzugsweise kann das GCN5-ähnliche Polypeptid der Erfindung zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen:
  
  Motiv 34: LKF[LV]C[YL]SNDG[VI]DEHM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[TS]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 504) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 34.
  
  Motiv 35: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQHARD[AVM]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 505) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 35.
  
  Motiv 36: KQGFTKEI[THY][LF][DE]K[ED]RW[QH]GYIKDYDGGILMECKID[PQ]KLPY[TV]DL[AS]TMIRRQRQ (SEQ ID NR: 506) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 36.
• Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das GCN5-ähnliche Polypeptid der Erfindung zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen:
  
  Moliv 37: LKFVC[LY]SND[GDS][VI]DEHM[VM][WCR]LIGLKNIFARQLPNMPKEYIVRL[VL]MDR[SGK]HKSVM (SEQ ID NR: 507) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 37.
  
  Motiv 38: CAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HFY]ARD[MV]DGLTHFLTYADNNAVGYF[IV]KQGF (SEQ ID NR: 508) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 38.
  
  Motiv 39: W[QH]G[YF]IKDYDGG[IL]LMECKID[PQ]KL[PS]YTDLS[TS]MIR[RQ]QR[QK]AIDE[KR]IRELSNC[HQ][IN] (SEQ ID NR: 509) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 39.
• Gemäß einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das GCN5-ähnliche Polypeptid der Erfindung zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen:
  
  Motiv 40: FLCYSNDGVDEHMIWLVGLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDRTHKSMMVI (SEQ ID NR: 510) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 40.
  
  Motiv 41: MNHLKQHARDADGLTHFLTYADNNAVGY[FL]VKQGFTKEIT[LF]DKERWQGYIK (SEQ ID NR: 511) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 41.
  
  Motiv 42: IR[ED]LSNCHIVY[SP]GIDFQKKEAGIPRR[LT][MI]KPEDI[PQ]GLREAGWTPDQ[WL]GHSK (SEQ ID NR: 512) oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv 42.
• Die Motive 31, 32 und 33 entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in GCN5-ähnlichen Polypeptiden gefäßpflanzlichen Ursprungs wiedergeben. Die Motive 34, 35 und 36 entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in GCN5-ähnlichen Polypeptiden höheren gefäßpflanzlichen Ursprungs wiedergeben. Die Motive 37, 38 und 39 entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in einem aus einer dikotylen Pflanze stammenden GCN5-ähnlichen Polypeptid wiedergeben, und die Motive 40, 41 und 42 schließlich entsprechen Konsensussequenzen, die konservierte Proteinregionen in einem aus einer monokotylen Pflanze stammenden GCN5-ähnlichen Polypeptid wiedergeben.
• Es versteht sich, dass die hier bezeichneten Motive 31, 32, 33, 34, 35 und 36 die Sequenz des homologen Motivs umfassen, wie sie in einem speziellen GCN5-ähnlichen Polypeptid, vorzugsweise in einem GCN5-ähnlichen Polypeptid der Tabelle A6, besonders bevorzugt in SEQ ID NO: 460, vorliegen. Methoden zum Identifizieren des homologen Motivs von Motiven 31 bis 42 in einem Polypeptid sind im Stand der Technik gut bekannt. So kann man zum Beispiel das Polypeptid mit dem Motiv vergleichen, indem man ihre jeweilige Aminosäuresequenzen abgleicht, um Regionen mit einer ähnlichen Sequenz zu identifizieren, wobei man sich eines Algorithmus wie Blast (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) bedient.
• Alternativ dazu hat das Homolog eines GCN5-ähnlichen Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 460, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst.
• Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
• Vorzugsweise bilden die Polypeptidsequenzen von GCN5, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 15 gezeigten verwendet werden, lieber Cluster mit der Gruppe von GCN5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es gibt Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlog D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
• Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ahnlichkeits-/Identitats-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
• Weiterhin verfügen LDOX-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über Oxidoreduktaseaktivtät. LDOX-Proteine (EC 1.14.11.19) katalysieren insbesondere die folgende Reaktion Leucocyanidin + 2-Oxoglutarat + O2 ⇆ cis- und trans-Dihydroquercetine + Succinat + CO₂ + 2H₂O
• Werkzeuge und Techniken zum Messen der LDOX-Aktivität sind im Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel Saito et al. (Plant J. 17, 181–189, 1999) oder Pelletier et al. (Plant Mol. Biol. 40, 45–54, 1999). Nähere Angaben finden sich in Beispiel 6.
• Darüber hinaus liefern LDOX-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 7 und 8 umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einer erhöhten Biomasse, einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Jungpflanzenvitalität bei einer Kultivierung unter Nährstoffmangel.
• YRP5-Polypeptide verleihen bei einer Expression in Pflanzen, insbesondere Reispflanzen, diesen Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren.
• Weiterhin verfügen CK1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine Caseinkinaseaktivtät. Werkzeuge und Techniken zum Messen der Caseinkinaseaktivität sind im Stand der Technik gut bekannt Lee et al. Plant Cell 2005, 17, 2817–31.
• Darüber hinaus liefern CK1-Polypeptide, wenn sie wie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung im Beispielteil umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Tausendkerngewicht oder einem erhöhten Schwerpunkt der Krone.
• Darüber hinaus können CK1-Polypeptide eine bevorzugte subzelluläre Lokalisierung zeigen, typischerweise nuklear, cytoplasmatisch, chloroplastisch und/oder mitochondrial. Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehostet vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM und andere zur Verfügung. Erfindungsgemäße CK1-Polypeptide befindet sich vorzugsweise in den Plasmodesmata von Pflanzenzellen.
• Weiterhin verfügen bHLH12-ähnliche Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine DNA-bindende Aktivtät. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik gut bekannt, zum Beispiel in Dombrecht et al. (2007) Plant Cell 19, 2225–2245, 2007.
• Das erfindungsgemäße bHLH12-ähnliche Polypeptid bindet sich vorzugsweise an einen Promotor, der ein E-Box-Motiv umfasst. E-Box-Motive sind DNA-Motive, die im Stand der Technik gut bekannt sind und eine Variation der palindromen Hexanukleotidsequenz umfassen, die durch CANNTG wiedergegeben wird (SEQ ID NO: 408). Verfahren zum Bestimmen der Bindung an die E-Box in einem Promotor sind im Stand der Technik gut bekannt.
• Darüber hinaus liefern bHLH12-ähnliche Polypeptide, wenn sie wie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung im Beispielteil umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise ausgewählt aus einem erhöhten Tausendkerngewicht, einem erhöhten Schwerpunkt der Krone und einem veränderten, vorzugsweise erhöhten, Biomassenverhältnis von Wurzel/Spross.
• Darüber hinaus können bHLH12-ähnliche Polypeptide eine bevorzugte subzelluläre Lokalisierung zeigen, typischerweise nukleär, cytoplasmatisch, chloroplastisch und/oder mitochondrial. Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehostet vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM und andere zur Verfügung. Erfindungsgemäße bHLH12-ähnliche Polypeptide befindet sich vorzugsweise im Kern von Pflanzenzellen.
• Weiterhin verfügen ADH2-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine S-Nitrosoglutathionreduktase-(GSNOR-)Aktivtat. Werkzeuge und Techniken zum Messen der GSNOR-Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe Rusterucci et al., 2007.
• Darüber hinaus liefern ADH2-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Samenertrag.
• Weiterhin verfügen GCN5-ähnliche Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine blütenmeristemregulierende Aktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der blütenmeristemregulierenden Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt.
• Darüber hinaus liefern GCN5-ähnliche Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 7 und 8 umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Samenertrag und auch einer erhöhten Biomasse.
• Darüber hinaus können GCN5-ähnliche Polypeptide eine bevorzugte subzelluläre Lokalisierung zeigen, typischerweise nukleär, cytoplasmatisch, chloroplastisch und/oder mitochondrial. Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehostet vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM und andere zur Verfügung.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 1, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten LDOX-Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für LDOX-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A1 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des LDOX-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 2, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz- aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so kann die vorliegende Erfindung zum Beispiel ausgeführt werden, indem man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 185, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 186 codiert, oder SEQ ID NR: 187, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 4 codiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten YRP5-Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für YRP5-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A2 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Orthologe und Paraloge der in Tabelle A2 angeführten Aminosäuresequenzen lassen sich leicht unter Einsatz von Routinewerkzeugen und -methoden wie einer reziproken Blast-Suche erhalten. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 186 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Populus trichocarpa-Sequenzen erfolgen; falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 187 oder SEQ ID NR: 188 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 194, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 195 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für CK1 codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten CK1-Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für CK1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A3 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des CK1-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 195, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 194 oder SEQ ID NR: 195 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Was bHLH-ähnliche Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 279, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 280 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten bHLH12-ähnlichen Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für bHLH12-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A4 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A4 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des bHLH12-ähnlichen Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 280, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begannen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 279 oder SEQ ID NR: 280 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Populus trichocarpa-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 codieren, dargestellt. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten ADH2-Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für ADH2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A5 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des ADH2-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 413, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 412, SEQ ID NR: 413, SEQ ID NR: 414 oder SEQ ID NR: 415 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Saccharum-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 459, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 460 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten GCN5-ähnlichen Polypeptid durchführen.
• Beispiele für für GCN5-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A6 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A6 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des GCN5-ähnlichen Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 460, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. in der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet. Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Wie man den E-Wert berechnet, ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
• Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehostet vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere zur Verfügung.
• Nukleinsäurevarianten können auch bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
• Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, welche durch Genshuffling erhalten werden. Die Begriffe Hybridisierungssequenz, Spleißvariante, Allelvariante und Genshuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
• Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
• Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nichtcodierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes LDOX-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes YRP5-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von YRP5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes CK1-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 194. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment eines Proteins mit mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50% 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 2.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 279 oder SEQ ID NR: 295. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Polypeptid, welches, wenn man es bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorzugsweise innerhalb BEE3, bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes ADH2-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, mit zunehmender Präferenz, mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von ADH2-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes GCN5-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A6 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 459. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 15 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von GCN5-ähnlichen Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
• Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabellen A1 bis A6 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabellen A1 bis A6 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes LDOX-Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes YRP5-Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A2 aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von YRP5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes CK1-Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 194 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Protein mit mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 195.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A4 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 279 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Protein, welches, wenn man es bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorzugsweise innerhalb BEE3, bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes ADH2-Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von ADH2-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so codieren Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes GCN5-Polypeptid, mit im Wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität wie die in Tabelle A6 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A6 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 459 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischer Baums wie dem in 15 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von GCN5-ähnlichen Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe bildet.
• Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleißvariante, die für ein wie hier definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
• Was LDOX-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleißvariante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleißvariante von einer beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfasst.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von YRP5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 194 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 195 codiert.
• Vorzugsweise hat die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 195.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 279 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 280 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn man sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorzugsweise innerhalb BEE3, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415. Vorzugsweise bildet die die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von ADH2-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 459 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 460 codiert. Vorzugsweise bildet die die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 15 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe von GCN5-ähnlichen Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein wie oben definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
• Was LDOX-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäure, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das LDOX-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfassen.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das YRP5-Polypeptid von SEQ ID NR: 186 und beliebige der in Tabelle A2 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz lieber Cluster mit YRP5-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das CK1-Polypeptid von SEQ ID NR: 195 und beliebige der in Tabelle A3 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 194 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 195 codiert. Vorzugsweise hat die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 195.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das bHLH12-ähnliche Polypeptid von SEQ ID NR: 280 und beliebige der in Tabelle A4 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 279 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 280 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die allelische Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn man sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorzugsweise innerhalb BEE3, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ADH2-Polypeptid von SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 und beliebige der in Tabelle A5 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 codiert. Vorzugsweise bildet die von der Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 12 abgebildet ist, lieber Cluster mit den ADH2-Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so haben die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das GCN5-ähnliche Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 460 und beliebige der in Tabelle A6 des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 459 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 460 codiert. Vorzugsweise bildet die von der Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, lieber Cluster mit den GCN5-ähnlichen Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Genshuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche für wie oben definierte LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Genshuffling” wie hier definiert ist.
• Was LDOX-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäurensequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A3 oder Tabelle A4 oder Tabelle A5 oder Tabelle A6 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Genshuffling erhalten wird.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Toleranz von Pflanzen gegenüber abiotischen Stress bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A2 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Genshuffling erhalten wird.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so bildet vorzugsweise die durch die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 4 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster innerhalb der Gruppe der LDOX-Polypeptide als mit irgendeiner anderen Gruppe; besonders bevorzugt bildet die Polypeptidsequenz Cluster innerhalb der Untergruppe A der LDOX-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2 umfasst.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe der YRP5-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so hat die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A3, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 195.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so bildet die durch die durch Genshuffling erhaltene Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn man sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, der mit den Polypeptidsequenzen, auf die in 4 von Heim et al. (2003) Bezug genommen wurde, konstruiert wurde, lieber Cluster mit einem der Polypeptide der Gruppe XII in 4 von Heim et al. (2003), vorzugsweise innerhalb BEE3, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 12 abgebildet ist, lieber Cluster mit der Gruppe der ADH2-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 413 oder SEQ ID NR: 415 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, lieber Cluster mit der Gruppe der GCN5-ähnlichen Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 460 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
• Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
• Für LDOX-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle einschließlich Pilzen oder Bakterien gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
• Für YRP5-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotylen oder dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae oder Solanaceae.
• Für CK1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, besonders bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am meisten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
• Für bHLH12-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das bHLH12-ähnliche Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Populus, ganz besonders bevorzugt aus Populus trichocarpa.
• Für ADH2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das ADH2-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Saccharum officinarum.
• Für GCN5-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das GCN5-ähnliche Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhtem Ertrag, insbesondere einem erhöhtem Samenertrag und/oder einem gesteigerten Wurzelwachstum und/oder einer erhöhten Jungpflanzenvitalität, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag”, ”Samenertrag” und ”Jungpflanzenvitalität” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
• Was CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhtem Ertrag, insbesondere einem erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Stress.
• Ein Verweis auf gesteigerte Ertragsmerkmale soll hier eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, die oberirdische Biomasse und/oder Wurzeln, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
• Nimmt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem in einem oder mehreren der Folgenden zeigen: einer Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, einer Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, einer Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist).
• Nimmt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als Erhöhung eines oder mehrerer der Folgenden zeigen: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl von Rispen pro Pflanze, Rispenlänge, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), einer Erhöhung des Tausendkerngewichts. Bei Reis kann auch eine Toleranz gegenüber Untertauchen zu einem erhöhten Ertrag führen.
• Was abiotischen Stress betrifft, so stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Stresstoleranz von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein YRP5-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30%, oder 25%, weiter bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Trockenheit oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Trockenheit), Salzstress, oxidativem Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
• Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können insbesondere unter Bedingungen einer (milden) Trockenheit durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einer gesteigerten Trockentoleranz im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält, was sich als erhöhter Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen manifestieren könnte. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Trockenheit, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Trocken-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Trockenheit und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Trockenheit oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress” bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter (milden) Trockenbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhter Trockentoleranz im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Trockentoleranz von Pflanzen, welche unter (milden) Trockenbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein YRP5-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nährstoffmangetbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit gesteigerter Toleranz gegenüber durch Nährstoffmangel verursachtem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Toleranz gegenüber durch Nährstoffmangel verursachtem Stress bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, umfasst. Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit gesteigerter Toleranz gegenüber Salz im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Steigern der Salztoleranz von unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
• Was Ertragsmerkmale betrifft, so steht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
• Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann so verstanden werden, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimschnelligkeit, Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, alle innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate lässt sich durch Ableiten verschiedener Parameter aus den Wachstumskurven bestimmen, wobei es sich bei den Parametern unter anderem um die folgenden handeln kann: T-Mid (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 50% ihrer Maximalgrösse benötigen) und T-90 (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 90% ihrer Maximalgrösse benötigen).
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30%, oder 25%, weiter bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Trockenheit oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen: Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Trockenheit), Salzstress, oxidativem Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nichtstress” bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Der Begriff Nichtstressbedingungen, wie hierin verwendet, umfasst die gelegentlichen oder alltäglichen milden Stressfaktoren denen eine Pflanze ausgesetzt ist, wie hierin definiert, umfasst jedoch keine schweren Stressfaktoren.
• Die Verfahren der vorliegender Erfindung können unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Trockenheit durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Trockenheit, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1155–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Trocken-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Trockenheit und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Trockenheit oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress” bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen liefert herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags von unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen einer milden Trockenheit herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das für ein wie oben definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert.
• Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
• Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
• (a) eine Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert;
• (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
• (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• Die Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, ist vorzugsweise wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
• Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verbunden.
• Was LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide betrifft, so kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”. Was GCN5-ähnliche Polypeptide betrifft, so eignet sich für die erfindungsgemäßen Verfahren auch ein wurzelspezifischer Promotor.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein samenspezifischer Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Was LDOX-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für LDOX-Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das LDOX-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
• Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor GOS2 aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 184 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 184 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor aus Reis umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 184, und die für das LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Was YRP5-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für YRP5-Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das YRP5-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
• Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt handelt es sich bei den Promotor um den Promotor GOS2 aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 189. ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 189 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen (GOS2-)Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 189, und die für das YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Was CK1-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für CK1-Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 194 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das CK1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
• Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor GOS2 aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 272 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 272 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 272, und die für das CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Was bHLH12-ähnliche Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für bHLH12-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 279 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das bHLH12-ähnliche Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
• Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor GOS2 aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 357 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 357 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 357, und die für das bHLH12-ähnliche Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Was ADH2-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für ADH2-Polypeptid codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 412 oder SEQ ID NR: 414 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das ADH2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors beschränkt.
• Der samenspezifische Promotor stammt vorzugsweise aus Reis. Weiter bevorzugt wird der samenspezifische Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 458 ähnelt, oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt ist der samenspezifische Promotor ein Promotor gemäß SEQ ID NR: 458. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen putativen Proteinaseinhibitorpromotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 458, und die für das ADH2-Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Was GCN5-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für GCN5-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 459 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das GCN5-ähnliche Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors beschränkt.
• Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor), besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor GOS2 aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 513 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 513 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
• Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 513, und die für das GCN5-ähnliche Polypeptid codierende Nukleinsäure.
• Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Kontrollsequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
• Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
• Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Biomasse, erhöhtem Samenertrag und/oder erhöhter Jungpflanzenvitalität, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
• (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert; und
• (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines LDOX-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerter Stresstoleranz, insbesondere erhöhter Toleranz gegenüber (milder) Trockenheit, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
• (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert; und
• (ii) Kultivieren der Pflanze unter Bedingungen von abiotischem Stress.
• Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines YRP5-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
• (i) Einführen und Exprimieren einer für ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in eine Pflanze oder Pflanzenzelle; und
• (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Bei der Nukleinsäure von (i) kann es sich um eine beliebige Nukleinsäure handeln, die dazu fähig ist, für ein wie oben definiertes CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid zu codieren.
• Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
• Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
• Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nichttransformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
• Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
• Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nichttransformierten Zellen; klonale Transformanten (wobei z. B. alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nichttransformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nichttransformierten Spross gepropft wird) sein.
• Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
• Die Erfindung umfasst außerdem Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, enthalten. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder der Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
• Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Endivien, Karotten, Maniok, Klee, Sojabohne, Rüben, Zuckerrüben, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze. Zu Beispielen von monokotylen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Beispiele für Getreide schließen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ein.
• Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Ertragsmerkmalen, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser LDOX-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
• Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für YRP5-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser YRP5-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
• Für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, oder die LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnlichen Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnlichen Polypeptide selbst, können in Züchtungsprogrammen Anwendung finden, bei denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein Gen gebunden sein kann, das für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert. Die Nukleinsäuren/Gene oder die LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnlichen Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnlichen Polypeptide selbst lassen sich zur Definition eines molekularen Markers verwenden. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und/oder gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Stress, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein LDOX-Polypeptid oder ein YRP5-Polypeptid oder ein CK1-Polypeptid oder ein bHLH12-ähnliches Polypeptid oder ein ADH2-Polypeptid oder ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, können außerdem bei markergestützen Züchtungsprogrammen eingesetzt werden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von Allelvarianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
• Nukleinsäuren, die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Für eine solche Verwendung von für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäuren benötigt man lediglich eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäuren lassen sich als Restriction Fragment Length Polymorphism-(RFLP-)Marker verwenden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lender et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für LDOX-Polypeptide oder YRP5-Polypeptide oder CK1-Polypeptide oder bHLH12-ähnliche Polypeptide oder ADH2-Polypeptide oder GCN5-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
• Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
• Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
• Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
• In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hindert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
• Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
• Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und/oder gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Stress, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Merkmalen und/oder weiteren Merkmalen einer Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, gesteigerten Ertragsmerkmalen, Merkmale, die verschiedene architektonische Eigenschaften und/oder biochemische und/oder physiologische Eigenschaften modifizieren.
• Punkte
• 1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die für ein Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptid codiert, wobei das LDOX-Polypeptid eine Isopenicillin-N-Synthasedomäne (PRINTS-Eintrag PR00682) und eine 2OG-Fe(II)-Oxygenasedomäne (PFAM-Eintrag PF03171) umfasst.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das LDOX-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 1 bis 9 (SEQ ID NR: 173 bis SEQ ID NR: 181) umfasst.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
• 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale eine erhöhte Jungpflanzenvitalität und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
• 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 8, wobei die für ein LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
• 10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, umfasst.
• 11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GO52-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
• 13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
• 15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 16. Transgene Pflanze mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Wurzelbiomasse und/oder Samen sind.
• 19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18 abgeleitet sind.
• 20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 2. YRP5-Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung der Toleranz von Pflanzen gegenüber abiotischem Stress, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 oder eines Orthologs oder Paralogs von einem der beiden codiert.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein YRP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die für ein YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A2 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A2 angegebenen Proteine codiert.
• 5. Verfahren gemäß Punkt 3 oder 4, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 6. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 5, wobei die für ein YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus Populus trichocarpa oder Arabidopsis thaliana stammt.
• 7. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein YRP5-ähnliches Polypeptid codiert, umfasst.
• 8. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 9. Konstrukt gemäß Punkt 8, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promoter, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
• 10. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 8 oder 9 in einem Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit erhöhter Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 11. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 8 oder 9 transformiert ist.
• 12. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhter Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche abiotischen Stress fördern.
• 13. Transgene Pflanze mit Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 14. Transgene Pflanze gemäß Punkt 7, 11 oder 13, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Zuckerrohr, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 15. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 14, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 16. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 14 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 15 abgeleitet sind.
• 17. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein Caseinkinase-1-, CK1-, Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das CK1-Polypeptid ein Proteinmotiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem der folgenden Motive umfasst; (i) Motiv 13: KANQVY(IV)ID(YF)GLAKKYRDLQTH(KR)HIPYRENKNLTGTARYASVNTHLG(VI)EQ (SEQ ID NR: 276), (ii) Motiv 14: CKSYPSEF(VTI)SYFHYCRSLRFEDKPDYSYLKRLFRDLFIREGYQFDYVFDW (SEQ ID NR: 277), (iii) Motiv 15: PSLEDLFNYC(NS)RK(FL)(ST)LKTVLMLADQ(LM)INRVEYMHSRGFLHRDIKPDNFLM (SEQ ID NR: 278) wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
• 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
• 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
• 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
• 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, umfasst.
• 12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
• 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
• 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
• 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 22. isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268; (ii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; 1. eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A3, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; 2. ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; 3. eine Nukleinsäure, die für ein Calreticulin-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
• 23. Isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
• 4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-ähnliches (bHLH12-ähnliches) Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das bHLH12-ähnliche Polypeptid ein Proteinmotiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem der Motive 16 bis 19 (SEQ ID NR: 404 bis 407) umfasst;
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A4 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A4 angegebenen Proteine codiert.
• 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
• 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
• 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
• 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, umfasst.
• 12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
• 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
• 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
• 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 22. Isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335; (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A4, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) eine Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt
• 23. Isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
• 5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das ADH2-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) GROES-Domäne (Domäne 1): AGEVRVKILFTALCHTDHYTWSGKDPEGLFPCILGHEAAGVVESVGEGVTEVQPGDHVIPCYQAECKECKFCKSGKTNLCGKVRGATGVGVMMNDMKSRFSVNG KPIYHFTGTSTFSQYTVVHDVSVAKI, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 1; und (ii) Domäne der zinkbindenden Dehydrogenase (Domäne 2): AGSIVAVFGLGTVGLAVAEGAKAAGASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVNPKDHDKPIQQVLVDLTDGGVDYSFECIGNVSVMRAALECCHKDWGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGFKSRTQVPWLVD, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 2; und gegebenenfalls zusätzlich (iii) DUF61-Domäne (Domäne 3): VDKYMNKEVK, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, wenigstens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 3.
• 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das ADH2-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 20 bis 30 oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, wenigstens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne III einer der Motive 20 bis 30 umfasst: Motiv 20: HYTWSGKDP (SEQ ID NR: 445); Motiv 21: PCYQAECK (SEQ ID NR: 446); Motiv 22: GKTNLCGKVRGATGVGVMMND (SEQ ID NR: 447); Motiv 23: YHFMGTSTFSQYTVVHDVSVAKINPQAPLDKVCLLGCGVPTGLG (SEQ ID NR: 448); Motiv 24: WNTAKVEAGSIVAVFGLGTVGLAVAEG (SEQ ID NR: 449); Motiv 25: GASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVN (SEQ ID NR: 450); Motiv 26: KDHDKPIQLVLVDIAD (SEQ ID NR: 451); Motiv 27: SVRRAAEEC (SEQ ID NR 452); Motiv 28: WGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGF (SEQ ID NR 453); Motiv 29: KVDEYITH (SEQ ID NR: 454); Motiv 30: MLKGESIRCIITM (SEQ ID NR: 455) umfasst.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein ADH2-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A5 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A5 angegebenen Proteine codiert.
• 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
• 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem putativen Proteinaseinhibitorpromotor aus Reis, verbunden ist.
• 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Saccharum, am meisten bevorzugt aus Saccharum officinarum.
• 10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, umfasst.
• 11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einen putativen Proteinaseinhibitorpromotor, ganz besonders bevorzugt einen putativen Proteinaseinhibitorpromotor aus Reis handelt.
• 13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
• 15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18 abgeleitet sind.
• 20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• 1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das Polypeptid zwei Domänen mit den PFam-Zugangsnummern PF00583 und PF00439 umfasst:
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das GCN5-Polypeptid auch die folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 31: LKF[VL]C[YL]SNDGVD[EQ]HM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[ST]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 501), (ii) Motiv 32: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HY]ARD[AV]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 502), (iii) Motiv 33: H[AP]DAWPFKEPVD[SA]RDVPDYYDIIKDP[IM]DLKT[MI]S[KR]RV[ED]SEQYYVTLEMFVA (SEQ ID NR: 503).
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei das GCN5-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 34: LKF[LV]C[YL]SNDG[VI]DEHM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[TS]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 504), (ii) Motiv 35: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQHARD[AVM]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 505), (iii) Motiv 36: KQGFTKEI[THY][LF][DE]K[ED]RW[QH]GYIKDYDGGILMECKID[PQ]KLPY[TV]DL[AS]TMIRRQRQ (SEQ ID NR: 506).
• 4. Verfahren gemäß einem der Punkt 1 bis 3, wobei das GCN5-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 37: LKFVC[LY]SND[GDS][VI]DEHM[VM][WCR]LIGLKNIFARQLPNMPKEYIVRL[VL]MDR[SGK]HKSVM (SEQ ID NR: 507), (ii) Motiv 38: CAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HFY]ARD[MV]DGLTHFLTYADNNAVGYF[IV]KQGF (SEQ ID NR: 508), (iii) Motiv 39: W[QH]G[YF]IKDYDGG[IL]LMECKID[PQ]KL[PS]YTDLS[TS]MIR[RQ]QR[QK]AIDE[KR]IRELSNC[HQ][IN] (SEQ ID NR: 509).
• 5. Verfahren gemäß einem der Punkt 1 bis 4, wobei das GCN5-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 40: FLCYSNDGVDEHMIWLVGLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDRTHKSMMVI (SEQ ID NR: 510), (ii) Motiv 41: MNHLKQHARDADGLTHFLTYADNNAVGY[FL]VKQGFTKEIT[LF]DKERWQGYIK (SEQ ID NR: 511), (iii) Motiv 42: IR[ED]LSNCHIVY[SP]GIDFQKKEAGIPRR[LT][MI]KPEDI[PQ]GLREAGWTPDQ[WL]GHSK (SEQ ID NR: 512).
• 6. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein wie in einem der vorherigen Punkte definiertes GCN5-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die für ein GCN5-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A6 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
• 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 7, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A6 angegebenen Proteine codiert.
• 9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
• 11. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
• 12. Verfahren gemäß einem der Punkte 6 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 13. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 12, wobei die für ein GCN5-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
• 14. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 13, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, umfasst.
• 15. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 5 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 16. Konstrukt gemäß Punkt 15, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
• 17. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 15 oder 16 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 18. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 15 oder 16 transformiert ist.
• 19. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 5 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 20. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 5 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 21. Transgene Pflanze gemäß Punkt 18, 19 oder 21, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
• 22. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 21, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 23. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 21 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 22 abgeleitet sind.
• 24. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• Beschreibung der Figuren
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
• 1 Anthocyanin- und PA-Synthesepfad in Arabidopsis (Abrahams et al., 2003). Gezeigt ist der Anthocyanin- und PA-Pfad von Chalconsynthase. Die Enzyme LDOX und BAN wirken auf Leucocyanidin bzw. Cyanidin unter Bildung von Epicatechin. Die Catechinsynthese (gestrichelte Linie) konnte in Arabidopsis bislang noch nicht gezeigt werden. Verwendete Abkürzungen: CHS, Chalconsynthase; CHI, Chalconisomerase; F3H, Flavanon-3-β-hydroxylase; F3'H, Flavonoid-3'-hydroxylase; FLS, Flavonolsynthase; DFR, Dihydroflavonol-4-reduktase, LDOX, Leucoanthocyanidindioxygenase; BAN, Anthocyanidinreduktase; UFGT, UDP Glucose-flavonoid-3-O-glucosyltransferase.
• 2 zeigt die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 2 mit den konservierten Domänen Isopenicillinsynthase (fett) und 2OG-Fe(II)-Oxygenase (kursiv) und den Motiven (unterstrichen und nummeriert).
• 3 zeigt ein multiples Alignment verschiedener LDOX-Polypeptide, die Bezeichnungen entsprechen den in der Sequenzliste verwendeten.
• 4 zeigt den phylogenetischen Baum der LDOX-Polypeptide.
• 5 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für LDOX-Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• 6 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für YRP5-Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• 7 zeigt ein multiples Alignment der pflanzlichen CK1-Polypeptide von Tabelle A3.
• 8 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für CK1-Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• 9 zeigt ein multiples Alignment der pflanzlichen bHLH12-ähnlichen Polypeptide von Tabelle A4. Die Position von Motiv 16 bis 19 und die bHLH-Domäne in den Polypeptiden des Alignments ist gezeigt.
• 10 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für bHLH12-ähnliche Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• 11 zeigt ein multiples Alignment der pflanzlichen ADH2-ähnlichen Polypeptide.
• 12 ist eine Wiedergabe von 3 aus Kavanagh et al., Cell Mol Life Sci. 2008 Dez.; 65(24): 3895–3906.
• 13 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für ADH2-Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines putativen Proteinaseinhibitorpromotors in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• 14 zeigt die Gesamtstruktur von GCN5 in Wirbeltieren, Drosophila und Hefe. Gezeigt ist die schematische Darstellung und die Domänenorganisation von GCN5 aus Menschen (hs; Homo sapiens), Huhn (gg; Gallus gallus), Zebrafisch (dr; Danio rerio), Kugelfisch (tn; Tetraodon nigrovindis), Drosophila melanogaster (dm) und Hefe (sc; Saccharomyces cerevisiae). Die AT-Domäne ist schwarz und die Bromodomäne (Bromo) schattiert gezeigt. Die Zahlen über den Kästchen geben die Positionen der Aminosäuren an. Die Identität zwischen den verschiedenen Faktoren ist recht von den horizontalen Linien in % angegeben, wobei die Zahlen für paarweise Vergleiche stehen. AT bedeutet ”Acetyltransferase”.
• 15 stellt den phylogenetischen Baum ausgewählter GCN5-Proteine für die verschiedenen Kladen dar: die Klade monokotyler Pflanzen, die Klade dikotyler Pflanzen, die Klade der höheren Gefäßpflanzen, die Klade der Gefäßpflanzen, die Klade der Pflanzen und die Klade der Eukaryoten. Das Alignment wurde mit MAFFT (Katoh and Toh (2008) Briefings in Bioinformatics 9: 286–298) erstellt. Ein Neighbour-joining-Baum wurde mit QuickTree berechnet (Houwe et al. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546–7), 100 bootstrap repetitions. Das kreisförmiges Phylogramm wurde mit Dendroscope gezeichnet (Hudson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 460). Für Hauptverzweigungen ist die Konfidenz für 100 bootstrap-Wiederholungen angegeben. Hauptverzweigungspositionen sind durch Kreise gekennzeichnet.
• 16 zeigt den für eine erhöhte Expression einer für GCN5-Polypeptide codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor.
• Beispiele
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
• DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
• Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
• Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenz-Suchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
• 1.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• In Tabelle Al findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Diese Sequenzen sind Teil der Untergruppe A im phylogenetischen Baum von 4. Tabelle A1: Beispiele für LDOX-Polypeptide:

  Name des Gens	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
  A.thaliana_AT5G05600.1#1_PLN_LDOX-1	1	2
  Gossypium_hirsutum_EU921264#1_PLN_LDOX-1	3	4
  Hieracium_pilosella_EU561015#1_PLN_LDOX-1	5	6
  A.thaliana_AT3G11180.1#1_PLN_LDOX-1	7	8
  P.trichocarpa_560919#1_PLN_LDOX-1	9	10
  P.trichocarpa_646527#1_PLN_LDOX-1	11	12
  G.max_TC240789#1_PLN_LDOX-1	13	14

  S.bicolor_Sb03g038880.1#1_PLN_LDOX-1	15	16
  A.thaliana_AT2G38240.1#1_PLN_LDOX-1	17	18
  A.thaliana_AT4G22880.1#1_PLN_LDOX-1	19	20
  O.sativa_LOC_Os11g25060.1#1_PLN_LDOX-1	21	22
  O.sativa_LOC_Os06g06720.1#1_PLN_LDOX-1	23	24
  Anthurium_andraeanum_AY232495#1_PLN_LDOX-1	25	26
  Allium_cepa_AY221248#1_PLN_LDOX-1	27	28
  O.sativa_LOC_Os02g52840.1#1_PLN_LDOX-1	29	30
  Antirrhinum_majus_DQ272591#1_PLN_LDOX-1	31	32
  A.thaliana_AT4G03070.1#1_PLN_LDOX-like	33	34
  P.patens_220256#1_PLN_LDOX-like	35	36
  M.truncatula_AC149079_25.4#1_PLN_LDOX-like	37	38
  S.lycopersicum_TC206577#1_FUNGI_LDOX-like	39	40
  A.fumigatus_XP_746433.2_Aspergillus_fumigatus_Af293_FUNGI_LDOX-like	41	42
  P.stutzeri_YP_001173385.1_Pseudomonas_stutzeri_A1501_BAC_LDOX-like	43	44
  B.phymatum_YP_001861244.1_Burkholderia_phymatum_STM815_BAC_LDOX-like	45	46
  P.aeruginosa_YP_001345621.1_Pseudomonas_aeruginosa_PA7_BAC_LDOX-like	47	48
  P.aerugenosa_NP_252880.1_Pseudomonas_aeruginosa_PAO1_BAC_LDOX-like	49	50
  G.zeae_XP_391616.1_FG11440.1_Gibberella_zeae_PH-1_FUNGI_LDOX-like	51	52
  M.smegmatis_YP_884827.1_Mycobacterium_smegmatis_str_MC2 155_BAC_LDOX-like	53	54
  S.pombe_NP_588526.2_Schizosaccharomyces_pombe_972b_FUNGI_LDOX-like	55	56
  O.sativa_LOC_Os02g41954.1#1_PLN_LDOX-like	57	58
  P.patens_141764#1_PLN_LDOX-like	59	60
  P.trichocarpa_760976#1_PLN_LDOX-like	61	62
  Acacia_mangium_EU252106#1_PLN_LDOX-like	63	64
  Helianthus_annuus_AM989990#1_PLN_LDOX-like	65	66
  Phaseolus_vulgaris_U70532#1_PLN_LDOX-like	67	68
  Gossypium_hirsutum_AY895169#1_PLN_LDOX-like	69	70
  M.truncatula_AC152349_23.5#1_PLN_LDOX-like	71	72
  A.thaliana_AT2G34555.1#1_PLN_LDOX-like	73	74
  A.thaliana_AT1G78440.1#1_PLN_LDOX-like	75	76
  Helianthus_annuus_FM872397#1_PLN_LDOX-like	77	78
  Phaseolus_coccineus_AJ132438#1_PLN_LDOX-like	79	80
  S.bicolor_Sb03g0350001#1_PIN_LDOX-lke	81	82
  Zea_mays_EU951971#1_PLN_LDOX-like	83	84
  M.truncatula_AC124961_21.4#1_PLN_LDOX-like	85	86
  A.thaliana_AT4G21690.1#1_PLN_LDOX-like	87	88
  Phaseolus_coccineus_AJ854305#1_PLN_LDOX-like	89	90
  O.sativa_LOC_Os01_g08220.1#1_PLN_LDOX-like	91	92
  P.patens_127644#1_PLN_LDOX-like	93	94
  A.thaliana_AT4G23340.1#1_PLN_LDOX-like	95	96
  A.thaliana_AT1G78550.1#1_PLN_LDOX-like	97	98
  Helianthus_annuus_EF469861#1_PLN_LDOX-like	99	100
  S.lycopersicum_TC196004#1_PLN_LDOX-like	101	102
  P.trichocarpa_550094#1_PLN_LDOX-like	103	104
  O.sativa_LOC_Os10g40880.1#1_PLN_LDOX-like	105	106
  T.aestivum_c54899629@17382#1_PLN_LDOX-like	107	108
  Z.mays_ZM07MC20186_BFb0126L23@20135#1_PLN_LDOX-like	109	110
  S.bicolor_Sb02g007240.1#1_PLN_LDOX-like	111	112
  Zea_mays_EU972786#1_PLN_LDOX-like	113	114
  P.trichocarpa_578863#1_PLN_LDOX-like	115	116
  M.truncatula_TC119720#1_PL_LDOX-like	117	118
  G.max_TC252707#1_PLN_LDOX-like	119	120
  S.bicolor_Sb10g005210.1#1_PLN_LDOX-like	121	122
  A.thaliana_AT4G10500.1#1_PLN_Z	123	124
  P.trichocarpa_569251#1_PLN_Z	125	126
  M.truncatula_AC151423_10.5#1_PLN_Z	127	128
  P.patens_162685#1_PLN_Z	129	130
  O.sativa_LOC_Os08g37456.1#1_PLN_Z	131	132
  G.max_TC263716#1_PLN_Z	133	134
  S.lycopersicum_TC196957#1_PLN_Z	135	136
  O.sativa_LOC_Os02g53180.1#1_PLN_Z	137	138
  Actinidia_deliciosa_M97961#1_PLN_Z	139	140
  Hevea_brasiliensis_AM743172#1_PLN_Z	141	142
  Phaseolus_lunatus_AB062359#1_PLN_Z	143	144
  Gossypium_hirsutum_DQ116444#1_PLN_Z	145	146
  O.sativa_LOC_Os04g56700.1#1_PLN_Z	147	148
  Aethusa_cynapium_DQ683351#1_PLN_Z	149	150
  Ammi_majus_AY817678#1_PLN_Z	151	152
  Anethum_graveolens_AY817679#1_PLN_Z	153	154
  G.max_TC235255#1_PLN_Z	155	156
  Aethusa_cynapium_DQ683350#1_PLN_Z	157	158
  Apium_graveolens_AY817676#1_PLN_Z	159	160
  Allium_cepa_AY221246#1_PLN_Z	161	162
  Anthurium_andraeanum_AY232493#1_PLN_Z	163	164
  Hieracium_pilosella_EU561014#1_PLN_Z	165	166
  P.trichocarpa_773769#1_PLN_Z	167	168
  S.lycopersicum_TC205689#1_PLN_Z	169	170
  P.patens_146815#1_PLN_Z	171	172

• In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. in anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
• 1.2. YRP5-Polypeptide
• In Tabelle A2 findet sich eine Liste von YRP5-Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A2: Beispiele für YRP5-Polypeptide:

  Name	Organismus	Nukteinsäure-SEQ ID NR	Polypeptid-SEQ ID NR
  Pt_YRP5	Populus trichocarpa	185	186
  At_YRP5	Arabidopsis thaliana	187	188

• In manchen Fällen werden entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) werden derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifiziert. In anderen Fällen werden spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”.
• 1.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• In Tabelle A3 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten homologen Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A3: Beispiele für CK1-Nukleinsäuren und die von ihnen codierten Polypeptide:

  Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polynukleotid SEQ ID NR:
  A.thaliana_AT5G43320.1	194	195
  A.thaliana_AT5G43320.1_AF360257	196	197
  A.thaliana_AT1_G03930.1	198	199
  A.thaliana_AT1G04440.1	200	201
  A.thaliana_AT3G23340.1	202	203
  A.thaliana_AT4G14340.1	204	205
  A.thaliana_AT4G28540.1	206	207
  A.thaliana_AT5G44100.1	208	209
  B.napus_BN06MC08360_42724797@8337	210	211
  B.napus_BN06MC29527_51362554@29403	212	213
  C.sinensis_TA13558_2711	214	215
  G.max_Gm0063x00417	216	217
  G.max_Gm0272x00019	218	219
  G.max_GM06MC19561_59701261@19191	220	221
  H.argophyllus_TA2201_73275	222	223
  H.vulgare_TA34160_4513	224	225
  L.sativa_TA836_4236	226	227
  L.usitatissimum_LU04MC11322_LU61714150@11318	228	229
  M.domestica_TA29095_3750	230	231
  M.truncatula_AC174288_27.4	232	233
  O.sativa_LOC_Os02g40860.1	234	235
  O.sativa_LOC_Os02g56560.1	236	237
  O.sativa_LOC_Os04g43490.1	238	239
  O.sativa_LOC_Os10g33650.1	240	241
  P.trichocarpa_725863	242	243
  P.trichocarpa_803757	244	245
  P.trichocarpa_816074	246	247
  P.trichocarpa_scaff_V.1336	248	249
  P.trichocarpa_scaff_XIII.465	250	251
  S.bicolor_5277943	252	253
  S.bicolor_5284662	254	255
  S.officinarum_TA30972_4547	256	257
  T.aestivum_TA72195_4565	258	259
  V.vinifera_GSVIVT00020288001	260	261
  V.vinifera_GSVIVT00028561001	262	263
  Z.mays_TA179031_4577	264	265
  Z.mays_TA184008_4577	266	267
  Z.mays_ZM07MC21747_BFb0210E19@21687	268	269

• In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
• 1.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• In Tabelle A4 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten homologen Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A4: Beispiele für bHLH12-ähnliche Nukleinsäuren und die von ihnen codierten Polypeptide:

  Name	Nukleinsaure-SEQ ID NR:	Polypeptid-SEQ ID NR:
  Poptr_TA1	279	280
  A.thaliana_AT1_G68920.1	281	282
  A.thaliana_AT3G07340.1	283	284
  A.thaliana_AT5G48560.1	285	286
  AT1G26260.1	287	288
  G.max_Gm0017x00130	289	290
  G.max_Gm0119x00198	291	292
  M.truncatula_AC171266_17.4	293	294
  O.sativa.indica_BGIOSIBCE028578	295	296
  O.sativa.indica_BGIOSIBCE030471	297	298
  O.sateva_LOC_Os01g68700.1	299	300
  O.sativa_LOC_Os09g32510.1	301	302
  O.sateva_LOC_Os09g32510.2	303	304
  O.sativa_LOC_Os09g32510.3	305	306
  O.sativa_LOC_Os09g32510.4	307	308
  O.sativa_Os01g0915600	309	310
  O.sativa_Os08g0524800	311	312
  O.sativa_Os09g0501600	313	314
  O.sateva_TA48480 4530	315	316
  P.patens_171809	317	318
  P.persica_TA4550_3760	319	320
  P.trichocarpa_553223	321	322
  P.trichocarpa_566736	323	324
  P.trichocarpa_572918	325	326
  S.bicolor_5288233	327	328
  V.vinifera_GSVIVT00021166001	329	330
  V.vinifera_GSVIVT00031646001	331	332
  Z.mays_TA192877_4577	333	334
  Z.mays_ZM07MC34166_BFb0333007@34064	335	336
  A.formosa_x_pubescens_TA11486_338618	337	338
  A.formosa_x_pubescens_TA14036_338618	339	340
  A.thaliana_AT3G23690.1	341	342
  AT1G10120.1	343	344
  AT1G18400.1	345	346
  AT1G25330.1	347	348
  AT1G59640.1	349	350
  AT1G73830.1	351	352
  AT1G74500.1	353	354
  AT2G18300.1	355	356
  AT2G42300.1	357	358
  AT3G47710.1	359	360
  AT3G57800.1	361	362
  AT4G34530.1	363	364
  AT5G15160.1	365	366
  AT5G39860.1	367	368
  AT5G50915.1	369	370
  AT5G62610.1	371	372
  Atrichopoda_CO999791	373	374
  G.max_Gm0048x00157	375	376
  G.max_Gm0248x00045.1	377	378
  M.truncatula_TA31225_3880	379	380
  O.sativa_LOC_Os09g32510.5	381	382
  P.sitchensis_TA17440_3332	383	384
  P.taeda_TA18081_3352	385	386
  S.bicolor_TA25015_4558	387	388
  S.moellendorffii_439190	389	390
  S.tuberosum_TA37331_4113	391	392
  Z.mays_TA159345_4577	393	394
  Os_BEE3	395	396
  At_BEE3	397	398
  At_BEE3_2	399	400
  Os_BEE3_2	401	402

• In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
• 1.5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• In Tabelle A5 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A5: Beispiele für ADH2-Polypetide:

  Name	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Polypeptid-SEQ ID NR:
  Arabidopsis	412	413
  T___M___C___37431; CDS___; 278; 1423; 4547; 39#	414	415
  A.thaliana_AT5G43940.1#1	416	417
  M.truncatula_AC146819_11.4#1	418	419
  O.sativa_AK058376#1	420	421
  O.sativa_AK109105#1	422	423
  O.sativa_Os02g0815500#1	424	425
  P.patens_129804#1	426	427
  P.patens_137950#1	428	429
  P.trichocarpa_scaff_II.2595#1	430	431
  P.trichocarpa_scaff_XIV.1430#	432	433
  S.lycopersicum_TC191692#	434	435
  Zuckerrohr	436	437
  Z.mays_TA10843_4577999#	438	439
  T___M___C___884; CDS___; 46; 1185; 3702; 40#	440	441

• In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
• 1.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• In Tabelle A6 findet sich eine Liste GCN5-ähnlicher Sequenzen. Tabelle A6: Beispiele für GCN5-ähnliche Polypeptide:

  Name	Nukleinsäure-SEQ ID NR:	Polypeptid-SEQ ID NR:
  > T.aestivum_GCN5	459	460
  > Hordeum_vulgare_AK252049	461	462
  > O.sativa_LOC_Os10g28040.1	463	464
  > S.bicalor_Sb01g021950.1	465	466
  > Zea_mays_AF440227	467	468
  > A.thaliana_AT3G54610.1	469	470
  > G.max_Glyma03g31490.1	471	472
  > G.max_Glyma19g34340.1	473	474
  > P.trichocarpa_421007	475	476
  > P.sitchensis_WS0277_C21	477	478
  > S.moellendorffii_139448	479	480
  > P.patens_HAG1501	481	482
  > C.reinhardtii_142398	483	484
  > C.vulgaris_43427	485	486
  > O.lucimarinus_33057	487	488
  > O.RCC809_28620	489	490
  > O.taurii_34304	491	492
  > S.cerevisiae_GCN5	493	494
  > D.discoidum_GCN5	495	496
  > H.sapiens_GCN5	497	498
  > P.tricornutum_HAG15203	499	500

• In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
• Beispiel 2: Alignment der mit den in den Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptidsequenzen verwandten Sequenzen
• 2.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Blosum 62 (wenn die Polypeptide aligniert sind), gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2). Die LDOX-Polypeptide sind in der 3 aligniert.
• Mit diesem Alignment lassen sich konservierte Signatursequenzen mit einer Länge von etwa 5 bis 10 Aminosäuren bestimmen. Vorzugsweise werden die konservierten Regionen der Proteine verwendet, die durch die identische Reste über das Alignment und konservierte Substitutionen erkennbar sind. Dem Fachmann ist die Identifizierung solcher konservierten Regionen vertraut.
• Für den phylogenetischen Baum wurden die Proteine mit MAFT (Katoh und Toh (2008). Briefings in Bioinformatics 9: 286–298.) aligniert. Ein Neighbour-joining-Baum wurde mit QuickTree1.1 berechnet (Houwe et al. (2002). Bioinformatics 18(11): 1546–7). Ein kreisförmiges Dendrogramm wurde mit Dendroscope2.0.1 gezeichnet (Hudson et al. (2007). Bioinformatics 8(1): 460). Der Baum wurde unter Einsatz repräsentativer Mitglieder jedes Clusters erstellt. Innerhalb der LDOX-Proteine sind vier Untergruppen erkenntlich, diese haben jedoch die gleiche funktionelle Aktivität. SEQ ID NR: 2 ist im Baum als A.thaliana_AT5G05600.1#1_PLN angegeben.
• 2.2. YRP5-Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgt unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet (bzw. Blosum 62 (wenn die Polypeptide aligniert sind), gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wird eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt.
• Ein phylogenetischer Baum der YRP5-Polypeptide wird mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus dem Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgt unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wird eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt.
• 2.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem MAFFT-Alignment-Programm (MAFFT (v6.704b)), einer Methode für das schnelle multiple Sequenzalignment, welches auf einer schnellen Fourier-Transformation basiert, bei welcher eine Aminosäuresequenz in eine Sequenz umgewandelt wird, die aus Volumen- und Polaritätswerten der einzelnen Aminosäurereste besteht, im Wesentlichen wie von Katoh et al. Nucleic Acids Research, 2002, Band 30, Nr. 14 3059–3066 beschrieben.
• In 7 sind die CK1-Polypeptide aligniert und in einem Alignment im CLUSTAL-Format gezeigt.
• Hochkonservierte Reste (*) und konservierte Reste (:) sind markiert.
• 2.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche)Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem Align-Package des VNTI-Programms (Invitrogen) unter Anwendung der Standardeinstellungen.
• In 9 sind die bHLH12-ähnlichen Polypeptide aligniert und in einem Alignment im CLUSTAL-Format gezeigt. Gezeigt ist eine Konsensussequenz, die die am häufigsten vorkommenden Aminosäuren zeigt. Keine Aminosäure in der Konsensussequenz bedeutet, dass in dieser Position keine oder eine beliebige Aminosäure stehen kann.
• 2.5. Alkoholdehydragenase-(ADH2-)Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgt unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet (bzw. Blosum 62 (wenn die Polypeptide aligniert sind), gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wird eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Ein phylogenetischer Baum der ADH2-Polypeptide wird mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus dem Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
• 2.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet (bzw. Blosum 62 (wenn die Polypeptide aligniert sind), gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2).
• Ein phylogenetischer Baum der GCN5-ähnlichen Polypeptide (15) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus dem Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
• Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Polypeptidsequenzen
• 3.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences verfügbar sind. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
  Wertungsmatrix: Blosum62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt.
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten LDOX-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, lediglich 18,2% Aminosäureidentität betragen; selbst innerhalb der Untergruppe A des phylogenetischen Baums, der SEQ ID NR: 2 umfasst, kann die Sequenzidentität lediglich 26,7% betragen.
• 
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• 3.2. YRP5-Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen werden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter sind:
  Wertungsmatrix: Blosum 62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• Es können auch eine MATGAT-Tabelle für das lokale Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten bezüglich der Identitäts-/Ähnlichkeits-% zwischen spezifischen Domänen erzeugt werden.
• 3.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMG Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
  Wertungsmatrix: Blosum 62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die globale Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt.
• Die prozentuale Identität zwischen den CK1-Polypeptidsequenzen in Tabelle B2 liegt im Bereich von 92% bis 94%, verglichen mit SEQ ID NR: 195.
• 
• 3.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in Tabelle B3 in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
  Wertungsmatrix: Blosum 62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• Die prozentuale Identität zwischen den bHLH12-ähnlichen Polypeptidsequenzen in Tabelle B3 liegt im Bereich von 92% bis 94%, verglichen mit SEQ ID NR: 280.
• 
• 3.5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-ADH2-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter sind:
  Wertungsmatrix: Blosum 62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• 3.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: eine Anwendung, die Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen mittels Protein- oder DNA-Sequenzen erzeugt. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in Tabelle B4 in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
  Wertungsmatrix: Blosum 62
  Erstlücke: 12
  Lückenerweiterung: 2
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten GCN5-ähnlichen Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 460, lediglich 26,90% Aminosäureidentität betragen. Tabelle B4: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.

  
• 
• Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
• 4.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 sind in der Tabelle C1 aufgeführt. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2.

  Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR 2
  InterPro	IPR002283	Isopenicillin-N-Synthase	/
  FPrintScan	PR00682	IPNSYNTHASE	T[85–102] 7.8E–8 T[280–306] 7.8E–8
  InterPro	IPR005123	2OG-Fe(II)-Oxygenase	/
  HMMPfam	PF03171	2OG-Fell_Oxy	T[220–320] 6.50E–42
  InterPro	NULL	NULL	/
  Gene3D	G3DSA:2.60.120.330	G3DSA:2.60.120.330	T[21–368] 9.20E–112
  HMMPanther	PTHR10209	PTHR10209	T[79–369] 0.0 T[79–369] 0.0
  HMMPanther	PTHR10209:SF19	PTHR10209:SF19	T[79–369] 0.0 T[79–369] 0.0
  Superfamilie	SSF51197	SSF51197	T[22–362] 6.1E–110

• 4.2. YRPS-Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• 4.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 195 sind in der Tabelle C2 aufgeführt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2.

  Methode	Zugangsnummer	Kurzbezeichnung	Ort
  IPR000719	Protein kinase, core
  PRODOM	PD000001	Prot_kinase	0.0 [9–248]T
  PROFILE	PS50011	PROTEIN_KINASE_DOM	0.0 [9–278]T
  IPR011009	Protein kinase-like
  SUPERFAMILY	SSF56112	Kinase_like	6.8E–64 [1–299]T
  	Serine/threonine protein
  IPR017442	kinase-related
  PFAM	PF00069	Pkinase	4.6E–36 [9–232]T
  noIPR	unintegrated
  GENE3D	G3DSA:1.10.510.10	G3DSA:1.10.510.10	3.3E–54 [85–293]T
  GENE3D	G3DSA:3.30.200.20	G3DSA:3.30.200.20	4.0E–29 [2–84]T
  PANTHER	PTHR11909	PTHR11909	0.0 [19–404]T 0.0 [19–404]T
  PANTHER	PTHR11909:SF18	PTHR11909:SF18	0.0 [19–404]T 0.0 [19-404]T

• 4.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 280, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 280.

  Methode	Zugang	InterPro	Domäne	Start	Stopp	E-Wert	Domänenname	Anmerkung
  Gene3D	G3DSA:4.10.28 0.10	IPR011598	nicht beschrieben	371	452	4,00E–07	Helix-Schleife-Helix-DNA-Bindung	zelluläre Komponente: Kern (GO:0005634), molekulare Funktion: Transkriptionssteuerungsaktivität (GO:0030528), biologisches Verfahren: Steuerung der Transkription (GO:0045449)
  HMMPanth er	PTHR12565:SF 7	NULL	ZENTROMERENBIN-DUNGSPROTEIN 1, CBP-1	378	425	8,90E–07	NULL
  HMMPanth er	PTHR12585	NULL	STEROLSTEUERUNGSELEMENT-BINDENDES PROTEIN	378	425	8,90E–07	NULL
  HMMSmart	SM00353	IPR001092	HLH	381	431	5,50E–10	Basische Helix-Schleife-Helix-Dimerisierungsregion bHLH	zelluläre Komponente: Kern (GO:0005634), molekulare Funktion: Transkriptionssteuerungsaktivität (GO:0030528), biologisches Verfahren: Steuerung der Transkription (GO:0045449)
  ProfileScan	PS50888	IPR001092	HLH	369	426	11,765	Basische Helix-Schleife-Helix-Dimerisierungsregion bHLH	zelluläre Komponente: Kern (GO:0005634), molekulare Funktion: Transkriptionssteuerungsaktivität (GO:0030528), biologisches Verfahren: Steuerung der Transkription (GO:0045449)
  HMMPfam	PF00010	IPR001092	HLH	376	426	1,80E–06	Basische Helix-Schleife-Helix-Dimerisierungsregion bHLH	zelluläre Komponente: Kern (GO:0005634), molekulare Funktion: Transkriptionssteuerungsaktivität (GO:0030528), biologisches Verfahren: Steuerung der Transkription (GO:0045449)
  Superfamilie	SSF47459	IPR011598	HLH, Helix-Schleife-Helix-DNA-Bindungsdomäne	373	458	2,00E–16	Helix-Schleife-Helix-DNA-Bindung	zelluläre Komponente: Kern (GO:0005634), molekulare Funktion: Transkriptionssteuerungsaktivität (GO:0030528), biologisches Verfahren: Steuerung der Transkription (GO:0045449)

• 4.5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 413 sind in Tabelle C4 angeführt.
• Es wurden insbesondere die folgenden Domänen identifiziert:
  IPR002085: Alkoholdehydrogenasesuperfamilie, Zn-haltig
  PTHR11695: alkoholdehydrogenaseverwandt
  IPR002328: Alkoholdehydrogenase, Zn-haltig, konservierte Stelle
  PS00059: ADH_ZINC
  IPR011032: GroES-ähnlich
  SSF50129: GroES-ähnlich
  IPR013149: Alkoholdehydrogenase, Zn_bindend
  PF00107: ADH_Zinc_N
  IPR013149: Alkoholdehydrogenase, GroES-ähnlich
  PF08240: ADH_N
  IPR01418: Alkoholdehydrogenase, Klasse III S-(Hydroxymethyl)glutathiondehydrogenase
  TIGR02818: adh_III_F_hyde: S-(Hydroxymethyl)glutathion
  G3DSA:3.90.180.10 (keine Beschreibung)
  PTHR11695:SF4: Alkoholdehydrogenase Tabelle C4: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 413.

  
• 
• 4.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 460, sind in der Tabelle C5 dargestellt. Tabelle C5: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 460.

  Method	Accession	Domain	start	stop	E-value
  HMMSmart	SM00297	BROMO	371	480	6.00E–38
  HMMPanther	PTHR22880:SF6	HISTONE ACETYLTRANS-FERASE GCN5	128	476	3.20E–198
  HMMPanther	PTHR22880	FALZ-RELATED BROMODOMAIN-CONTAINING PROTEINS	1.28	476	3.2E–198
  FPrintScan	PR00503	BROMODOMAIN	393	406	3.90E–15
  FPrintScan	PR00503	BROMODOMAIN	407	423	3.90E–15
  FPrintScan	PR00503	BROMODOMAIN	442	461	3.90E–1.5
  superfamily	SSF47370	Bromodomain	352	481	8.10E–34
  superfamily	SSF55729	Acyl-CoA N-acyltransferases (Nat.)	150	297	2.10E–31
  Gene3D	G3DSA:3.40.630.30	no description	136	295	2.20E–68
  Gene3D	G3DSA:1.20.920.10	no description	354	478	5.50E–31
  HMMPfam	PF00583	Acetyltransf_1	186	262	7.80E–16
  HMMPfam	PF00439	Bromodomain	382	466	1.60E–35
  ScanRegExp	PS00633	BROMODOMAIN_1	395	453	NA
  ProfileScan	PS50014	BROMODOMAIN_2	390	461	20.724
  ProfileScan	PS51186	GNAT	143	290	17.291

• Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der für die Durchführung der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
• 5.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriafes Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 sind in der Tabelle D1 aufgeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2 kann es sich um das Zytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle D1: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 2. Abkürzungen: Len, Länge; cTP, chloroplastisches Transitpeptid; mTP, mitochondriales Transitpeptid, SP, Signalpeptid des sekretorischen Pfades, andere, andere subzelluläre Ziele, Loc, vorhergesagter Ort; RC, Verlässlichkeitsklasse; TPlen, vorhergesagte Transitpeptid länge.

  Name TPlen	Len	cTP	mTP	SP	andere	Loc	RC
  SEQ ID NR: 2 371	0,312	0,057	0,047	0,822	_	3	-
  Ausschlussbedingung	0,000	0,000	0,000	0,000

• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• 5.2. YRP5-Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten. Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• 5.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• 5.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• 5.5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universitat von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• 5.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
• Eine Anzahl von Parametern wird ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
• Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
• • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
• • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• • PSORT (URL: psort.org)
• • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
• Beispiel 6: Assay im Zusammenhang mit den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
• 6.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Die LDOX-Aktivität lässt sich entweder durch einen Immunassay oder durch die Quantifizierung von Produkten enzymatischer Reaktionen durch chromatographische und metabolomische Techniken wie von Pelletier et al. (1999) beschrieben messen. Ein enzymatischer Assay wird in Saito et al. (Plant J. 17, 181–189, 1999) beschrieben. Mit einem His-Tag oder einem MBP-Tag versehene LDOX-Proteine werden hergestellt und nach Standardvorschriften aufgereinigt. Assay auf enzymatische LDOX-Aktivität, Kurzbeschreibung:
  
  Bildung von Anthocyanidin. 100 μl Reaktionsmischung mit 20 mM K-Pi (pH 7,0), 200 mM NaCl, 10 mM Maltose, 5 mM DTT, 4 mM Natriumascorbat, 1 mM 2-Oxoglutarsäure, 0,4 mM FeSO₄, 1 mM Leucoanthocyanidin und aufgereinigtem LDOX-Protein werden über eine angemessene Zeitspanne bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 μl 36%iger HCl beendet, anschließend wird das gebildete Anthocyanidin (Pelargonidin oder Cyanidin) für die Analyse durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit 100 μl Isoamylalkohol extrahiert. Die HPLC erfolgt an einer YMC-ODS-A312-Säule (∅ 6 mm × 150 mm, YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan) unter Verwendung einer Mischung von Methanol/Essigsäure/Wasser (20:15:65) als Laufmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 1.0 ml min^–1 bei 40°C. Die Mengen an Pelargonidin und Cyanidin, die nach 5,5 min beziehungsweise 4,3 min eluieren, werden über ihre Peakfläche beim Aufzeichnen der Extinktion bei 520 nm bestimmt. Die Eichkurven für die quantitative Bestimmung wurden mit standardisierten Pelargonidin- und Cyanidinmaterialien erstellt. Standardisierte Anthocyanidinmaterialien werden hergestellt, indem man Leucopelargonidin und Leucocyanidin bei 95°C in n-Butanol mit 5%iger HCl 10 min hitzebehandelt.
  
  Freisetzung von ¹⁴CO₂:. Die Reaktionsmischung (100 μl) besteht aus 20 mM K-Pi (pH 7,0), 200 mM NaCl, 10 mM Maltose, 5 mM DTT, 4 mM Natriumascorbat, 1 mM [1–¹⁴C] 2-Oxoglutarsäure (1,85 GBq/mmol; 50 mCi mmol^–1) (Du Pont/NEN Research Products), 0,4 mM FeSO₄, 1 mM Leuccanthocyanidin und aufgereinigtem LDOX-Protein. Ein mit 20 μl Soluene-350 (0,5 M quaternäres Ammoniumhydroxid/Toluol, Packard) vollgesogener Papierfilter (Whatman 3 MM, 1 cm × 2 cm) wird zum Einfangen des freigesetzten ¹⁴CO₂ auf das Mikroröhrchen gelegt, das die Reaktionsmischung enthält. Nach Inkubation bei 30°C wird die Reaktion durch Zugabe von 1 μl 36%iger HCl gestoppt, und die Reaktionsmischung wird weitere 30 min belassen, damit die CO₂-Erzeugung vollständig ablaufen kann. Die Menge an ¹⁴C auf dem Filterpapier wird durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
• 6.2. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• S-Nitrosoglutathionreduktase-(GSNOR-)Aktivität wie in Rusterucci et al. Plant Physiol. 2007 März; 143(3): 1282–1292 beschrieben.
• Beispiel 7: Klonieren der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
• 7.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm04344 (SEQ ID NR: 182; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcagg cttcacaatgaacaagaacaagattgat-3' und prm04345 (SEQ ID NR: 183; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctttaagggaagaaataaaa g-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”Entry Clone”, pLDOX, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 1 umfassende ”Entry Clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”Entry Clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 184) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::LDOX (4) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.2. YRP5-Polypeptide
• Die Nukleinsäuresequenz wird durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wird mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die Primer schließen die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination ein. Das amplifizierte PCR-Fragment wird ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wird der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone” erhält. Das Plasmid pDONR201 wird von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 185 oder SEQ ID NR: 187 umfassende ”entry clone” wird dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthält als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 191) für die konstitutive spezifische Expression befindet sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wird der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::YRP5 (6) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.3. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um: prm (fwd) 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggatcgtgtggttggtg 3' (SEQ ID NR: 270) und prm (rev) 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaagccaagcctctcacttc 3' (SEQ ID NR: 271), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pCK1, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 194 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 272) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::CK1 (8) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.4. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Populus trichocarpa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um: prm (fwd) 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaaagagataagttgtttg-3' (SEQ ID NR: 409) und prm (rev) 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtagggactgtttattggttaat-3' (SEQ ID NR: 410), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pbHLH12-like, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 279 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 411) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::bHLH12-like (10) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.5. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei eine Saccharum-cDNA-Bibliothek (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm08126 (SEQ ID NR: 457; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcttcccccacc-3' und prm08127 (SEQ ID NR: 458; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgacatatatgcaaacg gctt-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pADH2, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 412 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein putativer Proteinaseinhibitorpromotor aus Reis (SEQ ID NR: 456) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pProteinase inhibitor::ADH2 (13) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.6. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Oryza sativa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm 10643 (SEQ ID NR: 515; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaa caatggacggcctcgcgg-3' und prm 10644 (SEQ ID NR: 516; revers, komplementär): 5'-gggg accactttgtacaagaaagctgggtaagtgactacccaatgcgccc-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pGCN5, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway^®-Technologie erworben.
• Der die SEQ ID NR: 459 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 513) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::GCN5 (16) gemäß im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• Auf die gleiche Weise wurde SEQ ID NR: 475 aus einer Populus trichocarpa-cDNA-Bibliothek cloniert, wobei die Primers prm12019: ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggacactcactctcactta (Vorwärts-Primer) und prm12020: ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaatattgatctcctaagaactg (reverser Primer) verwendet wurden, und für die Reistransformation in Agrobacterium LBA4044 eingeführt.
• Beispiel 8: Pflanzentransformation
• Transformation von Reis
• Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
• Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in einem flüssigen Cokultivierungsmedium in einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli wurden 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potenzial freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
• Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
• Beispiel 9: Transformation anderer Kulturpflanzen
• Transformation von Mais
• Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Weizen
• Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Sojabohne
• Sojabohne wird gemäß einer Modifikation der in der US-Patentschrift 5,164,310 von Texas A&M beschriebenen Methode transformiert. Mehrere kommerzielle Sojabohnensorten sind einer Transformation nach diesem Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Raps/Canola
• Kotyledonäre Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Alfalfa
• Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthaften.
• Transformation von Baumwolle
• Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Die Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und mit destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
• Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
• 10.1 Auswertungsansatz
• Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen wurden, werden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, und um die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung zu erfüllen.
• T1-Ereignisse wurden unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungskammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Trockenheits-Screen
• Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) werden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fällt der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht ist. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
• Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Salzstress-Screen
• Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Dann wurden samenbezogene Parameter gemessen.
• 10.2 Statistische Analyse: F-Test
• Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
• Wurden zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt, so wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
• 10.3 Gemessene Parameter
• Messung von biomassebezogenen Parametern
• Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungskammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
• Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
• Messungen von samenbezogenen Parametern
• Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (Harvest Index, HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor von 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samenfüllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein%-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
• Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
• 11.1. Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptide
• Die Pflanzen wurden in der T1-Generation untersucht. Im Folgenden finden sich die Ergebnisse der Untersuchung von LDOX-Nukleinsäure unter Stickstoffmangelbedingungen exprimierenden transgenen Reispflanzen. Es wurden Zunahmen bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), der Jungpflanzenvitalität (EmerVigor), der Wurzelbiomasse (RootMax und RootThickMax), der Gesamtanzahl an Samen, der Anzahl erster Rispen und dem Tausendkerngewicht (Table E1) beobachtet. Tabelle E1: Zusammenfassung der Daten von transgenen Reispflanzen; für jeden Parameter ist die prozentuale Gesamtzunahme für die T1-Generation gezeigt, für jeden Parameter liegt der p-Wert bei < 0,05.

  Parameter	Gesamtzunahme
  AreaMax	8,1
  EmerVigor	11,6
  RootMax	6,2
  nrtotalseed	39,4
  TKW	17,2
  firstpan	80,6
  RootThickMax	13,9

• 11.2. Caseinkinase-Typ-I-(CK1-)Polypeptide
• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 194 unter den oben im Screen der Stickstoffverwendungsefizienz beschriebenen Stickstoffmangelbedingungen exprimieren, sind unten angeführt (Tabelle E2). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Tabelle E2.

  Ertragsmerkmal	% Zunahme bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
  TKW	4%
  GravityYMax	8,2%

• Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen im Screen der Stickstoffverwendungseffizienz zeigten eine Zunahme bei Tausenkerngewicht (TKW) und beim Schwerpunkt (GravityYMax), was mit einer Zunahme bei der Samengröße und dem Samengewicht und einer Veränderung bei der Gestalt der Krone der Pflanze korreliert, so dass die Pflanzenhöhe und/oder der Blattwinkel in einer solchen Weise verändert sind, dass der Schwerpunkt der Krone höher liegt.
• 11.3. Basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-(bHLH12-ähnliche) Polypeptide Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen pGOS2::bHLH12-like (SEQ ID NR: 280)
• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 279 unter den oben im Screen der Stickstoffverwendungseffizienz beschriebenen Stickstoffmangelbedingungen exprimieren, sind unten angeführt (Tabelle E3a). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Tabelle E3a:

  Ertragsmerkmal	% Zunahme in transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
  TKW	4%
  GravityYMax	8,2%

• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen im Screen der Stickstoffverwendungseffzienz zeigten eine Zunahme bei Tausenkerngewicht (TKW) und beim Schwerpunkt (GravityYMax), was mit einer Zunahme bei der Samengröße und dem Samengewicht und einer Veränderung bei der Gestalt der Krone der Pflanze korreliert, so dass die Pflanzenhöhe und/oder der Blattwinkel in einer solchen Weise verändert sind, dass der Schwerpunkt der Krone höher liegt.
• Phänotypische Untersuchung der transgenen Pflanzen PGOS2::pGOS2::bHLH12-like (SEQ ID NR: 395)
• Transgene Reispflanzen der T1-Generation werden wie oben beschrieben durch Transformation eines genetischen Konstrukts, das den GOS2-Promotor funktionell verbunden mit dem längsten offenen Leserahmen in SEQ ID NR: 395 unter den oben im Screen der Stickstoffverwendungseffzienz beschriebenen Stickstoffmangelbedingungen exprimieren, erzeugt. Der längste offene Leserahmen in SEQ ID NR: 395 wird durch PCR gemäß dem Protokoll der Beispiele oben isoliert, wobei man die unten angeführten Primer verwendet:
  fwd primer: ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaatgagaaggacgcca
  rev primer: ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttgcttcagttgtggaatca
• Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen im Screen der Stickstoffverwendungseffizienz zeigen, dass die transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
• Phänotypische Untersuchung der transgenen Pflanzen PGOS2::pGOS2::bHLH12-like (SEQ ID NR: 399)
• Transgene Reispflanzen wurden wie oben beschrieben erzeugt, indem man ein genetisches Konstrukt transformierte, das den GOS2-Promotor funktionell verbunden mit dem längsten offenen Leserahmen in SEQ ID NR: 399 enthielt, welcher durch PCR gemäß dem Protokoll der Beispiele oben isoliert wurde, wobei man die unten angeführten Primer verwendete:
  fwd primer: ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgaatctctcttctgat
  rev primer: ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaaacaaaagtcaaagggtcc
• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, die unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden, zeigen, dass die transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen; siehe Tabelle E3b: Tabelle E3b:

  Ertragsmerkmal	% Zunahme im Vergleich zu Kontrollpflanzen
  totalwgseeds	29,8
  fillrate	30,7
  harvestindex	26,7
  nrfilledseed	27,4
  HeightMax	5,1
  GravityYMax	6,3

• Phänotypische Untersuchung der transgenen Pflanzen PGOS2::pGOS2::bHLH12-like (SEQ ID NR: 391)
• Transgene Reispflanzen der T1-Generation wurden wie oben beschrieben durch Transformation eines genetischen Konstrukts, das den GOS2-Promotor funktionell verbunden mit dem längsten offenen Leserahmen in SEQ ID NR: 391 unter den oben im Screen der Stickstoffverwendungseffizienz beschriebenen Stickstoffmangelbedingungen exprimieren, erzeugt. Der längste offene Leserahmen in SEQ ID NR: 391 wird durch PCR gemäß dem Protokoll der Beispiele oben isoliert, wobei man die unten angeführten Primer verwendete:
  fwd primer: ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaatgagaaggacgcca
  rev primer: ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttgcttcagttgtggaatca
• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen im Screen der Stickstoffverwendungseffzienz zeigen, dass die transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufwiesen; insbesondere wurde eine Zunahme bei der AreaMax (Biomasse, 3 positive Linen mit einer mehr als 5%igen Zunahme), beim TKW (2 positive Linen mit einer Zunahme von 5% oder mehr) und bei der HeightMax (Höhe der Pflanze, 2 positive Linen mit einer Zunahme von 5% oder mehr) beobachtet.
• 11.4. Alkoholdehydrogenase-(ADH2-)Polypeptide
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 412 unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten gezeigt. Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele.
• Im Vergleich zu Kontrollpflanzen wurde bei den folgenden Parametern eine Zunahme beobachtet: Gesamtsamengewicht, Anzahl an Blüten pro Rispe, Füllrate, Wurzelbiomasse, Höhe der Pflanze und Tausendkerngewicht (TKW).
• 11.5. GCN5-ähnliche Polypeptide
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 459 unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten gezeigt.
• Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen unter Nichtstressbedingungen sind unten gezeigt (Tabelle E4). Eine Zunahme von (mindestens – mehr als) 5% wurde bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), dem Gesamtsamenertrag (Gesamtgewicht an Samen), der Anzahl gefüllter Samen, der Füllrate, der Anzahl an Blüten pro Rispe, dem Ernteindex, der Zeit bis zum Blühen (TimetoFlower), der Gesamtanzahl an Samen pro Pflanze (nrtotalseed), dem Schwerpunkt der Krone (GravityYMax) und dem Anteil der dicken Wurzel am Wurzelsystem (RootThickMax) beobachtet. Tabelle E4: Nichtstressbedingungen

  Parameter	Gesamt
  AreaMax	9,7
  TimetoFlower	6,4
  totalwgseeds	14,2
  nrtotalseed	8,0
  fillrate	5,0
  harvestindex	5,3
  nrfilledseed	12,7
  flowerperpan	7,7
  GravityYMax	5,6
  RootThickMax	8,2

• Für alle Parameter ist der prozentuale Gesamtanteil gezeigt, wenn der Wert p ≤ 0:05 erreicht und über der 5%-Schwelle liegt.
• Mit SEQ ID NR: 475 transformierte Reispflanzen wurden unter Nichtstressbedingungen herangezogen und zeigten einen erhöhten Ertrag (erhöhten Samenertrag sowie erhöhte Biomasse, insbesondere erhöhte Wurzelbiomasse); Details finden sich in Tabelle E5. Tabelle E5: Durchschnittliche Ertragszunahme bei den vier besten Linien von insgesamt 6 getesteten Linien:

  	Durchschnittliche prozentuale Zunahme
  Gesamtsamengewicht	12,8%
  Gesamtanzahl an Samen	12,8%
  Anzahl an Blüten pro Rispe	12,1%
  Anzahl an gefüllten Samen	16,2%
  Root max	11,4%

  Xxh794686ende_PF62101_PCT – sequences SEQUENZLISTE

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

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• Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (127)

1. Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die für ein Leucoanthocyanidindioxygenase-(LDOX-)Polypeptid codiert, wobei das LDOX-Polypeptid eine Isopenicillin-N-Synthasedomäne (PRINTS-Eintrag PR00682) und eine 2OG-Fe(II)-Oxygenasedomäne (PFAM-Eintrag PF03171) umfasst.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das LDOX-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 1 bis 9 (SEQ ID NR: 173 bis SEQ ID NR: 181) umfasst.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die für ein LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale eine erhöhte Jungpflanzenvitalität und einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die für ein LDOX-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, umfasst.
11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
12. Konstrukt gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 11 oder 12 transformiert ist.
15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
16. Transgene Pflanze mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
17. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Wurzelbiomasse und/oder Samen sind.
19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 18 abgeleitet sind.
20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein LDOX-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
21. Verfahren zur Steigerung der Toleranz von Pflanzen gegenüber abiotischem Stress, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure moduliert, die für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 186 oder SEQ ID NR: 188 oder eines Orthologs oder Paralogs von einem der beiden codiert.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein YRP2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 22, wobei die für ein YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A2 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A2 angegebenen Proteine codiert.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die für ein YRP5-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus Populus trichocarpa oder Arabidopsis thaliana stammt.
27. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, umfasst.
28. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 21 oder 22 definiertes YRP5-Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
29. Konstrukt gemäß Anspruch 28, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
30. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 28 oder 29 in einem Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit erhöhter Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
31. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 28 oder 29 transformiert ist.
32. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhter Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche abiotischen Stress fördern.
33. Transgene Pflanze mit Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
34. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 27, 31 oder 33, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
35. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 34, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
36. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 34 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 35 abgeleitet sind.
37. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein YRP5-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung der Toleranz gegenüber abiotischem Stress, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
38. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein Caseinkinase-1-, CK1-, Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
39. Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei das CK1-Polypeptid ein Proteinmotiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem der folgenden Motive umfasst; (i) Motiv 13: KANQVY(IV)ID(YF)GLAKKYRDLQTH(KR)HIPYRENKNLTGTARYASVNTHLG(VI)EQ (SEQ ID NR: 276), (ii) Motiv 14: CKSYPSEF(VTI)SYFHYCRSLRFEDKPDYSYLKRLFRDLFIREGYQFDYVFDW (SEQ ID NR: 277), (iii) Motiv 15: PSLEDLFNYC(NS)RK(FL)(ST)LKTVLMLADQ(LM)INRVEYMHSRGFLHRDIKPDNFLM (SEQ ID NR: 278) wobei Aminosäurereste in Klammern für alternative Aminosäuren in dieser Position stehen.
40. Verfahren gemäß Anspruch 38 oder 39, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 40, wobei die für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 41, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 42, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
44. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 43, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 43, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
46. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 40 bis 45, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
47. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 46, wobei die für ein CK1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
48. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 38 bis 47, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, umfasst.
49. Konstrukt, umfassend: i. Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 38 oder 39 definiert; ii. eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls iii. eine Transkriptionsterminationsequenz.
50. Konstrukt gemäß Anspruch 49, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
51. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 49 oder 50 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
52. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 49 oder 50 transformiert ist.
53. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 38 oder 39 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
54. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 38 oder 39 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
55. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 48, 52 oder 54, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
56. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 55, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
57. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 55 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 56 abgeleitet sind.
58. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein CK1-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
59. Isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 210, 212, 216, 220, 228 und 268; (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A3, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) eine Nukleinsäure, die für ein Calreticulin-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
60. Isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 211, 213, 217, 221, 229 und 269 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A3, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
61. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein basische Helix-Schleife-Helix-Gruppe-12-ähnliches (bHLH12-ähnliches) Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
62. Verfahren gemäß Punkt 61, wobei das bHLH12-ähnliche Polypeptid ein Proteinmotiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem der Motive 16 bis 19 (SEQ ID NR: 404 bis 407) umfasst.
63. Verfahren gemäß Anspruch 61 oder 62, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
64. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 63, wobei die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A4 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
65. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 64, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A4 angegebenen Proteine codiert.
66. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 65, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
67. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 66, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
68. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 66, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
69. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 63 bis 68, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
70. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 69, wobei die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
71. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 70, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, umfasst.
72. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 61 oder 62 definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
73. Konstrukt gemäß Anspruch 72, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
74. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 72 oder 73 in einem Verfahren zur Herstellung vor Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
75. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 72 oder 73 transformiert ist.
76. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 61 oder 62 definiertes bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
77. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, wie in Anspruch 61 oder 62 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
78. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 71, 75 oder 77, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
79. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 78, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
80. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 78 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 79 abgeleitet sind.
81. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
82. Isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 279 und 335; (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A4, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) eine Nukleinsäure, die für ein bHLH12-ähnliches Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58% 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
83. Isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 280 und 336 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A4 codiert, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
84. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das ADH2-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) GROES-Domäne (Domäne 1): AGEVRVKILFTALCHTDHYTWSGKDPEGLFPCILGHEAAGVVESVGEGVTEVQPGDHVIPCYQAECKECKFCKSGKTNLCGKVRGATGVGVMMNDMKSRFSVNGKPIYHFTGTSTFSQYTVVHDVSVAKI, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 1; und (ii) Domäne der zinkbindenden Dehydrogenase (Domäne 2): AGSIVAVFGLGTVGLAVAEGA KAAGASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVNPKDHDKPIQQVLVDLTDGGVDYSFECIGNVSVMRAALECCHKDWGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGFKSRTQVPWLVD, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 2; und (iii) DUF61-Domäne (Domäne 3): VDKYMNKEVK, oder eine Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, wenigstens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zur Domäne 3.
85. Verfahren nach Anspruch 84, wobei das ADH2-Polypeptid ein oder mehrere der Motive 20 bis 30 oder ein Motiv mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Domäne III einer der Motive 20 bis 30 umfasst: Motiv 20: HYTWSGKDP (SEQ ID NR: 445); Motiv 21: PCYQAECK (SEQ ID NR: 446); Motiv 22: GKTNLCGKVRGATGVGVMMND (SEQ ID NR: 447); Motiv 23: YHFMGTSTFSQYTVVHDVSVAKINPQAPLDKVCLLGCGVPTGLG (SEQ ID NR: 448); Motiv 24: WNTAKVEAGSIVAVFGLGTVGLAVAEG (SEQ ID NR: 449); Motiv 25: GASRIIGIDIDNKKFDVAKNFGVTEFVN (SEQ ID NR 450); Motiv 26: KDHDKPIQLVLVDIAD (SEQ ID NR: 451); Motiv 27: SVRRAAEEC (SEQ ID NR 452); Motiv 28: WGTSVIVGVAASGQEIATRPFQLVTGRVWKGTAFGGF (SEQ ID NR 453); Motiv 29: KVDEYITH (SEQ ID NR: 454); Motiv 30: MLKGESIRCIITM (SEQ ID NR: 455).
86. Verfahren gemäß Anspruch 84 oder 85, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ES43-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
87. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 86, wobei die für ein ADH2-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A5 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
88. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 87, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A5 angegebenen Proteine codiert.
89. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 88, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
90. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 89, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
91. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 86 bis 90, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem samenspezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem putativen Proteinaseinhibitorpromotor aus Reis, verbunden ist.
92. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 91, wobei die Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Gattung Saccharum, am meisten bevorzugt aus Saccharum officinarum.
93. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 84 bis 92, wobei die Pflanze oder der Tel davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, umfasst.
94. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 84 oder 85 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
95. Konstrukt gemäß Anspruch 94, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise einen putativen Proteinaseinhibitorpromotor, ganz besonders bevorzugt einen putativen Proteinaseinhibitorpromotor aus Reis handelt.
96. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 94 oder 95 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
97. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 94 oder 95 transformiert ist.
98. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 84 oder 85 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
99. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ADH2-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 84 oder 85 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
100. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 93, 97 oder 99, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
101. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 100, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
102. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 100 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 101 abgeleitet sind.
103. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 84 oder 85 definiertes ADH2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
104. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das Polypeptid zwei Domänen mit den PFam-Zugangsnummern PF00583 und PF00439 umfasst:
105. Verfahren gemäß Anspruch 104, wobei das GCN5-Polypeptid auch die folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 31: LKF[VL]C[YL]SNDGVD[EQ]HM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[ST]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 501), (ii) Motiv 32: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HY]ARD[AV]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 502), (iii) Motiv 33: H[AP]DAWPFKEPVD[SA]RDVPDYYDIIKDP[IM]DLKT[MI]S[KR]RV[ED]SEQYYVTLEMFVA (SEQ ID NR: 503).
106. Verfahren gemäß Anspruch 104 oder 105, wobei das GCN5-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 34: LKF[LV]C[YL]SNDG[VI]DEHM[IV]WL[IV]GLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDR[TS]HKS[MV]M (SEQ ID NR: 504), (ii) Motiv 35: FGEIAFCAITADEQVKGYGTRLMNHLKQHARD[AVM]DGLTHFLTYADNNAVGY (SEQ ID NR: 505), (iii) Motiv 36: KQGFTKEI[THY][LF][DE]K[ED]RW[QH]GYIKDYDGGILMECKID[PQ]KLPY[TV]DL[AS]TMIRRQRQ (SEQ ID NR: 506).
107. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 106, wobei das GCN5-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 37: LKFVC[LY]SND[GDS][VI]DEHM[VM][WCR]LIGLKNIFARQLPNMPKEYIVRL[VL]MDR[SGK]HKSVM (SEQ ID NR: 507), (ii) Motiv 38: CAITADEQVKGYGTRLMNHLKQ[HFY]ARD[MV]DGLTHFLTYADNNAVGYF[IV]KQGF (SEQ ID NR: 508), (iii) Motiv 39: W[QH]G[YF]IKDYDGG[IL]LMECKID[PQ]KL[PS]YTDLS[TS]MIR[RQ]QR[QK]AIDE[KR]IRELSNC[HQ][IN] (SEQ ID NR: 509).
108. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 107, wobei das GCN5-Polypeptid auch ein oder mehrere der folgenden Motive umfassen kann: (i) Motiv 40: FLCYSNDGVDEHMIWLVGLKNIFARQLPNMPKEYIVRLVMDRTHKSMMVI (SEQ ID NR: 510), (ii) Motiv 41: MNHLKQHARDADGLTHFLTYADNNAVGY[FL]VKQGFTKEIT[LF]DKE RWQGYIK (SEQ ID NR: 511), (iii) Motiv 42: IR[ED]LSNCHIVY[SP]GIDFQKKEAGIPRR[LT][MI]KPEDI[PQ]GLREAGWTPDQ[WL]GHSK (SEQ ID NR: 512).
109. Verfahren gemäß Anspruch 104 oder 105, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein wie in einem der vorherigen Ansprüche definiertes GCN5-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
110. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 109, wobei die für ein GCN5-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A6 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
111. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 110, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A6 angegebenen Proteine codiert.
112. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 111, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
113. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 112, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
114. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 112, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestressbedingungen, Salzstressbedingungen oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
115. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 109 bis 111, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
116. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 115, wobei die für ein GCN5-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
117. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 104 bis 116, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, umfasst.
118. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 104 bis 108 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
119. Konstrukt gemäß Anspruch 118, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
120. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 118 oder 119 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
121. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 118 oder 119 transformiert ist.
122. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 104 bis 108 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
123. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 104 bis 108 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
124. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 121, 122 oder 123, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer ist.
125. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 124, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
126. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 124 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 125 abgeleitet sind.
127. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein GCN5-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

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