WO2013077419A1 - 植物体の子実増大機能を有する遺伝子及びその利用 - Google Patents

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基行 芦苅
献軍 宋
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present specification relates to DNA that can increase the grain of a plant body and the use thereof, and more particularly to a method for producing a plant body using the DNA, a method for producing seeds of a plant body, and the like.
  • the genetic characteristics of rice cultivars are determined by the sum of various mutant loci.
  • a locus that has an additive effect on a specific trait is called a quantitative trait locus (QTL). Therefore, it can be said that the genetic characteristic that a certain variety has a large seed size and seed weight is also determined by the quantitative trait locus.
  • QTL quantitative trait locus
  • Non-patent Document 1 Other gene regions that contribute to grain size have been found (Non-patent Document 1). In addition, a gene related to root elongation has been identified (Patent Document 3).
  • JP 2007-49994 A JP 2010-115176 A International Publication WO / 2007/011681
  • Non-Patent Document 1 no gene is identified. Moreover, it cannot be said that the gene disclosed in Patent Document 3 is related to an increase in grain or biomass.
  • a gene having a function of increasing the grain of a plant body is isolated and identified, and the gene is used.
  • the present inventors attempted QTL analysis combined with positional cloning in order to isolate and identify a gene that controls increase in grain size or mass in rice, which is a typical cereal species.
  • the present inventors were able to newly isolate and identify genes that control seed size and the like. It was found that expression of this gene tends to increase seed size or weight.
  • the identified gene was introduced into varieties other than the species, and the protein encoded by the gene was expressed to obtain a plant that acquired the function of increasing seed size or mass. According to the disclosure of the present specification, the following means are provided based on these findings.
  • DNA encodes a protein having a function of increasing the grain of a plant body; (A) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; (B) DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • the transformed plant cell according to (5) which is rice, wheat, barley, oat, corn, pearl barley, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet or sugar cane (7)
  • a transformed plant comprising the transformed cell according to any one of (4) to (6).
  • (8) The transformed plant according to (7), wherein the expression of the protein encoded by the DNA is enhanced.
  • the plant according to (7) or (8) which is provided with a grain increasing function.
  • (11) A transformed plant which is a descendant or clone of the transformed plant according to any one of (7) to (10).
  • A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • C DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; and (d) one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • E DNA having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • F DNA encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • C DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; and (d) one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • E DNA having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • F DNA encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the first parent plant is represented by SEQ ID NO: 7, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 so that any one of the DNAs of (a) to (f) can be operated.
  • a plant comprising a promoter composed of any DNA selected from the group consisting of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to SEQ ID NO: 7, Method.
  • the production method according to (18) or (19), wherein the production step further includes selecting the new variety using the gene marker according to (15).
  • (21) A method for producing seeds of the plant comprising the step of cultivating the plant according to any one of (7) to (11), (16) and (17).
  • (22) a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7, a DNA having a base sequence having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 From a group consisting of DNA having a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted and / or added, and DNA which hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to SEQ ID NO: 7 A promoter comprising any selected DNA, which has an activity of enhancing expression of a protein encoded by the following DNA.
  • A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
  • B DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
  • C a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • E DNA DNA having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • F DNA encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • FIG. It is a figure (with a wrinkle) which shows the result of having compared the seed weight of 1000 seeds using SL29, Nipponbare, and Kasalath. It is a figure (there is no wrinkle) which shows the result of having compared the thousand grain weight of the seed using SL29, Nipponbare, and Kasalath.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the positional cloning about the 6th chromosome of Kasalath. It is a figure which shows the result of having evaluated the grain length of the seed of a transformed plant body. It is a figure which shows the characteristic of GW6a gene in Nipponbare and Kasalath. In the figure, (1) indicates a UTR region, and (2) indicates a region including an exon.
  • Gm Glycine max (soybean), Pt is seven of Populus trichocarpa (black boxwood), LOC is rice, Bd is Brachypodium distachyon (purple false brome), Sb is Sorghum bicolor (sorghum) Hv is Hordeum vulgare (barley), At Is Arabidopsis thaliana, Vv is Vitis vinifera (grape), Mt is Medicago truncatula (barrel clover), Rc is Ricinus communis (corn bean), Zm is Zea mays (corn), Pp is Physcomitrella patens (rapeseed), Selaginella moellendorffii (spikemoss), Bn represents Brassica napus (moss).
  • Arabidopsis It is a figure which shows the foreign gene structure introduce
  • GW6a gene transcript ((2); region containing exon) in semi-quantitative RT-PCR in transgenic plants overexpressing the GW6a allele of Nipponbare and Kasalas and transgenic plants introduced with antisense to the GW6a gene (A) showing an increase in the number of endogenous GW6a gene transcripts by the GW6a primer set corresponding to the UTR-containing region (1) in a transgenic plant introduced with antisense to the GW6a gene.
  • the figure showing an increase in the GW6 transcript (2) (exon-containing region) (B) and the amount of the endogenous GW6a gene transcript by the GW6a primer set in the transgenic plant introduced with antisense to the GW6a gene It is a figure (C) which shows fall of.
  • FIG. 1 figure showing fruit (B), and GW6a allele of Nipponbare and Kasalath, showing the result of 1000 grain weight of transgenic Arabidopsis plants overexpressing the GW6a allele of Nipponbare and Kasaras (C) shows an increase in GW6a transcripts in transgenic Arabidopsis plants overexpressing It is a figure which shows the result by the Western blot of the in-vitroHAT assay of Nipponbare and Kasalath HIS-GW6a using the antibody with respect to acetylated histone 3.
  • FIG. 1 figure showing fruit (B), and GW6a allele of Nipponbare and Kasalath
  • FIG. It is a figure which shows the result by the western blotting of the in-vitroHAT assay of Nipponbare and Kasalath HIS-GW6a using the antibody with respect to acetylated histone 4.
  • FIG. It is a figure which shows the result of having detected acH3 strongly with the increase in HIS-GW6a protein concentration. It is a figure which shows the result of having detected acH4 strongly with the increase in HIS-GW6a protein concentration. It is a figure which shows the result of having extracted total protein from about 1 cm long-stem tissue including the shoot apical meristem (CS tissue) of NILS in two NILS, and detecting acH3 using Western blotting.
  • CS tissue shoot apical meristem
  • the disclosure of the present specification relates to a DNA (gene) encoding a protein related to an increase in the grain of a plant body and the use thereof.
  • the disclosure of the present specification is based on the fact that the present inventors succeeded in newly isolating and identifying a gene that contributes to an increase in grain yield, and as a result, an increase in grain yield.
  • the inventors of the present invention focused on the Indian rice “kasarath”. “Casaras” has a longer grain length than Japanese rice “Nipponbare”, but has a characteristic that the weight of 1000 grains is about 30 to 40% less in both rice bran and brown rice. The inventors focused on the fruit length of “Casalas” and tried to isolate the gene involved in the growth of the fruit by combining with “Nippon Hare”, which has a large fruit circumference, and succeeded in finding it. .
  • the present inventors have a function of increasing grain by expressing a gene newly identified from “Kasalath”. That is, the grain size can be increased and the grain size can be increased.
  • This gene is particularly useful in the agricultural field, the energy field using biomass as a raw material, and the chemical industry field.
  • an increase in grain or its mass can increase the yield of grains of plants such as cereals.
  • this gene has a function of increasing biomass. That is, not only the fruit but also the yield of biomass (the above-ground part excluding the rhizome part of the plant body) can be increased. This gene can also have a function of increasing plant height.
  • this gene also has a function of increasing the amount (concentration) of carbohydrate in the seed of the plant body.
  • This gene is advantageous in terms of food supply and breeding because the carbohydrate content increasing function is provided in combination with the grain increasing function.
  • this gene also has a function of reducing the oil content (concentration) of plant seeds. This means that this gene is advantageous for improving storage stability, such as improved oxidation resistance. This also means that this gene is advantageous from a nutritional point of view (reduction of oil intake).
  • this gene is often not relatively retained in japonica species than in indica species in gramineous plants. Therefore, it can be said that this gene is advantageous for improving the traits of Japonica species Gramineae.
  • this gene maintains the taste of its fruit while having the various functions described above. Therefore, it can be said that the gene is more suitable for food supply.
  • a DNA encoding a protein having an activity of increasing grain of a plant body (hereinafter also simply referred to as GW6a protein or this protein) (hereinafter also simply referred to as GW6a gene or this gene) has the following (a) to ( It has the DNA represented by f).
  • A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
  • B DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
  • C DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3;
  • D DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
  • E a DNA having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; and
  • f an amino acid having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the cDNA of the GW6a gene of Indian rice “Kasalath”, and SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the protein encoded by this gene.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the cDNA of the GW6a gene of Japanese rice “Nipponbare”, and SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of the protein encoded by this gene.
  • the GW6a gene was newly identified by the present inventors as a gene related to 1000 seed weights by QTL analysis and positional cloning of seed seeds using Indian rice "Kasalath". To date, there has been no report on the function of the protein encoded by the GW6a gene.
  • the Kasalath GW6a gene was found to be present in a region of about 4 kb in 11 CMs near the long arm 100 cM of chromosome 6 of the Indian rice "Kasalath".
  • a gene highly homologous to the GW6a gene of the Indian rice "Kasalath” exists on the same chromosome position of the Japanese rice "Nippon Hare”.
  • the protein encoded by the homologous gene in the Japanese rice “Nipponbare” differs from the GW6a gene of Kasalath by 4 amino acids.
  • the seed includes plant seeds, fruits, and spikelets.
  • the increase in grain means that the grain weight of the grain increases.
  • the increase in grain may include an increase in grain length.
  • having a grain-increasing activity means a plant body in which this gene is not expressed or a plant body in which this gene is not enhanced (for example, a parent plant such as a plant not transformed by this gene).
  • Body (Nipponbare etc.)) and the progeny of the progeny plant obtained by cultivating the progeny plant whose gene is enhanced in the parent plant under the same cultivation conditions preferably 10% More preferably, it means 15%, more preferably 20% or more, more preferably 25% or more, and still more preferably 30% or more, relative to the grain of the parent plant body.
  • Mean that the average value of 50 grains randomly extracted from the above is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, still more preferably 15% or more, and even more preferably 20% or more. Good.
  • the GW6a gene since the GW6a gene is thought to exist widely in plants including cereal plants, this gene includes homologous genes present in various plants.
  • the “homologous gene” means a gene encoding a protein functionally equivalent to the GW6a protein in various plants. Examples of such proteins include, but are not limited to, the following mutants, alleles, variants, homologs, partial peptides of the protein, or fusion proteins with other proteins.
  • the plant body is not particularly limited, and may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
  • monocotyledonous plants include rice, wheat, barley, oats, oats, corn, sorghum, facility ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, millet, sugarcane and the like.
  • a rice can be mentioned more preferably.
  • Wheat and barley are also preferred.
  • sorghum and corn are also preferable.
  • dicotyledonous plants include Lamiaceae plants such as sesame and lavender, Sesame plants such as sesame, Asteraceae plants such as sunflower and safflower, Brassicaceae plants such as rapeseed, Flaxaceae plants such as flax, Kenaf, Cotton Mushrooms such as cacao (sometimes classified as Aegiriaceae), cucurbitaceae plants such as pumpkin, soybean, azuki bean, kidney bean, lima bean, pea, red bean, broad bean, cowpea, chickpea, mung bean, lentil, Legumes such as locust bean, cluster bean, jujube, bean, peanut, rose family such as almond, urchinaceae such as cashew and pistachio, birch plant such as hazel, corn beetle such as macadamia, beech such as chestnut Family plants and the like.
  • Lamiaceae plants such as sesame and lavender
  • Sesame plants such as ses
  • Examples include legumes such as soybean and clover, and cruciferous plants such as rapeseed. In addition, willow plants such as poplar are also included. There are also flaxaceae plants such as spike moss. In addition, the plants shown in FIG. 10 and the plants included in the family and genus to which the plants belong are exemplified.
  • the gene is not particularly limited as long as it can encode the protein having the grain increasing function of the present invention, and the gene includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, etc. in addition to cDNA. Moreover, if this gene codes this protein mentioned later, DNA which has the arbitrary base sequences based on the degeneracy of a genetic code will be contained.
  • Protein having a function of increasing grain of plant As an aspect of this protein, it is a protein encoded by the DNA of any one of the above (a) to (f) and having a grain increasing function. That is, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 or a protein having a certain relationship with these proteins.
  • One aspect of the present protein is a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, A protein having a function may be mentioned.
  • the other protein is a variant or a variant of the one protein.
  • the protein encoded by the Kasalath GW6a gene represented by SEQ ID NO: 2 can be said to be a mutant having four substitution mutations of S72G, V270M, G304C and A337E in the amino acid sequence of the Nipponbare GW6a gene represented by SEQ ID NO: 4. These substitution mutations include substitution of A at position 214 with G, substitution of position G with A at position 808, and substitution of position G with T at position 910 in the base sequence of the Nipponbare GW6a gene represented by SEQ ID NO: 3. , Substitution of T to C at position 912 and substitution of C to A at position 1010.
  • these mutations may or may not be included.
  • SEQ ID NO: 1 When a variant is obtained by modifying the amino acid sequence of the protein represented by SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence encoding it, SEQ ID NO: 1, these mutations may or may not be conserved. May be. That is, amino acid substitution, deletion, insertion and / or addition may be performed at sites other than these amino acid substitution mutations, and mutations such as amino acid substitutions may be provided at these amino acid substitution sites. .
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, more preferably within 10 amino acids, still more preferably within 5 amino acids, and even more preferably within 3 amino acids. It is.
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid whose amino acid side chain properties are conserved (this is known as a conservative amino acid substitution).
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) can be broadly classified.
  • an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, Y), containing a sulfur atom
  • Amino acids with side chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side Amino acids can also be classified such as amino acids having chains (H, F, Y, W).
  • mutational matrix (Taylor 1986, J, Theor. Biol. 119, 205-218; Sambrook, J.
  • Another aspect of the present protein is a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, wherein the parent protein (Kasalath or Nipponbare) GW6a protein) and functionally equivalent proteins.
  • DNA is typically at least 50% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more of the entire base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid-encoding sequence. More preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is.
  • another embodiment of the present protein is a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and comprising a parent protein (Kasalath or Nipponbare GW6a Protein) and functionally equivalent proteins.
  • the identity is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and even more preferably. Is 95% or more, still more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more.
  • “functionally equivalent” means that the target protein has the same biological function or biochemical function as the parent protein (Casalas or Nipponbare GW6a protein).
  • the biological function and biochemical function of the parent protein include a function of increasing fruit bodies such as seeds of plants including cereal plants.
  • the function which increases the biomass of a plant body or the height of a plant body may be sufficient.
  • the GW6a gene nucleotide sequence for example, DNA represented by SEQ ID NO: 1 or 3 or a part thereof as a probe, or using a DNA having a complementary nucleotide sequence as a probe
  • the GW6a gene Isolation of a homologous gene of a parent gene (Casalas or Nipponbare GW6a gene) from various plants using an oligonucleotide that specifically hybridizes to a primer as a primer is usually possible.
  • a hybridization reaction is usually performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions For example, pretreatment overnight at 42 ° C. in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 ⁇ SSC, 50 mM Hepes® pH 7.0, 10 ⁇ Denhardt's solution, 20 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA. After hybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating overnight at 42 ° C.
  • the cleaning solution and temperature conditions for the subsequent cleaning are about ⁇ 1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C '', more severe conditions are about ⁇ 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C '', and more severe conditions are ⁇ 0.2xSSC , 0.1% SDS, 65 ° C. ”.
  • isolation of DNA having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing hybridization are more severe.
  • combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
  • the identity of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97) in the entire amino acid sequence. %, 98%, 99% or more). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul.
  • the vector disclosed herein can contain the DNA.
  • the present vector can be an expression vector containing elements for enhancing the expression of the present DNA in plant cells. This vector is intended to introduce this DNA as exogenous DNA and, as a result, enhance the expression of this gene regardless of the presence or absence of the endogenous gene on the chromosome in the host cell (plant cell). can do.
  • a vector containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a DNA of another aspect of the DNA is driven by a promoter that enhances the expression of the DNA, specifically, an expression level. It is preferably operably linked to the downstream region of the promoter.
  • a vector containing the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a DNA of another aspect of the DNA may enhance the expression of the DNA, specifically increase the expression level. It is preferably linked to the downstream region of the promoter in a controllable manner by the promoter.
  • the present vector may be intended to enhance the expression of the present DNA at a site where the present DNA exists on a chromosome in a plant cell by homologous recombination or the like.
  • the Kasalath GW6a gene promoter can enhance the expression of the Kasalath GW6a gene downstream of Kasalath more than, for example, Nipponbare's GW6a promoter. Accordingly, the Kasalas GW6aq gene promoter and the promoters of the other embodiments described below can be used as promoters of the present vector.
  • the promoter of the Kasalath GW6a gene is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the sequence of the Nipponbare GW6a gene promoter is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the following mutations existed between these promoters: .
  • the following mutations represent mutations in the Kasalas GW6a promoter sequence relative to the Nipponbare GW6a promoter sequence (FIG. 19B).
  • a preferred promoter is considered to maintain the mutation of (13) below. It is also preferable to have the following mutations (3) to (16). Alternatively or in addition, it is also preferable to maintain the following mutations (1) and / or (2), or in addition to these, the following mutations (17) and / or (18) are maintained. It is also preferable. It is preferable to maintain all of the following mutations (2) to (18). There is also a substitution mutation from A to G at position -1678, a substitution mutation from A to T at position -1664, and a substitution mutation from A to G at position -1631.
  • the Kasalas GW6a promoter further has a certain relationship with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and has the same promoter activity as the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7. May be.
  • These DNAs only need to have the same expression enhancing activity (promoter activity) as that of the DNA encoding the present protein possessed by the Kasalas GW6a promoter. That the promoter activity is homogeneous means that the promoter activity is at least 80%, preferably 90% or more, more preferably 100% or more of the enhancement level of the Kasalas GW6a promoter.
  • the promoter activity can be evaluated by, for example, introducing into a plant cell a vector that is capable of expressing a DNA encoding a reporter protein that can be controlled by the promoter DNA, as shown in Examples described later.
  • the Kasalath GW6a gene promoter that operably links the DNA encoding this protein, the DNA fragment (cassette) containing the promoter having the same quality as the promoter, a vector containing the cassette, and the cassette Transformed cells are also included in the disclosure herein.
  • plant cells there is no particular limitation on plant cells as host cells into which the vector is introduced.
  • plant cells derived from various monocotyledons and dicotyledons already described can be used.
  • the cell derived from a grain plant may be sufficient.
  • plant cells include cells such as Arabidopsis, rice, wheat, barley, oat, corn, pearl barley, sorghum, Italian ryegrass, perennial ryegrass, timothy, meadow fescue, millet, millet, and sugar cane.
  • Wheat, barley, corn and sorghum In addition to cultured cells such as suspension cultured cells, plant cells include protoplasts and callus. Plant cells include shoot primordia, multi-buds, hairy roots and the like, as well as cells in plant bodies such as leaf sections.
  • this vector When this vector is intended to introduce and express this DNA as a foreign DNA in a plant cell, it comprises a promoter that can be transcribed in the plant cell and this DNA that is operably linked under the control of the promoter. be able to. Furthermore, a terminator containing poly A can also be included. Examples of such a promoter include the promoter of the lower Kasalath GW6a gene. In addition, for example, a promoter for constitutively or inducibly expressing this gene can be mentioned. Examples of promoters for constant expression include cauliflower mosaic virus 35S promoter (Odell et al.
  • promoters for inducibly expressing this gene are expressed by external factors such as infection and invasion of filamentous fungi, bacteria and viruses, low temperature, high temperature, drying, ultraviolet irradiation, and spraying of specific compounds. Examples of such promoters are known. Examples of such promoters include rice chitinase gene promoter (Xu et al. 1996 Plant Mol. Biol. 30: 387) and tobacco PR protein gene promoter (Ohshima et al.
  • This vector may also be intended to be produced as a recombinant protein in host cells of cells such as E. coli, yeast, animal and plant cells and insect cells.
  • this vector can be provided with this gene under the control of a promoter operable in an appropriate host cell.
  • This vector can be constructed by those skilled in the art using, for example, commercially available materials such as various plasmids known to those skilled in the art. For example, in addition to plasmids “pBI121”, “pBI221”, “pBI101” (all manufactured by Clontech), etc., a vector that expresses this gene in a plant cell can be constructed to produce a transformed plant body. it can. The introduction of this vector into plant cells will be described later.
  • a transformed cell having the present gene introduced therein is also provided.
  • the transformed plant body disclosed in the present specification includes such transformed cells.
  • the present transformant has enhanced expression of this gene as compared to that before transformation.
  • the gene to be enhanced may be a gene endogenous to the plant body or a foreign gene. Both of these may be used.
  • the expression of a gene is enhanced when the expression level of the gene (the amount of the primary transcription product of this gene and the production amount of the protein encoded by this gene) is greater than that before transformation, or This means that the activity of the protein is increased from that before transformation.
  • the expression level of this gene may increase and the activity of the protein itself may increase.
  • the mode of enhancing the expression of this gene is not particularly limited.
  • a mode in which a promoter operable in a plant cell and the present gene operably linked by the promoter are retained as foreign DNA outside the chromosome of the plant cell or outside the chromosome.
  • This gene linked to the promoter may be endogenous to the plant cell or exogenous.
  • an embodiment in which the entire promoter region or a part of the promoter region on the chromosome is replaced, and an embodiment in which the promoter region is replaced with the endogenous gene are also included.
  • the transformed plant can be obtained by regenerating the plant from the transformed cell.
  • various methods known to those skilled in the art such as polyethylene glycol method, electroporation (electroporation), Agrobacterium-mediated method, and particle gun method can be used.
  • polyethylene glycol method electroporation (electroporation), Agrobacterium-mediated method, and particle gun method
  • gene transfer to protoplasts using polyethylene glycol Datta, SK (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66-74
  • gene transfer to protoplasts using electric pulses Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507
  • gene transfer directly into cells by particle gun method Christou et al.
  • Regeneration of a plant body from a transformed plant cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell (see Toki et al. (1995) Plan Physiol. 100: 1503-1507).
  • a method for producing a transformed plant is to introduce a gene into protoplasts using polyethylene glycol and regenerate the plant (indian rice varieties are suitable) (Datta, SK (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66-74, a method of regenerating plants (Japanese rice varieties are suitable) by introducing genes into protoplasts by electric pulses (Toki et al. (1992) Plant Physiol.
  • offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible.
  • the disclosure of the present specification includes (1) a plant cell into which the present gene has been introduced, (2) a plant containing the cell, (3) progeny and clones of the plant, and (4) The plant body, its progeny, and clonal propagation material are included.
  • the transformed plant produced in this way is imparted or improved with an increasing function of grain, and has an increased thousand grain weight.
  • a genetic marker comprising a polynucleotide comprising at least 15 consecutive bases complementary to the base sequence of the DNA of any one of the above (a) to (f) or its complementary sequence;
  • a gene amplification agent is provided.
  • the “complementary sequence” refers to the sequence of the other strand with respect to the sequence of one strand of the double-stranded DNA consisting of A: T, G: C base pairs.
  • “complementary” is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 consecutive nucleotide regions, but preferably has 90%, more preferably 95% or more nucleotide sequence identity. do it.
  • Such DNA is used as a gene marker such as a probe for detecting and isolating the present gene, and as a gene marker such as a primer for amplifying the gene for detecting and isolating and gene amplification. It can be used as an agent.
  • Plant grain enhancer According to the disclosure of the present specification, a seed increasing agent for a plant body comprising any one of the presently disclosed gene, the present protein, the present vector and a transformed cell as an active ingredient is provided.
  • the plant grain-enhancing agent further discloses a DNA fragment (cassette) comprising this gene, or a vector or transformed cell containing this fragment, which can be controlled by the promoter of the Kasalath GW6a gene or its equivalent. Can be used as a seed enhancer.
  • a plant body other than the Indian rice “Kasalath”, which is provided with a grain increasing function by including any of the following DNAs is provided by crossing.
  • A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • B DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • C a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (d) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are substituted or missing.
  • DNA encoding a protein having an amino acid sequence that has been deleted, inserted, and / or added are substituted or missing.
  • E a DNA having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; and
  • f a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the plant body include a plant body that has been provided with a Kasalath GW6a DNA and DNA of another embodiment of the DNA on a chromosome by crossing.
  • a plant body in which the Kasalath GW6a DNA has been introduced and retained by crossing using the Indian rice “Kasalath” or its offspring carrying the Kasalath GW6a gene can be mentioned.
  • Other examples include a transformed plant having the GW6a gene of Kasalath on the chromosome or a plant in which this gene is introduced and retained by mating using its offspring having the GW6a gene.
  • the plant body is capable of operating any one of the DNAs (a) to (f) above, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and one or more of the base sequences represented by SEQ ID NO: 7 DNA having a base sequence with substitution, deletion, insertion, and / or addition of a base, DNA having a base sequence of 80% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and complementary to SEQ ID NO: 7 It may be provided with a promoter composed of any DNA selected from the group consisting of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA composed of a simple base sequence.
  • the plant body other than “casalas” may be a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant, but is preferably a cereal plant such as a gramineous plant.
  • a cereal plant such as a gramineous plant.
  • various Japanese rices including “Nipponbare” can be mentioned.
  • Such rice other than “casalas” is not particularly limited, and examples thereof include Japanese rice such as Koshihikari, Haenuki, Akitakomachi, Hitomebore, Hinohikari and the like.
  • the plant body by crossing can be carried out, for example, by using Indian rice “Kasalath” as the first parent plant body that retains the Kasalath GW6a gene (preferably including the promoter region) in a general breeding method. That is, it can be provided with a step of crossing an Indian rice “Kasalath” with a second parent plant body having an arbitrary function to produce a new variety that retains this gene.
  • the second parent plant body that is, other cereal grains other than Kasalath, the various grasses already described are preferably applied.
  • the first parent plant is also a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 so that any one of the above DNAs (a) to (f) can be operated.
  • a promoter comprising any DNA selected from the group consisting of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a nucleotide sequence complementary to No. 7 may be provided. That is, the first parent plant body may be Kasalath, or may be a natural plant body or a transformed plant body that is not genetically modified by other genetic engineering.
  • the promoter of the Kasalath GW6a gene has a high ability to enhance the expression of the Kasalath GW6a gene. For this reason, the plant body obtained by crossing has an enhanced function of increasing grain.
  • the first parent plant is casalas
  • a plant body that has been provided with casalas GW6aDNA by crossing is often provided with a region containing the regulatory region of the casalas GW6a gene. That is, in such a plant body, the Kasalath GW6a DNA is provided so as to be controllable by the promoter region of the Kasalath GW6a gene.
  • the plant grain production method disclosed in the present specification can include a step of cultivating the transformed plant body or a plant body by crossing (hereinafter referred to as the present plant body). According to the production method of the present invention, it is possible to obtain a plant body having an increased seed weight, in other words, a large amount of grain harvest, and to harvest more seeds.
  • the production method can further include a step of harvesting the seed of the plant body.
  • a person skilled in the art can appropriately set the cultivation process and the harvesting process according to the type of the plant body.
  • a method for regulating the grain yield of a plant which comprises regulating the expression of the gene in the plant.
  • the regulation method disclosed in the present specification by increasing the expression of this gene, the seed can be increased and the yield of the seed can be increased. Moreover, seeds can be reduced by suppressing the expression of this gene.
  • production of a plant body having such characteristics by genetic engineering or mating can be mentioned.
  • the gene expression in the plant body known to those skilled in the art such as antisense method, ribozyme method, co-suppression, dominant negative, etc.
  • Use of a suppression method is mentioned.
  • the gene endogenous to the plant body may be inactivated by genetic engineering mutation or the like. Moreover, you may make it cross with the plant body which does not have this gene or this gene does not function.
  • a method for determining an increasing function of a grain of a plant body comprising a step of performing expression analysis of the present gene in a test plant body or a part thereof.
  • the “determining the seed increasing function” includes not only the determination of the seed increasing function in the existing variety, but also the determination of the seed increasing function in the new variety by crossing or gene recombination technology.
  • the part of the test plant body may be a plant organ, tissue, or cell.
  • this determination method for example, there is an advantage particularly when breeding is improved by crossing plants. Compared to judging the presence or degree of a grain-increasing function of a plant by its phenotype, it is simple and reliable to judge at the gene level. Can contribute.
  • RNA sample containing RNA is prepared from a test plant or its propagation material, cDNA is synthesized from the RNA in this sample using reverse transcriptase, and the expression level is evaluated based on the synthesis level. it can. For example, it can be determined that the test plant body is deficient or suppressed in terms of grain growth due to the fact that the gene is not expressed by expression analysis or the low expression level. Moreover, it can be determined that the test plant body has a grain-enhancing function or is enhanced by the expression of this gene or the amount of expression thereof.
  • a known expression analysis method such as a DNA microarray using the above-described probe or primer or real-time PCR can be appropriately used.
  • this gene since this gene has a tendency to be specifically expressed in the shoot apical meristem and flower buds, it is possible to determine the function of increasing grain by analyzing the expression of the part.
  • Thousand grain weights were examined for 98 backcross inbred lines (BIL) obtained by performing backcross and self breeding with Nipponbare as a recurrent parent to F1 individuals that crossed “Nipponbare” and “Kasarasu”. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, in this lineage group, the thousand-grain weight was 19 to 33 g. Furthermore, the QTL analysis regarding 1000 grain weight was conducted about this system group. As a result, as shown in FIG. 2, loci controlling the seed weight of seeds were detected on the second, fourth and sixth chromosomes. Among these QTLs, the effect of increasing the thousand grain weight was stronger in the long arm of chromosome 6 (FIG. 3).
  • a near-isogenic line (NIL) SL29 in which Kasaras's long arm of chromosome 6 was replaced with the Nipponbare chromosome background was created (FIG. 4).
  • NIL near-isogenic line
  • FIGS. 5 and FIG. 6 the seed weight of 1000 grains was compared.
  • FIGS. 5 and FIG. 6 the seeds of the SL29 line clearly had an increase in grain length as compared with Nipponbare and a thousand grain weight increased by about 20%. From the above, it was found that there is a gene in the long arm of chromosome 6 of Kasalath that increases seed size or thousand grain weight.
  • the GW6a gene is a gene having a grain-increasing function
  • Agrobacterium EHA105 strain introduced with a DNA fragment was introduced by infecting callus of Nipponbare, and transformed plants were selected on a medium containing 50 mg / l hygromycin.
  • the hygromycin-resistant plant was transplanted to soil and cultivated at 30 ° C. for 16 hours in light conditions / 8 hours in dark conditions.
  • the seed grain length obtained from a plant transformed with only the TAC7 vector is 100
  • the range of 110% to 130% is obtained in five individuals into which the GW6a gene derived from Kasalath is introduced.
  • the grain length increased. From this result, it was concluded that the GW6a gene is a gene having a grain increasing function.
  • the classification to which the GW6a gene belongs and the genetic change of its sequence were investigated. By comparing complementary DNA (cDNA) and genomic DNA (gDNA) of allelic GW6a protein in Nipponbare, three exons and two introns were found (FIG. 9A).
  • the Rice Genome Automated Annotation System annotated the GW6a protein as a GCN5-related N-acetyltransferase-like (GNAT like) protein with a conserved GNAT motif.
  • the gDNAs of the parental alleles of the GW6a protein were compared and nine single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, five of which caused four amino acid mutations. (FIGS. 9A and 9B). None of the amino acid mutations were present within the conserved GNAT domain. That is, the GNAT motif was conserved in the two GW6a proteins.
  • transgenic plants (rice) driven by the 35S promoter and overexpressed in the GW6a_N protein and the GW6a_K protein in which a series of amino acids in the cDNA ORF and GW6a alleles were exchanged. (Nipponbare allele, GW6a N-OE, Kasalath allele, GW6a K-OE) and four transgenic plants were prepared by exchanging the written alleles at specific sites (FIG. 11). In all of the obtained transgenic plants, GW increased with the mRNA level of GW6a (A and B in FIG. 12, A and B in FIG. 13, A and B in FIG. 14).
  • GCN5 a well-studied protein in GNAT protein, has been reported to function as a HAT that acetylates histones H3 and H4 (17).
  • GW6a protein works as a functional HAT, it was performed in in vitro and in vivo HAT assays. First, 6-histidine (6 ⁇ HIS) GW6a fusion protein in Escherichia coli was expressed, and the purified protein was analyzed using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The polypeptide was confirmed to be a polypeptide encoding a group and having a molecular weight of ⁇ 46 kDa.
  • HIS-GW6a_N or HIS-GW6a_K protein was incubated with the reaction mixture of acetyl-CoA and histone H3 peptide.
  • acH3 acetylated histone H3 peptide
  • NIL-gw6a_N isogenic lines
  • NIL-gw6a_K differing in alleles in GW6a
  • total protein was extracted from about 1 cm long fold tissue including each NILS shoot apical meristem (CS tissue) and detected using Western blotting. From NIL-gw6a_N A stronger acH3 band was also detected in NIL-gw6a_K (FIG. 17A).
  • Relative luciferase expression was evaluated after transformation into maize protoplasts via electroporation. As shown in FIG. 20, the GW6a promoter expressed significantly higher luciferase than the minimal promoter, and in particular, the pGW6a_K construct produced twice as much LUC reporter expression as the pGW6a_N construct. These results were similar to those of RT-PCR and quantitative RT-PCR, and it was confirmed that the GW6a Casalas allelic promoter has a greater activity than that of the Nipponbare Allele.
  • transgenic rice plants hereinafter, pGW6a_N-GUS and pGW6a_K-GUS
  • pGW6a_N and pGW6a_K-GUS expressing the GW6a_N and GW6a_K promoter :: ⁇ -glucuronidase (GUS) reporter clones.
  • GUS signals were consistently present in CS tissues and young panicles.
  • the GUS signal was much stronger in the transgenic plants containing the pGW6a_K-GUS clone than in pGW6a_N-GUS.
  • the plant body containing pGW6a_K-GUS showed a signal 2 to 3 times larger than the plant containing pGW6a_N-GUS. Presented. These results are consistent with the genetic evidence so far and confirmed that the promoter activity of the GW6a Casalas allele was strong against the Nipponbare Allele.
  • GW6a mRNA was present in the basal part of the dorsal axis side of the trophic phase (FIGS. 23, a, e).
  • a similar expression pattern was observed at the basal part on the dorsal axis side of the entire pupae during the reproductive period (FIGS. 23, b, c, f, g).
  • GW6a mRNA accumulation was observed in the early branch wings (Fig. 23, b, f).
  • SEM scanning electron microscope
  • E and F of FIG. 27 there was no statistical difference between the NILS between the number of grains per main spike and the number of spikes per individual.
  • G of FIG. 27 as expected, the grain yield per plant of NIL-gw6a_K was increased by 15.8% (P ⁇ 0.05).
  • NIL-GW6a_K the biomass amount also has increased notably, and it has been shown that GW6a contributes to the whole biomass amount. That is, CSSL29, a plant with GW6a and GW6b loci, had great potential for a greatly enhanced grain yield over the control Nipponbare. NIL-gw6a_K and CSSL29 plants were remarkably taller than NIL-gw6a_N and Nipponbare, respectively (H and I in FIG. 27, D and E in FIG. 28). Therefore, we investigated the possibility that GW6a also regulates the plant height (PH). As shown in FIG.
  • GW6a 2N NILS transcriptomes were compared using high-density oligonucleotide microarrays. Based on the view that excess acetylchromatin is transcriptionally active (2, 20), we focused on genes with highly enhanced expression in NIL-gw6a_K. As a result, it was found that in NIL-gw6a_K ⁇ ⁇ ⁇ , the expression was significantly increased at least 1.5-fold in 3.1 to 4.3 percent of all genes from 833 to 1,167 genes (based on 3 repetitions). In contrast, in NIL-gw6a_N, 441 common genes were enhanced.
  • GW6a mainly functions as a transcriptional regulator that affects lipid transport.
  • Transcriptional regulators are said to play an important role in cultivation and breeding. Therefore, we investigated whether GW6a has become a target for human selection in rice cultivation and modern breeding. That is, genetic variation was analyzed for three regions of GW6a, the GW6a promoter in O. sativa and O. rufipogon; the region from GW6a gene to 50 kb upstream; and the region from GW6a gene to 60 kb downstream. The results are shown in FIG. As a result, no selection signal was found in either Nipponbare or Kasalath's GW6a allele, indicating that the GW6a allele was not developed by human selection.
  • Test method The test methods used for the above examples are described below.
  • BAC_K0242A07 was digested with the restriction enzyme HindIII, partially separated and recovered, and inserted into the vector pYLTAC7 (27). Appropriate clones were confirmed by sequence analysis and used for rice genetic recombination assays and performed as previously described (28).
  • GW6a was down-regulated by inserting the ORF of the GW6a_N cDNA in the antisense direction, whereas the full-length GW6a cDNA ORF was amplified from the CS tissues of both Nipponbare and CSSL29 plants (see text) and overloaded It was cloned into a plant binary vector PHB (7) for the expression GW6a.
  • swapping amino acids FIG. 11
  • RNA isolation and RT-PCR analysis Total RNA is digested with recombinant DNase I (RNase-free, Takara Shuzo) to remove possible genomic DNA contamination according to manufacturer's instructions, followed by RNeasy Plant mini Kit (QIAGEN) Isolated. The total RNA obtained was quantified with a 2000 photometer (Thermo Fisher Scientific). For first strand cDNA synthesis, 2 ⁇ g of total RNA per sample was used for reverse transcription using OmniScript reverse transcriptase (QIAGEN) according to the manufacturer's standard protocol. The synthesized cDNA was then diluted 1: 5 with Milli-Q water and subjected directly to semi-quantitative RT-PCR and quantitative RT-PCR.
  • DNase I RNase-free, Takara Shuzo
  • QIAGEN RNeasy Plant mini Kit
  • Quantitative RT-PCR was performed on a CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad) using SYBR green PCR master mix (Bio-Rad). Unless otherwise noted, all samples used for semi-quantitative RT-PCR and quantitative RT-PCR were derived from CS tissue. Primers used for quantitative RT-PCR are listed in FIG. 32 and the relative expression levels were normalized to those of UBQ. Each sample was repeated three times.
  • Fluorescent HAT assay kit (Active Motif) was purchased and assayed according to the instruction manual. That is, 30 ⁇ l of reaction mixture containing 5 ⁇ HAT assay buffer, 0.5 mM acetyl CoA 2 ⁇ l, histone H3 or H4 peptide 3 ⁇ g, the indicated volume of purified fusion or HIS tag protein for 2 hours at 30 ° C. Incubated. One third of each reaction mixture, ie 10 ⁇ l, was dissolved in 15% SDS-PAGE and subjected to Western blotting using antibodies against acetylated histone H3-H4 or (anti-acH3 / H4, Millipore).
  • HIS tag or HIS-GW6a was detected using an antibody against HIS tag (MBL) (FIG. 16A).
  • MBL HIS tag
  • FIG. 16A For in vivo HAT assays, crude protein extracts of whole 20 day-old seedling plants or CS tissues (up to 1 cm long, including shoot apical meristems) were prepared (31). Western blots were probed using anti-acH3 or anti-acH4 antibodies.
  • the cDNA fragment is described in FIG. 32 and the pBluescript II SK + and pBluescript II KS + vectors are linearized and used to make digoxigenin-labeled sense and antisense probes, each with a cloning set GW6a specific primer Amplified by RT-PCR using Sample fixation, sectioning, and in situ hybridization (32) were performed as described elsewhere.
  • a GFP :: GW6a in-frame fusion construct was constructed that operates under the control of the CaMV 35S promoter.
  • the introduction of the construct was driven into onion epidermal cells using a PDS-1000 / He apparatus (Bio-Rad).
  • 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, PH7.0) was used to stain the nuclei of onion epidermal cells, and then the transient expression in the samples was examined with a Zeiss LSM700 confocal laser microscope.
  • the GW6a promoter segment was amplified from genomic DNA from both parents by PCR amplification using the primers shown in FIG.
  • the base length of the amplified product was 1681 bp (pGW6a_N) and 1652 bp (pGW6a_K).
  • Transient expression assay in maize leaf protoplasts After digestion with XhoI and BamHI, the resulting pGW6a_N and pGW6a_K fragments were inserted into the reporter construct NBS-LUC and a minimal 35S promoter was replaced with the insert (35). Transient expression assays using corn leaf protoplasts were performed using the protocol described by Studer et al. (36). The reporter assay was repeated at least 3 times with similar results. For each repeat, 3 replicates were performed for each construct.
  • RNA isolated from CS tissue of 20 day old seedlings of GW6a 2 NILS was used for microarray experiments.
  • An Agilent-015241 rice gene expression 4 ⁇ 44K microarray (Agilent Technology) for GW6a transcriptome profile analysis was used.
  • RNA transcribed using T7 RNA polymerase was labeled with Cy3 or Cy5.
  • dye exchange was performed on three samples. RNA labeling, microarray hybridization, and data analysis were performed according to Shimono et al. (38).
  • Gene ontology analysis Commonly enhanced 441 genes were selected for gene ontology analysis.
  • the GO term categories used were in accordance with the Gramene ontology database (http://www.gramene.org/plant_ontology/index.html).
  • the number of genes within each category was calculated using GO enrichment analysis using the rice oligonucleotide sequence database (http://www.ricearray.org/index.shtml). P-values were calculated by hypergeometric distribution (39).

Abstract

　本発明は、穀物の子実の増大機能を有する遺伝子を単離・同定し、その遺伝子を利用することを目的とする。本明細書の開示によれば、インド型イネ「カサラス」の第６染色体の長腕において、穀物の子実増大機能を有する遺伝をGW6a遺伝子として同定・単離した。

Description

植物体の子実増大機能を有する遺伝子及びその利用
　本明細書は、植物体の子実の増大させることのできるＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、該ＤＮＡを用いた植物体の作製方法、植物体の種子の生産方法等に関する。
　本出願は、２０１１年１１月２２日出願の日本国特許出願である特願２０１１－２５５３５７を優先権主張の基礎とするものであり、その出願における全ての開示は、引用により本出願に組み込まれるものとする。
　人口が増大する一方、環境汚染や温暖化等により、地球規模での食糧危機が問題となってきている。こうした中、主食となる穀物、特にその子実の収量増大の必要性が高まってきている。したがって、多収量性のイネなどの穀物の育種と普及が重要課題となってきている。
　イネの栽培品種等の遺伝的特性は、各種の変異遺伝子座の総和によって決定されている。このように、特定の形質に加算的な影響を及ぼす遺伝子座を量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）という。したがって、ある品種が種子サイズや種子重量が大きいという遺伝的特性も、量的形質遺伝子座によって決定されているといえる。イネに関しては、こうした遺伝子が既に単離・同定されている（特許文献１、２）。
　他にも、子実の大きさに寄与する遺伝子領域が見出されている（非特許文献１）。また、根の伸長に関連する遺伝子が同定されている（特許文献３）。
特開２００７－４９９９４号公報 特開２０１０－１１５１７６号公報 国際公開ＷＯ／２００７／０１１６８１号
Longbiao Guoら、J Integr Plant Biol. 2009 Jan;51(1):45-51
　しかしながら、非特許文献１では遺伝子が同定されていない。また、特許文献３に開示される遺伝子は、子実やバイオマスの増大に関連とはいえない。
　本明細書は、植物体の子実の増大機能を有する遺伝子を単離・同定し、その遺伝子を利用する。
　本発明者らは、代表的穀物種であるイネにおける子実サイズの増加ないし質量の増加を制御する遺伝子を単離同定するために、ポジショナルクローニングを組み合わせたＱＴＬ解析を試みた。膨大な実験及び解析の結果、本発明者らは、種子サイズ等を制御する遺伝子を新たに単離同定することができた。この遺伝子が発現されることで、種子サイズないし重量が増大傾向となることがわかった。さらに同定した遺伝子を当該種以外の品種に導入し、当該遺伝子がコードするタンパク質を発現させることで種子サイズないし質量の増大機能を獲得した植物を得た。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき、以下の手段が提供される。
（１）植物体の子実を増大させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
（ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）前記ＤＮＡは、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかである、（１）に記載のDNA：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）（１）又は（２）に記載のDNAを含むベクター。
（４）（１）又は（２）に記載のDNAを保持する形質転換植物細胞
（５）前記形質転換細胞が単子葉植物又は双子葉植物に由来する、（４）に記載の細胞。
（６）イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ又はサトウキビである、（５）に記載の形質転換植物細胞 
（７）（４）～（６）のいずれかに記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
（８）前記ＤＮＡがコードするタンパク質の発現が増強されている、（７）に記載の形質転換植物体。
（９）子実増大機能が付与された、（７）又は（８）に記載の植物体。
（１０）バイオマス増大機能が付与された、（７）～（９）のいずれかに記載の植物体。
（１１）（７）～（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１２）（７）～（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。 
（１３）（７）～（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）又は（２）に記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
（１４）（１）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
（１５）（１）に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカー。
（１６）以下の（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを含んで、子実増大機能が付与された、インド型イネ「カサラス」以外の植物体。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１７）前記植物体が単子葉植物又は双子葉植物である、（１６）に記載の植物体。
（１８）以下の（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを備える第１の親植物体と、任意の機能を有する第２の親植物体とを交配して、前記ＤＮＡを保持する新品種を作製する工程、を備える、植物体の作製方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１９）前記第１の親植物体は、前記（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを作動可能に、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるプロモーターを備える植物体である、（１８）に記載の方法。
（２０）さらに、前記作製工程は、（１５）に記載の遺伝子マーカーを用いて前記新品種を選抜することを含む、（１８）又は（１９）に記載の作製方法。
（２１）（７）～（１１）、（１６）及び（１７）のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、前記植物体の種子の生産方法。
（２２）配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるプロモーターであって、以下のＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現増強活性を有するプロモーター。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；および
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
（ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
戻し交雑自殖系統群（ＢＩＬ）９８系統について、千粒重を調査した結果を示す図である。 ＱＴＬ解析結果を第６染色体について着目して解析した結果を示す図である。 一次枝梗数を制御する遺伝子としてのWFP遺伝子のクローニング結果を示す図である。OsSPL14遺伝子のプロモーター領域に特定できることを示している。 日本晴の染色体背景にカサラスの第６染色体長腕が置換した準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）ＳＬ２９示す図である。 ＳＬ２９と日本晴とカサラスとを用いて、種子の千粒重を比較した結果を示す図（籾付き）である。 ＳＬ２９と日本晴とカサラスとを用いて、種子の千粒重を比較した結果を示す図（籾なし）である。示す図である。 カサラスの第６染色体についてのポジショナルクローニングの結果を示す図である。 形質転換植物体の種子の粒長を評価した結果を示す図である。 日本晴とカサラスにおけるGW6a遺伝子の特徴を示す図である。なお、図中の(1)はUTR領域を示し、(2)はエクソンを含む領域を示している。 日本晴及びカサラスにおけるGW6a遺伝子及びホモログのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 GW6aタンパク質の予測されるアミノ酸配列を用いたシーケンスブラストの結果を示す図である。GmはGlycine max（大豆）、PtはPopulus trichocarpa（黒ハコヤナギ）の７個、LOCはイネ、BdはBrachypodium distachyon（紫偽ブロム）、SbはSorghum bicolor （モロコシ）HvはHordeum vulgare（大麦）、AtはArabidopsis thaliana （シロイヌナズナ）、VvはVitis vinifera（ブドウ）、MtはMedicago truncatula（バレルクローバー）、RcはRicinus communis（トウゴマ）、ZmはZea mays（トウモロコシ）、PpはPhyscomitrella patens（菜種）、SmはSelaginella moellendorffii (スパイクモス；spikemoss)、BnはBrassica napus（苔）を表す。シロイヌナズナ、 ４種のトランスジェニック植物に導入する外来遺伝子構造を示す図である。 日本晴及びカサラスのGW6a対立遺伝子をそれぞれ過剰発現させたトランスジェニック植物とGW6a遺伝子に対するアンチセンスを導入したトランスジェニック植物における子実を示す図（Ａ）及びその子実の1000粒重を示す図（Ｂ）である。 日本晴及びカサラスのGW6a対立遺伝子をそれぞれ過剰発現させたトランスジェニック植物とGW6a遺伝子に対するアンチセンスを導入したトランスジェニック植物における半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてGW6a遺伝子の転写物（(2)；エクソンを含む領域）が増大していることを示す図（Ａ）、GW6a遺伝子に対するアンチセンスを導入したトランスジェニック植物においてUTRを含む領域(1)に対応するGW6aプライマーセットによる内在性のGW6a遺伝子の転写物が低下しているが、GW6転写物(2)（エクソンを含む領域）の増大を示す図（Ｂ）及びGW6a遺伝子に対するアンチセンスを導入したトランスジェニック植物におけるGW6aプライマーセットによる内在性のGW6a遺伝子の転写物量の低下を示す図（Ｃ）である。 ４種のトランスジェニック植物の子実の大きさを示す図（Ａ）、半定量的ＲＴ－ＰＣＲによるGW6a転写物の増大の検出を示す図（Ｂ）及び４種のトランスジェニック植物における1000粒重の比較結果を示す図（Ｃ）である。 日本晴及びカサラスのGW6a対立遺伝子をそれぞれ過剰発現させたトランスジェニックシロイヌナズナ植物の子実の1000粒重の測定結果を示す図（Ａ）、子実を示す図（Ｂ）及び日本晴及びカサラスのGW6a対立遺伝子をそれぞれ過剰発現させたトランスジェニックシロイヌナズナ植物におけるGW6a転写物の増大を示す図（Ｃ）である。 アセチル化ヒストン３に対する抗体を用いた日本晴及びカサラスのHIS－GW6aのin vitroHATアッセイのウェスタンブロットによる結果を示す図である。 アセチル化ヒストン４に対する抗体を用いた日本晴及びカサラスのHIS－GW6aのin vitroHATアッセイのウェスタンブロットによる結果を示す図である。 HIS-GW6aタンパク質濃度の増大に伴ってacH3を強く検出した結果を示す図である。 HIS-GW6aタンパク質濃度の増大に伴ってacH4を強く検出した結果を示す図である。 ２つのNILSにおいてNILSの茎頂分裂組織（CSの組織）を含む約１cmの長稈の組織から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを用いてacH3を検出した結果を示す図である。 GW6a遺伝子に関するトランスジェニック植物（GW6a N-OE、GW6a K-OE、GW6a-AS）においてウェスタンブロッティングを用いてacH3及びacH4を検出した結果を示す図である。 葉身、葉鞘、CSの組織、根、および幼穂を含む複数の主要な器官や組織におけるGW6a遺伝子の発現プロファイルを半定量的RT-PCRで調べた結果を示す図である。 葉身、葉鞘、CSの組織、根、および幼穂を含む複数の主要な器官や組織におけるGW6a遺伝子の発現プロファイルを半定量的RT-PCRで調べた結果を示す図である。 日本晴とＣＳＳＬ２９とをコントロールとしたGW6a遺伝子のｘｊ－１７マーカーと翻訳開始部位ＡＴＧ遺伝子領域の配列解析によるホモ組換えにおけるＳＮＰの遺伝子マップを示す図である。 一過性発現コンストラクトとそのコンストラクトによるＬＵＣアッセイ結果を示す図である。 ＧＵＳ染色によって、GW6a_NとGW6a_Kプロモーター::β-グルクロニダーゼ（GUS）レポータークローンを発現するトランスジェニックイネ植物の組織染色結果を示す図である。 植物全体から抽出したタンパク質を用いたＧＵＳ量の測定結果を示す図である。 苗木や若い花序の組織切片についてGW6a mRNAのin situハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。ａ～ｄは日本晴であり、ｅ～ｈはＣＳＳＬ２９である。 ２つのGW6a NILS、日本晴、CSSL29及びKasalath（カサラス）につき、長さ、幅、およびの厚さを含む穀物の形状成分の定量分析の結果を示す図である。 GW6aタンパク質がプリ受精の小穂外皮の細胞数に対する影響を示す図であり、対象となる小穂を示す図（Ａ）、GW6aタンパク質がプリ受精の小穂外皮の細胞数に対する影響を示す図であり、長さの測定結果を示す図（Ｂ）、ＳＥＭによる側の表皮細胞、特に外花類の中央部を検査した結果を示す図（Ｃ、矢印は外花穎の境界を示す。）、Ｃの拡大図（Ｄ）及び外花穎の内部の表皮細胞の長さの測定結果を示す図（Ｅ）である。 日本晴とCSSL29の小穂外皮の長さ（Ａ）と表皮細胞の長さ（Ｂ）とを示す図である。 ２つのGW6a NILSの間に収量に関するいくつかのコンポーネントの特性を比較した結果を示すＡ～Ｊである。 日本晴とカサラスとの各種特性を比較した図である。 日本晴及びカサラスのGW6a対立遺伝子をそれぞれ過剰発現させたトランスジェニック植物（イネ及びシロイヌナズナ）における草丈、植物体の大きさを示す図である。 35S ::緑色蛍光タンパク質（GFP）-GW6a融合コンストラクトを用いてタマネギ表皮細胞における一過性発現の結果を示す図である。 遺伝子オントロジー解析結果を示す図である。 ２つのGW6a NILSについての子実組成を比較した結果を示す図である。 O. sativaとO. rufipogonにおけるGW6aプロモーター；GW6a遺伝子から上流へ５０ｋｂまでの領域；GW6a遺伝子から下流へ６０ｋｂまでの領域につき、遺伝的変異を解析した結果を示す図である。 定量的RT-PCRに用いたプライマーを示す図である。
　本明細書の開示は、植物体の子実の増大に関連するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）及びその利用に関連する。本明細書の開示は、本発明者らが子実の増大に貢献し、結果として子実収量の増大を得ることができる遺伝子を新たに単離同定に成功したことに基づいている。
　本発明者らは、インド型イネ「カサラス」（kasarath）に着目した。「カサラス」は、日本型イネ「日本晴」に比べてその子実長が長いが千粒重は籾及び玄米のいずれにおいても３～４割程度少ないという特徴を有している。発明者らは、「カサラス」の子実長に着目し、子実周の大きい「日本晴」と組み合わせることにより、子実の増大に関与する遺伝子の単離を試み、それを見出すことに成功した。
　本明細書によれば、本発明者らが新たに「カサラス」より同定した遺伝子を発現させることで、子実増大機能を有している。すなわち、子実を増大させ、子実質量を増大させることができる。
　この遺伝子は、特に農業分野、バイオマスを原料とするエネルギー分野及び化学工業分野に有用である。例えば、子実又はその質量の増大は、穀類など植物体の子実の収量を増加させることができる。
　さらに、この遺伝子は、バイオマス増大機能も有している。すなわち、子実のみならず、バイオマス（植物体の根茎部を除く地上部）の収量を増加させることもできる。この遺伝子は、植物体の高さの増大機能を有することもできる。
　さらにまた、この遺伝子は、植物体の子実の炭水化物量（濃度）を増大させる機能も有している。この遺伝子は、炭水化物含有量の増大機能が子実増大機能に併せて備えられるため、食糧供給や育種により有利な遺伝子である。
　また、この遺伝子は、植物体の子実の油脂含有量（濃度）を低下させる機能も有している。このことは、この遺伝子が耐酸化性の向上など、保存性向上に有利な遺伝子であることを意味する。また、このことは、この遺伝子が１つの栄養学的観点（油脂の摂取量の低減）からみて有利な遺伝子であることを意味している。
　さらに、この遺伝子は、イネ科植物においてインディカ種においてよりもジャポニカ種において相対的に保持されていない場合が多い。したがって、この遺伝子はジャポニカ種のイネ科植物の形質改善に有利な遺伝子であるといえる。
　さらにまた、この遺伝子は上記した各種機能を有しつつ、その子実の食味を維持することがわかっている。したがって、食糧供給により適した遺伝子であるといえる。
　以下、本明細書の開示に関し、子実の増大に関連する遺伝子、発現ベクター、形質転換植物体、植物体の作製方法、植物体の子実の製造方法等について順次説明する。
（植物体の子実の増大活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ）
　植物体の子実の増大活性を有するタンパク質（以下、単にGW6aタンパク質又は本タンパク質ともいう。）をコードするＤＮＡ（以下、単にGW6a遺伝子あるいは本遺伝子ともいう。）は、以下の（ａ）～（ｆ）で表されるＤＮＡを有している。
（ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ；及び
（ｆ）配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　配列番号１は、インド型イネ「カサラス」のGW6a遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号２は、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号３は、日本型イネ「日本晴」のGW6a遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号４は、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す。
　GW6a遺伝子は、インド型イネ「カサラス」を用いた種子の千粒重に関するQTL解析及びポジショナルクローニングによって、種子の千粒重に関連するとして遺伝子として新たに本発明者らによって同定された。現在までのところ、GW6a遺伝子がコードするタンパク質の機能について報告されていない。
　カサラスGW6a遺伝子は、インド型イネ「カサラス」の第６番染色体の長腕１００ｃＭ近傍の１１ＣＭのうちの約４ｋｂの領域に存在しているとして見出された。インド型イネ「カサラス」のGW6a遺伝子に相同性の高い遺伝子が日本型イネ「日本晴」の同じ染色体位置上に存在する。日本型イネ「日本晴」における相同遺伝子がコードするタンパク質は、カサラスのGW6a遺伝子と４アミノ酸が相違している。
　「カサラス」と「日本晴」との子実長の相違からカサラスのGW6a遺伝子は、日本晴のGW6a遺伝子よりも、子実を増大する機能が高いと考えられる。この相違は、GW6a遺伝子のコード領域でなくプロモーター領域に依拠するものと考えられる。
　本明細書において、子実とは、植物体の種子、果実、頴花を含んでいる。また、本明細書において、子実の増大とは、子実の千粒重が増加することをいう。子実の増大には、子実の粒長が増加することを含んでいてもよい。
　また、子実の増大活性を有するとは、本遺伝子が発現していない植物体かあるいは本遺伝子が増強されていない植物体（例えば、本遺伝子により形質転換等されていない植物体などの親植物体（日本晴など））と、親植物体において本遺伝子が増強されたその子孫植物体とを、同一の栽培条件で栽培したときに得られる子孫植物体の子実の千粒重が、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％、さらに好ましくは２０％以上、一層好ましくは２５％以上、より一層好ましくは３０％以上親植物体の子実に対して増大していることを意味している。加えて、本遺伝子が発現していない植物体かあるいは本遺伝子が増強されていない植物体と比較して、同一の栽培条件で栽培したときに得られる子実の粒長の平均値（１０００粒から不作為に抽出した５０粒の平均値）が、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、一層好ましくは２０％以上増加していることを意味していてもよい。
　さらに、GW6a遺伝子は穀物植物を含む植物体に広く存在すると考えられるため、本遺伝子には、種々の植物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の植物において、GW6aタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を意味している。このようなタンパク質には、例えば、以下に示す本タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、本タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、植物体としては、特に制限はなく、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。単子葉植物としては、例えばイネ、コムギ、オオムギ、ハトムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、ヒエ、キビ、アワ、サトウキビ等のイネ科植物が挙げられる。また、本明細書における単子葉植物として、より好ましくは、イネを挙げることができる。また、コムギ、オオムギも好ましい。さらに、ソルガム、トウモロコシも好ましい。また、双子葉植物としては、エゴマ、ラベンダー等のシソ科植物、ゴマ等のゴマ科植物、ヒマワリ、ベニハナ等のキク科植物、ナタネ等のアブラナ科植物、アマなどのアマ科植物、ケナフ、ワタ、カカオ（アオギリ科に分類されることもある。）等のアオイ科植物、カボチャ等のウリ科植物、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、ライマメ、エンドウ、ベニハナインゲン、ソラマメ、ササゲ、ヒヨコマメ、リョクトウ、レンズマメ、イナゴマメ、クラスタマメ、ナタマメ、キマメ、ラッカセイ等のマメ科植物、アーモンド等のバラ科植物、カシューやピスタチオなどのウルシ科植物、ヘーゼル等のカバノキ科植物、マカダミア等のヤマモガシ科植物、クリ等のブナ科植物等が挙げられる。ダイズ、クローバーなどのマメ科植物、ナタネなどのアブラナ科植物も挙げられる。また、ポプラなどのヤナギ科植物も挙げられる。スパイクモスなどのイワヒバ科植物も挙げられる。この他、図１０に示す各植物及び当該植物が属する科や属に包含される植物が挙げられる。
　本遺伝子は、本発明の子実増大機能を有するタンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、本遺伝子は、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなども含まれる。また、本遺伝子は、後述する本タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
（植物体の子実増大機能を有するタンパク質）
　本タンパク質の態様としては、上記（ａ）～（ｆ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、子実増大機能を有するタンパク質である。すなわち、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はこれらのタンパク質と一定の関係を有するタンパク質である。
　本タンパク質の一態様としては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、子実増大機能を有するタンパク質が挙げられる。なお、配列番号２及び４で表されるタンパク質のいずれか一方を基準としたとき、他方のタンパク質は前記一方のタンパク質の変異体又は改変体であるといえる。
　配列番号２で表されるカサラスGW6a遺伝子がコードするタンパク質は、配列番号４で表される日本晴GW6a遺伝子のアミノ酸配列において、Ｓ７２Ｇ、Ｖ２７０Ｍ、Ｇ３０４Ｃ及びＡ３３７Ｅの４つの置換変異を有する変異体といえる。これらの置換変異は、配列番号３で表される日本晴GW6a遺伝子の塩基配列において第２１４位のＡのＧへの置換、第８０８位のＧからＡへの置換、第９１０位のＧからＴへの置換、第９１２位のＴからＣへの置換及び第１０１０位のＣからＡへの置換に基づいている。したがって、配列番号４で表されるタンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードするＤＮＡを改変して変異体を取得する場合には、これらの変異を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。配列番号２で表されるタンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列である配列番号１を改変して変異体を取得するときには、これらの変異が保存されていてもよいし、保存されていなくてもよい。すなわち、これらのアミノ酸置換変異以外の部位において、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加が行われていてもよいし、これらのアミノ酸置換部位においてアミノ酸置換などの変異を備えていてもよい。
　変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内であり、一層好ましくは３アミノ酸以内である。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい（これは、保存的アミノ酸置換として知られている）。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）および親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）の二種類に大別することができる。また、その側鎖の構造に基づいて、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）などのようにアミノ酸を分類することもできる。さらに、例えば、変異マトリクス（mutational matrix）によってアミノ酸を分類することも周知である（Taylor 1986, J, Theor. Biol. 119, 205-218; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 3rd ed. A7.6-A7.9, Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）。この分類を以下に要約すると、脂肪族アミノ酸（L、I、V）、芳香族アミノ酸（H、W、Y、F）、荷電アミノ酸（D、E、R、K、H）、正荷電アミノ酸（R、K、H）、負荷電アミノ酸（D、E）、疎水性アミノ酸（H、W、Y、F、M、L、I、V、C、A、G、T、K）、極性アミノ酸（T、S、N、D、E、Q、R、K、H、W、Y）、小型アミノ酸（P、V、C、A、G、T、S、N、D）、微小アミノ酸（A、G、S）および大型（非小型）アミノ酸（Q、E、R、K、H、W、Y、F、M、L、I）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはよく知られている。
　本タンパク質の他の一態様としては、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、親タンパク質（カサラス又は日本晴GW6aタンパク質）と機能的に同等なタンパク質が挙げられる。このようなＤＮＡは、典型的には、配列番号１で表される塩基配列と、アミノ酸をコードする配列の全体で、少なくとも５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、より一層好ましくは８５％以上であり、さらに一層好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、さらにまた一層好ましくは９９％以上である。
　さらに、本タンパク質の他の一態様としては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、親タンパク質（カサラス又は日本晴GW6aタンパク質）と機能的な同等なタンパク質が挙げられる。同一性は好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、より一層好ましくは８５％以上であり、さらに一層好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、さらにまた一層好ましくは９９％以上である。
　本明細書において、「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が親タンパク質（カサラス又は日本晴GW6aタンパク質）と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。親タンパク質（カサラス又は日本晴GW6aタンパク質）の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば穀物植物を含む植物体の種子などの子実体を増大させる機能を挙げることができる。また、植物体のバイオマス又は植物体の高さを増大させる機能であってもよい。
　相同遺伝子等を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、GW6a遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１又は３で表されるＤＮＡ）もしくはその一部をプローブとして、あるいはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、GW6a遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物から親遺伝子（カサラス又は日本晴GW6a遺伝子）の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。
　相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4xSSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　単離されたＤＮＡの同一性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　なお、the National Center for Biotechnology Information (NCBI) 及びRice Genome Research Program (RGP)のデータベースに対してシーケンスブラストを行ったところ、Glycine max（大豆）の12個、Populus trichocarpa（黒ハコヤナギ）の７個、イネ、Brachypodium distachyon（紫偽ブロム）及びSorghum bicolor （モロコシ）にそれぞれ５個、 Hordeum vulgare（大麦）及びArabidopsis thaliana （シロイヌナズナ）及びVitis vinifera（ブドウ）にそれぞれ４個、Medicago truncatula（バレルクローバー）及びRicinus communis（トウゴマ）にそれぞれ３個、Zea mays（トウモロコシ）、Physcomitrella patens（菜種）及びSelaginella moellendorffii (スパイクモス；spikemoss)にそれぞれ２個、Brassica napus（苔）において１個であった。
（ベクター）
　本明細書に開示されるベクターは、上記ＤＮＡを含むことができる。本ベクターは、上記ＤＮＡのほか、植物細胞内で本ＤＮＡの発現を増強するための要素を含んだ発現ベクターとすることができる。本ベクターは、宿主細胞（植物細胞）内の染色体上の内在性の本遺伝子の有無に関わらず、本ＤＮＡを外来性ＤＮＡとして導入して、結果として、本遺伝子の発現を増強することを意図することができる。
　配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡや当該ＤＮＡについての他の態様のＤＮＡを含むベクターは、このＤＮＡの発現を増強するような、具体的には発現量を増大させるようなプロモーターによって制御可能にそのプロモーターの下流域に連結されていることが好ましい。また、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡや当該ＤＮＡについての他の態様のＤＮＡを含むベクターは、このＤＮＡの発現を増強するような、具体的には発現量を増大させるようなプロモーターによって制御可能にそのプロモーターの下流域に連結されていることが好ましい。
　本ベクターは、相同組換え等により、植物細胞内の染色体上において本ＤＮＡが存在する箇所において本ＤＮＡの発現を増強するように意図されていてもよい。
　カサラスのGW6a遺伝子のプロモーターは、カサラスにおいて、その下流にあるカサラスのGW6a遺伝子の発現を、例えば、日本晴のGW6aプロモーターよりも強く増強することができる。したがって、カサラスのGW6aq遺伝子プロモーター及び以下に説明する他の態様のプロモーターは、それ自体、本ベクターのプロモーターとして用いることができる。
　カサラスGW6a遺伝子のプロモーターを配列番号７に示す。また、日本晴のGW6a遺伝子プロモーターの配列を配列番号８に示す。これらのプロモーター配列をMartines/Needleman-Wunisch DNA Aligment（Minimum Match: 9, Gap Pentality: 1.10, Gap length: Pentality: 0.33)を用いてアラインメントしたとき、これらのプロモーター間には以下に示す変異があった。以下の変異は日本晴のGW6aプロモーター配列に対するカサラスのGW6aプロモーター配列における変異を表す（図１９のＢ）。なお、これらのプロモーター配列をアラインメントしたとき、コンセンサスレングスは１６８７であり、同一性は９６．５％、ギャップ数；８、ギャップ長；４１であった。好ましいプロモーターは、下記（１３）の変異を維持していることが考えられる。下記（３）～下記（１６）の変異を備えていることも好ましい。あるいは又はこれらに加えて、下記（１）及び／又は（２）の変異を維持していることも好ましく、あるいは又はこれらに加えて、下記（１７）及び／又は（１８）の変異を維持していることも好ましい。また、下記（２）～（１８）の変異の全てを維持していることが好ましい。なお、－１６７８位にＡからＧへの置換変異、－１６６４位にＡからＴへの置換変異、－１６３１位にＡからＧへの置換変異も存在している。
（１）－１６２６位～－１６０５位（ＡＴＣＴ ＧＡＴＧ ＣＴＡＴ ＴＣＧＴＴＣＡＡ ＡＡ欠損）
（２）－１６０４位～－１６０２位（ｘｊ－１７）（ＧＡＡ欠損）
（３）－１４５１位（ＴtoＣ）
（４）－１３５７位（ＴtoＧ）
（５）－８６８位（Ｔ欠損）
（６）－８５５位（ＧtoＡ）
（７）－７３９位（ＴtoＣ）
（８）－６４１位（ＴtoＣ）
（９）－６３２位（Ｇ挿入）
（１０）－６３０位（ＡtoＣ）
（１１）－６２１位（Ｔ挿入）
（１２）－６２０位）（Ｔ挿入）
（１３）―５９２位～－５８７位（ＣＡＧＣＴＧ欠損）
（１４）－４９４位（Ａ挿入）
（１５）－４９３位（Ｃ挿入）
（１６）－３９５位（Ｇ挿入）
（１７）－９２～－９０位（ＡＧＣ欠損）
（１８）－６９位（ＡtoＴ）
　カサラスのGW6aプロモーターは、さらに、配列番号７で表される塩基配列と一定の関係を有し、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡと同質のプロモーター活性を有している態様であってもよい。例えば、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上（より具体的には、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％以上）の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるものであってもよい。これらのＤＮＡであって、カサラスのGW6aプロモーターが有する本タンパク質をコードするＤＮＡの発現増強活性と同質の発現増強活性（プロモーター活性）を有していればよい。プロモーター活性が同質であるとは、少なくともカサラスのGW6aプロモーターの増強程度の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％以上の増強活性を有することを意味している。なお、プロモーター活性は、後述する実施例に示すように、プロモーターＤＮＡによって制御可能にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備えるベクターを植物細胞内に導入するなどして評価することができる。
　以上のことから、本タンパク質をコードするＤＮＡを作動可能に連結するカサラスGW6a遺伝子プロモーターやそれと同質のプロモーター活性を有する上記プロモーターを含むＤＮＡ断片（カセット）や、当該カセットを含むベクター、当該カセットを含む形質転換細胞も本明細書の開示に含まれる。
　本ベクターが導入される宿主細胞としての植物細胞としては特に制限はない。例えば、既に記載した各種の単子葉植物及び双子葉植物に由来の植物細胞を用いることができる。また、穀物植物由来の細胞であってもよい。植物細胞としては、例えば、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ハトムギ、ソルガム、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビなどの細胞が挙げられるが、好ましくは、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムが挙げられる。また、植物細胞には、懸濁培養細胞等の培養細胞の他、プロトプラスト、カルスも含まれる。また、植物細胞には、苗条原基、多芽体、毛状根などのほか、葉の切片等の植物体中の細胞も含まれる。
　本ベクターが、植物細胞に、外来性ＤＮＡとして本ＤＮＡを導入し発現させることを意図するとき、植物細胞で転写可能なプロモーターと当該プロモーターの制御下に作動可能に連結された本ＤＮＡとを備えることができる。さらに、ポリＡを含むターミネーターを含めることもできる。こうしたプロモーターとしては、上記下カサラスGW6a遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、例えば、本遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターが挙げられる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol.Biol. 23:567）などが挙げられる。また、本遺伝子を、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：387）やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、イネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol.GenGenet. 240:1）、イネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、シロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406）、パセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624）などが挙げられる。
　本ベクターは、また、本タンパク質を組換えタンパク質として、大腸菌、酵母、動植物細胞、昆虫細胞等の細胞の宿主細胞に生産させることを意図するものであってもよい。この場合には、本ベクターは、適当な宿主細胞で作動可能なプロモーターの制御下に本遺伝子を備えることができる。
　本ベクターは、当業者であれば、例えば、当業者に公知の各種プラスミドなど商業的に入手可能な材料を利用して構築することができる。例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などのほか、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本遺伝子を発現させるベクターを用いて構築することができる。本ベクターの植物細胞への導入については後述する。
（形質転換細胞及び形質転換植物体並びにこれらの作製方法）
　本明細書の開示によれば、本ベクターが導入されて、本遺伝子を保持する形質転換細胞も提供される。本明細書に開示される形質転換植物体は、こうした形質転換細胞を含んでいる。本形質転換体は、形質転換前に比較して本遺伝子の発現が増強されている。増強される本遺伝子は、植物体に内在する遺伝子であってもよいし、外来性の遺伝子であってもよい。これらの双方であってもよい。また、遺伝子の発現が増強されているとは、遺伝子の発現量（本遺伝子の一次転写産物の量ほか、本遺伝子がコードするタンパク質の生産量）が形質転換前よりも増大しているか、あるいは当該タンパク質の活性が形質転換前よりも増大していることを意味している。本遺伝子の発現の増強の結果、本遺伝子の発現量が増大するとともに本タンパク質の活性自体が増大していてもよい。
　本遺伝子の発現の増強の態様は、特に限定されない。例えば、植物細胞で作動可能なプロモーターと当該プロモーターによって作動可能に結合された本遺伝子とが、外来性ＤＮＡとして、植物細胞の染色体又は染色体外に保持される態様が挙げられる。プロモーターに連結される本遺伝子は、植物細胞に内在性のものであっても外来性のものであってもよい。なお、内在性の本遺伝子のプロモーターの活性を向上させるために、染色体上のそのプロモーター領域の全体又はその一部を置換等する態様、内在性遺伝子とともにプロモーター領域を置換する態様も挙げられる。
　本形質転換植物体は、本形質転換細胞から植物体を再生させることにより得ることができる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールによるプロトプラストへ遺伝子導入（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによるプロトプラストへ遺伝子導入（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）等の各種方法が挙げられる。また、転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられる。
　形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
　ゲノム上に本遺伝子が組み込まれた形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本明細書の開示には、既に説明した（１）本遺伝子が導入された植物細胞、（２）該細胞を含む植物体のほか、（３）該植物体の子孫およびクローン、並びに（４）該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
　このようにして作出された形質転換植物体は、子実の増大機能が付与又は向上され、千粒重が増加したものとなっている。
（遺伝子マーカー等）
　本明細書の開示によれば、上記（ａ）～（ｆ）のいずれかのＤＮＡの塩基配列またはその相補配列に対して相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカー及び遺伝子増幅剤が提供される。ここで「相補配列」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖の配列に対する他方の鎖の配列を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られないが、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列の同一性を有すればよい。このようなＤＮＡは、本遺伝子の検出や単離を行なうためのプローブなどの遺伝子マーカーとして、また、検出や単離等のために本遺伝子の増幅を行なうためのプライマーなどの遺伝子マーカーや遺伝子増幅剤として用いうる。
（植物体の子実増大剤）
　本明細書の開示によれば、既に開示した本遺伝子、本タンパク質、本ベクター及び形質転換細胞のいずれかを有効成分とする、植物体の子実増大剤が提供される。植物体の子実増大剤は、さらに、カサラスのGW6a遺伝子のプロモーター又はその同等物により制御可能に本遺伝子を備えるＤＮＡ断片（カセット）又はこの断片を含むベクターや形質転換細胞も本明細書に開示される子実増大剤として用いることができる。
（交配によって得られる植物体及びその作製方法）
　本明細書の開示によれば、交配によって、以下のＤＮＡのいずれかを含んで子実増大機能が付与された、インド型イネ「カサラス」以外の植物体が提供される。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；および
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA。
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ；及び
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　本植物体は、カサラスGW6aＤＮＡ及び当該ＤＮＡの他の態様のＤＮＡを、交配によって染色体上に備えるに至った植物体が挙げられる。典型的には、インド型イネ「カサラス」あるいはカサラスGW6a遺伝子を保有するその子孫を用いて交配によってカサラスGW6aＤＮＡが導入され保持された植物体が挙げられる。また、他には、カサラスのGW6a遺伝子を染色体上に備える至った形質転換植物体又はGW6a遺伝子を保有するその子孫を用いて、交配によって本遺伝子が導入され保持された植物体が挙げられる。
　本植物体は、上記（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを作動可能に、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるプロモーターを備えるものであってもよい。
　「カサラス」以外の植物体としては、双子葉植物であっても単子葉植物であってもよいが、イネ科植物等の穀物植物であることが好ましい。例えば、他のインド型イネのほか、「日本晴」を含む各種の日本型イネが挙げられる。こうした「カサラス」以外のイネとしては、特に限定されないで、例えば、コシヒカリ、ハエヌキ、アキタコマチ、ヒトメボレ、ヒノヒカリ等の日本型イネが挙げられる。
　交配による植物体は、例えば、一般的な育種方法において、カサラスのGW6a遺伝子（好ましくはプロモーター領域を含む）を保持する第１の親植物体としてインド型イネ「カサラス」を用いることで実施できる。すなわち、インド型イネ「カサラス」と任意の機能を有する第２の親植物体とを交配して本遺伝子を保持する新品種を作製する工程を備えることができる。ここで第２の親植物体、すなわち、カサラス以外の他の穀物としては、既に説明した各種のイネ科植物が好ましく適用される。本遺伝子を保持する植物体を選抜するには、子実の千粒重や粒長で選抜することも可能であるほか、「カサラス」と前記他の植物体との交雑体であるＦ１、当該Ｆ１と他の植物体との交雑体Ｂ１、Ｂ２等のいわゆる戻し交雑体において、本遺伝子マーカーを用いた本遺伝子の保持の有無により選抜することができる。なお、交配に用いる「カサラス」に換えて、本遺伝子、すなわち、GW6a遺伝子と相同遺伝子を有する他のイネ科植物などの植物体を用いることもできる。
　第１の親植物体は、また、上記（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを作動可能に、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるプロモーターを備えるものであってもよい。すなわち、第１の親植物体は、カサラスであってもよいし、その他の遺伝子工学的に遺伝子組換えされていない天然の植物体や形質転換植物体であってもよい。カサラスGW6a遺伝子のプロモーターはカサラスGW6a遺伝子の発現増強能力が高い。このため、交配によって得られる植物体は、子実増大機能が増強される。
　例えば、第１の親植物体をカサラスとするときなど、交配によってカサラスGW6aＤＮＡを備えるに至った植物体には、多くの場合、カサラスGW6a遺伝子の調節領域を含む領域が備えられている。すなわち、こうした植物体には、カサラスGW6aＤＮＡがカサラスGW6a遺伝子のプロモーター領域により制御可能に備えられている。
（植物体の子実の生産方法）
　本明細書に開示される植物体の子実の生産方法は、本形質転換植物体又は交配による植物体（以下、本植物体という。）を栽培する工程を備えることができる。本発明の生産方法によれば、千粒重が増加した、換言すれば、子実収穫量の多い植物体を得ることができ、種子をより多く収穫することができる。本生産方法は、さらに、前記本植物体の子実を収穫する工程を備えることができる。栽培工程及び収穫工程は、いずれも、当業者であれば、本植物体の種類に応じて適宜設定することができる。
（子実収量の調節方法）
　本明細書の開示によれば、植物体において、本遺伝子の発現を調節することを特徴とする、植物体の子実の収量を調節する方法が提供される。本明細書に開示の調節方法によれば、本遺伝子の発現を増強することで、種子を増大させて種子の収量を増大させることができる。また、本遺伝子の発現を抑制することで、種子を縮小させることができる。植物体において本遺伝子の発現を増強するには、既に説明したように、遺伝子工学的にあるいは交配によりかかる特性を有する植物体を作製することが挙げられる。また、植物体において本遺伝子の発現を抑制するには、例えば、植物体に内在する本遺伝子をアンチセンス法、リボザイム法、共抑制、ドミナントネガティブ等の当業者に公知の植物体における遺伝子の発現抑制方法を用いることが挙げられる。植物体に内在する本遺伝子に遺伝子工学的に変異等して不活性化してもよい。また、本遺伝子を有していないあるいは本遺伝子が機能していない植物体と交配させてもよい。
（子実増大機能の判定方法）
　本明細書の開示によれば、植物体の子実の増大機能を判定する方法が提供される。すなわち、被検植物体又はその一部における本遺伝子の発現解析を実施する工程を備えることを特徴とする、方法が提供される。「子実増大機能を判定する」とは、既存品種における子実増大機能の判定のみならず、交配や遺伝子組換え技術による新しい品種における子実増大機能の判定も含まれる。また、被検植物体の一部としては、植物の器官、組織及び細胞であってもよい。
　本判定方法によれば、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において特に利点を有する。植物体の子実増大機能の有無や程度を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本判定方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得る。
　本遺伝子の発現解析は当業者において周知の方法で実施することができる。例えば、被検植物体又はその繁殖材料からＲＮＡを含むＲＮＡ試料を調製し、この試料中のＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、その合成量に基づいて発現量を評価することができる。例えば、発現解析によって本遺伝子が発現されていないことやその発現量の少なさによってその被検植物体は、子実増大機能が欠損ないし抑制されていると判定できる。また、本遺伝子の発現又はその発現量の多さによって、その被検植物体は、子実増大機能を有しているあるいは増強されている、と判定できる。
　発現解析には、例えば、上記したプローブやプライマーを用いたＤＮＡマイクロアレイやリアルタイムＰＣＲなど公知の発現解析手法を適宜用いることができる。発現解析にあたっては、本遺伝子は、茎頂分裂組織や花芽において特異的に発現する傾向があるため、当該部分について発現解析することによっても、子実増大機能に関し判定することができる。
　以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
（子実増大機能を有する遺伝子の同定）
　QTL解析を行う雑種集団の親として、子実の粒長の差が明確であった日本型イネの「日本晴」と、インド型イネの「カサラス」を選択した。なお、植物体は、ペトリ皿内の水中で、３０℃、７２時間処理して発芽させた後、直径１０ｃｍ、高さ１３ｃｍのポットに移植した。種子を収穫して千粒重を測定した。
　「日本晴」と「カサラス」とを交雑したＦ１個体に日本晴を反復親とした戻し交雑と自殖を行って得られた戻し交雑自殖系統群（ＢＩＬ）９８系統について、千粒重を調査した。結果を図１に示す。図１に示すように、この系統群では、その千粒重は１９ｇ～３３ｇを示した。さらに、この系統群について千粒重に関するＱＴＬ解析を行った。その結果、図２に示すように、種子の千粒重を制御する遺伝子座を第２、第４及び第６染色体に検出した。これらのＱＴＬのうち、第６染色体長腕においてより千粒重の増加効果が強かった（図３）。
　第６染色体長腕上に座乗するＱＴＬの効果を検証するために、日本晴の染色体背景にカサラスの第６染色体長腕が置換した準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）ＳＬ２９を作出した（図４）。このＳＬ２９と日本晴とカサラスとを用いて、種子の千粒重を比較した。結果を図５及び図６に示す。図５には、籾付きでの千粒重を示し、図６には、玄米での千粒重を示す。図５及び図６に示すように、ＳＬ２９系統の種子は明らかに日本晴よりも粒長が増加するとともに、千粒重が約２０％増加していた。以上のことから、カサラスの第６染色体の長腕には種子のサイズないし千粒重を増加させる遺伝子があることがわかった。
　カサラスの第６染色体長腕に座乗するＱＴＬを特定するために、日本晴染色体背景に第6染色体のGW6a領域がカサラスに置換したCSSL29に日本晴を交雑したF1を作成し、その自殖系統のF2をポジショナルクローニングに供試した。結果を、図７に示す。図７に示すように、カサラスの持つ子実増大機能に関する遺伝子の候補領域を第６染色体上の分子マーカーＧ１１２とＧ１１３とに挟まれる領域に本遺伝子が座乗することがわかった。さらに、高精度連鎖解析を行った。その結果、図７に示すように、xj5453-20及びxj-5453-17に挟まれる４．０ｋｂを子実増大機能関連遺伝子として特定できた。子実増大機能関連遺伝子の候補領域につき遺伝子予測を行ったところ、一つの遺伝子が存在することがわかり、GW6a遺伝子と命名した。この遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードしており、そのｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１で表される。
　GW6a遺伝子が子実増大機能を有する遺伝子であることを証明するために、カサラス由来のGW6a遺伝子の日本晴への導入を試みた。すなわち、以下に示すようにして形質転換用プラスミドを構築し、形質転換した。得られた形質転換植物体の種子の粒長を評価した。結果を図８に示す。
（プラスミドの構築及び植物体の形質転換）
　カサラスのGW6a遺伝子が導入された形質転換体を作製するために、GW6a遺伝子を単離しバイナリーベクターpYLTAC7(理化学研究所より分譲)に導入した。このバイナリベクターを、アグロバクテリウムEHA105株にエレクトロポレーションで導入した。イネを、文献（Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. & Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282 (1994).）記載の方法で形質転換した。簡略して説明すると、DNA断片が導入されたアグロバクテリウムEHA105株を日本晴のカルスに感染させて導入し、形質転換植物体を、50mg/lハイグロマイシンを含有する培地で選抜した。ハイグロマイシン耐性植物体を土壌に移植し、３０℃で１６時間光条件／８時間暗条件で栽培した。
　図８に示すように、TAC7ベクターのみを形質転換した植物体から得られた種子の粒長を１００とすると、カサラス由来のGW6a遺伝子を導入した５種の個体では、１１０％から１３０％の範囲で粒長が増大していた。この結果から、GW6a遺伝子が子実増大機能を有する遺伝子であると結論づけた。
（GW6a遺伝子の機能の同定）
　GW6a遺伝子が属する分類とその配列の遺伝的変化を調べた。日本晴における対立遺伝子のGW6aタンパク質の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）とを比較することで、3つのエクソンと2つのイントロンを見出した（図９Ａ）。イネゲノム自動アノテーションシステム（The Rice Genome Automated Annotation System）はGW6aタンパク質を保存されたＧＮＡＴモチーフを有するGCN5関連N-アセチルトランスフェラーゼ様（GNAT like）タンパク質としてアノテーションした。GW6aタンパク質のORFにおける変化を同定するために、GW6aタンパク質の親の対立遺伝子のｇＤＮＡを比較し、９個の一塩基多型（SNP）を同定し、そのうち５個が４個のアミノ酸変異をひきおこしていることがわかった（図９Ａ及び図９Ｂ）。アミノ酸変異は、いずれも保存さGNATドメイン内に存在してなかった。すなわち、二つのGW6aタンパク質においてＧＮＡＴモチーフが保存されていた。
　次に、クエリとしてGW6aタンパク質の予測されたアミノ酸配列を用いて、the National Center for Biotechnology Information (NCBI) 及びRice Genome Research Program (RGP)のデータベースに対してシーケンスブラストを行った。結果を図１０に示す。その結果、GW6aホモログのすべては、植物界に限られていることがわかった。すなわち、Glycine max（大豆）の12個、Populus trichocarpa（黒ハコヤナギ）の７個、イネ、Brachypodium distachyon（紫偽ブロム）及びSorghum bicolor （モロコシ）にそれぞれ５個、 Hordeum vulgare（大麦）及びArabidopsis thaliana （シロイヌナズナ）及びVitis vinifera（ブドウ）にそれぞれ４個、Medicago truncatula（バレルクローバー）及びRicinus communis（トウゴマ）にそれぞれ３個、Zea mays（トウモロコシ）、Physcomitrella patens（菜種）及びSelaginella moellendorffii (スパイクモス；spikemoss)にそれぞれ２個、Brassica napus（苔）において１個であった。これらのホモログは、シロイヌナズナ胚軸の分化的細胞伸長において機能するHOOKLESS1遺伝子（AtHLS1、At4G37580）を除いて機能未知のタンパク質としてアノテーションされた。GW6aタンパク質における対立遺伝子における変異は、ホモログ間で、シロイヌナズナ間でおいてさえも高度に保存されているわけではなかった（図９Ｂ）。
　GW6a対立遺伝子の機能的影響を評価するために、GW6a_Nタンパク質及びGW6a_Kタンパク質のcDNA ORF及びGW6a対立遺伝子における一連のアミノ酸を交換したものを35Sプロモーターにより駆動して過剰発現させたトランスジェニック植物（イネ）（日本晴の対立遺伝子、GW6a N-OE、Kasalathの対立遺伝子、GW6a Ｋ-OE）及び書く対立遺伝子を特定部位で交換した４種のトランスジェニック植物を作製した（図１１）。得られたトランスジェニック植物の全てにおいてGW6aのmRNAのレベルとともにGWが上昇していた（図１２のＡ及びＢ、図１３のＡ及びＢ、図１４のＡ及びＢ）。対照的に、GW6a_N（全ORF）cDNAをアンチセンス方向で過剰発現させたトランスジェニック植物では、有意にGWが減少し、内在性GW6aのmRNAレベルが低下していた（図１２のＡ、図１２のＢ、図１３のＣ）。
　さらに、GW6a_N及びGW6a_K のcDNA ORFをシロイヌナズナ（COL）で過剰発現させたトランスジェニック植物では、GW6aタンパク質の転写量が増大するとともに、野生型におけるよりも大きく重い種子を生産した（図１５のＡ、Ｂ及びＣ）。
　これらの結果は、GW6aの二つの対立遺伝子はそれぞれ機能的であり、これらのDNAが、GWのためのコード領域を表していることがわかった。さらに、GW6aタンパク質は、シロイヌナズナのホモログと３２．６～４１．４％の配列同一性しか有していないのにかかわらず、単子葉植物と双子葉植物において種子のGW及び大きさに関して決定的で保存された役割を有していることがわかった。
　GNATタンパク質においてよく研究されたタンパク質であるGCN5はヒストンH3およびH4をアセチル化するHATとして機能することが報告されている（17）。GW6aタンパク質が機能HATとして動作するかどうかを調べるために、in vitroおよびin vivoのHATアッセイで行った。まず、大腸菌（Escherichia coli）における6 - ヒスチジン（6×HIS）GW6a融合タンパク質を発現させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いて精製したタンパク質を分析し、GW6aタンパク質は419残基をコードし、～46 kDaの分子量を有するポリペプチドであることを確認した。
　その後、精製したタンパク質をin vitroでのHATアッセイに供し、HIS-GW6a_NまたはHIS-GW6a_Kタンパク質を、アセチル-CoAとヒストンH3ペプチドの反応混合物とインキュべートした。その結果、ウェスタンブロットアッセイで特異的な抗体を用いてアセチル化ヒストンH3ペプチド（acH3）のバンドを強く検出した。対照としてHISタグのみを使用する以外は同様にアッセイしたところ、明確なacH3バンドは検出されなかった（図１６Ａ）。GW6aタンパク質は、in vitroでのHATアッセイにおいて、ヒストンH4ペプチドをアセチル化した（図１６Ｂ）。さらにこれらの反応の特異性を確認するために、HIS-GW6aタンパク質の濃度依存性試験を行ったところ、HIS-GW6aタンパク質濃度の増大に伴ってacH3及びacH4を強く検出した（図１６Ｃ、図１６Ｄ）。これらの結果は、GW6aタンパク質は、少なくとも、ヒストンH3およびH4に対してHAT活性を有することが示唆された。
　GW6aタンパク質の機能解析のために、日本晴の遺伝的背景に、GW6aにおける対立遺伝子において相違する二つの同質遺伝子系統（NILS）NIL-gw6a_NとNIL-gw6a_Kを栽培した。in vivoでのHATアッセイにおいて、それぞれのNILSの茎頂分裂組織（CSの組織）を含む約１cmの長稈の組織から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを用いて検出したところ、NIL-gw6a_NよりもNIL-gw6a_Kにおいてより強いacH3バンドを検出した（図１７Ａ）。また、GW6aを過剰発現またはノックダウンするトランスジェニックコンストラクトを含む若い苗全体から抽出した総タンパク質を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、ネガティブコントロールに対してGW6a-OEサンプルでヒストンH3 /H4の発現の促進を有意に検出した。しかし、GW6a-ASのサンプル中のヒストンH3／H4のアセチル化は著しく減少した（図１７Ｂ）。以上のことから、GW6a対立遺伝子はいずれも植物界においてHATとして機能していることがわかった。
（GW6a対立遺伝子における変異）
　二つのGW6a遺伝子に関するNILSに関し、半定量的RT-PCRと定量的逆転写PCRとを用いて、葉身、葉鞘、CSの組織、根、および幼穂を含む複数の主要な器官や組織におけるGW6a遺伝子の発現プロファイルを調べた。その結果、半定量的RT-PCR法では、GW6a転写物が、調べた器官や組織のすべてに出現した。また、GW6a遺伝子は、GWの制御における機能に従い、幼穂の段階で優先的に発現していた。発現レベルを比較すると、NIL-gw6a_Nより、NIL-gw6a_K遺伝子型のNILにおいてより高く発現していることがわかった（図１８）。定量的RT-PCRの結果も同様であった（図１９Ａ）。以上の結果は、NIL-gw6a_KとGW6a-OEのサンプルでアセチル化が強化されており、GW6a遺伝子の発現の促進がアセチル化に寄与していることを示唆している。
　GW6a対立遺伝子の発現の相違の原因を確認するために、ホモ接合トランスジェニック植物を用いて全体の配列を比較した。一つの組換え事象は、XJ-17付近で発生しており、他方は、ATG翻訳開始部位の近くのプロモーター領域に存在していた（図１９Ｂ）。こうした遺伝子的証拠によれば、GW6a座をそのプロモーター領域内として判定できた。このことは、RT-PCRやrRT-PCRの結果とよく整合し、対立するGW遺伝子分離は調節領域に起因することを示唆した。
　KasalathのGW6a対立遺伝子のプロモーター領域の塩基配列（配列番号７）と日本晴のGW6a対立遺伝子のプロモーター領域の塩基配列（配列番号８）とを対比すると、以下に示すように、様々なＳＮＰが存在していることがわかった。日本晴のGW6a対立遺伝子の候補プロモーター領域内推定のE-boxモチーフ（CAGCTG）を同定したが、Kasalathの対立遺伝子には欠けていた（-592 - 587；図１９Ｂ）。以下の変異は日本晴のGW6aプロモーター配列に対するカサラスのGW6aプロモーター配列における変異を表す。
（１）－１６２６位～－１６０５位（ＡＴＣＴ ＧＡＴＧ ＣＴＡＴ ＴＣＧＴＴＣＡＡ ＡＡ欠損）
（２）－１６０４位～－１６０２位（ｘｊ－１７）（ＧＡＡ欠損）
（３）－１４５１位（ＴtoＣ）
（４）－１３５７位（ＴtoＧ）
（５）－８６８位（Ｔ欠損）
（６）－８５５位（ＧtoＡ）
（７）－７３９位（ＴtoＣ）
（８）－６４１位（ＴtoＣ）
（９）－６３２位（Ｇ挿入）
（１０）－６３０位（ＡtoＣ）
（１１）－６２１位（Ｔ挿入）
（１２）－６２０位）（Ｔ挿入）
（１３）―５９２位～－５８７位（ＣＡＧＣＴＧ欠損）
（１４）－４９４位（Ａ挿入）
（１５）－４９３位（Ｃ挿入）
（１６）－３９５位（Ｇ挿入）
（１７）－９２～－９０位（ＡＧＣ欠損）
（１８）－６９位（ＡtoＴ）
　遺伝子発現に対する制御領域の個々のセグメントの効果を評価するために、トウモロコシの葉のプロトプラストについてトランジェントアッセイを行った。日本晴pGW6a_N遺伝子とKasalath pGW6a_K遺伝子のプロモーターセグメントをカリフラワーモザイクウイルス（mpCaMV）の最小プロモーターの代わりに、ホタルルシフェラーゼORF（LUC）とノパリンシンターゼ（NOS）ターミネーターの上流に、レポーターコンストラクトにクローニングした（図２０）。
　相対ルシフェラーゼ発現は、エレクトロポレーションを介したトウモロコシプロトプラストへのトランスフォーメーション後に評価した。図２０に示すように、GW6aプロモーターは最小限プロモーターの場合に対して著しく高いルシフェラーゼ発現し、特にpGW6a_NコンストラクトよりpGW6a_Kコンストラクトの場合が２倍のLUCレポーター発現を生じた。これらの結果は、RT-PCRや定量RT-PCRのデータと同様であり、GW6aカサラス対立遺伝子プロモーターは日本晴アレルのそれより大きい活性を有することを確認した。
　さらに、我々は GW6a_NとGW6a_Kプロモーター::β-グルクロニダーゼ（GUS）レポータークローンを発現するトランスジェニックイネ植物（以下、pGW6a_N-GUSとpGW6a_K-GUS）を分析した。図２１に示すように、GUSシグナルは、CSの組織や幼穂で一貫して存在していた。また、図２１に示すように、GUSシグナルは、pGW6a_N-GUSよりpGW6a_K-GUSのクローンを含有するトランスジェニック植物でずっと強かった。さらに、図２２に示すように、植物体全体から抽出したタンパク質を用いたGUSシグナルの定量結果により、pGW6a_N-GUSを含む植物に比べて、pGW6a_K-GUS含む植物体が２～３倍大きいシグナルを呈した。これらの結果は、これまでの遺伝的証拠に整合しており、日本晴アレルに対して、GW6aカサラス対立遺伝子のプロモーター活性が強い、ことを確認できた。
　GW6aの特異的な発現パターンを確認するために、苗木や若い花序の組織切片についてGW6a mRNAのin situハイブリダイゼーションを行った。図２３に示すように、GW6a mRNAは、栄養相葉の背軸側の基底部に存在していた（図２３、ａ、ｅ）。同様の発現パターンは、生殖期、苞全体の背軸側の基底部で観察された（図２３、ｂ、ｃ、ｆ、ｇ）。一次および二次枝の分化段階では、GW6a mRNAの蓄積が初期枝の苞において観察された（図２３、ｂ、ｆ）。加えて、GUS染色で観察されるように、Kasalathの遺伝子型GW6a mRNAは、日本晴の遺伝子型より強い発現を示した。これらの結果は、GW6a遺伝子の調節の変化、すなわち、転写レベルでの違いは、GW6a対立遺伝子によって付与されるGW /サイズの対立遺伝子の表現型の変化につながることを示した。
（GW6aによる小穂外皮のセル数の変更）
　GWの変化の起源を明らかにするために、２つのGW6a NILS、日本晴、CSSL29及びKasalathにつき、長さ、幅、およびの厚さを含む穀物の形状成分の定量分析を行った。結果を図２４に示す。図２４に示すように、NIL-gw6a_Nに対して、NIL-gw6a_Kにおいて粒長の大幅な増加（7.4％増）、粒幅の低い増加（4.3％増）及びほぼ同一の粒厚さを認めた。また、同様に、日本晴に比べ、CSSL29がより大幅な粒長の増加（9.2パーセント）、粒幅の低い増加（6.3パーセント）及び統計的に変化ない粒厚さを認めた。また、図２４に示すように、CSSL29では、その粒幅と厚さがKasalathを超え、粒長は、Kasalathに匹敵するものであった。これらの結果は、粒形コンポーネントで、粒長は日本晴でGWの変化を引き起こす主な要因であったことを示している。
　さらに、図２５Ａ及び図２５Ｂに示すように、NIL-gw6a_K小穂の殻はNIL-gw6a_Nプリ受精に比べて統計的に長かった（P = 1.39×10-5）。走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、内側の表皮細胞、特に外花穎の中央部を検査した。その結果、図２５Ｃ～図２５Ｅに示すように、NIL-gw6a_Kに関し、長手方向で表皮細胞の平均細胞長（125.6μm、n = 496）は、NIL-gw6a_N（126.3μmのは、n = 499）とは有意差はみられなかった（P = 0.43）。対照的に、図２６に示すように、CSSL29の表皮細胞の長さ（118.9μm、n = 478）は日本晴（128.9μmのは、n = 430、P <0.005、相対的に短かかった。これらの結果は、GW6aは、粒長さの変化の起因として小穂籾殻中の細胞の数を変更したことを示している。
（GW6aによるGW、歩留まり及び植物バイオマスの増大）
　穀物生産におけるGW6aの効果を評価するために、２つのGW6a NILSの間に収量に関するいくつかのコンポーネントの特性を比較した。図２７のＡ～Ｄに示すように、NIL-GW6a_Kは大幅に増加したGW（8.3パーセント、Pを= 1.55×10-4）及び茶色GW（6.2パーセント、P = 2.12×10-3）を有していた。また図２７のＥ及びＦに示すように、NILS間でメイン穂当たり粒数と個体当り穂数は統計的な差は認められなかった。図２７のＧに示すように、予想通り、NIL-gw6a_Kの植物あたりの穀物収量は15.8％増加していた（P <0.05）。これらの結果は、GW6a遺伝子座が穀物の収量を促進することができたことを示している。
　さらに、図２７のＨ及びＩに示すように、NIL-GW6a_Kでは、そのバイオマス量も顕著に増大しており、GW6aがバイオマス量全体に寄与することを示していた。すなわち、GW6aとGW6b座とを持つ植物であるCSSL29は、コントロールである日本晴に対して大幅に強化された穀物収量のための大きな可能性を持っていた。NIL-gw6a_KとCSSL29植物体はそれぞれ、NIL-gw6a_Nと日本晴に比べ著しく背が高かった（図２７のＨ、Ｉ、図２８のＤ、Ｅ）。このため、GW6aも草丈（PH）を調節している可能性を調べた。図２９のＡに示すように、GW6a遺伝子座を定義する重要ないくつかの組換え体の表現型の解析によれば、このQTLは、PHに責任があることを示唆した。図２９のＢに示すように、早期播種の段階では、GW6a_N-OEコンストラクトを保有するイネは、NIL-gw6a_Nのものをリードしていた。また、GW6aノックダウン（GW6a-AS）コンストラクトを有するトランスジェニック植物体は相対的にさらにゆっくり成長した。さらに、図２９のＤ及びＥに示すように、双方の親の対立遺伝子を過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナは幼苗期中に成長促進を示した。
　これらの結果は、GW6aが植物生長を制御するという考えを支持している。さらに重要なことに、図２７のＪに示すように、標準的な条件下の水田で栽培したときに、NIL-gw6a_KはNIL-gw6a_Nよりも優れた植物当たりバイオマスを示した。同時に、図２８のＦに示すように、CSSL29は日本晴より大きい植物当たりバイオマスを持っていた。まとめると、これらの結果は、」GW6aはそのユビキタス発現パターンに沿ったもので、穀物の収量と植物バイオマスという少なくとも二つの有益な形質に寄与する多面的な遺伝子座であることを示唆している。以上のことから、GW6aは、子実及びバイオマスの収量増大に関わる高収量品種改良のための遺伝子座であることがわかった。
（GW6aタンパク質のさらなる機能：転写因子）
　従来より、HATには、タイプＡとタイプＢとがあることが知られている。細胞質局在性のタイプＢのHATは、核に導入されクロマチンに組み込まれる前に細胞質内で新たに合成されたヒストンをアセチル化し、タイプＢのHATは、転写関連のアセチル化を触媒する核酵素である（2、19）。GW6aタンパク質の細胞内局在性を検討するために、35S ::緑色蛍光タンパク質（GFP）-GW6a融合コンストラクトを作製し、タマネギ表皮細胞における一過性発現を行った。結果を図３０Ａに示す。図３０Ａに示すように、GFP-GW6aは、核内に局在していた。このため、GW6aが出力形質を制御する転写調節因子として機能する作用型のHATであることを仮定した。
　次に、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して、GW6aの2 NILSのトランスクリプトームを比較した。過剰アセチルクロマチンは、転写的に活性であるとの見方（2、20）に基づき、NIL-gw6a_Kにおいて高度に発現が亢進された遺伝子に着目した。その結果、NIL-gw6a_K では、833～1,167遺伝子、全遺伝子に対して3.1から4.3パーセントが有意に少なくとも1.5倍に発現が亢進されたことがわかった（３回の繰り返しに基づく）。これに対してNIL-gw6a_Nでは、共通する441の遺伝子が亢進されていた。
　さらに、これら441遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）タームエンリッチメントを検討した。その結果、図３０Ｂに示すように、転写調節、脂質輸送、およびオーキシンを介したシグナル伝達経路としてのRNAの生合成に関与する遺伝子に関連したGOタームエンリッチメントを観察した。したがって、GW6aは脂質輸送に影響を及ぼす、転写調節因子として主に機能することが示唆された。
　そこで、2つのGW6a NILSで５つの穀物品質特性（脂肪、タンパク質、炭水化物、水、ミネラル、Na+含量）を評価した。その結果、図３０Ｃに示すように、GW6aは米粒内における脂質輸送及び脂質蓄積に影響を与えることがわかった。この結果は、マイクロアレイ解析をサポートするものであった。タンパク質やミネラル含量には、NILS間で差は認められなかったが炭水化物含有量は小さいが有意な増加がことを考えると、Kasalathの遺伝子型のカサラスGW6a対立遺伝子が高収量の繁殖のために有用であることが示唆された。
　さらに、日本晴とＣＳＳＬとの食味について官能試験を行った。官能試験は、両者を同様に白米まで精米して、同一条件で一般的な手法により市販の炊飯器を用いて炊飯し、官能試験に熟練した複数の試験者により、その食味について評価することにより行った。その結果、日本晴とＣＳＳＬは、食味の官能評価は同等であった。以上のことから、GW6a遺伝子を増強しても、親植物の子実やバイオマスを増大するが、子実等の可食性部位の食味を変化させることがないことがわかった。
　転写調節因子は、栽培や育種において重要な役割を担うとされている。そこで、GW6aがコメの栽培や近代の育種において人間による選別対象になってきた否かを調べた。すなわち、GW6aの３つの領域、O. sativaとO. rufipogonにおけるGW6aプロモーター；GW6a遺伝子から上流へ５０ｋｂまでの領域；GW6a遺伝子から下流へ６０ｋｂまでの領域につき、遺伝的変異を解析した。結果を図３１に示す。その結果、日本晴またはKasalathのGW6a対立遺伝子のいずれにおいても、選択シグナルは見出されず、GW6a対立遺伝子は、人間の選択によって開発されていないことがわかった。また、50のインディカ品種のうち26品種がGW6aプロモーター領域を備えるKasalath型のGW6a対立遺伝子を持っていたのに対し、ジャポニカ品種はいずれも、Kasalathの対立遺伝子を持っていなかった。さらに、インディカ品種間におけるGW6a対立遺伝子の地理的分布には偏りがなかった。以上のことから、今まで知られていないGW6aインディカ対立遺伝子が、穀類を含む作物において、特にジャポニカ品種で、作物の農業形質（大きさ、重量等）を改善するための潜在的なツールになり得ることがわかった。
（試験方法）
以下に、上記実施例に関して用いた試験方法を記載する。
（イネの遺伝子組換えアッセイ）
　GW6a軌跡を定義するマーカーXJ-6、XJ-11を使用して、独立行政法人農業生物資源研究所におけるKasalathのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性のBACクローン：BAC_K0242A07を同定した。BAC_K0242A07は制限酵素HindIIIを用いて消化して部分的に分離・回収し、ベクトルpYLTAC7（２７）に挿入した。適切なクローンを配列分析によって確認し、イネの遺伝子組換えアッセイのために使用し、前述したように行った（２８）。 GW6aがアンチセンス方向にGW6a_N cDNAのORFを挿入することによってダウンレギュレートされたのに対し、全長GW6a cDNAのORFは、日本晴とCSSL29植物の両方のCS組織（テキストを参照）から増幅し、過剰発現GW6aに対する植物バイナリベクターPHB（７）にクローニングした。同様に、GW6aアレルのシリーズでスワッピングアミノ酸（図１１）は内因性の制限酵素消化から選択してから、同じバイナリベクターにクローニングされた混合された対立遺伝子特異的なテンプレートのPCR増幅により得た。
（GW6aを発現するトランスジェニックシロイヌナズナの世代）
　日本晴とKasalathからびGW6aのコード領域は、ゲートウェイバイナリにプライマー5 'CACCATGGTGGAGACGACGACG-3'および5 'TTAGAACTCGCGGGGGTCGACG-3'、pENTR / D-TOPOベクター（Invitrogen）、シークエンスにライゲーションを用いたPCRによって増幅され、シーケンスされ、LRクロナーゼ（Invitrogen）を用いてpBA002-HA（２９）の誘導体であるベクトルpBA002Gw-HAに組み込まれた。これらのコンストラクトは、フローラルディップ法（３０）を使用して、シロイヌナズナに導入した。ホモ接合T3の子孫を、実験に使用した。
（cDNAの分離とRT-PCR解析）
　全RNAを、製造者の説明書に従って、可能性あるゲノムDNA汚染を除去するために組換えDNase I（RNaseフリー、宝酒造）を用いて消化し、その後RNeasy Plant mini Kit（QIAGEN社）を用いて単離した。得られた全RNAは2000光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で定量した。第一鎖のcDNA合成のために、メーカーの標準プロトコルに従い、サンプルあたりの総RNA2μgに対してOmniScript逆転写酵素（QIAGEN）を用いて逆転写に使用した。次に、合成したcDNAをMilli-Q水で1:5に希釈し、半定量的RT-PCRおよび定量RT-PCRのために直接供した。定量RT-PCRは、SYBRグリーンPCRマスターミックス（Bio-Rad）を用いてCFX96リアルタイムPCRシステム（Bio-Rad社製）上で行った。特に断りのない限り、半定量的RT-PCR及び定量RT-PCRに用いた全てのサンプルは、CS組織に由来した。定量RT-PCRに用いたプライマーは図３２にリストされており、相対的な発現レベルをUBQのものに標準化した。各試料を3回繰り返した。
（HAT活性のためのタンパク質調製およびアッセイ）
　in vitroでのHATアッセイと同様に、日本晴またはKasalathのGW6a対立遺伝子をコードするcDNAのORF をpET32a（+）にクローン化した。大腸菌BL21（DE3）pLysS Rosetta-gami 2（Novagen社製）が組換えタンパク質6×HIS-GW6a_Nと6×HIS-GW6a_K を得るために使用された。これらの融合タンパク質の誘導および精製は、製造者のプロトコルに記載されている。
　蛍光HATアッセイキット（アクティブモティフ）を購入し、取扱説明書に準じてアッセイを行った。すなわち、5×HATのアッセイバッファー、0.5mMのアセチルCoA 2μl、ヒストンH3またはH4ペプチド ３μｇ、指示された容量の精製された融合又はHISタグタンパク質を含む３０μｌの反応混合物を、2時間、30℃でインキュベートした。各反応混合物の3分の1、すなわち10μlを、15％のSDS-PAGEに溶かし、アセチル化ヒストンH3-H4または（anti-acH3/H4、ミリポア）に対する抗体を用いたウェスタンブロット法に供した。HISタグまたはHIS-GW6aは、HISタグに対する抗体（MBL）を用いて検出した（図１６Ａ）。生体内のHATアッセイでは、20日齢の苗の植物全体またはCS組織（茎頂分裂組織を含む、1cmまでの長稈の組織）の粗タンパク質抽出物を調製した（31）。ウェスタンブロットは、抗acH3または抗acH4抗体を使用してプロービングした。
（インサイトゥRNAハイブリダイゼーション）
　cDNA断片を図３２に記載されているおよびpBluescript II SK +およびpBluescript II KS +ベクターは、線状化し、ジゴキシゲニン標識センスおよびアンチセンスプローブを作るために使用され、それぞれ両方にクローニング設定GW6a特異的プライマーを用いたRT-PCRにより増幅した。サンプルの固定、切片、およびin situハイブリダイゼーション（32）は、他の箇所に記載のように行った。
（細胞内局在とGW6aプロモーターGUS解析）
　CaMV 35Sプロモーターの制御下で作動するGFP:: GW6aインフレームフュージョンコンストラクトを構築した。コンストラクトの導入は、PDS-1000/He装置（Bio-Rad）を用いてタマネギ表皮細胞に打ち込んだ。4'、6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI、PH7.0）をタマネギ表皮細胞の核を染色し、その後、ツァイスLSM700共焦点レーザー顕微鏡で試料中の一過性の発現を調べた。図３２に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅により、両方の親からのゲノムDNAからGW6aプロモーターセグメントを増幅した。増幅産物の塩基長は、1681bp（pGW6a_N）及び1652bp（pGW6a_K）であった。
　次に、これらのセグメントを、GUSレポーター遺伝子の発現を駆動するためにバイナリベクターpCAMBIA1300に挿入し、プラスチドpGW6a_N-GUS及びpGW6a_K-GUSを作製し、これらのコンストラクトを導入したトランスジェニックイネ植物を作製した。トランスジェニック植物の組織や器官のGUS染色を行った（33）。 pGW6a_N-GUSとpGW6a_K-GUSの20日齢の全体トランスジェニック植物を、以下の粗タンパク質の抽出に抽出緩衝液中でホモジナイズした（山本ら、31）。GUS活性を定量化するためＭＵＧアッセイは、Geらに従って行った（34）。
（トウモロコシ葉プロトプラストにおける一過性発現アッセイ）
　XhoIおよびBamHIによる消化後、結果として得られたpGW6a_NとpGW6a_K断片をレポーターコンストラクトNBS-LUCに挿入し、最小限35Sプロモーターをそのインサートで置換した（35）。トウモロコシ葉のプロトプラストを用いた一過性発現アッセイはステューダーらによって記述されたプロトコルを使用して行った（36）。レポーターアッセイは少なくとも3回繰り返して同様の結果を得た。各繰り返しにつき、各コンストラクトあたり３回反復実験を行った。
（SEMによる組織学的検査）
　２つのGW6aニルスの小穂籾殻は受精する前に収集した。その後、FAA溶液（50％エタノール、5％氷酢酸、5％ホルムアルデヒド）に固定した。小穂籾殻の外花穎の内側の表皮細胞を走査型電子顕微鏡（SEM；S-3000N、日立、東京）を用いて観察した。外花穎の中心部に位置する4平方ミリメートル領域を撮影し、外花穎当たり50以上の細胞につきは、ImageJソフトウェア（37）を用いて測定した。
（推定GW6aホモログの配列解析）
　クエリとしてGW6a_N（日本晴のGW6a対立遺伝子）のアミノ酸配列を用いて、GenBank（NCBI）およびRGPデータベースに対してBLAST検索を行った後、60個の GW6a推定ホモログを同定した。これらのタンパク質の配列（図１０）はClustal W2計算を用いたparallel editor functionでGENETYX（ver. 10）を用いてアラインメントさせた。
（マイクロアレイ実験）
　GW6aの2 NILSの20日齢の苗のCS組織から単離した全RNAを、マイクロアレイ実験に用いた。GW6aトランスクリプトームプロファイル分析用のAgilent-015241イネ遺伝子発現4×44Kマイクロアレイ（アジレント・テクノロジー）を使用した。 T7 RNAポリメラーゼを用いて転写されたRNAはCy3又はCy5で標識した。マイクロアレイデータの再現性を確保するために、３つの試料について染料交換を行った。RNA標識、マイクロアレイハイブリダイゼーション、およびデータ分析は下野らに従って行った（38）。
（遺伝子オントロジー分析）
　遺伝子オントロジー分析のために、共通して亢進した441遺伝子を選択した。使用したのGOタームのカテゴリはGrameneオントロジーデータベース（http://www.gramene.org/plant_ontology/index.html）に従った。各カテゴリ内の遺伝子の数はコメオリゴヌクレオチド配列データベース（http://www.ricearray.org/index.shtml）を使用して、GOエンリッチメント分析を用いて計算した。P-値は、超幾何分布によって算出した（39）。
（遺伝的多様性と合体シミュレーション分析）
　GW6a領域における遺伝的多様性解析のために、50のインディカ品種（栽培種）、14のジャポニカ品種（栽培種）（http://www.gene.affrc.go.jp/databases-core_collections_wr_en.php）及び３４品種のO. rufipogonのイネのアクセッション情報のセットを用いた。アクセッション情報から、その3つのサイトにおいて配列を利用した。すなわち、GW6aプロモーター領域、GW6a遺伝子本体の50キロバイト上流と60キロバイトの下流である。これらの配列及びDnaSP 5.1（40）を使用して栽培グループとO. rufipogonとのヌクレオチド多様性を評価した。GaoとInnan（41）に記載されている方法で、栽培の二人口モデルと合体したシミュレーションを行った。
　以下に開示される文献における全ての開示は、引用により本願の一部に組み込まれるものとする。以下の文献に付される番号は、本願明細書において適宜参照される。
（１）T. Jenuwein, C.D. Allis, Science 293, 1074 (2001).
（２）S. Y. Roth et al., Annu Rev Biochem 70, 81 (2001).
（３）T. Kouzarides, Cell 128, 693 (2007).
（４）S. Kaluarchchi, Duffy et al., Cell 149, 936 (2012).
（５）< http://www.fao.org/index_en.htm, http://www.wfp.org/>
（６）P.A. Sanchez, M.S. Swaminathan, Science 307, 357 (2005).
（７）C. Fan et al., Theor Appl Genet 112, 1164 (2006).
（８）X. J. Song et al., Nat Genet 39, 623 (2007).
（９）Y. B. Li et al., Nat Genet 43, 1266 (2011).
（１０）X. Huang et al., Nat Genet 41, 494 (2009).
（１１）S. K. Wang et al., Nat Genet 44, 950 (2012).
（１２）A. Shomura et al., Nat Genet 40, 1023 (2008).
（１３）S.Y. Lin, T. Sasaki, M. Yano, Theor Appl Genet 96, 997 (1998).
（１４）K. Ishimaru, Plant Physiol 133, 1083 (2003).
（１５）Rice Genome Automated Annotation System, available at http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp/.
（１６）A. Lehman, R. Black, J.R. Ecker, Cell 85, 183 (1996).
（１７）M. H. Kuo et al., Nature 383, 269 (1996).
（１８）F. Li et al., Cell Res 20, 838 (2010).
（１９）J. E. Brownell, C.D. Allis, Proc Natl Acad Sci 92, 6364 (1996).
（２０）B. Li et al., Cell 128, 707 (2007).
（２１）R. M. Imoberdorf et al., Mol Cell Biol 26, 1610 (2006).
（２２）H. Li et al., Dev Cell 7, 193 (2004).
（２３）G. Kim et al., Genes Dev 12, 2381 (1998).
（２４）J. F. Doebley et al., Cell 127, 1309 (2006).
（２５）F. Y. An et al., Cell Res 22, 915 (2012).
（２６）Y. Okada et al., Blood 104, 2027 (2004).
（２７）G.Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6535 (1999).
（２８）A.Nishimura et al., Nat Protocols 1, 2796 (2006)
（２９）I. Jang et al., Genes Dev. 19, 593 (2005)
（３０）S. J. Clough et al., Plant J. 16, 735 (1998)
（３１）Y. Yamamoto et al., Plant Cell 22, 3589 (2010)
（３２）H. Kouchi et al., Mol. Gen. Genet. 238, 106 (1993)
（３３）D. Lagarde et al., Plant J. 9, 195 (1996)
（３４）L. Ge et al., Plant Cell 22, 1749 (2010)
（３５）S. Yanagisawa et al., Nature 425, 521 (2003)
（３６）A. Studer et al., Nat Genet 43, 1160 (2011)
（３７）M.D. Abramoff et al., Biophotonics Int. 11, 36 (2004)
（３８）M. Shimono et al.,Plant Cell 19, 2064 (2007)
（３９）S.M. Brady et al., Science 318, 801 (2007)
（４０）P. Librado, J. Rozas, Bioinformatics 25, 1451 (2009)
（４１）L. Z. Gao, H. Innan,Genetics 179, 965 (2008)

Claims (22)

  1. 　穀物の子実を増大させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
    （ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
    （ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
    （ｆ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  2. 　前記ＤＮＡは、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかである、請求項１に記載のＤＮＡ：
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA；および
    （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
    （ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項１又は２に記載のＤＮＡを含むベクター。
  4. 　請求項１又は２に記載のＤＮＡを保持する形質転換植物細胞
  5. 　前記形質転換細胞が単子葉植物又は双子葉植物に由来する、請求項４に記載の細胞。
  6. 　イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ハトムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ又はサトウキビである、請求項５に記載の形質転換植物細胞。
  7. 　請求項４～６のいずれかに記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
  8. 　前記ＤＮＡがコードするタンパク質の発現が増強されている、請求項７に記載の形質転換植物体。
  9. 　子実増大機能が付与された請求項７又は８に記載の植物体。
  10. 　バイオマス増大機能が付与された、請求項７～９のいずれかに記載の植物体。
  11. 　請求項７～１０のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
  12. 　請求項７～１０のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
  13. 　請求項７～１０のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１又は２に記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
  14. 　請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
  15. 　請求項１に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子マーカー。
  16. 　以下の（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを含んで、子実増大機能が付与された。インド型イネ「カサラス」以外の植物体。
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
    （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
    （ｆ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  17. 　前記植物体が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１６に記載の植物体。
  18. 　以下の（ａ）～（ｆ）のＤＮＡを備える第１の親植物体と、任意の機能を有する第２の親植物体とを交配して、前記ＤＮＡを保持する新品種を作製する工程、を備える、植物体の作製方法。
    （ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
    （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｅ）配列番号１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
    （ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  19. 　前記第１の親植物体は、前記（ａ）～（ｆ）のＤＮＡのいずれかを作動可能に、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなるプロモーターを備える植物体である、請求項１８に記載の方法。
  20. 　さらに、前記作製工程は、請求項１５に記載の遺伝子マーカーを用いて前記新品種を選抜することを含む、請求項１８又は１９に記載の作製方法。
  21. 　請求項７～１１、１６及び１７のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、植物体の種子の生産方法。
  22. 　配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で表される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号７と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる群から選択されるいずれかのＤＮＡからなり、以下のＤＮＡの発現増強活性を有するプロモーター。
    （ａ）配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
    （ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および
    （ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｅ）配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ。
    （ｆ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113151575A (zh) * 2021-06-04 2021-07-23 中国水稻研究所 一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011681A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Basf Plant Science Gmbh Yield increase in plants overexpressing the hsrp genes
JP2007049994A (ja) * 2002-11-13 2007-03-01 Honda Motor Co Ltd 穀物の収量を増加させる遺伝子、並びにその利用
WO2009000789A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Cropdesign N.V. Yield enhancement in plants by modulation of maize myb-ada2 gene
JP2010115176A (ja) * 2008-11-14 2010-05-27 National Institute Of Agrobiological Sciences 穀物の種子を増大させる遺伝子、並びにその利用
WO2010127969A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and/or enhanced abiotic stress tolerance and a method for making the same
JP2011101622A (ja) * 2009-11-11 2011-05-26 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物体の子実を増大させる遺伝子、並びにその利用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007049994A (ja) * 2002-11-13 2007-03-01 Honda Motor Co Ltd 穀物の収量を増加させる遺伝子、並びにその利用
WO2007011681A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Basf Plant Science Gmbh Yield increase in plants overexpressing the hsrp genes
WO2009000789A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Cropdesign N.V. Yield enhancement in plants by modulation of maize myb-ada2 gene
JP2010115176A (ja) * 2008-11-14 2010-05-27 National Institute Of Agrobiological Sciences 穀物の種子を増大させる遺伝子、並びにその利用
WO2010127969A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-11 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and/or enhanced abiotic stress tolerance and a method for making the same
JP2011101622A (ja) * 2009-11-11 2011-05-26 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物体の子実を増大させる遺伝子、並びにその利用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 16 February 2008 (2008-02-16), SASAKI,T. ET AL.: "Oryza sativa Japonica Group genomic DNA, chromosome 6, PAC clone:P0453H04.", accession no. P005453 *
KONSTANTINOS E. VLACHONASIOS ET AL.: "Disruption Mutations of ADA2b and GCN5 Transcriptional Adaptor Genes Dramatically Affect Arabidopsis Growth, Development, and Gene Expression", THE PLANT CELL, vol. 15, no. 3, 2003, pages 626 - 638, XP002496617, DOI: doi:10.1105/tpc.007922 *
LONGBIAO GUO ET AL.: "Genetic Analysis and Fine Mapping of Two Genes for Grain Shape and Weight in Rice", JOURNAL OF INTEGRATIVE PLANT BIOLOGY, vol. 51, no. 1, 2009, pages 45 - 51 *
MOUSSA BENHAMED ET AL.: "Genome-scale Arabidopsis promoter array identifies targets of the histone acetyltransferase GCN5", THE PLANT JOURNAL, vol. 56, no. 3, 2008, pages 493 - 504 *
NOORTJE KORNET ET AL.: "Members of the GCN5 Histone Acetyltransferase Complex Regulate PLETHORA-Mediated Root Stem Cell Niche Maintenance and Transit Amplifying Cell Proliferation in Arabidopsis", THE PLANT CELL, vol. 21, no. 4, 2009, pages 1070 - 1079 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113151575A (zh) * 2021-06-04 2021-07-23 中国水稻研究所 一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用

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