DE112008000275T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und/oder erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

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Abstract

Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das NAP1-like Polypeptid eine NAP-Domäne umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von verschiedenen wirtschaftlich wichtigen Ertragsmerkmalen und/oder erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress in Pflanzen. Genauer ausgedrückt befasst sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Yield Enhancing Protein (YEP) kodiert, in Pflanzen. Das YEP stammt aus der Gruppe Nucleosome Assembly Protein 1-artiges Polypeptid (NAP1-like), Like Sm Polypeptid (Lsm-Protein), verkürztes Cyclin H-(CycHTr-)Polypeptid, Remorin-Polypeptid und DREB-Protein. Die vorliegende Erfindung befasst sich auch mit Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für solch ein YEP kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Erfindung stellt auch bis jetzt unbekannte YEP-Kodiernukleinsäuren und Konstrukte, die diese umfassen, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Dadurch, dass die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft vorhanden ist, wird die Wissenschaft gezwungen, sich mit der Verbesserung der Schlagkräftigkeit der Landwirtschaft zu befassen. Bei traditionellen Mitteln für die pflanzen- und gartenbauliche Züchtung verwendet man Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Erbmaterial von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (typischerweise in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Pflanzen, auch Kulturpflanzen, mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen zu produzieren.
  • Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen von vielen Pflanzen wichtig für die menschliche und tierische Ernährung sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle von Zuckern, Ölen und vielen Arten von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimpflanzen). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; er erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
  • Bei Futterpflanze wie Luzerne, Siliermais und Heu stellt die pflanzliche Biomasse den Ertrag. Bei Kornfrüchten wurden viele stellvertretende Parameter für den Ertrag verwendet. Die wichtigsten darunter sind Schätzer der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielerlei Art und Weise je nach der Art und dem Entwicklungsstadium gemessen werden, dazu zählen Gesamtpflanzentrockengewicht, Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Frischgewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Blattfläche, Stängelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe und Anzahl der Blätter. Bei vielen Arten bleibt ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe von verschiedenen Pflanzenteilen zu einem bestimmten Entwicklungsstadium bestehen. Mit diesen aliometrischen Beziehungen extrapoliert man von einer dieser Größenmaße auf ein anderes (z. B. Tittonell et al, 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium korreliert typischerweise mit der Pflanzengröße später während der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren und wird daher wahrscheinlich während desselben Zeitraums mehr an Gewicht zunehmen (Fasoula & Tollenaar 2005, Maydica 50: 39). Dazu kommt, dass der Vorteil bezüglich der Mikroumwelt bzw. der genetische Vorteil, der der Pflanze beschieden war, um ursprünglich eine größere Größe zu erreichen, sich möglicherweise noch fortsetzt. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente (z. B. ter Steege et al, 2005, Plant Physiology 139: 1078), es wird also für eine Reihe von verschiedenen Genotypen die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung wahrscheinlich mit der Größe unter einer anderen korrelieren (Hittalmani et al, 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise verwendet man eine Standardumwelt als stellvertretenden Parameter für die unterschiedlichen und dynamischen Umwelten, die die Kulturpflanzen im Feld an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeiten antreffen.
  • Der Harvest Index, das Verhältnis von Samenertrag zu Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, und so kann man häufig zu einer guten Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag gelangen (z. B. Rebetzke et al, 2002, Crop Science 42: 739). Diese Vorgänge sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der gegenwärtigen oder gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und Stängel der Pflanze abhängt (Gardener et al, 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Die Selektion auf Pflanzengröße, sogar in den frühen Entwicklungsstadien, wurde daher als Indikator für einen potentiellen Ertrag in der Zukunft eingesetzt (z. B. Tittonell et al, 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Prüft man den Einfluss von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz, so ist die Fähigkeit, Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität zu standardisieren, ein intrinsischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammerumwelten im Vergleich zum Feld. Künstlich verursachte Begrenzungen des Ertrags aufgrund schlechter Bestäubung wegen fehlendem Wind bzw. fehlenden Insekten, oder unzureichender Raum für das Wachstum der reifen Wurzeln bzw. des reifen oberirdischen Bestandes können den Einsatz dieser kontrollierten Umwelten für das Austesten von Ertragsunterschieden jedoch einschränken. Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus sind daher übliche Praktiken, um zu einem Hinweis auf potentielle genetische Ertragsvorteile zu gelangen.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Kulturpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Eine Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel von modernen Reiszüchtungsprogrammen für Sorten von tropischem Reis, aber auch Reis für gemäßigte Zonen. Lange Wurzeln sind wichtig für Reis, der in Wasser gesät wird, für eine ordentliche Verankerung im Boden. Dort, wo Reis direkt in angestaute Felder gesät wird und wo die Pflanzen rasch durch das Wasser auflaufen müssen, sind längere Triebe mit Vitalität assoziiert. Wird das Saatgut gedrillt, so sind längere Mesokotyle und Koleoptilen wichtig für eine gutes Auflaufen der Keimpflanzen. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität in Pflanzen mittels Gentechnik einzubringen, wäre in der Landwirtschaft von großer Wichtigkeit. So bildete zum Beispiel eine schlechte Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung für die Einführung von Maishybriden (Zea mays L.), die auf Erbmaterial des „Corn Belt” beruhten, in die europäische Atlantikregion.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das der verbesserten Toleranz für abiotischen Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Erntesverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al, Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrems, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die pflanzliche Toleranz für über abiotischem Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Der Kulturpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben genannten Faktoren erhöht werden.
  • Je nach dem Endzweck kann man die Modifikation von bestimmten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu anderen bevorzugen. Für Anwendungen wie zum Beispiel Feldfutter- oder Holzproduktion oder als Quelle für Biokraftstoff kann zum Beispiel eine Zunahme der vegetativen Pflanzenteile wünschenswert sein, und für Anwendungen wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Zunahme bei den Samenparametern besonders wünschenswert sein. Auch unter den Samenparametern selbst können je nach Anwendungszweck manche im Vergleich zu anderen bevorzugt werden. Zur Erhöhung des Samenertrags können verschiedene Mechanismen beitragen, egal, ob in Form von erhöhter Samengröße oder erhöhter Anzahl an Samen.
  • Ein Ansatz für die Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) bei Pflanzen kann durch Modifizieren der pflanzeneigenen Wachstumsmechanismen, wie des Zellzyklus oder von verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind, erfolgen.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ein Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Yield Enhancing Protein (YEP), das aus der Gruppe Nucleosome Assembly Protein 1-artiges Polypeptid (NAP1-like), Like Sm Polypeptid (Lsm-Protein), verkürztes Cyclin H (CycHTr) Polypeptid, Remorin-Polypeptid und DREB-Protein stammt, kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und/oder erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • I. Nucleosome Assembly Protein 1-artiges Polypeptid (NAP1-like)
  • Die NAP-Proteine bilden eine Familie von verwandten Proteinen, die in der Tierwelt bekannt sind und von denen berichtet wird, dass sie an mit Chromatin in Zusammenhang stehenden Aktivitäten beteiligt sind. Die NAP-Proteinfamilie ist durch das Vorhandensein einer konservierten Sequenz, die als NAP-Domäne bekannt ist, gekennzeichnet. Die NAP-Domäne wird in den Datenbanken Pfam (Eingang PF00956) und Interpro (Eingang IPR002164) beschrieben. NAP ist eine Komponente eines mehrfaktoriellen Komplexes, der die DNA-Verpackung in Nukleosomen vermittelt (Krude, T. und Keller, C. (2001), Cell. Mol. Life Sci. 58, 665–672). Während der S-Phase des eukaryontischen Zellteilungszyklus wird neu replizierte DNA rasch zu Chromatin assembliert. Bei diesem Vorgang ist die koordinierte Wirkung von mehreren Faktoren erforderlich. In den Anfangsstadien bindet CAF1 (chromatin assembly factor 1) die Histonproteine H3 und H4 und dirigiert sie über PCNA-Bindung zu der Replikationsgabel. Die anschließende Ablagerung der Histonproteine H2A und H2B wird von den NAP1-Proteinen vermitteln. NAP1 wurde zuerst bei HeLA-Zellen beschrieben (von Lindern et al, (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 3346–3355); später wurde gefunden, dass es bei allen Eukaryonten konserviert vorkommt. Außerdem sollen die NAP-Proteine die Gentranskription regulieren und könnten die Zelldifferenzierung und -entwicklung beeinflussen.
  • Die SET-Proteine sind mit den NAP-Proteinen nahe verwandt und spielen bei verschiedenen Zellvorgängen beim Menschen eine Rolle. In menschlichen Zellen wurde gezeigt, dass SET mit verschiedenen CDK-Cyclinkomplexen während der Regulation des Zellzyklus, wie dem G2/M-Übergang, assoziiert ist. SET ist ein wirksamer Hemmer der Proteinphosphatase 2A (PP2A), die an mehreren Signalleitungswegen beteiligt ist. Die Hemmwirkung von SET könnte auf eine saure C-terminale Domäne zurückzuführen sein (Canela et al, (2003), J. Biol. Chem. 278, 1158–1164). Andere Berichte zeigen, dass SET an der DNA-Reparatur und der Transkription beteiligt ist. SET ist Bestandteil eines Komplexes, der DNA-Bindungs und -Biegeaktivitäten, die von dem mit Chromatin assoziierten Protein HMG2 vermittelt werden, aufweist. HMG2 unterstützt die Assemblierung von Nukleoproteinstrukturen einer höheren Ordnung durch Biegen von DNA und Loop-Bildung bei der DNA oder durch Stabilisierung von schwach gewundener DNA. HMG2 wird gemeinsam mit SET ausgefällt (Fan et al, (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2810–2820). Es wird auch berichtet, dass SET die aktive DNA-Demethylierung hemmt (Cervoni et al, (2002) J. Biol. Chem. 277, 25026–25031). Das Oncoprotein Set/TAF-I, das an der Hemmung der Histonacetylierung beteiligt ist, hemmt auch die Demethylierung von ektopisch methylierter DNA, was zu Gene Silencing führt. Es wurde vorgeschlagen, dass Set/TAF-I eine Rolle bei der Integration von epigenetischen Zuständen der Histone und DNA bei der Genregulation spielt.
  • Die Aktivität von NAP1-Proteinen wird teilweise durch Phosphorylierung reguliert. Es wurde gezeigt, dass die subzelluläre Lokalisierung von NAP1 bei Drosophila von seinem Phosphorylierungszustand abhängt, welcher von der Caseinkinase II kontrolliert werden könnte (Rodriguez et al, (2000), J. Mol. Biol, 298, 225–238). Es wurde auch berichtet, dass Säugetiere über mehrere NAP1-Proteine verfügen, während nur ein bekanntes NAP1-Protein in der Hefe vorliegt.
  • Pflanzliche NAP1-Orthologe sind nach wie vor ziemlich unbekannt, obwohl über NAP1-Protein aus der Sojabohne (Yoon et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 249, 465–473), Arabidopsis, Tabak, Mais und Reis (Dong et al, (2003), Planta 216, 561–570) berichtet wurde. Die phylogenetische Analyse von pflanzlichen NAP1-like-Genen hat ergeben, dass es zwei Untergruppen gibt, von denen eine mit NAP1 verwandt und die andere mit dem SET-Protein verwandt ist (1). Es ist äußerst wahrscheinlich, dass später eine Sequenzabweichung stattgefunden haben könnte, da die beiden Arabidopsis-, die beiden Mais- und die beiden Tabak-Sequenz-Cluster gemeinsam auf einen jüngeren Genduplikationseffekt hinweisen. Das Genom von Saccharomyces cerevisiae enthält nur ein NAP-Codiergen, das die funktionellen Eigenschaften der beiden Untergruppen NAP1 und SET kombiniert. Auf ähnliche Weise ist bei dem Template Activating Factor 1 (TAF-I), einem Homolog von NAP1, eine PP2a-Hemmaktivität (Saito et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 259, 471–475, 1999) und eine Chromatin-Remodelling-Aktivität (Kawase et al, Genes Cells 1, 1045–1056, 1996) kombiniert. Es ist daher wahrscheinlich, dass die pflanzlichen Proteine der NAP/SET-Familie größtenteils funktionsüberflüssig sind, insbesondere die Gruppe der SET-Proteine, wo ein im Vergleich zu der NAP-Gruppe niedrigerer Abweichungsgrad beobachtet wird. Weiterhin besteht ein Strukturhinweis darauf, dass die NAP- und SET-Proteine zu derselben Familie gehören, da sie beide über die NAP-Domäne verfügen, an die sich eine C-terminale saure Region anschließt.
  • Über die Funktion von NAP1-like-Proteinen in Pflanzen ist wenig bekannt, obwohl eine Rolle bei der Mitose und Cytokinese vorgeschlagen wurde (Dong et al, 2003). Die pflanzlichen Orthologe des NAP1-Proteins spielen höchstwahrscheinlich eine andere Rolle als ihre tierischen Gegenstücke. Aufgrund der Lokalisierung im Zellkern und aufgrund von Sequenzähnlichkeiten mit dem Säugetier-SET-Protein kann man erwarten, dass die pflanzlichen Proteine eine Rolle beim Chromatin-Remodelling spielen. Außerdem könnte die Gruppe der pflanzlichen NAP/SET-Proteine an der Regulation von PP2A bei Pflanzen beteiligt sein. PP2A ist eine der wichtigsten Phosphatasen in Pflanzen, die großteils auf Transkriptionsfaktoren und Proteinkinasen wirken, wobei vorgeschlagen wurde, dass sie die Aktivität von Proteinen, die bei verschiedenen Vorgängen der Zelle, darunter der Zellzyklus (Ayaydin et al, (2000), Plant J. 23, 85–96), Hormonwirkungen wie der ABA-vermittelten Bewegung der Spaltöffnungen, Keimung (Kwak et al, (2002), Plant Cell 14, 2849–2861) oder Auxintransport und Wurzelentwicklung (Garbers et al, 1996, EMBO J. 15, 2115–2124) beteiligt sind, regulieren. Weiterhin wird berichtet, dass PP2A an der Photosynthese und an der Lichtsignalleitung (Sheen (1993), EMBO J. 12, 3497–3505) und der Stickstoffassimilation (Hirose und Yamaya (1999), Plant Physiology 121, 805–812) beteiligt ist. In WO 2005/094562 wird die Verwendung von NAP1-like-Proteinen für die Ertragserhöhung beschrieben, über die Wirkungen der modulierten Expression von NAP1-like-Proteinen bei Pflanzen, die unter abiotischem Stress leiden, wird jedoch nichts gesagt.
  • II. Lsm(Like Sm)-Protein
  • Ribonukleinsäure (RNA), ein Nukleinsäurepolymer, das aus Ribonukleotidmonomeren besteht, ist ein wesentlicher Bestandteil von lebenden Organismen. Sie spielt bei essentiellen Zellfunktionen eine wesentliche Rolle. Die RNA dient als Matrize für die Translation von Genen zu Proteinen, wobei sie Aminosäuren zum Ribosom überträgt, um Proteine zu synthetisieren. Manche RNA-Moleküle wie Ribozyme üben auch katalytische Wirkungen aus, und die Rolle von RNA-Molekülen als wichtige Regulatoren der Genexpression ist in jüngster Zeit ebenfalls bestätigt worden.
  • Für die Synthese und das Funktionieren von messenger-RNA (mRNA) in einer Zelle sind verschiedene Ereignisse erforderlich, darunter Transkription, Prozessierung, Transport, Translation und Abbau. Der Begriff RNA-Prozessierung bezieht sich auf Ereignisse, die die RNA nach der Transkripition modifizieren. Bei eukaryontischen Organismen enthält der Großteil der entstehenden pre-mRNA Introns, die herausgespleißt werden, was zu der präzisen Ligation von Exons führt, wodurch eine reife mRNA entsteht, wobei es sich um die RNA-Form, die von den Ribosomen für die Translation zu einem Protein verwendet wird, handelt. Die Modifikation von RNAs nach der Transkription beinhaltet auch das „Capping” am 5'-Ende und die Polyadenylierung am 3'-Ende, was die Stabilität und Effizienz der Translation beeinflusst. Das Verhältnis zwischen mRNA-Translation und Umsatz ist für die Regulation der Genexpression und das korrekte Funktionieren der Zelle kritisch. Bei höheren eukaryontischen Organismen sind am RNA-Metabolismus mehrere hundert Proteine beteiligt. Ein Beispiel für solche Proteine sind die Lsm-Proteine (Like Sm-Proteins).
  • Die Lsm-Proteine (Like Sm) erhielten diese Bezeichnung, weil sie eine strukturelle Ähnlichkeit zu den zuvor beschriebenen Sm-Proteinen aufweisen. Bei den Lsm-Proteinen handelt es sich um kleine Proteine, die mit den Kern-Spliceosomen-snRNAs (smaII nuclear RNAs) und snRNPs (smaII nuclear ribonuclear proteins) assoziiert sind. Die Lsm-Proteine enthalten eine Lsm-Domäne mit variabler Länge, typischerweise zwischen 50 bis 70 Aminosäuren lang, die zwei kurze Abschnitte von konservierten Aminosäuren, die durch eine variable Region getrennt sind, beinhaltet. Im Vergleich zu den Sm-Proteinen wurde vorgeschlagen, dass die Lsm-Proteine einen Heterohepta- oder Hexamerenkomplex bilden, in dem sieben oder sechs Lsm-Proteine als Ring mit einer mittigen Öffnung angeordnet sind (Kambach C, et al, Cell 1999; 96: 375–387; Khusial P, et al, Trends Biochem. Sci. 2005, Sep.; 30(9): 522–8; Zaric B, et al, J. Biol. Chem. 2005, Apr. 22; 280(16): 16066–75).
  • Die Familie der Sm-like-Proteine unterlag während der Evolution einer Erweiterung, wodurch Komplexe von Proteinen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten entstanden. Eine Eigenschaft, die den verschiedenen Proteinkomplexen gemeinsam ist, ist, dass sie mit RNAs interagieren und sie gegen unerwünschte Nukleaseaktivität schützen und/oder ihre Strukturen modifizieren, was in vielen Fällen ihre Interaktionen mit anderen RNAs oder mit Proteinen beeinflusst. Gene, die für Lsm-Proteine kodieren, finden sich nicht nur in Eukaryonten, sondern auch in Bakterien und sogar Archaebakterien, die über keinen Spleiß-Apparat verfügen.
  • Es wurde beschrieben, dass in der Hefe Lsm-Proteine sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma Komplexe bilden, die das Spleißen und den Abbau der pre-mRNA, die Prozessierung der „smaII nuclear” RNA, der tRNA und der rRNA und den Abbau der mRNA beeinflussen. Diese Aktivitäten schlagen RNA-chaperoneartige Rollen für die Lsm-Proteine vor, die die RNA-RNA- und oder RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen. Die Zellkern-Lsm-Proteine spielen zusätzliche Rollen bei der Aufrechterhaltung der Ordnung der pre-rRNA-Prozessierungsereignisse, sie assoziieren mit dem Ribosom und fördern möglicherweise die Assemblierung des Ribosoms. Mutationen in dem Lsm6p-, dem Lsm7p- und dem Lsm1p-Protein hatten nur eine geringe Auswirkung auf die Stabilität von Zellkern-RNAs, was darauf hinweist, dass andere aktive Lsm-Proteine oder eventuelle Sm-Proteine diese nicht essentiellen Lsm-Proteine ersetzen können (Beggs JD. et al, Biochem. Soc. Trans. 2005, Juni; 33 (Teil 3): 433–8). Trotz der Tatsache, dass Lsm-Proteine zu separaten Proteinkomplexen mit unterschiedlicher Substratspezifität assoziieren, besteht daher eine funktionelle Redundanz unter den Lsm-Proteinen, welche gestattet, dass alternative Proteinkomplexe mit unterschiedlicher Lsm-Zusammensetzung dieselbe Funktion ausüben. Eine funktionelle Konservierung der Lsm-Proteine zwischen den Arten wurde mittels heterologer Systeme nachgewiesen. So fördert zum Beispiel Hefe-Lsm1p die Replikation eines pflanzlichen RNA-Virus in der Hefe (Noueiry AO, et al, Mol. Cell. Biol. 2003, Juni; 23(12): 4094–106).
  • Die Interaktion von Lsm1 mit Proteinen, die am Entfernen der „Caps” von mRNAs beteiligt sind, hat eine zusätzliche Rolle der Lsm-Proteine beim Abbau der Cytoplasma-mRNA nahegelegt (Tharun S, et al, Genetics. 2005, Mai; 170(1): 33–46). Weiterhin wurden auch bestimmte Rollen beim Schutz von snoRNAs (smaII nucleolar RNAs) sowie snRNAs gegen „trimming” am, 3'-Ende sowie ein Abbau der ARE-mRNA (messenger-RNAs, die ein AU-reiches Element enthalten) beschrieben (Beggs JD. Lsm proteins and RNA processing. Biochem. Soc. Trans. 2005, Juni; 33 (Teil 3): 433–8; Stoecklin G, Mayo T, Anderson P. ARE-mRNA degradation requires the 5'-3' decay pathway. EMBO Rep. 2006, Jan.; 7(1): 72–7). Stoecklin G, Mayo T, Anderson P. ARE-mRNA degradation requires the 5'-3' decay pathway. EMBO Rep. 2006, Jan.; 7(1): 72–7).
  • In der Hefe sind die LSM-Proteine in acht Klassen, nämlich Lsm1 bis Lsm8, eingeteilt worden (Wang und Brendel, Genome Biology 2004, 5: R102). Alle Hefe-Lsm-Proteine verfügen über Homologe in Pflanzen. In Arabidopsis thaliana liegen 11 Lsm-Proteine vor, die dahingehend identifiziert wurden, dass sie in dieselben acht Gruppen, wie sie auch in der Hefe auftreten, fallen. Vier der Lsm-Proteine sind in Arabidopsis verdoppelt. Es ist wahrscheinlich, dass diese Gene als einzelne Kopien bei den Vorfahren von Tieren und Pflanzen vorlagen, dass sie jedoch innerhalb der pflanzlichen Ahnenreihe verdoppelt wurden.
  • In Pflanzen wurde eines der 11 Lsm-Gene (LSM5, At5g48870) experimentell charakterisiert. Eine Arabidopsis-Mutante, die für Lsm5p defizient ist, wurde isoliert, und es wurde gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Modulation der Abscisinsäuresignalleitung spielt. Dementsprechend wiesen die mutierten Pflanzen einen SAD-Phänotyp (SAD = supersensitive to ABA and drought treatment) auf (Xiong L, et al, Dev. Cell. 2001, Dez.; 1(6): 771–81).
  • III. Verkürztes Cyclin H
  • Bei den Cyclinen handelte es sich um Proteine, die beim Durchlaufen des Zellzyklus eine Rolle spielen. Sie werden während des Zellzyklus synthetisiert und abgebaut, und die meisten üben ihre Funktion dadurch aus, dass sie an cyclinabhängige Kinasen binden und diese dadurch aktivieren. Die Cycline lassen sich in Mitose-Cycline (wobei diese bei den höheren Eukaryonten als Cycline des A- und B-Typs und bei der Sprosshefe als CLBs bezeichnet werden) und G1-spezifische Cycline (wobei diese bei Säugetieren als Cycline des D-Typs und bei der Sprosshefe als CLNs bezeichnet werden) einteilen. Cyclin B zum Beispiel ist die große Proteinuntereinheit des Mitosis Promoting Factor (MPF); Cyclin B wird während des Zellzyklus synthetisiert und abgebaut, um die MPF-Aktivität zu regulieren. Cyclin B und die cyclinabhängige Kinase 1 (cdk1, auch cdc2 oder auch p34-Kinase genannt) bilden gemeinsam ein aktives MPF-Protein. Zu den anderen Cyclinen zählen Cyclin E (bindet an die G1-Phasen-Cdk), das für den Übergang von der G1- in die S-Phase benötigt wird, und Cyclin A, das an die S-Phasen-Cdk2 bindet und das benötigt wird, damit die Zelle die S-Phase durchläuft. Cycline des H-Typs regulieren die Aktivität der CAKs (CDK-activating kinases). Alle vier in Pflanzen bekannten Cyclintypen wurden hauptsächlich aufgrund ihrer Analogie zu ihren menschlichen Gegenstücken identifiziert. In Arabidopsis wurden zehn Cycline des A-Typs, neun des B-Typs, zehn des D-Typs und eine des H-Typs beschrieben (Vandepoele et al, 2002). Cycline weisen typischerweise eine so genannte Cyclin-Box auf, eine konservierte Sequenz, die für die Bindung an die cyclinabhängige Kinase und deren Aktivierung erforderlich ist.
  • Cyclin H ist auch ein Regulator des Zellzyklus (Fisher et al, Cell 78, 713–724, 1994; Makela et al, Nature 371, 254–257, 1994; Yamaguchi et al, Plant J. 24, 11–20, 2000). In tierischen Zellen ist es ein Teil des CDK7/Cyclin H/MAT1-Komplexes. Dieser Komplex ist eigentlich ein „Cyclinaktivierungskomplex”, der die Aktivität von anderen Cyclin/CDK-Komplexen durch Phosphorylierung des Cyclins innerhalb einer Aktivierungskaskade reguliert. Er ist auch an der Transkription und an der DNA-Reparatur beteiligt. CDK7 und seine Gegenstücke in anderen Organismen, wie R2 beim Reis oder Mcs6/Crk1/Mop1 in Schizosaccharomyces, sind als cyclinabhängige kinaseaktivierende Kinase (CDK-activating kinase bzw. CAK) bekannt.
  • Die CDK-aktivierende Kinase (CAK) aktiviert die cyclinabhängigen Kinasen (cdks), die das Durchlaufen des Zellzyklus kontrollieren, durch Phosphorylieren eines Threoninrests, der bei den cdks konserviert ist. Der CAK-Komplex des Menschen umfasst p40MO15 (cdk7), Cyclin H und MAT1, bei denen es sich auch um Untereinheiten des Transkriptionsfaktors IIH handelt, der die C-terminale Domäne der großen Untereinheit der RNA-Polymerase II phosphoryliert.
  • IV. Remorin
  • Die Remorine (auch pp34 oder dbp genannt) bilden eine Überfamilie der „plasma membrane/lipid-raft associated”-Proteine (Alliotte et al, (1989), Plant Physiol. 89: 743–752; Reymond et al, (1996), Plant Cell 8: 2265–2276; Bariola et al, (2004), Plant Molec. Biol. 55: 579–594; Mongrand et al, (2004), J. Biol. Chem. 279(35): 36277–36286). Diese pflanzenspezifische Überfamilie findet sich bei Angiospermen, Gymnospermen und Bryophyten. Bei Arabidopsis finden sich mindestens 15 eng verwandte Remorin-Polypeptide, und die Remorin-Familien bei anderen Pflanzen weisen eine ähnliche Abundanz auf.
  • Die Remorin-Polypeptide sind durch das Vorhandensein einer Coiled-Coil-Domäne in ihrer C-terminalen Hälfte gekennzeichnet. Coiled-Coil-Domänen sind häufig an der Protein-Protein-Interaktion, insbesondere Oligomerisation, beteiligt. Demgemäß wurde gefunden, dass Remorine in vitro oligomerisieren und fadenförmige Strukturen bilden, und dass sie in pflanzlichen Plasmamembranpräparaten als oligomere Strukturen vorliegen (Bariola et al, oben).
  • Obwohl die Remorin-Polypeptide stark mit Plasmamembranen assoziiert sind, weisen sie nicht die Struktur eines typischen membrangebundenen Proteins auf. Stattdessen handelt es sich bei den Remorinen um kleine hydrophile Polypeptide. Insbesondere die C-terminale Hälfte der Remorine ist reich an den geladenen Aminosäuren (Lys (K) Arg (R), Asp (D) und Glu (E). Schließlich umfasst ein Großteil der Remorine mindestens ein Cystein (Cys oder C) und/oder ein Phenylalanin (Phe oder F), das/die in den letzten zehn Aminosäureresten am C-terminalen Ende des Polypeptids vorliegt/vorliegen.
  • Die Remorine können in vitro unspezifisch mit Polyanionen wie Oligogalacturonsäuren (OGAs; Reymond et al, oben), Polygalacturonsäuren (PGAs; Farmer et al, (1991), J. Biol. Chem. 266(5): 3140–5), eine Bindung eingehen, und können auch an doppelsträngige DNA binden (Alliotte et al, oben). Die OGAs, bei denen es sich um aktive extrazelluläre Matrixkomponenten, die an zahlreichen Signalleitungswegen beteiligt sind, handelt, stimulieren auch die Phosphorylierung von Remorinen in vitro, vor allem an Threoninresten.
  • Es war nicht möglich, gesunde Arabidopsis-Linien zu gewinnen, die eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, überexprimieren, und antisense-Linien weisen keinen offensichtlichen Phänotyp auf, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass die Remorine durch große Multigen-Familien repräsentiert sind (Bariola et al, oben). Die internationale Patentanmeldung WO 02/16655 beschreibt eine Nukleinsäuresequenz, die an ein Remorin-Polypeptid kodiert, als SEQ ID NO: 2621. Das US-Patent 7,071,380 beschreibt zwei Nukleinsäuresequenzen, die für ein Remorin-Polypeptid kodieren, als SEQ ID NO: 379 und SEQ ID NO: 380. Das US-Patent 7,135,616 beschreibt eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, als SEQ ID NO: 133.
  • V. DREB
  • Transkriptionsfaktoren werden üblicherweise als Proteine, die eine sequenzspezifische DNA-Bindung aufweisen und die zur Aktivierung und/oder Repression der Transkription befähigt sind, definiert. Das Arebidopsis-Genom kodiert für mindestens 1533 Transkriptionsregulatoren, die ~5,9% seiner geschätzten gesamten Anzahl Gene ausmachen. Ungefähr 45% dieser Transkriptionsfaktoren sollen von Familien stammen, die für Pflanzen spezifisch sind (Riechmann et al, 2000, (Science Band 290, 2105–2109)).
  • Bei den AP2/EREBPs (APETALA2/Ethylene-Responsive Element Binding Proteins) handelt es sich um die prototypische Familie von Transkriptionsfaktoren, die nur bei Pflanzen auftreten und deren kennzeichnende Eigenschaft ist, dass sie eine so genannte AP2-DNA-Bindungsdomäne enthalten, die direkt mit einer GCC-Box in den auf Ethylen reagierenden Promotern interagiert. Proteine, die eine AP2-Domäne enthalten, werden jedoch auch im Genom von Viren, Blaualgen und Ciliaten kodiert, wo man annimmt, dass sie als Endonukleasen fungieren (Magnani et al, Plant Cell. 2004, Sep.; 16(9): 2265–77).
  • Die Mitglieder der AP2/EREBP-Familie werden aufgrund der Anzahl der AP2-Domänen und des Vorhandenseins von anderen konservierten Motiven in drei unterschiedliche Gruppen eingeteilt. Die Konsensus-Sequenz der AP2-Domäne zeigt kleine Unterschiede zwischen den Gruppen. Die erste separate Gruppe mit der Bezeichnung APETALA-2-Unterfamilie besteht aus Mitgliedern, die zwei wiederholte AP2-Domänen enthalten. Mitglieder der zweiten Gruppe mit der Bezeichnung ERF-Unterfamilie enthalten eine einzelne AP2-Domäne, und die dritte Gruppe, die auch als RAV-Proteine bezeichnet wird, besteht auch Proteinen, die zusätzlich zu einer einzelnen AP2-Domäne eine B3-Domäne enthalten. Obwohl berichtet wurde, dass die Proteine mit zwei AP2-Domänen eine Rolle bei der Entwicklung spielen, wurden die meisten Proteine, die eine einzelne AP2-Domäne enthalten, bezüglich biotischem und abiotischem Stress untersucht.
  • Die DREBs oder CBFs-Proteine stellen eine Untergruppe der Proteine, die eine einzelne AP2-Domäne enthalten, und die an der Reaktion auf abiotischen Stress beteiligt sind, dar (Yamaguchi-Shinozaki, et al, 1994, Plant Cell 6, 251–264). Die DREBs oder CBFs sollen an spezifische cis-agierende Elemente in Genpromotern mit der Bezeichnung DRE (drought-responsive element) und/oder CRT (C-repeat) binden und sollen die Transkription der stromabwärts gelegenen Gene, die mit Kälte, Trockenheit und hohem Salzgehalt in Beziehung stehen, aktivieren (Baker, et al, (1994), Plant Mol. Biol. 24, 710–713); Stockinger, et al, (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1035–1040; Liu, et al, Plant Cell 10, 1391–1406).
  • Die Genexpression der DREB-Proteine ist bei Pflanzen stark reguliert. Anhand einer unterschiedlichen Expression unter verschiedenen Stressbedingungen können bei Arabidopsis zwei DREBs-Untergruppen unterschieden werden, nämlich DREB1 und DREB2. Strukturell und funktionell jedoch agieren die zwei Untergruppen ähnlich, und zwar durch Bindung an die DRE/CRT-cis-Elemente und durch Regulation der Expression der Stressgene. Weiterhin kann die Bindung zu trans-Aktivierung oder trans-Inaktivierung von stromabwärts gelegenen Genen führen (Zhao, et al, 2006, JBC 218, 10752–10759).
  • Es wurde viel darüber berichtet, dass die Überexpression von DREB-Genen bei Pflanzen zu einer starken Expression der stressinduzierbaren Gene führt und dass die transgenen Pflanzen eine höhere Toleranz für abiotischen Stress erworben hatten (Jaglo-Ottosen et al, (1998), Science 280: 104–106; Sakuma Y, et al, (2006), Plant Cell 18: 1292–1309; Jaglo KR, et al, (2001), Plant Physiol. 127: 910–917; Shen et al, (2003), Theor. Appl. Genet. 106: 923–930, Dubouzet JG, et al, (2003), Plant J. 33: 751–763). Über eine Toleranz für abiotischen Stress wurde auch bei einer CBF2-Mutante bei Arabidopsis thaliana, bei der die CBF2-Genexpression gestört war, berichtet. Interessanterweise waren die Expressionsniveaus von CBF1/DREB1B und CBF3/DREB1A in den CBF2-Knock-Out-Pflanzen erhöht. Diese Ergebnisse legten nahe, dass CBF2/DREB1C bei Arabidopsis die Expression der CBF1/DREB1B- und CBF3/DREB1A-Gene negativ reguliert (Novillo et al, 2004, 101, 3985–3990).
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Yield Enhancing Protein (YEP), das aus der Gruppe Nucleosome Assembly Protein 1-artiges Polypeptid (NAP1-like), Like Sm Polypeptid (Lsm-Protein), verkürztes Cyclin H (CycHTr) Polypeptid, Remorin-Polypeptid und DREB-Protein stammt, kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen und/oder erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress führt.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe „Polypeptid” und „Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, die miteinander über Peptidbindungen verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe „Polynukleotid(e)”, „Nukleinsäuresequenz(en)”, „Nukleotidsequenz(en)”, „Nukleinsäure(n)”, „Nukleinsäuremolekül” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in polymerer, unverzweigter Form mit einer beliebigen Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Typischerweise gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Einzelorganismen, denen das Transgen aufgrund von Aufspaltung fehlt. Eine „Kontrollpflanze” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang nicht nur ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
  • Homolog(e)
  • „Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz Kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (calmodulin-binding peptide), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf den Ersatz von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch in Abhängigkeit von funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen. Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) and Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest konservative Substitutionen Rest konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von fachbekannten Techniken der Peptidsynthese, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind in der Fachwelt gut bekannt. So sind dem Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA gut bekannt; dazu zählen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site Directed Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese.
  • Derivate
  • „Derivates” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie des interessierenden Proteins, Substitutionen von Aminosäuren durch nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nichtnatürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. „Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acetylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nichtnatürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das/der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, um seinen Nachweis zu gestatten, und nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. „Derivate” beinhalten weiterhin auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (ein Übersichtsartikel über Tagging-Peptide finden sich bei Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(e)/Paralog(e)
  • Orthologe und Paraloge umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Vorfahrenbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Vorfahrengens entstanden sind; Orthologe sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind und die auch von einem gemeinsamen Vorfahrengen abstammen.
  • Domäne
  • Der Begriff „Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen schwanken können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen identifiziert und können als Identifikationsmittel verwendet werden, um zu bestimmen, ob irgendein Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
  • Motiv/Konsensussequenz/Signatur
  • Der Begriff „Motiv” oder „Konsensussequenz” oder „Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff „Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem sich im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen aneinander anlagern. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem sonstigen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann weiterhin stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen kieselsäurehaltigen Glasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder „micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um „hairpins” oder sonstige Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
  • Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird von Bedingungen wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelzpunkttemperatur (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter Tm liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter Tm liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise für die Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit der Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sequenzmäßig abweichen und trotzdem noch für ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
  • Bei dem Tm-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt zusammenpassenden Sonde hybridisiert. Der Tm-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen zum Beispiel hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem Tm-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und bei zusätzlich 50% Formamid ermöglicht es, bei 30 bis 45°C hybridisieren zu können, obwohl die Hybridisierungsrate erniedrigt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für längere Sonden, sinkt der Tm-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der Tm-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]–1 – 0,61x% Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (In)
    • a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
    • b nur für %GC im 30%- bis 75%-Bereich genau.
    • c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
    • d oligo, Oligonukleotid; In, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).
  • Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
  • Abgesehen von den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung typischerweise auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der das Ergebnis von unspezifischer Hybridisierung ist, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu kritischen Faktoren von solchen Waschvorgängen zählen die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie das Hintergrundsignal ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisevorgänge wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen mit höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
  • So umfassen zum Beispiel typische hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, so kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
  • Um das Ausmaß der Stringenz zu bestimmen, kann Sambrook et al, (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff „Spleißvariante” umfasst im vorliegenden Zusammenhang Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in denen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verdrängt oder hinzugefügt wurden oder in denen Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten wird die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleiben; dies kann dadurch erzielt werden, dass man funktionelle Abschnitte des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten können in der Natur vorkommen oder vom Menschen hergestellt werden. Verfahren für die Prognostizierung und für das Isolieren von solchen Spleißvarianten sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die an derselben chromosomalen Lage lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), aber auch SmalI Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs). Die Größe der INDELs beträgt üblicherweise weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • „Genshuffling”/gerichtete Evolution
  • „Genshuffling” oder „gerichtete Evolution” besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem entsprechendem Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die für Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al, (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Regulationselement/Kontrollsequenz/Promoter
  • Die Begriffe „Regulationselement”, „Kontrollsequenz” und „Promoter” werden im vorliegenden Text alle austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die fähig sind, eine Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirkten. Der Begriff „Promoter” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, und hier können eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet sein. Der Begriff „Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
  • Ein „pflanzlicher Promoter” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines Kodiersequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promoter muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der „pflanzliche Promoter” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere „pflanzliche” Regulationssignale, wie „pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Nukleotidsequenzen gelegenen Promoter können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promoter, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, zu stören. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promoter durch Modifizieren ihrer Sequenz modifizieren oder sie vollständig durch aktivere Promoter ersetzen, sogar durch Promoter von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben operativ mit einem geeigneten Promoter verbunden sein oder einen geeigneten Promoter umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Für ein Identifizieren von funktionell äquivalenten Promotern kann die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster eines potentiellen Promoters zum Beispiel dadurch analysiert werden, dass man den Promoter operativ mit einem Reportergen verbindet und das Expressionsausmaß und -muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze testet. Zu geeigneten gut bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel die beta Glukoronidase oder die beta-Galaktosidase. Die Promoteraktivität wird dadurch getestet, dass man die enzymatische Aktivität der beta-Glukoronidase oder der beta-Galaktosidase misst. Die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit derjenigen/demjenigen eines Referenzpromoters (wie demjenigen, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird) verglichen werden. Die Promoterstärke kann jedoch auch dadurch getestet werden, dass man die mRNA-Mengen quantitativ bestimmt oder dadurch, dass man die mRNA-Mengen der in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäure mit den mRNA-Mengen von „housekeeping”-Genen wie 18S rRNA unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wie Northern-Blotting unter densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitativer Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al, 1996, Genome Methods 6: 986–994) vergleicht. Im Allgemeinen versteht man unter „schwachem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf niedrigem Niveau vorantreibt. Unter „niedrigem Niveau” versteht man Mengen von ungefähr 1/10 000 Transkripte bis 1/100 000 Transkripte bis ungefähr 1/500 0000 Transkripte pro Zelle. Im Gegensatz dazu treibt ein „starker Promoter” die Expression einer Kodiersequenz auf hohem Niveau bzw. mit ungefähr 1/10 Transkripten bis 1/100 Transkripte bis ungefähr 1/1 Transkripte pro Zelle voran.
  • Operativ verknüpft
  • Der Begriff „operativ verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotersequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des interessierenden Gens zu initiieren.
  • Konstitutiver Promoter
  • Ein „konstitutiver Promoter” bedeutet einen Promoter, der während den meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionmäßig aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promoter finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promoter
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Actin McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990
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    V-ATPase WO 01/14572
    Superpromoter WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promoter
  • Ein ubiquitärer Promoter ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsregulierter Promoter
  • Ein entwicklungsregulierter Promoter ist während gewissen Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsmäßige Veränderungen auftreten, aktiv.
  • Induzierbarer Promoter
  • Ein induzierbarer Promoter weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz auf, oder kann „stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder „pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
  • Organspezifische/gewebespezifische Promoter
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promoter ist ein Promoter, der fähig ist, die Transkription bevorzugt in gewissen Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. zu initiieren. So ist zum Beispiel ein „wurzelspezifischer Promoter” ein Promoter, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promoter, die fähig sind, die Transkription nur in gewissen Zellen zu initiieren, werden im vorliegenden Text als „zellspezifisch” bezeichnet.
  • Ein samenspezifischer Promoter ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei „leaky”-Expression) transkriptionsmäßig aktiv. Der samenspezifische Promoter kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promoter kann endosperm-/aleuron-/embryospezifisch sein. Beispiele für samenspezifische Promoter sind in Tabelle 2b, 2c, 2d und 2e unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promoter sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Beschreibung wird hiermit durch Bezugnahme als ob hier vollständig beschrieben aufgenommen. Tabelle 2b: Beispiele für samenspezifische Promoter
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    PRO005 WO 2004/070039
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    Tabelle 2c: Beispiele für endospermspezifische Promoter
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    Mais-ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al, (1997), Plant J. 12: 235–46
    Sorghumhirse-Kafirin DeRose et al, (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2d: Beispiele für embryospezifische Promoter:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Reis-OSH1 Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
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    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2e: Beispiele für aleuronspezifische Promoter:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
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    Mais B-Peru Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promoter wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promoter, der in erster Linie in grünem Gewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promoter ist ein meristemspezifischer Promoter, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Terminator
  • Der Begriff „Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Modulation
  • Der Begriff „Modulation” bedeutet in Bezug auf die Expression oder Genexpression einen Vorgang, bei dem das Expressionsniveau durch diese Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze verändert wird; das Expressionsniveau kann erhöht oder erniedrigt werden. Bei der ursprünglichen, nichtmodulierten Expression kann es sich um eine beliebige Art von Expression einer Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation handeln. Unter dem Begriff „Modulieren der Aktivität” versteht man jegliche Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die zu erhöhtem Ertrag und/oder erhöhtem Wachstum der Pflanzen führt.
  • Expression
  • Der Begriff „Expression” oder „Genexpression” bedeutet die Transkription eines bestimmten Gens bzw. von bestimmten Genen oder eines spezifischen Genkonstrukts. Insbesondere bedeutet der Begriff „Expression” oder „Genexpression” die Transkription eines Gen bzw. von Genen oder eines Genkonstrukts in Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA, mit oder ohne anschließender) Translation von letzterer in ein Protein. Der Vorgang beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des entstandenen mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff „erhöhte Expression” oder „Überexpression” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang jegliche Form von Expression, die zusätzlich zu dem ursprünglichen Expressionsniveau des Wildtyps ist.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt; dazu zählen zum Beispiel die von entsprechenden Promotern vorangetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promoter- oder Enhancerelemente dienen, können in einer geeigneten Lage (typischerweise stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingeführt werden, um die Expression einer Nukleinsäure, die für das interessierende Polypeptid kodiert, hinaufzuregulieren. So können zum Beispiel endogene Promoter in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al, WO9322443 ) verändert werden, oder es können isolierte Promoter in eine Pflanzenzelle in der korrekten Orientierung und in korrektem Abstand von einem Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um die Expression des Gens zu kontrollieren.
  • Wünscht man, ein Polypeptid zu exprimieren, so ist es im Allgemeinen wünschenswert, am 3'-Ende einer Polynukleotid-Kodierregion eine Polyadenylierungsregion mitzuverwenden. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA stammen. Die hinzuzufügende 3'-terminale Sequenz kann zum Beispiel von dem Nopalinsynthasegen oder dem Octopinsynthasegen oder alternativ von einem anderen pflanzlichen Gen, oder, was weniger bevorzugt wird, von jeglichem sonstigen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Um die Menge der reifen Information, die im Cytosol akkumuliert zu erhöhen, kann der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz der Partialkodiersequenz auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden. Es wurde gezeigt, dass die Mitverwendung eines spleißbaren Introns in der Transkriptionsunit sowohl bei pflanzlichen als auch bei tierischen Expressionskonstrukten die Genexpression sowohl auf dem mRNA-Niveau als auch dem Proteinniveau bis um das 1000fache erhöht (Buchman und Berg (1988), Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al, (1987), Genes Dev. 1: 1183–1200). Solch eine Intronverstärkung der Genexpression ist typischerweise dann am größten, wenn sie in der Nähe des 5'-Endes der Transkriptionsunit platziert wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2, und 6, das Bronze-1-Intron, sind in der Fachwelt gut bekannt. Allgemeine Informationen finden sich in: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N.Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Wird im vorliegenden Text ein „endogenes” Gen erwähnt, so bezieht sich dies nicht nur auf das jeweilige Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form vorkommt (d. h. ohne menschlichen Eingriff), sondern auch auf dasselbe Gen (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure/ein im Wesentlichen homologes Gen) in isolierter Form, das anschließend in eine Pflanze (erneut) eingeführt wird (ein Transgen). So kann zum Beispiel bei einer transgenen Pflanze, die solch ein Transgen enthält, eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens stattfinden. Das isolierte Gen kann von einem Organismus isoliert sein oder kann künstlich, zum Beispiel mittels chemischer Synthese, hergestellt sein.
  • Verringerte Expression
  • Wird im vorliegenden Text von „verringerter Expression” oder „Verringerung oder im Wesentlichen stattfindender Elimination” der Expression gesprochen, so bedeutet dies eine Verringerung der Expression des endogenen Gens und/oder der Polypeptidmengen und/oder Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination ist mit ansteigender Bevorzugung im Vergleich zu derjenigen der Kontrollpflanzen um mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr reduziert.
  • Für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Um ein „gene silencing” durchzuführen, muss diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide lang sein; sie kann jedoch sogar die Länge des ganzen Gens (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder ganz oder teilweise) betragen. Der Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann von der Nukleinsäure, die für das interessierende Protein kodiert (Zielgen) oder von jeglicher Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen. Vorzugsweise ist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide fähig, mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden; stärker bevorzugt weist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide eine Sequenzidentität mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) von mit ansteigender Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität auf. Für die verschiedenen Verfahren, die im vorliegenden Text für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens diskutiert werden, ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, nicht Voraussetzung.
  • Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression kann unter Verwendung von Routinemaßnahmen und -techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression besteht darin, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einem der interessierenden Proteine zu kodieren, abstammen) als invertierte Wiederholung (teilweise oder ganz), die durch einen Spacer (nichtkodierende DNA) getrennt ist, kloniert wird, in eine(r) Pflanze einzuführen und zu exprimieren.
  • Bei solch einem bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, und zwar unter Verwendung einer invertierten Wiederholung einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einem Abschnitt von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen), die bzw. der vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin”-Struktur auszubilden. Die invertierte Wiederholung wird in einen Expressionsvektor, der Kontrollsequenzen umfasst, kloniert. Zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die die invertierte Wiederholung bilden, befindet sich eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, zum Beispiel ein „matrix attachment region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker usw.). Nach der Transkription der invertierten Wiederholung entsteht eine chimäre RNA mit selbstkomplementärer Struktur (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als „hairpin”-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten „silencing”-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet weiter die mRNA-Transkripte und reduziert dadurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in Polypeptide zu translatieren sind, wesentlich. Weitere allgemeine Einzelheiten finden sich zum Beispiel bei Grierson et al, (1998), WO 98/53083 ; Waterhouse et al, (1999), WO 99/53050 ).
  • Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht unbedingt erforderlich, dass man ein Genkonstrukt, in das die Nukleinsäure als invertierte Wiederholung kloniert ist, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, sondern es können eine oder mehrere von verschiedenen gut bekannten „gene silencing”-Verfahren eingesetzt werden, um zu derselben Wirkung zu gelangen.
  • Ein solches Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Herunterregulation). In diesem Fall wird das Silencing in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA), die im Wesentlichen eine Ähnlichkeit mit der endogenen Zielsequenz aufweist, ausgelöst. Diese dsRNA wird von der Pflanze weiter zu ungefähr 20 bis ungefähr 26 Nukleotiden prozessiert, die als „short interfering” RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens weiter spaltet und so die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduziert, eingebaut. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
  • Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren führt man Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon (in diesem Fall einen Abschnitt von mit im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) in sense-Orientierung in eine Pflanze ein. „Sense-Orientierung” bedeutet eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. Es würde daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze eingeführt werden. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens reduzieren und so zu einem Phänomen, das als Cosuppression bekannt ist, führen. Die Reduktion der Genexpression ist dann stärker ausgeprägt, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingeführt werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptniveaus und dem Auslösen der Cosuppression besteht.
  • Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren verwendet man antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine „antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer „sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zu dem Kodierstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise zu dem endogenen Gen, bei dem das Silencing erfolgen soll, komplementär. Die Komplementarität kann sich in der „Kodierregion” und/oder in der „Nichtkodierregion” eines Gens befinden. Der Begriff „Kodierregion” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff „Nichtkodierregion” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die Kodierregion flankieren und die transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (auch 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen genannt).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können nach den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zu der gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall einem Abschnitt von mit im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) komplementär sein, kann jedoch auch ein Oligonukleotid sein, das nur gegenüber einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der mRNA-5'- und 3'-UTR) in antisense orientiert ist. So kann zum Beispiel die antisense-Oligonukleotidsequenz zu derjenigen Region, die den Translationsstartpunkt eines mRNA-Transkripts, das für ein Polypeptid kodiert, umgibt, komplementär sein. Die Länge einer geeigneten antisense-Oligonukleotidsequenz ist in der Fachwelt bekannt und kann ab ungefähr 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotide lang oder weniger sein. Eine erfindungsgemäße antisense-Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von chemischen Synthesereaktionen und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von fachbekannten Verfahren konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, so dass die biologische Stabilität der Moleküle vergrößert wird oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs, der zwischen der antisense-Nukleinsäuresequenz und der sense-Nukleinsäuresequenz gebildet wird, erhöht wird; es können zum Beispiel Phosphorthioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide eingesetzt werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die eingesetzt werden können, um die antisense-Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, sind in der Fachwelt gut bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Ringschluss und „Caps” sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analog wie Inosin. Weitere Modifikationen von Nukleotiden sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Die antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäuresequenz in antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wird, wird in antisense-Orientierung in Bezug auf eine interessierende Zielnukleinsäure vorliegen), erzeugt werden. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung von antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts umfassend einen Promoter, ein operativ verknüpftes antisense-Oligonukleotid und einen Terminator.
  • Die für das Silencing in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle (egal, ob in eine Pflanze insertiert oder in situ erzeugt) hybridisieren mit bzw. binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die für ein Polypeptid kodieren, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z. B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch traditionelle Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs oder zum Beispiel bei einer antisense- Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix erfolgen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können in eine Pflanze durch Transformation oder direkte Injektion in eine spezifische Gewebestelle eingeführt werden. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können jedoch auch so modifiziert werden, dass sie bestimmte Zellen ansteuern, und dann systemisch verabreicht werden. So können zum Beispiel für die systemische Verabreichung antisense-Nukleinsäuresequenzen so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. dadurch, dass man die antisense-Nukleinsäuresequenz mit Peptiden oder Antikörpern verknüpft, welche an Zelloberflächenrezeptoren oder -antigene binden. Die antisense-Nukleinsäuresequenzen können an die Zellen auch unter Verwendung der im vorliegenden Text beschriebenen Vektoren abgegeben werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt handelt es sich bei der antisense-Nukleinsäuresequenz um eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al, (1987), Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al, (1987), Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al, (1987), FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
  • Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen erfolgen. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die fähig sind, eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, wie eine mRNA, für die sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Ribozyme (z. B. „hammerhead”-Ribozyme (beschrieben bei Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334, 585–591)) können also dazu verwendet werden, um mRNA-Transkripte, die für ein Polypeptid kodieren, katalytisch zu spalten, wodurch sie die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid zu translatieren sind, wesentlich reduzieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe zum Beispiel: Cech et al, U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al, U.S. Patent No. 5,116,742 ). mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, können jedoch auch dazu verwendet werden, um eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (Bartel und Szostak (1993), Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist in der Fachwelt bekannt (z. B. Atkins et al, (1994), WO 94/00012 ; Lenne et al, (1995), WO 95/03404 ; Lutziger et al, (2000), WO 00/00619 ; Prinsen et al, (1997), WO 97/13865 und Scott et al, (1997), WO 97/38116 ).
  • Ein Gen-Silencing kann auch mittels Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie unter anderen bei Angell und Baulcombe ((1999), Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind, erreicht werden.
  • Gen-Silencing kann auch stattfinden, wenn eine Mutation an einem endogenen Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure, das/die anschließend in eine Pflanze eingeführt wird, vorliegt. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination kann von einem nichtfunktionellen Polypeptid verursacht werden. So kann das Polypeptid zum Beispiel an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch fähig ist, interagierende Proteine (wie Rezeptorproteine) zu binden, das jedoch nicht seine normale Funktion (wie Signalligand) ausüben kann.
  • Ein weiterer Ansatz beim Gen-Silencing besteht darin, dass man Nukleinsäuresequenzen, die zu der Regulationsregion des Gens (z. B. dem Promoter und/oder den Enhancern) komplementär ist, ansteuert, um dreifache Helixstrukturen zu bilden, die die Transkription des Gens in den Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L.J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Der Fachmann wird mit anderen Methoden, wie der Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, um dessen Funktion in planta zu hemmen, oder dem Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, gut vertraut sein. Insbesondere ist es vorstellbar, dass künstlich hergestellte Moleküle für die Hemmung der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder für das Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Es kann jedoch auch ein Screening-Programm angelegt werden, um innerhalb einer Pflanzenpopulation natürliche Varianten eines Gens, die für Polypeptide mit verringerter Aktivität kodieren, zu identifizieren. Solche natürliche Varianten können zum Beispiel auch verwendet werden, um eine homologe Rekombination durchzuführen.
  • Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können dazu verwendet werden, um ein Knock-Out der Genexpression und/oder mRNA-Translation durchzuführen. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die typischerweise 19-24 Nukleotide lang sind. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Regulation der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen mikroRNAs (miRNAs) weisen eine komplette oder beinahe komplette Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Diese werden ausgehend von längeren nichtkodierenden RNAs mit charakteristischen „Fold-Back”-Strukturen durch doppelsträngige spezifische RNasen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie in den „RNA-induced silencing”-Komplex (RISC) eingebaut, und zwar durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonautenprotein. miRNAs dienen als Spezifitätskomponenten des RISCs, da sie eine Basenpaarung mit Zielnukleinsäuren, in erster Linie mRNAs, im Cytoplasma eingehen. Anschließende Regulationsereignisse beinhalten die Spaltung der Ziel-mRNA und die Zerstörung und/oder translationelle Hemmung. Auswirkungen der miRNA-Überexpression spiegeln sich daher häufig in verringerten mRNA-Mengen der Zielgene wider.
  • Künstliche microRNAs (amiRNAs), die typischerweise 21 Nukleotide lang sind, können dahingehend einem Genetic Engineering unterworfen werden, dass sie spezifisch die Genexpression von einzelnen oder mehreren interessierenden Genen negativ regulieren. Determinanten der pflanzlichen microRNA-Zielauswahl sind in der Fachwelt gut bekannt. Es wurden empirische Parameter für die Zielerkennung definiert, und diese können als Hilfe beim Entwickeln von spezifischen amiRNAs verwendet werden (Schwab et al, Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Praktische Werkzeuge für die Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorstufen sind ebenfalls für die Allgemeinheit verfügbar (Schwab et al, Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung ist bei den Gen-Silencing-Techniken, die für die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen von monokotylen Pflanzen für die Transformation von monokotylen Pflanzen und von Nukleinsäuresequenzen von dikotylen Pflanzen für die Transformation von dikotylen Pflanzen erforderlich. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz von einer beliebigen Pflanzenart in dieselbe Art eingeführt. So wird zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz aus dem Reis in einer Reispflanze hineintransformiert. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz von derselben Pflanzenart wie diejenige Pflanze, in die sie eingeführt werden wird, stammt. Es reicht aus, dass eine Art wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
  • Im obigen Text sind Beispiele für verschiedene Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Ein Fachmann wäre leicht fähig, die oben genannten Silencing-Verfahren dahingehend zu adaptieren, dass eine Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer ganzen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung von z. B. einem entsprechenden Promoter erzielt wird.
  • Selektionsmarker(gen)/Reportergen
  • „Selektionsmarker”, „Selektionsmarkergen” oder „Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen zählen zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosate vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Es ist bekannt, dass bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und gewünschtenfalls in ihr Genom integriert, was von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik abhängt. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuselektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel bei Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nichtfunktionell sind, und zwar zum Beispiel durch Deletion mit traditionellen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in einer Wirtszellen auf demselben Vektor, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, umfasst, oder auch in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben).
  • Da, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingeführt worden sind, die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht mehr erforderlich sind oder unerwünscht sind, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Einführung der Nukleinsäuren vorteilhaft Techniken verwendet, die die Entfernung oder das Herausschneiden dieser Markergene gestatten. Eines dieser Verfahren ist die so genannten Cotransformation. Bei dem Cotransformationsverfahren werden zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation verwendet, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter Vektor das Markergen bzw. die Markergene trägt. Ein Großteil der Transformanten erhält oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beider Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten üblicherweise nur einen Teil des Vektors, d. h. diejenige Sequenz, die von der T-DNA flankiert ist, die üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend von der transformierten Pflanze mittels Kreuzen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden für die Transformation Markergene, die in ein Transposon integriert sind, gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure eingesetzt (dies ist unter der Bezeichnung Ac/Ds-Technologie bekannt). Die Transformanten können mit einer Transposasequelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das transient oder stabil die Expression einer Transposase vermittelt, transformiert. In manchen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, aus dem Genom der Wirtszelle heraus und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an einen anderen Locus. In diesen Fällen muss das Markergen durch Kreuzen entfernt werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse möglich machen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf den so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil darin besteht, dass ein Entfernen durch Kreuzen nicht erforderlich ist. Das bekannteste System dieses Typs ist unter der Bezeichnung Cre/lox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die Sequenzen, die sich zwischen den loxP-Sequenzen befinden, entfernt. Ist das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert, so wird es, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen wie Hefe, Pilze oder Bakterien angewandt werden.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „transgen”, „Transgen” oder „rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen für Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, oder
    • (b) genetische Kontrollsequenz(en) in operativer Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promoter, oder
    • (c) a) und b)
    sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umwelt befinden oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es sich bei der Modifikation zum Beispiel um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten handeln kann. Unter der natürlichen genetischen Umwelt versteht man den natürlichen genomischen oder chromosomalen Locus in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer Genombibliothek. Bei einer Genombibliothek wird die natürliche genetische Umwelt der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umwelt flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest auf einer Seite und weist eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 Bp, auf. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promoters der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch unnatürliche, synthetische („künstliche”) Verfahren wie zum Beispiel mutagene Behandlung modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in
    US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Unter einen transgenen Pflanze versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen auch, dass die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind, obwohl die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanze werden im vorliegenden Text erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff „Einführung” oder „Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das anschließend durch Klonieren vermehrt werden kann, egal ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden und eine ganze Pflanze daraus regeneriert werden. Das jeweilige ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen Klonierungsvermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben zählen zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf fachbekannte Art und Weise regenerieren.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Die Transformation von Pflanzenarten ist heutzutage eine ziemliche Routineangelegenheit. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden zählen die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Beschuss mit der Genkanone, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Methoden können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al, (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al, (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al, (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit mit DNA oder RNA beschichteten Partikeln (Klein TM et al, (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien inokulieren. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Methoden für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises zählen gut bekannte Methoden für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al, (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al, (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Bei der Transformation des Maises ist die bevorzugte Methode entweder wie bei Ishida et al, (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al, (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Diese Methoden sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana zählt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in einer Agrobakterienlösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittel Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Andere Methoden beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Eine besonders wirksame Methode ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der „floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der „floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al, 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen dirigieren die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie ist in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet worden (Klaus et al, 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al, Science (1992), 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, die üblicherweise einen Promoter (kann auch ein Translationsenhancer oder ein Intron sein) enthält, in die Genomregion des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts von der Kodierregion eines Gens in solch einer Anordnung, dass der Promoter die Expression des Zielgens dirigiert. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens unterbrochen, und das Gen gelangt unter die Kontrolle des neu eingeführten Promoters. Typischerweise ist der Promoter in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird in das pflanzliche Genom zufallsmäßig insertiert, zum Beispiel mittel Agrobacterium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression von Genen in der Nähe der inserierten T-DNA. Die entstehenden transgenen Pflanzen weisen aufgrund der modifizierten Expression von Genen in der Nähe des eingeführten Promoters dominante Phänotypen auf.
  • TILLING
  • Der Begriff „TILLING” ist eine Abkürzung von „Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die für Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promoter betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING typischerweise durchlaufen werden, lauten: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al, (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren der einzelnen Mutante; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt (McCallum et al, (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
  • Homologe Rekombination
  • Die homologe Rekombination gestattet die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom in einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standardtechnik, die routinemäßig in den Biowissenschaften für niedere Organismen wie Hefe oder das Moos Physcomitrella eingesetzt wird. Methoden für die Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen (Offringa et al, (1990), EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al, (2002), Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004), Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8) beschrieben worden, und es gibt Ansätze, die unabhängig von dem Zielorganismus allgemein anwendbar sind (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das typischerweise mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum in Relation steht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, bzw. ist der tatsächliche Ertrag der Ertrag pro Quadratmeter für eine Kultur und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bepflanzten Quadratmeter dividiert. Der Begriff „Ertrag” einer Pflanze kann sich auf die vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die Reproduktionsorgane und/oder auf Vermehrungsmaterial (wie Samen) derjenigen Pflanze beziehen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes balanciertes Wachstum, insbesondere während der Frühstadien des Pflanzenwachstums, und kann das Ergebnis einer erhöhten pflanzlichen Anpassungsfähigkeit aufgrund von z. B. einer besseren Adaption der Pflanzen an ihre Umwelt (d. h. Optimieren der Nutzung von Energieressourcen und Aufteilung zwischen Spross und Wurzel) sein. Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität weisen auch ein erhöhtes Überleben der Keimpflanzen und eine besseres Etablieren der Kultur auf, was häufig zu stark einheitlichen Feldern (wobei die Kultur einheitlich heranwächst, d. h. wobei der Großteil der Pflanzen die verschiedenen Entwicklungsstadien im Wesentlichen gleichzeitig erreicht) und häufig zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Jungpflanzenvitalität lässt sich daher dadurch bestimmen, dass man verschiedene Faktoren misst, wie Tausendkorngewicht, Keimungsprozentsatz, Prozentsatz des Auflaufens, Keimpflanzenwachstum, Keimpflanzenhöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und viele andere mehr.
  • Erhöhen/Verbessern/Fördern
  • Die Begriffe „erhöhen”, „verbessern” oder „fördern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
  • Samenertrag
  • Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllte) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
  • Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung der Samenausbeute kann sich auch als Erhöhung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
  • „Greenness”-Index
  • Der „Greenness-Index” wird im vorliegenden Zusammenhang aufgrund von digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem pflanzlichen Subjekt des Bilds gehört, wird das Verhältnis zwischen dem Grünwert und dem Rotwert (im RGB-Modell für die Farbkodierung) berechnet. Der „Greenness-Index” wird als Prozentsatz Pixel, bei denen das Grün/Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt, ausgedrückt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Nährstoffmangel-Wachstumsbedingungen wird der „Greenness-Index” von Pflanzen beim letzten Imaging vor der Blüte gemessen. Im Gegensatz dazu wird der „Greenness-Index” von Pflanzen unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen beim ersten Imaging nach der Trockenheit gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff „Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
  • Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, zählen all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die folgende umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (LB. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B.. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Tnticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. und viele andere mehr.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • I. NAP
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, moduliert, bereit.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird im folgenden Text ein „Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so versteht man darunter ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein NAP1-like Polypeptid zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäure (und die daher beim Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede beliebige Nukleinsäure, die für die Art von Protein, die nun beschrieben werden wird, kodiert, und wird im Folgenden auch „NAP1-like Nukleinsäure” oder „NAP1-like Gen” genannt.
  • Der Begriff „NAP1-like Protein” definiert im vorliegenden Zusammenhang jedes Protein, das eine NAP-Domäne und eine saure C-terminale Region umfasst. Der Begriff „NAP-Domäne” entspricht im vorliegenden Zusammenhang der Definition der Pfam-Datenbank gemäß Zugangsnummer PF00956 (Datenbank gehostet vom Sanger Institute, Großbritannien; Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002), siehe zum Beispiel Tabelle 3). Vorzugsweise weisen NAP-artige Proteinsequenzen, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, eine NAP-Domäne umfassend eine (T/S)FF(T/N/S/E/D)(W/F)(L/F)-Signatur (SEQ ID NO: 33) und/oder die konservierte Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 34 auf. Vorzugsweise lautet die Signatur von SEQ ID NO: 33 SFF(T/N/S)(W/F)F. Vorzugsweise weist die NAP-Domäne eines NAP1-like Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, mit ansteigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 32 auf. Stärker bevorzugt weist die NAP-Domäne eines NAP1-like Proteins, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 32 auf. Am stärksten bevorzugt entspricht die NAP-Domäne SEQ ID NO: 32. Der Begriff „saure C-terminale Region” oder „saures C-terminales Ende” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang das carboxyterminale Ende des Proteins, wobei dieses carboxyterminale Ende ungefähr 20 bis 25 Aminosäuren lang ist, von denen mindestens 13 Reste Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure sind. Tabelle 3: Beispiele für Arabidopsis-Proteine, die eine NAP1-Domäne umfassen
    Gen-ID Pfam-Profil Position Score e-Wert SEQ ID NO:
    at1g18800 PF00956 27-224 147,7 2e-40 20, 21
    at1g74560 PF00956 31-229 135,0 1.3e-36 1,2
    at2g19480 PF00956 52-300 457,4 1.2e-133 26, 27
    at5g56950 PF00956 52-300 473,2 2.2e-138 28, 29
    at4g26110 PF00956 52-301 503,4 1.7e-147 24, 25
    at3g13782 PF00956 69-311 300,7 1.7e-86 30, 31
  • Außerdem weisen NAP1-like Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) eine PP2a-Phosphatase-hemmende Aktivität auf. Werkzeuge und Techniken für die Messung der PP2a-Phosphatase-hemmenden Aktivität sind in der Fachwelt gut bekannt, siehe zum Beispiel Li et al, J. Biol. Chem. 271, 11059–11062, und darin genannte Literaturstellen. Die Chromatin-Remodelling-Aktivitäten können auf verschiedene Art und Weise getestet werden, wie zum Beispiel Messung der DNA-Bindungsaktivität in einem Gel-Retardierungs-Assay (Fan et al, 2002) oder Messen der Histonbindungsaktivität mittels ELISA (Rodriguez et al, (1997), Genomics 44, 253–265). Die DNA-Biegungsaktivität kann in einem ligasevermittelten Ringschluss-Assay (Fan et al, 2002) oder in einem Supercoiling-Assay (Fujii-Nakata et al, (1992), J. Biol. Chem. 267, 20980–20986; Yoon et al, (1995), Mol. Gen. Gen. 249, 465–473) bestimmt werden. Weitere Anleitungen für die Charakterisierung von NAP1-like Proteinen finden sich in Beispiel 6.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums wie dem in 4 dargestellten eingesetzt wird, Cluster mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, und nicht mit einer beliebigen anderen Gruppe.
  • Die Begriffe „Domäne” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (gehostet vom Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the Proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 in der SMART-Datenbank zeigte, dass eine NAP-Domäne vorlag (PFAM-Eintrag PF0059, 1). Diese Domäne ist für NAP-Proteine spezifisch, von denen behauptet wird, dass sie beim Transport von Histonen in den Zellkern, bei der Assemblierung der Nukleosomen und an der Fluidität des Chromatins beteiligt sind. Durch Alignment der Sequenzen von SEQ ID NO: 2 mit Sequenzen von anderen NAP1-like Proteinen lässt sich die Lokalisierung der NAP-Domäne bestimmen.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden ((Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wird, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können außerdem statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7). Die Sequenzidentitätswerte, die unten in Beispiel 3 als Prozentsatz angegeben sind, wurden mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz und/oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert, dargestellt. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit jeder Nukleinsäure, die für NAP1-like Polypeptide kodiert, oder mit NAP1-like Polypeptiden, wie sie im vorliegenden Text definiert sind, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, finden sich in Tabelle A von Beispiel 1 im vorliegenden Text. Solche Nukleinsäuren sind bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. Die Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des NAP1-like Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der Sequenzen in Tabelle A von Beispiel 1). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten nützlich sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodieren, wobei die Begriffe „Homolog” und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodieren. Homologe und Derivate, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, Allelvariante und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Nukleinsäuren die für NAP1-like Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beisipiel 1 oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebene Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren in Tabelle A von Beispiel 1 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mit ansteigender Bevorzugung mindestens 400, 500, 600 oder 700 aufeinanderfolgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 handelt oder um eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, handelt. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz umfassend (eine(s) oder mehrere der im vorliegenden Text definierten Domänen oder Motive). Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 und nicht mit einer anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text zu hybridisieren vermag.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle A von Beispiel 1 zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende sequenzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle A von Beispiel 1 oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert zu hybridisieren. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäregemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz, die ein oder mehrere Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert umfaßt. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie beim Erstellen eines phylogenetischen Stammbaums verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 als mit einer anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein NAP1-like Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise umfasst die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert.
  • Vorzugsweise bildet die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 als mit einer anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante, die für ein NAP1-like Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 oder eine Allelvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die Allelvarianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das NAP1-like Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und eine der Aminosäuren, die in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildet sind, auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist von den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NO: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise umfasst die von der Allelvariante kodierte Aminosäure eine(s) oder mehrere Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die von der Allelvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 als mit einer anderen Gruppe Cluster.
  • „Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, um Varianten von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen; wobei der Begriff „gene shuffling” wie oben definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 oder eine Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle A von Beispiel 1 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels „gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise kodiert die mittels „gene shuffling” erhaltene Nukleinsäurevariante für eine Aminosäuresequenz, die eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert umfasst. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der mittels „gene shuffling” erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAP1-like Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 als mit einer anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
  • Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das NAP1-like Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer monokotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit einer erhöhten Resistenz gegen abiotischen Stress (bzw. Toleranz für abiotischen Stress, wobei diese Begriffe austauschbar verwendet werden), ausgedrückt als verstärkte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wenn der Anbau unter abiotischem Stress erfolgt. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” werden im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben. Es ist jedoch anzumerken, dass der Begriff „Ertragsmerkmale” nicht den Metabolitengehalt der Pflanzenzellen umfasst und dass die verbesserten Ertragsmerkmale das Ergebnis von erhöhter Stressresistenz sind.
  • Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Samenausbeute in Bezug auf die Samenausbeute von geeigneten Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Hektar oder Acre etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/-durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Quadratmeter oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausenkorngewicht und viele andere mehr.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Erhöhung der Resistenz gegen abiotischen Stress bei Pflanzen bereit, das zu einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag, insbesondere Samenertrag von Pflanzen, führt, wobei das Wachstum unter abiotischen Stressbedingungen erfolgt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindestens während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen. Neben dem erhöhten Ertragspotential kann auch ein erhöhtes Nährstoffaneignungsvermögen zu der Ertragserhöhung beitragen. Es wird beobachtet, dass die erfindungsgemäßen Pflanzen ein höheres Nährstoffaneignungsvermögen aufweisen. Ein erhöhtes Nährstoffaneignungsvermögen ermöglicht besseres Pflanzenwachstum, wenn die Pflanze gestresst ist.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate, wenn das Wachstum unter abiotischen Stressbedingungen erfolgt. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen unter abiotischen Stressbedingungen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, wenn die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen abiotischen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Milder Stress ist (im vorliegenden Zusammenhang) der alltägliche abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird.
  • Ein weiteres Beispiel für einen abiotischen Umweltstress ist die reduzierte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von der Pflanze für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses, den die Nährstoffverwertungsfähigkeit einer Pflanze auf den Ertrag und die Produktqualität ausübt, wird eine enorm hohe Menge Dünger auf die Felder gestreut, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von den drei Hauptnährstoffen Phosphor, Kalium und Stickstoff begrenzt, wobei von diesen drei Nährstoffen üblicherweise der letztgenannte das limitierende Element der Pflanzenwachstumsrate ist. Das wichtigste Nährstoffelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, darunter Aminosäuren, Proteine (Enzyme), Nukleinsäuren und Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse ist Stickstoff und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins. Die Verfügbarkeit von Stickstoff ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Kulturpflanzenwachstum und die Kulturpflanzenproduktion (Frink et al, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und auf die Aminosäurezusammensetzung. Kulturpflanzen mit erhöhtem Ertrag, wenn sie unter Stickstofflimitierungsbedingungen herangezogen werden, sind daher von großem Interesse.
  • Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilzen und Insekten verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Stressbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen abiotischen Stressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter abiotischen Stressbedingungen einen im Vergleich zu geeigneten Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, erhöht. In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei der erhöhten Toleranz für abiotischen Stress um eine erhöhte Toleranz für eine verringerte Nährstoffverfügbarkeit.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (darunter Samen), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein NAP1-like Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz
    bereit.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für NAP1-like Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Die Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
  • Für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz kann vorteilhaft jede Art von Promoter verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich, vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promoter um einen starken konstitutiven Promoter. Es ist klar, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1, die für das NAP1-like Polypeptid kodiert, beschränkt ist bzw. dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist.
  • Bei dem konstitutiven Promoter handelt es sich vorzugsweise um einen GOS2-Promoter, stärker bevorzugt um den Reis-GOS2-Promoter, am meisten bevorzugt um den Promoter gemäß SEQ ID NO: 39. Für weitere Beispiele für konstitutive Promoter siehe Tabelle 2 in Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette gemäß SEQ ID NO: 3.
  • Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gewünschtenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zu zusätzlichen Regulationselementen können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer zählen. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Um die Menge oder reifen Botschaft, die im Cytosol akkumuliert wird, kann eine Introsequenz auch zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz hinzugefügt werden, siehe Beschreibung im Abschnitt „Definitionen”.
  • Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Es ist bekannt, dass je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik bei der stabilen oder transinten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und falls gewünscht in ihr Genom integriert. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen Selektionsmarker) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten, in denen diese Gene nicht funktionell sind, verwendet werden, und zwar zum Beispiel durch Deletion nach traditionellen Methoden. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, umfasst, jedoch auch auf einen separaten Vektor. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bei Wachstum unter abiotischen Stressbedingungen bereit, welches das Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze umfasst.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbessertem Ertag bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Norther- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden.
  • Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf einen untransformierten Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes NAP1-like Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuren oder Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden.
  • Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression. Eine erhöhte Expression bzw. Überexpression bedeutet jegliche Expression, die zu dem ursprünglichen Expressionsniveau des Wildtyps zusätzlich ist. Verfahren zum Erhöhen der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich im Abschnitt „Definitionen”.
  • Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise das Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Auswirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. des Verbesserns der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielt werden. Es folgt nun eine Beschreibung von einigen dieser Techniken.
  • Eine dieser Techniken ist das T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al, Science (1992), 1350–1353), bei dem T-DNA, die üblicherweise einen Promoter (kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) enthält, in der genomischen Region des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts der Kodierregion eines Gens in solch einer Konfiguration insertiert wird, dass der Promoter die Expression des Zielgens dirigiert. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens durch seinen natürlichen Promoter disrumpiert, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingeführten Promoters. Der Promoter ist typischerweise in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird zufallsmäßig in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel mittels Agrobakterium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression der Gene in der Nähe der insertierten T-DNA. Die entstandenen transgenen Pflanzen weisen aufgrund der modifizierten Expression der Gene in der Nähe des eingeführten Promoters dominante Phänotypen auf.
  • Die Effekte der Erfindung können auch mit der TILLING-Technik (Targeted Induced Local Lesions In Genomes) reproduziert werden; eine Beschreibung dieser Technik findet sich im Abschnitt „Definitionen”.
  • Die Effekte der Erfindung können auch mittels homologer Rekombination reproduziert werden; eine Beschreibung dieser Technik findet sich im Abschnitt „Definitionen”.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie im vorliegenden Text beschriebene NAP1-like Polypeptide kodieren, und die Verwendung dieses NAP1-like Polypeptids bei der Verbesserung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen, wenn diese unter abiotischen Stressbedingungen wachsen.
  • Nukleinsäuren, die für ein wie im vorliegenden Text beschriebenes NAP1-like Polypeptid kodieren, bzw. die NAP1-like Polypeptide selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein NAP1-like Polypeptid kodierenden Gen verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die NAP1-like Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
  • Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann dem Programm eine Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial dienen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze.
  • Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
  • Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuren, die für NAP1-like Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das NAP1-like Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
  • Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping” (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
  • II. Lsm
  • Überaschenderweise wurde nun gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Die bestimmte Klasse der Lsm-Polypeptide, die sich für die Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen eignet, wird im folgenden Text genauer beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Wird im folgenden Text ein „Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so versteht man darunter ein Lsm-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein Lsm-Polypeptid zu kodieren.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodiert, besteht darin, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die für ein Protein, das in den wie unten definierten erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bei der Nukleinsäure, die in einer Pflanze einzuführen ist (und die daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist), handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die die Art Protein, die nun beschrieben werden wird, kodiert und die im folgenden Text auch „Lsm-Nukleinsäure” oder „Lsm-Gen” genannt wird. Ein „Lsm”-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert bedeutet ein beliebiges Molekül mit einer Aminosäure umfassend eine Lsm-Domäne.
  • Beispiele von Lsm-Domänen, die sich in den repräsentativen Lsm-Proteinen gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 befinden, sind die SEQ ID NOs 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130. Typischerweise weisen die Lsm-Domäne in Lsm-Proteinen eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 auf.
  • Das Vorliegen von Lsm-Domänen in einem Polypeptid kann leicht dadurch bestimmt werden, dass man die Sequenz mit bereits gut beschriebenen Lsm-Proteinen vergleicht und eine Homologie in der Lsm-Domäne feststellt. Verfahren zur Durchführung von Sequenzvergleich sind in der Fachwelt gut bekannt und werden im Folgenden beschrieben. Alternativ dazu können Lsm-Domänen leicht dadurch identifiziert werden, dass man Suchen in entsprechenden Datenbanken, die konservierte Proteindomänen wie in Beispiel 14 beschrieben enthalten, durchführt.
  • Typischerweise umfassen Lsm-Proteine eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 auf.
  • Weiter bevorzugt umfasst die Lsm-Sequenz des Proteins, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ein beliebiges oder mehrere der folgenden Motive:
    • Motiv I: GTLXSFDQFANWLXGACERVIVGELYCDVPLGLYVIRGENVVLIG, oder ein Motiv mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 70%, 80% oder 90% Sequenzidentität zu der Sequenz von Motiv I, wobei jeglicher konservativer Austausch gestattet ist und wobei 'X' jegliche Aminosäure bedeuten kann;
    • Motiv II: KAEREARDLKGTMRKRMEFLDFD, oder ein Motiv mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 70%, 80% oder 90% Sequenzidentität zu der Sequenz von Motiv II, wobei jeglicher konservativer Austausch gestattet ist und wobei 'X' jegliche Aminosäure bedeuten kann.
  • Motiv I und/oder Motiv II können mit ansteigender Bevorzugung eine Deletion und/oder eine Substitution und/oder eine Insertion von 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren umfassen.
  • Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei dem Lsm-Protein, das in den Methoden der Erfindung nützlich ist, um ein Protein der Klasse Lsm1. Ein Protein der Klasse Lsm1 bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein beliebiges Ortholog des Lsm1-Proteins aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae oder ein beliebiges Ortholog des Lsm1a- oder Lsm1b-Proteins aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID No. 41 und SEQ ID No. 43.
  • Verfahren zum Identifizieren von orthologen Proteinen sind in der Fachwelt gut bekannt und im vorliegenden Text beschrieben. Beispiele für repräsentative Proteine der Klasse Lsm1 sind in Tabelle G angegeben.
  • Die Lsm-Proteine, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, umfassen vorzugsweise eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit steigender Bevorzugung mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NOs. 120, 121, 131, 132, 133, 140, 142, 143, 144, 152, 154 und 157.
  • Noch stärker bevorzugt umfasst das oben genannte Protein der Klasse Lsm1 eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID No 41, 43, 73, 75, 77, 81, 85, 87, 89, 105, 109 und 115. Am stärksten bevorzugt ist das Lsm1-Protein eines gemäß SEQ ID No 41, 43, 73, 75, 77, 81, 85, 87, 89, 105, 109 und 115.
  • Beispiele für Proteine, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, und für Nukleinsäuren, die dieselben kodieren, sind unten in Tabelle G von Beispiel 11 angeführt,
  • Ebenfalls nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind Homologe von einer beliebigen der Lsm-Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11.
  • Ebenfalls nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind Derivate von einem beliebigen der Polypeptide in Tabelle G von Beispiel 11 oder Orthologe oder Paraloge von einer beliebigen der oben genannten SEQ ID NOs.
  • Die Erfindung wird dadurch erläutert, dass man Pflanzen mit der Arabidopsis-thaliana-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40, die für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 41 kodiert, transformiert; die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt. Die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, das in den erfindungsgemäßen Verfahren wie im vorliegenden Text definiert nützlich ist, durchgeführt werden, darunter Homologe, Orthologe und Paraloge, wie eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle G von Beispiel 11.
  • Die Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 können als Orthologe und Paraloge des Lsm-Polypeptids gemäß einer beliebigen der SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 betrachtet werden, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind.
  • Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der Sequenzen in Tabelle G von Beispiel 11). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 40 oder SEQ ID NO: 41, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels des Prozentsatzes der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • In Tabelle G von Beispiel 11 sind Beispiele für Orthologe und Paraloge des Lsm-Proteins gemäß SEQ ID NO: 41 angegeben. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht unter Verwendung des oben beschriebenen BLAST-Vorgangs identifiziert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Proteine können aufgrund des Vorhandenseins einer konservierten Lsm-Domäne bzw. von konservierten Lsm-Domänen identifiziert werden (zum Beispiel wie in 9 dargestellt).
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie dem in 9 dargestellten Stammbaum, verwendet wird, eher mit der Gruppe der Lsm-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 41 Cluster als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Die Begriffe „Domäne”, „Signatur” und „Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Spezialdatenbanken gibt es auch für die Identifikation von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth-protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)).
  • Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken wie Sequenz-Alignment identifiziert werden. Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wäre, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können zum Beispiel statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden (wie Lsm-Domänen oder eines der oben definierten Motive). Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7). Die Sequenzidentitätswerte, die unten in Beispiel 3 als Prozentsatz angegeben sind, wurden mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz und/oder über ausgewählte Domänen oder konservierte(s) Motiv(e) bestimmt.
  • Weiterhin ist die Aktivität der Lsm-Proteine (zumindest in ihrer nativen Form) beschrieben worden. Aktivitäts-Assays beruhen typischerweise auf biochemischen oder biologischen Funktionen der Lsm-Proteineigenschaften, darunter ihrer Fähigkeit, andere Lsm-Proteine zu binden, Spliceregulation, Abbau der cytoplasmatischen mRNA, rRNA-Prozessierung und ihre Rolle in der Translationseffizienz. Hefe-Zwei-Hybrid-Versuche und in-vitro-Copräzipitationsversuche können dazu eingesetzt werden, um die Bindung an snRNA und snRNPs nachzuweisen (Mayes AE, et al, EMBO J. 1999, Aug. 2; 18(15): 4321–31). Über die Lsm-proteinbedingte Interferenz mit der Proteintranslation wurde unter Verwendung von „Toeprinting”, in-vitro-Translation und Elektromobilitäts-Shift-Assays berichtet (Vytvytska O, et al, Genes Dev. 2000, Mai 1; 14(9): 1109–18; Zaric B, et al, J. Biol. Chem. 2005, Apr. 22; 280(16): 16066–75). Die Lsm-Aktivität wurde auch durch Bestimmung der relativen Akkumulationsniveaus von spezifischen Genen, die durch desadenylierungsabhängiges „Decapping” beeinflusst werden (Tharum et al, 2005) oder durch Veränderungen in der mRNA-Genexpression insgesamt (Fraser MM, Watson PM, Fraig MM, Kelley JR, Nelson PS, Boylan AM, Cole DJ, Watson DK. CaSm-mediated cellular transformation is associated with altered gene expression and messenger RNA stability. Cancer Res. 2005, Juli 15; 65(14): 6228–36) nachgewiesen.
  • Bei den Nukleinsäuren, die für Proteine, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren, muss es sich nicht um Volllängen-Nukleinsäuren handeln, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht an die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen gebunden ist. Zu Beispielen für Nukleinsäuren, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, zählen die Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11, sind jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt. Nukleinsäurevarianten können ebenfalls bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Zu Beispielen für solche Nukleinsäurevarianten zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren hybridisieren, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodieren und Varianten von Nukleinsäuren, die für ein Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, Allelvariante und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze einen Teil von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 oder einem Teil einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, eine der folgenden:
    • (i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 oder SEQ ID NO: 116;
    • (ii) eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117 kodiert;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren in (i) oder (ii) oben zu hybridisieren vermag.
  • Abschnitte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein Polypeptid, das unter die Definition einer Nukleinsäure, fällt, die für ein Protein kodiert, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, wie im vorliegenden Text definiert, und das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 aufweist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren in Tabelle G von Beispiel 11. Der Abschnitt ist typischerweise mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide lang, vorzugsweise mindestens 150 aufeinander folgende Nukleotide lang, stärker bevorzugt vorzugsweise mindestens 180 aufeinander folgende Nukleotide lang und am stärksten bevorzugt vorzugsweise mindestens 350 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 handelt. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 40. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz umfassend eine oder mehrere der Lsm-Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Lsm-Stammbaums, wie den in 10 angegebenen, verwendet wird, eher mit einem der repräsentativen Lsm-Proteine umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 Cluster bildet als abseits von den oben genannten SEQ ID NOs. Cluster bildet.
  • Ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie im vorliegenden Text definiert kodiert, kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Lsm-Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text definiert zu hybridisieren vermag.
  • Hybridisierende Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein Polypeptid mit einer Lsm-Domäne (siehe Alignment in 10) und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das Lsm-Protein gemäß einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 auf. Die hybridisierende Sequenz ist typischerweise mindestens 100 aufeinander folgende Nukleotide lang, vorzugsweise mindestens 150 aufeinander folgende Nukleotide lang, stärker bevorzugt vorzugsweise mindestens 180 aufeinander folgende Nukleotide lang und am stärksten bevorzugt vorzugsweise mindestens 350 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 handelt. Vorzugsweise handelt es sich bei der hybridisierenden Sequenz um eine, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle G von Beispiel 11 oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 40 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz umfassend eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Lsm-Stammbaums, wie den in 10 angegebenen, verwendet wird, eher mit einem der repräsentativen Lsm-Proteine umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 Cluster bildet als abseits von den oben genannten SEQ ID NOs. Cluster bildet.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle G von Beispiel 11 zu hybridisieren, einführt und exprimiert, oder dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 kodiert, zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein Lsm-Protein wie oben definiert, kodiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 oder eine Spleißvariante Teil einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 40 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 41 kodiert. Vorzugsweise umfasst die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleißvariante kodierte Aminosäure, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Lsm-Stammbaums, wie dem in 10 abgebildeten, verwendet wird, eher innerhalb der Kladen entsprechend einer der Kladen der Klasse 1 bis Klasse 8 oder alternativ mit einem der repräsentativen Lsm-Proteine umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 Cluster als abseits von den oben genannten SEQ ID NOs.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie oben definiert kodiert. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Verwendung von diesen natürlichen Allelen. Die Allelvarianten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie eines der Lsm-Proteine in Tabelle G auf. Als Beispiel für eine Allelvariante von SEQ ID NO: 40 ist in SEQ ID NO: 80 bereitgestellt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante von einer der Nukleinsäuren in Tabelle G von Beispiel 11 in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder das umfasst, dass man eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante von SEQ ID NO: 40 oder eine Allelvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 41 kodiert. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert.
  • Vorzugsweise bildet die von der Allelvariante kodierte Aminosäuresequenz, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Lsm-Stammbaums, wie dem in 10 abgebildeten, verwendet wird, eher innerhalb der Kladen entsprechend einer der Kladen der Klasse 1 bis Klasse 8 oder alternativ mit einem der repräsentativen Lsm-Proteine umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 Cluster als abseits von den oben genannten SEQ ID NOs.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die sich zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Nukleinsäurevariante, die durch „gene shuffling” erhalten wurde. „gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls für die Erzeugung von Varianten von Nukleinsäuren, die für Lsm-Proteine wie oben definiert, kodieren, verwendet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder das umfasst, dass man eine Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle G von Beispiel 11 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels „gene shuffling” erhalten wurde.
  • Vorzugsweise kodiert die Nukleinsäurevariante, die mittels „gene shuffling” erhalten wurde, für eine Aminosäuresequenz umfassend eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die von der Nukleinsäurevariante, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurde, kodierte Aminosäure, wenn sie für die Konstruktion eines phylogenetischen Lsm-Stammbaums, wie dem in 10 abgebildeten, verwendet wird, eher innerhalb der Kladen entsprechend einer der Kladen der Klasse 1 bis Klasse 8 oder alternativ mit einem der repräsentativen Lsm-Proteine umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 Cluster als abseits von den oben genannten SEQ ID NOs.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
  • Nukleinsäuren, die für Lsm-Proteine kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für Lsm kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicae, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana.
  • Wird im vorliegenden Text daher ein Lsm-Protein erwähnt, so soll dies ein Lsm-Protein wie oben definiert bedeuten. Jede Nukleinsäure, die für solch ein Lsm-Protein kodiert, eignet sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die mit den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das für ein Lsm-Protein wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression der Nukleinsäuresequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in eine Pflanze und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz
    bereit.
  • Das von der Nukleinsäure (a) oben kodierte Lsm-Protein weist eine Aminosäuresequenz mit mit steigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe von SEQ ID NOs 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 auf.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Nukleinsäure von (a) oben um:
    • (i) eine der SEQ ID No.: 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 und 116 oder
    • (ii) eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren in (i) oder mit einer Nukleinsäure mit einer komplementären Sequenz zu einer der Nukleinsäuren in (i) zu hybridisieren.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend die interessierende Sequenz (d. h. eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, kodiert) transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
  • Für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz kann vorteilhaft jede Art von Promoter verwendet werden.
  • Bei dem Promoter kann es sich um einen konstitutiven Promoter oder um einen organspezifischen oder einen gewebespezifischen Promoter oder einen zellspezifischen Promoter handeln.
  • Vorzugsweise ist die Lsm-Nukleinsäure oder die Variante davon operativ mit einem samenspezifischen Promoter verbunden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem samenspezifischen Promoter um einen WSI18-Promoter oder einen funktionell äquivalenten Promoter. Stärker bevorzugt ist die Promotersequenz wie in SEQ ID NO: 161 oder SEQ ID NO: 164 dargestellt. Es ist anzumerken, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NO: 40 dargestellte Lsm-Nukleinsäure beschränkt ist, und dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Lsm-Nukleinsäure, wenn sie von einem samenspezifischen Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist. Beispiele für andere samenspezifische Promoter, die ebenfalls dazu verwendet werden können, um die Expression einer Lsm-Nukleinsäure voranzutreiben, sind im Abschnitt „Definitionen” dargestellt.
  • Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer beinhalten. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zu den 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz kann auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden, um die Informationsmenge, die im Zytosol akkumuliert, zu erhöhen; Beschreibung im Abschnitt „Definitionen”. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Die Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Lsm-Nukleinsäure oder Variante davon, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Norther- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden.
  • Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes Lsm-Protein kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen.
  • Wirtspflanzen für die/den bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um eine erhöhte Expression.
  • Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise das Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Auswirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. des Verbesserns der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielt werden und Beispiele finden sich im Abschnitt „Definitionen”.
  • Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Verbesserung der Ertragsmerkmale, lassen sich auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielen, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Methoden führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann.
  • Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Samenausbeute in Bezug auf die Samenausbeute von geeigneten Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Hektar oder Acre etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, Korngewicht, Tausendkorngewicht, Ährenlänge/-durchmesser, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale äußern: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausenkorngewicht und viele andere mehr.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen. Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann zu einem oder mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, egal, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzt ist. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilzen und Insekten verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu geeigneten Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, heranwachsen, einen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung finden die Ertragserhöhung und/oder die Erhöhung der Wachstumsrate unter Nichtstressbedingungen statt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden die verbesserten Ertragsmerkmale unter milden Trockenheitsbedingungen beobachtet, am stärksten bevorzugt entspricht die Trockenheitsbedingung der Gießbehandlung 2, wie sie in Beispiel 18 beschrieben ist.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden.
  • Der Begriff „Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jeder der genannten Begriffe das interessierende Gen/die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, die wiederum jeweils das interessierende Gen/die interessierende Nukleinsäure umfassen.
  • Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch bis jetzt unbekannte Lsm-Nukleinsäuren und Lsm-Proteine bereit, wobei diese Sequenzen ebenfalls für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das Folgendes umfasst, bereitgestellt:
    • (i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 oder SEQ ID NO: 116;
    • (ii) das Komplement von einer der SEQ ID NOs. in (i);
    • (iii) eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117 kodiert;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren in (i), (ii) oder (iii) oben zu hybridisieren vermag.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
    • (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117;
    • (ii) eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117;
    • (iii) Abkömmlinge von einer der Aminosäuresequenzen in (i) oder (ii) oben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für das Lsm-Protein wie im vorliegenden Text beschrieben kodieren, und die Verwendung dieser Lsm-Proteine bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen.
  • Nukleinsäuren, die für das im vorliegenden Text beschriebene Lsm-Protein kodieren, oder die Lsm-Proteine selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch mit einem Gen, das für Lsm kodiert, verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die Lsm-Proteine selbst können eingesetzt werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die verbesserte Ertragsmerkmale wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definiert aufweisen.
  • Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein Lsm-Protein kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann das Programm eine Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial dienen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
  • Nukleinsäuren, die für Lsm-Proteine kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für Lsm-Protein kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für Lsm-Protein kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA; mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuren, die für Lsm-Protein kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das Lsm-Protein kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
  • Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic. Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping” (Dear und Cook (1989), Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
  • III. Verkürztes Cyclin H
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen in Bezug auf Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression einer Nukleinsäure, die für ein verkürztes Cyclin-H-Polypeptid, im Folgenden auch CycHTr genannt, kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise die Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Wird im vorliegenden Text ein „Protein, das in den erfindungsgemäßen Methoden nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies ein CycHTr-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Der Begriff umfasst auch Cyclin-H-Polypeptide, die für die Erzeugung einer verkürzten Form wie unten definiert verwendet werden. Wird im vorliegenden Text eine „Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäure, die fähig ist, für solch ein CycHTr-Polypeptid zu kodieren oder für ein Cyclin-H-Polypeptid, das für die Erzeugung einer verkürzten Form wie unten definiert verwendet wird, zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäure (und die daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für die Art von Protein, die nun beschrieben werden soll und die im Folgenden auch „CycHTr-Nukleinsäure” oder ”CycHTr-Gen” genannt wird, kodiert.
  • Cyclin-H-Polypeptide sind Proteine, die typischerweise CDK-aktivierende Kinasen (CAK) binden und aktivieren. Cyclin H soll zwei charakteristische alpha-Helix-Domänen aufweisen, die jeweils 5 Helizes (H1 bis H5 und H1' bis H5' genannt) umfassen, sowie eine N-terminale und eine C-terminale Helix (Hn und Hc, siehe 13) (Andersen et al, EMBO Journal 16, 958–967, 1997). Cyclin H umfasst die charakteristische Cyclin-Box (13), eine Domäne, die in allen Cyclinen vorliegt; weiterhin umfasst CycH vorzugsweise auch das konservierte Motiv 1 (L/V/I)(Q/R)(E/D)VCXAF (SEQ ID NO: 169).
  • Ein ”CycH-Polypeptid” kann auch als Cyclin definiert werden, das, mit ansteigender Bevorzugung, mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 173 aufweist.
  • Weiterhin können Cycline (zumindest in ihrer nativen Form) CDK-Bindungsaktivität aufweisen. Insbesondere soll CycH CAK-Proteine binden und aktivieren. Werkzeuge und Techniken für die Bestimmung von Protein-Protein-Interaktionen (einschließlich Zwei-Hybrid-Assays) und für die Bestimmung der Kinaseaktivität (insbesondere der CAK-Aktivität) sind in der Fachwelt gut bekannt; nähere Einzelheiten finden sich im Beispiel 25.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird ein verkürztes Cyclin H eingesetzt. Nützliche verkürzte Formen von CycH sind alle diejenigen, die noch fähig sind, an CAK zu binden, die jedoch nicht fähig sind, CAK zu aktivieren. Anweisungen für die Messung der CycH-Bindung und CAK-Aktivierung finden sich bei Andersen et al, (1997). Vorzugsweise fehlt dem verkürzten Cyclin H mindestens die Hc-Helixdomäne, weiter bevorzugt fehlt dem verkürzten Cyclin H auch die H5'-Helixdomäne, stärker bevorzugt fehlen dem verkürzten Cyclin H die Hc-, die H5'- und die H4'-Helizes. In einer besonderen Ausführungsform ist das verkürzte Cyclin H im Vergleich zu der Volllängen-Cyclin-H-Proteinsequenz durch die Abwesenheit der Helizes H3', H4', H5' und Hc gekennzeichnet. Vorzugsweise ist das verkürzte CycH wie in SEQ ID NO: 166 dargestellt. Wie jedoch bei Andersen et al, (1997) umrissen, führt die Deletion von anderen Helixdomänen auch zum Verlust der CAK-aktivierenden Aktivität. Diese Deletionsvarianten sind ebenfalls von dem Begriff „verkürztes Cyclin H” oder ”CycHTr” umfasst und sind bei den erfindungsgemäßen Verfahren ebenso nützlich.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie desjenigen, der in 15 dargestellt ist, eingesetzt wird, mit der Gruppe der CycH-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 eher Cluster als mit irgend einer anderen Gruppe.
  • Die Begriffe „Domäne” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (des Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the Proteomics server for in-depth protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 166 in der SMART-Datenbank ergab, dass eine Cyclin-Box vorhanden war, SMART-Eingang SM00385 (siehe 13).
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. Mat-GAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wäre, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können zum Beispiel statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7). Die Sequenzidentitätswerte, die unten in Beispiel 3 als Prozentsatz angegeben sind, wurden mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz und/oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch erläutert, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 165, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 166 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit verkürzten Formen von einer beliebigen CycH-kodierenden Nukleinsäure oder von CycH-Polypeptiden wie im vorliegenden Text definiert durchgeführt werden, wobei die verkürzte Form wie oben beschrieben ist.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, finden sich in Tabelle K von Beispiel 20 im vorliegenden Text. Solche Nukleinsäuren eignen sich für die Erzeugung von verkürzten Formen von Cyclin H bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 1 sind Beispielesequenzen von Orthologen und Paralogen der CycH-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 173, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der Sequenzen in Tabelle K von Beispiel 20). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 172 oder SEQ ID NO: 173, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels des Prozentsatzes der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Nukleinsäurevarianten können ebenfalls bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Zu Beispielen für solche Varianten zählen Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodieren, wobei die Begriffe „Homolog” und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der Aminosäuresequenz in Tabelle K von Beispiel 20 kodieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie Abstammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Alle diese Nukleinsäuren und Varianten davon können dazu verwendet werden, um Nukleinsäuren, die für ein CycHTr-Polypeptid wie oben beschrieben kodieren, zu erzeugen. Die Begriffe „hybridisierende Sequenz”, „Spleißvariante”, „Allelvariante” und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text beschrieben.
  • Bei den Nukleinsäuren, die für CycH-Polypeptide kodieren, muss es sich nicht um Volllängen-Nukleinsäuren handeln, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht von der Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen abhängig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze einen Teil von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 oder einen Teil einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, einführt und exprimiert. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein verkürztes Cyclin-H-Polypeptide wie oben beschrieben.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind und die für ein CycHTr-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodieren, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuren in Tabelle K von Beispiel 20 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 100, 150, 200, 250, oder 300 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 oder um eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, handelt. Stärker bevorzugt handelt es sich beim dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 172, am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 165. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz umfassend (eine(s) oder mehrere der im vorliegenden Text definierten Domänen oder Motive). Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der CycHTR-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 und nicht mit einer anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein CycH-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text definiert zu hybridisieren vermag.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, das man eine Nukleinsäure, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle K von Beispiel 20 zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäure, die fähig ist, an eine Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Nukleinsäure für ein verkürztes Cyclin H wie oben beschrieben.
  • Hybridisierende Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein CycHTr-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und kodieren für ein Polypeptid, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer der Nukleinsäuren in Tabelle K von Beispiel 20 oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 zu hybridisieren. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuregemäß SEQ ID NO: 165 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz, die ein oder mehrere Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert umfaßt. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie beim Erstellen eines phylogenetischen Stammbaums wie demjenigen, der in 15 dargestellt ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der CycH-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 Cluster bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein CycH-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist. Vorzugsweise kodiert die Spleißvariante oder ein Teil davon für ein CycHTr-Polypeptid wie oben beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Spleißvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20, oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert. Vorzugsweise kodiert die Spleißvariante für ein verkürztes Cyclin H wie oben beschrieben.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten von einer der Nukleinsäuren, die für eine verkürzte Form eines CycH-Polypeptids in Tabelle K von Beispiel 20 kodieren, oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die für ein verkürztes Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen von CycHTr wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, eher mit der Gruppe der CycH-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 Cluster als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein CycH-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist. Vorzugsweise kodiert die Allelvariante für eine verkürzte Form des Cyclin H wie oben beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante von einer der Nukleinsäuren, die für eine verkürzte Form eines CycH-Polypeptids in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein verkürztes Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert. Vorzugsweise kodiert die Allelvariante für ein verkürztes Cyclin H wie oben beschrieben.
  • Die von den Allelvarianten kodierten Polypeptide, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das CycHTr-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 166 und eine verkürzte Form wie oben beschrieben von einer der Aminosäuresequenzen, die in Tabelle K von Beispiel 20 abgebildet sind, auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung von diesen natürlichen Allelen ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante gemäß SEQ ID NO: 165 oder SEQ ID NO: 172, oder um eine Allelvariante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 kodiert. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen von CycHTr wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der CycH-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 Cluster als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • „Gene shuffling” oder gerichtete Evolution können ebenfalls eingesetzt werden, um Varianten von Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen; wobei der Begriff „gene shuffling” wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 oder eine Variante davon in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K von Beispiel 20 kodiert, wobei diese Nukleinsäure durch „gene shuffling” erhalten wurde, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein verkürztes Cyclin H wie oben definiert.
  • Vorzugsweise kodiert die Nukleinsäurevariante, die durch „gene shuffling” erhalten wurde, für eine Aminosäuresequenz umfassend eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäurevariante, die mittels „gene shuffling” erhalten wurde, kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums, wie demjenigen, der in 15 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der Gruppe der CycH-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173 als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
  • Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das CycHTr-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, speziell erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” sind im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text genauer beschrieben.
  • Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen und/oder (vegetative) Biomasse, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Samenausbeute in Bezug auf die Biomasse und die Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Hektar oder Acre etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, Korngewicht, Tausendkorngewicht, Ährenlänge/-durchmesser, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale äußern: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht und viele andere mehr.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags, speziell des Samenertrags, von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen. Neben dem erhöhten Ertragspotential kann auch ein erhöhtes Nährstoffaneignungsvermögen zu der Ertragserhöhung beitragen. Es wird beobachtet, dass die erfindungsgemäßen Pflanzen ein höheres Nährstoffaneignungsvermögen aufweisen. Ein erhöhtes Nährstoffaneignungsvermögen ermöglicht besseres Pflanzenwachstum, wenn die Pflanze gestresst ist.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem oder mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, wenn die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird.
  • Ein weiteres Beispiel für einen abiotischen Umweltstress ist die reduzierte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von der Pflanze für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses, den die Nährstoffverwertungsfähigkeit einer Pflanze auf den Ertrag und die Produktqualität ausübt, wird eine enorm hohe Menge Dünger auf die Felder gestreut, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von den drei Hauptnährstoffen Phosphor, Kalium und Stickstoff begrenzt, wobei von diesen drei Nährstoffen üblicherweise der letztgenannte das limitierende Element der Pflanzenwachstumsrate ist. Das wichtigste Nährstoffelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, darunter Aminosäuren, Proteine (Enzyme), Nukleinsäuren und Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse ist Stickstoff und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins. Die Verfügbarkeit von Stickstoff ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Kulturpflanzenwachstum und die Kulturpflanzenproduktion (Frink et al, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und auf die Aminosäurezusammensetzung. Kulturpflanzen mit erhöhtem Ertrag, wenn sie unter Stickstofflimitierungsbedingungen herangezogen werden, sind daher von großem Interesse.
  • Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilzen und Insekten verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Verbindungen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltsstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu geeigneten Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (darunter Samen), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein CycHTr-Polypeptid wie oben definiert, kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression der Nukleinsäuren, die für ein CycHTr-Polypeptid kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in eine Pflanze und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz
    bereit.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die für CycHTr-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Die Pflanzen werden mit einem Vektor umfassend eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
  • Vorteilhafterweise kann jede Art von Promoter eingesetzt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz voranzutreiben. Vorzugsweise ist die CycHTr-Nukleinsäure oder Variante davon operativ mit einem samenspezifischen Promoter verknüpft. Ein samenspezifischer Promoter ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe, (bei „leaky”-Expression) transkriptionell aktiv. Der samenspezifische Promoter kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Samenspezifische Promoter sind in der Fachwelt gut bekannt. Vorzugsweise ist der samenspezifische Promoter ein Oleosinpromoter oder ein WSI18-Promoter oder ein funktionell äquivalenter Promoter. Stärker bevorzugt ist die Promotersequenz wie von einer der SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 und SEQ ID NO: 164 dargestellt. Es muss klargestellt werden, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die CycHTr-Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 165 beschränkt ist und dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer CycHTr-Nukleinsäure, wenn diese von einem samenspezifischen Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist. Beispiele für andere samenspezifische Promoter, die ebenso eingesetzt werden können, um die Expression einer CycHTr-Nukleinsäure voranzutreiben, sind in dem Abschnitt „Definitionen” gezeigt.
  • Optional können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer beinhalten. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zu den 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz kann auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden, um die Informationsmenge, die im Zytosol akkumuliert, zu erhöhen; Beschreibung im Abschnitt „Definitionen”. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR- Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Die Erfindung stellt spezifischer ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbessertem Ertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Norther- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden.
  • Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes CycHTR-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden.
  • Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Modulation (vorzugsweise das Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Verbesserung der Ertragsmerkmale, lässt sich auch mit anderen, gut bekannten Techniken erzielen, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung von einigen dieser Techniken findet sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Weiterhin können für die Erzeugung von Mutationen in endogenen CycH-Genen EMS-Mutagenese oder Insertionsmutagenese unter Verwendung von T-DNA oder Transposons eingesetzt werden, was zur Bildung einer CycHTr-Kodiersequenz führt. Diese Techniken sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für wie im vorliegenden Text beschriebene CycHTr-Polypeptide kodieren, und die Verwendung dieses CycHTr-Polypeptids bei der Verbesserung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Nukleinsäuren, die für ein wie im vorliegenden Text beschriebenes CycHTr-Polypeptid kodieren, bzw. die CycHTr-Polypeptide selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein CycHTr-Polypeptid kodierenden Gen verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Nukleinsäuren/Gene bzw. die CycHTr-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
  • Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial beginnen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die einen erhöhten Ertrag geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
  • Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuren, die für CycHTr-Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuren als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für das CycHTr-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al, In: Non mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
  • Mit den Nukleinsäuren können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic. Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping" (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping" (Dear und Cook (1989), Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
  • IV. Remorin
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Wird im folgenden Text ein „Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so versteht man darunter ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für solch ein Remorin-Polypeptid zu kodieren. Bei der Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze einzuführen ist (und die daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist), handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die die Art Protein, die nun beschrieben werden wird, kodiert und die im folgenden Text auch „Remorin-Nukleinsäuresequenz” oder „Remorin-Gen” genannt wird.
  • Ein im vorliegenden Text definiertes „Remorin-Polypeptid” bedeutet jegliches Polypeptid, das Folgendes umfasst: (i) eine C-terminale Remorin-Domäne (entsprechend der Pfam-Familie mit der Zugangsnummer PF03763); und (ii) eine C-terminale prognostizierte Coiled-Coil-Domäne.
  • Zusätzlich umfasst ein im vorliegenden Text definiertes „Remorin-Polypeptid” eines oder beide der folgenden Merkmale: (i) eine C-terminale Remorin-Domäne, die an geladenen Aminosäuren angereichert ist; (ii) mindestens ein Cys und/oder ein Phe, das in den letzten zehn Aminosäureresten am C-terminalen Ende des Polypeptids umfasst ist.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bedeutet ein „Remorin-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert jegliches Polypeptid, das mit ansteigender Bevorzugung mindestens 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der C-terminalen Remorin-Domäne gemäß SEQ ID NO: 326 aufweist.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bedeutet ein „Remorin-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert jegliches Polypeptid, das mit ansteigender Bevorzugung mindestens 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199 aufweist.
  • Die Begriffe „Domäne” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, (2004), Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, oder Pfam (Bateman et al, (2002) Nucleic Acids Research 30(1): 276–280). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (gehostet vom Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 199 ist unten in den Beispielen 32 und 34 dargestellt. Die C-terminale Remorin-Domäne ist in der Pfam-Datenbank als Pfam Familie mit der Zugangsnummer PF03763 identifiziert und in der Prodom-Datenbank als Zugangsnummer PD350442. Die C-terminale Remorin-Domäne gemäß SEQ ID NO: 199 wird gemäß ihrer Identifikation in der Pfam-Datenbank durch die SEQ ID NO: 326 dargestellt. Da der Prozentsatz der Identität zwischen der C-terminalen Remorin-Domäne der Remorin-Polypeptide angeblich ist, ist die Identifikation von solchen Domänen unter Verwendung der Algorithmen von Spezialdatenbanken wie Pfam besonders nützlich.
  • Der „N-Terminus” (auch unter der Bezeichnung „N-terminales Ende” oder „Amino-Terminus” bekannt) soll im vorliegenden Text das Ende eines Proteins oder Polypeptids oder Peptids bedeuten, das von einer Aminosäure mit einer freien Aminogruppe (-NH2) beendet wird. Der „C-Terminus” (auch unter der Bezeichnung „C-terminales Ende” oder „Carboxy-Terminus” bekannt) eines Proteins oder Polypeptids oder Peptids ist das Ende der Aminosäurekette, das von einer freien Carboxygruppe (-COOH) beendet wird. Unter „C-terminaler Hälfte” versteht man diejenige Hälfte des Polypeptids, die den C-Terminus umfasst. Unter „C-terminaler Domäne” versteht man im vorliegenden Zusammenhang eine Domäne, die in derjenigen Hälfte des Polypeptids umfasst ist, die den C-Terminus umfasst. Das Vorhandensein von mindestens einem Cys und/oder einem Phe in den letzten zehn Aminosäureresten am C-Terminus des Remorin-Polypeptids kann einfach durch Betrachtung erfolgen. Sobald der C-Terminus des Remorin-Polypeptids identifiziert ist, werden die zehn Aminosäurereste stromaufwärts davon (in Richtung des N-Terminus) auf das Vorhandensein von mindestens einem Cys und/oder einem Phe überprüft.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. Mat-GAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wäre, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können zum Beispiel statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7). Die Sequenzidentitätswerte, die unten in Beispiel 33 als Prozentsatz angegeben sind, wurden mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz (Tabelle Q1 im vorliegenden Text) und/oder über ausgewählte Domänen (wie die C-terminale Remorin-Domäne gemäß SEQ ID NO: 326; Tabelle Q1 im vorliegenden Text) oder konservierte(s) Motiv(e) bestimmt. Der Prozentsatz der Identität zwischen den Remorin-Polypeptiden ist angeblich niedrig (nur 10%), und diejenige zwischen der C-terminalen Remorin-Domäne der Remorin-Polypeptide ist etwas höher (15% oder mehr).
  • Weiterhin kann das Vorhandensein von Regionen, die reich an bestimmten Aminosäuren sind (wie eine Domäne, die reich an geladenen Aminosäuren ist), mittels Computer-Algorithmen oder einfach durch Betrachten identifiziert werden. Im ersteren Fall kann die primäre Aminosäurezusammensetzung (in %) zur Bestimmung, ob eine Polypeptidregion reich an bestimmten Aminosäuren ist, unter Verwendung von Software-Programmen des ExPASy-Servers, insbesondere dem ProtParam-Werkzeug (Gasteiger E et al, (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788) berechnet werden. Die Zusammensetzung des interessierenden Polypeptids kann dann mit der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (in %) in der Swiss-Prot Proteinsequenzdatenbank verglichen werden. Innerhalb dieser Datenbank beträgt der durchschnittliche Prozentsatz der geladenen Aminosäuren (Asp, Glu Lys und Arg) 23% (Tabelle F im vorliegenden Text). Wie im vorliegenden Text definiert ist eine C-terminale Remorin-Domäne eines Remorin-Polypeptids dann an geladenen Aminosäuren angereichert, wenn der Prozentsatz der geladenen Aminosäurereste dieser Remorin-Domäne über dem Prozentsatz der geladenen Aminosäurereste in der Swiss-Prot Proteinsequenzdatenbank liegt. Vorzugsweise beträgt der Prozentsatz an geladenen Aminosäuren in einer C-terminalen Remorin-Domäne eines Remorin-Polypeptids 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% oder mehr als der Prozentsatz der geladenen Aminosäuren in der Swiss-Prot Proteinsequenzdatenbank. So zum Beispiel umfasst die C-terminale Remorin-Domäne gemäß SEQ ID NO: 326 40% geladene Aminosäuren, insbesondere Lys, Arg und Glu, wie dies in Beispiel 36 dargestellt ist.
  • Coiled Coils sind für die Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen wie Oligomerisation, entweder von identischen Proteinen oder von Proteinen derselben Familie oder von nichtverwandten Proteinen, wichtig. Ein Remorin-Polypeptid kann mit sich selbst oder mit einem Remorin-Ortholog oder einem Paralog interagieren. In letzter Zeit fanden in der computergestützten Vorhersage von „Coiled Coils” aufgrund Sequenzdaten große Fortschritte statt. Unter den Algorithmen, mit denen der Fachmann vertraut ist, sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen COILS, PAIRCOIL, PAIRCOIL2, MULTICOIL, oder MARCOIL des Swiss Institute for Bioinformatics verfügbar. In Beispiel 36 bzw. 19 sind die zahlenmäßigen und graphischen Ergebnisse von SEQ ID NO: 199 als Ergebnis der COILS Algorithmusanalyse dargestellt. Eine C-terminale prognostizierte „Coiled-Coil”-Domäne ist in der Remorin-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199 identifiziert.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die Transformation von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198, die für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199 kodiert, erläutert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung von jeglicher Remorin-Nukleinsäurekodiersequenz bzw. jedes Remorin-Polypeptids wie im vorliegenden Text definiert durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die für pflanzliche Remorin-Polypeptide kodieren, sind in Tabelle P von Beispiel 31 im vorliegenden Text angeführt. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen der Remorin-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 199, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der Sequenzen in Tabelle P von Beispiel 31). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 198 oder SEQ ID NO: 199, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels des Prozentsatzes der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Nukleinsäurevarianten können ebenfalls bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Zu Beispielen für solche Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodieren, wobei die Begriffe „Homolog” und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe „Abschnitt”, „hybridisierende Sequenz”, „Spleißvariante”, „Allelvariante” und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text beschrieben.
  • Bei den Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, muss es sich nicht um Volllängen-Nukleinsäuresequenzen handeln, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht von der Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen abhängig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 oder einem Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für Remorin-Polypeptide wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Wirksamkeit auf wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle P von Beispiel 31 angeführt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mit steigender Bevorzugung mindestens 200, 300, 400, 500 oder 600 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um beliebige der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 handelt oder um eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, handelt. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für eine Polypeptidsequenz umfassend eine oder mehrere der im vorliegenden Text definierten Domänen oder Motive. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text zu hybridisieren vermag.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, das man eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, an eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 oder einem Abschnitt von einer Sequenzen zu hybridisieren, wobei in ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Amonisäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 zu hybridisieren. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Polypeptidesequenz, die ein oder mehrere Motive oder Domänen wie im vorliegended Text definiert umfaßt. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198 oder einen Abschnitt davon bei hybridisieren. Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für eine Polypeptidsequenz umfassend eine(s) oder mehrere der im vorliegenden Text definierten Domänen oder Motive. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung Wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Spleißvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31, oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Die Spleißvarianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das Remorin-Polypeptid von SEQ ID NO: 199 und eine beliebige der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 auf. Vorzugsweise umfasst die Polypeptidsequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Am stärksten bevorzugt ist die Spleißvariante eine Spleißvariante der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 198 oder eine Spleißvariante der Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 199 kodiert.
  • Eine weitere Nukleinsäurevariante, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die Allelvarianten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199 und einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 1 auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Vorzugsweise umfasst die von der Allelvariante kodierte Polypeptidsequenz eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante von SEQ ID NO: 198 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 199 kodiert.
  • „Gene shuffling” oder gerichtete Evolution können ebenfalls eingesetzt werden, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen, wobei der Begriff „gene shuffling” wie im vorliegenden Text definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 kodiert, wobei diese Nukleinsäuresequenz durch „gene shuffling” erhalten wurde, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Die Nukleinsäuresequenzvarianten, die durch „gene shuffling” erhalten wurden und die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselben biologischen Eigenschaften wie das Remorin-Polypeptid von SEQ ID NO: 199 und einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle P von Beispiel 31 auf. Vorzugsweise kodiert die Nukleinsäuresequenzvariante, die durch gene shuffling erhalten wurde, für eine Polypeptidsequenz umfassend eine(s) oder mehrere der Motive oder Domänen wie im vorliegenden Text definiert.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
  • Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die für das Remorin-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, speziell erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” sind im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text genauer beschrieben.
  • Werden im vorliegenden Text verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse bzw. des Biomassegewichts von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Hektar oder Acre etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, Korngewicht, Tausendkorngewicht, Ährenlänge/-durchmesser, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale äußern: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht und viele andere mehr.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, in einer Pflanze erhöht. Vorzugsweise ist ein verbessertes Ertragsmerkmal eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Samenfüllungsrate; (ii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; (iv) erhöhte Gesamtzahl Samen; (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem oder mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, wenn die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, unter Nichtstressbedingungen steht oder verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilzen und Insekten verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, verbesserten Ertragsmerkmalen erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, heranwachsen, einen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen, Teile davon (darunter Samen) und Pflanzenzellen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen, Teile davon oder Pflanzenzellen umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression der Nukleinsäuresequenzen, die für ein Remorin-Polypeptid kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in eine Pflanze und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Konstrukts in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz
    bereit.
  • Die Begriffe „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Kontrollsequenz um einen konstitutiven Promoter, vorzugsweise einen der folgenden Promoter: (i) GOS2-Promoter; oder (ii) High Mobility Group B (HMGB) Promoter.
  • Die Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die auf dem Vektor vorliegen müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, selektieren und vermehren, gut vertraut. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) operativ verknüpft.
  • Vorteilhaft kann eine beliebige Art von Promoter verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz voranzutreiben. Ein konstitutiver Promoter ist in den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich. Es ist klar, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 198 kodiert, beschränkt ist und dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promoter ist vorzugsweise einer der folgenden: (i) GOS2-Promoter; oder (ii) high mobility group B (HMGB) Promoter. Weitere Beispiele für konstitutive Promoter finden sich im vorliegenden Text in Tabelle 2 im Abschnitt „Definitionen”. Weiterhin bevorzugt stammt der GOS2-Promoter von Reis, stärker bevorzugt ist er im Wesentlichen dem GOS2-Promoter gemäß SEQ ID NO: 329 ähnlich, am stärksten bevorzugt ist der GOS2-Promoter wie in SEQ ID NO: 329 oder SEQ ID NO: 39 dargestellt. Weiterhin bevorzugt stammt der HMGB-Promoter von Reis, stärker bevorzugt ist er im Wesentlichen dem HMGB-Promoter gemäß SEQ ID NO: 330 ähnlich, am stärksten bevorzugt ist der HMGB-Promoter wie in SEQ ID NO: 330 oder SEQ ID NO: 331 dargestellt.
  • Wahlweise können in dem in die Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen benutzt werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer beinhalten. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zu den 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz kann auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden, um die Informationsmenge, die im Zytosol akkumuliert, zu erhöhen; Beschreibung im Abschnitt „Definitionen”. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • Die Erfindung stellt insbesondere auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, einen Teil davon oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die fähig ist, für ein Remorin-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert zu kodieren.
  • Die Nukleinsäuresequenz kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse oder quantitativer PCR auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden.
  • Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder jegliches Pflanzenteil oder jegliche Pflanze Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alles Pflanzenvermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein wie oben definiertes Remorin-Polypeptid kodiert, enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren. Stärke oder Proteine.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Verbesserung der Ertragsmerkmale, lassen sich jedoch auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielen, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide wie im vorliegenden Text beschrieben kodieren, und die Verwendung dieser Remorin-Polypeptide bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Vorzugsweise handelt es sich bei den verbesserten Ertragsmerkmalen um erhöhten Ertrag, stärker bevorzugt erhöhten Samenertrag, am stärksten bevorzugt umfasst der erhöhte Samenertrag eines oder mehrere der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Samenfüllungsrate; (ii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; (iv) erhöhte Gesamtzahl Samen; (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index.
  • Die Erfindung stellt auch bis jetzt unbekannte Nukleinsäuren, die für Remorin kodieren, und Remorin-Polypeptide bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe, bereitgestellt:
    • (i) Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 332;
    • (ii) Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 332;
    • (iii) Nukleinsäure, die für ein Remorin-Polypeptid mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333 und mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 334 kodiert (VKKEEVETKVTAWQTAEVAKINNRFKREDVVINGWETEQVEKASAWLKKIERKLDEQRAKALEKTQNDIAKARRKAEEKRASAEAKRGLKLAKVLELANFMKAVGRVPTKR, die zu der C-terminalen Region von SEQ ID NO: 326 passt).
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der folgenden Reihe, bereitgestellt:
    • (i) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333;
    • (ii) Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333, und mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 334 (VKKEEVETKVTAWQTAEVAKINNRFKREDVVINGWETEQVEKASAWLKKIERKLDEQRAKALEKTQNDIAKARRKAEEKRASAEAKRGLKLAKVLELANFMKAVGRVPTKR, die zu der C-terminalen Region von SEQ ID NO: 326 passt);
    • (iii) Abkömmlinge von einer der Aminosäuresequenzen in (i) oder (ii) oben.
  • Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide wie im vorliegenden Text beschrieben kodieren, oder die Remorin-Polypeptide selbst, können in Züchtungsprogrammen, in denen ein DNA-Marker, der mit einem Gen, das für ein Remorin-Polypeptid kodiert, genetisch verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen bzw. die Remorin-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
  • Allelvarianten eines Gens/einer Nukleinsäuresequenz, das/die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial beginnen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die erhöhte Ertragsmerkmale geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
  • Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuresequenzen als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäuresequenz, die für das Remorin-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben: So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al, In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
  • Mit den Nukleinsäuresequenzen können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuren beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic. Acid Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping" (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping" (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesem Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäure, um Primer-Paare für die Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragsverbessernden Merkmalen, Toleranz für andere abiotische und biotische Stressfaktoren, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
  • V. DREB
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man dadurch, dass man die Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder die Menge und/oder die Aktivität eines DREB-Proteins in Pflanzen reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag gelangt. Die vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder die Menge und/oder die Aktivität eines DREB-Proteins reduziert oder im Wesentlichen eliminiert.
  • Die Auswahl einer Kontrollpflanzen ist ein Routineschritt eines Versuchsansatzes und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen, in denen keine Modulation (durch menschlichen Eingriff) der Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder der Menge und/oder der Aktivität eines DREB-Proteins vorliegt, umfassen.
  • Vorteilhaft führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” sind im vorliegenden Text genauer in dem Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Unter dem Begriff „erhöhter Ertrag” versteht man im vorliegenden Zusammenhang eine (mengenmäßige) Erhöhung bei einem oder mehreren erntbaren Teilen einer Pflanze, wozu Biomasse (Gewicht) zählen kann, egal, ob oberirdische Teile und/oder unterirdische Teile.
  • Insbesondere zählen zu solchen erntbaren Teilen vegetative Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit einem im Vergleich zu dem Ertrag von Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag (an vegetativer Biomasse und/oder Samen).
  • Eine Erhöhung der Anzahl Samen kann das Ergebnis von mehr Bestockungstrieben pro Pflanze und/oder mehr Infloreszenz (Rispen) pro Bestockungstrieb oder pro Pflanze und/oder mehr Blüten pro Rispe oder pro Pflanze sein. Die Erhöhung kann auf eine niedrigere Blüten-/Embryoabstoßung und/oder eine Erhöhung der Befruchtungseffizienz und/oder eine verbesserte Samenfüllung zuruckzuführen sein.
  • Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern.
  • Dies kann die Menge an Stoffen in dem Samen, wie Öle, Proteine und Kohlenhydrate, erhöhen bzw. deren Zusammensetzung verändern. Weiterhin kann eine Erhöhung des Samenertrags sich auch als Erhöhung der Samenoberfläche und/oder Samenlänge und/oder der Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur entstehen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: erhöhte Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, Korngewicht, Tausendkorngewicht, Ährenlänge/-durchmesser, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale äußern: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht und viele andere mehr.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere einer erhöhten Anzahl an Rispen und/oder erhöhtem Samenertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Pflanzensamenertrags und/oder erhöhte Anzahl Rispen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man das Aktivitätsniveau eines DREB-Proteins reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, vorzugsweise durch Herunterregulieren der Expression eines DREB-Gens.
  • Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen. Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem oder mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte (Keimlings-)Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate und/oder erhöhter Keimlingsvitalität. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen und/oder der Keimlingsvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder die Menge und/oder die Aktivität eines endogenen DREB-Gens in einer Pflanze vorzugsweise reduziert und/oder im Wesentlichen eliminiert.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate findet dann statt, wenn die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen unter Nichtstressbedingungen steht oder verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichter Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Nematoden, Pilzen und Insekten verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag erhält. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhten Ertrag aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Trockenheitsbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein DREB-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, heranwachsen, einen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein DREB-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann das Ergebnis einer Unterversorgung mit Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor und anderen mehr sein.
  • Die oben genanten Wachstumseigenschaften können vorteilhafterweise in jeder beliebigen Pflanze modifiziert werden.
  • Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten, und Gewebe und Organe, wobei jeder der genannten Teile das interessierende Gen/die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canoia-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt wird, dass die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist. Zu Beispielen für monokotyle Pflanzen zählt Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu Beispielen für Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Triticale, Roggen, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer.
  • Das endogene DREB-Protein, das für die Erfindung relevant ist, bedeutet ein Protein umfassend eine einzige AP2-Domäne, die fähig ist, an ein DRE-Element (dehydration response element), das in einem Promoter oder einem Fragment davon umfasst ist, zu binden.
  • Typischerweise umfassen die DREB-Proteine zusätzlich zu der AP2-Domäne mehrere charakteristische konservierte Motive, nämlich CMIII-1 bis CMIII-4 und/oder CMIV-1 und CMIV-2, wie die von Sakuma et al, 2002 (Biochemical und Biophysical Research Communications (2002), 290, 3, 998–1009) beschriebenen. Zusätzlich kann das DREB-Protein ein Kernlokalisierungssignal enthalten, dessen Funktion darin besteht, das Protein zum Zellkern zu dirigieren. Die Kernlokalisierung wurde zum Beispiel für das OsDREB1L-Protein (das mit SEQ ID NO: 336 identisch ist) beschrieben (Chen et al, 2003, Theor. Appl. Genet. 107: 972979).
  • Weiterhin neigen die DREB-Proteine, wenn sie in einem phylogenetischen Stammbaum von AP2-Proteinen analysiert werden, eher dazu, gemeinsam in einer separaten Klade abseits von Kladen, die AP2-Proteine, die zu anderen Unterfamilien wie den Unterfamilien Apetala 2, RAV oder ERF gehören, umfassen, Cluster zu bilden. Die phylogenetische Beziehung zwischen den AP2-Proteinen ist ausführlich beschrieben worden (Shigyo et al, Gene 366 (2006) 256–265; Nakano et al, 2006; Dubouzet et al, 2003). Verfahren zur Durchführung einer Analyse der phylogenetischen Beziehung der DREB-Proteine sind in der Fachwelt gut bekannt. Typischerweise führt man mit den Proteinsequenzen ein Alignment unter Verwendung einer der vielen verfügbaren Methoden, wie CLUSTAL X oder derjenigen, die in Align AlignX von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, durch. Mit dem Alignment als Input wird ein Stammbaum erstellt, und zwar unter Verwendung von Algorithmen, wie sie zum Beispiel in Vector NTI (Invitrogen) oder in dem PHYLIP-Paket oder in MOLPHY Version 2.3b3 (Adachi und Hasegawa, 1996) bereitgestellt werden. Es wird ein Maximum-Likelihood-Stammbaum erstellt. Die Wahrscheinlichkeiten der Stammbäume können zum Beispiel unter Verwendung von zum Beispiel des ProtML-Programmen mit dem JTT-Modell berechnet werden, und die Stammbäume können gemäß ihrer AIC-Werte (Akaike Information Criterion) sortiert werden (Adachi und Hasegawa, 1996). Die lokale Bootstrap-Wahrscheinlichkeit jedes Zweigs kann unter Verwendung der RELL-Methode (Resampling-of-Estimatedlog-Likelihood) geschätzt werden (Kishino et al, 1990; Hasegawa und Kishino, 1994). Ein Beispiel für einen phylogenetischen Stammbaum eines AP2-Proteins, der die separaten Kladen zeigt, in denen die DRE-Proteine Cluster bilden, ist in 25 dargestellt. Vorzugsweise bildet das DREB-Protein, das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, Cluster innerhalb der Gruppe NP_567719.
  • Die AP2-Domäne ist dem Fachmann gut bekannt und in Datenbanken wie pfam, interpro und smart ausführlich beschrieben (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002); Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318; Letunic et al, (2006), Nucleic Acids Res. 34, D257–D260). Die Sequenz ”.a+GVp.+.hG.+W.ucltcs..........ttclaLGoFsottAAhAYD.AAhhhhG..pAhhNFs....tt” (SEQ ID NO: 340) stellt gemäß SMART-Datenbank eine Konsensus-Sequenz einer AP2-Domäne dar. Die Zugangsnummer für die AP2-Domäne in der SMART-Datenbank lautet SM00380. Die in den Abkürzungen verwendeten Aminosäuregruppierungen sind in Tabelle 4 dargestellt. „Gaps” und „Insertionen”, typischerweise bis zu 5 Aminosäuren, sind gestattet. Die AP2-Domäne ist ungefähr 60-70 Aminosäuren lang und weist DNA-Bindungsaktivität auf (Ohme-takagi und Shinshi; Plant Cell 1995; 7: 173–182). Zum Beispiel bindet sie an die GCC-Box, die in Promotern von „pathogenesis-related”-Proteinen vorliegt (Liu et al, 2006. FEBS Lett. 580(5): 1303–8). Tabelle 4. Code der Aminosäuregruppierung, der in der AP2-Konsensussequenz verwendet wird (SEQ ID NO: 340). „Klasse” bezieht sich auf die Aminosäureklassifikation, „Schlüssel” bedeutet den für eine Klasse verwendeten Code, „Reste” bezeichnet die Aminosäuren, die in eine bestehende Klasse fallen.
    Klasse Schlüssel Reste
    alkohol o S,T
    aliphatisch l I,L,V
    beliebig . A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y
    aromatisch a F,H,W,Y
    geladen c D,E,H,K,R
    hydrophob h A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y
    negativ – D,E
    polar p C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T
    positiv + H,K,R
    klein s A,C,D,G,N,P,S,T,V
    winzig u A,G,S
    „turn-like” t A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T
  • Verfahren zum Identifizieren einer AP2-Domäne werden im vorliegenden Text beschrieben. In Beispiel 49 finden sich weitere Einzelheiten über solche Verfahren. Das für die Erfindung relevante DREB-Protein umfasst eine AP2-Domäne (DNA-Bindungsdomäne) mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu der Domäne gemäß SEQ ID NO: 340 oder SEQ ID NO: 341.
  • DREB-Proteine können an die cis-Elemente binden, die in den Promotern von Stressreaktionsgenen, verkörpert durch die Elemente DRE (dehydration-responsive element), CRT (C-repeat) und LTRE (low temperature responsive element) vorliegen. Die Nukleinsäuresequenz TACCGACAT verkörpert das DRE-Element, während das CCGAC- Core-Motiv auch indem CRT- und in dem LTRE-Motiv, wie sie in Promotern der Stressgene von Arabidopsis thaliana vorliegen, umfasst ist. DREB-Proteine binden spezifisch an sechs Nukleotide, die durch (G/a)(C/t)CGAC (SEQ ID NO: 342) innerhalb des DRE-Elements verkörpert werden. Der Fachmann kann unter Verwendung von bioinformatischen Standardmethoden und molekularen Werkzeugen leicht DRE/CRT/LTRE-Motiv in einer Polynukleotidsequenz identifizieren. Die Protein-DNA-Bindung von DREB-Proteinen an das DRE/CRT/LTRE-Motiv kann in vivo getestet werden, zum Beispiel in einem Ein-Hybrid-Screening, oder in vitro unter Verwendung von „gel mobility shift”-Assays. Diese Verfahren sind in der Fachwelt gut bekannt und beschrieben (Xue, Biochim Biophys Acta. (2002), 1577(1): 63–72; Hao D, et al, Biochemistry. 2002, Apr. 2; 41(13): 4202–8; Dubouzet et al, 2003); Qin et al,. 2004, Aug.; 45(8): 1042–52).
  • Das für die Erfindung relevante DREB-Protein ist fähig, an ein DNA-Molekül umfassend das DRE-Element gemäß SEQ ID NO: 342 zu binden.
  • AP2/ERF-Proteine wurden auf Grundlage des Vorhandenseins von konservierten Motiven in ihrer Aminosäuresequenz eingeteilt. Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen DREB-Proteine fallen in die Untergruppen A-1 und A-2 der AP2/ERF-Transkriptionsfaktoren wie von Sakuma et al, 2002, (Biochemical and Biophysical Research Communications, 290, 998–1009) definiert oder alternativ dazu unter die Gruppen IIIc, IVa und IVb gemäß der Einteilung von Nakano et al, 2006, (Plant Phys. 140, 411–432).
  • Gemäß Nakamo et al, 2006, umfassen die Arabidopsis-thaliana-DREB-Proteine in Gruppe IIIc zusätzlich zu einer AP2-Domäne mehrere konservierte Motive, nämlich CMII-1 bis CMIII-4. CMIII-1 kann durch die Sequenz PELAWSLPRPESTSPKDIQAAAAEAAAMF (SEQ ID NO: 343), CMII-2 durch Sequenz QSCGAFFMDEEAMLGMPNLLANMAEGMLLPPP (SEQ ID NO: 344), CMIII-3 durch Sequenz DYDPTLAESCPKKPAGRKKFR (SEQ ID NO: 345), und CMIII-4 durch LWSY (SEQ ID NO: 346; nach Nakano et al, 2006) dargestellt werden. Die Motive CMIII-2 und CMIII-4 sind typischerweise in der C-terminalen Region lokalisiert. Die Motive CMIII-2 und CMIII-4 sind innerhalb eines 98 Aminosäuren langen C-terminalen Abschnitts der Arabidopsis-thaliana-CBF1/DREB1B-Proteine umfasst, von dem wiederholt gezeigt wurde, dass er als Transaktivierungsdomäne agiert (Wang et al, 2005, Plant Mol. Biol. 58: 543–559).
  • „CMIII-3-Motiv” bedeutet die stark konservierten Regionen, die sich beidseitig von AP2/ERF finden. Das Vorhandensein von konservierten Sequenzen in diesen beiden Regionen, nämlich PKK/RPAGRxKFxETRHP (Region I), wobei X eine beliebige Aminosäure bedeutet (SEQ ID NO: 347), und DSAWR (Region II) (SEQ ID NO: 348), ist in den DREB-Proteinen von verschiedenen Pflanzenarten konserviert (Jaglo et al, 2001, Plant Physiol. 127: 910–917; Haake et al, 2002, Plant Physiol. 130: 639–648).
  • DREB-Proteine, die zu der Gruppe IV gemäß Nakano et al, 2006 gehören, umfassen die Motive CMIV-1 und CMIV-2 gemäß der konservierten Sequenz K/RGKGGPxN (SEQ ID NO: 349) bzw. KKRKRRGGRDVAEILKKWKEYNEQVEADSCIDGGGPKKIRK (SEQ ID NO: 350), worin X eine beliebige Aminosäure bedeuten kann. Das CMIV-2-Motiv beinhaltet ein mutmaßliches Kernlokalisierungssignal (Liu et al, 1998).
  • Typischerweise sollte das Vorhandensein von mindestens einem konservierten Motiv, das mit den Motiven CMIII-1 bis CMIII-4, Region I und II, Motiven CMIV-1 und CMIV-2 in einer Polypeptid umfassenden AP2-Domäne identisch bzw. dazu ausreichend homolog ist, ausreichen, um eine Abfragesequenz als DREB-Protein zu identifizieren, das Vorhandensein von zumindest PKK/RPAGRxKFxETRHP (Region I) und DSAWR (Region II) wird jedoch bevorzugt.
  • Die Konsensus-Sequenz für die konservierten Motive beruht in erster Linie auf Sequenzen von DREB-Proteinen von Arabidopsis thaliana. Ein Fachmann wäre sich darüber im Klaren, dass, wenn weitere oder andere Sequenzen (zum Beispiel Sequenzen vom anderen Organismus) für Vergleichszwecke verwendet würden, die Konsensus-Sequenz in gewissem Ausmaß variieren kann, darunter auch durch die Deletion oder Insertion von Aminosäuren. Vorzugsweise ist die konservierte Sequenz von CMIII-1 bis CMIII-4 und der Motive CMIV-1 und CMIV-2 mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% zu einem der konservierten Motive CMIII-1 bis CMIII-4, CMIV-1 und CMIV-1 identisch. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei den konservierten Motiven um diejenigen, die in dem Reisprotein OsDREB1A oder Os09g0522200 gemäß 23 vorhanden sind.
  • Vorzugsweise umfasst das für die Erfindung relevante DREB-Protein folgendes:
    • (i) eine AP2-DNA-Bindungsdomäne mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 340 oder SEQ ID NO: 341 und
    • (ii) ein oder mehrere konservierte Motive mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer der SEQ ID NO: 343 bis SEQ ID NO: 350.
  • Noch stärker bevorzugt umfasst das in den erfindungsgemäßen Verfahren nützliche DREB-Protein
    • (i) eine AP2-DNA-Bindungsdomäne mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 340 oder SEQ ID NO: 341 und
    • (ii) ein oder mehrere konservierte Motive mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer der SEQ ID NO: 343 bis SEQ ID NO: 348.
  • Beispiele für DREB-Proteine und DREB-Gene, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, finden sich in Beispiel 46.
  • Weiter bevorzugt ist, dass das erfindungsgemäße relevante DREB-Protein eine Sequenz, die mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in Beispiel 46 aufweist, umfasst. Am stärksten bevorzugt weist das DREB-Protein eine der Sequenzen in Beispiel 46, am stärksten bevorzugt gemäß SEQ ID NO: 336, auf.
  • Wird im folgenden Text eine „Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination” der Expression eines endogenen DREB-Gens in einer Pflanze erwähnt, so soll dies eine Reduktion oder Verringerung der DREB-Gentranskription und/oder der Menge und/oder der Konzentration der DREB-mRNA im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination kann zu einer reduzierten oder verringerten oder im Wesentlichen aufgehobenen DREB-mRNA-Aktivität in einer Pflanze führen. Die Verringerung, Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination beträgt mit ansteigender Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wird im vorliegenden Text eine „Reduktion” der Menge eines endogenen DREB-Proteins in einer Pflanze erwähnt, so soll dies eine Reduktion oder Verringerung der DREB-Proteinmenge und/oder -Proteinkonzentration oder im Wesentlichen stattfindende Elimination eines endogenen DREB-Proteins im Vergleich zu den endogenen DREB-Proteinmengen, die in Kontrollpflanzen auftreten, bedeuten. Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination kann zu einer reduzierten oder im Wesentlichen aufgehobenen DREB-Proteinaktivität in einer Pflanze führen. Die Verringerung, Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination beträgt mit ansteigender Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wird im vorliegenden Text eine „Reduktion” der Aktivität eines endogenen DREB-Proteins in einer Pflanze erwähnt, so soll dies eine Reduktion oder Verringerung der DREB-Proteinaktivität und/oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Aktivität eines endogenen DREB-Proteins im Vergleich zu den endogenen DREB-Proteinaktivitätsniveaus, die in Kontrollpflanzen auftreten, bedeuten. Die Verringerung, Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination beträgt mit ansteigender Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Vorzugsweise wird die Reduktion der endogenen DREB-Proteinmenge und/oder -aktivität durch Herunterregulieren der Expression des endogenen DREB-Gens erzielt.
  • Wird im vorliegenden Zusammenhang ein „endogenes” DREB-Gen erwähnt, so bezieht sich dies auf DREB-Gene, wie sie in einer Pflanze in ihrer natürlichen Form (d. h. ohne menschliches Eingreifen) auftreten. Die „Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination” der Expression des DREB-Gens und/oder der Menge und/oder Aktivität des DREB-Proteins, das für die Erfindung relevant ist, kann auch ein DREB-Transgen, also ein isoliertes DREB-Gen, das anschließend in einer Pflanze eingeführt worden ist, beeinflussen. Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren an einer transgenen Pflanze, die ein DREB-Transgen enthält, führt zu der Reduktion oder im Wesentlichen stattfindenden Elimination der Expression des endogenen DREB-Gens und/oder des DREB-Transgens, und/oder der Reduktion oder im Wesentlichen stattfindenden Elimination der Menge und/oder der Aktivität des DREB-Proteins im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder der Menge und/oder Aktivität des DREB-Proteins dadurch erzielt, dass man eine DREB-Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen homolog zu einem DREB-Gen ist, einführt, wobei stärker bevorzugt diese isolierte Nukleinsäure fähig ist, eine „hairpin”-Struktur zu bilden, und wobei weiter bevorzugt ist, dass die isolierte Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters steht.
  • Für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Um ein Gen-Silencing durchzuführen, können dies nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein; alternativ dazu kann dies sogar das gesamte Gen (inklusive Introns, der 5'- und/oder 3'-UTR (untranslated region), entweder ganz oder teilweise) sein. Der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotide kann von SEQ ID NO: 335 oder von einer der Nukleinsäuresequenzen in Beispiel 1 oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die fähig ist, für ein Homolog (Ortholog oder Paralog, wobei die Begriffe „Ortholog” und „Paralog” wie im vorliegenden Text definiert sind) zu kodieren, oder von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen in Beispiel 46 abgeleitet sein. Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist für die im vorliegenden Text diskutierten verschiedenen Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens nicht Voraussetzung.
  • Diese Reduktion (oder im Wesentlichen stattfindende Elimination) der endogenen DREB-Genexpression kann durch eines oder mehrere der verschiedenen gut bekannten Gen-Silencing-Verfahren erzielt werden. Die Begriffe Gen-Silencing oder ”Herunterregulieren” der Expression bedeuten im vorliegenden Zusammenhang eine Reduktion bzw. die im Wesentlichen stattfindende Elimination der DREB-Genexpression und/oder der DREB-Proteinmengen und/oder der DREB-Proteinaktivität. Eine Beschreibung von Techniken für das Herunterregulieren der Expression findet sich in dem Abschnitt „Definitionen”.
  • Ein solches Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression ist das RNA-vermittelte Herunterregulieren der Genexpression (RNA-Silencing). In diesem Fall wird das „Silencing” in einer Pflanze durch ein doppelsträngiges RNA-Molekül (dsRNA) ausgelöst, das zu einem Ziel-DREB-Gen im Wesentlichen homolog ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze weiter zu ungefähr 21 bis ungefähr 26 Nukleotiden mit der Bezeichnung „short interfering RNAs” (siRNAs) prozessiert. Die siRNAs werden in einem RNA-induzierten „Silencing”-Komplex (RISC) eingebaut, der die mRNA eines DREB-Zielgens spaltet und dadurch die Anzahl der DREB-mRNAs, die in ein DREB-Protein zu translatieren sind, reduziert oder im Wesentlichen eliminiert bzw. deren Konzentration reduziert. Die erfindungsgemäßen siRNAs weisen Sequenzen auf, die Fragmenten von ungefähr 21 im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden über die gesamte Sequenz des Zielgens entsprechen. Vorzugsweise können die in der Erfindung nützlichen siRNAs, die sich von dem Zielgen gemäß SEQ ID NO: 335 ableiten, eine Vielzahl von RNA-Molekülen umfassen, die aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden, die im Wesentlichen zu irgend welchen vorgegebenen unmittelbar aufeinander folgenden 18 bis 26 Nukleotiden gemäß SEQ ID NO: 335 identisch sind, besteht.
  • Um die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der DREB-Genexpression zu erzielen, wird dsRNA bevorzugt, die eine Nukleotidsequenz enthält, die mit einem Abschnitt des Zielgens identisch oder im Wesentlichen dazu homolog ist. Die Erfindung weist jedoch den Vorteil auf, dass sie fähig ist, Sequenzvariationen tolerieren zu können, die aufgrund von genetischer Mutation, Stammpolymorphismus oder evolutionärer Divergenz erwartet werden könnten. RNA-Sequenzen mit Insertionen, Deletionen und Einzelpunktmutationen im Bezug auf die Zielsequenz können ebenfalls für die Reduktion wirksam sein. Es wird mehr als 90%, 92%, 94%, 96%, 98% Sequenzidentität, ja sogar bis zu 100% Sequenzidentität, zwischen der siRNA und dem DREB-Gen bevorzugt. Alternativ dazu kann die Duplexregion der RNA funktionell als Nukleotidsequenz, die fähig ist, mit einem Abschnitt des Zielgentranskripts unter stringenten Bedingungen (z. B. 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, bei 60 C Celsius über 12–16 h; anschließend waschen) zu hybridisieren, definiert werden. Die Länge der im Wesentlichen identischen doppelsträngigen Nukleotidsequenz kann mindestens ungefähr 21 (darunter mindestens 15), 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 oder mehr bis zu der Gesamtlänge des Ziel-DREB-Gens betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge der doppelsträngigen Nukleotidsequenz von ungefähr ca. 21 (mindestens 15) bis ungefähr 400 oder 500 Nukleotide lang und ist gleich oder kürzer als die Gesamtlänge des Ziel-DREB-Gens.
  • Bei einem Beispiel für ein RNA-„Silencing”-Verfahren werden Gensequenzen oder Teile davon in sense-Orientierung in einer Pflanze eingeführt. „sense-Orientierung” bedeutet DNA, die homolog ist oder die einem mRNA-Transkript davon entspricht. Es würde daher mindestens eine zusätzliche Kopie (ganz oder teilweise) eines DREB-Gens, das bereits in der Wirtspflanze vorliegt, in eine Pflanze eingeführt werden. Das zusätzliche Gen bzw. der Teil davon führt zu dem Silencing eines endogenen DREB-Gens, was zu einer Erscheinung, die als Cosuppression bekannt ist, führt. Die Reduktion der DREB-Genexpression wird stärker ausgeprägt sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien in die Pflanze eingeführt werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptmengen und dem Auslösen der Cosuppression besteht.
  • Bei einem anderen Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren verwendet man antisense-DREB-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”antisense”-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer „sense”-Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, komplementär ist, z. B. die zu dem Kodierstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls komplementär ist oder die zu einer mRNA-Sequenz komplementär ist. Demgemäß kann eine antisense-Nukleinsäure mit einer sense-Nukleinsäure hybridisieren. Die antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten DREB-Kodierstrang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. Antisense-Nukleinsäuren können gemäß den Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung entwickelt werden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann „antisense” zu einer „Kodierregion” oder „antisense” zu einer „Nichtkodierregion” der transkribierten mRNA oder premRNA des DREB-Gens sein. Der Begriff „Kodierregion” bezieht sich auf diejenige Region der Nukleotidsequenz, die Kodons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff „Nichtkodierregion” bezieht sich auf Sequenzen in einem Gen oder seiner transkribierten RNA, die außerhalb der Kodierregionen liegen. Solche Nichtkodierregionen können zumindest teilweise eine beliebige der folgenden Regionen umfassen: 5'-Leitsequenz, 3'-UTR (untranslated region) und Introns.
  • Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten Kodierregion der DREB-mRNA komplementär sein, es handelt sich dabei jedoch vorzugsweise um ein Oligonukleotid, das nur zu einem Abschnitt der Kodierregion bzw. Nichtkodierregion der DREB-mRNA „antisense” ist. So kann zum Beispiel das antisense-Oligonukleotid zu der Region, die die Translationsstartstelle der DREB-mRNA umgibt, komplementär sein. Die Länge eines geeigneten antisense-Oligonukleotids wäre fachbekannt und könnte bei ungefähr 20 Nukleotiden lang oder darunter beginnen. Eine erfindungsgemäße antisense-Nukleinsäure kann unter Verwendung von chemischen Synthese- und enzymatischen Ligationsreaktionen unter Verwendung von fachbekannten Vorgehensweisen konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine antisense-Nukleinsäure chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder von verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, die dergestalt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle erhöht wird oder dass die physikalische Stabilität des zwischen antisense- und sense-Nukleinsäuren gebildeten Doppelstrangs erhöht wird, so können zum Beispiel Phosphorothioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die für die Erzeugung der antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Ringschluss und „caps” sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analog wie Inosin. Weitere Modifikationen von Nukleotiden sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Alternativ dazu kann die antisense-Nukleinsäure biologisch hergestellt werden, und zwar unter Verwendung eines Expressionsvektors, in den eine Nukleinsäure in antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h. RNA, die von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wurde, wird in antisense-Orientierung in Bezug auf eine interessierende Zielnukleinsäure vorliegen; eine genauere Beschreibung erfolgt in dem folgenden Unterabschnitt). Vorzugsweise erfolgt die Herstellung von antisense-Nukleinsäuren in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Transgens, das einen Promoter, der für die bevorzugte Expression in Endospermgewebepflanzen operativ ist, ein antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression kann unter Verwendung von Routinemaßnahmen und -techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression besteht darin, dass man ein Genkonstrukt, in das die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Nukleinsäure in Form eines invertierten Repeats (ganz oder teilweise), die durch einen Spacer (nichtkodier-DNA) beabstandet ist, kloniert wurde, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  • In solch einem bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing reduziert oder im Wesentlichen eliminiert, und zwar unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure, der in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, oder eines Teils davon, der vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin”-Struktur zu bilden. Dieser invertierte Repeat wird in einen Expressionsvektor, der Kontrollsequenzen umfasst, kloniert. Zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den invertierten Repeat bilden, befindet sich eine Nichtkodier-DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, zum Beispiel ein „Matrix Attachment Region”-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker usw.). Nach der Transkription des invertierten Repeats bildet sich eine chimäre DREB-RNA mit einer autokomplementären Struktur (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als „hairpin”-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RISC eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA eines DREB-Zielgens weiter, wodurch die Anzahl von DREB-mRNAs, die in ein DREB-Protein zu translatieren sind, reduziert oder im Wesentlichen eliminiert wird. Siehe zum Beispiel Grierson et al, (1998), WO 98/53083 ; Waterhouse et al, (1999), WO 99/53050 ).
  • Die für das „Silencing” in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle (egal, ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren mit bzw. binden an Zell-mRNA und/oder eine genomische DNA-Region umfassend ein DREB-Gen, um dadurch die Expression des Proteins zu hemmen, z. B. dadurch, dass die Transkription und/oder Translation gehemmt wird. Die Hybridisierung kann durch traditionelle Komplementarität der Nukleotide erfolgen, wodurch ein stabiler Doppelstrang gebildet wird, oder, zum Beispiel im Falle eines antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA- Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuremoleküle können in eine Pflanze durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle eingeführt werden. Alternativ dazu können antisense-Nukleinsäuremoleküle dahingehend modifiziert werden, dass sie ausgewählte Zellen als Ziel ansteuern und dann systemisch verabreicht werden können. So können zum Beispiel antisense-Moleküle für die systemische Verabreichung so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. dadurch, dass man die antisense-Nukleinsäuremoleküle mit Peptiden oder Antikörpern verknüpft, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch unter Verwendung der im vorliegenden Text beschriebenen Vektoren an Zellen abgegeben werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt handelt es sich bei der antisense-Nukleinsäure um ein a-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein a-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride, in denen im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al, Nucl. Ac. Res. 15, 6625–6641, 1987). Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al, Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148, 1987) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al, FEBS Lett. 215, 327–330, 1987) umfassen.
  • Künstliche und/oder natürliche Mikro-RNAs (miRNAs) können dazu verwendet werden, um die Genexpression und/oder mRNA-Translation zu reduzieren. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die typischerweise 19-24 Nukleotide lang sind. Ihre Funktion besteht in erster Linie in der Regulation der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen mikroRNAs (miRNAs) weisen eine komplette oder beinahe komplette Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Diese werden ausgehend von längeren nichtkodierenden RNAs mit charakteristischen „Fold-Back”-Strukturen durch doppelsträngige spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie in den „RNA-induced silencing”-Komplex (RISC) eingebaut, und zwar durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonautenprotein. miRNAs dienen als Spezifitätskomponenten des RISCs, da sie eine Basenpaarung mit Zielnukleinsäuren, in erster Linie mRNAs, im Cytoplasma eingehen. Anschließende Regulationsereignisse beinhalten die Spaltung der Ziel-mRNA und die Zerstörung und/oder translationelle Hemmung. Auswirkungen der miRNA-Überexpression spiegeln sich daher häufig in verringerten mRNA-Mengen der Zielgene wider.
  • Natürliche miRNAs kommen in der Natur vor. Künstliche microRNAs (amiRNAs) sind jedoch ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. amiRNAs, die typischerweise 21 oder 24 Nukleotide lang sind, können dahingehend einem Genetic Engineering unterworfen werden, dass sie spezifisch die Genexpression von einzelnen oder mehreren interessierenden Genen negativ regulieren. Determinanten der pflanzlichen microRNA-Zielauswahl sind in der Fachwelt gut bekannt. Es wurden empirische Parameter für die Zielerkennung definiert, und diese können als Hilfe beim Entwickeln von spezifischen amiRNAs verwendet werden (Schwab R. et al, Dev. Cell 8 (4), 517–527, 2005). Praktische Werkzeuge für die Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls für die Allgemeinheit verfügbar (Schwab et al, Plant Cell 18 (5), 1121–1133, 2006).
  • Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination bevorzugt unter Verwendung von microRNA (natürlicher oder künstlicher miRNA) durchgeführt.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung handelt es sich bei einer antisense-Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, um ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die fähig sind, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, für die sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Ribozyme (z. B. „hammerhead”-Ribozyme (beschrieben bei Haselhoff und Gerlach (1988), Nature 334, 585–591)) können also dazu verwendet werden, um DREB-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch sie die Translation von DREB-mRNA inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäure, die für DREB kodiert, kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer DREB-cDNA entwickelt werden. Beispielsweise kann ein Derivat von Tetrahymena-L-19-IVS-RNA, in dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle zu der Nukleotidsequenz, die in eine mRNA, die für DREB kodiert, gespalten werden soll, komplementär ist, konstruiert werden. Siehe zum Beispiel: Cech et al, U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al, U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ kann DREB-cDNA auch dazu verwendet werden, um eine katalytische RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (Bartel und Szostak (1993), Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist in der Fachwelt bekannt (z. B. Atkins et al, (1994), WO 94/00012 ; Lenne et al, (1995), WO 95/03404 ; Lutziger et al, (2000), WO 00/00619 ; Prinsen et al, (1997), WO 97/13865 und Scott et al, (1997), WO 97/38116 ).
  • Ein Gen-Silencing kann auch mittels Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Gen-Silencing-Strategien wie sie unter anderen bei Angell und Baulcombe ((1998), Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind, erreicht werden.
  • Gen-Silencing kann auch stattfinden, wenn eine Mutation auf dem endogenen DREB-Gen vorliegt und/oder wenn eine Mutation auf einem isolierten DREB-Gen anschließend in eine Pflanze eingeführt wird. Ein Verfahren, um solch eine Mutation einzuführen, ist zum Beispiel die EMS-Behandlung (EMS = Ethylmethane Sulphonate). Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der DREB-Proteinaktivität kann durch ein nichtfunktionelles DREB-Protein verursacht werden. So kann zum Beispiel DREB an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) können daher ein DREB-Protein bereitstellen, das noch fähig ist, interagierende Proteine zu binden, das jedoch nicht seine normale Funktion als Transkriptionsfaktor ausüben kann.
  • Ein weiterer Ansatz für das Gen-Silencing besteht darin, dass man Nukleotidsequenzen, die zu der Regulationsregion des DREB-Gens (z. B. DREB-Promoter und/oder Enhancer) komplementär sind, ansteuert, um so Triplehelixstrukturen zu bilden, die die Transkription des DREB-Gens in den Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren wie die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in der Pflanze gerichtet sind, oder ein Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann gut vertraut sein. Insbesondere ist es vorstellbar, dass künstlich hergestellte Moleküle für die Hemmung der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder für das Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Alternativ dazu kann ein Screening-Programm erstellt werden, um in einer Pflanzenpopulation natürliche Varianten eines Gens, die für Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren, zu identifizieren. Solche natürliche Varianten können auch zum Beispiel für die Durchführung von homologer Rekombination verwendet werden.
  • Ein weiterer Ansatz für das Gen-Silencing wiederum wird von Hiratsu et al, (Plant J. 34, 733–739, 2003) beschrieben. Dieses Verfahren ist nicht auf Sequenzhomologie mit dem Zielgen angewiesen, sondern beinhaltet die Verwendung einer Repressionssequenzdomäne in Transkriptionsgenfusionen, und wurde eingesetzt, um Merkmale von landwirtschaftlichem Interesse zu modifizieren (Fujita et al, Plant Cell 17, 3470–3488, 2005, und Mitsuda et al, Plant Cell 17, 2993–3006, 2005). Typischerweise wird eine chimäre Nukleotidfusion zwischen einem Gen, das für ein Protein kodiert, das fähig ist, die Expression des Zielgens (wie einen Transkriptionsaktivator) positiv zu beeinflussen, und einem Nukleotidfragment, das für eine Repressionsdomäne kodiert, hergestellt. Bei der Expression der chimären Genfusion wird die Expression des Zielgens reprimiert, und zwar üblicherweise auf dominanz-negative Art und Weise, wodurch die Aktivität des Transkriptionsfaktors reduziert und aufgehoben wird. Repressionsdomänen sind in der Fachwelt gut bekannt, zum Beispiel das in manchen AP2- und Zinkfingertranskriptionsfaktoren vorhandene EAR-Motiv. Auf Repressionsdomänen basierende Verfahren eignen sich gut dazu, um die Genredundanz für das Zielgen in der gewählten Pflanzenart zu überwinden (Hiratsu et al, Plant J. 2003, Juni; 34(5): 733–9.).
  • Im obigen Text sind Beispiele für verschiedene Verfahren des Gen-silencing (für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression und Aktivität des Proteins) beschrieben. Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen auf der Reduktion der Expression eines endogenen DREB-Gens in einer Pflanze. Ein Fachmann wäre leicht fähig, die oben genannten „Silencing”-Verfahren so zu adaptieren, dass man ein Gen-Silencing in einer ganzen Pflanze oder Teilen davon zum Beispiel durch Verwendung eines geeigneten Promoters erzielt.
  • Es ist anzumerken, dass das Wesen der vorliegenden Erfindung in den vorteilhaften und überraschenden Ergebnissen liegt, die bei der Reduktion oder im Wesentlichen stattfindenden Elimination der endogenen DREB-Genexpression in einer Pflanze gefunden wurden, und nicht auf irgend ein bestimmtes Verfahren für solch eine Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Proteinaktivität beschränkt ist. Die Aktivität eines DREB-Proteins kann auch dadurch reduziert oder eliminiert werden, dass man eine genetische Modifikation (vorzugsweise im Locus eines DREB-Gens) einführt. Unter dem Locus eines Gens versteht man im vorliegenden Text eine genomische Region, die das interessierende Gen und 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts der Kodierregion beinhaltet.
  • Die genetische Modifikation kann zum Beispiel durch eines (oder mehrere) der folgenden Verfahren eingeführt werden: T-DNA-Inaktivierung, TILLING, ortsgerichtete Mutagenese, gerichtete Evolution, homologe Rekombination. Nach der Einführung der genetischen Modifikation folgt ein Schritt, in dem man auf reduzierte Aktivität eines DREB-Proteins selektiert, wobei die verringerte Aktivität zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag führt.
  • Bei dem T-DNA-Inaktivierungs-Tagging insertiert man eine T-DNA in der genomischen Region des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts der Kodierregion eines Gens in solch einer Konfiguration, dass die T-DNA die Expression des Zielgens hemmt. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens durch ihren natürlichen Promoter disrumpiert. Die T-DNA wird in das pflanzliche Genom zum Beispiel durch Infektion mit Agrobacterium zufallsmäßig insertiert und führt zur herunterregulierten Expression von Genen in der Nähe der insertierten T-DNA. Die entstandenen transgenen Pflanzen weisen aufgrund der gehemmten Expression von Genen in der Nähe der eingeführten T-DNA Phänotypen auf.
  • Eine genetische Modifikation kann in den Locus eines DREB-Gens auch unter Verwendung der TILLING-Technik (Targeted Induced Local Lesions In Genomes) eingeführt werden. Diese Mutagenesetechnologie ist nützlich, um mutagenisierte Varianten einer DREB-Nukleinsäure, die unfähig sind, DREB-Aktivität aufzuweisen, zu erzeugen, zu identifizieren und zu isolieren. Mittels TILLING kann man auch Pflanzen, die solche Mutationsvarianten tragen, selektieren. Diesen Mutationsvarianten kann eine DREB-Aktivität vollkommen fehlen. Das Prinzip des TILLING ist in dem Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Zur Erzeugung von Varianten von DREB-Nukleinsäuren kann man ortsgerichtete Mutagenese und zufällsmäßige Mutagenese verwenden. Zur Erzielung von ortsgerichteter Mutagenese existieren mehrere Verfahren, wobei die häufigsten Methoden auf PCR basieren (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Für die Erzeugung von Varianten von DREB-Nukleinsäuren kann man sich auch der gerichteten Evolution bedienen. Diese besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem entsprechendem Screening und/oder Selektion zwecks Erzeugung von Varianten von DREB-Nukleinsäuren oder Varianten davon, die für DREB-Proteine mit modifizierter (hier: reduzierter oder aufgehobener oder eliminierter) biologischer Aktivität kodieren (Castle et al, (2004), Science 304 (5674): 1151-4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Die T-DNA-Aktivierung, TILLING, die ortsgerichtete Mutagenese und die gerichtete Evolution sind Beispiele für Technoloigen, die die Erzeugung von neuen Allelen und DREB-Varianten ermöglichen.
  • Die homologe Rekombination gestattet es, eine ausgewählte Nukleinsäure in ein Genom an eine definierte ausgewählte Position, vorzugsweise an den Locus des DREB-Gens, einzuführen.
  • Andere Verfahren wie die Verwendung von Antikörpern gegen das endogene DREB zur Hemmung seiner Funktion in der Pflanze, oder ein Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem DREB beteiligt ist, werden dem Fachmann gut vertraut sein. Alternativ dazu kann ein Screening-Programm erstellt werden, um natürliche Varianten eines DREB-Gens mit reduzierter DREB-Aktivität oder überhaupt keiner DREB-Aktivität zu identifizieren. Solche natürliche Varianten können ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
  • Für eine optimale Durchführung ist bei den Gen-Silencing-Techniken, die für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression verwendet werden, die Verwendung von DREB-Gensequenzen aus monokotylen Pflanzen für die Transformation in monokotyle Pflanzen erforderlich. Vorzugsweise wird eine DREB-Gensequenz von einer bestimmten Pflanzenart in dieselbe Art eingeführt. So wird zum Beispiel eine DREB-Gensequenz aus Reis (egal, ob eine Volllängen-DREB-Sequenz oder ein Fragment) in eine Reispflanze transformiert. Die DREB-Gensequenz muss nicht in dieselbe Pflanzensorte eingeführt werden.
  • Ein „DREB-Gen” oder eine „DREB-Nukleinsäure” bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder ein Ribonukleotidpolymer umfassend eine Sequenz, die zu der transkribierten Region eines für ein DREB-Protein kodierenden Gens homolog ist oder dieser entspricht. Das oben genannte Polymer kann eine beliebige Länge aufweisen, kann entweder doppel- oder einzelsträngig sein oder kann Analoga davon sein, die die essentielle Eigenschaft eines natürlichen Ribonukleotids insofern aufweisen, als sie fähig sind, ähnlich wie natürlich vorkommende Polynukleotide an Nukleinsäuren zu hybridisieren.
  • „Nukleinsäure, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” bezieht sich auf eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden, die typischerweise von einem DREB-Protein-Kodiergen abstammen, um das Silencing eines Gens, das für ein DREB-Protein kodiert, zu bewirken; dies kann nur 20 oder sogar weniger Nukleotide sein. Ein Gen, das für ein (funktionelles) Protein kodiert, ist für die verschiedenen oben diskutierten Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder der Menge und/oder der Aktivität eines DREB-Proteins nicht unbedingt erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung einer ausreichenden Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden einer/eines DREB-Gens/Nukleinsäure, die aus 21 oder weniger (typischerweise mindestens 10) Nukleotiden bestehen kann, die von einem beliebigen Teil des/der DREB-Gens/Nukleinsäure, wie der AP2-kodierenden Kodierregion, die innerhalb der DREB-Genfamilie gut konserviert ist, oder von einem beliebigen Teil der Nichtkodierregionen in dem DREB-Gen sein können, durchgeführt werden.
  • Gene, die für DREB-Proteine kodieren, sind in der Fachwelt gut bekannt und nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren, sind im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgende Nukleotide der beschriebenen pflanzlichen DREB-Gene/Nukleinsäure (Qin et al, Plant Cell Physiol., Aug. 2004; 45(8): 1042–52; Li et al, Theor. Appl. Genet., Mai 2005; 110(8): 1355–62; Nakano et al, Plant Physiol. 140, 411–432, 2006, Badawi et al, Mol. Genet. Genomics. Feb. 2007; Huang et al, J. Plant Physiol., 13. Jan. 2007).
  • Andere Sequenzen, die von DREB-Gen/Nukleinsäure abstammen, können ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden und können vom Fachmann leicht identifiziert werden. DREB-Proteine können durch das Vorhandensein von einem oder von mehreren gut bekannten Merkmalen (siehe oben) identifiziert werden. Nach der Identifikation eines DREB-Proteins könnte ein Fachmann leicht unter Verwendung von Routinetechniken die entsprechende kodierende Nukleinsäuresequenz ableiten und eine ausreichende Länge von unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden derselben verwenden, um eines oder mehrere der oben beschriebenen Gen-Silencing-Verfahren durchzuführen.
  • Pflanzliche DREB-Proteine können auch aufgrund des Vorhandenseins von gewissen konservierten Motiven identifiziert werden. Das Vorhandensein von diesen konservierten Motiven kann unter Verwendung von Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke wie oben beschrieben identifiziert werden. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. So kann zum Beispiel bei der Verwendung von BLAST die statistische Signifikanzschwelle („Erwartungs”-Wert genannt) für das Berichten von „Matches” mit Datenbanksequenzen erhöht werden, um weniger stringente „Matches” aufzuzeigen. Typischerweise sind der erwartete Wert für „Matches”, die DREB-Proteine identifizieren, bei Verwendung der Motive CMIII-1 bis CMIII-4 oder der Motive CMIV-1 und CMIV-2 niedriger als e-07, typischerweise niedriger als e-10, e-15, e-20, e-25, e-30, e-35, e-40, e-45, e-50 oder e-100. Auf diese Weise können kurze, beinahe exakte „Matches” identifiziert werden. Nach der Identifikation eines DREB-Proteins durch das Vorhandensein dieser Motive kann der Fachmann leicht die entsprechende Nukleinsäure, die für das Polypeptid umfassend die relevanten Motive kodiert, ableiten und eine ausreichende Länge von unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden derselben verwenden, um eines oder mehrere der oben beschriebenen Gen-Silencing- Verfahren durchzuführen (für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination einer endogenen DREB-Genexpression und/oder der Menge und/oder der Aktivität eines DREB-Proteins).
  • Homologe wie oben definiert können leicht unter Verwendung von gut fachbekannten Routinetechniken identifiziert werden, wie mittels Sequenz-Alignment; Homologe von DREB-Proteinen mögen in unterschiedlichen Pflanzenarten verschieden bezeichnet worden sein, weshalb die Gen/Proteinbezeichnungen nicht zum Identifizieren von Orthologen oder Paralogen herangezogen werden sollten. Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das Alignment von zwei vollständigen Sequenzen, das die Anzahl der „Matches” maximiert und die Anzahl der „Gaps” minimiert, zu finden. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven (siehe unten) können, wie dem Fachmann klar wird, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können zum Beispiel statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) unter Verwendung der oben beschriebenen Programme mit Default-Parametern bestimmt werden. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus nach Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981), J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
  • Die Begriffe „Domäne”, „Signatur” und „Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Die verschiedenen Strukturdomänen in einem DREB-Protein können unter Verwendung von Spezialdatenbanken identifiziert werden, z. B. SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids. Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie mittels Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Weiterhin kann ein DREB-Protein auch aufgrund seiner Fähigkeit, an DNA zu binden und mit anderen Proteinen zu interagieren, identifizierbar sein. DNA-Bindungsaktivität und Protein-Protein-Interaktionen können leicht in vitro oder in vivo unter Verwendung von gut fachbekannten Techniken bestimmt werden. Zu Beispielen für in-vitro-Assays für die DNA-Bindungsaktivität zählen: Gelretardationsanalyse unter Verwendung von bekannten DREB-DNA-Bindungsdomänen (Sakuma et al, 2002) oder Hefe-Ein-Hybrid-Assays (Qin et al, 2004). Alternativ dazu kann die Aktivität eines DREB-Proteins dadurch bestimmt werden, dass man die Fähigkeit, die Expression eines Reporterkonstrukts, in dem ein DRE-haltiger Promoter die Expression des Reportergens vorantreibt, zu transaktivieren, bestimmt, zum Beispiel dadurch, das man die Menge oder Aktivität des erzeugten Reporterprodukts bestimmt. Ein solches Beispiel ist das Protoplastensystem, das auf einem Reporterkonstrukt umfassend den rd29A-Promoter von Arabidopsis thaliana in Kopplung mit dem UidA-Gen und der anschließenden Bestimmung der GUS-Aktivität beruht (Dubouzet et al, 2003). Ein Beispiel für einen in-vitro-Assay auf Protein-Protein-Interaktionen ist die Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse (Fields und Song (1989), Nature 340: 245–6). Zu den Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie mit DREB interagieren, zählen ADA2 und GCN5 Stockinger et al, (Nucleic Acids Res. 2001; 29(7): 1524–33). Zu den Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie an die DREB-Genpromoter binden und daher ihre Genexpression beeinflussen, zählen ICE1 (Chinnusamy et al, Genes Dev., 15. April 2003; 17(8): 1043–54).
  • Nach der Identifikation eines DREB-Proteins mit Hilfe von einem oder mehreren der oben beschriebenen Merkmale kann ein Fachmann daher leicht die entsprechende Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, ableiten und eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden davon verwenden, um irgend ein oder mehrere der oben beschriebenen Gen-Silencing-Verfahren (für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination einer endogenen DREB-Genexpression) durchzuführen.
  • Bevorzugt für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 335 (OsDREB1A) oder die Verwendung einer ausreichenden Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von OsDREB1A (SEQ ID NO: 335) kodiert. Beispiele für solche Orthologe und Paraloge des OsDREB1A-Proteins finden sich im Beispiel 46. Bevorzugte Homologe von OsDREB1A sind die Proteine gemäß den Proteinsequenzen in Tabelle Y2.
  • Orthologe in zum Beispiel monokotylen Pflanzenarten können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel SEQ ID NO: 335 oder SEQ ID NO: 336). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) können verwendet werden, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 335 oder SEQ ID NO: 336, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Reissequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem zweiten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist. Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Bei dem Herkunftsmaterial der im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotide einer/eines DREB-Gens/Nukleinsäure kann es sich um ein beliebiges pflanzliches Herkunftsmaterial oder ein künstliches Herkunftsmaterial handeln. Für eine optimale Leistung ist es erforderlich, dass die für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression verwendeten Gen-Silencing-Techniken die DREB-Sequenzen von monokotylen Pflanzen für die Transformation in monokotyle Pflanzen einsetzt.
  • Vorzugsweise werden DREB-Sequenzen der Familie Poaceae in Pflanzen der Familie Poaceae transformiert. Weiter bevorzugt wird ein DREB-Gen aus Reis (egal, ob es sich um eine Volllängen-DREB-Sequenz oder ein Fragment handelt) in eine Reispflanze transformiert. Die DREB-Nukleinsäure muss nicht unbedingt in dieselbe Pflanzenvarietät eingeführt werden. Am stärksten bevorzugt weist die DREB-Nukleinsäure aus Reis eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 335 (OsDREB1A) oder eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von OsDREB1A (SEQ ID NO: 335) kodiert, auf. Wie oben erwähnt wäre einem Fachmann durchaus klar, was eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgenden Nukleotiden zum Durchführen eines der oben definierten Gen-Silencing-Verfahrens darstellen würde, dies kann in manchen Fällen nur 20 oder sogar weniger im Wesentlichen unmittelbar aufeinander folgende Nukleotide sein.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren zur Erleichterung des Einführens und/oder der Expression der in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Nukleotidsequenzen bereit.
  • Es wird daher ein Genkonstrukt bereitgestellt, das eine oder mehrere Kontrollsequenzen umfasst, welche fähig sind, die Expression einer sense- und/oder antisense-DREB-Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze voranzutreiben, um bei einem endogenen DREB-Gen in der Pflanze ein Silencing zu bewirken; sowie gewünschtenfalls eine Transkriptionsterminationssequenz. Vorzugsweise handelt es sich bei der Kontrollsequenz um einen konstitutiven und ubiquitären Promoter.
  • Ein bevorzugtes Konstrukt für das Gen-Silencing ist eines, das ein invertiertes Repeat eines DREB-Gens oder ein Fragment davon, das vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin”-Struktur auszubilden, umfasst, wobei das invertierte Repeat unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters steht. Erfindungsgemäße Verfahren können auch unter Verwendung von anderen Strategien, bei denen die Menge und/oder Aktivität des Proteins reduziert wird, durchgeführt werden. Solche Techniken sind fachbekannt.
  • Konstrukte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, können unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik, mit der der Fachmann gut vertraut ist, erzeugt werden. Die Genkonstrukte können in Vektoren, die im Handel erhältlich sein können und die sich für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen eignen, insertiert werden. Die Erfindung stellt daher die Verwendung eines wie oben definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens einem Promoter), die fähig sind, die Expression in einer Pflanze zu erhöhen, operativ verknüpft. Die Begriffe „Kontrollsequenz” und „Promoter” sind wie im vorliegenden Text definiert.
  • Vorteilhaft kann ein beliebiger Promoter eingesetzt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz voranzutreiben. Vorzugsweise ist die DREB-Nukleinsäure oder die funktionelle Variante davon operativ mit einem konstitutiven Promoter verknüpft. Vorzugsweise weist der konstitutive Promoter, der fähig ist, die Nukleinsäure vorzugsweise überall in der Pflanze zu exprimieren, ein vergleichbares Expressionsprofil wie ein GOS2-Promoter auf. Stärker bevorzugt weist der konstitutive Promoter dasselbe Expressionsprofil wie des Reis-GOS2-Promoter auf, am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Promoter, der fähig ist, die Nukleinsäure vorzugsweise in der gesamten Pflanze zu exprimieren, um den GOS2-Promoter aus Reis (SEQ ID NO: 339 oder SEQ ID NO: 39). Es muss klargestellt werden, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die DREB-Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 335 beschränkt ist bzw. dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer DREB-Nukleinsäure, wenn diese von einem GOS2-Promoter vorangetrieben wird, beschränkt ist. Ein alternativer konstitutiver Promoter, der in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist der „high mobility group protein”-Promoter (SEQ ID NO: 40 in WO 2004/070039 ). Beispiele für andere konstitutive Promoter, die ebenfalls verwendet werden können, um die Expression einer DREB-Nukleinsäure voranzutreiben, sind in dem Abschnitt „Definitionen” dargestellt.
  • Optional können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze einzuführenden Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche Regulationselemente können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer beinhalten. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Zu den 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz kann auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden, um die Informationsmenge, die im Zytosol akkumuliert, zu erhöhen; Beschreibung im Abschnitt „Definitionen”. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Enhancer-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
  • Die Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben. Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markern sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Pflanzen, einschließlich Pflanzenteile, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind und die im Vergleich zu Kontrollpflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen und die eine reduzierte oder im Wesentlichen eliminierte Expression eines endogenen DREB-Gens aufweisen. Wirtszellen und Wirtspflanzen sollen im vorliegenden Zusammenhang Zellen, gesamte Pflanzen oder Teile davon bedeuten, die das genetische Konstrukt der Erfindung, das typischerweise unter Verwendung von Transformationstechniken eingeführt worden ist, aufgenommen haben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag bereit, wobei diese transgenen Pflanzen eine reduzierte oder im Wesentlichen eliminierte Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder Menge und/oder Aktivität eines DREB-Proteins aufweisen.
  • Die Erfindung stellt genauer gesagt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbessertem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren eines Genkonstrukts, umfassend eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die fähig sind, vorzugsweise die Expression einer sense- und/oder antisense-DREB-Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze voranzutreiben, um ein Silencing der Expression eines endogenen/DREB-Gens in der Pflanze zu bewirken, in eine(r) Pflanze, einen/einem Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bevorzugt ist das in die Pflanze eingeführte Konstrukt eines, das ein invertiertes Repeat (teilweise oder vollständig) eines DREB-gens oder Fragments davon umfasst und bevorzugt zur Bildung einer ”hairpin”-struktur befähigt ist.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird das Konstrukt in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Norther- und/oder Western-Analyse oder quantitativer PCR verfolgt werden; alle Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, wodurch man zu homozygoten Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) gelangt, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden.
  • Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze wie Samen und Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie Trockenpellets oder -pulver, Öle, Fette und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von DREB-Nukleinsäuren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression und/oder Menge und/oder Aktivität eines DREB-Proteins in einer Pflanze, um den wie oben definierten Samenertrag der Pflanze zu erhöhen.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Abbildungen beschrieben werden, in denen Folgendes dargestellt wird.
  • 1 zeigt die Sequenz von SEQ ID NO: 2 (A) und von SEQ ID NO: 27 (B), wobei die NAP1-Domäne fettgedruckt und unterstrichen ist.
  • 2 zeigt den binären Vektor für die verstärkte Expression einer Arabidopsis NAP1-like-Protein-Kodiernukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters in Oryza sativa.
  • 3 zeigt ein multiples Sequenz-Alignment von NAP1-like-Polypeptiden aus verschiedenen Pflanzenarten in CLUSTAL W. SEQ ID NO: 2 (AtNAP1-like, At1g74560) ist fettgedruckt dargestellt, und die konservierte NAP-Domäne ist unterstrichen.
  • 4 ist ein phylogenetischer Stammbaum, der die Beziehungen zwischen NAP- und SET-Proteinen aus der Hefe, aus dem Menschen und aus Pflanzen darstellt. Die in dem Stammbaum angegebenen Referenzen sind die GenBank-Zugangsnummern bzw. MIPS-Zugangsnummern (für Arabidopsis thaliana) der Sequenzen. At: Arabidopsis thaliana, Gm: Glycine max, Nt: Nicotiana tabacum (Sequenzen aus WO 03/085115 abgeleitet), Os: Oryza sativa, Ps: Pisum sativum, Zr: Zea mays, Hs: Homo sapiens, Sc: Saccharomyces cerevisiae.
  • 5 Das Medicago-NAP1-like-Protein wurde in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie mit Hilfe des 6xHIS-Tag aus rohem Zellextrakt aufgereinigt. Die Elution des 34 kD großen Proteins bei unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen aus dem Nickel-Agarose-Harz wird durch Western-Blotting unter Verwendung von anti-6xHIS-Antikörper (Sigma, St Louis, USA) sichtbar gemacht.
  • 6 Das NAP1-like-Protein ist in Pflanzen im Zellkern lokalisiert. A) Durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen das aufgereinigte Protein (linke Abbildung von Tafel A) wurde gezeigt, dass das Medicago NAP1-like Protein im Zellkern von kultivierten Luzernezellen lokalisiert ist. Um die Lokalisierung im Zellkern zu bestätigen, wurden die Kerne parallel dazu mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbt (rechte Abbildung von Tafel A). In dem Insert zeigt der Pfeil auf eine Metaphasezelle. Eine schwache Fluoreszenz zeigt geringe Abundanz des NAP1-like-Proteins um die Chromosomen in Metaphasezellen ohne Kernkompartiment an. B) Das transient exprimierte mit GFP konjugierte Arabidopsis-NAP1-like-Protein ist nach der PEG-vermittelten Aufnahme des Genkonstrukts in die Protoplasten im Zellkern in Arabidopsis-Zellen lokalisiert.
  • 7 Das aufgereinigte Medicago-NAP1-like-Protein hemmt in vitro die Phospho-Histon-H2B-Dephosphorylierungsaktivität von PP2A (aufgereinigt aus Kaninchen-Skelettmuskel), hat jedoch auf die Dephosphorylierung der Glykogenphosphorylase durch dasselbe Enzym keinen Einfluss.
  • 8 Beispiele für Sequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
  • 9 zeigt die Domänenstruktur von SEQ ID NO: 41. Das schraffierte Rechteck zeigt die Position der Lsm-Domäne an.
  • 10 zeigt ein Alignment (10A) und den entsprechenden phylogenetischen Stammbaum der Lsm-Proteine (10B). Die Lage der konservierten Domänen ist angegeben: Eine gestrichelte Linie gibt die Position der alpha-Helix an; das Lsm-Motiv I und II sind einfach bzw. doppelt unterstrichen; Motiv I und Motiv II gemäß SEQ ID NO: 159 und SEQ ID NO: 160 sind eingerahmt.
  • 11 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer Arabidopsis-thaliana-Lsm-Protein-Kodiernukleinsäure unter der Kontrolle eines WSI18-Promoters in Oryza sativa.
  • 12 zeigt Einzelheiten von Beispielen für Sequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
  • 13 zeigt die Sequenz von SEQ ID NO: 173, wobei die Cyclin-Box fett angegeben ist. Die verschiedenen Helix-Domänen (Hn, H1, H2, H3, H4, H5, H1', H2', H3', H4', H5' und Hc) gemäß der Einteilung von Andersen et al, (1997), sind angegeben.
  • 14 zeigt ein multiples Sequenz-Alignment von CycH-Polypeptiden aus verschiedenen Arten in CLUSTAL W. Es wurden die folgenden Parameter verwendet: slow alignment, gqap opening 10, gap extension: 0.1, BLOSUM matrix. Konservierte Aminosäuren sind mit einem Sternchen gekennzeichnet, konservative Substitutionen durch einen Strichpunkt, weniger konservierte Substitutionen durch einen Punkt. Solche multiplen Sequenz-Alignments sind nützlich, um Helix-Domänen in anderen Cyclin-H-Proteinen zu definieren und um geeignete Verkürzungen für die Erzeugung von CycHTr-Polypeptiden, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zu definieren.
  • 15 zeigt einen phylogenetischen Stammbaum umfassend verschiedene Cyclin-Polypeptidsequenzen (Yamaguchi et al, Plant J. 24, 11–20, 2000). Sequenzen, die mit Cyclin H Cluster bilden (wie die Sequenz von SEQ ID NO: 166 oder SEQ ID NO: 173) können bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein.
  • 16 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer Arabidopsis-thaliana-CycHTr-Protein-Kodiernukleinsäure unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promoters in Oryza sativa.
  • 17 zeigt Einzelheiten von Beispielen für Sequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
  • 18 zeigt ein Diagramm, das die Struktur der Remorine darstellt. Die C-terminale Remorin-Domäne ist angegeben (entspricht der Pfam-Familien-Zugangsnummer PF03763), die N-terminale Domäne (umfassend die Aminosäurereste vom N-Terminus bis zum letzten Aminosäurerest stromaufwärts der C-terminalen Remorin-Domäne, vom N-Terminus zum C-Terminus) und die letzten 10 Aminosäurereste am C-Terminus des Polypeptids, umfassend mindestens ein Cys und/oder ein Phe, sind dargestellt.
  • 19 zeigt den graphischen Output des COILS-Algorithmus, der eine Coiled-Coil-Domäne in der C-terminalen Hälfte des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 199 vorhersagt. Die X-Achse stellt die Koordinaten der Aminosäurereste dar und die Y-Achse die Wahrscheinlichkeit (im Bereich von 0 bis 1), dass eine Coiled-Coil-Domäne vorliegt, und die drei Linien die drei untersuchten „Windows” (14, 21, 28).
  • 20 zeigt ein multiples Sequenz-Alignment von der C-terminalen Remorin-Domäne von Remorin-Polypeptiden und von den letzten C-terminalen Aminosäureresten der Remorin-Polypeptide von verschiedenen Herkunftsarten in CLUSTAL W (1; 83). Die Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199 wird durch ein schwarzes Kästchen oberhalb der Polypeptidsequenz dargestellt und ist als solche bezeichnet. Die vorhergesagte Coiled-Coil-Domäne von SEQ ID NO: 199 ist doppelt unterstrichen, und eine mutmaßliche Sumoylierungsstelle ist eingerahmt. Außerdem sind die C-terminalen Aminosäurereste der Remorin-Polypeptide, die üblicherweise mindestens ein Cys und/oder ein Phe umfassen, über das gesamte Alignment eingerahmt.
  • 21 zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer Arabidopsis-thaliana-Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters, und zwar GOS2 oder HMGB in Oryza sativa.
  • 22 zeigt Einzelheiten von Beispielen für Sequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
  • 23 ist eine Darstellung einer Volllängensequenz des OsDREB1A (SEQ ID NO: 336) -Proteins. Die Lage der konservierten Motive CMIII-1 bis CMIII-4 und CMIV-1 und CMIV-2 ist angegeben. Ein mutmaßliches Lokalisierungssignal ist doppelt unterstrichen. Die Region, die der AP2-Domäne entspricht, ist fett markiert.
  • 24 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen von DREB-Proteinen aus Reis und Arabidopsis thaliana. Es wird eine Konsensus-Sequenz gezeigt.
  • 25 zeigt einen „Unrooted Maximum-Likelihood Tree” des phylogenetischen Stammbaums der AP2/EREBP-Multigenfamilie gemäß der Veröffentlichung von Shigyo et al, 2006. Die verschiedenen Unterfamilien und Gruppen, in die die AP2-Transkriptionsfaktoren eingeteilt sind, darunter auch die DREB-GROUP, sind bezeichnet.
  • 26 zeigt den binären Vektor für das Silencing der OsDREB1A-RNA in Otyza sativa unter Verwendung eines „hairpin”-Konstrukts unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters (OsGOS2).
  • 27 gibt Einzelheiten von Beispielen für Sequenzen an, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind oder die beim Isolieren von solchen Sequenzen nützlich sind. Die Sequenzen können das Ergebnis von öffentlich zugänglichen EST-Assemblierungen sein, bei denen die Sequenzierung eine niedrigere Qualität aufweisen. Es können daher einige Nukleinsäuresubstitutionen erwartet werden. Das Start-Kodon (ATG) und das Stopp-Kodon begrenzen die Nukleinsäuresequenzen, wenn diese für Volllängen-DREB-Proteine kodieren. Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können jedoch auch sowohl 5'- als auch 3'-UTRs verwendet werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen, beschrieben. Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht vollständig definieren oder auf andere Weise begrenzen.
  • DNA-Manipulation: Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 1 verwandt sind, und/oder Proteinsequenzen, die mit SEQ ID NO: 2 verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Das von SEQ ID NO: 1 kodierte Polypeptid wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid) -Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren.
  • Tabelle A zeigt eine Aufzählung von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 und der Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 verwandt sind. Tabelle A: Nukleinsäuresequenzen, die für NAP1-like-Polypeptide kodieren und NAP1-like-Polypeptide
    Bezeichnung/Identifikation Herkunftsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO:
    AtNAP1 Arabidopsis thaliana 1 2
    NtNAP1a Nicotiana tabacum 6 7
    NtNAP1b Nicotiana tabacum 8 9
    Ms10.1 Medicago sativa 10 11
    nfa104 Zea mays 12 13
    OsNAP1a Oryza sativa 14 15
    OsNAP1b Oryza sativa 16 17
    nfa103 Zea mays 18 19
    NAP1-like Arabidopsis thaliana 20 21
    LeNAP1 Lycopersicon esculentum 22 23
    NAP1-like Arabidopsis thaliana 24 25
    NAP1-like Arabidopsis thaliana 26 27
    NAP1-like Arabidopsis thaliana 28 29
    NAP1-like Arabidopsis thaliana 30 31
    NAP1Ps Pisum sativum 35 36
    SNAP-1 Glycine max 37 38
  • Beispiel 2: Alignment von NAP1-like Polypeptidsequenzen
  • Ein Alignment der Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des AlignX-Programms von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) beruht, durchgeführt. Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte „weight matrix” ist Blosum 62 (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Die Ergebnisse in 3 zeigen, dass den NAP1-like Polypeptiden Regionen mit hoher Sequenzkonservierung gemeinsam sind.
  • Ein phylogenetischer Stammbaum, der die Beziehungen zwischen den NAP- und den SET-Proteinen aus der Hefe, aus dem Menschen und aus Pflanzen darstellt, ist in 4 angegeben. Der Stammbaum wurde mit dem AlignX-Programm von VNTI Suite 5.5 (Informax) erstellt. Die für die Erzeugung des multiplen Alignments verwendete Matrix ist Blosum62, und die verwendeten Alignment-Parameter lauteten: Gap Opening penalty, 10; Gap Extension penalty, 0.5; Gap separation penalty range, 8; % identity for alignment delay, 40. Der Stammbaum wurde unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode von Saitou und Nei erstellt.
  • Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der Diagonale Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen (unter Ausschluss der partialen Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz steht über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale.
  • Der Identitätsprozentsatz zwischen den Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kann nur 22% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 betragen. Da die NAP-Domäne den größten Teil der Proteinsequenz abdeckt, ist die Sequenzidentität bei Vergleich der NAP-Domänen nur ein wenig höher.
  • Figure 01740001
  • Figure 01750001
  • Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle C dargestellt. Tabelle C: InterPro-Scan-Ergebisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung
    PANTHER PTHR11875 NAP_family
    PANTHER PTHR11875:SF9 PTHR11875:SF9
    PFAM PF00956 NAP
  • Beispiel 5: Topologievorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind (Lokalisierung innerhalb der Zelle, Transmembran ...)
  • TargetP 1.1 sagt die Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen innerhalb der Zelle vorher. Die Lokalisierungszuordnung beruht auf dem vorhergesagten Vorliegen von einer der folgenden N-terminalen Presequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondrial Targeting Peptide (mTP) oder Signalpeptid des sekretorischen Wegs (SP). Die Wertungen, auf denen die schlussendliche Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und fügen nicht ungedingt etwas zu einer Wahrscheinlichkeit hinzu. Die Lokalisierung mit der höchsten Wertung ist jedoch gemäß TargetP die wahrscheinlichste, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis dafür sein, wie gewiss die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (reliability Klasse RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird am Server der technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Bei denjenigen Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine mögliche Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurden mehrere Parameter ausgewählt, wie Organismengruppe (Nichtpflanze oder Pflanze), Cutoff-Sätze (keine, vorbestimmter Cutoff-Satz oder vom User spezifizierter Cutoff-Satz), und Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (ja oder nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle D dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe „Pflanze” gewählt, es wurden keine Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids erfragt. Bei der Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 innerhalb der Zelle kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln, es wird kein Transitpeptid vorhergesagt. Tabelle D: TargetP 1.1 – Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Länge (AA) 256
    Chloroplasten-Transitpeptide 0,108
    Mitochondrien-Transitpeptide 0,079
    Signalpeptide des sekretorischen Wegs 0,134
    Sonstiges Targeting an die Zellorganellen 0,908
    Vorhergesagte Lokalisation /
    Verlässlichkeitsklasse 2
    Vorhergesagte Transitpeptidlänge /
  • Für die Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, darunter:
    • • ChloroP 1.1, gehosted am Server der Technischen Universität Dänemark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet am Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet am Server der University of Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark.
  • Beispiel 6: Charakterisierung eines Medicago-sativa-NAP1-like-Proteins:
  • Material und Methoden
  • Isolation des Volllängen-cDNA-Klons des mutmaßlichen Luzerne PP2A-Hemmers
  • Mit einem isolierten cDNA-Fragment, das für einen Teil eines mutmaßlichen NAP1-like-Proteins aus Luzerne (Medicago sativa) kodiert, wurde unter Verwendung von standardmäßigen Screening-Maßnahmen wie vom Hersteller (Stratagene) beschrieben der Volllängenklon von einer Luzerne-Wurzelknöllchen-λ-ZAP-Phagen-cDNA-Bibliothek isoliert (Savoure et al, Plant Mol. Biol. 27, 1059–1070; 1995). Es wurden 400 000 Plaques gescreent, 20 Klone wurden behalten, von denen 18 im zweiten Hybridisierungsschritt-Screening positiv waren. 8 von diesen Klonen wurden für weitere Arbeiten ausgewählt und ausgehend von einzelnen Phagen in Phasmide umgewandelt. Es wurden vier Klone sequenziert, und es stellte sich heraus, dass es sich bei zwei davon um Volllängen-cDNA-Klone des mutmaßlichen NAP1-like-Proteins handelte. Einer der Klone (Ms 10.1) wurde für weitere Arbeiten ausgewählt (SEQ ID NO: 10, kodiert für das Protein von SEQ ID NO: 11).
  • Herstellung und Aufreinigung des Medicago NAP1-like-Proteins
  • Die cDNA-Sequenz, die für das Medicago sativa NAP1-like-Protein kodiert, wurde in die NcoI/XhoI-Stelle des Vektors pENTRY4 GATEWAY® (Invitrogen) insertiert und anschließend in den bakteriellen Expressionsvektor pDEST17 eingeführt. Der Vektor pDEST17 gestattete die Expression des NAP1-like-Proteins in BL21 E. coli Zellen als Protein mit 6xHIS-Tag. Das 34 kDa große NAP1-like-Protein wurde mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Nickel-Agaroseharzes (Sigma) aufgereinigt (5).
  • Messungen der Phosphataseaktivität
  • Eine potentielle phosphatasehemmende Aktivität des Medicago sativa NAP1-like-Proteins wurde in vitro an aus Kaninchenskelettmuskeln aufgereinigten katalytischen Untereinheiten der Proteinphosphatase 2A (PP2A) gemäß Ulloa et al, (1993) getestet, und zwar unter Verwendung von mit 32P-Isotop markierter Glykogenphosphorylase und Histon-H2A-Proteinen als Substrate.
  • Lokalisierung der MsNAP1-like- und AtNAP1-like-Proteine innerhalb der Zelle
  • Polyklonale anti-MsNAP1-like-Antikörper wurden unter Verwendung eines standardmäßigen Immunisierungsprotokolls gegen das aufgereinigte Protein mit 6xHIS-Tag in Kaninchen erzeugt.
  • Aus in Suspension kultivierten Zellen von Luzerne (Medicago sativa) wurden Protoplasten isoliert und mit 6% Formaldehyd fixiert. Die Zellen wurden anschließend auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Glasobjektträger aufgebracht und mit anti-MsNAP1-like-Antiserum (200fach verdünnt in PBS) behandelt, gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (SIGMA, 100fache Verdünnung) behandelt. Die Kerne wurden parallel mit DAPI (0,02 mg/ml) gefärbt und mit einem Nikon-Fluoreszenzmikroskop Typ TE300 und einer CCD-Farbkamera Typ SPOT II fotographiert.
  • Die Kodierregion des Arabidopsis thaliana-Orthologs des Medicago sativa NAP1-like-Proteins (SEQ ID NO: 1) wurde zusammen mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) leserastergerecht in den GATEWAY®-kompatiblen Pflanzenexpressionsvektor (pK7WGF2) insertiert. Die Protoplasten wurden isoliert und mit der aufgereinigten Plasmid-DNA unter Verwendung von standardmäßigen Vorgehensweisen transfiziert. Ein oder zwei Tage nach der Transfektion wurde eine transiente Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie festgestellt.
  • Ergebnisse
  • Arabidopsis und Medicago NAP1-like-Proteine sind im Zellkern lokalisiert
  • Unter Verwendung der anti-MsNAP1-like-Antikörper ergab die indirekte Immunfluoreszenz, dass die Antikörper ein Protein erkannten, das bei den Kernen von in Suspension kultivierten Luzernezellen lokalisiert war. Diese Lokalisierung wurde mit dem Zellkernfarbstoff DAPI überprüft. Eine schwache Fluoreszenz war mit den Chromosomen in Metaphasezellen assoziiert (6.A, insert).
  • Das Arabidopsis NAP1-like-Protein mit GFP-Tag war ebenfalls ausschließlich an den Zellkernen von in Suspension kultivierten Arabidopsis-Zellen lokalisiert (6.B).
  • Das Luzerne-NAP1-like-Protein hemmt in vitro die PP2A-Phosphataseaktivität an einem Phospho-Histonsubstrat
  • Reaktionsansätze, die die katalytischen Untereinheiten von Kaninchenskelettmuskel-PP2A und phosphoryliertes Histon-H2A oder Glykogenphosphorylase als Substrat enthielten, wurden in unterschiedlichen Konzentrationen mit aufgereinigtem Luzerne-NAP1-like-Protein versetzt. Es wurde beobachtet, dass das NAP1-like-Protein keinen Einfluss auf die Dephosphorylierung der Glykogenphosphorylase hatte, nicht einmal bei einer Konzentration von 500 mM, dass jedoch schon eine Konzentration von 2,5 mM des NAP1-like-Proteins die PP2A-Aktivität an dem Phospho-Histon-H2A-Substrat wirksam hemmte (50%ige Aktivitätsabnahme) (7).
  • Schlussfolgerung
  • Die Medicago-sativa- und Arabidopsis-thaliana-NAP1-like-Proteine wiesen sowohl strukturell als auch funktionell eine Ähnlichkeit auf. Pflanzliche NAP1-like-Proteine hemmen in vitro die Phosphatase(PP2A)-Aktivität an Histonsubstraten, was auf eine mögliche in-vivo-Rolle bei der Chromatinorganisation und der Gentranskription hinweist.
  • Beispiel 7: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1
  • Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Die Arabidopsis NAP1-like Nukleinsäure wurde unter Verwendung einer Arabidopsis-thaliana-Keimlings-cDNA-Bibliothek (Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize mittels PCR amplifiziert. Nach der reversen Transkription von aus Keimlingen extrahierter RNA wurden die cDNAs in pCMV Sport 6.0 kloniert. Die durchschnittliche Insertgröße der Bank betrug 1,5 kB, und die ursprüngliche Zahl Klone betrug 1,59 × 107 KBE. Der ursprüngliche Titer wurde als 9,6 × 105 KBE/ml bestimmt, nach der ersten Amplifikation 6 × 1011 KBE/ml. Nach der Plasmidextraktion wurden 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix eingesetzt. Für die PCR-Amplifikation wurden die Primer prm1505 (SEQ ID NO: 4) und prm1506 (SEQ ID NO: 5), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalten, eingesetzt. Die PCR wurde mittels Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment mit einer Größe von 771 Bp wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone”, pNAP1-like, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Der „entry clone” pNAP1-like wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt, der als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders folgendes enthielt: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine visuelle Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette für die LR-in-vivo-Rekombination, wobei die interessierende Sequenz bereits in den „entry clone” kloniert war. Ein GOS2-Promoter für die konstitutive Expression befindet sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette. Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::NAP1-like (2) in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 und anschließend in Oryza-sativa-Pflanzen transformiert, wobei man sich fachbekannter Techniken bediente.
  • Beispiel 8: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996), Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden), herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der in dem Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps/Canola-Transformation
  • Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Explantate werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl für die Keimung umgesetzt. Die Hypokotyle von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt von einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1.6 g/l Gelrite) umgesetzt, und zwar mit Murashige-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxime und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um die restlichen Bakterien abzutöten. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden für die Gewebevermehrung weiter auf Selektionsmedium kultiviert (30°C, 16-Stunden-Fotoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nichtselektionsmedium weiter kultiviert, um zu somatischen Embryonen zu gelangen. Gesund aussehende Embryonen mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 Stunden kultiviert, und Pflänzchen in 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus umgestellt.
  • Beispiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 9.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Reispflanzen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
  • Vier T1-Events wurden in der T2-Generation weiter ausgewertet, wobei man bei der Auswertung wie bei der T1-Generation vorging, jedoch mit mehr Einzelorganismen pro Event. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
  • 9.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • 9.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse, Maximalfläche) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) 3 Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wurde) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozentsatz ausgedrückt) der Anzahl gefüllte Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Bei den transgenen Pflanzen wurde im Vergleich zu den entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen) eine Erhöhung der Biomasse und des Samenertrags wie in Tabelle F angegeben beobachtet; der P-Wert betrug jeweils unter 0,05.
    Parameter Erhöhung (in %)
    Max. Fläche (Biomasse) 17,0
    Samengesamtgewicht 35,9
    Anzahl gefüllte Samen 34,7
    Samenfüllungsrate 11,6
    Harvest Index 17,1
  • Beispiel 11: Identifikation von Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41 verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbankabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 40 verwandt sind, und/oder Proteinsequenzen, die mit SEQ ID NO: 41 verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Das von SEQ ID NO: 40 kodierte Polypeptid wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß dem Wahrscheinlichkeits-Score (E-Wert) gereiht, wobei der Score die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentidentität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren.
  • Zusätzlich zu den öffentlich zugänglichen Nukleinsäuresequenzen, die beim NCBI verfügbar sind, wird auch in privaten Sequenzdatenbanken gesucht, wobei man wie oben beschrieben vorgeht.
  • In Tabelle G findet sich eine Aufzählung von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40 und der Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 41 verwandt sind.
  • Die Lsm-Proteine werden in acht Gruppen oder Klassen eingeteilt. Die Spalte mit der Überschrift „Lsm-Klasse” in Tabelle G gibt diejenige Klasse an, zu der das Lsm-Protein oder die entsprechende Nukleinsäure, die für solch ein Protein kodiert, gehört.
  • Homologe, orthologe und paraloge Sequenzen zu SEQ ID NO: 41 finden sich in der Spalte mit der Überschrift „Evolutionäre Beziehung zu SEQ ID NO: 41”.
    Bez. Zugangs-Nr* Herkunfts-Organismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO: Lsm-KI. Evolutionäre Beziehung zu SEQ ID No. 41 Status
    AtLSM1a AT1G19120 Arabidopsis thaliana 1 2 Lsm1 NA volle Länge
    AtLSM1b AT3G14080 Arabidopsis thaliana 3 4 Lsm1 Paralog volle Länge
    AtLMS2 At1g03330 Arabidopsis thaliana 5 6 Lsm2 Homolog volle Länge
    AtLSM3a AT1G21190 Arabidopsis thaliana 7 8 Lsm3 Homolog volle Länge
    AtLSM3b At1g76860 Arabidopsis thaliana 9 10 Lsm3 Homolog volle Länge
    AtLMS4 AT5G27720 Arabidopsis thaliana 11 12 Lsm4 Homolog volle Länge
    AtLMS5 AT5G48870 Arabidopsis thaliana 13 14 Lsm5 Homolog volle Länge
    AtLMS6a AT3G59810 Arabidopsis thaliana 15 16 Lsm6 Homolog volle Länge
    AtLMS6b At2G43810 Arabidopsis thaliana 17 18 Lsm6 Homolog volle Länge
    AtLMS7 AT2G03870 Arabidopsis thaliana 19 20 Lsm7 Homolog volle Länge
    AtLMS8 AT1G65700 Arabidopsis thaliana 21 22 Lsm8 Homolog volle Länge
    MsABE78228 ABE78228 Medicago truncatula 23 24 Lsm1 Ortholog volle Länge
    PpLSM1 scaffold_158 Populus trichocarpa 25 26 Lsm1 Ortholog volle Länge
    OsLSM1 Os04g0445800 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 27 28 Lsm1 Ortholog volle Länge
    OsLSM3 Os01g0866700 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 29 30 Lsm3 Homolog volle Länge
    OsLMS4 Os01g0256900 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 31 32 Lsm4 Homolog volle Länge
    OsLSM5 Os05g0389300 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 33 34 Lsm5 Homolog volle Länge
    OsLSM6 Os04g0388900 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 35 36 Lsm6 Homolog volle Länge
    OsLSM7 Os08g0177700 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 37 38 Lsm7 Homolog volle Länge
    OsLSM8 Os05g0594900 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 39 40 Lsm8 Homolog volle Länge
    Os_LSM CAH67241 Oryza sativa (japonica-Kultivar-Gruppe) 41 42 Lsm1 Ortholog volle Länge
    LuLSM8 LU04FL@6234 1874 NZ Linum usitatissimum 43 44 Lsm8 Homolog volle Länge
    BnLSM1a BNM01@BN04 MC02973 NZ Brassica napus 45 46 Lsm1 Ortholog volle Länge
    BnLSM1b BN0204@conti g12290 NZ Brassica napus 47 48 Lsm1 Ortholog volle Länge
    BnLSM1c BN0204@conti g30411 NZ Brassica napus 49 50 Lsm1 Ortholog volle Länge
    BnLSM4a BN04FL@419 82578 NZ Brassica napus 51 52 Lsm4 Homolog volle Länge
    BnLSM4b BN04FL@421 20216 NZ Brassica napus 53 54 Homolog volle Länge
    BnLSM4c BN04FL@429 52553 NZ Brassica napus 55 56 Lsm4 Homolog volle Länge
    GmLSM4a GM04FL@GM 06LC725 NZ Glycine max 57 58 Lsm4 Homolog volle Länge
    GmLSM4b GM04FL@GM 06LC5469 NZ Glycine max 59 60 Lsm4 Homolog volle Länge
    GmLSM4c GM04FL@GM 06MC03669 NZ Glycine max 61 62 Lsm4 Homolog volle Länge
    Gm_LSM5 GM04FL@GM 02LC15807 NZ Glycine max 63 64 Lsm5 Homolog volle Länge
    HvLSM1 HV04FL@631 22459 NZ Hordeum vulgare 65 66 Lsm1 Ortholog volle Länge
    HvLSM4 HV04FL@626 58793 NZ Hordeum vulgare 67 68 Lsm4 Homolog volle Länge
    TaLSM1 TA0704@conti g16414 NZ Triticum aestivum 69 70 Lsm1 Ortholog volle Länge
    TaLSM4b TA04FL@TA0 21024263 NZ Triticum aestivum 73 74 Lsm4 Homolog volle Länge.
    ZmLSM1 ZM0404@conti g12257 NZ Zea mays 75 76 Lsm1 Ortholog volle Länge
    ZmLSM4a ZM04FL@ZM0 6106366 NZ Zea mays 77 78 Lsm4 Homolog volle Länge
    • * Zugangsnummer bezieht sich auf die Genbank-Datenbank, die „populus sequence database” des DOE Joint Genome Institute. NZ nicht zutreffend
  • Beispiel 12: Alignment und phylogenetischer Stammbaum von relevanten Polypeptidsequenzen
  • Für das Alignment der Lsm-Proteinsequenzen wurde AlignX von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) basiert, verwendet. Unter Verwendung eines Neighbour-Joining Clustering-Algorithmus wurde ein phylogenetischer Stammbaum erstellt. Die Default-Werte lauteten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0.1, und die ausgewählte Gewichtsmatrix ist Blosum 62.
  • Das Ergebnis des multiplen Sequenz-Alignments, das mit AlignX von Vector NTI (Invitrogen) unter Verwendung der Default-Parameter durchgeführt wurde, ist in 10A dargestellt. Unter Verwendung des AlignX von Vector NTI (Invitrogen) und Einstellung von Default-Parametern wurden ein multiples Sequenz-Alignment und der entsprechend der phylogenetische Stammbaum (10B) der Lsm-Proteine durchgeführt. Die Lsm-Polypeptide fallen in Cluster, die mindestens ein Lsm-Protein der Gruppe beinhalten, die von den repräsentativen Lsm-Proteinen aus Arabidopsis thaliana gemäß SEQ ID NOs 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 definiert wird statt abseits der oben genannten repräsentativen Sequenzen Cluster zu bilden. Die Lsm1-Proteine bilden um AtLsm1 und AtLsm2 herum Cluster.
  • Die Lsm-Proteine in unterschiedlichen Klassifikationsgruppen bilden in separaten Kladen Gruppen. Es werden die Kladen für die Lsm-Klassen 1 bis 8 gezeigt.
  • Das multiple Alignment zeigt, dass die höchste Sequenzhomologie unter den Lsm-Polypeptiden im N-Terminus des Proteins besteht. Die konservierten Reste sind in der Konsensussequenz bezeichnet. Die Lage der konservierten Motive I und II sind bezeichnet. Außerdem sind die charakteristischen Motive Helix, Lsm-I-Motiv und Lsm-II-Motiv der Lsm-Proteinfamilie gezeigt.
  • Beispiel 13: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitincka gehostet) bestimmt. Die MatGAT-Softwafe erzeugt Ähnlichkeits/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der Diagonale Trennlinie dargestellt.
  • Bei dem in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen (unter Ausschluss der partialen Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz steht über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den Volllängen-Arabidopsis-thaliana-Lsm-Proteinen beginnt bei ungefähr 17% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 41. Die nächste paraloge Sequenz zu SEQ ID NO: 41 ist zu 79,7% zu SEQ ID NO: 41 identisch (Tabelle H1).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den Lsm-Domänen in den Arabidopsis-thaliana-Lsm-Proteinen beginnt bei ungefähr 19% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 41. Die Identität zwischen den Lsm-Domänen von SEQ ID NO: 41 und dem nächsten Paralog, AtLsm1b, beträgt 84,3% (Tabelle H2).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den Sequenzen des orthologen Lsm-Proteins in Tabelle H3 beginnt bei ungefähr 55%. Das nächste orthologe Protein zu SEQ ID NO: 41 in Tabelle H3 ist zu 84,3% mit SEQ ID NO: 41 identisch. Tabelle H1: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die Lsm-Polypeptidsequenzen von Arabidopsis thaliana
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    1. AtLsm1a 84,3 26,2 20,2 21,4 24,1 22,9 25,3 25,3 34,1 39,3
    2. AtLsm1b 92,8 23,8 25,9 25,6 22,9 24,1 30,3 24,1 36,4 38,1
    3. AtLsm2 42,2 43,4 19,1 20,7 31,1 20,7 25,6 24,4 21,4 23,7
    4. AtLsm3a 39,3 39,3 42,9 90,5 22,4 29,8 24,1 25,3 23,6 22,4
    5. AtLsm3b 39,3 39,3 41,7 96,4 22,4 29,8 23 23 23,6 23,5
    6. AtLsm4 36,1 38,6 48,6 39,3 39,3 23,2 25,9 24,7 22,4 25
    7. AtLsm5 48,2 47 39 46,4 46,4 40,2 19,5 19,5 20,7 28,9
    8. AtLsm6a 41,7 44 42,9 46,4 46,4 45,2 39,3 90,5 28,3 23,9
    9. AtLsm6b 40,5 40,5 44 46,4 45,2 42,9 39,3 92,9 30,4 22,7
    10. AtLMs7 50 53,6 32,1 47,6 48,8 34,5 47,6 46,4 44 32,1
    11. AtLsm8 61,4 59 38,2 36,9 36,9 40,8 47,6 45,2 44 46,4
    Tabelle H2: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die Lsm-Domäne gemäß den Arabidopsis thaliana-Lsm-Polypeptidsequenzen
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    1. At1g03330 Lsm2_domain 26,2 19,1 23,7 20,7 21,4 24,4 23,8 25,6 31,1 20,7
    2. AT1G19120 Lsm1a_domain 42,2 20,2 39,3 21,4 34,1 25,3 84,3 25,3 24,1 22,9
    3. AT1G21190 Lsm3a_domain 42,9 39,3 22,4 90,5 23,6 25,3 25,9 24,1 22,4 29,8
    4. AT1G65700 Lsm8_domain 38,2 61,4 36,9 23,5 31 22,7 38,1 23,9 25 28,9
    5. At1g76860 Lsm3b_domain 41,7 39,3 96,4 36,9 23,6 23 25,6 23 22,4 29,8
    6. AT2G03870 LMs7_domain 32,1 50 47,6 47,6 48,8 30,4 36,4 28,3 22,4 19,5
    7. AT2G43810 Lsm6b_domain 44 40,5 46,4 44 45,2 44 24,1 90,5 24,7 19,5
    8. AT3G14080 Lsm1b_domain 43,4 92,8 39,3 59 39,3 53,6 40,5 30,3 22,9 24,1
    9. AT3G59810 Lsm6a_domain 42,9 41,7 46,4 45,2 46,4 46,4 92,9 44 25,9 19,5
    10. AT5G27720 Lsm4_domain 48,6 36,1 39,3 40,8 39,3 34,5 42,9 38,6 45,2 23,2
    11. AT5G48870 Lsm5_domain 39 48,2 46,4 47,6 46,4 47,6 39,3 47 39,3 40,2
    Tabelle H3: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität zwischen Lsm-Proteinen der Klasse Lsm 1
    1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    1. AtLSM1a 79,7 84,4 76 72,1 70,3 77,3 77,3 76,6 76,6 76,6
    3. MsABE78228 Lsm1 88,3 85,9 84,5 80,1 57 77,3 77,3 85,2 85,2 84,4
    4. PpLSM1 90,6 93,8 80,6 76,5 60,9 85,9 85,9 81,3 81,3 79,7
    5. OsLSM1 86,8 92,2 91,5 94,9 55 75,2 75,2 95,3 95,3 92,2
    6. OsLSM 82,4 87,5 86,8 94,9 52,2 71,3 71,3 90,4 90,4 87,5
    7. BnLSM1a 71,9 64,1 66,4 62,8 59,6 56,3 56,3 55,5 55,5 53,9
    8. BnLSM1b 88,3 91,4 93,8 90,7 86 63,3 100 75,8 75,8 75
    9. BnLSM1c 88,3 91,4 93,8 90,7 86 63,3 100 75,8 75,8 75
    10. HvLSM1 85,9 93 90,6 97,7 92,6 62,5 89,8 89,8 100 92,2
    11. TaLSM1 85,9 93 90,6 97,7 92,6 62,5 89,8 89,8 100 92,2
    12. ZmLSM1 85,9 92,2 88,3 94,6 89,7 60,9 89,1 89,1 95,3 95,3
  • Beispiel 14: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains und Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle I1 dargestellt. Tabelle I1: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung
    Interpro IPR006649 LSM_core
    Interpro IPR010920 LSM_related_core.
    Interpro IPR001163 LSM_snRNP_core.
    Pfam PF01423 LSM
    ProDom PD020287 snRNP
    SMART SM00651 Sm.1
    Tabelle I2: SEQ ID No., die der Sequenz der Lsm-Domäne in den Lsm-Proteinen in Tabelle G entspricht
    Bezeichnung SEQ ID NO. Bezeichnung des Lsm-Referenzproteins SEQ ID NO. des Lsm-Referenzproteins
    AtLSM1a_domain 120 AtLSM1a 41
    AtLSM1b_domain 121 AtLSM1b 43
    AtLMS2_domain 122 AtLMS2 45
    AtLSM3a_domain 123 AtLSM3a 47
    AtLSM3b_domain 124 AtLSM3b 49
    AtLMS4_domain 125 AtLMS4 51
    AtLMS5_domain 126 AtLMS5 53
    AtLMS6a_domain 127 AtLMS6a 55
    AtLMS6b_domain 128 AtLMS6b 57
    AtLMS7_domain 129 AtLMS7 59
    AtLMS8_domain 130 AtLMS8 61
    MsABE78228_domain 131 MsABE78228 63
    PpLSM1_domain 132 PpLSM1 65
    OsLSM1_domain 133 OsLSM1 67
    OsLSM3_domain 134 OsLSM3 69
    OsLMS4_domain 135 OsLMS4 71
    OsLSM5_domain 136 OsLSM5 73
    OsLSM6_domain 137 OsLSM6 75
    OsLSM7_domain 138 OsLSM7 77
    OsLSM8_domain 139 OsLSM8 79
    Os_LSM_domain 140 Os_LSM 81
    LuLSM8_domain 141 LuLSM8 83
    BnLSM1a_domain 142 BnLSM1a 85
    BnLSM1b_domain 143 BnLSM1b 87
    BnLSM1c_domain 144 BnLSM1c 89
    BnLSM4a_domain 145 BnLSM4a 91
    BnLSM4b_domain 146 BnLSM4b 93
    BnLSM4c_domain 147 BnLSM4c 95
    GmLSM4a_domain 148 GmLSM4a 97
    GmLSM4b_domain 149 GmLSM4b 99
    GmLSM4c_domain 150 GmLSM4c 101
    Gm_LSM5_domain 151 Gm_LSM5 103
    HvLSM1_domain 152 HvLSM1 105
    HvLSM4_domain 153 HvLSM4 107
    TaLSM1_domain 154 TaLSM1 109
    TaLSM4a_domain 155 TaLSM4a 111
    TaLSM4b_domain 156 TaLSM4b 113
    ZmLSM1_domain 157 ZmLSM1 115
    ZmLSM4a_domain 158 ZmLSM4a 116
  • Beispiel 15: Klonieren der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40
  • Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Das Arabidopsis-thaliana-Lsm-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung einer Arabidopsis-thaliana-Keimpflanzen-cDNA-Bibliothek (Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize amplifiziert. Für die PCR-Amplifikation wurden der sense-Primer 5'-ggggacaagtttgt acaaaaaagcaggcttaaacaatgtcttgggctgctcct-3' (SEQ ID NO: 162) und der Reverseprimer 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttttctacaatgctgcaacaca-3' (SEQ ID NO: 163), die die AttB-Spaltstellen für die Gateway-Rekombination beinhalten, verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgefürt. Ein PCR-Fragment mit der erwarteten Größe (einschließlich AttB-Spaltstellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone”, pLsm, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Beispiel 16: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40
  • Der „entry clone pLsm” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit pWSI18, einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthält als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den „entry clone” kloniert wurde, dient. Ein Reis-WSI18-Promoter (SEQ ID NO: 157) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pWSI18::Lsm (11) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 17: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCL2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekultur, in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen invitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achseinodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps/Canola-Transformation
  • Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesetzt zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0.7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0.5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4.35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloridlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl für die Keimung umgesetzt. Die Hypokotyle von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr. 108 Zellen pro ml, verdünnt von einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur unter Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) umgesetzt, und zwar mit Murashige-Skoog-Salzen und mit B5-Vitaminen (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxime und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um die restlichen Bakterien abzutöten. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden für die Gewebevermehrung weiter auf Selektionsmedium kultiviert (30°C, 16-Stunden-Fotoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nichtselektionsmedium weiter kultiviert, um zu somatischen Embryonen zu gelangen. Gesund aussehende Embryonen mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0.1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 Stunden kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultur ins Gewächshaus umgestellt.
  • Beispiel 18 Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 18.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Fünf Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspalteten, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Die Pflanzen wurden unter unterschiedlichen Gießbehandlungen ausgewertet. Bei der Behandlung 1 wurde täglich gegossen, und zwar mit genug Wasser, um die Erfordernisse der Pflanzen für optimales Wachstum ohne Wassermangelsymptome zu decken. Bei der Behandlung 2 wurde das Gießen während des Rispenschiebens zeitweise reduziert, bis sichtbare Wassermangelsymptome, die sich als Blattrollen äußerten, bei den Kontrollpflanzen zu beobachten waren. Unter den letztgenannten Bedingungen sank der Wassergehalt im Boden unter 20% ab.
  • Vier T1-Events wurden in der T2-Generation weiter ausgewertet, wobei man bei der Auswertung wie bei der T1-Generation vorging, jedoch mit mehr Einzelorganismen pro Event. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
  • Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
  • 18.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, gemessen wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und einen Gesamteffekt des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die unterschiedlichen Phänotypen verursacht.
  • 18.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) 3 Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllte Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozentsatz ausgedrückt) der Anzahl gefüllte Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 19: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Nukleinsäuresequenz exprimieren, sind in Tabelle J dargestellt. Der Unterschied in Prozent zwischen den transgenen Pflanzen und den entsprechenden Nullizygoten ist ebenfalls dargestellt.
  • In den transgenen Pflanzen, die die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Nukleinsäuresequenz exprimieren, sind der Gesamtsamenertrag, die Anzahl der gefüllten Samen, die Samenfüllungsrate und der Harvest Index im Vergleich zu den Kontrollpflanzen (im vorliegenden Fall den Nullizygoten) signifikant erhöht. Tabelle J: Ergebnisse der Ausbreitung von transgenen Reispflanzen, die die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Nukleinsäuresequenz exprimieren.
    Merkmal % Erhöhung unter Gießbehandlung 1 % Erhöhung unter Gießbehandlung 2
    Gesamtsamenertrag 27 27
    Anzahl gefüllte Samen 25 25
    Füllrate 27 14
    Biomasse 1 5
    Harvest Index 25 21
  • Reispflanzen, die mit einer Nukleinsäure, die für das Protein von SEQ ID NO: 47 kodieren und unter der Kontrolle des Reis-GOS2-Promoters stehen, wurden unter den Gießbehandlungsbedingungen 2 herangezogen. Bei mindestens einem Event wurde eine Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Parameter beobachtet: Vegetative Biomasse, Jungpflanzenvitalität, Samengesamtgewicht, Anzahl gefüllte Samen, Gesamtzahl Samen.
  • Beispiel 20: Identifikation von Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 165 und SEQ ID NO: 166 verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von SEQ ID NO: 172 und/oder SEQ ID NO: 173 und Datenbankabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 165 verwandt sind, und/oder Proteinsequenzen, die mit SEQ ID NO: 166 verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Das von SEQ ID NO: 173 kodierte Polypeptid wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß dem Wahrscheinlichkeits-Score (E-Wert) gereiht, wobei der Score die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentidentität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure (oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren.
  • In Tabelle K findet sich eine Aufzählung von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 165 und der Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 166 verwandt sind. Tabelle K: Nukleinsäuresequenzen, die für CycHTr-Polypeptide und CycHTr-Polypeptide kodieren.
    Bez. Herkunftsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO:
    AtCycHTr Arabidopsis thaliana 1 2
    AtCycH1 Arabidopsis thaliana 8 9
    CAK-assoziiertes cyclinH-Homolog Populus tremula x Populus tremuloides 10 11
    cycH-1 Oryza sativa 12 13
    CycH Lycopersicon esculentum 14 15
    CycH Zea mays 16 17
    CycH Triticum aestivum 18 19
    CycH Aquilegia formosa 20 21
    CycH Solanum tuberosum 22 23
    CycH Saccharum officinarum 24 25
    CycH Ostreococcus tauri 26 27
    CycH Drosophila melanogaster 28 29
    CycH Homo sapiens 30 31
    CycH Phaeodactylum tricornutum 32 33
  • Beispiel 21: Alignment von CycH-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Verwendung des ClustalW (1.83) Algorithmus. Alternativ dazu kann man AlignX von Vector NTI (Invitrogen), das ebenfalls auf dem beliebten Clustal-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) basiert, verwenden. Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte „weight matrix” ist Blosum 62 (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Die Ergebnisse in 14 zeigen, dass den CycH-Polypeptiden Regionen mit hoher Sequenzkonservierung gemeinsam sind.
  • Ein phylogenetischer Stammbaum der CycHTr-Polypeptide wurde unter Verwendung von Standardtechniken erstellt. 15 zeigt, wie die CycH-Polypeptide miteinander Cluster bilden.
  • Beispiel 22: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (Campanella et al, BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein oder DNA sequences) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der Diagonale Trennlinie dargestellt.
  • Bei dem in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle L für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen (unter Ausschluss der partialen Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz steht über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale (normal gedruckt).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den CycH-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kann nur 22% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 173 betragen. Tabelle L: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen
    Figure 02110001
  • Beispiel 23: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains und Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 173 sind in Tabelle M dargestellt. Tabelle M: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 173
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung
    Interpro IPR006670 cyclin
    Interpro IPR011028 Cyclin-like
    SMART SM00385 cyclin
    PANTHER PTHR10026 SF8 CYCLIN H
    SUPERFAMILY SSF47954 Cyclin-like
  • Beispiel 24: Topologievorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind (Lokalisierung inerhalb der Zelle, Transmembran ...)
  • TargetP 1.1 sagt die Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen innerhalb der Zelle vorher. Die Lokalisierungszuordnung beruht auf dem vorhergesagten Vorliegen von einer der folgenden N-terminalen Präsequezen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), „mitochondrial Targeting Peptide (mTP) oder Signalpeptid des sekretorischen Wegs (SP). Die Scores, auf denen die schlussendliche Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und fügen nicht ungedingt etwas zu einer Wahrscheinlichkeit hinzu. Die Lokalisierung mit dem höchsten Scores ist jedoch gemäß TargetP die wahrscheinlichste, und die Beziehung zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis dafür sein, wie gewiss die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Klasse RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird am Server der technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Bei denjenigen Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine mögliche Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurden mehrere Parameter ausgewählt, wie Organismengruppe (Nichtpflanze oder Pflanze), Cutoff-Sätze (keine, vorbestimmter Cutoff-Satz oder vom User spezifizierter Cutoff-Satz), und Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (ja oder nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 173 sind in Tabelle D dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe „Pflanze” gewählt, es wurden keine Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des gewünschten Transitpeptids. Bei der Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 173 innerhalb der Zelle kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln. Es ist jedoch anzumerken, dass die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen beobachteten Auswirkungen auf den Ertrag nicht durch eine bestimmte Lokalisierung des Proteins hervorgerufen werden. Tabelle N: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 173
    Länge (AA) 336
    Chloroplasten-Transitpeptide 0,109
    Mitochondrien-Transitpeptide 0,416
    Signalpeptide des sekretorischen Wegs 0,083
    Sonstiges Targeting an die Zellorganellen 0,551
    Vorhergesagte Lokalisation sonstige
    Verlässlichkeitsklasse 5
    Vorhergesagte Transitpeptidlänge /
  • Für die Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, darunter:
    • • ChloroP 1.1, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark;
    • • Protein Prowler Subcellular Lokalisation Predictor Version 1.2, gehostet am Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet am Server der University of Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, gehostet am Server der Technischen Universität Dänemark.
  • Beispiel 25: Assay bezüglich der bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Polypeptidsequenzen
  • Für die Bestimmung der Interaktion zwischen einem CycHTr-Protein und dem CAK-Protein verwendet man das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Yamaguchi et al, 2000). Kurz gesagt werden CAK in Fusion mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne (DNA-BD) und CycHTr in Fusion mit der GAL4-Transaktivierungsdomäne (AD) von den Saccharomyces-cerevisiae-Stamm Y190, bei dem die HIS3 und LacZ-Reportergene unter den Konsensus-Sequenzen der GAL4-Bindungsstelle stehen, erzeugt. Die Expression von CAK oder CycHTr indizuert nicht die Expression der Reportergene, während Zellen, die sowohl das CAK- als auch das CycHTr-Fusionsprotein exprimieren, auf einem Medium ohne Histidin wachsen und das LacZ-Protein exprimieren können.
  • Die Aktivierung der CAK durch CycH wird gemäß Yamaguchi (2000) gemessen. Bei der Sprosshefe weist Civ1/Cak1 in vitro eine CAK-Aktivität, jedoch keine CTD-Kinaseaktivität, auf. Es wurde nachgewiesen, dass die Überexpression der Reis-CAK (R2) fähig war, für eine CAK-Mutation in dem Sprosshefestamm GF2351, der eine temperaturempfindliche Mutation in dem civ1/cak1-Gen trägt, zu komplementieren. Werden CAK (als Klon in dem Expressionsvektor pYES2, der den galaktoseinduzierbaren GAL1-Promoter enthält), CycH, (als Klon in dem konstitutiven Expressionsvektor pGAD-GL, der den verkürzten adh-Promoter enthält und die GAL4-Transaktivierungsdomäneinfusion mit CycH exprimiert) oder beide in GF2351-Zellen eingeführt, dann wachsen Zellen, die CAK exprimieren, bei 34°C auf galaktosehaltigem Minimalmedium (MVGS), jedoch nicht auf glukosehaltigem Minimalmedium (MVD). Zellen, die nur CycH exprimieren, können bei 34°C nicht wachsen. Im Gegensatz dazu wachsen Zellen, die sowohl CAK als auch CycH exprimieren, auf dem MVGS-Medium bei 36°C, jedoch sind bei dieser Temperatur diejenigen, die nur CAK exprimieren, nicht zum Wachstum befähigt. Dies zeigt an, dass die Expression von CycH die supprimierende Aktivität der CAK auf die civ1/cak1-Mutation in Sprosshefezellen verstärkt. Im Gegensatz dazu wird, wenn statt CycH CycHTr verwendet wird, keine Aktivierung beobachtet.
  • Darüberhinaus führt die Überexpression eines CycHTr-Proteins in einer Pflanze zu erhöhten Samenausbeuten, wie unten beschrieben.
  • Beispiel 26: Klonieren der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 165
  • Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Das Arabidopsis-thaliana-CycHTr-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung einer Arabidopsis-thaliana-Keimpflanzen-cDNA-Bibliothek (Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize amplifiziert. Die Primer (SEQ ID NO: 167; sense,: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggcggattttcagacatc-3') und SEQ ID NO: 168; revers, komplementär,: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaactcaacctatgggtggc-3'), die die AttB-Spaltstellen für die Gateway-Rekombination beinhalten, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment mit der erwarteten Größe (einschließlich AttB-Spaltstellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone” rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Beispiel 27: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 165
  • Die „entry clone umfassende SEQ ID NO: 165” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den „entry clone” kloniert wurde, dient. Ein Reis-Oleosin- oder -WSI18-Promoter (SEQ ID NO: 170 oder SEQ ID NO: 171) für die samenspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pSeed::CycHTr (16) nach fachbekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 28: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCL2, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer, in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps/Canola-Transformation
  • Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältlich Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesetzt zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in- vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0.7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0.5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4.35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl für die Keimung umgesetzt. Die Hypokotyle von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt von einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1.6 g/l Gelrite) umgesetzt, und zwar mit Murashige-Skoog-Salzen und mit B5-Vitaminen (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxime und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um die restlichen Bakterien abzutöten. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden für die Gewebevermehrung weiter auf Selektionsmedium kultiviert (30°C, 16-Stunden-Fotoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nichtselektionsmedium weiter kultiviert, um zu somatischen Embryonen zu gelangen. Gesund aussehende Embryonen mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 Stunden kultiviert, und Pflänzchen in 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus umgestellt.
  • Beispiel 29: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 29.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekultur in ein Gewächshaus umgestellt. Sieben Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Events wurden in der T2-Generation weiter ausgewertet, wobei man bei der Auswertung wie bei der T1-Generation vorging, jedoch mit mehr Einzelorganismen pro Event. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen von T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichen. Anschließend werden sie in ein „trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in zufallsmäßig ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
  • Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • 29.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, gemessen wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und einen Gesamteffekt des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Events durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist nützlich, um die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen „Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch-Event-Segreganten) mit einbezieht. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Likelihood-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen vergleicht.
  • 29.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) 3 Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse während des Zeitraums des aktiven Wachstums von Wurzel and Spross) ausgedrückt.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozentsatz ausgedrückt) der Anzahl gefüllte Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 30: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die CycHTr-Nukleinsäure unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promoters exprimieren, zeigten, dass im Vergleich zu den Kontrollpflanzen eine Erhöhung bei einem oder mehr der folgenden Parameter stattgefunden hatte: Vegetative Biomasse (Maximalfläche), Wurzel/Spross-Index, Samengesamtgewicht, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Anzahl Blüten pro Rispe, Harvest Index (HI), Tausendkorngewicht (TKG), Gesamtsamenzahl.
  • Bei dem Konstrukt mit dem Oleosinpromoter waren unter den erhöhten Parametern die in Tabelle O dargestellten. Tabelle O: Erhöhte Samenparameter für Pflanzen mit dem CycHTr-Transgen unter der Kontrolle eines Oleosinpromoters, im T1- und T2-Stadium
    Parameter T1 T2 kombiniert
    % Erhöhung p-Wert % Erhöhung p-Wert p-Wert
    Max. Fläche 13 0,0020 30 0,0000 0,0000
    Samengesamtgewicht 22 0,0021 38 0,0000 0,0000
    Anzahl gefüllte Samen 23 0,0008 35 0,0000 0,0000
    Samenfüllungsrate 16 0,0011 32 0,0000 0,0000
    Harvest Index 7 0,2319 18 0,0044 0,0000
  • Beispiel 31: Identifikation von Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 198 und SEQ ID NO: 199 verwandt sind
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbankabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 198 verwandt sind, und/oder Proteinsequenzen, die mit SEQ ID NO: 199 verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Das von SEQ ID NO: 199 kodierte Polypeptid wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß dem Wahrscheinlichkeits-Score (E-Wert) gereiht, wobei der Score die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentidentität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren.
  • In Tabelle P findet sich eine Aufzählung von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198 und der Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 199 verwandt sind. Tabelle P: Nukleinsäuresequenzen, die für Remorin-Polypeptide kodieren, und Remorin-Polypeptide
    Bez. Herkunftsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO: Datenbank-Eingangnummer Datenbank-Eingangnummer
    Remorin Arabidopsis thaliana 198 199 NM_115614.2 NP_567050.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 200 201 AY086863.1 AAM63910.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 202 203 NM_115990.3 NP_191685.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 204 205 M25268.1 AAA57124.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 206 207 BT000016.1 AAN15335.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 208 209 AF387006_1 AAK62451.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 210 211 NM_203095.1 NP_974824.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 212 213 NM_122280.2 NP_197764.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 214 215 NM_114753.1 NP_190463.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 216 217 NM_130145.3 NP_182106.1
    hypothetisch Arabidopsis thaliana 218 219 gi|7267383 CAB80876.1
    ohne Bez. Arabidopsis thaliana 220 221 gi|10176838 BAB10048.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 222 223 NM_116292.2 NP_191976.2
    Remorin Arabidopsis thaliana 224 225 NM_179535.1 NP_849866.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 226 227 NM_001036171.1 NP_001031248.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 228 229 NM_105426.2 NP_564900.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 230 231 NM_125521.1 NP_200936.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 232 233 NM_129751.1 NP_181718.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 234 235 NM_101258.1 NP_172845.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 236 237 gi|7270623 CAB80363.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 238 239 NM_104263.3 NP_175789.2
    Remorin Arabidopsis thaliana 240 241 NM_102770.3 NP_174322.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 242 243 NM_202247.1 NP_973976.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 244 245 NM_126277.1 AAO23587.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 246 247 gi|6382042 AAC13631.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 248 249 gi|12597777 AAG60092.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 250 251 gi|12325073 AAG52495.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 252 253 gi|6850877 CAB71056.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 254 255 gi|6434255 CAB62016.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 256 257 gi|6491703 CAB66111.1
    Remorin Arabidopsis thaliana 258 259 gi|12324670 AAG52296
    Remorin Arabidopsis thaliana 260 261 gi|20198316 AAB63554
    Remorin Arabidopsis thaliana 262 263 gi|7940274 AAF79398
    Remorin Oryza sativa 264 265 Os02g0824500 NP_001048576.1
    Remorin Oryza sativa 266 267 Os02g0642200 NP_001047554.1
    Remorin Oryza sativa 268 269 Os04g0533300 NP_001053409.1
    Remorin Oryza sativa 270 271 Os10g0503800 BAF26915.1
    Remorin Oryza sativa 272 273 Os07g0208600 BAF21077.1
    Remorin Oryza sativa 274 275 Os03g0111200 BAF10636.1
    Remorin Oryza sativa 276 277 Os07g0569100 NP_001060036.1
    Remorin Oryza sativa 278 279 Os03g0808300 NP_001051650.1
    Remorin Oryza sativa 280 281 Os03g0211500 NP_001049348.1
    Remorin Oryza sativa 282 283 Os02g0602000 BAF09268.1
    Remorin Oryza sativa 284 285 Os02g0658400 BAF09549.1
    Remorin Oryza sativa 286 287 Os03g0120200 BAF10700.1
    Remorin Oryza sativa 288 289 Os02g0116800 NP_001045682.1
    Remorin Oryza sativa 290 291 Os04g0620200 NP_001053905.1
    Remorin Oryza sativa 292 293 Os12g0613600 BAF30284.1
    Remorin Oryza sativa 294 295 Os11g0616300 BAF28646.1
    Remorin Oryza sativa 296 297 Os10g0325400 BAF26266.1
    Remorin Oryza sativa 298 299 Os09g0456100 BAF25275.1
    Remorin Oryza sativa 300 301 Os08g0471800 NP_001062016.1
    Remorin Oryza sativa 302 303 Os02g0767000 NP_001048227.1
    hypothetisch Zea mays 304 305 gi|23928433 AAN40027.1
    Remorin Solanum tuberosum 306 307 gi|1881584 AAB49425.1
    Remorin Glycine max 308 309 gi|83853825 ABC47866.1
    Remorin Medicago truncatula 310 311 gi|61097833 ABN08208.1
    Remorin Medicago truncatula 312 313 gi|62629912 ABE89592.1
    Remorin Medicago truncatula 314 315 gi|84662897 ABE87162.1
    rem-1 Lycopersicum esculentum 316 317 gi|4731572 AAD28506.1
    rem-2 Lycopersicum esculentum 318 319 gi|4883529 AAD28507.2
    Remorin Medicago truncatula 320 321 gi|49170172 ABE84731.1
    Remorin Musa acuminata 322 323 gi|102140012 ABF70164.1
    Remorin Medicago truncatula 324 325 gi|52694025 ABE86981.1
  • Beispiel 32: Alignment der Remorin-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Verwendung des AlignX-Programms von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal W Algorithmus des progressiven 5 Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) beruht. Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte „weight matrix” ist Blosum 62 (wenn die Polypeptide als Alignment vorliegen). Konservierte Sequenzen finden sich bei den Remorinen im Wesentlichen in der C-terminalen Remorin-Domäne der Polypeptide, wobei die N-terminale Domäne üblicherweise variabler bezüglich Sequenzlänge und -zusammensetzung ist. Die C-terminale Remorin-Domäne der Remorin-Polypeptide ist in 20 als Alignment dargestellt. Die Aminosäurereste in der C-terminalen Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199 (und gemäß SEQ ID NO: 326) sind fettgedruckt, darüber steht ein schwarzes Kästchen. Die meisten Remorin-Polypeptide umfassen mindestens ein Cys und/oder Phe in den C-terminalen zehn Aminosäureresten, wie dies mit einem Kästchen in 20 dargestellt ist. Die vorhergesagte Coiled-Coil-Region ist doppelt unterstrichen, und eine mutmaßliche Sumoylierungsstelle ist eingerahmt.
  • Beispiel 33: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fach Welt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J, Software gehostet von Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der Diagonale Trennlinie dargestellt.
  • Bei dem in dem Vergleich eingesetzten Parameter handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle Q für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen aus zum Beispiel Arabidopsis (unter Ausschluss der partialen Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz steht über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Polypeptidsequenzen aus Arabidopsis thaliana kann nur 11% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 199 betragen.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen der C-terminalen Remorin-Domäne der Arabidopsis-thaliana-Remorin-Polypeptide, wie die C-terminale Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199 gemäß SEQ ID NO: 326 ist in Tabelle Q1 dargestellt. Der Prozentsatz der Identität zwischen Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 326 und anderen Arabidopsis-thaliana-Remorin C-terminalen Remorin-Domänen steigt auf 16% Aminosäureidentität.
  • Figure 02300001
  • Figure 02310001
  • Beispiel 34: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains und Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199 sind in Tabelle R und 20 dargestellt. Tabelle R: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO 199
    InterPro IPR005516 Remorin, C-terminale Region 180-291
    Pfam PF03763 Remorin C 180-291
    Prodom PD350442 Remorin C 180-291
  • Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von multiplen Sequenz-Alignments und versteckten Markov-Modellen, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger-Instituts in Großbritannien gehostet.
  • Beispiel 35: Vorhersage von Merkmalen der Sekundärstruktur der bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Polypeptidsequenzen
  • „Coiled Coils” enthalten üblicherweise ein wiederholtes Muster von sieben Aminosäureresten, das als Heptadenwiederholungen bezeichnet wird. „Coiled Coils” sind wichtig für die Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen, wie Oligomerisation, und zwar entweder von identischen Proteinen, von Proteinen derselben Familie oder von nichtverwandten Proteinen. Ein Remorin-Polypeptid kann mit sich selbst oder mit einem Remorin-Ortholog oder einem Paralog interagieren. In jüngster Zeit wurden wichtige Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage von „Coiled Coils” aus Sequenzdaten gemacht. Bei „ExPASy Proteomics” Werkzeugen sind viele Algorithmen verfügbar, mit denen der Fachmann vertraut ist. Einer davon, COILS, ist ein Programm, das eine Sequenz mit einer Datenbank von bekannten parallelen zweisträngigen „Coiled Coils” vergleicht und eine Similaritätswertung ableitet. Durch Vergleichen dieser Wertung mit der Verteilung der Wertungen in globulären und „Coiled-Coil”-Proteinen berechnet das Programm dann die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz eine „Coiled Coil”-Konformation einnehmen wird.
  • Das Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199 weist mit hoher Wahrscheinlichkeit in allen drei untersuchten Windows (14, 21 und 28) eine C-terminale vorhergesagte „Coiled Coil”-Domäne auf. In Tabelle D sind die Koordinaten der Reste, die Reste, die drei Windows und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte dargestellt. In 2 ist der graphische Output des COILS-Algorithmus an dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, wo die vorhergesagte „Coiled Coil” deutlich in der C-terminalen Hälfte des Polypeptids sichtbar ist, in allen drei Windows (durch die drei Linien dargestellt). Tabelle S: Numerischer Output des COILS-Algorithmus an dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199. Es sind die Koordinaten der Reste (#), die Reste, die drei Windows und die entsprechenden Wahrscheinlichkeitswerte dargestellt. Wahrscheinlichkeiten über 0,09 sind grau dargestellt.
    # Rest Window = 14 Wahrsch Window = 21 Wahrsch Window = 28
    213 G c 0,003 C 0,014 b 0,004
    214 W d 0,002 C 0,069 c 0,013
    215 L d 0,014 D 0,821 d 0,626
    216 N e 0,014 E 0,821 e 0,626
    217 E f 0,014 F 0,821 f 0,626
    218 Q g 0,014 G 0,821 g 0,626
    219 V a 0,014 A 0,821 a 0,626
    220 H b 0,014 B 0,821 b 0,626
    221 R c 0,066 C 0,821 c 0,626
    222 A d 0,066 D 0,821 d 0,626
    223 N e 0,066 E 0,821 e 0,626
    224 S f 0,066 F 0,821 f 0,626
    225 W g 0,066 G 0,821 g 0,626
    226 M a 0,642 A 0,821 a 0,626
    227 K b 0,642 B 0,821 b 0,626
    228 K c 0,642 C 0,821 c 0,626
    229 I d 0,642 D 0,821 d 0,626
    230 E e 0,642 E 0,821 d 0,746
    231 R f 0,642 F 0,821 b 0,819
    232 K g 0,642 G 0,821 c 0,819
    233 L a 0,642 A 0,821 d 0,819
    234 E b 0,642 B 0,821 e 0,819
    235 D c 0,642 C 0,821 f 0,819
    236 R d 0,642 D 0,789 f 0,889
    237 R e 0,642 D 0,871 g 0,889
    238 A f 0,642 E 0,871 a 0,889
    239 K f 0,908 F 0,976 f 0,967
    240 A g 0,930 G 0,976 g 0,967
    241 M a 0,982 A 0,976 a 0,967
    242 E b 0,982 B 0,976 b 0,967
    243 K c 0,982 C 0,976 c 0,967
    244 T d 0,982 D 0,976 d 0,967
    245 Q e 0,982 E 0,976 e 0,967
    246 N f 0,982 F 0,976 f 0,967
    247 K g 0,982 G 0,976 g 0,967
    248 V a 0,982 A 0,976 a 0,967
    249 A b 0,982 B 0,976 b 0,967
    250 K c 0,982 C 0,976 c 0,967
    251 A d 0,982 D 0,976 d 0,967
    252 Q e 0,982 E 0,976 e 0,967
    253 R f 0,982 F 0,976 f 0,967
    254 K g 0,982 G 0,976 g 0,967
    255 A a 0,981 A 0,976 a 0,967
    256 E b 0,981 B 0,976 b 0,967
    257 E c 0,981 C 0,976 c 0,967
    258 R d 0,727 D 0,976 d 0,967
    259 R e 0,578 E 0,976 e 0,967
    260 A b 0,577 F 0,964 f 0,967
    261 T c 0,577 G 0,958 g 0,967
    262 A d 0,577 A 0,913 a 0,967
    263 E e 0,577 B 0,913 b 0,967
    264 G f 0,577 C 0,585 c 0,967
    265 K g 0,577 D 0,550 d 0,967
    266 R a 0,577 E 0,407 e 0,967
    267 G b 0,092 F 0,064 f 0,769
    268 T c 0,029 G 0,024 g 0,741
    269 E d 0,010 D 0,023 a 0,159
    270 V a 0,007 E 0,023 b 0,017
    271 A b 0,007 F 0,023 c 0,009
    272 R c 0,007 G 0,023 g 0,007
    273 V d 0,007 A 0,023 a 0,007
    274 L e 0,007 B 0,007 b 0,007
  • Weitere wichtige Sekundärstrukturen können unter Verwendung von Algorithmen vorhergesagt werden, die die Sequenzinformation gemäß SEQ ID NO: 199 benötigen. Viele nützliche Algorithmen werden an der ExPaSy-Site, die vom Swiss Bioinformatics Institute gehostet wird, umgruppiert. So zum Beispiel ist Jpred ein Web-Server, der ausgehend von einer Proteinsequenz oder einem multiplen Alignment von Proteinsequenzen die Sekundärstruktur unter Verwendung eines neuronalen Netzes mit der Bezeichnung Jnet vorhersagt. Die Vorhersage ist die Definition von jedem Rest in entweder alpha-Helix-(H), beta-Faltblatt-(E) oder Random-Coil-(C)-Sekundärstrukturen. Es folgt nun der Output des Vorhersageprogramms für das Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199:
    Figure 02350001
  • Beispiel 36: Aminosäurezusammensetzung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199
  • Die primäre Aminosäurezusammensetzung (in %) für die Bestimmung, ob eine Polypeptid-Domäne reich an spezifischen Aminosäuren ist, kann unter Verwendung von Software-; Programmen, insbesondere des ProtParam-Werkzeugs, von dem ExPASy-Server (Gasteiger et al, (2003), ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788), berechnet werden. Die Zusammensetzung des interessierenden Proteins kann dann mit der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (in %) in der UniProtKB/Swiss-Prot Proteinsequenzdatenbank (Neuerscheinung 52.0 vom 6. März 2007, enthält 260175 Sequenzeingänge und umfasst 95002661 Aminosäuren aus 152564 Literaturstellen) verglichen werden.
  • Das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199, die Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199 und die N-terminale Domäne von SEQ ID NO: 199 wurden auf ihre Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen T und U unten angegeben. Tabelle T: Aminosäurezusammensetzung des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 199, die C-terminale Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199 und die N-terminale Domäne von SEQ ID NO: 199 (Aminosäurereste stromaufwärts der C-terminalen Remorin-Domäne vom N- zum C-Terminus) im Vergleich mit der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (in %) in der UniProtKB/Swiss-Prot Proteinsequenzdatenbank (Neuerscheinung 52.0 vom 6. März 2007).
    Volllängen-Polypeptid (insgesamt 296 Aminosäuren) Remorin-Domäne (180-290) N-terminale-Domäne (1-179) Swiss-Prot 52.0
    Rest Anzahl % Anzahl % Anzahl % %
    Ala (A) 25 8,4 17 15,3 8 4,5 7,88
    Arg (R) 30 10,1 15 13,5 15 8,4 5,42
    Asn (N) 22 7,4 7 6,3 15 8,4 4,13
    Asp (D) 17 5,7 2 1,8 15 8,4 5,33
    Cys (C) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1,5
    Gln (Q) 12 4,1 5 4,5 7 3,9 3,96
    Glu (E) 25 8,4 12 10,8 13 7,3 6,66
    Gly (G) 21 7,1 4 3,6 7 9,5 6,96
    His (H) 4 1,4 1 0,9 3 1,7 2,29
    Ile (I) 12 4,1 4 3,6 8 4,5 5,91
    Leu (L) 12 4,1 4 3,6 7 3,9 9,65
    Lys (K) 15 5,1 15 13,5 0 0,0 5,92
    Met (M) 7 2,4 3 2,7 4 2,2 2,39
    Phe (F) 6 2,0 1 0,9 3 1,7 3,95
    Pro (P) 9 3,0 2 1,8 7 3,9 4,82
    Ser (S) 27 9,1 1 0,9 23 12,8 6,84
    Thr (T) 24 8,1 5 4,5 19 10,6 5,40
    Trp (W) 4 1,4 3 2,7 1 0,6 1,13
    Tyr (Y) 3 1,0 0 0,0 3 1,7 3,01
    Val (V) 21 7,1 10 9,0 11 3,1 6,73
    Tabelle U: Anzahl der positiv und negativ geladenen Reste des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 199, der Remorin-Domäne von SEQ ID NO: 199. und der N-terminalen Domäne von SEQ ID NO: 199.
    SEQ ID NO: 199 Remorin-Domäne (180-290) N-terminale-Domäne (1-179) Swiss-Prot 52.0 in Prozent
    Gesamtzahl negativ geladene Reste (Asp + Glu): 42 14 28 12%
    Gesamtzahl positiv geladene Reste (Arg + Lys): 45 30 15 11,3%
    Prozentsatz geladene Aminosäuren insgesamt: 29% 40% 24% 23,33%
  • Die Remorin-Domäne ist an geladenen Aminosäuren, insbesondere Lys, Arg und Glu, angereichert.
  • Beispiel 37 Vorhersage von Serin/Threonin-Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen in dem in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen Polypeptid.
  • Die Phosphorylierungszustände eines Polypeptids stehen üblicherweise mit einer Aktivierung oder Inaktivierung oder Aktivierungs-/Inaktivierungszwischenstufen des Polypeptids in Zusammenhang. Die durch OGA und oder PGA erhöhte Phosphorylierung von Remorin findet an einem oder mehreren Threoninrest(en) als Ergebnis einer Serin/Threonin-Proteinkinase statt. Obwohl alle Serin/Threonin-Kinasen Serin- oder Threoninreste in ihren Substraten phosphorylieren, wählen sie für die Phosphorylierung spezifische Reste aufgrund derjenigen Reste, die die Phosphorakzeptorstelle flankieren, die gemeinsam die Konsensus-Sequenz umfassen. Wie in der Technik gut bekannt wurden mehrere Algorithmen entwickelt, um solche Phosphorylierungsstellen aufgrund einer gegebenen Polypeptidsequenz vorherzusagen. Der NetPhos 2.0 Server, der an der Technischen Universität Dänemark gehostet wird, erstellt Neuronennetzwerkvorhersagen für Serin-, Threonin- und Thyrosinphosphorylierungsstellen in eukaryontischen Proteinen. NetPhos 2.0 Server – Ergebnis der Vorhersage
    Figure 02380001
    Vorhersagen für Serin
    Bezeichnung Pos Kontext Wertung Vorhersage
    Sequenz 10 GQERSPENS 0.986 *S*
    Sequenz 14 SPENSTTST 0.974 *S*
    Sequenz 17 NSTTSTTDA 0.997 *S*
    Sequenz 22 TTDASDRRD 0.995 *S*
    Sequenz 30 DETPSSEIV 0.730 *S*
    Sequenz 31 ETPSSEIVV 0.677 *S*
    Sequenz 55 QQRGSGGGY 0.972 *S*
    Sequenz 61 GGYLSPSRS 0.979 *S*
    Sequenz 63 YLSPSRSIA 0.395 .
    Sequenz 65 SPSRSIAFS 0.415 .
    Sequenz 69 SIAFSDGTT 0.942 *S*
    Sequenz 74 DGTTSSGEN 0.990 *S*
    Sequenz 75 GTTSSGENF 0.845 *S*
    Sequenz 83 FTTVSREFN 0.237 .
    Sequenz 94 VIAGSSMDN 0.417 .
    Sequenz 95 IAGSSMDNN 0.311 .
    Sequenz 100 MDNNSNGTN 0.026 .
    Sequenz 106 GTNQSGGHR 0.014 .
    Sequenz 140 PEEDSNPWA 0.023 .
    Sequenz 156 NRDGSENNI 0.951 *S*
    Sequenz 164 IVLASSGGQ 0.014 .
    Sequenz 165 VLASSGGQN 0.960 *S*
    Sequenz 176 VTTASVQRV 0.164 .
    Sequenz 224 HRANSWMKK 0.895 *S*
    Sequenz 291 PAKRSFFSL 0.039 .
    Sequenz 294 RSFFSLS-- 0.121 .
    Sequenz 296 FFSLS---- 0.019 .
    Vorhersagen für Threonin
    Bezeichnung Pos Kontext Wertung Vorhersage
    Sequenz 3 --MLTLYGQ 0.176 .
    Sequenz 15 PENSTTSTT 0.122 .
    Sequenz 16 ENSTTSTTD 0.059 .
    Sequenz 18 STTSTTDAS 0.526 *T*
    Sequenz 19 TTSTTDASD 0.038 .
    Sequenz 28 RRDETPSSE 0.983 *T*
    Sequenz 42 IHAMTTTTE 0.165 .
    Sequenz 43 HAMTTTTEL 0.918 *T*
    Sequenz 44 AMTTTTELT 0.673 *T*
    Sequenz 45 MTTTTELTR 0.069 .
    Sequenz 48 TTELTRPQQ 0.061 .
    Sequenz 72 FSDGTTSSG 0.118 .
    Sequenz 73 SDGTTSSGE 0.491 .
    Sequenz 80 GENFTTVSR 0.055 .
    Sequenz 81 ENFTTVSRE 0.331 .
    Sequenz 103 NSNGTNQSG 0.010 .
    Sequenz 121 RNELTRIGE 0.280 .
    Sequenz 173 NRMVTTASV 0.528 *T*
    Sequenz 174 RMVTTASVQ 0.484 .
    Sequenz 190 EAKITAWQT 0.138 .
    Sequenz 194 TAWQTAKVA 0.936 *T*
    Sequenz 244 AMEKTQNKV 0.497 .
    Sequenz 261 ERRATAEGK 0.951 *T*
    Sequenz 268 GKRGTEVAR 0.769 *T*
  • Beispiel 38: Identifikation von vorhergesagten Modifizierungsstellen der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 199
  • Posttranslationelle Modifikationen von Polypeptiden, üblicherweise an bestimmten Stellen, sind Im Allgemeinen wichtig, bilden jedoch nicht unbedingt eine absolute Voraussetzung für die biologische Funktion dieser Polypeptide. Die Identifikation von vorhergesagten posttranslationellen Modifizierungsstellen kann jedoch zu einem besseren Verständnis der Rolle des interessierenden Polypeptids in der Biologie der Zelle beitragen.
  • 38.1 Identifikation von SUMO-Motiven
  • Bei der Sumoylierung handelt es sich um eine posttranslationelle Modifikation von Proteinen ähnlich wie beim Ubiquitin, die reversible covalente Bindung von SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) an Lysinreste in Substratproteinen verändert die Eigenschaften der Proteine, mit denen SUMO konjugiert. Im Gegensatz zum Ubiquitin führt die SUMO-Konjugation jedoch nicht typischerweise zum Abbau des Substrats; vielmehr übt die Sumoylierung eine unterschiedliche Reihe von Auswirkungen auf viele verschiedene biologische Vorgänge aus, darunter Proteinlokalisierung und -stabilität, transkriptionelle Aktivitäten, Kern-Cytoplasma-Signalleitung und -transport und Genomreplikation, sowie Regulation der Genexpression und Virusreproduktion.
  • Die mutmaßlichen Sumoylierungsstellen können unter Verwendung von speziellen Algorithmen wie SUMOplot am ExPASy-Server vorhergesagt werden. Die meisten Sumo-modifizierten Proteine enthalten das Tetrapeptidmotiv B-K-x-DIE, wobei B einen hydrophoben Rest bedeutet, K das mit SUMO konjugierte Lysin bedeutet, x eine beliebige Aminosäure (aa) bedeutet, und D oder E einen sauren Rest bedeutet.
  • Führt man mit dem Remorin-Polypeptid von SEQ ID NO: 199 den SUMOplot-Algorithmus durch, so wird eine Sumoylierungsstelle am Lys (oder K) mit der Koordinate 181 wie unten dargestellt vorhergesagt.
    Nr. Pos. Gruppe Wertung
    1 K181 ASVQR VKRE EVEAK 0.93
    Figure 02400001
    Figure 02410001
  • 38.2 Identifikation von PEST-Motiven
  • PEST-Sequenzen finden sich in vielen rasch abgebauten Proteinen. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Sequenzen als Signale für den proteolytischen Abbau dienen. Der Algorithmus PESTFind (am EmbNet gehostet) sucht nach hydrophilen Regionen von 12 oder mehr Aminosäuren, die mindestens ein P (Prolin), ein E (Glutaminsäure) oder D (Asparaginsäure) und ein S (Serin) oder T (Threonin) enthalten und von K-(Lysin-), R-(Arginin-) oder H-(Histidin-)Resten flankiert werden. Der Algorithmus ordnet jeder möglichen gefundenen PEST-Sequenz einen Score zu. Der Score liegt im Bereich von –50 bis +50, wobei ein Score über Null eine mögliche PEST-Region bedeutet, während ein Score größer +5 von besonderem Interesse ist. Unter Verwendung des Algorithmus findet man ein vorhergesagtes PEST-Motiv an den Aminosäuren mit den Koordinaten 9 bis 24 mit einem Hydrophobizitätsindex von 28,64. Die niedrige Hydrophobizität legt nahe, dass die Region für Proteasen oder für Protein-Protein-Interaktion mit anderen Proteinen wie molekularen Chaperones, Transportproteinen oder Komponenten von proteolytischen Systemen an der Oberfläche zugänglich sind.
    Figure 02410002
    POTENTIELLE PEST-SEQUENZen:
    Figure 02420001
  • Beispiel 39: Klonierung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198
  • Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterialien und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
  • Das Arabidopsis-thaliana-Remorin-Gen wurde unter Verwendung einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek, die aus mRNA, die von gemischten Pflanzengeweben extrahiert worden war, synthetisiert worden war, als Matrize mittels PCR amplifiziert. Primer prm09186 (SEQ ID NO: 327; sense,: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGTTGACTTTGTACGGTCAA-3') und Primer prm09187 SEQ ID NO: 328; revers, komplementär,: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTTAGCTAGGAAAGAGAGAA-3'), die die AttB-Spaltstellen für die Gateway-Rekombination beinhalten, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Größe (einschließlich AttB-Spaltstellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone” rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben.
  • Beispiel 40: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 198
  • Der „entry clone”, der SEQ ID NO: 198 umfasst, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den „entry clone” kloniert wurde, dient. Ein Reis-GOS2-Promoter (SEQ ID NO: 329) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette. In einem zweiten Expressionsvektor befand sich ein anderer Promoter, nämlich high mobility group B (HMGB; SEQ ID NO: 330), ebenso für die konstitutive Expression, stromaufwärts der Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die erhaltenen Expressionsvektoren pGOS2::Remorin und pHMGB::Remorin (21) nach fachbekannten Methoden unabhängig voneinander in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 41: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurden unabhängig Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCL2, wonach 6-mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man unabhängig den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den jeweiligen individuellen Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Für jedes Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekultur, in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
  • Beispiel 42: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 42.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekultur in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspalteten, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
  • Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8 mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
  • 42.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, gemessen wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und einen Gesamteffekt des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • 42.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanzen (Keimpflanzen) drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als maximale Wurzelbiomasse, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse während des Zeitraums des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen, und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Das Gesamtsamengewicht pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert. Der Harvest Index (HI) wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtzahl Blüten pro Rispe wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtsamenzahl und der Anzahl der reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate wird in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis (als Prozentsatz ausgedrückt) der Anzahl gefüllte Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
  • Beispiel 43: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Remorin-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 199 unter der Kontrolle des GOS2-Promoters für konstitutive Expression exprimieren, sind unten angeführt.
  • Im Vergleich zu den entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen) wurde wie in Tabelle V gezeigt eine signifikante Erhöhung bei der Samenfüllrate, dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, der Gesamtzahl gefüllter Samen, der Gesamtzahl Samen, dem Tausendkorngewicht (TKG) und dem Harvest Index der transgenen Pflanzen beobachtet. Tabelle V: Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Remorin-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 199 unter der Kontrolle des GOS2-Promoters exprimieren.
    Durchschnittliche Erhöhung in der T1-Generation in %
    Samenfüllrate 10%
    Gesamtsamenertrag 19%
    Gesamtzahl gefüllter Samen pro Pflanze 15%
    Gesamtzahl Samen 5%
    TKG 3%
    Harvest Index 21%
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Remorin-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 199 unter der Kontrolle des HMGB-Promoters für konstitutive Expression exprimieren, sind unten angeführt.
  • Im Vergleich zu den entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen) wurde wie in Tabelle W gezeigt eine signifikante Erhöhung bei der Samenfüllrate, dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, der Gesamtzahl gefüllter Samen, der Gesamtzahl Samen, dem Tausendkorngewicht (TKG) und dem Harvest Index der transgenen Pflanzen beobachtet. Tabelle W: Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Remorin-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 199 unter der Kontrolle des HMGB-Promoters exprimieren.
    Durchschnittliche Erhöhung in der T1-Generation in %
    Samenfüllrate 6%
    Gesamtsamenertrag 14%
    Gesamtzahl gefüllter Samen pro Pflanze 14%
    Gesamtzahl Samen 7%
    TKG 1%
    Harvest Index 12%
  • Beispiel 44: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen
  • Die Nukleinsäuresequenzen, die für die Remorin-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233 und SEQ ID NO: 241 kodieren, wurden unter die Kontrolle eines konstitutiven Promoters gestellt und in Reis transformiert. In den transgenen Reispflanzen wurden im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Ertragsmerkmale beobachtet, wie dies in Tabelle X unten dargestellt ist. Tabelle X: Zusammenfassung der in transgenen Pflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, unter der Kotrolle eines konstitutiven Promoters exprimieren, beobachteten verbesserten Ertragsmerkmale.
    Verbesserte Ertragsmerkmale
    Remorin-Polypeptid Oberirdische Biomasse Samenfüllrate Gesamtsamenertrag pro Pflanze Gesamtzahl gefüllter Samen pro Pflanze TKG Harvest Index
    SEQ ID NO: 217 √ √ √ √ √
    SEQ ID NO: 203 √ √ √ √
    SEQ ID NO: 233 √
    SEQ ID NO: 229 √ √ √ √
    SEQ ID NO: 227 √ √ √ √
    SEQ ID NO: 241 √ √ √
  • Bei transgenen Reispflanzen, die die Remorin-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 233 unter der Kontrolle des GOS2-Promoters für konstitutive Expression exprimieren und in Nährlösung mit verringertem Stickstoffgehalt herangezogen werden, wird eine signifikante Erhöhung des Tausendkorngewichts (Gesamterhöhung mehr als 5%, p-Wert 0,0000) beobachtet. Außerdem wurde bei mehreren Events eine Erhöhung bei einem oder mehr der Parameter Gesamtzahl Samen, Anzahl gefüllte Samen, Samengesamtgewicht, Wurzel/Spross-Index und Jungpflanzenvitalität beobachtet.
  • Beispiel 45: Beispiele der Transformation von anderen Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps/Canola-Transformation
  • Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesetzt zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0.7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0.5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (Mckersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (Mckersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4.35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloridlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl für die Keimung umgesetzt. Die Hypokotyle von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr. 108 Zellen pro ml, verdünnt von einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur unter Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) umgesetzt, und zwar mit Murashige-Skoog-Salzen und mit B5-Vitaminen (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxime und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um die restlichen Bakterien abzutöten. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden für die Gewebevermehrung weiter auf Selektionsmedium kultiviert (30°C, 16-Stunden-Fotoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nichtselektionsmedium weiter kultiviert, um zu somatischen Embryonen zu gelangen. Gesund aussehende Embryonen mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0.1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 Stunden kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultur ins Gewächshaus umgestellt.
  • Beispiel 46: Identifikation von DREB-Genen und DREB-Proteinen
  • Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbankabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit SEQ ID NO: 335 verwandt sind, und/oder Proteinsequenzen, die mit SEQ ID NO: 336 verwandt sind, identifiziert. Das Programm wurde dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Das von SEQ ID NO: 335 kodierte Polypeptid wurde für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß dem Wahrscheinlichkeits-Score (E-Wert) gereiht, wobei der Score die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentidentität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. Beispiele für DREB-Proteine, die in Genbank (GenBank® ist die NIH-Gensequenzdatenbank, die über das NCBI – National Centre for Biotechnology Information verfügbar ist) identifiziert werden, sind in Tabelle Y1 angeführt. Ein bevorzugter Satz von DREB-Genen und DREB-Proteinen, die für die Erfindung relevant sind, ist in Tabelle Y2 angeführt. Die GenBank-Zugangsnummer und der Organismus, von dem sie stammen, sind angeführt. Tabelle Y1. DREB-Proteinsequenzen aus unterschiedlichen Herkunftsorganismen.
    GenBank Zugangsnummer Herkunftsorganismus
    AAQ23983 [Oryza sativa]
    AAX28960 [Sorghum bicolor]
    AAX23703 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX28953 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    ABK55358 [Triticum aestivum]
    CAG30550 [Festuca arundinacea]
    ABK55359 [Triticum aestivum]
    ABK55360 [Triticum aestivum]
    AAX57275 [Lolium perenne]
    ABK32848 [Lolium perenne]
    ABK32847 [Lolium perenne]
    NP_001115477639 (japonica Kultivar-Gruppe)]
    BAD09739 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    BAD46703 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    EAZ09799 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]
    AAY32555 [Triticum monococcum]
    AAY32550 [Triticum monococcum]
    ABK55363 [Triticum aestivum]
    AAX14175 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAX23694 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX14155 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAG59618 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX14163 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAX14173 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAX23693 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAY32553 [Triticum monococcum]
    AAX14165 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    BAF36841 [Lolium perenne]
    ABK55361 [Triticum aestivum]
    ABK55362 [Triticum aestivum]
    AAX14170 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAX14169 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    AAX14171 [Hordeum vulgare subsp. spontaneum]
    CAJ21277 [Avena sativa]
    BAF36837 [Lolium perenne]
    BAF36838 [Lolium perenne]
    BAF36842 [Lolium perenne]
    AAX23712 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAY32558 [Triticum monococcum]
    AAX23710 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX23713 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAY32564 [Triticum monococcum]
    AAX23716 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX28956 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    BAF36839 [Lolium perenne]
    AAY32554 [Triticum monococcum]
    ABK55364 [Triticum aestivum]
    Os09g0522000 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    BAF36840 [Lolium perenne]
    EAZ09798 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]
    BAD09738 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    Os08g0545400 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    ABK55369 [Triticum aestivum]
    ABK55370 [Triticum aestivum]
    EAZ07868 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]
    AAY33832 [Zea mays]
    AAY32556 [Triticum monococcum]
    AAX23715 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAN02488 [Oryza sativa]
    ABK55371 [Triticum aestivum]
    ABA01492 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAP83888 [Oryza sativa]
    CAJ21278 [Avena sativa]
    ABK55367 [Triticum aestivum]
    ABK55368 [Triticum aestivum]
    ABK55365 [Triticum aestivum]
    ABK55366 [Triticum aestivum]
    ABA01491 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAQ98965 [Schedonorus arundinaceus]
    ABA25904 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAY32557 [Triticum monococcum]
    BAD66926 [Triticum aestivum]
    ABK55375 [Triticum aestivum]
    BAF36843 [Lolium perenne]
    CAG23919 [Festuca arundinacea]
    ABK55377 [Triticum aestivum]
    ABK55376 [Triticum aestivum]
    BAD66925 [Triticum aestivum]
    AAL35759 [Secale cereale]
    CAJ21276 [Avena sativa]
    ABK55381 [Triticum aestivum]
    ABK55382 [Triticum aestivum]
    BAF36844 [Lolium perenne]
    ABK55384 [Triticum aestivum]
    AAY32552 [Triticum monococcum]
    ABA25905 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    ABK55383 [Triticum aestivum]
    AAY32562 [Triticum monococcum]
    ABK55380 [Triticum aestivum]
    AAX23696 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AX28951 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    BAF36846 [Lolium perenne]
    ABF59742 [Elaeis guineensis]
    AAX23690 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    ABF59744 [Dypsis lutescens]
    ABA01494 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX23689 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAL35760 [Secale cereale]
    ABK55378 [Triticum aestivum]
    ABB54457 [Hordeum brevisubulatum]
    ABF59745 [Cocos nucifera]
    ABB84399 [Triticum aestivum]
    ABK55387 [Triticum aestivum]
    ABF59739 [Ravenea rivularis]
    ABF59738 [Trachycarpus fortunei]
    AAX28959 [Sorghum bicolor]
    ABF59749 [Rhapidophyllum hystrix]
    ABK55390 [Triticum aestivum]
    ABK55388 [Triticum aestivum]
    ABK55379 [Triticum aestivum]
    ABF59737 [Sabal minor]
    ABF59736 [Sabal palmetto]
    ABK55355 [Triticum aestivum]
    AAX28966 [Triticum aestivum]
    EAZ24170 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    ABF59748 [Rhapidophyllum hystrix]
    AAX28961 [Triticum aestivum]
    ABK55385 [Triticum aestivum]
    ABK55372 [Triticum aestivum]
    ABK55386 [Triticum aestivum]
    EAY87059 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]
    AAX23709 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAX28955 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAY32560 [Triticum monococcum]
    BAE17131 [Lycopersicon hirsutum]
    EAZ35676 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    AAX28952 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAL35761 [Secale cereale]
    AAS00621 [Thellungiella salsuginea]
    AAZ22480 [Capsicum annuum var. annuum]
    ABK55373 [Triticum aestivum]
    AAX23698 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAR88363 [Capsicum annuum]
    AAX23700 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    AAR35030 [Capsella bursa-pastoris]
    AAX28963 [Triticum aestivum]
    AAR26658 [Capsella bursa-pastoris]
    AAZ20446 [Malus x domestica]
    AAR20499 [Brassica napus]
    ABK55356 [Triticum aestivum]
    ABK55357 [Triticum aestivum]
    ABE96792 [Vitis vinifera]
    AAX23686 [Hordeum vulgare subsp. vulgare]
    ABK55354 [Triticum aestivum]
    ABC86564 [Triticum aestivum]
    EAY95226 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]
    AAS77819 [Lycopersicon esculentum]
    ABD63908 [Brassica rapa subsp. chinensis]
    AAX23720 [Hordeum vuigare subsp. vulgare]
    ABK55389 [Triticum aestivum]
    AAW58104 [Vitis riparia]
    AAY32551 [Triticum monococcum]
    AAY43213 [Hevea brasiliensis]
    AAC99369 [Arabidopsis thaliana]
    AAZ57434 [Iris lactea var. chinensis]
    ABG38530 [Cucumis sativus]
    AAC99371 [Arabidopsis thaliana]
    AAS77820 [Lycopersicon esculentum]
    AAP83325 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    AAR20500 [Brassica napus]
    AAD45623 [Brassica napus]
    AAM18960 [Brassica napus]
    ABE66241 [Arabidopsis thaliana]
    CAH10191 [Festuca arundinacea]
    ABK28752 [Arabidopsis thaliana]
    AAV80413 [Arabidopsis thaliana]
    AAG43549 [Nicotiana tabacum]
    ABI93900 [Arabidopsis thaliana]
    AAP83936 [Gossypium hirsutum]
    ABD14412 [Arabidopsis thaliana]
    AAM18959 [Brassica napus]
    ABD42992 [Arabidopsis thaliana]
    AAR20498 [Brassica napus]
    AAS77821 [Lycopersicon esculentum]
    AAY43345 [Brassica rapa subsp. pekinensis]
    ABD65969 [Nicotiana tabacum]
    ABM21468 [Capsella bursa-pastoris]
    AAR11858 [Brassica napus]
    ABA42927 [Arabis pumila]
    AAM18958 Brassica napus]
    ABC79627 [Populus tomentosa]
    AAR20497 [Brassica napus]
    AAV80414 [Arabidopsis thaliana]
    AAV80415 [Arabidopsis thaliana]
    ABD65473 [Gossypium hirsutum]
    AAY21899 [Arabidopsis thaliana]
    CAA18178 [Arabidopsis thaliana]
    CAB81358 [Arabidopsis thaliana]
    AAQ98869 [Gossypium hirsutum]
    ABK55374 [Triticum aestivum]
    AAQ02702 [Brassica oleracea]
    AAG43548 [Nicotiana tabacum]
    Os06g0165600 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]
    BAD27123 [Prunus avium]
    AAL38242 [Brassica napus]
    ABB51638 [Eucalyptus gunnii]
    Tabelle Y2. Bevorzugte DREB-Gene und DREB-Proteine, die für die Erfindung relevant sind
    Beschreibung Nukleotid (Nt)/Proteine (PROT) Herkunftsart SEQ ID NO:
    Os09g0522200 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 335
    Os09g0522200 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 336
    Os08g0545500 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 351
    Os08g0545500 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 352
    Os09g0522100 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 353
    Os09g0522100 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 354
    Os08g0545400 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 355
    Os08g0545400 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 356
    Os06g0165600 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 357
    Os06g0165600 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 358
    Os09g0522000 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 359
    Os09g0522000 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 360
    Os02g0677300 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 361
    Os02g0677300 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 362
    Os06g0127100 Nt [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 363
    Os06g0127100 PROT [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)] 364
    OsDREB1B Nt Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)] 365
    OsDREB1B PROT [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)] 366
    ZmCBF1 Nt [Zea mays] 367
    ZmCBF1 PROT [Zea mays] 368
    ZmCBF2 Nt [Zea mays] 369
    ZmCBF2 PROT [Zea mays] 370
    ZmCBF3 Nt [Zea mays] 371
    ZmCBF3 PROT [Zea mays] 372
    ZmDREB1 Nt [Zea mays] 373
    ZmDREB1 PROT [Zea mays] 374
    ZmDREB1B Nt [Zea mays] 375
    ZmDREB1B PROT [Zea mays] 376
    TaCBF1 Nt [Triticum aestivum] 377
    TaCBF1 PROT [Triticum aestivum] 378
    TaCBF2 Nt [Triticum aestivum] 379
    TaCBF2 PROT [Triticum aestivum] 380
    TaCBF3 Nt [Triticum monococcum] 381
    TaCBF3 PROT [Triticum monococcum] 382
    TaCBF4 Nt [Triticum monococcum] 383
    TaCBF4 PROT [Triticum monococcum] 384
    TaCBF5 Nt [Triticum monococcum] 385
    TaCBF5 PROT [Triticum monococcum] 386
    DBP3b Nt [Gossypium hirsutum] 387
    DBP3b PROT [Gossypium hirsutum] 388
    DBP3a Nt [Gossypium hirsutum] 389
    DBP3a PROT [Gossypium hirsutum] 390
    DREB1A Nt [Gossypium hirsutum] 391
    DREB1A PROT [Gossypium hirsutum] 392
    DREB1 Nt [Gossypium hirsutum] 393
    DREB1 PROT [Gossypium hirsutum] 394
    DREB1L Nt [Gossypium hirsutum] 395
    DREB1L PROT [Gossypium hirsutum] 396
    DREB2a Nt [Glycine max] 397
    DREB2a PROT [Glycine max] 398
    DREBa Nt [Glycine max] 399
    DREBa PROT [Glycine max] 400
    DREB2b Nt [Glycine max] 401
    DREB2b PROT [Glycine max] 402
    DREB3 Nt [Glycine max] 403
    DREB3 PROT [Glycine max] 404
    DREB Nt [Glycine max] 405
    DREB PROT [Glycine max] 406
    CBF17 Nt [Brassica napus] 407
    CBF16 PROT [Brassica napus] 408
    CBF7 Nt [Brassica napus] 409
    CBF16 PROT [Brassica napus] 410
    CBF7 Nt [Brassica napus] 411
    CBF7 PROT [Brassica napus] 412
    CBF5 Nt [Brassica napus] 413
    CBF5 PROT [Brassica napus] 414
    CBF-like protein Nt [Brassica oleracea] 415
    CBF-like protein PROT [Brassica oleracea] 416
  • Beispiel 47: Alignment von relevanten DREB-Proteinen
  • AlignX von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem beliebten Clustal-Algorithmus des progressiven Alignments (Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) basiert, wurde (mit Default-Parametern) verwendet, um das multiple Alignment von DREB-Proteinen wie in 24 dargestellt durchzuführen.
  • Das Ergebnis des multiplen Sequenzalignments unter Verwendung von erfindungsrelevanten Polypeptiden ist in 24 dargestellt. Die zwischen den Reis- und Arabidopsis-thaliana-DREB-Proteinen konservierten Aminosäuren sind in der Konsensus-Sequenz bezeichnet. Die Regionen mit der höchsten Ähnlichkeit sind diejenigen, die der AP2-Domäne und dem CMIII-4-Motiv entsprechen.
  • Beispiel 48: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen DREB-Proteinen
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J, Software gehostet von Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der Diagonale Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle Z2 für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen (unter Ausschluss der partialen Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz steht über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale.
  • Die Identität in Prozent über die gesamte Aminosäuresequenz zwischen paralogen DREB-Proteinen in Arabidopsis thaliana schwankte zwischen 18,5 und 86,9%. Ein ähnlicher Sequenzidentitätsbereich wurde für paraloge DREB-Proteine in Reis gefunden. Die Identität zwischen den DREB-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Reis schwankte zwischen 18,5% und 44,5%. Tabelle Z1: Beschreibung der Proteine in Tabelle Z2
    DREB-Protein Chromosomenlocus
    1 At4g25470
    2 At4g36900
    3 At5g25810
    4 At1g46768
    5 At4g25480
    6 At3g11020
    7 At2g40220
    8 At5g05410
    9 AT4G25490
    10 AT1G7808
    11 Os09g0522200
    12 Os09g0522100
    13 Os09g0522000
    14 Os08g0545500
    15 Os08g0545400
    16 Os06g0165600
    17 Os06g0127100
    18 Os02g0677300
    19 Os01g0968800
    Tabelle Z2: MatGAT-Ergebnisse für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der in Tabelle Z1 beschriebenen DREB-Proteine.
    Figure 02630001
  • Beispiel 49: Identifikation von AP2-Domänen in einem Protein
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains und Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, GENE3D, PROFILE, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 336 sind in Tabelle AA dargestellt. Tabelle AA: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 336
    Datenbank Zugangsnummer Beschreibung des Hits E-Wert [Aminosäureposition der Domäne]
    InterPro IPR001471 ”Pathogenesis-related” Transkriptionsfaktor und ERF
    PRODOM PD001423 Q8LLV0_ORYSA_Q8LLV0; 5e-15 [61-95]T
    PRINTS PR00367 ETHRSPELEMNT 6.9e-05 [51-62]T 6.9e-05 [75-91]T
    GENE3D G3DSA:3.30.730.10 Keine Beschreibung 7.7e-15 [49-118]T
    PFAM PF00847 AP2 2.5e-21 [48-120]T
    SMART SM00380 AP2 1.5e-13 [50-121]T
    PROFILE PS51032 AP2_ERF 19.664 [50-115]T
  • Beispiel 50: Genklonierung
  • Das Oryza-sativa-DREB1A-Gen wurde unter Verwendung einer Oryza-sativa-Keimpflanzen-cDNA-Bibliothek (Invitrogen, Paisley, Großbritannien) als Matrize mittels PCR amplifiziert.
  • Nach der reversen Transkription von aus Keimpflanzen extrahierter RNA wurden die cDNAs in pCMV Sport 6.0 kloniert. Die durchschnittliche Insertgröße der Bibliothek betrug 1,5 kB und die ursprüngliche Anzahl Klone lag im Bereich von 1,59 × 107 kbe. Der ursprüngliche Titer wurde als 9,6 × 105 kbe/ml bestimmt, und betrug nach der ersten Amplifikation 6 × 1011 kbe/ml. Nach der Extraktion des Plasmids wurden 200 ng Matrize in einem PCR- Ansatz von 50 μl verwendet. Für die PCR-Amplifikation wurden die Primer prm07441 (SEQ ID NO: 337; sense: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgtgcgggatcaagca-3') und prm07442 (SEQ ID NO: 338; revers, komplementär: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggcaaaattgtacagttgattg-3'), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalteten, verwendet. PCR wurde unter Verwendung der Hifi-Taq-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment mit der erwarteten Größe wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung von – gemäß Gateway-Teminologie – eines „entry clone” rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway® Technik erworben
  • Beispiel 51: Vektorkonstruktion
  • Der „entry clone” umfassend die OsDREB-Gen-Kodiersequenz wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette, und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den „entry clone” kloniert wurde, dient. Ein Reis-GOS2-Promoter (SEQ ID NO: 339) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor (26) in dem Agrobacterium-Stamm LBA4044 und anschließend in Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Die transformierten Reispflanzen wurden heranwachsen gelassen und anschließend auf die in Beispiel 48 beschriebenen Parameter untersucht.
  • Beispiel 52: Auswertungsmethoden für Pflanzen, die mit OsDREB1A im Herunterregulations-Modus unter der Kontrolle des Reis-GOS2-Promoters transformiert wurden
  • Es wurden ungefähr 15 bis 20 unabhängige T0-Reistransformanten, die eine invertierte wiederholte rekombinante DNA für OSDREB1A umfassten, erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Sechs Events, von denen die T1-Nachkommenschaft im Verhältnis 3:1 für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens aufspaltete, wurden behalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten) und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten) durch Beobachten der visuellen Markerexpression selektiert. Die ausgewählten T1-Pflanzen wurden in ein Gewächshaus umgestellt. Jede Pflanze erhielt eine einzigartige Strichcode-Markierung, um die Werte der Phänotypbestimmung eindeutig mit der entsprechenden Pflanze zu verbinden. Die ausgewählten T1-Pflanzen wurden in Erde in Töpfen mit 10 cm Durchmesser herangezogen und zwar unter den folgenden Umweltbedingungen: Fotoperiode = 11,5 h, Tageslichtintensität = 30 000 lux oder mehr, Tagestemperatur = 28°C oder höher, Nachttemperatur = 22°C, relative Feuchtigkeit = 60–70%. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze von mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening auf Stickstoffverwertungseffizienz
  • Reispflanzen von T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Abreife mit einer speziellen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-Gehalt (N), üblicherweise zwischen 7 bis 8-mal weniger, gegossen. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenabreife, Samenernte). Die Wachstums- und Ertragparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben aufgezeichnet.
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend wurden die Samenparameter bestimmt.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl Pixel der Digitalbilder der vom Hintergrund unterschiedlichen oberirdischen Pflanzenteile zählte. Von diesem Wert wurde über die am selben Zeitpunkt von den unterschiedlichen Winkeln aus aufgenommenen Bilder ein Durchschnitt berechnet und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise bestimmte Maximalfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die maximale Fläche ist diejenige oberirdische Fläche, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten, bestimmt wurde.
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Nach der Trennung wurden beide Samengruppen mit kommerziell-erhältlichen Zählmaschine gezählt. Die leeren Spelzen wurden verworfen. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen und der Querschnitt der Samen wurde unter Verwendung von digitalem Imaging gemessen. Diese Vorgehensweise führte zu dem Satz der folgenden Samenparameter:
    „Blüten pro Rispe” ist ein Parameter, der die durchschnittliche Anzahl Blüten pro Rispe an einer Pflanze schätzt und der von der Gesamtsamenzahl dividiert durch die Anzahl der ersten Rispen abgeleitet wird. Die höchste Rispe und alle Rispen, die bei horizontaler Ausrichtung mit der höchsten Rispe überlappten, wurden als erste Rispen betrachtet und von Hand gezählt. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl gefüllter Spelzen, die nach dem Abtrennschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag (Samengesamtgewicht) wurde dadurch bestimmt, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch bestimmt, dass man die von einer Pflanze geernteten Spelzen auszählte und entspricht der Anzahl Blüten pro Pflanze. Diese Parameter wurden automatisiert unter Verwendung von Bild-Analyse-Software von den digitalen Bildern abgeleitet und statistisch analysiert. Einzelne Samenparameter (darunter Breite, Länge, Fläche, Gewicht) wurden mit einem speziell hergestellten Gerät, das aus zwei Hauptbestandteilen, nämlich einem Wäger- und einem Imaging-Gerät, bestand und das mit Bildanalyse-Software gekoppelt war, bestimmt.
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanzen wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse), die auf den unausgewogenen Versuchsaufbau korrigiert worden war, eingesetzt. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem Gen transformiert wurden, gemessen wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und einen Gesamteffekt des Gens, auch unter der Bezeichnung „globaler Geneffekt” bekannt. Wenn der Wert des F-Tests zeigt, dass die Versuchsdaten signifikant sind, so wird daraus geschlossen, dass ein „Gen”-Effekt vorliegt, das heißt, dass nicht nur das Vorhandensein oder die Lage des Gens diesen Effekt verursacht. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt.
  • Um eine Prüfung auf einen Geneffekt innerhalb eines Events, d. h. für einen linienspezifischen Effekt, durchzuführen, wurde innerhalb jedes Events unter Verwendung von Versuchsdatensätzen der transgenen Pflanzen und der entsprechenden Null-Pflanzen ein t-Test durchgeführt. Die „Null-Pflanzen” oder „Null-Segreganten” oder „Nullizygoten” sind die Pflanzen, die auf dieselbe Weise wie die transgene Pflanze behandelt wurden, aus denen das Transgen jedoch aufgespaltet hat. Null-Pflanzen können auch als homozygote negativ transformierte Pflanzen beschrieben werden. Die Signifikanzschwelle für den t-Test wird auf einem Wahrscheinlichkeitsniveau von 10% festgelegt. Die Ergebnisse von manchen Events können oberhalb oder unterhalb dieser Schwelle liegen. Dies beruht auf der Hypothese, dass ein Gen nur in gewissen Positionen in dem Genom einen Effekt ausüben könnte, und dass das Auftreten dieses positionsabhängigen Effekts nicht ungewöhnlich ist. Diese Art von Geneffekt wird im vorliegenden Text auch mit „Linieneffekt” des Gens bezeichnet. Der p-Wert wird dadurch erhalten, dass man den t-Wert mit der t-Verteilung vergleicht oder alternativ dazu dadurch, dass man den F-Wert mit der F-Verteilung vergleicht. Der p-Wert ergibt dann die Wahrscheinlichkeit, dass die Nullhypothese korrekt ist (d. h., dass das Transgen keinen Effekt ausübt).
  • Beispiel 53: Bestimmung von Ertragsparametern für antisense-Konstrukt-Transformanten
  • Bei der Analyse der Samen wie oben beschrieben haben die Erfinder gefunden, dass Pflanzen, die mit dem antisense-OsDREB1A-Genkonstrukt transformiert worden waren, im Vergleich zu Pflanzen ohne das OsDREB1A-Transgen einen höheren Samenertrag, ausgedrückt als Anteil gefüllte Samen, Samengesamtgewicht, Gesamtanzahl Samen, Anzahl Rispen pro Pflanzen und Blüten pro Rispe aufwiesen. Zusätzlich dazu zeigte die transgene Keimpflanze eine im Vergleich zu den Kontrollkeimpflanzen erhöhte Vitalität. Die p-Werte zeigen, dass die Erhöhungen signifikant waren.
  • Die für Pflanzen in der T1-Generation erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle BB, die die Mittelwerte für alle getesteten Linien darstellt, zusammengefasst: Tabelle BB: Ergebnisse der Auswertung
    Merkmal Verbesserung in Prozent
    Keimpflanzenvitalität 11%
    Samengesamtausbeute 13%
    Anzahl gefülltter Samen 14%
    Anzahl Primärrispen pro Pflanze 13%
    Gesamtzahl Samen 14%
    Harvest Index 9%
  • Beispiel 54: Transformation von anderen Pflanzenarten
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps/Canola-Transformation
  • Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältlich Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesetzt zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0,5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Die Transformation von Baumwolle unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erfolgt nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloridlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl für die Keimung umgesetzt. Die Hypokotyle von 4- bis 6-Tage-alten Keimlingspflanzen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr. 108 Zellen pro ml, verdünnt von einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur unter Licht werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) umgesetzt, und zwar mit Murashige-Skoog-Salzen und mit B5-Vitaminen (Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxime und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um die restlichen Bakterien abzutöten. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden für die Gewebevermehrung weiter auf Selektionsmedium kultiviert (30°C, 16-Stunden-Fotoperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nichtselektionsmedium weiter kultiviert, um zu somatischen Embryonen zu gelangen. Gesund aussehende Embryonen mit einer Länge von mindestens 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 Stunden kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultur ins Gewächshaus umgestellt.
  • Zusammenfassung
  • Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und/oder erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress und Verfahren zu ihrer Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von verschiedenen wirtschaftlich wichtigen Ertragsmerkmalen in Pflanzen. Genauer ausgedrückt befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Yield Enhancing Protein (YEP) kodiert, in Pflanzen. Das YEP stammt aus der Gruppe Nucleosome Assembly Protein 1-artiges Polypeptid (NAP1-like), Like Sm Polypeptid (Lsm-Protein), verkürztes Cyclin H (CycHTr) Polypeptid, Remorin-Polypeptid und DREB-Protein. Die vorliegende Erfindung befasst sich auch mit Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für solch ein YEP kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Erfindung stellt auch bis jetzt unbekannte YEP-Kodiernukleinsäuren und Konstrukte, die diese umfassen, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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    • - Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterialien und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) [0763]
    • - Aldemita und Hodges 1996 [0769]
    • - Chan et al, 1993 [0769]
    • - Hiei et al, 1994 [0769]
    • - Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0783]
    • - Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0784]
    • - Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188 [0786]
    • - Mckersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0787]
    • - Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) [0787]
    • - Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659 [0787]
    • - Mckersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0787]
    • - Murashige und Skoog, 1962 [0787]
    • - Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968) [0788]
    • - Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0789]
    • - Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 [0789]
    • - Thompson et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882 [0790]
    • - Chenna et al, (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500 [0790]
    • - BMC Bioinformatics. 2003, 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J, Software gehostet von Ledion Bitincka [0792]
    • - Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0811]
    • - Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 [0812]
    • - Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) [0814]
    • - McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0815]
    • - Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) [0815]
    • - Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659 [0815]
    • - McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847 [0815]
    • - Murashige und Skoog, 1962 [0815]
    • - Gamborg et al, Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968) [0816]

Claims (111)

  1. Verfahren für die Erhöhung der Resistenz bei Pflanzen gegen abiotischen Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das NAP1-like Polypeptid eine NAP-Domäne umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das NAP1-like Polypeptid mit ansteigender Bevorzugung mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu dem NAP1-like Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, durch eine der Nukleinsäure-SEQ ID NOs. in Tabelle A oder einen Abschnitt davon oder durch eine Sequenz, die mit einer der Nukleinsäure-SEQ ID NOs. in Tabelle A zu hybridisieren vermag, dargestellt ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einer der SEQ ID NOs. in Tabelle A kodiert.
  5. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei der erhöhten Resistenz gegen abiotischen Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen um erhöhtes Nährstoffaneignungsvermögen handelt.
  6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Nährstoffaneignungsvermögen zu einer erhöhten Biomasse und/oder zu einem erhöhten Samenertrag führt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der erhöhte Samenertrag mindestens ein erhöhtes Samengesamtgewicht und/oder eine erhöhte Anzahl gefüllter Samen umfasst.
  8. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die modulierte Expression dadurch erfolgt, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure operativ mit einem konstitutiven Promoter, vorzugsweise einem GOS2-Promoter, verknüpft ist.
  10. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
  11. Verwendung eines Konstrukts bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen abiotischen Stress, wobei das Konstrukt (a) Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst und wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promoter, vorzugsweise ein GOS2-Promoter, ist.
  12. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein NAP1-like Polypeptid kodiert, in einem Verfahren zur Erhöhung der Resistenz gegen abiotischen Stress in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  13. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm(Like-Sm)-Protein kodiert, moduliert.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Lsm-Protein eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 aufweist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das Lsm-Protein eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 und 61 aufweist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Lsm-Protein ein beliebiges oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv I: GTLXSFDQFANWLXGACERVIVGELYCDVPLGLYVIRGENVVLIG oder eine Signatur mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 70%, 80% oder 90% Sequenzidentität zu der Sequenz von Motiv I, wobei jeglicher konservativer Austausch gestattet ist und wobei 'X' jegliche Aminosäure bedeuten kann; (ii) Motiv II: KAEREARDLKGTMRKRMEFLDFD oder eine Signatur mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 70%, 80% oder 90% Sequenzidentität zu der Sequenz von Motiv II, wobei jeglicher konservativer Austausch gestattet ist und wobei 'X' jegliche Aminosäure bedeuten kann; wobei Motiv I und/oder Motiv II mit ansteigender Bevorzugung eine Deletion und/oder eine Substitution und/oder eine Insertion von 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren umfassen können.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei es sich bei dem Lsm-Protein um ein Protein der Klasse Lsm1 handelt.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das Lsm-Protein vorzugsweise eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung oder mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus den SEQ ID NOs. 120, 121, 131, 132, 133, 140, 142, 143, 144, 152, 154 und 157 umfasst.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das Lsm-Protein vorzugsweise eine der SEQ ID NOs. 41, 43, 73, 75, 77, 81, 85, 87, 89, 105, 109 und 115 umfasst.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei es sich bei der Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, um eine der Nukleinsäure-SEQ ID NOs. in Tabelle G oder einen Abschnitt davon oder eine Sequenz, die mit einer der Nukleinsäure-SEQ ID NOs. in Tabelle G oder mit einer ihrer komplementären Sequenzen zu hybridisieren vermag, handelt.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog zu einem der Proteine in Tabelle G kodiert.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, wobei die Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, eine(s) der folgenden umfasst: (i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 oder SEQ ID NO: 116; (ii) das Komplement von einer der SEQ ID NOs. in (i); (iii) eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117 kodiert; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren in (i), (ii) oder (iii) oben zu hybridisieren vermag.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 22, wobei die modulierte Expression dadurch erfolgt, dass man in eine(r) Pflanze eine Lsm-Nukleinsäure einführt und exprimiert.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 23, wobei die modulierte Expression durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen erfolgt: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, ortsgerichtete Mutagenese, gerichtete Evolution oder homologe Rekombination.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 24, wobei es sich bei dem verbesserten Ertragsmerkmal um eines der folgenden Merkmale handelt: im Vergleich zur Kontrollpflanze erhöhter Ertrag, vorzugsweise erhöhter Samenertrag, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Samenfüllungsrate oder erhöhte Biomasse.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 25, wobei die Nukleinsäure operativ mit einem in einer Pflanzenzelle exprimierten Promoter verbunden ist, vorzugsweise mit ansteigender Bevorzugung einem samenspezifischen Promoter, wie dem Reis-WSI18-Promoter.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 26, wobei es sich bei dem Promoter um einen durch ABA induzierbaren Promoter handelt.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 27, wobei die Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
  29. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 28, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, umfasst.
  30. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114 oder SEQ ID NO: 116; (ii) das Komplement von einer der SEQ ID NOs. in (i); (iii) eine Nukleinsäure, die für ein LSm-Protein mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117 kodiert; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren in (i), (ii) oder (iii) oben zu hybridisieren vermag.
  31. Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117; (ii) eine Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117; (iii) Abkömmlinge von einer der Aminosäuresequenzen in (i) oder (ii) oben.
  32. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, wobei die Aminosäuresequenz des Lsm-Proteins eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe von SEQ ID NOs. 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 umfasst; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  33. Konstrukt nach Anspruch 32, wobei es sich bei der Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, um eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 30 handelt.
  34. Konstrukt nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, wobei es sich bei der einen oder mehreren Kontrollsequenz(en) um mindestens einen samenspezifischen Promoter, vorzugsweise um einen Reis-WSI18-Promoter, handelt.
  35. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 32 bis 34 für die Erzeugung von Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
  36. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach einem der Ansprüche 32 bis 34.
  37. Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen, das Folgendes umfasst: (a) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, in eine(r) Pflanze, wobei die Aminosäuresequenz des Lsm-Proteins eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe von SEQ ID NOs. 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 umfasst; und (b) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Nukleinsäure von (a) gemäß Anspruch 30 ist.
  39. Transgene Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, wobei der erhöhte Ertrag das Ergebnis einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, ist, wobei die Aminosäuresequenz des Lsm-Proteins eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe von SEQ ID NOs. 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 umfasst; oder transgene Pflanzenzelle, die von dieser transgenen Pflanze abstammt.
  40. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 29, 36 oder 39, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abstammt, handelt.
  41. Erntegut einer Pflanze nach einem der Ansprüche 29, 36, 39 oder 40, wobei es sich bei dem Erntegut vorzugsweise um Samen handelt.
  42. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 40 und/oder von Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 41 abstammen.
  43. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Lsm-Protein kodiert, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, wobei die Aminosäuresequenz des Lsm-Proteins eine Lsm-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe von SEQ ID NOs. 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 und 130 umfasst.
  44. Verwendung nach Anspruch 43, wobei es sich bei dem verbesserten Ertragsmerkmal um im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Samenertrag und/oder erhöhte Biomasse handelt.
  45. Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein verkürztes Cyclin H-(CycHTr-)Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das CycHTr-Polypeptid fähig ist, an CAK zu binden, jedoch nicht fähig ist, CAK zu aktivieren.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das CycHTr-Polypeptid von einem Cyclin H mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu dem CycH-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 173 oder zu einer der Aminosäuresequenzen in Tabelle K abstammt, oder wobei das CycHTr-Polypeptid von einem Cyclin H abstammt, das ein Ortholog oder Paralog der Aminosäuresequenzen in Tabelle K ist.
  47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, wobei es sich bei der Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Protein kodiert, um einen Teil von einer der Aminosäure-SEQ ID NOs. in Tabelle K oder eine Sequenz, die mit einer der Nukleinsäure-SEQ ID NOs. in Tabelle K zu hybridisieren vermag, handelt.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei dem CycHTr die Hc-Helixdomäne, vorzugsweise auch die H5'-Helixdomäne fehlt, stärker bevorzugt wobei dem CycHTr die Hc-, die H5'- und die H4'-Helixdomänen fehlen, am stärksten bevorzugt wobei dem CycHTr die Hc-, H5'-, H4'- und H3'-Helixdomänen fehlen.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei die modulierte Expression durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen erfolgt: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, ortsgerichtete Mutagenese, gerichtete Evolution oder homologe Rekombination.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei die modulierte Expression dadurch erfolgt, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die für CycHTr-Protein kodiert, einführt und exprimiert.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 50, wobei es sich bei dem verbesserten Ertragsmerkmal um im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, handelt.
  52. Verfahren nach Anspruch 50 oder 51, wobei die eingeführte Nukleinsäure operativ mit einem samenspezifischen Promoter verknüpft ist.
  53. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 52, wobei die Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, noch stärker bevorzugt von der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
  54. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 53, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid kodiert, umfasst.
  55. Konstrukt, umfassend: (a) Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 45 bis 48 definiert umfasst; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  56. Konstrukt nach Anspruch 55, wobei es sich bei einer der Kontrollsequenzen um einen samenspezifischen Promoter handelt.
  57. Verwendung eines Konstrukts nach den Ansprüchen 55 oder 56 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag.
  58. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach Anspruch 55 oder 56.
  59. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, das Folgendes umfasst: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 45 bis 48 definiert, kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  60. Transgene Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, die das Ergebnis der erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 45 bis 48 definiert, kodiert, ist; oder transgene Pflanzenzelle, die von solche einer transgenen Pflanze abstammt.
  61. Transgene Pflanze nach Anspruch 54, 58 oder 60, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer oder eine transgene Pflanzenzelle, die von solch einer transgenen Pflanze abstammt, handelt.
  62. Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 61, wobei es sich bei dem Erntegut vorzugsweise um Samen handelt.
  63. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 61 und/oder von Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 62 abstammen.
  64. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein CycHTr-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 45 bis 48 definiert, kodiert, für die Erhöhung des Ertrags, insbesondere die Erhöhung der Biomasse und/oder des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  65. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für das Remorin-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das Remorin-Polypeptid (i) eine C-terminale Remorin-Domäne (entsprechend der Pfam-Familienzugangsnummer PF03763); und (ii) eine C-terminale prognostizierte Coiled-Coil-Domäne umfasst.
  66. Verfahren nach Anspruch 65, wobei das Remorin-Polypeptid zusätzlich eines oder beide der folgenden umfasst: (i) eine C-terminale Remorin-Domäne, die mit geladenen Aminosäuren angereichert ist; und (ii) mindestens ein Cys und/oder ein Phe, das/die in den letzten zehn Aminosäureresten am C-terminalen Ende des Polypeptids vorliegt/vorliegen.
  67. Verfahren nach Anspruch 65 oder 66, wobei das Remorin-Polypeptid eine C-terminale Remorin-Domäne mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der C-terminalen Remorin-Domäne gemäß SEQ ID NO: 326 aufweist.
  68. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 67, wobei es sich bei dem Remorin-Polypeptid um ein Polypeptid mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem Remorin-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 199 handelt.
  69. Verfahren nach Anspruch 65 oder 66, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle A aufgelisteten Nukleinsäuresequenzen dargestellt ist, oder ein Teil davon ist, oder eine Sequenz, die mit einer der in Tabelle P aufgelisteten Nukleinsäuresequenzen zu hybridisieren vermag, ist.
  70. Verfahren nach Anspruch 65 oder 66, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle P aufgelisteten Polypeptide kodiert.
  71. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 70, wobei die verstärkte Expression durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen erfolgt: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination.
  72. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 71, wobei die verstärkte Expression dadurch erfolgt, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
  73. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 72, wobei es sich bei den verbesserten Ertragsmerkmalen um erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, am stärksten bevorzugt um ein oder mehrere der folgenden Merkmale handelt: (i) erhöhte Samenfüllungsrate; (ii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; (iv) erhöhte Gesamtzahl Samen; (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index.
  74. Verfahren nach Anspruch 72 oder 73, wobei die Nukleinsäuresequenz operativ mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, vorzugsweise einem der folgenden Promoter: (i) einem GOS2-Promoter; oder (ii) einem High Mobility Group B-(HMGB-)Promoter.
  75. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 74, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
  76. Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 75, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale mit Pflanzen erzielt werden, die unter begrenzten Nährstoffbedingungen herangezogen werden.
  77. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 65 bis 76, wobei die Pflanze oder der Teil davon ein Nukleinsäuretransgen, das für ein Remorin-Polypeptid kodiert, umfasst.
  78. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 65 bis 70 definiert kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  79. Konstrukt nach Anspruch 78, wobei es sich bei einer der Kontrollsequenzen um einen konstitutiven Promoter, vorzugsweise einen der folgenden Promoter: (i) einen GOS2-Promoter; oder (ii) einen High Mobility Group B-(HMGB-)Promoter handelt.
  80. Verwendung eines Konstrukts nach den Ansprüchen 78 oder 79 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wobei es sich bei den verbesserten Ertragsmerkmalen bevorzugt um eines oder mehrere der folgenden Merkmale handelt: (i) erhöhte Samenfüllungsrate; (ii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; (iv) erhöhte Gesamtzahl Samen; (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  81. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt nach Anspruch 78 oder 79.
  82. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen, das Folgendes umfasst: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 65 bis 70 definiert kodiert, in eine(r) Pflanze, einen/einem Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  83. Transgene Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen verbesserten Ertragsmerkmalen, die das Ergebnis einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 65 bis 70 definiert ist, oder transgene Pflanzenzelle oder transgener Pflanzenteil, die/der von der transgenen Pflanze stammt.
  84. Transgene Pflanze nach Anspruch 77, 81 oder 83, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse, Emmer, Spelz, Secale, Einkorn, Teff, Milo-Hirse und Hafer oder eine transgene Pflanzenzelle oder einen transgenen Pflanzenteil, die/der von der transgenen Pflanze abstammt, handelt.
  85. Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 84, wobei es sich bei dem Erntegut vorzugsweise um Samen handelt.
  86. Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 84 und/oder von Erntegut einer Pflanze nach Anspruch 85 abstammen.
  87. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Remorin-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 65 bis 70 definiert kodiert, bei der Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen, vorzugsweise bei der Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Samenfüllungsrate; (ii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; (iv) erhöhte Gesamtzahl Samen; (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  88. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (i) Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 332; (ii) Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 332; (iii) Nukleinsäure, die für ein Remorin-Polypeptid mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333 und mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 334 kodiert.
  89. Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der folgenden Reihe: (i) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333; (ii) Aminosäuresequenz mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 333 und mit mit ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 334; (iii) Abkömmlinge von einer der Aminosäuresequenzen in (i) oder (ii) oben.
  90. Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, das umfasst, dass man die Expression eines endogenen DREB-Gens und/oder die Menge und/oder Aktivität eines DREB-Proteins in dieser Pflanze reduziert oder im Wesentlichen eliminiert.
  91. Verfahren nach Anspruch 90, wobei das RNA-vermittelte Herunterregulieren der Genexpression erfolgt.
  92. Verfahren nach Anspruch 91, wobei das RNA-vermittelte Herunterregulieren durch Cosuppression erfolgt.
  93. Verfahren nach Anspruch 91, wobei das RNA-vermittelte Herunterregulieren durch die Verwendung von antisense-DREB-Nukleinsäuresequenzen beeinflusst wird.
  94. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination dadurch erfolgt, dass man eine invertierte Wiederholung eines DREB-Gens oder Fragments davon verwendet.
  95. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination durch Verwendung einer mikroRNA erfolgt.
  96. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination durch Insertionsmutagenese erfolgt.
  97. Verfahren nach einem der Ansprüche 90 bis 96, das umfasst, dass man eine DREB-Nukleinsäure oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen zu einem DREB-Gen homolog ist, in eine Wirtspflanze einführt.
  98. Verfahren nach den Ansprüchen 90 bis 97, wobei die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination auf konstitutive Art und Weise, vorzugsweise durch Verwendung eines konstitutiven Promoters, stärker bevorzugt eines GOS2-Promoters, erfolgt.
  99. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die eingeführte Nukleinsäure von derselben Familie, stärker bevorzugt von derselben Gattung, noch stärker bevorzugt von derselben Art wie die Wirtspflanze stammt.
  100. Verfahren nach Anspruch 97, wobei die eingeführte DREB-Nukleinsäuresequenz eine ausreichende Länge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden von SEQ ID NO: 335 oder ein Ortholog oder Paralog davon umfasst und wobei es sich bei der Wirtspflanze um ein Getreide, vorzugsweise um Reis, handelt.
  101. Verfahren nach Anspruch 100, wobei die Nukleinsäure für ein Protein gemäß einer der folgenden Sequenzen kodiert: SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414 und SEQ ID NO: 416.
  102. Verfahren nach Anspruch 100 oder 101, wobei die Nukleinsäure einer der folgenden. Sequenzen entspricht: SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 413 und SEQ ID NO: 415.
  103. Verfahren nach einem der Ansprüche 90 bis 102, wobei es sich bei dem erhöhten Ertrag um erhöhten Samenertrag und/oder erhöhte Anzahl Rispen pro Pflanze und/oder erhöhte Vitalität der jungen Keimpflanze handelt.
  104. Verfahren nach einem der Ansprüche 90 bis 103, wobei der erhöhte Samenertrag aus einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausgewählt ist: a) erhöhte Samenbiomasse (erhöhtes Samengewicht); b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; und c) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen.
  105. Pflanze oder Teil davon, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 90 bis 104.
  106. Konstrukt, das Folgendes umfasst: (a) eine invertierte Wiederholung eines DREB-Gens oder Fragments davon; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  107. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhtem Samenertrag, das Folgendes umfasst: (i) Einführen des Konstrukts nach Anspruch 106 in eine Pflanzenzelle; und (ii) Kultivieren der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  108. Verwendung von DREB-Nukleinsäuren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen DREB-Genexpression in einer Pflanze zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  109. Verwendung nach Anspruch 108, wobei es sich bei dem erhöhten Ertrag um erhöhten Samenertrag und/oder erhöhte Anzahl Rispen und/oder erhöhte Vitalität der jungen Keimpflanze handelt.
  110. Verwendung nach Anspruch 109, wobei der erhöhte Samenertrag aus einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausgewählt ist: a) erhöhte Samenbiomasse (erhöhtes Samengewicht); b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; und c) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen.
  111. Verwendung nach einem der Ansprüche 108 bis 110, wobei die Ertragserhöhung unter leichten Stressbedingungen stattfindet.
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