DE112010002842T5

DE112010002842T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Publication number: DE112010002842T5
Application number: DE112010002842T
Authority: DE
Inventors: Christophe Reuzeau; Ju Kon Kim; Yang Do Choi; Jin Seo Jeong
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH; Crop Functional Genomics Center
Priority date: 2009-04-29
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2012-09-27
Also published as: KR20120034588A; EP2957637A3; CN102459614A; EP2424994B1; KR101647732B1; CA2760429A1; AU2010243730A1; ES2552461T3; AR076483A1; KR20150046788A; AU2010243730B2; WO2010124953A1; EP2957637A2; EP2424994A1; US20120102599A1; MX2011011453A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener ökonomisch wichtiger Pflanzen-Ertragsmerkmale. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Pflanzen-Ertragsmerkmalen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches (Auxin/Indolylessigsäure 2-ähnliches) Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die Nukleinsäuren umfassen, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodieren und sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzen-Wachstumsmerkmale durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener ökonomisch wichtiger Pflanzen-Ertragsmerkmale. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Pflanzen-Ertragsmerkmalen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches (Auxin/Indolylessigsäure 2-ähnliches) Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die Nukleinsäuren umfassen, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodieren und sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzen-Wachstumsmerkmale durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen zur Kulturpflanzen- und gartenbaulichen Verbesserung nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, die und vielen Arte von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt und sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann je nach der Spezies und der Entwicklungsstufe auf vielerlei Arten gemessen werden, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies behalten auf einer gegebenen Entwicklungsstufe ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei. Diese allometrischen Beziehungen werden dazu verwendet, aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße auf einem frühen Entwicklungsstadium korreliert üblicherweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht erlangen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt noch zu dem potentiellen Fortbestehen des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, damit sie bereits zu Beginn größer werden konnte. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078) und daher besteht für eine Auswahl an diversen Genotypen wahrscheinlich eine Korrelation zwischen der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung und der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen verwendet, denen Nutzpflanzen. auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten gegenüberstehen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen sowohl bei gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für die richtige Bodenverankerung bei wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zur gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea mays L.-)Hybriden auf der Basis des im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasmas im Europäischen Atlantik.
Der Harvest Index, das Verhältnis von Samenertrag zum Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und so kann oft eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (beispielsweise Rebetzke et al 2002 Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil der Großteil der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängt (Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Daher wurde die Selektion auf Pflanzengröße sogar in frühen Entwicklungsstufen als Indikator für einen zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet (beispielsweise Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Bei der Untersuchung der Auswirkung genetischer Unterschiede auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit und Lichtintensität ein intrinsischer Vorteil der Umgebungen im Gewächshaus oder in der Pflanzenwachstumskammer im Vergleich zum Feld. Künstliche Einschränkungen des Ertrags aufgrund einer schlechten Bestäubung wegen des Fehlens von Wind oder Insekten oder ein unzureichender Raum für das Wachstum der Wurzel oder Krone bis zur Reife können die Verwendung solcher kontrollierten Umgebungen zur Untersuchung der Ertragsunterschiede einschränken. Daher sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder in einem Gewächshaus Standard-Praktiken, die einen Hinweis auf potentielle genetische Ertragsvorteile geben.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung in den vegetativen Pflanzenteilen gewünscht sein und für Anwendungen wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
Ein Ansatz zur Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie des Zellzyklus oder verschiedener Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder an Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
Es wurde jetzt entdeckt, dass verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
Es wurde jetzt außerdem entdeckt, dass verschiedene Wachstumsmerkmale in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
Hintergrund
1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Die AUX/IAA-(Auxin/Indolylessigsäure-)Gene kodieren eine Familie von Proteinen, deren Expression durch Auxin strikt reguliert wird. Das Pflanzenhormon Auxin ist an verschiedenen Vorgängen beteiligt, wie Zellzyklus, Zellvergrößerung und -differenzierung, Musterbildung in Embryonen, Bildung von Gefäßen oder anderen Geweben, Regulation des Wachstums von primären und lateralen Wurzel- und Sprossmeristemen. AUX/IAA-Proteine werden außerdem in der Regel gewebespezifisch exprimiert.
Die AUX/IAA-Protein haben gewöhnlich vier konservierte Aminosäuresequenzmotive (die Domänen I, II, III und IV) sowie Signalsequenzen für die Kernlokalisation. Man postuliert, dass die Domänen I und II das Protein destabilisieren und möglicherweise am Protein-Turnover beteiligt sind. Von den Domänen III und IV wird postuliert, dass sie an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind: AUX/IAA-Proteine können Homodimere bilden, und man weiß, dass sie sich mit ARF-Proteinen zusammenlagern. Die AUX/IAA-ARF-Komplexe sind wahrscheinlich an der auxinvermittelten Genexpression beteiligt. Die Aux/IAA-Proteine sind negative Regulatoren von Auxin Response Faktoren (ARFs), die die Expression Auxin-responsiver Gene regulieren. Aux/IAA-Proteine binden an die DNA-gebundenen ARF-Partnerproteine und reprimieren die ARF-Aktivität. Im Auxin-aktivierten Zustand werden die Aux/IAA-Proteine über Wechselwirkungen mit dem Auxin-modifizierten SCFTIR1-Komplex ubiquitiniert und anschließend durch Einwirkung des 26S-Proteasoms abgebaut. Einen Überblick über die Rollen und Aktivitäten von AUX/IAA-Proteinen gibt Reed (Trends in Plant Science 6, 420–425, 2001). Über die Struktur- und Expressionsanalyse einer frühen Auxin-responsiven Aux/IAA-Genfamilie in Reis (Oryza sativa) hat vor kurzem Jain et al. 2006 Funct Integr Genomics. 2006 Jan; 6(1): 47–59 berichtet.
2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Das Reis- und Arabidopsis-Genom kodiert für mehr als 1300 Transkriptionsregulatoren, die 6% von deren geschätzter Gesamt-Genanzahl ausmachen. Es wird berichtet, dass etwa 45% dieser Transkriptionsfaktoren aus für Pflanzen spezifischen Familien stammen (Riechmann et al., 2000; Kikuch et al., 2003). Ein Beispiel für eine solche pflanzenspezifische Familie von Transkriptionsfaktoren ist die NAC-Familie. NAC ist ein Akronym, das von den Bezeichnungen der drei Gene herrührt, für die erstmals beschrieben wurde, dass sie eine NAC-Domäne enthalten, nämlich NAM (no apical meristem), ATAF1,2 und CUC2 (cup-shaped cotyledon). NAC-Proteine enthalten eine hoch konservierte N-terminale DNA-Bindungsdomäne, die man als die ”NAC-Domäne” bezeichnet, sowie eine variable C-terminale Domäne (Ooka et al., 2003). NAC-Proteine sind anscheinend in Pflanzen weit verbreitet, wobei für die Genome von Reis und Arabidopsis vorhergesagt wird, dass sie 75 bzw. 105 NAC-Gene enthalten (Ooka et al., 2003; Xiong et al., 2005). Man bis jetzt nur wenige von ihnen charakterisiert aufgrund ihrer verschiedenartigen Funktionen bei der Pflanzenentwicklung und bei Stressreaktionen. Zu den frühen beschriebenen NAC-Genen gehören NAM aus Petunie, das die Position des apikalen Sprossmeristems bestimmt (Souer et al., 1996), und CUC2 aus Arabidopsis, das an der Entwicklung von Embryonen und Blüten beteiligt ist (Aida et al., 1997). Das NAP-Gen von Arabidopsis reguliert die Zellteilung und die Zellvergrößerung in Blühorganen (Sablowski et al., 1998). AtNAC1 vermittelt die Auxin-Signalgebung, wodurch die Entwicklung lateraler Wurzeln gefördert wird (Xie et al., 2000). Gene in der ATAF-Subfamilie, einschließlich StNAC (Collinge et al., 2001) aus Kartoffel (Solanum tuberosum) und ATAF1–2 (Aida et al., 1997) aus Arabidopsis, wurden durch Pathogen-Angriff und Verwundung induziert. Vor kurzem wurde herausgefunden, dass AtNAC072(RD29), AtNAC019, AtNAC055 und ANAC102 aus Arabidopsis (Fujita et al., 2004; Tran et al., 2004; Christianson et al., 2009), BnNAC aus Brassica napus (Hegedus et al., 2003), SNAC1 und SNAC2 aus Reis (Oryza sativa) (Hu et al., 2006; 2008) an der Reaktion auf verschiedene Umweltstressbedingungen beteiligt sind. AtNAC2, ein weiteres, mit Stress zusammenhängendes NAC-Gen von Arabidopsis, stromabwärts der Ethylen- und Auxin-Signalwege wirkt und bei Überexpression die Salztoleranz verstärkte (He et al., 2005). Von einem NAC-Gen aus Weizen, NAM-B1, wurde beschrieben, dass es an der Nährstoffremobilisierung aus Blättern in sich entwickelnde Körner beteiligt ist (Uauy et al., 2006). Trockenheit ist für die Nachhaltigkeit der Reiserträge in der Regen-gespeisten Landwirtschaft eine schwerwiegende Bedrohung. Insbesondere wenn das Rispenstadium Trockenheitsbedingungen ausgesetzt wird, führt dies zu, einer verzögerten Blütezeit, einer verringerten Anzahl an Ährchen und schlechter Kornfüllung. Heutzutage deutet eine Reihe von Studien darauf hin, dass eine Überexpression mit Stress zusammenhängender Gene die Trockenheitstoleranz in Reis in gewissem Ausmaß verbessern könnte (Xu et al., 1996; Garg et al., 2002; Jang et al., 2003; Ito et al., 2006; Hu et al., 2006, 2008; Nakashima et al., 2007; Oh et al., 2007). Trotz dieser Anstrengungen zur Entwicklung trockenheitstoleranter Reispflanzen haben sehr wenige davon verbesserte Kornerträge unter Feldbedingungen gezeigt.
Kurze Darstellung der Erfindung
1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Überraschenderweise hat es sich jetzt herausgestellt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen liefert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Verbessern der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Überraschenderweise hat es sich jetzt herausgestellt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wenn sie unter Nicht-Stress-(normalen)Bedingungen und/oder wenn sie unter abiotischen Stressbedingungen gezüchtet werden, insbesondere mit verbesserter Toleranz gegenüber Trockenheit, hoher Salinität und niedriger Temperatur im vegetativen Stadium und/oder verstärkter Trockenheitstoleranz im Reproduktionsstadium, im Vergleich zu Kontrollpflanzen liefert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Verbessern der Ertragsmerkmale einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beidem in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
Homologon/Homologa
”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen unmodifizierten Protein, die eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, aufweisen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, IacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen und von 1 bis 10 Aminosäureresten reichen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen mit konservativen Substitutionen sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht unter Verwendung von Peptidsynthese-Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch DNA-Rekombination herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins umfassen. ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6, oder Thioredoxin (einen Überblick über Tagging-Peptide siehe in Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(a)/Paralog(a)
Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Herkunftsbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, Orthologa sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind und die ebenfalls von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
Domäne, Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, deuten Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, auf Aminosäuren, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hul et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)) oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechiken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind im Stand der Technik bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologa können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologa verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder (ein) konservierte(s) Motiv(e) unter Verwendung der vorstehend genannten Programme mit den Default-Parameter bestimmt werden. Für lokale Alignments eignet sich besonders der Algorithmus von Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
Reziproke BLAST-Suche
Diese beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit einer der in Tabelle A im Abschnitt ”Beispiele” aufgelisteten Sequenzen) ein Blasting gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (zweites BLASTing). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit aus dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing dann idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter ist der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hier definiert, ist ein Vorgang, bei sich dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen aneinanderlagern. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie Magnetkügelchen, Sepharose-Kügelchen oder einem anderen Harz, immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann weiterhin stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder z. B. mittels Photolithographie z. B. auf einem Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”Mikrorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Damit die Hybridisierung stattfinden kann, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um Haarnadelschleifen (hairpins) oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers, beeinflusst. Im Allgemeinere werden Bedingungen niedriger Stringenz so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen eingesetzt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu der Zielnukleinsäuresequenz aufweisen. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisieren. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel bei höheren Temperaturen spezifisch. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich und für lange Sonden sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500 × [L^c]^–1 – 0,61 × % Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) oligo-DNA- oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(l_n) ^a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau. ^b nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau. ^c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren. ^d oligo, Oligonukleotid; l_n, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie vorstehend dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die hier beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder sie können künstlich hergestellt werden. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Engogenes Gen
Wenn hier auf ein ”endogenes Gen” verwiesen wird, betrifft dies nicht nur das infrage kommende Gen, wie man es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass es einen menschlichen Eingriff gibt) vorfindet, sondern auch in einer isolierten Form, die anschließend (wieder) in eine Pflanze eingebracht wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann es bei einer Pflanze, die ein solches Transgen enthält, zu einer erheblichen Verringerung der Transgenexpression und/oder zu einer erheblichen Verringerung der Expression des endogenen Gens kommen. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert oder künstlich hergestellt werden, zum Beispiel durch chemische Synthese.
Genshuffling/gerichtete Evolution
Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Konstrukt
Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translations-Enhancer umfassen. Der Fachmann kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen. Eine Intronsequenz kann ebenfalls zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, damit die Menge der reifen Botschaft gesteigert wird, die sich im Cytosol anreichert, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können leicht von ihm erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Bei einem Beispiel muss ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden. Bevorzugte Replikationsursprünge umfassen f1-ori und colE1, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, werden vorteilhafterweise Markergene (oder Reportergene) verwendet. Des Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier eingehender im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr vonnöten sind. Techniken zur Markerentfernung sind Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die die Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, bewirken können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, die in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, stammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle stammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die Promotoren, die sich stromaufwärts der Nukleotidsequenzen befinden, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel indem man den Promotor funktionsfähig mit einem Reportergen verknüpft und das Expressionsausmaß und/oder das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase. Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 185 rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert. ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripten, bis etwa 1/500000 Transkripten pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert dagegen die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle. Ein ”mittelstarker Promotor” soll im Allgemeinen ein Promotor sein, der die Expression einer kodierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor steuert, insbesondere bei einem Spiegel, der in allen Fällen unter demjenigen Spiegel liegt, der sich unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Promotors ergibt.
Funktionsfähig verknüpft
Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
Nos	Shaw et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promotor
Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw., initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch eine Leck-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind nachstehend in Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
Arabidopsis-PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
in Wurzeln exprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987
auxininduzierbares Gen des Tabaks	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988
wurzelspezifische Gene aus Tabak	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990
G1-3b-Gen aus B. napus	United States Patent No. 5,401,836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 aus Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al., (1996, PNAS 3: 8139)
Das LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse-I-Patatingen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist vorwiegend in Samengewebe transkriptionell aktiv, aber nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (in Fällen einer leaky-Expression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann endosperm-/aleuron-/embryospezifisch sein. Beispiele für samenspezifische Promotoren (endosperm-/aleuron-/embryospezifisch) sind nachstehend in Tabelle 2c bis Tabelle 2f dargestellt. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren geben Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004), deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen ist. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promotor aus Gerste	Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250:7 50–60, 1996
Gerste-DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
a-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
α-Kafirin aus Sorghumhirse	DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol, 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-artiges Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., (1986),Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al., (1987), FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2
Weizen-SPA	Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184
Weizen-Gliadine	Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15
Itr1-Promotor aus der Gerste	Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gersten-DOF	Mena et al., (1998), Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et al., (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
Synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., (1998),. Plant J. 13: 629–640
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin Glb-1	Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68
Mais-ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46
Sorghumhirse-Kafirin	DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:

Herkunftsgen	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:

Herkunftsgen	Literaturangabe
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gersten-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie im vorliegenden Text definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch eine Leck-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für Promotoren, die für grünes Gewebe spezifisch sind und die die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der Tabelle 2g unten dargestellt. Tabelle 2: Beispiele für Promotoren, die für grünes Gewebe spezifisch sind

Gen	Expression	Literaturangabe
Orthophosphatdikinase aus Mais	Blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Mais	Blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Reis	Blattspezifisch	Liu et al., 2003
Kleine Rubisco-Untereinheit aus Reis	Blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Beta-Expansin EXBP9 aus Reis	Sprossspezifisch	WO 2004/070039
Kleine Rubisco-Untereinheit aus Straucherbse	Blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
RBCS3A aus Erbse	Blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch Leck-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promotoren, die für das grüne Meristem spezifisch sind und die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2h unten dargestellt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezfische Promotoren

Herkunftsgen	Expressionsmuster	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sprossapikalmeristem, von globulärem Embryostadium bis zum Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	Meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzelapikalmeristeme, sowie in sich ausbreitenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von einer Reihe anderer Pflanzengene oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Selektionsmarker(gen)/Reportergen
”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert oder transformiert sind, zu erleichtern. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die, ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen) vermitteln, oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Bekanntlich nimmt bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle eingebracht. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert oder die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, oder auch in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren vorteilhafterweise Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Das Cotransformationsverfahren setzt 2 Vektoren gleichzeitig für die Transformation ein, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, die gewöhnlich die Expressions-Kassette darstellt. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäure-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/Iox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist der Marker zwischen den IoxP-Sequenzen integriert, wird er, nachdem die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewendet werden.
Transgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” zum Beispiel in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels Rekombinationsverfahren hervorgerufen wurden, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
(b) (eine) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke somit wie vorstehend, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
Modulation
Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend geändert ist, dass das Expressionsausmaß erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine beliebige Art der Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” soll jede Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine bedeuten, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation der letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des erhaltenen mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hier verwendet, steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegels hinausgeht.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren angetrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, die das interessierende Polypeptid kodiert, nach oben reguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ) oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Ende-Sequenz kann beispielsweise vom Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Gen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen hergeleitet sein.
Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Man hat gezeigt, dass die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in pflanzlichen und tierischen Expressionskonstrukten die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Proteinebene bis zu 1000fach steigert (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 439–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intron-Verstärkung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, des Bronze-1-Introns sind im Stand der Technik bekannt. Eine allgemeine Information siehe in: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N.Y. (1994).
Verringerte Expression
Wird im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder im Wesentlichen Beseitigung” der Expression verwiesen, soll dies eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder der Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung beträgt in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr verringert im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Für die Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gen-Silencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen, alternativ kann es sich um bis zu dem gesamten Gen handeln (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Die Abfolge der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide kann von der Nukleinsäure, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sein, die in der Lage ist, ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins zu kodieren. Der Bereich der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide kann vorzugsweise Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder dem Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat die Abfolge der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder dem Sense- oder dem Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der Expression kann unter Verwendung von Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Abfolge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure abstammen, die in der Lage ist, ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine zu kodieren) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA), kloniert wird, in eine Pflanze.
Bei einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines inverted Repeat einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall eines Bereichs von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sind, die in der Lage ist, ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins zu kodieren), der eine Haarnadelschleifen-(hairpin-)Struktur bilden kann, verringert oder im Wesentlichen beseitigt. Der inverted Repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fragment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker usw.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in Polypeptide translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Weitere allgemeine Einzelheiten siehe beispielsweise in Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, sondern ein oder mehrere von einigen bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren kann/können zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist des RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird durch die Pflanze weiter in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht vorzugsweise einem Zielgen.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall eine Abfolge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sind, die in der Lage ist, ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins zu kodieren) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Verringerung der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Auslösen der Co-Suppression gibt.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkript-Sequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, das einem Silencing unterzogen werden soll. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nicht-kodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleinsäuresequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß der Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall einer Abfolge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sind, die in der Lage ist, ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins zu kodieren), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der mRNA 5'- und 3'-UTR) Antisense-Orientierung aufweist. Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen mit Verfahren konstruiert werden, die ein Stand der Technik bekannt sind. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) kann zum Beispiel chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen sind u. a. Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die von der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, liegt zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung vor). Die Produktion von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes. Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die Nukleinsäuremoleküle, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren für das Silencing verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert/kodieren, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert werden, um ausgewählte Zellen anzusteuern, und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen beispielsweise derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise indem man die Antisense-Nukleinsäuresequenz mit Peptiden oder Antikörpern verknüpft, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren Zellen zugeführt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in denen im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).
Die Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, spalten können. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591 beschrieben) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die ein Polypeptid kodieren, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent Nr. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent Nr. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, dazu verwendet werden, eine katalytischen mRNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Das Gensilencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie u. a. von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind.
Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, das/die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Das Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) kann/können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), aber nicht mehr seine normale Funktion (beispielsweise als signalgebender Ligand) ausüben kann.
Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Ansteuern von Nukleinsäuresequenzen, die zu der regulatorischen Region des Gens (beispielsweise Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, so dass dreifach helikale Strukturen gebildet werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie die Verwendung von gegen ein endogenes Polypeptid gerichteten Antikörpern zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder eine Störung in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass von Menschenhand hergestellte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, nützlich sind.
Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Varianten eines Gens identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder der mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten Pflanzen-mikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, eingebracht MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC, da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs, im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können spezifisch genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder mehrerer interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Ziel-Selektion sind im Stand der Technik bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Entwicklung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Herkömmliche Werkzeuge zur Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen Beseitigung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer ganzen Pflanze oder in Teilen davon erzielt wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Transformation
Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige transformierte Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die Aufnahme freier DNA verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglykol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nicht integrierenden) Viren und dergleichen Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die in planta-Transformation. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat es sich als besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis gehören bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Ofenbarungen hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit einem solchen Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch die Zellen von pflanzlichen Meristemen, insbesondere die Zellen, die sich zu Gameten entwickeln, transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mal. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders effizientes Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastiden bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen verringert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren erreicht, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wird. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten berichtet, die durch ein transientes co-integriertes Markergen erzeugt werden können (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den vorstehend genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich der Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel Selektionsbedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Anzucht der Samen, gegebenenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ wird ein Screening der transformierten Pflanzen auf die Anwesenheit eines Selektionsmarkers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, durchgeführt.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch beispielsweise mittels Southern-Analyse hinsichtlich der Gegenwart des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet werden und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen annehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen, klonale Transformanten (wobei z. B. alle Zellen so transformiert sind, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock auf einen nicht-transformierten Spross aufgepfropft wird) sein.
T-DNA-Aktivierunbstagging
T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein), in die genomische Region des interessierenden Gens oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium-Infektion, und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die so erhaltenen transgenen Pflanzen zeigen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor dominante Phänotypen.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche mutierten Varianten tragen. Diese mutierten Varianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese mutierten Varianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82); Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), in J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods on Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Anlagern, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wobei das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50 erwähnt).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure an einer definierten ausgewählten Position in ein Genom. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe und das Moos Physcomitrella, verwendet wird. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8) und es gibt Ansätze, die ungeachtet des Zielorganismus allgemein anwendbar sind (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertragsmerkmale
Ertragsmerkmale umfassen eines oder mehrere aus Ertrag, Biomasse, Samenertrag, Jungpflanzenvitalität, Greenness Index, erhöhter Wachstumsrate, verbesserten agronomischen Eigenschaften (wie verbesserter Wasserausnutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE), Stickstoffausnutzungseffizienz (Nitrogen Use Efficiency, NUE) usw.
Ertrag
Der begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer angegebenen Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einhergeht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts direkt zum Ertrag bei oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro m² für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten m² dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die sich pro m² entwickeln, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. die Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung unter Anderem als Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro m², Anzahl Rispen pro Pflanze, Rispenlänge, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten (Blütchen) pro Rispe, erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht. Bei Reis kann auch eine Toleranz gegenüber Untertauchen zu einem erhöhten Ertrag führen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde, gut ausgewogene Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien erreicht) und oft zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhte Wachstumsrate
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimungsgeschwindigkeit, Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Samen der gleichen Pflanzenart (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro m² führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
Stressresistenz
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30% oder 25%, stärker bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-) Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern oft einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Bevorzugung, von mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben
Der Begriff Salzstress ist nicht auf Speisesalz (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um eines der folgenden Salze handeln: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
Erhöhen/Verbessern/Steigern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der Anmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie im vorliegenden Text definiert, bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro m²; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird, sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich weiterhin auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
Greenness Index
Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildaufnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen wird der Greenness Index der Pflanzen dagegen in der ersten Bildaufnahme nach dem Trockenstress gemessen.
Marker-unterstützte Züchtung
Solche Züchtungsprogramme erfordern manchmal die Einführung einer allelischen Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei man zum Beispiel EMS-Mutagenese einsetzt; alternativ kann das Programm von einem Spektrum an Allelvarianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die zufällig verursacht wurden. Die Identifizierung von Allelvarianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von besseren Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, durchgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte sind u. a. das Kreuzen von Pflanzen, in denen die hoherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Verwendung als Sonden (Genkartierung)
Die Verwendung von Nukleinsäuren, die das interessierende Protein kodieren, zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Diese Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-(RFLP-)Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für das interessierende Protein kodierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren dazu verwendet werden, Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einem Satz von Individuen enthalten, welche die Eltern und die Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und dazu verwendet, die Position der für das interessierende Protein kodierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Produktion und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der Genkartierung ist in Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder von Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gekreuzte Populationen, nahezu isogenische Linien und andere Sätze von Individuen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung-(FISH-)Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden möglich machen.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Gebet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primerpaare für die Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren, die PCR-basierte genetische Kartierung einsetzen, kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie er hier verwendet wird, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der vorstehend Genannten das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp:, Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
Kontrollpflanze(n)
Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zu derselben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die Pflanze, die untersucht werden soll. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch für Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, und wobei die Ertragsmerkmale nicht das verstärkte Wurzelwachstum umfassen.
Weiterhin wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
Wird im folgenden Text im Zusammenhang mit IAA2-ähnlichen Polypeptiden auf ein ”Protein (oder Polypeptid), das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein IAA2-ähnliches Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches IAA2-ähnliches Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”IAA2-ähnliche Nukleinsäure” oder ”IAA2-ähnliches Gen” bezeichnet.
Wird im folgenden Text im Zusammenhang mit NAC10-ähnlichen Polypeptiden auf ein ”Protein (oder Polypeptid), das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches NAC10-ähnliches Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”NAC10-ähnliche Nukleinsäure” oder ”NAC10-ähnliches Gen” bezeichnet.
Ein ”IAA2-ähnliches Polypeptid”, wie hier definiert, betrifft jedes Polypeptid, das eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, Interpro-Eintrag IPR003311) und das folgende umfasst Proteinmotiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes ”IAA2-ähnliches Polypeptid” umfasst zudem eines oder mehrere der folgenden Motive:
Motiv 2, SEQ ID NO: 23: (Q/G)LLDG(S/T)G(E/V)YTL
Motiv 3, SEQ ID NO: 24: LLDGSGEYTLVY
Motiv 4, SEQ ID NO: 25: KKLELRLGPPG,
wobei die in Klammern an einer Position angegebenen Aminosäuren für alternative Aminosäuren an dieser Position stehen.
Die AUX/IAA-Domäne überspannt die Aminosäuren 49 bis 335 in SEQ ID NO: 2. Ein Konsensus-Sequenz, die die am höchsten konservierten Aminosäuren in IAA-ähnlichem Polypeptid umfasst, kann durch SEQ ID NO: 21 wiedergegeben werden.
Außerdem hat das erfindungsgemäße IAA2-ähnliche Polypeptid in einer anderen Ausführungsform in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der AUX/IAA-Domäne von einem der Polypeptide im Tabelle A1, vorzugsweise mit der Aminosäuresequenz der AUX/IAA-Domäne der SEQ ID NO: 2, sogar noch stärker bevorzugt mit der Sequenz der AUX/IAA-Konsensusdomäne in IAA2-ähnlichen Polypeptiden, wie sie durch SEQ ID NO: 21 dargestellt wird.
Alternativ hat das Homologon eines IAA2-ähnlichen Polypeptids in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle A1, vorzugsweise von SEQ ID NO: 2, dargestellt wird, vorausgesetzt, dass das homologe Protein eine AUX/IAA-Domäne und ein oder mehrere der konservierten Motive, wie vorstehend dargestellt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines Algorithmus für globales Alignment, wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn man lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet.
Ein ”NAC10-ähnliches Polypeptid”, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, betrifft jedes beliebige Polypeptid, das eine NAM-Domäne (Pfam-Zugang PF02365, auch als NACHSTEHEND-Domäne bezeichnet, Prosite-Zugang PS51005) umfasst.
Zusätzlich oder alternativ ist ein ”NAC10-ähnliches Polypeptid”, wie im vorliegenden Text definiert, ein Polypeptid, das eines oder mehrere der nachstehend beschriebenen Motive umfasst.
Motiv I: A/P/S/N/V/T T/V/L/I/A/S T/P/S/D/V/Q D/V/I/F I A/T/G/P (SEQ ID NO: 379) oder ein Motiv, das in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Sequenz von Motiv I besitzt.
Motiv I ist vorzugsweise P/T V/A/S/L S/P I/F I A/P, am stärksten bevorzugt ist Motiv 1 PVPIIA.
Motiv II: R/N/K E/G/S I/R/S/Q/A/V/L R/Q A/P N/S/R (SEQ ID NO: 380) oder ein Motiv, das in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Sequenz von Motiv II besitzt.
Motiv II ist vorzugsweise N/K G A/V/I/L RPN, am stärksten bevorzugt ist Motiv II NGARPN.
Motiv III: C/Y R/K L/I/V S/Y/H/F/R N/K/Q K D/K/N/C/S/T/G/M/A/R (SEQ ID NO: 381) oder ein Motiv, das in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Sequenz von Motiv III besitzt.
Motiv III ist vorzugsweise C R V/I H/Y/R N/K/Q K G/M/A/S/R/K, am stärksten bevorzugt ist Motiv III CRIHKKS.
Am stärksten bevorzugt umfasst das NAC10-ähnliche Polypeptid in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 2 oder alle 3 Motive.
Alternativ oder zusätzlich hat das Homologon eines NAC10-ähnlichen Proteins in steigender Reihenfolge der Bevrozugung mindestens 25%, 26%, 27%, 28% 29%, 30%, 31%, 32% 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Aminosäure, vorausgesetzt, dass das homologe Protein die vorstehend genannten konservierten Motive besitzt. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines Algorithmus für globales Alignment, wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem NAC10-ähnlichen Polypeptid in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit den durch SEQ ID NO: 379 bis SEQ ID NR: 381 dargestellten Motiven (Motive I bis III).
Wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, bildet die Polypeptidsequenz vorzugsweise eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Hinsichtlich NAC10-ähnlicher Polypeptide ist ein Alignment der Polypeptide in Tabelle A2 in diesem Dokument in 5 und 12 dargestellt. Solche Alignments eignen sich zur Identifikation der zwischen den NAC10-ähnlichen Polypeptiden, wie hier definiert, am stärksten konservierten Domänen oder Motive. Eine derartige Domäne ist die NAM-Domäne (Pfam-Zugang PF02365), die in 4 fett dargestellt ist, während die Motive I bis III unterstrichen sind.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologa können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden. Für locale Alignments eignet sich besonders der Smith-Waterman-Algorithmus (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147 (1); 195–7).
Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide beschreibt Beispiel 3 in Tabelle B1 die Prozent Identität zwischen verschiedenen NAC10-ähnlichen Polypeptiden, insbesondere die Prozent Identität zwischen SEQ ID NO: 28 und anderen NAC10-ähnlichen Polypeptiden, die sogar nur 30% betragen kann.
Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Kennt man die Lokalisierung eines Proteins, erleichtert dies die Aufklärung seiner Funktion. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zur Markierung von Proteinen mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) oder mit Betaglucuronidase. Solche Verfahren sind im Vergleich zu Computerverfahren genau, jedoch arbeitsintensiv. Kürzlich wurden große Fortschritte bei der Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den Algorithmen, die dem Fachmann bekannt sind, sind auf dem ExPASy Proteomics Werkzeuge des Swiss Institute for Bioinformatics zugänglich, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM usw.
Für die NAC10-ähnlichen Polypeptide ist die vorhergesagte subzelluläre Lokalisierung der SEQ ID NO: 28 unter Verwendung des PSort-Algorithmus das Cytoplasma- oder Kernkompartiment (siehe Beispiel 5). Angesichts seiner Funktion als Transkriptionsaktivator ist die subzelluläre Lokalisierung höchstwahrscheinlich der Kern.
Außerdem können IAA2-ähnliche Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel Proteinbindungsaktivität aufweisen. Werkzeuge und Techniken zum Messen der Proteinbindungsaktivität sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten zum Beispiel Immunfällung von Proteinkomplexen oder das Hefe-Zwei-Hybrid-System. Werkzeuge und Techniken zum Messen der Aneinanderlagerung von IAA- und ARF-Polypeptid sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse (siehe zum Beispiel Fukaki et al. (Plant J. 44, 382–395, 2005).
Außerdem führen IAA2-ähnliche Polypeptide, wenn sie gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, wie im Abschnitt Beispiele dargestellt, in Reis exprimiert werden, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere mit erhöhtem Samenertrag.
Außerdem führen IAA2-ähnliche Palypeptide, wenn sie gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, wie im Abschnitt Beispiele dargestellt, in Reis exprimiert werden, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wie einer Erhöhung der Samenfüllungsrate und einem erhöhten Ernteindex.
Weiterhin können IAA2-ähnliche Polypeptide eine bevorzugte subzelluläre Lokalisierung aufweisen, und zwar üblicherweise eine aus einer Kern-, cytoplasmatischen, Chloroplasten- oder mitochondrialen Lokalisierung. Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Kennt man die Lokalisierung eines Proteins, erleichtert dies die Aufklärung seiner Funktion. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zur Markierung von Proteinen mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) oder mit Betaglucuronidase. Solche Verfahren sind im Vergleich zu Computerverfahren genau, jedoch arbeitsintensiv. Kürzlich wurden große Fortschritte bei der Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den Algorithmen, die dem Fachmann bekannt sind, sind auf dem ExPASy Proteomics Werkzeuge des Swiss Institute for Bioinformatics zugänglich, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM usw.
Außerdem können NAC10-ähnliche Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel DNA-Bindungsaktivität aufweisen. Werkzeuge und Techniken zum Messen der DNA-Bindungsaktivität sind im Stand der Technik bekannt, darunter PCR-gestützte Bindungsstellenselektion und ein DNA-Bindungs-Gel-Shift-Assay; allgemeine Angaben finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols.
Außerdem führen NAC10-ähnliche Polypeptide, wenn sie gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, wie im Abschnitt Beispiele dargestellt, in Reis exprimiert werden, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Resistenz gegenüber Salz-, Trockenheit- oder Kältestress in der vegetativen Phase des Pflanzenwachstums.
Hinsichtlich der IAA2-ähnlichen Polypeptide wird die vorliegende Erfindung dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nuk1einsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, oder jedes IAA2-ähnlichen Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die IAA2-ähnliche Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A1 im Abschnitt Beispiele angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologa und Paraloga des IAA2-ähnlichen Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” wie in diesem Dokument definiert sind. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”Blasting” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle A im Abschnitt Beispiele aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Reis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide wird die vorliegende Erfindung dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 27, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 28 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, oder jedes NAC10-ähnlichen Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A2 im Abschnitt Beispiele angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologa und Paraloga des NAC10-ähnlichen Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 28, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” wie in diesem Dokument definiert sind. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”Blasting” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle A2 im Abschnitt Beispiele aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 28, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Reis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird identifiziert, wenn am hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter ist die Bewertung (der ”Score”) (anders ausgedrückt, desto niedriger ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologa und Paraloga zu identifizieren.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologa und Derivate von einer der in Tabelle A1 oder A2 im Abschnitt Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” wie in diesem Dokument definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga von einer der in Tabelle A1 oder A2 im Abschnitt Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologa und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen. Weiterhin sind für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren Varianten geeignet, in denen die Codonnutzung optimiert wurde oder miRNA-Zielstellen entfernt worden sind.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die für IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die für IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, die mittels ”Genshuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”Genshuffling” sind wie hier definiert.
Nukleinsäuren, die IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 oder A2 im Abschnitt Beispiele angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Orthologon. Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A1 oder A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Im Hinblick auf IAA2-ähnliche Polypeptide kodieren Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ein IAA2-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das Proteinmotiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L, umfasst.
Im Hinblick auf NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450,1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die. ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 27, der die NAM-Domäne und ein oder mehrere der Motive I bis III umfasst. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A1 und/oder A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die für ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A1 und/oder A2 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Hinsichtlich IAA2-ähnlicher Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ein IAA2-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit dem Komplement von einer der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit dem Komplement von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit dem Komplement von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz oder ihre komplementäre Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das Protein-Motiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L, umfasst.
Hinsichtlich NAC10-ähnlicher Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit dem Komplement von einer der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit dem Komplement von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit dem Komplement von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 27 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die NAM-Domäne und eines oder mehrere der Motive I bis III (wie vorstehend definiert) umfasst und die, wenn sie wenn sie eine Volllängen-Sequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet und die funktionell äquivalent zu der SEQ ID NO: 28 ist.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Hinsichtlich der IAA2-ähnlichen Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise umfasst die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das Protein-Motiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L.
Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 27 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 28 kodiert. Vorzugsweise umfasst die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz die NAM-Domäne und eines oder mehrere der Motive I bis III (wie vorstehend definiert) und bildet, wenn sie eine Volllängen-Sequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster und ist funktionell äquivalent zu der SEQ ID NO: 28.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Nukleinsäuren einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Im Hinblick auf IAA2-ähnliche Polypeptide haben die von Allelvarianten kodierten Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das IAA2-ähnliche Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und irgendeine der in Tabelle A1 des Abschnitts Beispiele dargestellten Aminosäuren. Allelvarianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das Protein-Motiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L.
Im Hinblick auf NAC10-ähnliche Polypeptide haben die von Allelvarianten kodierten Polypeptide, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das NAC10-ähnliche Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 28 und irgendeine der in Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele dargestellten Aminosäuren. Allelvarianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante gemäß SEQ ID NO: 27 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 28 kodiert. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, die NAM-Domäne und eines oder mehrere der Motive I bis III (wie vorstehend definiert) und bildet, wenn sie eine Volllängen-Sequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster und ist funktionell äquivalent zu der SEQ ID NO: 28.
”Genshuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuren herzustellen, die IAA2-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”Genshuffling” wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 des Abschnitts Beispiele angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”Genshuffling” erhalten wird.
Im Hinblick auf IAA2-ähnliche Polypeptide umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäurevariante kodiert wird, die durch Genshuffling erhalten wurde, vorzugsweise eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das Protein-Motiv: Motiv 1, SEQ ID NO: 22: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L.
Im Hinblick auf NAC10-ähnliche Polypeptide umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäurevariante kodiert wird, die durch Genshuffling erhalten wurde, vorzugsweise die NAM-Domäne und eines oder mehrere der Motive I bis III (wie vorstehend definiert) und bildet, wenn sie eine Volllängen-Sequenz ist und zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 5 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der NAC10-ähnlichen Polypeptide, die die durch SEQ ID NO: 28 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen (Subgruppe I), als mit jeder anderen Gruppe Cluster und ist funktionell äquivalent zu der SEQ ID NO: 28.
Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
Nukleinsäuren, die IAA2-ähnliche Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder der genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
Nukleinsäuren, die NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder der genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile die Samen und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Quadratmeter wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, des Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100).
Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung von einem oder mehreren der folgenden Merkmale zeigen: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe, erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht. Bei Reis kann auch eine Toleranz gegen Überflutung zu einem erhöhten Ertrag führen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags, von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus aufweisen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimungsgeschwindigkeit, Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt) Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden. Unter dem Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie er hier verwendet wird, versteht man diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für einen gegebenen Standort. Der Begriff Nichtstressbedingungen, wie er 9n diesem Dokument verwendet wird, umfasst die gelegentlichen oder alltäglichen milden Stressfaktoren denen eine Pflanze ausgesetzt ist, wie hier definiert, umfasst jedoch keine schwerwiegenden Stressbedingungen.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Trockenheits-, Kälte oder Salzstressbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) zwischen Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut. Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen herangezogen werden) liefern oft einen Ertrag von, in der Reihenfolge der zunehmenden Bevorzugung, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann bezogen auf die Ernte und/oder die Saison berechnet werden. Der Fachmann ist mit den durchschnittlichen Erträgen einer Kultur vertraut.
Hinsichtlich der IAA2-ähnlichen Polypeptide führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert.
Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzer, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Weil die Effizienz der Nährstoffnutzung einen starken Einfluss auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität hat, wird eine riesige Menge an Dünger auf die Felder ausgebracht, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu steigern. Die Produktivität von Pflanzen wird in der Regel durch die drei Hauptnährstoffe Phosphor, Kalium und Stickstoff beschränkt, der unter diesen drei gewöhnlich das geschwindigkeitsbestimmende Element für das Pflanzenwachstum darstellt. Deshalb ist Stickstoff (N) das hauptsächliche für das Pflanzenwachstum benötigte Nährstoffelement. Er ist Bestandteil einer Reihe wichtiger Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, einschließlich Aminosäuren, Proteine (Enzyme), Nukleinsäuren und Chlorophyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Trockensubstanz von Pflanzen und etwa 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Damit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein wichtiger beschränkender Faktor für das Wachstum und die Produktion von Kulturpflanzen (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und übt außerdem einen großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und die Aminosäurezusammensetzung aus. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen bei Kultivierung unter stickstofflimitierenden Bedingungen von großem Interesse. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen oder einen Überschuss von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Salzstressbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhten Ertrag aufweisen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Salzstressbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Speisesalz (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um eines der folgenden Salze handeln: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Gene mit veränderten Expressionsspiegeln in Pflanzen, die ein NAC10-ähnliches Protein überexprimieren, im Vergleich zu den Expressionsspiegeln in entsprechenden Wildtyp-Pflanzen bereit. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Modulierung der Expression dieser Gene bereit, was wiederum die Modulation der biologischen Vorgänge, die sie steuern, ermöglicht. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, mit denen sich ein Spiegel und/oder eine Aktivität eines NAC10-ähnlichen Proteins nachahmen lässt, indem man stromabwärts gelegene Faktoren manipuliert, die an NAC10-ähnlichen Wegen beteiligt sind. Diese Strategie ermöglicht eine Feineinstellung der Wirkungen eines NAC10-ähnlichen Proteins. Wohingegen die Überexpression eines NAC10-ähnlichen Proteins pleiotrop sein und/oder pleiotrope Wirkungen haben kann, stellt die Erfindung Verfahren zum Verändern von Pflanzenmerkmalen auf kontrolliertere und zielgerichtetere Weise bereit, indem man due Zielgene eines NAC10-ähnlichen Proteins, wie von der vorliegenden Erfindung definiert, verwendet. Eine Modulation bestimmter biologischer Vorgänge ist jetzt möglich und kann zu Pflanzen mit veränderten Merkmalen führen, die besonders nutzbringend in der Landwirtschaft und im Gartenbau angewendet werden können, wie verbesserte Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter normalen oder unter Stressbedingungen herangezogen werden.
Deshalb wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verstärkung von einem oder mehreren Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in einer Pflanze die Expression von einer oder mehreren Nukleinsäuren modifiziert und/oder den Spiegel und/oder die Aktivität von einem oder mehreren Proteinen modifiziert, wobei die Nukleinsäuren oder Proteine im Wesentlichen ähnlich zu einem der in den Tabellen I bis K aufgelisteten Gene sind und wobei das eine oder die mehreren Ertragsmerkmal(e) im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen verändert sind..
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert, kodiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die IAA-ähnliche Palypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:

(a) eine Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert, kodiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” hat die hier definierte Bedeutung.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
Jede Art des Promoters, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für des Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden, aber vorzugsweise handelt es sich um einen Promotor pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise eine ubiquitärer konstitutiver Promotor mittlerer Stärke. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”. Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide ist auch ein wurzelspezifischer Promotor für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.
Hinsichtlich der IAA2-ähnlichen Polypeptide sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID. NO: 1 dargestellte Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, noch auf die Expression einer ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, die von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, der stärker bevorzugt aus einem aus Pflanzen stammenden Promotor ausgewählt ist, wie ein GOS2-Promotor, stärker bevorzugt handelt es sich um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 26 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 26 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen.
Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Das Konstrukt umfasst vorzugsweise eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich der SEQ ID NO: 26 ist, und die das IAA2-ähnliche Polypeptid kodierende Nukleinsäure umfasst.
Hinsichtlich der NAC10-ähnlichen Polypeptide sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 27 dargestellte Nukleinsäure, ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, noch auf die Expression einer ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, die von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, der stärker bevorzugt aus einer Pflanze ausgewählt ist, wie ein GOS2-Promotor, stärker bevorzugt handelt es sich um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 382 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 382 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier im Abschnitt ”Definitionen.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verknüpft. Der wurzelspezifische Promotor ist vorzugsweise ein RCc3-Promotor (Plant Mol Biol. 1995 Jan., 27(2): 237–48), stärker bevorzugt der RCc3-Promotor aus Reis, weiterhin bevorzugt wird der RCc3-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 383 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Promotor durch die SEQ ID NO: 383 dargestellt. Beispiele für andere wurzelspezifische Promotoren, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind im vorstehenden Abschnitt ”Definitionen” in Tabelle 3 dargestellt.
Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Das Konstrukt umfasst vorzugsweise eine Expressionskassette, die einen GOS2- oder einen RCc3-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich der SEQ ID NO: 382 bzw. der SEQ ID NO: 383 ist, und die Nukleinsäure, die das NAC10-ähnliche Polypeptid kodiert, umfasst.
Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich isst. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Stressresistenz und/oder erhöhtem Ertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure unter (1) kann es sich um irgendeine der Nukleinsäuren handeln, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder -zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel die Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Einsprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen einem Screening auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie der oben beschriebenen, unterzogen.
Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert wurden, so dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Lein, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntbaren Teile eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die NAC10-ähnliche Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser IAA-ähnlichen Polypeptide oder NAC10-ähnlichen Polypeptide zur Verbesserung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
Hier beschriebene Nukleinsäuren, die NAC10-ähnliches Polypeptid kodieren, oder die IAA-ähnlichen Polypeptide oder NAC10-ähnlichen Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein IAA-ähnliches Polypeptid oder ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die IAA-ähnlichen Polypeptide oder NAC10-ähnlichen Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Allelvariariten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das für IAA-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von Allelvariation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von Allelvarianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation von Allelvarianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer Allelvarianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene Allelvarianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
Nukleinsäuren, die IAA-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen. zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die IAA-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die IAA-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den Nukleinsäuren, die NAC10-ähnliche Polypeptide kodieren, sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die IAA-ähnliche Polypeptide oder NAC10-ähnliche Polypeptide kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der Genkartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragssteigernden Merkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene Architekturmerkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
Punkte
1. IAA2-ähnliche Polypeptide

1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das IAA2-ähnliche Polypeptid eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das durch SEQ ID NO: 22 dargestellte Proteinmotiv umfasst.
2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das IAA2-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 2, SEQ ID NO: 23: (Q/G)LLDG(S/T)G(E/V)YTL (ii) Motiv 3, SEQ ID NO: 24: LLDGSGEYTLVY (iii) Motiv 4, SEQ ID NO: 25: KKLELRLGPPG, wobei die an einer Position in Klammern angegebenen Aminosäuren für alternative Aminosäuren an dieser Position stehen.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
6. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise eine gesteigerte Biomasse und/oder einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsstress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
9. Verfahren nach einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert.
12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach den Punkten 1 oder 2 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
13. Konstrukt nach Punkt 12, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
14. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 12 oder 13 bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertern Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
17. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, ergibt, oder transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
18. Transgene Pflanze nach Punkt 11, 15 oder 17 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer ist.
19. Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 18, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 18 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 19 stammen.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

2. NAC10-ähnliche Polypeptide

1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das NAC10-ähnliche Polypeptid eine NAM-Domäne (Pfam PF02365) umfasst.
2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das NAC10-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv I: A/P/S/N/V/T T/V/L/I/A/S T/P/S/D/V/Q D/V/I/F I A/T/G/P, (ii) Motiv II: R/N/K E/G/S I/R/S/Q/A/V/L R/Q A/P N/S/R, (iii) Motiv III: C/Y R/K L/I/V S/Y/H/F/R N/K/Q K D/K/N/C/S/T/G/M/A/R
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A2 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A2 angegebenen Proteine kodiert.
6. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise eine gesteigerte Biomasse und/oder einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsstress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
9. Verfahren nach einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen oder einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem RCc3- oder einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem RCc3- oder einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert.
12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach den Punkten 1 oder 2 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
13. Konstrukt nach Punkt 12, wobei eine der Kontrollsequenzen ein wurzelspezifischer oder ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein RCc3- oder ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein RCc3- oder ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
14. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 12 oder 13 bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
17. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach Punkt 1 oder 2 kodiert, ergibt, oder transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
18. Transgene Pflanze nach Punkt 11, 15 oder 17 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer ist.
19. Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 18, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
20. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 18 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 19 stammen.
21. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand der folgenden Figuren veranschaulicht, in denen:
1 ein mehrfaches Alignment von IAA2-ähnlichen Polypeptiden darstellt.
2 den binären Vektor darstellt, der für eine erhöhte Expression einer für ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in Oryza sativa unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors verwendet wurde, (pGOS2).
3 die Domänenstruktur der SEQ ID NO: 28 darstellt, wobei die NAM-Domäne (PF02365) fettgedruckt ist und die konservierten Motive I bis III unterstrichen sind.
4 ein mehrfaches Alignment verschiedener NAC10-ähnlicher Polypeptide darstellt, wobei ClustalW mit Default-Einstellung für langsames Alignment verwendet wurde.
5 die phylogenetische Beziehung der Reis-NACHSTEHEND-Familie zeigt. Ein phylogenetischer Stammbaum wurde von einem Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von 54 Reis-NAC-Faktoren unter Verwendung des CLUSTAL W-Programms abgeleitet. Von 105 im Reisgenom vorhergesagten NAC-Faktoren wählten wir achtzehn mit EST-Information aus einer NCBI-Datenbank-Suche unter Verwendung des tBLAST N-Programms. Achtzehn stessinduzierbare Faktoren wurden durch Kästen angezeigt. Die in Tabelle G gezeigten Subgruppen I bis III sind durch Kreise markiert.
6 Eine RNA-Gel-Blot-Analyse wurde unter Verwendung der Gesamt-RNAs aus Wurzeln und Blättern von drei homozygoten T4-Linien von RCc3:OsNAC10- bzw. GOS2:OsNAC10-Pflanzen und von nichttransgenen (NT) Kontrollpflanzen durchgeführt. Die Blots wurden mit den für das OsNAC10-Gen spezifischen Sonden hybridisiert und erneut für RbcS (Jang et al., 1999) und Tuben sondiert. Eine EtBr-Färbung wurde zur Bestimmung einer gleichmäßigen Beladung mit RNAs verwendet. (–) Nullizygote Linien (ohne Transgen), (+) transgene Linien.
7 Erscheinungsbild transgener Pflanzen unter Trockenheitsstress. Drei unabhängige homozygote T4-Linien von RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen und von nichttransgenen (NT) Kontrollen wurden für 4 Wochen herangezogen, 3 T lang einem Trockenheitsstress unterzogen und anschließend 7 T lang im Gewächshaus erneut gewässert. Die Bilder wurden zu den angegebenen Zeitpunkten aufgenommen. ”+” gibt die Anzahl Tage der erneuten Wässerung unter normalen Wachstumsbedingungen an.
8 Veränderungen in der Chlorophyll-Fluoreszenz (Fv/Fm) von Reispflanzen unter den Stressbedingungen Trockenheit, hohe. Salinität und niedrige Temperatur. Drei unabhängige homozygote T4-Linien von RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen und von nichttransgenen (NT) Kontrollen, die 14 Tage lang in MS-Medium angezogen wurden, wurden verschiedenen Stressbedingungen unterzogen, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Nach den Stressbehandlungen wurden die Fv/Fm-Werte unter Verwendung eines Impulsmodulationsfluorimeters (Mini-PAM, Walze, Deutschland) gemessen. Sämtliche Pflanzen wurden vor den Stressbehandlungen unter Dauerbelichtung von 150 μmol m–2 s–1 angezogen. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachansätzen dar (n = 10).
9 Agronomische Merkmale für RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen, die auf dem Feld unter normalen und Stressbedingungen gezüchtet wurden. Spider-Diagramme von agronomischen Merkmalen von drei unabhängigen homozygoten T4-Linien von RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen und entsprechenden nichttransgenen (NT) Kontrollen unter normalen und Trockenheitsbedingungen wurden unter Verwendung der Microsoft-Excel-Software gezeichnet. Jeder Datenpunkt entspricht den Prozent der Mittelwerte (n = 20), die in den Ergänzenden Tabellen I und II aufgelistet sind. Die Mittelwerte der NT-Kontrollen wurden als Referenz auf 100% gesetzt. CL, Halmlänge; PL, Rispenlänge; NP, Anzahl Rispen pro Erhebung; NSP, Anzahl Ährchen pro Rispe; TNS, Gesamtzahl an Ährchen; FR, Füllrate; NFG, Anzahl gefüllter Körner; TGW, Gesamtkorngewicht; 1,000 GW, Tausendkorngewicht.
10 Transkriptionsaktivität von OsNAC10 in Hefe: Eine Volllängen-cDNA von OsNAC10 und zwei C-terminale Deletionsfragmente wurden mittels PCR amplifiziert und mit dem GAL4-BD-Vektor fusioniert. Die Konstrukte wurden jeweils in den Saccharomyces cerevisiae-Stamm AH 109 eingebracht. R, Volllängensequenz von OsNAC10; R1, C-terminale Deletionssequenz von OsNAC10 (Δ323–460); R2, C-terminale Deletionssequenz von OsNAC10 (Δ244–460). Gefüllter Kasten, Sequenz der NAC-Domäne von OsNAC10 (1–173); angefüllter Kasten, Sequenz der Aktivierungsdomäne von OsNAC10 (174–460). Die Transformanten wurden punktförmig auf SD/-Trp- und SD/-His/-Trp-Medien überführt und 3 Tage bei 30°C inkubiert.
11 Alignments der NAC-Domänen-Sequenzen von 18 stressinduzierbaren Reisgenen: Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der NAC-Domänen der 18 in Tabelle 1 aufgelisteten Gene wurden unter Verwendung des CLUSTAL W-Programms einem Alignment unterzogen. Identische und konservierte Reste sind hinterlegt (grau). Signatur-Motive sind durch Kästen markiert, die wie folgt überschrieben sind: Ia–e, IIa–c bzw. IIIa für die Subgruppen I–III.
12 Expression von OsNAC10 unter Stressbedingungen und in verschiedenen Geweben zu verschiedenen Entwicklungsstadien von Reis:
A, Reissamen wurden auf Murashige und Skoog-Agarmedium im Dunkeln für 2 Tage (D2) und anschließend im Licht für 1 Tag bei 28°C (L1) angezogen und dann wurden die Keimlinge in Töpfe mit Boden umgesetzt und im Gewächshaus 11 Tage lang (14d), bis zum Meiosestadium (M) und bis kurz vor dem Stadium des Rispenschiebens (”Heading”, BH) sowie bis kurz nach dem ”Heading” (AH) herangezogen. RT-PCR-Analysen wurden unter Verwendung von RNAs aus den angegebenen Geweben in den angegebenen Entwicklungsstadien und genspezifischer Primer durchgeführt. Der Expressionsspiegel eines Reis-Ubiquitins (OsUbi) wurde als interne Kontrolle verwendet. L1C, Koleoptilen von L1-Keimlingen. B, 10 μg Gesamt-RNA wurde auf Blatt- und Wurzelgewebe von 14 Tagen alten Keimlingen präpariert, die Trockenheit, hoher Salinität, ABA oder niedriger Temperatur bei den angegebenen Zeitpunkten ausgesetzt wurden: Für den Trockenheitsstress wurden due Keimlinge bei 28°C luftgetrocknet; für den Stress aufgrund hoher Salinität wurden die Keimlinge 400 mM NaCl bei 28°C ausgesetzt; für den Niedrigtemperaturstress wurden die Keimlinge 4°C ausgesetzt; für ABA wurden die Keimlinge einer Lösung mit 100 μM ABA ausgesetzt. Die Gesamt-RNAs wurden geblottet und mit den OsNAC10-Genspezifischen Sonden hybridisiert. Die Blots wurden dann erneut mit dem Dip1-(Oh et al., 2005b) Gen sondiert, das als Marker für eine Hinaufregulation von Schlüsselgenen nach den Stressbehandlungen verwendet wurde. Eine EtBr-Färbung wurde zur Bestimmung einer gleichmäßigen Beladung mit RNAs verwendet.
13 Regulierte Gene in Wurzeln und Blättern von RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen unter normalen und Stressbedingungen. Die Transkriptspiegel von OsNAC10 und sechs Zielgenen wurden mittels qRT-PCR (unter Verwendung der Primer, die in der Ergänzenden Tabelle S5 online aufgelistet sind). Die Transkriptspiegel der Gene in RCc3:OsNAC10 und GOS2:OsNAC10 wurden als relativer Wert zu demjenigen von unbehandelter NT-Kontrolle in Wurzel bzw. Blatt dargestellt. Die Daten wurden mithilfe der Transkriptspiegel des Reis-Ubiquitingens (OsUbi) normalisiert. Die Werte sind die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
DNA-Manipulation: Wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, die in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK), beschrieben.
Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (7NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA-, ESTs oder genomische) Sequenzen identifiziert, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Das Programm wurde zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kodiert wird, wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar mit Default-Einstellungen und unter Ausschalten des Filters für die Nichteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Das Ergebnis der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitsbewertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Bewertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment durch Zufall vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität bewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert derart erhöht werden, dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.
1.1. IAA2-ähnliche Polypeptide

Tabelle A1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der IAA2-ähnlichen Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Tabelle A1: Beispiele für IAA2-ähnliche Polypeptide:

Bezeichnung	Nukleinsäure-SEQ ID NO:	Polypeptid-SEQ ID NO:
O.sativa_Os01g0741900#1	1	2
O.sativa_Os05g0523300#1	3	4
Mais IAA6ähnl.ACF83856.1	5	6
Mais_EU965307_IAA6_ACG37425	7	8
H.vulgare_TC162609#1	9	10
OsIBCD003255\|319\|AUX-IAA indica	11	12
T.aestivum_TC289502#1	13	14
T.aestivum_TC297212#1	15	16
T.aestivum_TC350242#1	17	18
Z.mays_TC410949#1	19	20

1.2. NAC10-ähnliche Polypeptide

Tabelle A2 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der NAC10-ähnlichen Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.. Tabelle A2: Beispiele für NAC10-ähnliche Nukleinsäuren und Polypeptide:

Bezeichnung	Nukleinsäure-SEQ ID NO	Polypeptid-SEQ ID NO
OsNAC10	27	28
Os03g0815100	29	30
Os01g0884300	31	32
Os11g0184900	33	34
Os01g0136100	35	36
Os01g0293600	37	38
Os01g0666000	39	40
Os01g0687400	41	42
Os01g0700100	43	44
Os01g0705200	45	46
Os01g0775100	47	48
Os01g0816100	49	50
Os01g0845900	51	52
Os01g0862800	53	54
Os01g0928600	55	56
Os01g0937500	57	58
Os02g0111600	59	60
Os02g0159800	61	62
Os02g0252400	63	64
Os02g0503900	65	66
Os02g0555300	67	68
Os0290562600	69	70
Os02g0569400	71	72
Os02g0570700	73	74
Os02g0579000	75	76
Os02g0601500	77	78
Os02g0606200	79	80
Os02g0736200	81	82
Os02g0759400	83	84
Os02g0782500	85	86
Os02g0808800	87	88
Os03g0130100	89	90
Os03g0132900	91	92
Os03g0138700	93	94
Os03g0183500	95	96
Os03g0267000	97	98
Os03g0269300	99	100
Os03g0327100	101	102
Os03g0421000	103	104
Os03g0432100	105	106
Os03g0575200	107	108
Os03g0584400	109	110
Os03g0762000	111	112
Os04g0104900	113	114
Os04g0107600	115	116
Os04g0206500	117	118
Os04g0206600	119	120
Os04g0301500	121	122
Os04g0320700	123	124
Os04g0339800	125	126
Os04g0437000	127	128
Os04g0460600	129	130
Os04g0464100	131	132
Os04g0469000	133	134
Os04g0508500	135	136
Os04g0565200	137	138
Os04g0581100	139	140
Os04g0583900	141	142
Os04g0612700	143	144
Os0490632600	145	146
Os04g0664500	147	148
Os04g0675400	149	150
Os05g0247800	151	152
Os05g0298700	153	154
Os05g0318600	155	156
Os05g0376600	157	158
Os05g0404700	159	160
Os05g0469600	161	162
Os05g0481900	163	164
Os05g0542500	165	166
Os05g0555600	167	168
Os06g0104900	169	170
Os06g0215900	171	172
Os06g0317200	173	174
Os06g0318600	175	176
Os06g0486400	177	178
Os06g0548200	179	180
Os06g0568600	181	182
Os06g0671600	183	184
Os06g0675600	185	186
Os06g0728700	187	188
Os07g0129300	189	190
Os0790129700	191	192
Os07g0129800	193	194
Os0790130400	195	196
Os07g0154100	197	198
Os07g0171100	199	200
Os07g0182000	201	202
Os07g0190000	203	204
Os07g0251900	205	206
Os07g0262800	207	208
Os07g0410700	209	210
Os07g0486000	211	212
Os07g0490100	213	214
Os07g0558100	215	216
Os07g0663700	217	218
Os07g0674800	219	220
Os07g0683200	221	222
Os07g0684800	223	224
Os07g0689600	225	226
Os08g0115800	227	228
Os08g0133700	229	230
Os08g0203400	231	232
Os08g0367000	233	234
Os08g0474000	235	236
Os0890501000	237	238
Os08g0518800	239	240
Os08g0518900	241	242
Os08g0519300	243	244
os09g0417600	245	246
Os09g0417800	247	248
Os09g0445700	249	250
Os09g0448200	251	252
Os09g0457900	253	254
Os09g0497900	255	256
Os09g0507300	257	258
Os09g0517200	259	260
Os09g0551500	261	262
Os09g0555500	263	264
Os10g0134500	265	266
Os10g0136500	267	268
Os10g0151100	269	270
Os10g0174800	271	272
Os10g0204400	273	274
Os10g0418100	275	276
Os10g0451700	277	278
Os10g0498300	279	280
Os10g0505000	281	282
Os10g0569600	283	284
Os11g0118000	285	286
Os11g0154500	287	288
Os11g0282700	289	290
Os11g0453900	291	292
Os11g0514500	293	294
Os11g0539600	295	296
Os11g0567800	297	298
Os11g0687100	299	300
Os11g0701000	301	302
Os11g0701100	303	304
Os11g0701200	305	306
Os11g0701400	307	308
Os11g0701500	309	310
Os11g0701800	311	312
Os11g0701900	313	314
Os11g0702200	315	316
Os11g0702400	317	318
Os12g0123700	319	320
Os12g0197100	321	322
Os12g0227500	323	324
Os12g0431100	325	326
Os12g0485900	327	328
Os12g0597800	329	330
Os12g0610600	331	332
A.cepa_CF438306	333	334
Os11g03300.1	335	336
Z.mays_ZM07MC20223_BFb0131 A04@201 72	337	338
O.sativa TraitMillCDS___; CDS___1	339	340
O.sativa TraitMillCDS___; CDS___2	341	342
Z.mays_ZM07MStraceDB_BFb0239J01.f_11 20947912@54470	343	344
A.thaliana_AT3G04070.1	345	346
A.thaliana_AT3G04070.2	347	348
G.max_GM06MC20707_59724361@20295	349	350
M.truncatula_AC145753_12.5	351	352
P.trichocarpa_scaff_XI11.531	353	354
P.trichocarpascaff_XIX.359	355	356
A.thaliana_AT1G69490.1	357	358
G.max_GM06MC02339_48986826@2322	359	360
G.max_GM06M000030_47169159@30	361	362
M.truncatula_AC40030_19.5	363	364
G.max_GM06MC38096_sv19a12@37209	365	366
M.truncatula_CT573505_5.4	367	368
P.trichocarpa_scaff_VIII.823	369	370
S.lycapersicum_TC204003	371	372
S.lycopersicum_TC200098	373	374
M.truncatula_AC128638_20.4	375	376
M.truncatula_AC150891_8.5	377	378
OsNAC1	379	380
OsNAC6	381	382
OsNAO5	383	384
Os12g0597800	385	386
Os01g0264000	387	388
Os11g0694100	389	390
Os02g0530800	391	392
Os05g0469800	393	394

In einigen Fällen sind verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), öffentlich offenbart worden. Die Eukaryotic Gene Orthologs-(EGO-)Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erstellt worden, beispielsweise durch das Joint Genome Institute. Weiterhin ist durch Zugang zu geschützten Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen möglich.
Beispiel 2: Alignment von Sequenzen, die mit den Polypeptidsequenzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, verwandt sind
2.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von Vector NT1 (Invitrogen), das auf dem ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Das Alignment wurde mit Standard-Einstellungen durchgeführt: gap opening penalty 10, gap extension penalty 0,2. Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Das Alignment der IAA2-ähnlichen Polypeptide ist in 1 gezeigt.
Hoch konservierte Aminosäurereste sind in der Konsensussequenz angegeben.
2.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Das Alignment von Polypeptidsequenzen, wie in 4 dargestellt, erfolgte unter Verwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500) mit Standard-Einstellung (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, gap opening penalty 10, gap extension penalty 0,2). Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Dieses Alignment kann zur Bestimmung konservierter Signatur-Sequenzen von etwa 5 bis 10 Aminosäuren Länge verwendet werden. Vorzugsweise verwendet man die konservierten Regionen der Proteine, die durch die Sternchen (identische Reste), die Kolons (hoch konservierte Substitutionen) und die Punkte (konservierte Substitutionen) erkennbar sind.
Ein Stammbaum von NAC10-ähnlichen Polypeptiden (3) wurde unter Verwendung von ClustalW konstruiert, wie in der Legende beschrieben.
Beispiel 3: Berechnung der gesamten Prozent Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
3.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Die gesamten Prozent Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT-(Matrix Global Alignment Tool-)Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des Algorithmus für globales Alignment von Myers und Miller (mit einer gap opening penalty 12 und einer gap extension penalty 2) durch, berechnet die Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel unter Verwendung von Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix.
Parameter, die bei dem Vergleich eingesetzt werden können:
Scoring matrix: Blosum62
First Gap: 12
Extending gap: 2
3.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Die gesamten Prozent Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT-(Matrix Global Alignment Tool-)Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des Algorithmus für globales Alignment von Myers und Miller (mit einer gap opening penalty 12 und einer gap extension penalty 2) durch, berechnet die Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel unter Verwendung von Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei dem Vergleich eingesetzte Parameter waren: Blosum62 (Scoring matrix), 12 (First Gap penalty), 2 (Extending gap penalty).
Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die gesamte Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Prozent Identität sind oberhalb der Diagonalen angegeben und die Prozent Ähnlichkeit sind unter der Diagonalen angegeben.
Die Prozent Identität zwischen den NAC10-ähnlichen Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann bis zu nur 30% Sequenzidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 28 betragen.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
4.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Das Vorliegen konservierter Proteindomänen in der SEQ ID NO: 2 wurde durch eine Suche in der Pfam-Datenbank untersucht. Pfam ist eine große Sammlung von multiplen Sequenzalignments und Hidden Markov-Modellen, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sauger Institut im Vereinigten Königreich gehustet.
Die Ergebnisse der Suche in Pfam mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Abfragesequenz sind in Tabelle C1 angegeben. Tabelle C1: Pfam-Suchergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Polypeptidsequenz.

Beschreibung Typ des Eintrags Sequenz (Aminosäurekoordinaten der Domäne in der Abfragesequenz) E-Wert Alignment-Modus

Start Ende

Pfam-A AUX/IAA-Familie Familie 49 335 3E-13 Is
Bei dem für PF2309 verwendeten Alignment-Modus handelt es sich um das so genannte ”Is”. Die in dem Modell verwendeten Parameter sind in Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Is model: hmmbuild -F HMM Is SEED hmmcalibrate --cpu 1 --seed 0 HMM_Is

Parameter Is

Sequenz Domäne

Gathering cut-off –83 –83

Trusted cut-off –82 –82

Noise cut-off –83.5 –83.5
4.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von multiplen Sequenzalignments und Hidden Markov-Modellen, die viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
Die Ergebnisse des InterPro-Scan mit der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Polypeptidsequenz sind in Tabelle C3 angegeben. Tabelle C3: InterPro-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Polypeptidsequenz.

Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO: 28

PFAM PF02365 NAM 11–139

PROFILE PS51005 NAC 11–172

SUPERFAMILY SSF101941 NAM 7–173
Beispiel 5: Topologie-Vorhersage für die Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
5.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis darauf sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (reliability class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wurde eine Anzahl an Parametern ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:

• ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
• TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
• PSORT (URL: psort.org)
• PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).

5.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Hinweis darauf sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (reliability class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wurde eine Anzahl an Parametern ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Polypeptidsequenz sind in Tabelle D1 dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die subzelluläre Lokalisierung der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Polypeptidsequenz kann im Cytoplasma oder im Kern sein; es wird kein Transitpeptid vorhergesagt. Tabelle D1: TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NO: 28 dargestellten Polypeptidsequenz. Abkürzungen: Len, Länge; cTP, Chloroplasten-Transitpeptid; mTP, mitochondriales Transitpeptid, SP, Signalpeptid für den sekretorischen Weg, other, anderes subzelluläres Ziel, Loc, vorhergesagte Lokalisierung; RC, Verlässlichkeitsklasse; TPlen, vorhergesagte Länge des Transitpeptids.
Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:

Beispiel 6: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, und Reistransformation
6.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde mittels molekularbiologischer Routinetechniken aus Reis isoliert und in einen ”Entry Vector” der Gateway-Technologie (Invitrogen) kloniert.
Der die SEQ ID NO: 1 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine Expressionskassette für einen screenbaren Marker und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert war, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 26) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::IAA2-ähnlich (2) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
6.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
In einem Experiment wurde folgendes Transformationsverfahren verwendet:
Die kodierende Region von OsNAC10 wurde aus Gesamt-Reis-RNA unter Verwendung eines RT-PCR-Systems (Promega, WI) gemäß den Anleitungen des Herstellers amplifiziert. Es wurden folgende Primer-Paare verwendet:
Um die Überexpression des OsNAC10-Gens in Reis zu ermöglichen, wurde die isolierte cDNA für die konstitutive Expression mit dem GOS2-Promotor (de Pater et al., 1992) und für die wurzelspezifische Expression mit dem RCc3-Promotor (Xu et al., 1995) unter Verwendung des Gateway-Systems (Invitrogen, Carlsbad, CA) verknüpft. Die Plasmide wurden in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 durch triparentale Paarung eingeführt und embryogene (Oryza sativa cv Nipponbare-) Kalli von reifen Samen wurden transformiert, wie zuvor beschrieben f (Jang et al., 1999).
Um die Überexpression der OsNAC10-Gene in Reis zu ermöglichen, wurden ihre Volllängen-cDNAs isoliert und für die wurzelspezifische Expression mit dem RCc3-Promotor (Xu et al., 1995) und für die konstitutive Expression mit dem GOS2-Promotor (de Pater et al., 1992) verknüpft, so dass die Konstrukte RCc3::OsNAC10 und GOS2::OsNAC10 hergestellt wurden. Diese Konstrukte wurden dann durch Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hiei et al., 1994) in Reis eingebracht, wobei 15 bis 20 unabhängige transgene Linien pro Konstrukt erhalten wurden. Transgene T1-4-Samen wurden gesammelt und drei unabhängige homozygote T4-Linien von RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Sämtliche transgenen Linien wuchsen normal und waren nicht unterentwickelt. Die Transkriptspiegel von OsNAC10 in den RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen wurden durch RNA-Gel-Blot-Analyse bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die Gesamt-RNAs aus Blatt- und Wurzelgeweben von 14 Tage alten Keimlingen extrahiert, die unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen worden waren (4). OsNAC10 war in allen transgenen Linien deutlich nachweisbar, wurde jedoch in den nichttransgenen (NT) Kontrollen nicht nachgewiesen. Das Transgen wurde in hohen Spiegeln in Blättern und Wurzeln der GOS2::OsNAC10-Pflanzen und in Wurzeln der RCc3::OsNAC10-Pflanzen, jedoch bei den letzten nicht in den Blättern exprimiert, was bestätigte, dass die Promotoren konstitutiv bzw. wurzelspezifisch waren.
In einem anderen Experiment wurden Plasmide konstruiert und Pflanzen transformiert, wie folgt:
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Oryza sativa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Irivitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm08754 (SEQ ID NO: 386; Sense, Startcodon fett gedruckt): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatg ccgagcagcg-3' und prm08755 (SEQ ID NO: 387; revers, komplemetär): 5'-ggggaccactttg tacaagaaagctgggtctactgcatctgcagatga-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Technologie – ”entry clone”, pNAC10, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der die SEQ ID NO: 27 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine Expressionskassette für einen screenbaren Marker und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein RCc3-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 383) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pRCc3::NAC10 nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 8: Pflanzentransformation anderer Kulturpflanzen
Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Transformation von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli durch Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Einzelkopie-Pflanzen, die Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigten, für die Ernte von T1-Samen zurückbehalten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzellocus-Transformanten in einer Rate von mehr als 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
Beispiel 8: Pflanzentransformation anderer Kulturpflanzen
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Hellen bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojabohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für die in vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps-/Canolatransformation
Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die in vitro-Aussaat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den in vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Alfalfatransformation
Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte, wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben, erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur selektiert (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyrirginon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Baumwolltransformation
Baumwolle wird mit Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Baumwollsamen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung für 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl zur Keimung überführt. Die Hypokotylen von 4 bis 6 Tage alten Keimlingen werden entnommen, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8% Agar überführt. Eine Agrobacterium-Suspension (etwa 10⁸ Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, die mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformiert wurde) wird zum Beimpfen der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Belichtung werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige und Skoog-Salzen mit B5 Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂ und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien überführt. Einzelne Zelllinien werden nach 2 bis 3 Monaten isoliert (unter Erstellung von Subkulturen alle 4 bis 6 Wochen) und werden weiter auf Selektionsmedium zur Gewebeamplifikation (30°C, 16 Std. Photoperiode) kultiviert. Die transformierten Gewebe werden anschließend weiter auf Nicht-Selektionsmedium für 2 bis 3 Monate kultiviert, so dass somatische Embryonen erhalten wurden. Gesund aussehende Embryonen mit mindestens 4 mm Länge werden dann in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, angereichert mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberelinsäure, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Photoperiode von 16 Std. gezüchtet und die Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgepflanzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend zur weiteren Anzucht ins Gewächshaus überführt.
Beispiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
9.1 IAA2-ähnliche Polypeptide
9.1.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden die Ereignisse zurückbehalten, bei denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen herangezogen wurden, wurden regelmäßig gegossen, so dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren und um die Bedürfnisse der Pflanze für vollständiges Wachstum und vollständige Entwicklung zu erfüllen. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Screening unter Trockenheitsbedingungen
Pflanzen aus T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens (”Heading”) erreichten. Anschließend werden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, werden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wird. Dann werden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgt wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Umsetzung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend werden die Samenparameter gemessen.
9.1.2. Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Ein F-Test wurde an allen Parametern durchgeführt, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, gemessen wurden. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter Wert im F-Test weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
9.1.3. Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Zunahme der Wurzelbiomasse wird ausgedrückt als eine Zunahme in der Gesamt-Wurzelbiomasse (als maximale Biomasse der Wurzeln im Lebenszyklus der Pflanzen gemessen) oder als eine Zunahme des Wurzel/Spross-Index (als Verhältnis zwischen der Wurzelmasse und der Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross gemessen).
Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtanzahl der Samen (oder Einzelblüten) definiert.
9.2 NAC10-ähnliche Polypeptide
In einem ersten Satz von Experimenten wurden die folgenden Tests durchgeführt:
Trockenheitsbehandlungen im vegetativen Stadium
Transgene und nichttransgene (NT) Reis-(Oryza sativa cv Nipponbare-)Samen ließ man auf festem MS-Medium der halben Stärke in einer Wachstumskammer im Dunkeln bei 28°C 4 Tage lang auskeimen, dann wurden sie auf Boden umgesetzt und in einem Gewächshaus (Zyklen von 16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit) bei 28–30°C angezogen. Achtzehn Keimlinge von jeder transgenen und nichttransgenen Linie wurden in Töpfen (3 × 3 × 5 cm; 1 Pflanze pro Top) 4 Wochen lang weiter herangezogen, bevor die Trockenheitsstress-Experimente durchgeführt wurden. Zur Induktion von Trockenheitsstress wurden 4 Wochen alte transgene und NT-Keimlinge 3 Tage lang nicht gegossen und anschließend 7 Tage lang gegossen. Dann wurde die Anzahl der Pflanzen notiert, die überlebten oder ihr Wachstum fortsetzten.
Chlorophyll-Fluoreszenz unter Bedingungen von Trockenheit, hoher Salinität und niedriger Temperatur
Transgene und nichttransgene Reis-(Oryza sativa cv Nipponbare-)Pflanzen ließ man auf festem MS-Medium der halben Stärke in einer Wachstumskammer (Zyklen von 16 Std. Licht mit 150 μmol m^–2 s^–1/8 Std. Dunkelheit bei 28°C) 14 Tage lang auskeimen und wachsen. Die grünen Anteil von etwa 10 Keimlingen wurden von den Stressbehandlungen in vitro mit einer Schere zerschnitten. Für die Induktion von Niedrigtemperaturstress wurden die Keimlinge bei 4°C in Wasser bis zu 6 Std. unter Dauerbelichtung mit 150 μmol m^–2 s^–1 inkubiert. Für die Stressbehandlungen mit hoher Salinität wurden sie in 400 mM NaCl für 2 Std. bei 28°C unter Dauerbelichtung mit 150 μmol m^–2 s^–1 inkubiert und Trockenheitsstress wurde simuliert, indem sie für 2 Std. bei 28°C unter Dauerbelichtung mit 150 μmol m^–2 s^–1 luftgetrocknet wurden. Die Fv/Fm-Werte wurden dann gemessen, wie zuvor beschrieben (Oh et al., 2005b).
Trockenheitsbehandlungen und Analyse des Kornertrags bei im Feld wachsenden Reispflanzen
Zur Untersuchung der Ertragskomponenten transgener Pflanzen unter normalen Feldbedingungen wurden drei unabhängige homozygote T4-Linien der RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen zusammen mit nichttransgenen (NT-) Kontrollen auf ein Reisfeld bei der Rural Development Administration, Suwon, Korea, ausgepflanzt. Es wurde ein vollständig randomisiertes Design mit zwei Replikaten eingesetzt, die jeweils aus 4 Arealen mit einer Größe von 5 m2 bestanden. 25 Tage nach der Aussaat wurden die Keimlinge zufallsgemäß in einen Abstand von 15 × 30 cm umgesetzt. Nach dem letzten ”Paddling” und 45 Tage nach dem Umsetzen wurden 70N/40P/70K kg ha-1 Dünger ausgebracht. Die Ertragsparameter wurden für 10 Pflanzen pro Areal und 20 Pflanzen pro Linie untersucht.
Zur Untersuchung der Ertragskomponenten transgener Pflanzen unter trockenen Feldbedingungen wurden drei unabhängige homozygote T4-Linien der RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen und NT-Kontrollen in einen abnehmbaren, regenabhaltenden Unterstand mit einem 1 Meter tiefen Behälter, der mit natürlichem Reisfeldboden gefüllt war und sich bei der Myongji Universität, Yongin, Korea, befand, umgesetzt. Es wurde ein vollständig randomisiertes Design verwendet und der Umsetzungsabstand sowie die Verwendung von Dünger waren wie vorstehend für normale Feldbedingungen beschrieben. Der Trockenheitsstress wurde im Stadium des Rispenschiebens (von 10 Tage vor dem ”Heading” bis 20 Tage nach dem ”Heading”) begonnen, indem man das Wasser durch einen Ablauf am Boden des Behälters ablaufen ließ. Damit die Pflanzen nicht abstarben, wurde zweimal bewässert, wenn sich die Blätter der Pflanzen unter dem Trockenheitsstress einrollten. Nach dem Aussetzen gegenüber dem Trockenheitsstress wurden die Polyvinyl-Dächer abgenommen und die Pflanzen bis zur Ernte bewässert.
Wenn die Pflanzen unter normalen und Trockenheitsbedingungen bis zur Reife herangewachsen waren und die Körner gereift waren, wurden diese geerntet und von Hand gedroschen (Abtrennung der Samen von den vegetativen Anteilen). Die ungefüllten und die gefüllten Körner wurden getrennt, unabhängig voneinander mit einem Countmate MC1000H (Prince Ltd, Korea) gezählt und gewogen. Die folgenden agronomischen Merkmale wurden untersucht: Blütedatum, Rispenlänge, Anzahl der Ausläufer, Anzahl der Rispen, Ährchen pro Rispe, Füllungsrate (%), Gesamtkorngewicht (g) und 1000-Korngewicht (g). Die Ergebnisse von drei unabhängigen Linien wurden mittels Einweg-ANOVA getrennt analysiert und mit denjenigen der NT-Kontrollen verglichen. Die ANOVA wurde dazu verwendet, Nullhypothese, dass zwischen den Mittelwerten von transgenen Linien und NT-Kontrollen kein Unterschied besteht, zu verwerfen (P < 0,05). Für die statistische Analyse wurde SPSS Version 16.0 verwendet.
In einem anderen Satz wurden die folgenden Experimente durchgeführt:
9.2.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, bei denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen herangezogen wurden, wurden regelmäßig gegossen, so dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren und um die Bedürfnisse der Pflanze für vollständiges Wachstum und vollständige Entwicklung zu erfüllen.
Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation gemäß dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht.
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Screening unter Trockenheitsbedingungen
Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens (”Heading”) erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Umsetzung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Anschließend werden die Samenparameter gemessen.
9.2.2. Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Ein F-Test wurde an allen Parametern durchgeführt, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, gemessen wurden. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter Wert im F-Test weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
Wenn zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt werden, wird eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte werden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen vergleicht.
9.2.3. Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Zunahme der Wurzelbiomasse wird ausgedrückt als eine Zunahme in der Gesamt-Wurzelbiomasse (als maximale Biomasse der Wurzeln im Lebenszyklus der Pflanzen gemessen) oder als eine Zunahme des Wurzel/Spross-Index (als Verhältnis zwischen der Wurzelmasse und der Sprossmasse im Zeitraum des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross gemessen).
Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt Verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtanzahl der Samen (oder Einzelblüten) definiert.
Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung transgener Pflanzen
10.1. IAA2-ähnliche Polypeptide
Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure exprimieren, die den längsten offenen Leserahmen in SEQ ID NO: 1 umfasst, unter Nichtstressbedingungen sind nachstehend dargestellt. Einzelheiten zur Erzeugung der transgenen Pflanzen sind den vorstehenden Beispielen zu entnehmen.
Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen unter Nichtstressbedingungen sind nachstehend dargestellt (Tabelle E1). Eine Steigerung von mindestens 5% wurde bei der Samenfüllungsrate (Füllungsrate) und beim Harvest Index (Harvestindex) und von 2,5% beim Tausendkorngewicht (TKG) beobachtet. Tabelle E1

Ertragsmerkmal Prozent Zunahme in transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen

Füllungsrate 16,3

TKG 3

Harvestindex 11,1
10.2. NAC10-ähnliche Polypeptide
Ergebnisse des ersten Satzes von Experimenten:
Stresstoleranz von RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen im vegetativen Stadium
Um zu untersuchen, ob die Überexpression von OsNAC10 mit der Stresstoleranz in Reis korrelierte, wurden vier Wochen alte Pflanzen und NT-Kontrollen einem Trockenheitsstress unterworfen (5). Bei den NT-Pflanzen gab es sichtbare Symptome für trockenheitsinduzierte Schäden, wie Einrollen der Blätter und Welken bei gleichzeitigem Verlust der Chlorophylle, in einem früheren Stadium als bei den RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen. Die transgenen Pflanzen erholten sich auch schneller als die NT-Pflanzen nach Wiederaufnahme der Bewässerung. Folglich blieben die NT-Pflanzen schwer geschädigt zu einem Zeitpunkt, an dem sich einige der transgenen Linien teilweise wieder erholt hatten (7). Zur Bestätigung des Stresstoleranz-Phänotyps wurden die Fv/Fm-Werte der transgenen und der NT-Kontrollpflanzen sämtlich im vegetativen Stadium gemessen (8). Die Fv/Fm-Werte stehen für die maximale photochemische Effizienz von PS II im dunkeladaptierten Zustand (Fv, variable Fluoreszenz; Fm, maximale Fluoreszenz). Die Fv/Fm-Werte waren unter Trockenheits- und Niedrigtemperaturbedingungen in den RCc3::OsNAC10- und GOS2::OsNAC10-Pflanzen 15 bis 30% höher als in den NT-Pflanzen. Unter Bedingungen einer mäßigen Salinität waren die Fv/Fm-Werte in beiden transgenen Pflanzen 10% höher als in NT-Kontrollen, wohingegen unter Bedingungen einer starken Salinität die Werte ähnlich denjenigen bei den NT-Pflanzen blieben. Somit deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Überexpression von OsNAC10 in transgenem Reis die Toleranz dieser Pflanzen hauptsächlich gegen Trockenheits- und Niedrigtemperaturstressbedingungen im vegetativen Stadium erhöht.
Überexpression von OsNAC10 in Wurzeln erhöht den Reiskornertrag unter Trockenheitsbedingungen
Eine phänotypische Untersuchung von RCc3::OsNAC10- und NT-Kontrollpflanzen ergab keine größeren Unterschiede im vegetativen Wachstum der gesamten Pflanzen. Um zu untersuchen, ob die Überexpression von OsNAC10 der Kornertrag transgener Reispflanzen unter Feldbedingungen erhöht, setzen wir drei unabhängige homozygote T4-Linien von RCc3::OsNAC10 und nichttransgenen (NT-) Kontrollen in ein Reisfeld um und ließen sie bis zur Reife wachsen. Es wurde ein vollständig randomisiertes Design mit zwei Replikaten verwendet. In den RCc3::OsNAC10-Pflanzen war unter normalen Feldbedingungen jedoch das Gesamtkorngewicht 5–14% höher als bei den NT-Kontrollen, was anscheinend auf eine erhöhte Anzahl an gefüllten Körnern zurückzuführen ist (9, Tabelle F). Diese Beobachtungen veranlassten uns, die Ertragskomponenten der auf dem Feld herangezogenen transgenen Reispflanzen unter Trockenheitsbedingungen zu untersuchen. Drei unabhängige Linien von RCc3::OsNAC10 und NT-Kontrollen wurden in ein Reisfeld mit einen abnehmbaren, regenabhaltenden Unterstand umgesetzt und im Stadium des Rispenschiebens (von 10 Tage vor, dem ”Heading” bis 20 Tage nach dem ”Heading”) einem Trockenheitsstress ausgesetzt. Die statistische Auswertung der Ertragsparameter zeigte, dass die Abnahme des Kornertrags unter Trockenheitsbedingungen in den RCc3::OsNAC10-Pflanzen signifikant kleiner war als bei den NT-Kontrollen. Speziell war bei den trockenheitsbehandelten RCc3:OsNAC10-Pflanzen die Anzahl gefüllter Körner um 22–47% höher als bei den trockenheitsbehandelten NT-Pflanzen, was zu einer Zunahme des Gesamtkorngewichts von 19–29% je nach der transgenen Linie führte (9 und Tabelle G). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Überexpression von OsNAC10 in Wurzeln zu einer größeren Trockenheitstoleranz von transgenem Reis im reproduktiven Stadium führte, wodurch der Kornertrag signifikant gesteigert wurde.
Im zweiten Satz von Experimenten wurde eine Steigerung des Samenertrags bei den Pflanzen beobachtet, die mit der SEQ ID NO: 28 unter der Kontrolle des RCc3-Promotors transformiert worden waren. Drei von sechs getesteten Linien zeigten eine erhöhte Füllungsrate bei einer Gesamtzunahme von 14,6% (p-Wert 0,0304).
Beispiel 11: Transkriptionsaktivierungstest in Hefe
11.1. NAC10-ähnliche Polypeptide
Zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität von OsNAC10 und C-terminalen Deletionsmutanten davon wurde ein Transkriptionsaktivierungsassay in Hefe durchgeführt. Volllängen-OsNAC10 und C-terminale Deletionsmutanten davon wurden mittels PCR amplifiziert und in den pGBKT7-Vektor (Clontech, Palo Alto, CA) inseriert, wodurch eine Fusion mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne (BD) hergestellt wurde, wie zuvor beschrieben (Jeong et al., 2009). Dann wurden sämtliche Konstrukte mittels DNA-Sequenzanalyse überprüft. Die Konstrukte wurden in den Saccharomyces cerevisiae-Stamm AH109 (Clontech) eingebracht und die transformierten Zellen wurden auf SD/-Trp-Medium 3 Tage lang gezüchtet. Die transformierten Kolonien wurden zum Testen der Transkriptionsaktivität auf SD/-Trp- und SD/-Trp/-His-Medium aufplattiert.
GAL4-DNA-Bindungsdomäne-OsNAC10-Fusionsproteine wurden in Hefezellen exprimiert, die daraufhin hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Transkription von der GAL4-bindungssequenz zu aktivieren, untersucht wurden. 10 zeigt, dass OsNAC10 und OsNAC10 (Δ323–460) das Hefewachstum in Abwesenheit von Histidin förderten, was jedoch nach einer weiteren Deletion der C-terminalen Region bis zur Position 244 aufgehoben wurde. Dies zeigt, dass OsNAC10 als Transkriptionsaktivator wirkt.
Beispiel 12: OsNAC10 wird durch Stress induziert
12.1. NAC10-ähnliche Polypeptide
Reis-3'-Tiling-Mikroarray-Analyse
Es wurde ein Expressionsprofil unter Verwendung des Reis-3-Tiling-Mikroarrays von NimbleGen Inc. (http://www.nimblegen.com) erstellt, das 27448 in der IRGSP, RAP1-Datenbank (http://rapdb.lab.nig.ac.jp) hinterlegte Gene enthält. Weitere Informationen zu diesem Mikroarray, einschließlich der statistischen Analyse, finden sich unter http://www.ggbio.com (GreenGene Biotech). Unter den Genen auf dem Mikroarray stammen 20507 aus repräsentativen RAP1-Sequenzen mit cDNA/EST-Unterstützung und 6941 Gene wurden ohne cDNA/EST-Unterstützung vorhergesagt. Es wurden zehn 60 nt lange Sonden von jedem Gen entworfen, die 60 bp vor dem Stoppcodon begannen und jeweils um 10 bp-Positionen verschoben waren, so dass 10 Sonden 150 bp in der 3'-Region des Gens abdeckten. Auf diese Weise wurden insgesamt 270000 Sonden (durchschnittliche Größe 60 nt) so entworfen, dass ihre Tm-Werte zwischen 75°C und 85°C lagen. Zufallsgemäße GC-sonden (38000) wurden zur Überwachung der Hybridisierungseffizienz verwendet und Bezugsmarker an den vier Ecken (225) wurden hinzugenommen, um das Übereinanderlegen von Gitter und Bild zu erleichtern. Zur Identifizierung stressinduzierbarer NAC-Gene in Reis wurde die Gesamt-RNA (100 μg) aus 14 Tage alten Reis-(Oryza sativa cv Nipponbare-)Blättern von Pflanzen präpariert, die Stressbedingungen von Trockenheit, hoher Salinität, ABA und niedriger Temperatur unterzogen worden waren. Für die Behandlungen mit hoher Salinität und ABA wurden die 14 Tage alten Keimlinge in eine Nährlösung, die 400 mM NaCl oder 100 μM ABA enthielt, für 2 Std. im Gewächshaus unter Dauerlicht mit etwa 1000 μmol m-2 s-1 überführt. Für die Trockenheitsbehandlung wurden 14 Tage alte Keimlinge für 2 Std. unter Dauerlicht mit etwa 1000 μmol m–2 s–1 luftgetrocknet. Für die Niedrigtemperaturbehandlungen wurden 14 Tage alte Keimlinge in einer Kühlkammer für 6 Std. unter Dauerlicht mit 150 μmol m–2 s–1 4°C ausgesetzt. Zur Identifizierung von Genen, die in RCc3:OsNAC10-, GOS2:OsNAC10-Pflanzen nach oben reguliert werden, wurde Gesamt-RNA (100 μg) aus den Wurzelgeweben von 14 Tage alten transgenen und nichttransgenen Reis-(Oryza sativa cv Nipponbare-)Keimlingen unter normalen Wachstumsbedingungen präpariert. Die mRNA wurde unter Verwendung der Qiagen oligotex-Säule (Qiagen, Valencia, CA) nach den Anleitungen des Herstellers gereinigt. Für die Normalisierung wurden die Daten mit der ”cubic alpine”-Normalisierung, wobei Quartile zum Einstellen der Signalvariation zwischen den Chips verwendet wurden, und mittels Robust Multi-Chip Analysis unter Verwendung eines ”median” Polieralgorithmus, der in NimbleScan implementiert ist (Workman et al., 2002; Irizarry et al., 2003), verarbeitet. Zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit der Mikroarray-analyse wiederholten wir die Experimente dreimal mit unabhängig präparierten Gesamt-RNAs und analysierten jeden Datensatz statistisch unter Verwendung von Einweg-ANOVA.
RT-PCR- und qPCR-Analyse
Gesamt-RNA wurde präpariert, wie zuvor beschrieben (Oh et al., 2008). Für die Analyse von Genen mittels RT-PCR wurde ein cDNA-Synthesesystem (Invitrogen, Carlsbad, CA) entsprechend den Anleitungen des Herstellers verwendet. Zur Amplifikation der PCR-Produkte wurden Primer verwendet, die mit der Primer Designer 4-Software (Sci-ed Software, Durham, NC) entwickelt worden waren. Für die RT-PCR wurden die Primer-Paare jeweils in einer Endkonzentration von 10 pM und 2 μl (entsprechend 5 ng Gesamt-RNA) der cDNA als matrize eingesetzt. Die PCR erfolgte für 10 min bei 95°C, gefolgt von 25 bis 29 Zyklen bei 94°C. für 30 s, 57°C für 30 s und 68°C für 1 min. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Zur Validierung unserer RT-PCR-Ergebnisse wiederholten wir jedes Experiment zweimal mit unabhängig präparierter Gesamt-RNA.
Für quantitative Echtzeit-PCR-Experimente wurde das SuperScriptTM III Platinum^® One-Step Quantitative RT-PCR-System (Invitrogen, Carlsbad, CA) verwendet. Für die PCR-Reaktionen wurde ein Mastermix von Reaktionskomponenten gemäß dem Protokoll des Herstellers für Platinum^® SYBR^® Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA) hergestellt. Die Thermozyklen und der Fluoreszenznachweis erfolgten unter Verwendung eines Stratagene Mx3000p Real-Time PCR-Geräts (Stratagene, La Jolla, CA). Die PCR erfolgte bei 95°C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 94°C für 30 s, 57°C für 30 s und 68°C für 1 min. Zur Validierung unserer qPCR-Ergebnisse wiederholten wir jedes Experiment dreimal.
Northern-Blot-Analyse
Reis-(Oryza sativa cv Nipponbare-)Samen ließ man in Boden keimen und züchtete sie dann im Gewächshaus (Zyklen von 16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit) bei 22°C. Für die Behandlungen mit hoher Salinität und ABA wurden 14 Tage alte Keimlinge in eine Nährlösung, die 400 mM NaCl oder 100 μM ABA enthielt, für den angegebenen Zeitraum im Gewächshaus unter Dauerlicht mit etwa 1000 μmol/m2/s überführt. Für die Trockenheitsbehandlung wurden 14 Tage alte Keimlinge entnommen und für den angegebenen Zeitraum unter Dauerlicht mit etwa 1000 μmol/m2/s luftgetrocknet. Für die Niedrigtemperaturbehandlungen wurden 14 Tage alte Keimlinge in einer Kühlkammer für den angegebenen Zeitraum unter Dauerlicht mit150 μmol/m2/s 4°C ausgesetzt. Die Präparation von Gesamt-RNA und die RNA-Gel-Blot-Analyse wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Jang et al., 2002).
Zur Identifizierung stressinduzierbarer OsNAC-Gene erstellten wir ein Expressionsprofil mit dem Reis-3'-Tiling-Mikroarray (GreenGene Biotech, Yongin, Korea), wobei RNAs von 14 Tage alten Reisblättern von Keimlingen verwendet wurden, die Trockenheit, hoher Salinität, ABA und niedriger Temperatur unterworfen worden waren. Wenn drei Replikate gemittelt und mit unbehandelten Blättern verglichen wurden, stellte sich heraus, dass insgesamt 18 OsNAC-Gene 1,9-fach (P < 0,05) oder mehr durch eine oder mehrere Stressbedingungen nach oben reguliert wurden (Tabelle H). Eine phylogenetische Analyse der Aminosäuresequenzen der 18 OsNACs zeigte das Vorliegen von 3 Subgruppen (1 bis III) (11). Ein Vergleich der Aminosäuresequenz, die die NAC-Domäne überspannt, identifizierte Signatur-Motive, anhand deren man diese Subgruppen unterscheiden kann (9). Zum Beispiel sind die Signatur-Motive Ia–e, IIa–c und IIIa spezifisch für die Subgruppen I, II bzw. III. Neben der Sequenzähnlichkeit sind die Mitglieder jeder Subgruppe hinsichtlich ihrer Reaktion auf Stress eng miteinander verwandt. Zum Beispiel wird die Expression der Gene in Subgruppe II nicht durch niedrige Temperatur induziert. Eines dieser stressresponsiven Gene, OsNAC10 (AK069257), das für Subgruppe I steht, wurde in dieser Untersuchung funktionell charakterisiert. Tabelle H: Die NAC-Transkriptionsfaktorgene aus Reis wurden unter Stressbedingungen nach oben reguliert. Die fettgedruckten Zahlen geben eine mehr als 1,9-fache (P < 0,05) Hinaufregulation in Pflanzen an, die unter Stressbedingungen herangezogen wurden. ^aNummern für Volllängen-cDNA-Sequenzen der entsprechenden Gene. ^bzahlen stellen den Mittelwert von drei biologischen Replikaten dar. Diese Mikroarray-Datensätze sind unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus; GEO) zu finden. ^cP-Werte wurden durch Einweg-ANOVA analysiert. Zugangsnummern: SNAC1, AK067690; OsNAC6, AK068392; OsNAC5, AK102475.
Eine RT-PCR-Analyse der OsNAC10-Expression in verschiedenen Geweben zu verschiedenen Entwicklungsstadien ergab, dass es vorwiegend in Wurzeln und Blüten (Rispen) exprimiert wird (12A).
Außerdem wurde eine RNA-Gel-Blot-Analyse unter Verwendung von Gesamt-RNAs aus Blattgeweben 14 Tage alter Keimlinge, die hoher Salinität, Trockenheit, ABA und niedriger Temperatur ausgesetzt worden waren, durchgeführt (12B). In Übereinstimmung mit Ergebnissen aus den Mikroarray-Experimenten wurde die Expression von OsNAC10 durch Trockenheit, hohe Salinität und ABA, aber nicht durch niedrige Temperatur induziert.
Beispiel 13: Identifizierung von Genen, die durch überexprimiertes OsNAC10 nach oben reguliert werden
13.1. NAC10-ähnliche Polypeptide

Zum Identifizieren von Genen, die durch die Überexpression von OsNAC10 nach oben reguliert werden, erstellten wir Expressionsprofile von GOS2:OsNAC10- und RCc3:OsNAC10-Pflanzen im Vergleich zu NT-Kontrollen unter normalen Wachstumsbedingungen. Die Expressionsprofile mit dem 3'-Tiling-Mikroarray wurden unter Verwendung von RNA-Proben durchgeführt, die von 14 Tagen alten Wurzeln dieser transgenen Pflanzen und NT-Kontrollen extrahiert wurden, die sämtlich unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden. Jeder Datensatz wurde von drei biologischen Replikaten erhalten. Wie in den Tabellen I, J und K dargestellt ist, identifizierte eine statistische Analyse jedes Datensatzes mittels Einweg-ANOVA 141 Gene, die durch OsNAC10 hinaufreguliert werden mit einer 3-fachen oder höheren Induktion in den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den NT-Pflanzen (P < 0,05). Genauer gesagt, wurden insgesamt 38 Gene in beiden transgenen Pflanzen gemeinsam aktiviert, wohingegen 44 bzw. 59 Gene für RCc3:OsNAC10- bzw. GOS2:OsNAC10-Pflanzen spezifisch waren. Auf der Basis unserer Mikroarray-Daten, die in den Tabellen G und H dargestellt sind, wählten wir 6 (3 stressinduzierbare und 3 nicht stressinduzierbare) aus den 38 gemeinsamen Zielgenen aus und überprüften ihre OsNAC10-abhängigen Expressionsmuster in den Wurzeln der transgenen Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen mittels Echtzeit-PCR (13, Kontrolle). Um zu testen, ob ihre Expressionsspiegel sich unter Stressbedingungen weiter erhöhen, haben wir die Transkriptspiegel der 6 Gene in Wurzeln und Blättern von RCc3:OsNAC10-, GOS2:OsNAC10- und NT-Pflanzen gemessen, nachdem diese Bedingungen von Trockenheit, hoher Salinität und niedriger Temperatur ausgesetzt wurden (13). Die Transkriptspiegel von OsNAC10 sind, wie erwartet, in Wurzeln und Blättern von GOS2:OsNAC10-Pflanzen und in Wurzeln von RCc3:OsNAC10-Pflanzen höher im Vergleich zu den NT-Kontrollen. Im Falle von drei stressinduzierbaren Zielgenen, Cytochrom P450, 2OG-Fe(II)-Oxygenase und NCED4, waren die Transkriptspiegel innerhalb von 2 Stunden der Stressbehandlungen in NT-Wurzeln und -Blättern in unterschiedlichem Maße erhöht. Die Transkriptspiegel waren zudem in den transgenen Wurzeln unter Stressbedingungen im Vergleich zu stressbehandelten NT-Pflanzen höher. Ihre Transkriptspiegel in den transgenen Blättern blieben dagegen ähnlich wie bei den NT-Kontrollen, was darauf hindeutet, dass die Expression der stressinduzierbaren Zielgene in Blättern nicht OsNAC10-abhängig ist. Ebenso war ein nicht stressinduzierbares Zielgen, für den Kaliumtransporter KUP3, in Wurzeln, aber nicht in Blättern OsNAC10-abhängig. Interessanterweise war die Expression zweier nicht stressinduzierbarer Zielgene, Ser/Thr-Kinase und OPR2, in Wurzeln und Blättern beider transgener Pflanzen strikt OsNAC10-abhängig. Die OsNAC10-abhängige Expression der zwei Gene in den transgenen Blättern konnte nicht bestätigt werden, weil der OsNAC10-Transkriptspiegel in RCc3:OsNAC10-Blättern nicht erhöht war. Es ist bemerkenswert, dass die Expression der beiden nicht stressinduzierbaren Zielgene in Wurzeln und Blättern sowohl von RCc3:OsNAC10- als auch GOS2:OsNAC10-Pflanzen in besonderem Maße vielfach (mehr als 100-fach) erhöht war. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sowohl die konstitutive als auch die wurzelspezifische Überexpression des OsNAC10-Gens die Stresstoleranz transgener Pflanzen im vegetativen Stadium steigert, indem sie bestimmte Gruppen von Zielgenen aktiviert. Tabelle I: Hinaufregulierte Gene in RCc3:OsNAC10- und GOS2:OsNAC10-Pflanzen im Vergleich zu nichttransgenen Kontrollen: ^aNummern für Vollängen-cDNA-Sequenzen der entsprechenden Gene. ^bZahlen stellen den Mittelwert von drei unabhängigen biologischen Replikaten dar. Diese Mikroarray-Datensätze finden sich unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus, GEO). ^cP-Werte wurden mittels Einweg-ANOVA untersucht.

Genbezeichnung	Loc Nr.^a	RCc3::OsNAC10		GOS2::OsNAC10
	(IRGSP)	Mittel^b	P-Wert^c	Mittel^b	P-Wert^c
RCc3::OsNAC10 and GOS2::OsNAC10
stressinduzierbar
Cytochrom P450	Os02g0503900	9,28	0,00	4,99	0,00
9-cis-Epoxycarotinoid-Dioxygenase (NCED4)	Os07g0154100	7,83	0,00	4,17	0,00
Zn-Fingerprotein	Os11g0702400	7,71	0,00	14,94	0,00
Transkriptionsfaktor der WRKY-Familie	Os09g0417800	7,56	0,00	5,94	0,00
Kaliumtransporter	Os03g0575200	6,17	0,00	3,04	0,00
AP2	Os08g0474000	5,79	0,00	4,11	0,00
Mitogen-aktivierte Proteinkinasekinase	Os04g0339800	5,76	0,00	9,10	0,00
HLH, helix loop helix-Domäne	Os04g0301500	3,76	0,00	3,67	0,00
Protein der Cytochrom P450-Familie	Os02g0570700	3,46	0,00	7,89	0,00
2OG-Fe(II)oxygenase	Os04g0581100	7,67	0,00	3,19	0,00
mit Pathogenese zusammenhängendes Protein	Os07g0129300	5,22	0,00	3,01	0,00
DUF581	Os03g0183500	3,75	0,00	3,01	0,00
Mitglied der Auxin-responsiven SAUR-Genfamilie	Os06g0671600	3,33	0,00	5,83	0,00
1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatsynthase	Os07g0190000	3,16	0,00	5,32	0,00
in später Embryogenese häufiges Protein	Os01g0705200	3,00	0,00	6,03	0,00
Transkription, Translation, Replikation
Protein der Leucine-rich repeat-Familie	Os08g0203400	8,01	0,00	3,56	0,00
Transkriptionsfaktor der WRKY-Familie	Os09g0417600	7,84	0,00	9,28	0,00
Protein der NAC-Familie	Os11g0154500	3,89	0,00	6,64	0,00
Protein der Zinkfinger-Familie	Os11g0687100	5,14	0,00	8,97	0,00
Zelluläre Vorgänge
Ste20-ähnliche Ser/Th-Kinase (Ser/Thr-Kinase)	Os06g0486400	37,37	0,00	47,67	0,00
Lektin-Proteinkinase	Os07g0130400	6,52	0,00	7,01	0,00
Transmembranprotein-Kinase	Os07g0251900	3,97	0,00	4,68	0,00
Wall-assoziierte Kinase	Os02g0111600	3,50	0,00	5,96	0,00
Tyrosinkinase	Os10g0174800	3,49	0,00	6,67	0,00
Stoffwechsel
12-Oxophytodienoat-Reduktase (OPR2)	Os06g0215900	91,77	0,00	106,21	0,00
Acyl-CoA-Synthetase	Os03g0130100	3,87	0,00	3,42	0,00
Multi-Kupfer-Oxidasen	Os09g0507300	3,16	0,00	4,22	0,00
GCN5-uerwandte N-Acetyltransferase	Os05g0376600	3,12	0,00	3,05	0,00
Kaliumtransporter KUP3	Os09g0448200	7,76	0,00	5,73	0,00
Schwermetalltransporter	Os04g0469000	3,86	0,00	3,53	0,00
Entgiftungsprotein	Os04g0464100	3,33	0,00	3,19	0,00
Chitinase	Os0190687400	3,08	0,00	3,49	0,00
Glycosylhydrolase	Os05g0298700	3,08	0,00	3,52	0,00
Schlecht charakterisiert
Exprimiertes Protein	Os11g0282700	50,21	0,00	78,51	0,00
Proteinkinase	Os10g0134500	4,49	0,00	6,02	0,00
Proteinkinase-Domäne enthaltendes Protein	Os10g0151100	3,19	0,00	4,48	0,00
Proteinkinase-Domäne enthaltendes Protein	Os11g0694100	3,13	0,00	3,64	0,00
SAM-abhängige Methyltransferasen	Os04g0104900	3,09	0,00	5,43	0,00

Tabelle J: Hinaufregulierte Gene in RCc3::OsNAC10-Pflanzen im Vergleich zu nichttransgenen Kontrollen: ^aNummern für Vollängen-cDNA-Sequenzen der entsprechenden Gene. ^bZahlen stellen den Mittelwert von drei unabhängigen biologischen Replikaten dar. Diese Mikroarray-Datensätze finden sich unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus, GEO). ^cP-Werte wurden mittels Einweg-ANOVA untersucht.

Genbezeichnung	Loc Nr^a	RCc3::OsNAC10		GOS2::OsNAC10
	(IRGSP)	Mittel^b	P-Wert^c	Mittel^b	P-Wert^c
RCc3:OsNAC10
Glycosidhydrolase	Os05g0247800	8,68	0,00	1,96	0,01
AP2-domäne enthaltendes Protein RAP2.6	Os09g0457900	10,35	0,00	1,95	0,01
Glycoprotein	Os11g0514500	3,73	0,00	1,92	0,00
Calcium-transportierende ATPase	Os10g0418100	14,13	0,00	1,91	0,00
Arginindecarboxylase	Os04g0107600	3,28	0,00	1,88	0,00
Glycin-reiches Zellwand-Strukturprotein	Os10g0451700	17,53	0,00	1,78	0,00
NADH-abhängige Glutamatsynthase	Os05g0555600	4,26	0,00	1,56	0,01
Rypsin-alpha-Amylase-Inhibitorprotein.	Os10g0505000	5,37	0,00	1,47	0,03
L-Lactatdehydrogenase	Os06g0104900	4,18	0,00	1,31	0,06
FAD-verknüpfte Oxidase	Os06g0548200	3,95	0,00	1,30	0,06
Hitzeschockprotein	Os01g0136100	3,84	0,00	1,27	0,16
Glycosidhydrolase	Os11g0701200	3,39	0,00	1,26	0,43
Leucin-reicher Repeat	Os11g0701800	4,28	0,00	1,21	0,40
NAD-abhängige Mannitdehydrogenase	Os04g0612700	9,04	0,00	1,21	0,55
Glycosidhydrolase	Os08g0519300	3,41	0,00	1,15	0,39
CinnamoylCoA-Reduktase	Os02g0808800	13,09	0,00	1,12	0,77
Decarboxylase-Isozym	Os05g0469600	9,38	0,00	1,11	0,49
H+/Oligopeptidsymporter	Os03g0138700	4,13	0,00	1,09	0,77
Phosphoribosylamin-Glycinligase	Os12g0197100	3,99	0,00	1,07	0,72
Serin/Threonin-Proteinkinase	Os03g0269300	5,12	0,00	1,07	0,72
CW-Typ Zn-Finger	Os05g0404700	3,65	0,00	1,06	0,78
Chitinase	Os11g0701500	4,11	0,00	1,05	0,87
Decarboxylase	Os05g0469600	10,74	0,00	1,04	0,81
Chitinase	Os11g070180	4,70	0,00	1,03	0,92
Glycine-reiches Protein	Os06g0317200	3,85	0,00	–1,07	0,64
Tyrosinkinase	Os09g0551500	6,09	0,00	–1,12	0,70
Serin-Palmitoyltransferase	Os09g0551500	3,36	0,00	–1,15	0,69
Chitinase	Os11g0701400	5,08	0,00	–1,15	0,65
Agmatin-Cumaroyltransferase	Os04g0664500	3,12	0,00	–1,22	0,34
Protein der Hitzeschockprotein DnaJ-Familie	Os04g0675400	7,76	0,00	–1,24	0,38
AP2-Domäne enthaltendes Protein RAP2.2	Os07g0674800	3,48	0,00	–1,25	0,13
Hitzeschockprotein	Os03g0267000	4,14	0,00	–1,28	0,10
Glycosidhydrolase	Os11g0701900	3,91	0,00	–1,46	0,14
Ent-Kauren-Oxidase	Os06g0568600	3,50	0,00	–1,54	0,01
Glycosidhydrolase, Familie 18 Protein	Os08g0518900	5,83	0,00	–1,57	0,02
Klasse III Chitinase	Os11g0701100	3,42	0,00	–1,63	0,03
Chitinase	Os08g0518800	3,51	0,00	–1,77	0,02
Aspartylprotease	Os01g0937500	4,12	0,00	–1,85	0,00
Serin/Threonin-Proteinkinasen	Os07g0262800	3,08	0,04	–2,18	0,09
AAA-ATPase	Os12g0431100	3,56	0,00	–3,32	0,00
Klasse III Chitinase	Os11g0701000	3,98	0,00	–3,35	0,00
Phosphatdikinase	Os03g0432100	3,43	0,00	–3,69	0,00
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinas	Os10g0204400	9,92	0,00	–3,82	0,00
Glycosidhydrolase	Os11g0702200	3,82	0,00	–4,67	0,00

Tabelle K: Hinaufregulierte Gene in GOS2:OsNAC10-Pflanzen im Vergleich zu nichttransgenen Kontrollen: ^aNummern für Vollängen-cDNA-Sequenzen der entsprechenden Gene. ^bZahlen stellen den Mittelwert von drei unabhängigen biologischen Replikaten dar. Diese Mikroarray-Datensätze finden sich unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus, GEO). ^cP-Werte wurden mittels Einweg-ANOVA untersucht.

Genbezeichnung	Loc Nr.^a	RCc3::OsNAC10		GOS2::OsNAC10
	(IRGSP)	Mittel^b	P-Wert^c	Mittel^b	P-Wert^c
GOS2:OsNAC10
MATH-Domäne enthaltendes Protein	Os10g0429400	1,95	0,00	3,19	0,00
Chitinase	Os03g0132900	1,94	0,00	3,30	0,00
AP2	Os07g0410700	1,91	0,00	4,11	0,00
Dehydrogenase/Reduktase	Os07g0663700	1,90	0,00	3,43	0,00
ATPase	Os09g0517200	1,89	0,00	3,01	0,00
Protein der En/Spm-ähnlichen Transposonproteine-Familie	Os02g0530800	1,86	0,25	4,16	0,01
Zn-Finger, RING-Domäne enthaltendes Protein	Os02g0759400	1,84	0,00	4,83	0,00
AAA-Typ ATPase-ähnliches Protein	Os03g0584400	1,84	0,01	3,74	0,00
Serin/Threonin-Proteinkinase Rezeptor	Os04g0632600	1,84	0,11	4,06	0,00
Protein der Mlo-verwandten Proteinfamilie	Os02g0562600	1,80	0,07	3,21	0,00
Lipidphosphat-Phosphatase 2	Os01g0666000	1,72	0,00	4,17	0,00
Proteinkinase	Os10g0136500	1,69	0,03	7,18	0,00
Phytoen-Synthase	Os09g0555500	1,61	0,02	4,52	0,00
Protein der Proteinkinase-Familie	Os07g0129800	1,59	0,01	3,14	0,00
Gruppe 3 LEA (Typ I) Protein	Os05g0542500	1,51	0,18	3,62	0,00
Nicotianamin-Synthase 9	Os07g0689600	1,49	0,02	3,06	0,00
Glucosyltransferase	Os04g0320700	1,46	0,06	3,12	0,00
Zn-Finger	Os02g0252400	1,44	0,04	5,61	0,00
Protein der Cytochrom P450-Familie	Os02g0569400	1,42	0,05	3,34	0,00
kleines Hitzestressprotein Klasse CIII.	Os02g0782500	1,39	0,03	4,11	0,00
Protein der UDP-Glucosyltransferase-Familie	Os04g0206600	1,39	0,20	7,85	0,00
Dehydrin RAB 16D	Os11g0453900	1,39	0,06	3,23	0,00
Myb	Os04g0583900	1,39	0,20	8,57	0,00
RNA-gesteuerte RNA-Polymerase	Os02g0736200	1,37	0,08	3,20	0,00
Cyclin-ähnliche F-box-Domäne enthaltendes Protein	Os11g0539600	1,35	0,15	7,36	0,00
Myb	Os04g0508500	1,35	0,08	5,49	0,00
RIR1b-Protein	Os10g0569600	1,28	0,11	5,56	0,00
Cyclin-ähnliche F-box-Domäne enthaltendes Protein	Os02g0159800	1,28	0,10	3,42	0,00
HGWP-Repeat enthaltendes Protein	Os08g0133700	1,28	0,64	3,14	0,02
ATPase	Os12g0485900	1,24	0,24	5,10	0,00
Zn-Finger	Os01g0264000	1,24	0,17	4,66	0,00
Protein der En/Spm-ähnlichen Transposonproteine-Familie	Os08g0367000	1,23	0,67	3,15	0,01
Beta-Glucosidase-Aggregierungsfaktor	Os12g0227500	1,19	0,28	3,08	0,00
UDP-Glucuronosyl- und UDP-Glucosyltransferase	Os04g0565200	1,17	0,61	3,55	0,00
Peptidase S41A	Os06g0318600	1,16	0,41	5,01	0,00
Myb	Os07g0558100	1,12	0,48	3,06	0,00
Protein der UDP-Glucosyltransferase-Familie	Os04g0206500	1,12	0,73	4,43	0,00
Serin/Threonin-Proteinkinase	Os05g0318600	1,05	0,86	4,05	0,00
HAT-Dimerisierungsdomäne enthaltendes Protein	Os12g0597800	1,01	0,97	4,92	0,00
Calcium-bindende EF-Hand-Domäne-Protein	Os01g0845900	1,01	0,97	3,86	0,00
Abhydrolase	Os11g0118000	1,00	0,99	3,07	0,00
MutS IV-Domäne enthaltendes Protein	Os07g0486000	–1,81	0,07	53,93	0,00
Epoxidhydrolase	Os10g0498300	–1,04	0,88	42,54	0,00
HAT-Dimerisierungsdomäne enthaltendes Protein	Os01g0293600	–1,08	0,79	12,01	0,00
TPR-ähnliches-Domäne enthaltendes Protein	Os07g0171100	–1,32	0,17	9,47	0,00
AAA-ATPase	Os09g0445700	–1,03	0,88	6,82	0,00
Protein der Cytochrom P450-Familie	Os02g0601500	–1,19	0,30	6,34	0,00
Caseinkinase II alpha-Untereinheit	Os03g0762000	–1,12	0,40	6,29	0,00
Betaglucosidase	Os03g0323300	–1,04	0,78	5,16	0,00
Zn-Finger, B-Box-Domäne enthaltendes Protein	Os02g0606200	–1,57	0,04	4,91	0,00
Myb, DNA-Bindungsdomäne enthaltendes Protein	Os06g0728700	–5,12	0,00	3,84	0,00
OSH15-Protein (Homöoboxgen)	Os07g0129700	–1,14	0,24	3,75	0,00
Protein der Efflux Carrier-Familie	Os05g0481900	–1,13	0,46	3,69	0,00
Protein der UDP-Glucosyltransferase-Familie	Os07g0490100	–1,20	0,40	3,68	0,00
basische Region Leucin-Zipper	Os07g0182000	–1,37	0,11	3,65	0,00
Protein der Zink-Knuckle-(CCHC-Typ) Familie	Os01g0775100	–1,04	0,78	3,29	0,00
Multitransmembranprotein	Os01g0700100	–1,14	0,38	3,19	0,00
Serin/Threonin-Proteinkinasen	Os08g0501000	–1,26	0,25	3,15	0,00
FYVE/PHD-Zinkfinger-Domäne enthaltendes Protein	Os03g0421000	–1,28	0,30	3,05	0,00

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das IAA2-ähnliche Polypeptid eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Zugangsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311) und das durch SEQ ID NO: 22 dargestellte Proteinmotiv umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das IAA2-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 2, SEQ ID NO: 23: (Q/G)LLDG(S/T)G(E/V)YTL (ii) Motiv 3, SEQ ID NO: 24: LLDGSGEYTLVY (iii) Motiv 4, SEQ ID NO: 25: KKLELRLGPPG, wobei die an einer Position in Klammern angegebenen Aminosäuren für alternative Aminosäuren an dieser Position stehen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A1 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A1 angegebenen Proteine kodiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise eine gesteigerte Biomasse und/oder einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsstress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach den Ansprüchen 1 oder 2 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 12, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 12 oder 13 bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, ergibt, oder transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 15 oder 17 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer ist.
Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 18, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 18 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 19 stammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die ein IAA2-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das NAC10-ähnliche Polypeptid eine NAM-Domäne (Pfam PF02365) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das NAC10-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv I: A/P/S/N/V/T T/V/L/I/A/S T/P/S/D/V/Q D/V/I/F I A/T/G/P, (ii) Motiv II: R/N/K E/G/S I/R/S/Q/A/V/L R/Q A/P N/S/R, (iii) Motiv III: C/Y R/K L/I/V S/Y/H/F/R N/K/Q K D/K/N/C/S/T/G/M/A/R
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A2 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einem der in Tabelle A2 angegebenen Proteine kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise eine gesteigerte Biomasse und/oder einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsstress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen oder einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem RCc3- oder einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem RCc3- oder einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 30, wobei die Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, werter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 31 erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach den Ansprüchen 22 oder 23 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 33, wobei eine der Kontrollsequenzen ein wurzelspezifischer oder ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein RCc3- oder ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein RCc3- oder ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 33 oder 34 bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Anspruch 33 oder 34 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 22 oder 23 kodiert, in eine(r) Pflanze und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid nach Anspruch 22 oder 23 kodiert, ergibt, oder transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 32, 36 oder 38 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer ist.
Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 39, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 39 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 40 stammen.
Vorwendung einer Nukleinsäure, die ein NAC10-ähnliches Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse, in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.