KR102336841B1 - 방사선 처리에 의해 유도된 내염성 증진 사료용 옥수수 140rs516 돌연변이체 - Google Patents
방사선 처리에 의해 유도된 내염성 증진 사료용 옥수수 140rs516 돌연변이체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 방사선 처리에 의해 유도된 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체에 관한 것으로, 구체적으로 옥수수 품종 KS140 라인에 방사선을 처리하여 유도된 돌연변이체로 염 처리시 생육이 우수한 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 식품 조성물, 및 사료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 방사선 처리에 의해 유도된 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체에 관한 것으로, 구체적으로 옥수수 품종 KS140 Inbred 라인에 방사선을 처리하여 유도된 돌연변이체로 염 처리시 생육이 우수한 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 식품 조성물, 및 사료 조성물에 관한 것이다.
작물 재배를 위해 관개(irrigation)를 하면, 농경지 내의 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 황산염, 염소 등의 수용성 염의 농도가 증가하게 된다. 염이 일정수준 이상 토양에 축적되면 작물이 뿌리를 통해 수분을 흡수하는 기능이 저하되고, 식물 세포가 정상적인 대사활동을 할 수 없게 된다.
염의 농도가 높으면 높을수록 식물로 흡수되는 수분의 양이 감소하기 때문에 작물의 생산량이 감소할 뿐만 아니라, 작물 자체가 아예 사멸하는 지경까지 이를 수도 있다. 이와 같은 염에 의한 피해는 작물의 생산성을 심각하게 제약하는 요인 가운데 하나로, 해결이 어려운 농학 분야의 난제 중에 하나이다.
특히, 대규모로 개발된 간척지에 완전히 제염이 되지 않아 염이 남아있는 지역에 재배가 가능한 내염성이 증진된 작물을 개발이 필요하다.
한편, 가축 및 이들이 생산하는 생산품은 인류가 생존하기 위해 필요한 단백질의 주요 공급원으로서, 가축의 사육 및 이용의 발전은 인류 건강과 생활의 질의 향상에 밀접한 관련이 있다. 가축을 사육하기 위한 사료는 현재 많은 부분 곡물이 사용되고 있고, 인구의 증가에 따라 곡물의 수요가 증대되어 사료용 곡물의 재배가 더욱 요구되고 있다.
가축을 위한 사료로는 주로 옥수수, 대두박, 참깨, 맥류 등이 사용되고 있는데, 옥수수를 비롯한 사료용 작물은 수입에 의존하고 있는 실정이다. 이에 사료용 작물의 자급율을 높이기 위하여 국내 대규모로 개발된 간척지와 같은 유휴지를 활용할 수 있도록 내염성이 증진된 사료용 작물의 개발이 필요하다.
따라서, 농경지의 염화 문제를 해결하기 위해 교배와 같은 품종 개량법을 통해 내염성 작물을 개발하려는 연구가 많이 진행되고 있으나, 뚜렷한 성과를 얻지 못했다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 내염성을 향상시키기 위한 사료용 옥수수를 제공하고자 예의 노력한 결과, 방사선 처리에 의해 유도된 140RS516 돌연변이체를 선발하였고, 상기 140RS516 돌연변이체는 염 처리시 발아 및 간장(stem length)의 생육이 우수한 증진된 내염성을 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체를 제공한다.
본 발명의 "내염성"은 식물체가 염이 집적된 농도에 견디어 생육할 수 있는 성질로, 염분이 높은 환경에 대한 식물의 저항성을 의미한다. 상기 "염(salt)"은 산의 음이온과 염기의 양이온이 정전기적 인력으로 결합하고 있는 이온성 물질인 화합물을 말하고, 염화나트륨을 주성분으로 하는 소금 결정도 염에 해당된다.
본 발명의 "사료"는 축산업에서 가축을 사육하기 위해 가축에게 공급되는 먹이 및 영양공급원을 의미하며, 본 발명의 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 제한되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용 가능하다. 상기 사료는 대부분 곡물을 이용하여 여러 형태로 가공된다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 사료는 옥수수일 수 있고, 보다 구체적으로 내염성이 증진된 사료용 옥수수 돌연변이체일 수 있고, 보다 더 구체적으로 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "옥수수 140RS516 돌연변이체"는 방사선 처리에 의해 유도된 사료용 옥수수 돌연변이체로 선발된 것이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 돌연변이체는 KS140 Inbred 라인에 방사선을 처리하여 유도된 옥수수 돌연변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체는 국립농업과학원(KACC)에 2019년 4월 9일에 기탁하여 수탁번호 KACC98063P를 부여받았다.
본 발명의 "방사선 처리에 의해 유도된 돌연변이체"는 식물체에 방사선을 조사하여 돌연변이의 빈도를 높여 그 중에서 유용한 변이체를 여러 세대에 걸쳐 선발 육성하는 것을 의미한다. 이는 1 내지 2개의 주요 특성을 변화시킴으로써 식물 다양성을 개선하고, 향상된 농업적 특성을 가지는 새로운 품종 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 "방사선"은 방사성 원소의 붕괴에서 방출되는 입자 또는 파동이 매질 또는 공간을 전파하는 과정으로서의 에너지 흐름을 의미한다. 상기 방사선은 크게 전리방사선(이온화 방사선)과 비전리방사선(비이온화 방사선)으로 구분된다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 방사선은 감마선(γ-ray)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "감마선(γ-ray)"은 전리방사선 중 하나이고, 투과력이 가장 강한 방사선이다. 따라서 파장이 짧고 에너지가 높다. 상기 "전리방사선"은 분자에서 입자를 분리시켜 전리(이온화)시킬 수 있는 방사선이다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 감마선은 100 내지 300Gy일 수 있으며, 보다 구체적으로 100Gy일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "돌연변이체"는 돌연변이가 일어난 유전자를 지닌 개체를 의미한다. 상기 돌연변이의 발생 원인은 식물체에 방사선을 조사하면 염색체나 DNA의 일부를 변화시킴으로 유전자 정보전달의 신호 체계가 바뀌게 되고, 이러한 변화가 일어난 세포에서 개체가 발생하면 돌연변이체가 된다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 140RS516 돌연변이체는 염처리 후 내염성 관련 유전자 ABF9-1, CIPK21-1 유전자의 발현이 증가되고, ABF9-2, CIPK21-2, CIPK31 유전자의 발현이 감소되는 특성이 있어 비돌연변이체와 비교하여 유전자 발현양의 차이가 있음을 확인하였다(실시예 4).
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 일 구현예에서 상기 140RS516 돌연변이체는 염처리 후 비돌연변이체보다 발아 및 간장(stem length)의 생육이 우수함을 확인하였다(실시예 5).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 "옥수수 140RS516 돌연변이체"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 "식품"은 사람이 먹을 수 있는 천연의 상태 또는 가공, 조리한 상태의 물품을 의미하며, 상기 식품의 종류는 특별이 제한되지 않고 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함게 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 "식품 조성물"은 식품학적으로 허용 가능한 성분을 추가로 포함하는 조성물을 말한다. 상기 식품 조성물에는 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 옥수수 돌연변이체를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 "옥수수 140RS516 돌연변이체", 및 "사료"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 "사료 조성물"은 가축을 사육하기 위해 반드시 공급되어야 할 필수 영양소, 에너지, 아미노산, 광물질, 비타민 및 물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 옥수수는 본 발명의 사료 조성물의 탄수화물 공급원으로서 사용된다. 상기 옥수수는 조섬유 함량이 낮고 소화율이 높아 기호성이 있는 사료 조성물일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 사료 조성물은 옥수수 돌연변이체를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명의 방사선 처리에 의해 유도된 내염성이 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체는 비돌연변이체에 비하여 염처리 후 생육 상태가 우수하여, 제염이 되지 않아 염이 남아있는 대규모 간척지 등 넓은 지역에 재배가 가능하고, 사료용 작물의 자급율을 높여 그 활용도가 높을 것으로 기대된다.
본 발명의 방사선 처리에 의해 유도된 내염성 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체는 제염이 되지 않아 염이 남아있는 대규모 간척지 등 넓은 지역에 재배가 가능하고, 특히 내염성 증진 사료용 옥수수를 개발하여 사료용 작물의 자급율을 높여 그 활용도가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 광평옥(F1)에 NaCl을 처리하고 이에 따른 내염성을 분석한 도이다.
도 2는 0.7% NaCl 처리 조건에서 방사선 돌연변이체 M5 계통의 내염성 증진 라인을 선발한 도이다.
도 3은 KS140 계통의 방사선에 의해 유도된 돌연변이체 140RS516의 염색체 상 변이가 일어난 유전자의 발현 양상을 분석을 위해 사용한 RT-PCR 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 KS140 계통의 방사선에 의해 유도된 돌연변이체 140RS516의 염색체 상 변이가 일어난 유전자의 발현 양상을 분석한 도이다.
도 5는 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석하기 위해 사용한 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 RT-PCR에 의한 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 7은 RT-qPCR에 의한 비돌연변이체와 돌연변이체의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 8a는 비돌연변이체 KS140의 NaCl 농도별 생육조사 결과를 나타낸 도이고, 도 8b는 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 생육조사 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 발아율 조사 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 줄기(stem)의 길이 조사 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 0.7% NaCl 처리 조건에서 방사선 돌연변이체 M5 계통의 내염성 증진 라인을 선발한 도이다.
도 3은 KS140 계통의 방사선에 의해 유도된 돌연변이체 140RS516의 염색체 상 변이가 일어난 유전자의 발현 양상을 분석을 위해 사용한 RT-PCR 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 KS140 계통의 방사선에 의해 유도된 돌연변이체 140RS516의 염색체 상 변이가 일어난 유전자의 발현 양상을 분석한 도이다.
도 5는 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석하기 위해 사용한 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 RT-PCR에 의한 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 7은 RT-qPCR에 의한 비돌연변이체와 돌연변이체의 내염성 관련 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 8a는 비돌연변이체 KS140의 NaCl 농도별 생육조사 결과를 나타낸 도이고, 도 8b는 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 생육조사 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 발아율 조사 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516의 NaCl 농도별 줄기(stem)의 길이 조사 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 방사선 처리에 의한 사료용 옥수수 돌연변이 유도
1-1. 물리적 처리에 의한 돌연변이 유도
돌연변이 집단 품종으로 KS140(모) Inbred 라인을 선별하고, 방사선(γ-ray) 100, 200, 300Gy 처리 후 발아 및 생육상태 조사 결과 100Gy에서 가장 생육 상태가 좋음을 확인하였다.
1-2. 방사선 100Gy를 처리한 옥수수 포장 증식
KS140(모) Inbred 라인에 100Gy 방사선을 처리한 종자를 포장에 파종하여 45일 후 생육상태를 조사한 결과, 일부 형태적 변이는 있었지만, 대부분 생육에 문제가 없음을 확인하였다.
또한, 파종 3개월 후부터 교배를 시작하여 약 1개월 동안 교배하여 돌연변이 종자(M2)를 수확하였다.
자가 교배에 의해 M5 세대 진전된 종자를 사용하여 RT-PCR 등의 분석을 수행하였다.
실시예 2. 돌연변이체 사료용 옥수수 내염성 증진 계통 선발
2-1. 내염성 증진 돌연변이체 선발을 위한 염 농도 조건의 탐색
내염성 옥수수 돌연변이체 선발을 위한 예비 검정을 위해 광평옥(F1)을 사용하였다. NaCl 농도별 75mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM에 대해 광평옥의 생육 상태를 조사하였다(도 1).
발아 7일 후, NaCl 농도 별 처리하여 2주간 키운 다음 회복을 위하여 물을 주어 생육 상태를 조사한 결과, 농도별 생육 차이는 있었지만 250mM 에서 점차 고사됨으로 F1 내염성 분석을 위해서 적정 선발 농도임이 확인되었다.
발아 시부터 NaCl 농도별 포트에서 재배하여 생육 상태를 조사한 결과, 생육의 차이는 있었지만 125mM 에서 생육상태가 좋지 않으므로 Inbred 옥수수 돌연변이체 내염성 선발 농도로 적합함을 확인하였다.
2-2. 내염성 증진 돌연변이체 선발을 위한 온실 내 선발 방법 개발
방사선 처리에 의해 KS140 계통에서 자가 교배 M2 계통을 수득하였다. 온실 내에서 50공 포트에 계통당 20개의 종자를 파종하여 3주간 재배하는 동안 총 7L의 0.7% NaCl 농도에서 재배하여 선발하였다.
방사선 처리에 의하여 얻어진 돌연변이체에 대해 0.7% NaCl에서 생존하는 라인을 선발하였다. 선발된 Inbred 계통 KS140 약 10 계통 M3 종자 확보를 위해 자가 교배 후 종자를 수확하였다.
2-3. 방사선 처리에 의해 확보된 M2, M3, M4, M5 종자의 내염성 분석
방사선 처리에 의해 얻어진 각 계통 별 자가 교배에 의해 M2, M3, M4, M5 종자를 확보하였다.
온실에서 50공 플레트에 0.7% NaCl 농도에서 3주간 처리하여 내염성이 증진된 계통을 선발하였다.
2-4. 방사선 처리에 의해 수득된 돌연변이체들 중 내염성이 증진된 라인 선발
방사선 처리에 의해 얻어진 돌연변이체들 중에서 0.7% NaCl 처리 후 10계통의 KS140 M3 계통을 1차로 선발하였다(도 2).
실시예 3. 기내 배양에 의한 내염성 증진 돌연변이체 선발
기내 배양에 의한 선발 조건 확립을 위하여 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516에 대해 염 농도별(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 %) 발아 상태를 조사하였다.
이에, 비돌연변이체와 돌연변이체의 내염성 증진 관련 유전자의 발현 양상 분석 등에 이용된 염 처리 재료는 25℃ 기내에서 0.5% NaCl이 첨가된 배지에서 10일 정도 재배한 후 샘플링하여 사용하였다.
실시예 4. 내염성 증진 사료용 옥수수 돌연변이체를 이용한 내염성 관련 유전자들의 특성 규명
4-1. 내염성 증진 돌연변이체의 유전변이 분석
비돌연변이체와 내염성 증진 돌연변이체의 유전적 변이 분석을 위하여 각 계통의 DNA를 추출하여 유전체재해석(resequencing) 분석을 의뢰하였다. 그리고 상기 비돌연변이체와 돌연변이체들의 유전체재해석 결과를 이용하여 돌연변이체에서 변이된 영역 및 관련 유전자를 탐색하였다(표 1).
유전체 재해석을 위한 비교 데이터는 Zea mays inbred line B73 (http://plants.ensembl.org/Zea_mays/Info/Index, AGPv4, RefGen_v4)을 활용하였다.
KS140 계통의 내염성 증진 돌연변이체의 유전체재해석 후 비돌연변이체와 돌연변이체의 변이 영역을 비교 분석한 결과, 3곳의 아미노산 변이와 유전자 관련 변이 26곳 외 intergenic 영역에 302곳의 변이가 발생하여 전체적인 변이가 328개로 확인되었다.
돌연변이체들의 유전체재해석 결과, 사료용 옥수수의 염색체 상에 SNP 또는 Indel이 발생한 영역은 intron 영역에 18곳, 5'UTR 영역에 3곳과 3'UTR 영역에 1곳에서도 변이가 확인되었다.
4-2. 내염성 증진 돌연변이체에서 탐색된 유전자의 특성 및 기능 분석
비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 NaCl 처리에 의해 발현양상 분석을 위하여 무처리구와 0.5% NaCl 처리 조건에서 10일간 자란 샘플을 이용하였다.
내염성 증진 돌연변이체의 유전 변이가 일어난 유전자의 발현 양상 분석을 위해 RT-PCR에 이용된 샘플은 기내 배양에 의해 재배된 0.5% NaCl 처리된 샘플에서 RNA를 추출하였다. 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140R516의 잎에서 total RNA를 추출하여 Sprint RT Complete-OligodT(Clontech) 를 이용하여 first-strand cDNA를 합성하였다. BioRad C1000 PCR 기를 이용하여 PCR 반응 cycle은 98.0℃에서 5분간 해리시킨 후 98.0℃에서 30초간 58.0℃에서 30초간 다시 72.0℃에서 1분 동안 반응시켜 30회 반복하고 마지막으로 72.0℃에서8분간 반응시켰다. 도 3에 나타낸 프라이머(primer) 서열을 사용하여 PCR 한 후 1% agarose에 전기영동하여 발현량을 확인하였고, 결과 분석은 Actin 유전자를 기준으로 비교 분석하였다(도 4).
140RS516 돌연변이체에 아미노산 변이를 초래한 ATP synthase subunit gamma mitochondrial 유전자는 alanine(A)이 glycine(G)으로 변이가 발생하였으며, RT-PCR 반응 결과, ATP synthase subunit gamma mitochondrial은 비돌연변이체와 140RS516 계통에서 염처리 전 비돌연변이체에서 발현량이 많았으며 염 처리 후에는 비돌연변이체는 발현량이 감소하였지만, 140RS516 계통에서는 발현량이 증가하였다.
또한 serine/threonine-protein kinase AGC1-5 유전자는 leucine(L)이 glutamine(Q)으로 변이가 일어남을 확인하였고, RT-PCR 반응 결과 비돌연변이체에서는 염처리 후 발현량이 감소하였으며, 140RS516 계통은 염처리 전과 후에서 적은 양이 발현됨을 확인하였다.
아미노산 변이를 초래하지는 않았지만, 5'UTR과 intron에 SNP 또는 Indel 변이가 발생한 유전자들에 대해 RT-PCR에 의한 발현 분석 결과 유전적 변이가 일어난 전체 28개의 유전자들 중 내염성 스트레스와 관련이 있는 3개의 유전자 COP1, YABBY, Aldo-keto reductase 등은 염처리 후 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516 계통간의 RT-PCR에 의해 발현 양상을 분석한 결과 140RS516 계통은 비돌연변이체에 비해 발현량이 감소하는 것을 확인하였고, 염처리 후에는 비돌연변이체와 140RS516 계통 모두 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
RNA binding protein, Pentatricopeptide protein은 염 처리 전에는 140RS516 계통이 비돌연변이체에 비해 발현량이 약간 적음을 확인하였고, 염 처리 후에는 비돌연변이체에서는 발현량이 감소하였지만, 140RS516 계통은 발현량에 변화가 없음을 확인하였다.
또한 Belclin-1-like protein, Xylem bark cystein, STRUBBELIG-receptor 유전자에서도 비돌연변이체에 비해 140RS516 계통에서 염 처리 전 발현량이 적었다. 염 처리 후, 비돌연변이체와 140RS516 계통 모두 염 처리 전과 발현량에는 차이가 없음을 확인하였다(도 4).
4-3. 비돌연변이체와 돌연변이체 간 내염성 관련 유전자의 발현양상 분석
돌연변이체와 비돌연변이체에서의 내염성 관련 유전자의 발현양상 분석을 위하여 0.5% NaCl이 첨가된 배지를 기내 배양에 각각의 재료를 10일 정도 재배하여 RNA 추출 후 RT-PCR을 수행하였다(도 6).
내염성 관련 5개의 유전자(ABF9-1, 2, CIPK21-1, 2, CIPK31)를 사용하였고, PCR 수행에 사용된 각각의 프라이머 서열은 도 5에 나타내었다. 각각의 유전자 발현 정도를 보정하기 위하여 상시 발현되는 Actin 유전자를 이용하여 비돌연변이체와 내염성이 증진된 돌연변이체에서의 발현양상을 RT-qPCR 결과를 바탕으로 분석하였다(도 7).
RT-qPCR 반응 방법은 각 샘플의 RNA를 cDNA 합성 kit (cDNA EcoDryTM, Clontech cat# 639543)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 10배 희석시킨다. 유전자 반응은 상기 kit의 프로토콜에 따라 반응시키고, 각각 3번 반복한다. RT-qPCR 기는 BioRad CFX96 기기를 사용하였고, 반응을 실시 하였다. PCR 반응 cycle은 95.0℃에서3분간 해리시킨 후 95.0℃에서 10초간 55.0℃에서 10초간 다시 72.0℃에서 30초 동안 반응시켜 40번 반복한 분석 결과는 Actin 유전자를 기준으로 결과를 비교 분석하였다.
발현 양상을 분석한 결과, 비돌연변이체의 경우 ABF9-1, CIPK21-1, CIPK21-2 에서는 염 처리 후 발현량이 현저히 감소하였고, ABF9-2는 약간 증가하였고, CIPK31은 발현량에 변화가 없었다. 돌연변이체 140RS516 계통은 염 처리 전보다 염 처리 후 ABF9-1, CIPK21-1 유전자들에서는 발현량이 약간 증가됨을 확인하였고, ABF9-2, CIPK21-2와 CIPK31은 발현량이 염 처리 후 감소됨을 확인하였다(도 6 및 도 7).
이를 통해, 비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516 계통간 발현 패턴에는 많은 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 5: 내염성이 증진된 돌연변이체 생육 특성 분석
5-1. 비돌연변이체 KS140과 돌연변이체 140RS516 계통 NaCl 처리에 의한 내염성 분석
방사선 처리에 의해 얻어진 내염성 증진 돌연변이체 140RS516 계통의 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5% NaCl 농도별 처리 후 10일간 기내 배양 후 발아율 및 간장(stem 길이)을 조사하였다.
0.1% NaCl 처리구에서만 비돌연변이체가 돌연변이체 140RS516에 비해 생육이 좋았으나 나머지 처리구에서는 돌연변이체 140RS516의 생육이 좋은 것을 확인하였다(도 8a 및 8b).
비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 기내배양에 의한 발아율 조사 결과, 0, 0.1, 0.2% NaCl 에서는 100% 발아 되었고, 0.3, 0.4, 0.5% NaCl 처리구에서도 80% 이상의 발아율을 확인하였다.
비돌연변이체의 경우, 0.1% NaCl 처리구에서만 100% 발아율을 보였고, 0.3% NaCl 처리구에서는 60%의 발아율을 보여 염 처리에 의해 생육 상태가 좋지 않음을 확인하였다(도 9).
비돌연변이체와 돌연변이체 140RS516의 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5% NaCl 농도별 처리 후 10일간 기내 배양 후 간장을 조사한 결과, 0.1% NaCl 처리구에서만 비돌연변이체가 돌연변이체 140RS516에 비해 간장이 길었으나, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5% NaCl 농도별 처리구에서는 돌연변이체 140RS516의 간장이 비돌연변이체에 비해 더 길게 자란 것을 확인하였다(도 10).
이를 통해, NaCl 처리 후 발아율 및 간장을 비교한 결과, 돌연변이체 140RS516이 비돌연변이체에 비해 발아율이 높고 줄기가 길게 자란 결과를 통해 생육이 더 우수함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방사선 처리에 의해 유도된 내염성 증진된 사료용 옥수수 140RS516 돌연변이체는 제염이 되지 않아 염이 남아있는 대규모 간척지 등 넓은 지역에 재배가 가능하고, 특히 내염성 증진 사료용 옥수수를 개발하여 사료용 작물의 자급율을 높여 그 활용도가 높을 것으로 기대된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- 내염성이 증진된, 기탁번호 KACC98063P로 기탁된 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 방사선 처리에 의해 유도되는 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제3항에 있어서, 상기 방사선은 100Gy γ-ray인 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 옥수수는 사료용 옥수수인 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체는 KS140 inbred 라인에 방사선을 처리하여 돌연변이가 유도된 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체는 염처리 후 내염성 관련 유전자 ABF9-1, CIPK21-1 유전자의 발현이 증가되는 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체는 염처리 후 내염성 관련 유전자 ABF9-2, CIPK21-2, CIPK31 유전자의 발현이 감소되는 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 옥수수 140RS516 돌연변이체는 염처리 후 비돌연변이체보다 발아 및 간장(stem length)의 생육이 우수한 것인, 옥수수 140RS516 돌연변이체.
- 제1항의 기탁번호 KACC98063P로 기탁된 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는, 식품 조성물.
- 제1항의 기탁번호 KACC98063P로 기탁된 옥수수 140RS516 돌연변이체를 포함하는, 사료 조성물.
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