CN102732532A - 一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的用途。提高水稻多种抗逆性的基因为OryzasativaHeatShockProtein18（OsHSP18），其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。将SEQ ID NO：1所述基因全长编码序列插入到真核载体中，获得本发明所述OsHSP18基因过量表达真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得OsHSP18过表达转基因植株。实验表明：本发明所述OsHSP18基因在水稻受热、旱、盐、低温胁迫时表达水平明显升高，其过量表达转基因水稻能够增强植株对多种逆境（高温、干旱、盐、冷害）的抵抗能力，且对株高、分蘖等农艺性状没有明显影响，因而可在作物抗逆性状改良中应用。

Description

一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种增强水稻热、旱、盐、冷抗逆性的基因在作物性状改良中的应用。

背景技术

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是1962年在研究果蝇唾液腺时发现的，它是机体受到高温胁迫时所产生的用以防御机体细胞损伤的一类蛋白质(Lindquist等,Annual Review of Genetics,1988)，并在蛋白质折叠、细胞内转运、降解过程以及信号转导途径中发挥重要作用，因而热激蛋白高度保守、广泛分布于各种生物体中。在真核生物，根据热激蛋白分子量大小将其分为：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和small HSP(sHSP)五个家族(Vierling,Annual Reviewof Plant Physiology and Molecular Biology，1991)。小分子热激蛋白sHSPs是一组分子量为12~43kD、在C端含有一个保守ACD结构域(α-crystallin domain)的蛋白质(Perez等,Plant Physiology,2009)。大多数sHSP在高温等胁迫条件下诱导表达(Lopez等,BMC Genomics,2007)，通过形成sHSP聚合体与逆境胁迫下细胞内所产生的损伤蛋白结合以防止其聚集失活，并在依赖ATP的条件下与HSP100/HSP70和HSP60相互作用，帮助受损蛋白重新折叠，恢复其生物学功能，达到维持生物体高温等逆境条件下正常生命活动的作用(Sarkar等,BMCGenomics,2009)。

植物的小分子热激蛋白趋向于独立进化，通过基因扩增(gene duplication)机制形成相较于动物更多的sHSP。这些植物特有的多样的sHSP可能在陆生植物适应固着生活环境中热、旱等不利条件的过程中进化形成。多数小分子热激蛋白均可在热胁迫下诱导表达，是植物热胁迫应答蛋白的主要成分，一些小热激蛋白也可对冷、旱、盐甚至紫外线以及有毒物质、过氧化物和病虫害等胁迫产生反应(Gorovits等,Molecular Plant-Microbe Interactions,2004)。Harrington等(PlantPhysiology，1988)对人工培养的烟草细胞进行盐诱导，发现盐诱导下能产生一种小热激蛋白，使细胞抗盐性提高。Moynihan等(Plant Physiology，1995)的报道表明，经过高温处理的一些植物会具有一定的抗寒性，并认为是热诱导表达的小分子热激蛋白通过维持蛋白质正常结构功能，提高了植物的抗寒能力。Wehmeyer等(Plant Physiology，2000)的研究发现，拟南芥种子发育后期脱水过程中，以及热诱导后小分子热激蛋白基因HSP17.4可大量表达，进而提高种子和植株的抗旱性，而在旱敏感突变株中HSP17.4的表达量则很低，表明小分子热激蛋白基因HSP17.4可能同时具有抗热、抗旱功能。

近年来，全球范围内极端天气出现的频率、强度和不可预期性趋于加剧。在我国，这种强度、持续时间不确定性的夏季高温伏旱、秋冬春连旱、春秋季低温冷害均严重影响农业生产与粮食安全，因而对作物多种逆境耐受能力提出更高要求，可集约增强多逆境抗性的基因的鉴定与应用也受到更多关注。在这一方面，转录因子因具有调控下多途径基因表达作用而有其优势，但这些同时开启的调控途径又可能导致产生不利农艺性状的负面效应。如在转基因植株中过量表达水稻转录因子OsNAC6(Nakashima等,Plant Journal,2006)可以同时提高其旱、高盐和稻瘟病菌抵御能力，但这种转录调控又使植株矮化产量降低，抵消了其正面效应，不利于生产应用。因此，现有报道表明，鉴定具多逆境交叉抗性的植物小分子热激蛋白有重要意义。

在重要粮食作物水稻(Oryza sativa)中，Ouyang等(Plant Molecular Biology，2009)进行的热诱导实验发现，水稻小分子热激蛋白家族的多个基因均可在高温条件下表达，响应热胁迫信号。这些小分子热激蛋白是水稻自身基因资源，基因序列短易于克隆和遗传操作，但哪些小热激蛋白基因具有提高水稻抗热能力还未从分子水平进行鉴定，它们是否同时具有抗旱、盐等逆境功能，它们的表达是否影响水稻的其它主要农艺性状表型，如何应用于水稻等重要粮食作物抗逆性状改良等尚待研究。

发明内容

本发明的目的是在于提供一个提高水稻抗逆性的功能基因，所述基因的过量表达可增强水稻对热、旱、盐和冷害的抵抗能力。

本发明的技术方案如下：

本发明所述提高水稻抗逆性的基因，命名为OsHSP18(Oryza sativa HeatShock Protein18)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。该基因的克隆：根据GenBank中水稻mRNA序列(登录号：AK119261)，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计2对巢式PCR特异引物。从水稻叶片中提取总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)技术从水稻中分离到OsHSP18基因编码序列。

本发明所述OsHSP18基因过表达真核重组质粒，是将SEQ ID NO：1所述基因全长编码序列插入到真核表达载体pHB中获得。

将上述过表达重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明：相较于野生型植株，过量表达OsHSP18的转基因植株对热、旱、盐和冷害的抵抗能力明显增强。因此，本发明所述基因具有提高水稻抗逆性的作用，可在作物性状改良中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为提高水稻对多种逆境(高温、干旱、盐、冷害)抵抗能力的性状改良提供了一种新的功能基因资源。

2、本发明所用基因为水稻本身自有基因，所以转基因水稻的安全性能高。

3、本发明所述基因编码序列短，易于克隆和基因工程操作。

4、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1是水稻小热激蛋白基因OsHSP18在多种逆境胁迫条件(图1A)、激素诱导(图1B)和田间生长成熟植株各组织中(图1C)的表达情况。A：从左至右依次为：OsHSP18在正常生长条件(28°C)、高温(38°C处理3h;45°C处理48h)、盐(100mM NaCl处理48h;38°C,3h后100mM NaCl处理48h;200mM NaCl处理48h;38°C,3h后200mM NaCl处理48h)、旱(干旱处理48h;38°C,3h后干旱处理48h)、低温(4°C处理48h;38°C,3h后4°C处理48h)条件下的表达水平；B：从左至右依次为：OsHSP18在无植物激素正常生长条件下(WT)、20mg/mL赤霉素(GA)、10mg/mL萘乙酸(NAA)、10mg/mL脱落酸(ABA)诱导72h时的表达水平；C：从左至右依次为：OsHSP18在生长于光照培养箱(28°C,12h光/12h暗)的野生型日本晴幼苗叶片、田间(午间室外温度40°C)成熟植株根、茎、节、叶和颖花中的表达水平。

图2是OsHSP18基因植物过表达载体pHB-OsHSP18的构建。A：OsHSP18基因过表达真核重组质粒pHB-OsHSP18构建示意图；B：重组质粒pHB-OsHSP18酶切鉴定图。图中，从左至右第1泳道为DNA分子标记，Trans2Kplus，第2泳道为pHB-OsHSP18质粒Pst I、Xba I双酶切结果。

图3是OsHSP18过表达转基因植株鉴定结果。A：转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果。图中，M：DNA分子标记,DL2000；1：阴性对照，PCR模板为野生型植株基因组DNA；2：阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-OsHSP18；3-5：PCR模板为3个独立转基因植株OX-1、OX-2、OX-3基因组DNA。B：从左至右依次为：野生型(WT)、3个独立转基因株系幼苗(OX-1～OX-3)正常生长条件下(28°C，12h光/12h暗)OsHSP18的表达水平；C：从左至右依次为：野生型(WT)和转基因株系幼苗(OX-1)在28°C和38°C,3h、45°C,3h诱导条件下OsHSP18的表达水平。

图4是OsHSP18过表达转基因植株表型。A：野生型(WT)、OsHSP18过表达转基因株系(OX-2)谷穗；B：野生型(WT)、OsHSP18过表达田间植株(OX-1～OX-3)秕谷率；C：野生型(WT)、OsHSP18过表达转基因株系(OX-2)谷粒；D：抽穗灌浆期田间温度，图中标灰区域(2011.7.20～2011.7.25)为抽穗期田间温度。

图5是野生型(WT)、OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗在高温条件下生长情况。A：45°C,12h/28°C,12h处理3天；B：45°C,12h/28°C,12h处理21天；C：野生型、转基因株系在高温处理21天后的苗长、根长增长率；D：野生型、转基因株系在高温处理21天后整株、绿色存活部分干重。

图6是野生型(WT)、OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗在干旱条件下生长情况。A：15%PEG6000处理1天；B：干旱(加入少量蒸馏水)处理3天(左)、14天(右)；C：野生型、转基因株系的失水率；D：日本晴(WT)和7个干旱品种(1～7依次为zhang me lang、阿摸切、dulong-2、切加巴、modelong-2、modelong-1、沪旱3号)正常生长条件下(28°C,12h光/12h暗)幼苗中OsHSP18的表达水平。

图7是野生型(WT)、OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗在盐胁迫条件下生长情况。A：100mM NaCl处理5天(左)、7天(中)、14天(右)幼苗；B：100mM NaCl处理7天、14天苗长、根长增长率。

图8是野生型(WT)、OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗在4°C低温条件下生长21天时生长情况和茎叶、根的干重。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook Russell的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：水稻OsHSP18基因的克隆

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY^TM-BluntSimple Cloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare)种子由四川省农业科学院繁育提供。

3、培养基和溶液

LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基:胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基:SOB+20%葡萄糖。

100×Mg²⁺溶液:20.33g MgCl₂.6H₂O和24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mLH₂O，高压灭菌。

20%葡萄糖溶液:20g葡萄糖定容于100mL H₂O，过滤除菌。

4、方法

4.1水稻叶片RNA提取

1）取新鲜水稻叶片，加入液氮研磨成粉状，迅速转移100-200mg粉末于不含RNase的1.5mL Ep管中，即刻加入1mL Trizol提取液混匀，振荡10s，室温下放置5min；

2）加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置2-3min；

3）4°C，12000g离心15min，吸取上清约600μL至新EP管中，加入0.6mL异丙醇，室温下放置10min；

4）4°C，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇冲洗两次，4°C，7500g离心5min；

5)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，溶于50μL RNase-free ddH₂O中，保存于-80°C中备用。

4.2RT-PCR

4.2.1RT

1）取1μg总RNA与1μL polyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75μL，轻轻混匀；

2）65°C保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3）加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，ReverTra Ace反转录酶1μL(100U/μL)，42°C1h，合成第一链cDNA；

4）95°C加热5min，失活反转录酶，终止合成反应。

4.2.2PCR

水稻OsHSP18基因的克隆

将200μL EP管放置于冰上，加入以下试剂：

按以下程序进行扩增：98°C2min(预变性)；98°C10s(变性)，56°C10s(复性)，72°C60s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72°C5min(总延伸)。

以上述PCR产物为模板，以引物HSP18-F2和HSP18-R2进行第二轮PCR，复性温度58°C，延伸时间50s，其它条件同上。

引物序列如下：

HSP18-F1:5’-GAAGGAGAGCGAGAGAGCAA-3’

HSP18-R1:5’-ACCGAAACACGAACAGAGCA-3’

HSP18-F2:5’-CTGCAGAGTTGGTAGCCATGACGGAG-3’

HSP18-R2:5’-TCTAGACCCGAGCACTACGCTATGA-3’

通过上述操作，获得了OsHSP18基因PCR扩增产物。

4.3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接

将由上述4.2所述获得的OsHSP18基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector按摩尔分子数比2：1连接(25°C，10min)，连接体系如下：

pEASY^TM-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL)    1μL

PCR产物(～150μg/μL)                             2μL

4.4大肠杆菌转化

1）从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；

2）将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3）42°C热冲击90s，立即冰浴1-2min；

4）加入0.8mL SOC，混匀，37°C温和振荡培养1h；

5）室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37°C培养过夜。

4.5快速裂解法鉴定重组克隆

1）挑取单克隆接种于500μL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37°C振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8；

2）取200μL菌液至0.5mL EP管中，13000rpm离心1min，去上清，留约20μL上清；

3）加入20μL2×快速裂解液(0.2M NaOH50mL，SDS0.5g,蔗糖27.2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；

4）13000rpm离心15min；

5）取5μL上清直接电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

将4.5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

反应条件：94°C3min(预变性)；94°C30s(变性)，58°C30s(复性)，72°C50s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72°C5min(总延伸)。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-OsHSP18，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的OsHSP18基因全长编码序列。

实施例2：水稻OsHSP18基因表达模式分析

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；实时定量PCR试剂TransStart^TM Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

2、方法

取在多种逆境胁迫条件、激素诱导下野生型日本晴幼苗以及成熟植株各组织样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1所述。

以水稻内参基因(ACTIN，Genbank登录号X16280)为对照，进行OsHSP18基因表达水平的实时定量PCR分析。OsHSP18基因定量PCR引物为：RT18F和RT18R；ACTIN基因定量PCR引物为：RTACTF和RTACTR。引物序列如下：

RT18F：5’-CGCCTGAATCATAGCGTAGTGC-3’

RT18R：5’-CACAAACACATTCTACTGCTCCAAC-3’

RTACTF：5’-AGTGATTGCACCACCAGAAAGA-3’

RTACTR：5’-CAGGACCAGATTCATCATACTCG-3’

实时定量PCR反应体系如下：

反应条件：95°C30s；95°C5s，60°C15s，72°C10s，40个循环。扩增后，65°C5s，每个循环增加0.5°C，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-Rad CFX96上运行。

3、结果

3.1OsHSP18基因在多种逆境胁迫下的表达

实时定量PCR实验结果表明，如图1A所示，在高温(38°C、45°C)、盐(100mMNaCl、200mM NaCl)、干旱(加入极少量水分)、低温(4°C)胁迫条件下，OsHSP18的表达量均显著提高，且在38°C,3h热诱导以后再进行相应各种胁迫处理时，除低温外OsHSP18的表达量均有不同程度增加。

3.2OsHSP18基因在激素诱导下的表达

实时定量PCR实验结果显示，OsHSP18在植物激素20mg/mL赤霉素(GA)、10mg/mL萘乙酸(NAA)、10mg/mL脱落酸(ABA)诱导3天时表达均提高，尤其是ABA诱导时表达量增加更明显，见图1B。

3.3OsHSP18基因在成熟植株各组织中的表达

如图1C所示，与培养箱中(28°C,12h光/12h暗)生长的野生型日本晴幼苗相比，生长于田间(午间室外温度40°C)的野生型成熟植株根、茎、节、叶和颖花中OsHSP18的表达量升高，其中在根、节、颖花中表达水平较高，在颖花中最高。

实施例3：OsHSP18基因过表达重组质粒的构建

1、试剂

质粒提取试剂盒EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购于北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Pst I、Xba I、T4连接酶购于TaKaRa公司。

其它进口分装、常规试剂与实施例1相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

用于转基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105购于Clontech公司；真核表达载体pHB由上海交通大学杨洪全教授实验室构建(Mao等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005)提供。

3、培养基

YEB培养基:酵母提取物1g/L，牛肉膏5g/L，蛋白陈5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄.7H₂O0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

4、方法

4.1质粒微量提取

将由实施例1所获得已测序、连接于克隆载体pEASY^TM-Blunt Simple CloningVector的OsHSP18基因重组质粒pEASY-OsHSP18进行质粒提取，提取过程按照生产商建议程序进行。

1）将带有重组质粒pEASY-OsHSP18的大肠杆菌接种于裝有5mL LB培养液(含有100μg/mL氨苄青霉素)的试管中，37°C培养12h；

2）取3mL菌液，室温下10000g离心1min，吸尽上清。加入250μL含有RNaseA的无色重悬液RB(Resuspension Buffer)，漩涡振荡重新悬浮大肠杆菌；

3）加入250μL蓝色裂解液LB(Lysis Buffer)，温和翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；

4）加入350μL黄色中和液NB(Neutralization Buffer)，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；

5）15000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6）15000g离心1min，弃去收集液；

7）加入650μL洗涤液WB(Wash Buffer)，15000g离心1min，弃去收集液；

8）15000g离心2min，彻底去除残留的WB；

9）将吸附柱置于干净离心管中，在吸附柱中加入50μL洗脱液EB(ElutionBuffer)，室温静置1min；

10）10000g离心1min，洗脱DNA。DNA溶液于-20°C保存。

4.2DNA片段酶切回收

用限制酶Pst I、Xba I分别双酶切实施例1所获得重组质粒pEASY-OsHSP18和植物表达载体pHB，然后进行胶回收。DNA回收过程按照生产商建议程序进行。

1）切取琼脂糖凝胶中的DNA片段，放入干净离心管中；

2）加入3倍体积琼脂糖凝胶溶解液GSB(Gel Solubilization Buffer)，于55°C水浴6-10min使胶块完全融化。当胶块完全融化后，观察溶液颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠(pH5.2)，使溶液呈黄色；

3）待凝胶溶液降至室温(高温时吸附柱结合DNA能力弱)，加入吸附柱中静置1min，10000g离心1min，弃去收集液；

4）加入650μL洗涤液WB(Wash Buffer)，10000g离心1min，弃去收集液；

5）10000g离心2min，去除残留的WB；

6）将吸附柱开盖静置1min，使残留乙醇挥发干净，在吸附柱中加入60°C预热50μL洗脱液EB(Elution Buffer)，室温静置1min；

7）10000g离心1min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20°C保存。

4.3回收片段连接转化

对上述4.2所回收pHB载体片段、OsHSP18基因片段进行连接。连接体系如下：

于16°C连接4h。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作步骤同实施例1中4.4。

挑取转化平板上所生长单克隆，如实施例1中4.6所述进行菌落PCR鉴定。然后将所鉴定转化阳性克隆如实施例2中4.1所述进行质粒提取。经Pst I、Xba I双酶切鉴定，如图2所示，获得OsHSP18基因过量表达重组质粒，命名为pHB-OsHSP18。

4.4农杆菌感受态细胞制备

1)挑取农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105单菌落于2mL YEB液体培养基(含50μg/mL利福平)中，28°C振荡培养过夜；

2)取过夜培养液500μL转接于50mL YEB(含50μg/mL利福平)液体培养基中，28°C振荡培养至OD₆₀₀=0.5；

3)4°C5000rpm离心5min收集菌体，加l0mL0.15MNaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；

4)4°C5000rpm离心5min收集菌体，用1mL预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10min；

5)所制备感受态细胞分装成200μL/管，液氮中速冻1min，置-80°C保存备用。

4.5农杆菌转化

1）取200μL农杆菌感受态细胞，冰上解冻；

2）加入1μg pHB-OsHSP18重组载体，轻弹混匀，冰浴30min；

3）液氮中速冻1min，37°C水浴5min，然后加入1mLYEB培养基，28°C慢速振荡培养4h；

4）将培养物涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28°C培养约48h。

4.6农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取如上4.5所述转化平板上生长的农杆菌单菌落，接种于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR鉴定。

鉴定结果表明，获得了可用于转基因的带有pHB-OsHSP18质粒的阳性农杆菌克隆。

实施例4：OsHSP18过表达转基因水稻植株的获得

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；实时定量PCR试剂TransStart^TM Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司。其它试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、培养基

常规用组织培养基：

基本培养基配方如下

有机成分须用滤器抽滤，分装后-20℃保存。

AAM培养基须用滤器抽滤，分装后-20℃保存。

诱导培养基：NB+2mg/L 2,4-D，pH5.8~5.9；共培养培养基：NB+2mg/L2,4-D+100μM乙酰丁香酮，pH5.2；筛选培养基：NB+2mg/L 2,4-D+250mg/L羧苄青霉素+30~50mg/L潮霉素，pH5.8~5.9；分化培养基：NB+10mg/L KT+0.4mg/L NAA+250mg/L羧苄青霉素，pH58~5.9；生根培养基：1/2MS，pH5.8~5.9。

3、方法

3.1农杆菌介导法转化水稻

3.1.1胚性愈伤组织的诱导及继代

水稻日本晴成熟种子手工去壳，75%乙醇消毒1min，25%次氯酸钠溶液中振荡消毒25min，灭菌蒸馏水冲洗3次，接种到诱导培养基上。27°C暗培养条件下诱导约7天愈伤组织形成，切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培养。共继代2次。

3.1.2农杆菌的培养及处理

从-80°C低温冻存管中刮取少量实施例3所获带有pHB-OsHSP18质粒的阳性农杆菌克隆菌液，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB固体培养基划线，然后在28°C暗培养48h活化。取活化平板上的单菌落转接划菌，28°C培养48h后，悬浮于20mL含有100μM乙酰丁香酮的AAM培养基中，剧烈摇动1min后，静置1h。

3.1.3共培养

选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述3.1.2处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25°C暗培养3d。

3.1.4洗除农杆菌

挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗至水中不见丝状菌体，以含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后将转化愈伤置于无菌滤纸上晾干，移至含有潮霉素的筛选培养基。

3.1.5愈伤组织的筛选

转化愈伤在筛选培养板上生长，每两周转板1次。共转板2次。

3.1.6抗性愈伤组织的继代与植株的再生

转化愈伤在筛选培养板上生长约3周后即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选瘤状抗性愈伤至分化培养基上。约2周后愈伤开始转绿，然后分化出幼苗。将幼苗移至生根培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基移至温室盆栽。

3.2转基因植株的鉴定

3.2.1水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因植株叶片提取基因组DNA。

1）取液氮研磨叶片细粉100mg于1.5mL EP管中，每管加入500μL 65°C预热的2×CTAB提取缓冲液（100mM Tris－Hcl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4MNaCl，40mM2-巯基乙醇，2％CTAB）混匀；

2）65°C水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿；

3）5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA；

4）12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀；

5）将沉淀溶于200μL灭菌ddH₂O中，加入RNase A(10mg/mL)，37°C保温30min。加入等体积的酚/氯仿，混匀；

6）12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min；

7）12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于100μL灭菌ddH₂O中。DNA溶液于-20°C保存。

3.2.2阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因植株基因组DNA为模板，利用载体所携带潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。

潮霉素抗性基因特异引物为：

HPTF：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3'

HPTR：5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3'

按以下程序进行扩增：94°C3min(预变性)；94°C30s(变性)，58°C30s(复性)，72°C20s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72°C5min(总延伸)。

3.2.3转基因植株OsHSP18基因定量PCR检测

分别取野生型、转基因植株叶片液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1所述。

取野生型、转基因植株cDNA，以水稻内参基因(ACTIN)为对照进行实时定量PCR分析，操作步骤如实施例2所述。

3.2.4转基因植株表型分析

将转基因阳性鉴定植株(OX-1～OX-3)与同期生长野生型植株(各两行，20株)进行田间性状测定。对转基因株系(OX-1～OX-3)、野生型幼苗(各15株)在不同胁迫生长条件下生长情况进行分析比较。

4、结果

4.1转基因水稻植株鉴定

4.1.1转基因阳性水稻植株鉴定

利用潮霉素抗性标记基因(Hpt)序列对转基因、野生型水稻叶片基因组DNA进行PCR扩增检测。阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，如图3A所示，而野生型植株未能扩增出目标条带。

4.1.2转基因阳性水稻植株OsHSP18基因表达分析

实时定量PCR分析结果显示，3个独立转基因植株(OX-1～OX-3)中OsHSP18基因较野生型显著提高，见图3B。对其中1个转基因株系OX-1在28°C、38°C和45°C诱导下OsHSP18的表达水平检测结果表明，在常温、高温条件下转基因株系中OsHSP18的表达量均高于野生型，见图3C。

4.2转基因水稻植株表型分析

4.2.1田间表型

对OsHSP18转基因植株的田间性状测定结果如表1所示，各转基因株系水稻株高、分蘖数、穗长、每穗粒数与同期平行种植野生型相比没有明显变化；抽穗期与野生型相同，但在田间较高温度气候条件下(抽穗扬花期35°C-40°C)，转基因株系较野生型秕谷率显著下降，见表1、图4，表明过表达OsHSP18转基因植株具有较好的抗高温胁迫能力，可以提高热害天气条件下水稻的结实率和产量，对株高、分蘖等农艺性状没有明显影响。

表1OsHSP18过表达转基因植株田间表型

4.2.2转基因植株高温胁迫抗性表型分析

OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗高温胁迫生长实验结果显示：在45°C,12h/28°C,12h高温处理短时间(3天)、较长时间(21天)时，转基因株系均显示较好的高温抗性，见图5A,B；高温处理21天后各转基因株系幼苗的苗长、根长增长率和整株、绿色存活部分干重均高于野生型，如图5C、5D所示，表明OsHSP18可以提高水稻高温胁迫抗性。

4.2.3转基因植株干旱胁迫抗性表型分析

OsHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗干旱胁迫生长实验结果表明：野生型幼苗在15%PEG6000模拟干旱处理1天后即出现明显萎蔫现象，而转基因株系表型均优于野生型见图6A；在缺水处理短时间(3天)、较长时间(14天)时，如图6B所示，转基因株系也均显示较好的干旱抗性，说明OsHSP18可以提高水稻干旱胁迫抗性。

失水率测算结果表明：转基因株系较野生型有更好的保水能力，见图6C。在一些抗旱水稻品种，如阿摸切、切加巴、沪旱3号中OsHSP18的表达水平较高，如图6D所示，提示部分抗旱品种的抗旱性可能与OHSP18基因有关。

4.2.4转基因植株盐、低温胁迫抗性表型分析

OHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗盐胁迫生长实验结果表明：在100mMNaCl处理5天、7天、14天时，如图7A所示，转基因株系的萎蔫情况，以及苗长、根长增长率，见图7B，均优于野生型，显示OHSP18可以提高水稻盐胁迫抗性。

OHSP18转基因株系(OX-1～OX-3)幼苗低温胁迫生长实验结果表明：在4°C下生长时，虽然苗长、根长的增长并不明显，但低温连续处理21天后转基因株系茎叶、根的干重均高于野生型，如图8所示，显示OsHSP18可以提高水稻低温胁迫抗性。

序列表

<110>合肥工业大学

<120>一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的应用

<160>2

<170>Patent In Version3.2

<210>1

<211>829

<212>DNA

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<221>mRNA

<222>(1)…(829)

<223>一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的应用

<400>1

attgctgcag tagcaagaag gagagcgaga gagcaaagcc caagttggta gccatgacgg 60

agctgttcga caccgccgtg accagcctcc tccacctgcc ggaggtgctc gaccgcctcg 120

gcgccgccgc cggggaccgc cgctcggcgg gcgaccacgc gcaccacgcc gcgcatggac 180

acggccagca ccgcatcagt ggaatcggtg gtggcgcgcc agtggacatc atggagaccc 240

ccggcgagta cgcgttcgtg ctcgacgtcc ctggcctctc caagtccgac atccaggtga 300

cgctggagga ggacagggtg ctggtgatga agagcagcaa tggcgccggg aacgggaagc 360

ggaagcggga ggaggaggaa ggggagtgca agtacatccg cctcgagcgc cgcgcgtcgc 420

cgagggcgtt cgcgcgcaag ttccgcctcc cggaggacgc ggacaccggc ggcatctcgg 480

cgcgatgcga gaacggggtg ctcacggtca ccgtcaagaa gcggccgccg ccggagaaga 540

agaccaagtc cgtccaggtc accatcgcct gaatcatagc gtagtgctcg ggtaatggca 600

gcgtggcggt agtagaagct ggaaatggtt gccgagaatg gttggagcag tagaatgtgt 660

ttgtgctctg ttcgtgtttc ggtagtacaa gttgtcgctg atctgctatg tataaacgct 720

ggtgtgaccg tgaagatgaa gactacggaa gtagctgttc ttttgtgtag gatcaagcaa 780

attatgtcaa atctcgttcg tgaacgattc caaatcgatg cattatgtt             829

<210>2

<211>389

<212>PRT

<213>水稻（Oryza sativa）

<223>一种提高水稻抗逆性的多肽

<400>2

MET Thr Glu Leu Phe Asp Thr Ala Val Thr Ser Leu Leu His Leu

1               5                   10                  15

Pro Glu Val Leu Asp Arg Leu Gly Ala Ala Ala Gly Asp Arg Arg

                20                  25                  30

Ser Ala Gly Asp His Ala His His Ala Ala His Gly His Gly Gln

                35                  40                  45

His Arg Ile Ser Gly Ile Gly Gly Gly Ala Pro Val Asp Ile MET

                50                  55                  60

Glu Thr Pro Gly Glu Tyr Ala Phe Val Leu Asp Val Pro Gly Leu

                65                  70                  75

Ser Lys Ser Asp Ile Gln Val Thr Leu Glu Glu Asp Arg Val Leu

                80                  85                  90

Val MET Lys Ser Ser Asn Gly Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Arg

                95                  100                 105

Glu Glu Glu Glu Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Arg Leu Glu Arg Arg

                110                 115                 120

Ala Ser Pro Arg Ala Phe Ala Arg Lys Phe Arg Leu Pro Glu Asp

                125                 130                 135

Ala Asp Thr Gly Gly Ile Ser Ala Arg Cys Glu Asn Gly Val Leu

                140                 145                 150

Thr Val Thr Val Lys Lys Arg Pro Pro Pro Glu Lys Lys Thr Lys

                155                 160                 165

Ser Val Gln Val Thr Ile Ala

                170

Claims (3)

1.提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的用途，所述提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因为Oryza sativa Heat Shock Protein 18，缩写为OsHSP18，其特征在于：所述OsHSP18为水稻小分子热激蛋白家族基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，可用于作物抗逆性状改良。

2.一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的过表达真核重组质粒，其特征在于：将权利要求1所述OsHSP18的核苷酸序列中基因全长编码序列插入到真核表达载体中获得，所述真核表达载体为pHB。

3. 一种提高水稻抗逆性的方法，其特征在于：将权利要求2所述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。

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