DE112008002525T5

DE112008002525T5 - Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112008002525T5
Application number: DE112008002525T
Authority: DE
Inventors: Valerie Frankard; Christophe Reuzeau
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2011-03-24
Also published as: RU2010115568A; AR068534A1; JP2010538670A; CA2700294A1; US20100199382A1; UA103176C2; MX2010002463A; ES2390523T3; BRPI0817027A2; CN101868544A; EP2193203A1; EP2193203B1; AU2008300478A1; AU2008300478B2; CN101868544B; WO2009037338A1

Abstract

Verfahren zur Erhöhung von pflanzlichen Ertragsmerkmalen, bei dem man die Expression von Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöht sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Erhöhung von verschiedenen Pflanzenertragsmerkmalen durch Erhöhung der Expression in Pflanzen von (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und von (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden erhöht sind: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer erhöhten Expression von (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und von (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einer der folgenden: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
Dadurch, dass die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft vorhanden ist, wird die Wissenschaft gezwungen, sich mit der Verbesserung der Schlagkräftigkeit der Landwirtschaft zu befassen. Bei traditionellen Mitteln für die pflanzen- und gartenbauliche Züchtung verwendet man Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Erbmaterial von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (typischerweise in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Pflanzen, auch Kulturpflanzen, mit verschiedenen erhöhten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen zu produzieren.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen von vielen Pflanzen wichtig für die menschliche und tierische Ernährung sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle von Zuckern, Ölen und vielen Arten von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimpflanzen). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; er erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
Die pflanzliche Biomasse bedeutet für Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu den Ertrag. In Getreidekulturen sind für den Ertrag viele Ersatzparameter verwendet worden. Unter diesen sind Schätzwerte für die Pflanzengröße am wichtigsten. Die Pflanzengröße kann je nach Art und Entwicklungsstadium auf vielerlei Art und Weise bestimmt werden; hierzu zählen Gesamtpflanzentrockengewicht, oberirdisches Trockengewicht, oberirdisches Frischgewicht, Blattfläche, Stängelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe sowie Anzahl der Blätter. Bei vielen Arten wird das Verhältnis zwischen der Größe von unterschiedlichen Pflanzenteilen zu einem bestimmten Entwicklungsstadium beibehalten. Diese allometrischen Beziehungen werden für die Extrapolation von einem dieser Messwerte auf einen anderen eingesetzt (z. B. Tittonell et al. 2005 Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße zu einem frühen Entwicklungsstadium korreliert typischerweise mit der Pflanzengröße zu einem späteren Zeitpunkt in der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren, und es ist daher wahrscheinlich, dass diese Pflanze über denselben Zeitraum mehr Gewicht zunimmt (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39), was zusätzlich zu der potentiellen Weiterführung des Vorteils bezüglich der Mikroumwelt bzw. des genetischen Vorteils, den die Pflanze hatte, um von vornherein die größere Größe zu erzielen. Bezüglich Pflanzengröße und Wachstumsrate existiert eine starke genetische Komponente (z. B. ter Steege et al. 2005 Plant Physiology 139: 1078), und es ist daher für verschiedene unterschiedliche Genotypen wahrscheinlich, dass die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen Bedingung korreliert (Hittalmani et al. 2003 Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumwelt als Ersatzparameter für die unterschiedlichen und dynamischen Umwelten, denen Kulturen auf dem Feld an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten begegnen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Kulturpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel von modernen Reiszüchtungsprogrammen für Sorten von tropischem Reis, aber auch Reis für gemäßigte Zonen. Lange Wurzeln sind wichtig für Reis, der in Wasser gesät wird, für eine ordentliche Verankerung im Boden. Dort, wo Reis direkt in angestaute Felder gesät wird und wo die Pflanzen rasch durch das Wasser auflaufen müssen, sind längere Triebe mit Vitalität assoziiert. Wird das Saatgut gedrillt, so sind längere Mesokotyle und Koleoptilen wichtig für eine gutes Auflaufen der Keimpflanzen. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität in Pflanzen mittels Gentechnik einzubringen, wäre in der Landwirtschaft von großer Wichtigkeit. So bildete zum Beispiel eine schlechte Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung für die Einführung von Maishybriden (Zea mays L.), die auf Erbmaterial des „Corn Belt” beruhten, in die europäische Atlantikregion.
Der Harvest Index, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, und man gelangt daher häufig zu einer guten Korrelation zwischen Pflanzengröße und Samenertrag (z. B. Rebetzke et al. 2002 Crop Science 42: 739). Diese Vorgänge sind deshalb intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der stattfindenden bzw. gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und Stängel der Pflanze abhängt (Gardener et al. 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Ein Selektieren auf Pflanzengröße bereits in frühen Entwicklungsstadien ist daher als Indikator für den potentiellen Ertrag in der Zukunft verwendet worden (z. B. Tittonell et al. 2005 Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen auf den Einfluss von genetischen Unterschieden auf Stresstoleranz ist die Fähigkeit, die Bodeneigenschaften, Temperatur, Verfügbarkeit von Wasser und Nährstoffen sowie Lichtintensität zu standardisieren, ein intrinsischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwuchskammerumwelten im Vergleich zum Feld. Künstliche Begrenzungen des Ertrags aufgrund von schlechter Bestäubung, die durch das Fehlen von Wind oder von Insekten verursacht wird, oder ungenügender Raum für das Wachstum der reifen Wurzeln oder der Bestandesdecke kann jedoch die Verwendung dieser kontrollierten Umwelten für das Austesten von Ertragsunterschieden einschränken. Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus sind daher Standardpraktiken, um einen Hinweis auf mögliche genetische Ertragsvorteile zu erhalten.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das der erhöhten Toleranz für abiotischen Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Erntesverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Salinität, Temperaturextrema, chemische Toxizität, Überangebot oder Mangel an Nährstoffen (Makro- und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die pflanzliche Toleranz für abiotischen Stress zu erhöhen, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben genannten Faktoren erhöht werden.
Je nach dem Endzweck kann man die Modifikation von bestimmten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu anderen bevorzugen. Für Anwendungen wie zum Beispiel Feldfutter- oder Holzproduktion oder als Quelle für Biokraftstoff kann zum Beispiel eine Zunahme der vegetativen Pflanzenteile wünschenswert sein, und für Anwendungen wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Zunahme bei den Samenparametern besonders wünschenswert sein. Auch unter den Samenparametern selbst können je nach Anwendungszweck manche im Vergleich zu anderen bevorzugt werden. Zur Erhöhung des Samenertrags können verschiedene Mechanismen beitragen, egal, ob in Form von erhöhter Samengröße oder erhöhter Anzahl an Samen.
Ein Ansatz für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen (Samenertrag und/oder Biomasse) bei Pflanzen kann durch Modifizieren der pflanzeneigenen Wachstumsmechanismen, wie des Zellzyklus oder von verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind, erfolgen.
Es wurde nun gefunden, dass verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen dadurch erhöht werden können, dass man die Expression von folgendem in einer Pflanze erhöht: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden erhöht sind: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Die erhöhten Ertragsmerkmale umfassen einen oder mehrere der folgenden Faktoren: erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhte Samenfüllungsrate, erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen, erhöhter Harvest Index sowie erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
Hintergrund der Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptide
Bei den DNA-Bindungsproteinen handelt es sich um Proteine, die beliebige von vielen DNA-Bindungsdomänen umfassen und so eine spezifische oder allgemeine Affinität für DNA aufweisen. Zu den DNA-Bindungsproteinen zählen zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, die den Transkriptionsvorgang modulieren, Nukleasen, die DNA-Moleküle spalten, sowie Histone, die an der Verpackung der DNA im Zellkern beteiligt sind.
Transkriptionsfaktoren werden üblicherweise als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindungsaffinität aufweisen und die fähig sind, die Transkription zu aktivieren bzw. zu reprimieren. Das Arabidopsis-thaliana-Genom kodiert für mindestens 1533 Transkriptionsregulatoren, was ~5,9% seiner geschätzten Gesamtanzahl Gene ausmacht (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die „Database of Rice Transcription Factors” (DRTF) ist eine Sammlung von bekannten und vorhergesagten Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica, und enthält derzeit Genmodelle für 2025 mutmaßliche Transkriptionsfaktoren (TF) in indica und 2384 in japonica, die auf 63 Familien verteilt sind (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10): 1286–7).
Eine dieser Familien ist die „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Transkriptionsfaktorfamilie, die für Pflanzen spezifisch ist. In Arabidopsis thaliana sind mindestens neun GRF-Polypeptide identifiziert worden (Kim et al. (2003) Plant J. 36: 94–104) und in Oryza sativa mindestens zwölf (Choi et al. (2004) Plant Cell Physiol. 45(7): 897–904). Die GRF-Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie in ihrer N-terminalen Hälfte mindestens zwei hochkonservierte Domänen aufweisen, die nach den am stärksten konservierten Aminosäuren innerhalb von jeder Domäne benannt sind: (i) eine QLQ-Domäne (InterPro-Eintrag IPR014978, PFAM-Eintrag PF08880), wo die am stärksten konservierten Aminosäuren der Domäne Gln-Leu-Gln sind; und (ii) eine WRC-Domäne (InterPro-Eintrag IPR014977, PFAM-Eintrag PF08879), wo die am stärksten konservierten Aminosäuren der Domäne Trp-Arg-Cys sind. Die WRC-Domäne enthält weiterhin zwei kennzeichnende Strukturmerkmale; die WRC-Domäne ist nämlich an den basischen Aminosäuren Lys und Arg angereichert und umfasst weiterhin drei Cys- und einen His-Rest in konservierter Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H), was als „Effector of Transcription”(ET)-Domäne bezeichnet wird (Ellerstrom et al. (2005) Plant Molec. Biol. 59: 663-681). Die konservierte Beabstandung der Cystein- und Histidinreste in der ET-Domäne erinnert an die Zinkfingerproteine (Zinkbindungsproteine). Außerdem umfassen die GRF-Polypeptidsequenzen üblicherweise ein Kernlokalisierungssignal (Nuclear Localisation Signal (NLS)).
Mit einem Hefe-zwei-Hybrid-Interaktionsassay (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 13374–13379) wurde die Interaktion von einigen GRF-Polypeptiden mit einer kleinen Familie von Transkriptionscoaktivatoren, den „GRF-Interacting”-Faktoren (GIF1 bis GIF3, auch „synovial sarcoma translocation” SYT1 bis SYT3 genannt) nachgewiesen.
Die Bezeichnung GRF wurde auch für eine andere Art von Polypeptiden, die zu der 14-3-3-Polypeptidfamilie (de Vetten & Ferl (1994) Plant Physiol. 106: 1593–1604) gehören und die mit den GRF-Polypeptiden, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, überhaupt nicht verwandt sind, verwendet.
Transgene Arabidopsis-thaliana-Pflanzen, die mit einem Reis-GRF(OsGRF1)-Polypeptid unter der Kontrolle eines konstitutiven 35S-CaMV-Viruspromoters transformiert wurden, wiesen gekräuselte Blätter, eine stark reduzierte Elongation der Primärinfloreszenz sowie verzögertes Schossen auf (van der Knapp et al. (2000) Plant Physiol. 122: 695–704). Im Vergleich zu Wildtyppflanzen entwickelten transgene Arabidopsis-thaliana-Pflanzen, die mit einem beliebigen der beiden Arabidopsis-GRF-Polypeptide (AtGRF1 bzw. AtGRF2) transformiert worden waren, größere Blätter und Kotyledonen, wiesen verzögertes Schossen auf und waren (aufgrund des Fehlens von lebensfähigem Pollen) teilweise steril (Kim et al. (2003) Plant J. 36: 94–104).
In der US-Patentanmeldung US2006/0048240 wird ein Arabidopsis-thaliana-GRF-Polypeptid als SEQ ID NO: 33421 identifiziert. In der US-Patentanmeldung US2007/0022495 wird ein Arabidopsis-thaliana-GRF-Polypeptid als SEQ ID NO: 1803 (in jenem Dokument auch G1438 genannt) identifiziert. Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die G1438 mit dem 35S-CaMV-Promoter überexprimieren, weisen dunkelgrüne Blätter auf.
Hintergrund bezüglich der „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptide
Bei SYT handelt es sich um einen Transkriptionscoaktivator, der in Pflanzen mit Transkriptionsaktivatoren der GRF(Growth-Regulating Factor)-Proteinfamilie einen funktionellen Komplex bildet (Kim HJ, Kende H (2004) Proc. Nat. Acad. Sc. 101: 13374–9). SYT wird in dieser Arbeit GIF genannt, was für GRF-Interacting Factor steht, und AN3 steht für angustifolia3 bei Horiguchi et al. (2005) Plant J. 43: 68–78. Den GRF-Transkriptionsaktivatoren sind strukturelle Domänen (in der N-terminalen Region) mit den SWI/SNF-Proteinen der „chromatin-remodelling”-Komplexe in der Hefe gemeinsam (van der Knaap E et al., (2000) Plant Phys. 122: 695–704). Es wurde vorgeschlagen, dass Transkriptionscoaktivatoren dieser Komplexe an dem Transport von SWI/SNF-Komplexen an Enhancer- und Promoterregionen beteiligt sind, wo sie ein lokales chromatin-Remodelling bewirken (Übersichtsartikel Näär AM et al., (2001) Annu. Rev. Biochem. 70: 475–501). Die Veränderung der lokalen Chromatinstruktur moduliert die Transkriptionsaktivierung. Genauer gesagt wurde vorgeschlagen, dass SYT mit dem pflanzlichen SWI/SNF-Komplex dahingehend interagiert, dass die Transkriptionsaktivierung des GRF-Ziel-Gens bzw. der GRF-Ziel-Gene beeinflusst wird (Kim HJ, Kende H (2004) Proc. Nat. Acad. Sc. 101: 13374–9).
Bei Arabidopsis gehört SYT zu einer Genfamilie mit drei Mitgliedern. Die SYT-Polypeptide weisen eine Homologie zu dem Human-SYT auf. Es wurde nachgewiesen, dass das Human-SYT-Polypeptid einen Transkriptionscoaktivator darstellt (Thaete et al. (1999) Hum. Molec. Genet. 8: 585–591). Das Säugetier-SYT-Polypeptid wird durch drei Domänen charakterisiert:

(i) die N-terminale SNH (SYT N-terminal Homology)-Domäne, die in Säugetieren, Pflanzen, Nematoden und Fischen konserviert ist;
(ii) die C-terminale QPGY-reiche Domäne, die in erster Linie aus Glycin, Prolin, Glutamin und Tyrosin besteht und die in unterschiedlichen Abständen vorkommt;
(iii) eine methioninreiche („Met-rich”) Domäne, die zwischen den beiden vorgenannten Domänen liegt.

Bei pflanzlichen SYT-Polypeptiden ist die SNH-Domäne gut konserviert. Die C-terminale Domäne ist reich an Glycin und Glutamin, jedoch nicht an Prolin und Tyrosin. Sie wurde daher im Gegensatz zu der QPGY-Domäne der Säugetiere QG-reiche Domäne genannt. Wie bei Säugetier-SYT lässt sich am N-terminalen Ende der QG-Domäne eine Met-reiche Domäne identifizieren. Die QG-reiche Domäne kann im Wesentlichen als der C-terminale Rest des Polypeptids (minus der SHN-Domäne) angesehen werden; die Met-reiche Domäne liegt typischerweise innerhalb der ersten Hälfte der QG-reichen vor (vom N-terminalen Ende Richtung C-terminales Ende). Bei pflanzlichen SYT-Polypeptiden kann eine zweite Met-reiche Domäne der SNH-Domäne vorangehen (siehe 1).
Von einer SYT-„Loss-of-Function”-Mutante und transgenen Pflanzen mit verringerter SYT-Expression wurde berichtet, dass sie kleine schmale Blätter und Blütenblätter mit weniger Zellen entwickeln (Kim HJ, Kende H (2004) Proc. Nat. Acad. Sc. 101: 13374–9).
Die Überexpression von AN3 in Arabidopsis thaliana hat zu Pflanzen mit Blättern, die 20–30% größer als diejenigen des Wildtyps waren, geführt (Horiguchi et al. (2005) Plant J. 43: 68–78).
In der japanischen Patentanmeldung 2004-350553 wird ein Verfahren zur Steuerung der Blattgröße in horizontaler Richtung durch Steuerung der Expression des AN3-Gens beschrieben.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Erhöhen der Expression in einer Pflanze von: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, zu Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden führt: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von verschiedenen Pflanzenertragsmerkmalen bereitgestellt, dadurch, dass man in einer Pflanze die Expression von (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, erhöht, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden erhöht sind: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Die erhöhten Ertragsmerkmale umfassen einen oder mehrere der folgenden Faktoren: erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhte Samenfüllungsrate, erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen, erhöhter Harvest Index sowie erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe „Polypeptid” und „Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, die miteinander über Peptidbindungen verbunden sind.
Polvnukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe „Polynukleotid(e)”, „Nukleinsäuresequenz(en)”, „Nukleotidsequenz(en)”, „Nukleinsäure(n)” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in polymerer, unverzweigter Form mit einer beliebigen Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Typischerweise gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Eine „Kontrollpflanze” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang nicht nur ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Homolog(e)
„Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (calmodulin-binding peptide), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
Eine Substitution bezieht sich auf den Ersatz von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen).

Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch in Abhängigkeit von funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen. Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) and Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von fachbekannten Techniken der Peptidsynthese, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind in der Fachwelt gut bekannt. So sind dem Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA gut bekannt; dazu zählen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site Directed Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese.
Derivate
„Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie des interessierenden Proteins, Substitutionen von Aminosäuren durch nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nichtnatürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. „Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acetylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nichtnatürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das/der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, um seinen Nachweis zu gestatten, und nichtnatürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins.
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Vorfahrenbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Vorfahrengens entstanden sind; Orthologe sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind und die auch von einem gemeinsamen Vorfahrengen abstammen.
Domäne
Der Begriff „Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen schwanken können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen identifiziert und können als Identifikationsmittel verwendet werden, um zu bestimmen, ob irgendein Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff „Motiv” oder „Konsensussequenz” oder „Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff „Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem sich im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen aneinander anlagern. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuremoleküle liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eines der komplementären Nukleinsäuremoleküle auf einer Matrix wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem sonstigen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann weiterhin stattfinden, wenn eines der komplementären Nukleinsäuremoleküle an einen festen Träger wie eine GRFozellulose- oder Nylonmembran immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen kieselsäurehaltigen Glasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäuresequenz-Arrays oder „micorarrays” oder Nukleinsäuresequenz-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um „hairpins” oder sonstige Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird von Bedingungen wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelzpunkttemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise für die Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit der Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Nukleinsäuresequenzen können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sequenzmäßig abweichen und trotzdem noch für ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuresequenzmolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt zusammenpassenden Sonde hybridisiert. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen zum Beispiel hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresequenzsträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und bei zusätzlich 50% Formamid ermöglicht es, bei 30 bis 45°C hybridisieren zu können, obwohl die Hybridisierungsrate erniedrigt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für längere Sonden, sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) oligo-DNA- oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (l_n)

^aoder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
^bnur für %GC im 30%- bis 75%-Bereich genau.
^cL = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
^doligo, Oligonukleotid; l_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach erniedrigt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
Abgesehen von den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung typischerweise auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der das Ergebnis von unspezifischer Hybridisierung ist, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu kritischen Faktoren von solchen Waschvorgängen zählen die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie das Hintergrundsignal ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäuresequenzhybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisevorgänge wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen mit höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern werden.
So umfassen zum Beispiel typische hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuremoleküle mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, so kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Um das Ausmaß der Stringenz zu bestimmen, kann Sambrook et al, (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff „Spleißvariante” umfasst im vorliegenden Zusammenhang Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in denen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verdrängt oder hinzugefügt wurden oder in denen Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten wird die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleiben; dies kann dadurch erzielt werden, dass man funktionelle Abschnitte des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten können in der Natur vorkommen oder vom Menschen hergestellt werden. Verfahren für die Prognostizierung und für das Isolieren von solchen Spleißvarianten sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die an derselben chromosomalen Lage lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), aber auch Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs). Die Größe der INDELs beträgt üblicherweise weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
„Gen-Shuffling”/gerichtete Evolution
„Gen-Shuffling” oder „gerichtete Evolution” besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem entsprechendem Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon zu erzeugen, die für Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al, (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promoter
Die Begriffe „Regulationselement”, „Kontrollsequenz” und „Promoter” werden im vorliegenden Text alle austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die fähig sind, eine Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, zu bewirkten. Der Begriff „Promoter” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäuresequenzkontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die am Erkennen und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Erhöher und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, und hier können eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet sein. Der Begriff „Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuresequenzmoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder erhöht.
Ein „pflanzlicher Promoter” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines Kodiersequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Der „pflanzliche Promoter” stammt vorzugsweise von einer Pflanzenzelle, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere „pflanzliche” Regulationssignale, wie „pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Nukleotidsequenzen gelegenen Promoter können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promoter, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, zu stören. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promoter durch Modifizieren ihrer Sequenz modifizieren oder sie vollständig durch aktivere Promoter ersetzen, sogar durch Promoter von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuresequenzmolekül wie oben beschrieben operativ mit einem geeigneten Promoter verbunden sein oder einen geeigneten Promoter umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für ein Identifizieren von funktionell äquivalenten Promotern kann die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster eines potentiellen Promoters zum Beispiel dadurch analysiert werden, dass man den Promoter operativ mit einem Reportergen verbindet und das Expressionsausmaß und -muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze testet. Zu geeigneten gut bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel die beta-Glukoronidase oder die beta-Galaktosidase. Die Promoteraktivität wird dadurch getestet, dass man die enzymatische Aktivität der beta-Glukoronidase oder der beta-Galaktosidase misst. Die Promoterstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit derjenigen/demjenigen eines Referenzpromoters (wie demjenigen, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird) verglichen werden. Die Promoterstärke kann jedoch auch dadurch getestet werden, dass man die mRNA-Mengen quantitativ bestimmt oder dadurch, dass man die mRNA-Mengen der in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuresequenz mit den mRNA-Mengen von „housekeeping”-Genen wie 18S rRNA unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wie Northern-Blotting unter densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitativer Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al, 1996, Genome Methods 6: 986–994) vergleicht. Im Allgemeinen versteht man unter „schwachem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf niedrigem Niveau vorantreibt. Unter „niedrigem Niveau” versteht man Mengen von ungefähr 1/10 000 Transkripte bis 1/100 000 Transkripte bis ungefähr 1/500 0000 Transkripte pro Zelle. Im Gegensatz dazu treibt ein „starker Promoter” die Expression einer Kodiersequenz auf hohem Niveau bzw. mit ungefähr 1/10 Transkripten bis 1/100 Transkripte bis ungefähr 1/1 Transkripte pro Zelle voran. Im Allgemeinen versteht man unter „mittelstarkem Promoter” einen Promoter, der die Expression einer Kodiersequenz auf einem Niveau vorantreibt, das in allen Fällen unter demjenigen Niveau liegt, das unter der Kontrolle eines 35S-CaMV-Promoters erzielt wird.
Operativ verknüpft
Der Begriff „operativ verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotersequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotersequenz fähig ist, die Transkription des interessierenden Gens zu initiieren.
Konstitutiver Promoter

Ein „konstitutiver Promoter” bedeutet einen Promoter, der während den meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionmäßig aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promoter finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für pflanzliche konstitutive Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
GOS2	de Pater et al, Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al, Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al, Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al, Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al, Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al, Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos	Shaw et al, (1984), Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromoter	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promoter
Ein ubiquitärer Promoter ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promoter
Ein entwicklungsregulierter Promoter ist während gewissen Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsmäßige Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promoter
Ein induzierbarer Promoter weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz auf, oder kann „stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder „pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezifische/gewebespezifische Promoter
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promoter ist ein Promoter, der fähig ist, die Transkription bevorzugt in gewissen Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. zu initiieren. So ist zum Beispiel ein „wurzelspezifischer Promoter” ein Promoter, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promoter, die fähig sind, die Transkription nur in gewissen Zellen zu initiieren, werden im vorliegenden Text als „zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promoter sind in Tabelle 2b unten angegeben: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Reis-RCc3	Xu et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27(2): 237– 48
Arabidopsis-PHT1-Phosphattransporter	Kovama et al., 2005
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
Wurzelspezifische Gene RB7, RD2, RD5, RH12 aus Tabak	Conkling et at. (1990) Plant Phys. 93(3): 1203–1211
Wurzelspezifisches Lectin aus der Gerste	Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys. 91: 124–129
Wurzelspezifisches hydroxyprolinreiches Protein	Keller & Lamb (1989) Genes & Dev. 3: 1639–1646
Arabidopsis-CDC27B/hobbit	Blilou et al. (2002) Genes & Dev. 16: 2566–2575

Ein samenspezifischer Promoter ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei „leaky”-Expression) transkriptionsmäßig aktiv. Der samenspezifische Promoter kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele für samenspezifische Promoter sind in Tabelle 2c unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promoter sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Beschreibung wird hiermit durch Bezugnahme als ob hier vollständig beschrieben aufgenommen. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promoter

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezifische Gene	Simon et al, Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al, J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al, Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al, Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al, Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al, Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al, FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al, Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990
NapA	Stalberg et al, Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17:4 61–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al, Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promoter aus der Gerste	Diaz et al, (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 125362, 1999; Plant J. 4: 34355, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 75060, 1996
Gerste-DOF	Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
Synthetischer Promoter	Vicente-Carbajosa et al, Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
α-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al, Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 15768, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 23546, 1997
α-Kafirin aus Sorghumhirse	DeRose et al, Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 25771, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al, Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al, Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al, Plant Mol. Biol. 20: 849856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al, Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al, Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al, Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promoter wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promoter, der in erster Linie in grünem Gewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promoter, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2d unten dargestellt. Tabelle 2d: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promoter

Gen	Expression	Literaturangabe
Orthophosphatdikinase aus dem Mais	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Mais	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus dem Reis	blattspezifisch	Liu et al., 2003
Kleine Rubisco-Untereinheit aus dem Reis	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Beta-Expansiv EXBP9 aus dem Reis	sprossspezifisch	WO 2004/070039
Kleine Rubisco-Untereinheit aus der Straucherbse	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbsen-RBCS3A	blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promoter ist ein meristemspezifischer Promoter, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionsmäßig aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch „leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promoter mit Spezifität für das Meristem, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind in Tabelle 2e unten dargestellt. Tabelle 2e: Beispiele für meristemspezifische Promoter

Herkunftsgen	Expressionsmuster	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sprossapikalmeristem, vom globulärem Embryonenstadium bis zum Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Metallothionein aus dem Reis	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK 2	Spross- und Wurzelapikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Sepalen	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff „Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Modulation
Der Begriff „Modulation” bedeutet in Bezug auf die Expression oder Genexpression einen Vorgang, bei dem das Expressionsniveau durch diese Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze verändert wird; das Expressionsniveau wird vorzugsweise erhöht. Bei der ursprünglichen, nichtmodulierten Expression kann es sich um eine beliebige Art von Expression einer Struktur-RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation handeln. Unter dem Begriff „Modulieren der Aktivität” versteht man jegliche Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die zu erhöhtem Ertrag und/oder erhöhtem Wachstum der Pflanzen führt.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff „erhöhte Expression” oder „Überexpression” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang jegliche Form von Expression, die zusätzlich zu dem ursprünglichen Expressionsniveau des Wildtyps ist.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt; dazu zählen zum Beispiel die von entsprechenden Promotern vorangetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Erhöhern oder Translations-Erhöhern. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die als Promoter- oder Erhöherelemente dienen, können in einer geeigneten Lage (typischerweise stromaufwärts) einer nichtheterologen Form eines Polynukleotids eingeführt werden, um die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für das interessierende Polypeptid kodiert, hinaufzuregulieren. So können zum Beispiel endogene Promoter in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al, WO9322443 ) verändert werden, oder es können isolierte Promoter in eine Pflanzenzelle in der korrekten Orientierung und in korrektem Abstand von einem Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um die Expression des Gens zu kontrollieren.
Wünscht man, ein Polypeptid zu exprimieren, so ist es im Allgemeinen wünschenswert, am 3'-Ende einer Polynukleotid-Kodierregion eine Polyadenylierungsregion mitzuverwenden. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA stammen. Die hinzuzufügende 3'-terminale Sequenz kann zum Beispiel von dem Nopalinsynthasegen oder dem Octopinsynthasegen oder alternativ von einem anderen pflanzlichen Gen, oder, was weniger bevorzugt wird, von jeglichem sonstigen eukaryontischen Gen abstammen.
Um die Menge der reifen Information, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, kann der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz der Partialkodiersequenz auch eine Intronsequenz hinzugefügt werden. Es wurde gezeigt, dass die Mitverwendung eines spleißbaren Introns in der Transkriptionsunit sowohl bei pflanzlichen als auch bei tierischen Expressionskonstrukten die Genexpression sowohl auf dem mRNA-Niveau als auch dem Proteinniveau bis um das 1000fache erhöht (Buchman und Berg (1988), Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al, (1987), Genes Dev. 1: 1183–1200). Solch eine Intronerhöhung der Genexpression ist typischerweise dann am größten, wenn sie in der Nähe des 5'-Endes der Transkriptionsunit platziert wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2, und 6, das Bronze-1-Intron, sind in der Fachwelt gut bekannt. Allgemeine Informationen finden sich in: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Wird im vorliegenden Text ein „endogenes” Gen erwähnt, so bezieht sich dies nicht nur auf das jeweilige Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form vorkommt (d. h. ohne menschlichen Eingriff), sondern auch auf dasselbe Gen (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure/ein im Wesentlichen homologes Gen) in isolierter Form, das anschließend in eine Pflanze (erneut) eingeführt wird (ein Transgen). So kann zum Beispiel bei einer transgenen Pflanze, die solch ein Transgen enthält, eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens stattfinden.
Verringerte Expression
Wird im vorliegenden Text von „verringerter Expression” oder „Verringerung oder im Wesentlichen stattfindender Elimination” der Expression gesprochen, so bedeutet dies eine Verringerung der Expression des endogenen Gens und/oder der Polypeptidmengen und/oder Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination ist mit ansteigender Bevorzugung im Vergleich zu derjenigen der Kontrollpflanzen um mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr reduziert.
Für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine ausreichende Länge von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Um ein „gene silencing” durchzuführen, muss diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide lang sein; sie kann jedoch sogar die Länge des ganzen Gens (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder ganz oder teilweise) betragen. Der Abschnitt von im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann von der Nukleinsäuresequenz, die für das interessierende Protein kodiert (Zielgen) oder von jeglicher Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen. Vorzugsweise ist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide fähig, mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden; stärker bevorzugt weist der Abschnitt der im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotide eine Sequenzidentität mit dem Zielgen (entweder dem sense- oder antisense-Strang) von mit ansteigender Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität auf. Für die verschiedenen Verfahren, die im vorliegenden Text für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens diskutiert werden, ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, nicht Voraussetzung.
Diese Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression kann unter Verwendung von Routinemaßnahmen und -techniken erzielt werden. Ein Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der endogenen Genexpression besteht in RNA-vermitteltem Silencing unter Verwendung einer invertierten Wiederholung einer Nukleinsäuresequenz oder eines Teils davon (in diesem Fall einem Abschnitt von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren, abstammen), die bzw. der vorzugsweise fähig ist, eine „hairpin”-Struktur auszubilden. Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren führt man Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon (in diesem Fall einen Abschnitt von mit im Wesentlichen unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, abgeleitet von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins zu kodieren) in sense-Orientierung in eine Pflanze ein. Bei einem weiteren Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren verwendet man antisense-Nukleinsäuresequenzen. Ein Gen-Silencing kann auch mittels Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie unter anderen bei Angell und Baulcombe ((1999), Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben sind, erreicht werden. Der Fachmann wird mit anderen Methoden, wie der Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, um dessen Funktion in planta zu hemmen, oder dem Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, gut vertraut sein. Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können dazu verwendet werden, um ein Knock-Out der Genexpression und/oder mRNA-Translation durchzuführen. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die typischerweise 19–24 Nukleotide lang sind. Künstliche microRNAs (amiRNAs), die typischerweise 21 Nukleotide lang sind, können dahingehend einem Genetic Engineering unterworfen werden, dass sie spezifisch die Genexpression von einzelnen oder mehreren interessierenden Genen negativ regulieren. Determinanten der pflanzlichen microRNA-Zielauswahl sind in der Fachwelt gut bekannt. Es wurden empirische Parameter für die Zielerkennung definiert, und diese können als Hilfe beim Entwickeln von spezifischen amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., (2005) Dev. Cell 8(4): 517–27). Praktische Werkzeuge für die Entwicklung und Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorstufen sind ebenfalls für die Allgemeinheit verfügbar (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121–33).
Für eine optimale Leistung ist bei den Gen-Silencing-Techniken, die für die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen von monokotylen Pflanzen für die Transformation von monokotylen Pflanzen und von Nukleinsäuresequenzen von dikotylen Pflanzen für die Transformation von dikotylen Pflanzen erforderlich. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz von einer beliebigen Pflanzenart in dieselbe Art eingeführt. So wird zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz aus dem Reis in einer Reispflanze hineintransformiert. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz von derselben Pflanzenart wie diejenige Pflanze, in die sie eingeführt werden wird, stammt. Es reicht aus, dass eine Art wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäuresequenz besteht.
Im obigen Text sind Beispiele für verschiedene Verfahren für die Reduktion oder im Wesentlichen stattfindende Elimination der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Ein Fachmann wäre leicht fähig, die oben genannten Silencing-Verfahren dahingehend zu adaptieren, dass eine Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer ganzen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung von z. B. einem entsprechenden Promoter erzielt wird.
Selektionsmarker(gen)/Reportergen
„Selektionsmarker”, „Selektionsmarkergen” oder „Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzkonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuresequenzmoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen zählen zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosate vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und gewünschtenfalls in ihr Genom integriert, was von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik abhängt. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuselektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel bei Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nichtfunktionell sind, und zwar zum Beispiel durch Deletion mit traditionellen Verfahren. Weiterhin können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in einer Wirtszellen auf demselben Vektor, der die Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, umfasst, oder auch in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben).
Da, sobald die Nukleinsäuresequenzen erfolgreich eingeführt worden sind, die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht mehr erforderlich sind oder unerwünscht sind, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Einführung der Nukleinsäuresequenzen vorteilhaft Techniken verwendet, die die Entfernung oder das Herausschneiden dieser Markergene gestatten. Eines dieser Verfahren ist die so genannten Cotransformation. Bei dem Cotransformationsverfahren werden zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation verwendet, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz trägt und ein zweiter Vektor das Markergen bzw. die Markergene trägt. Ein Großteil der Transformanten erhält oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beider Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten üblicherweise nur einen Teil des Vektors, d. h. diejenige Sequenz, die von der T-DNA flankiert ist, die üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend von der transformierten Pflanze mittels Kreuzen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden für die Transformation Markergene, die in ein Transposon integriert sind, gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäuresequenz eingesetzt (dies ist unter der Bezeichnung Ac/Ds-Technologie bekannt). Die Transformanten können mit einer Transposasequelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäuresequenzkonstrukt, das transient oder stabil die Expression einer Transposase vermittelt, transformiert. In manchen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, aus dem Genom der Wirtszelle heraus und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an einen anderen Locus. In diesen Fällen muss das Markergen durch Kreuzen entfernt werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse möglich machen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf den so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil darin besteht, dass ein Entfernen durch Kreuzen nicht erforderlich ist. Das bekannteste System dieses Typs ist unter der Bezeichnung Cre/Iox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die Sequenzen, die sich zwischen den IoxP-Sequenzen befinden, entfernt. Ist das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert, so wird es, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen wie Hefe, Pilze oder Bakterien angewandt werden.
Transgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „transgen”, „Transgen” oder „rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen für Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, oder
(b) genetische Kontrollsequenz(en) in operativer Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promoter, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter einen transgenen Pflanze versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuresequenzen homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen auch, dass die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind, obwohl die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäuresequenzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanze werden im vorliegenden Text erwähnt.
Transformation
Der Begriff „Einführung” oder „Transformation” umfassen im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das anschließend durch Klonieren vermehrt werden kann, egal ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden und eine ganze Pflanze daraus regeneriert werden. Das jeweilige ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen Klonierungsvermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben zählen zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in. eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf fachbekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Die Transformation von Pflanzenarten ist heutzutage eine ziemliche Routineangelegenheit. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden zählen die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Beschuss mit der Genkanone, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Methoden können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al, (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al, (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al, (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit mit DNA oder RNA beschichteten Partikeln (Klein TM et al, (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien inokulieren. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Methoden für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises zählen gut bekannte Methoden für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al, (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al, (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Bei der Transformation des Maises ist die bevorzugte Methode entweder wie bei Ishida et al, (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al, (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme als ob vollständig beschrieben in den vorliegenden Text aufgenommen werden. Diese Methoden sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana zählt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in einer Agrobakterienlösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben tansgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Andere Methoden beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Eine besonders wirksame Methode ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der „floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der „floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al, 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen dirigieren die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie ist in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet worden (Klaus et al, 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al, Science (1992), 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, die üblicherweise einen Promoter (kann auch ein Translationserhöher oder ein Intron sein) enthält, in die Genomregion des interessierenden Gens oder 10 kB stromaufwärts oder stromabwärts von der Kodierregion eines Gens in solch einer Anordnung, dass der Promoter die Expression des Zielgens dirigiert. Typischerweise wird die Regulation der Expression des Zielgens unterbrochen, und das Gen gelangt unter die Kontrolle des neu eingeführten Promoters. Typischerweise ist der Promoter in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird in das pflanzliche Genom zufallsmäßig insertiert, zum Beispiel mittel Agrobacferium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression von Genen in der Nähe der inserierten T-DNA. Die entstehenden transgenen Pflanzen weisen aufgrund der modifizierten Expression von Genen in der Nähe des eingeführten Promoters dominante Phänotypen auf.
TILLING
Der Begriff „TILLING” ist eine Abkürzung von „Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promoter betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING typischerweise durchlaufen werden, lauten: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al, (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren der einzelnen Mutante; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt (McCallum et al, (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
Homologe Rekombination
Die homologe Rekombination gestattet die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz in ein Genom in einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standardtechnik, die routinemäßig in den Biowissenschaften für niedere Organismen wie Hefe oder das Moos Physcomitrella eingesetzt wird. Methoden für die Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen (Offringa et al, (1990), EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al, (2002), Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004), Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8) beschrieben worden.
Ertrag
Der Begriff „Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das typischerweise mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum in Relation steht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, bzw. ist der tatsächliche Ertrag der Ertrag pro Acre für eine Kultur und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bepflanzten Acres dividiert. Der Begriff „Ertrag” einer Pflanze kann sich auf die vegetative Biomasse, auf die Reproduktionsorgane und/oder auf Vermehrungsmaterial (wie Samen) derjenigen Pflanze beziehen.
Jungpflanzenvitalität
„Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes balanciertes Wachstum, insbesondere während der Frühstadien des Pflanzenwachstums, und kann das Ergebnis einer erhöhten pflanzlichen Anpassungsfähigkeit aufgrund von z. B. einer besseren Adaption der Pflanzen an ihre Umwelt (d. h. Optimieren der Nutzung von Energieressourcen und Aufteilung zwischen Spross und Wurzel) sein. Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität weisen auch ein erhöhtes Überleben der Keimpflanzen und eine besseres Etablieren der Kultur auf, was häufig zu stark einheitlichen Feldern (wobei die Kultur einheitlich heranwächst, d. h. wobei der Großteil der Pflanzen die verschiedenen Entwicklungsstadien im Wesentlichen gleichzeitig erreicht) und häufig zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Jungpflanzenvitalität lässt sich daher dadurch bestimmen, dass man verschiedene Faktoren misst, wie Tausendkorngewicht, Keimungsprozentsatz, Prozentsatz des Auflaufens, Keimpflanzenwachstum, Keimpflanzenhöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und viele andere mehr.
Erhöhen/Verbessern/Erhöhen
Die Begriffe „erhöhen”, „verbessern” oder „erhöhen” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder pro Hektar oder Acre; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe und/oder Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllte) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; f) erhöhte Anzahl Primärrispen; (g) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Ertrags kann sich auch als Erhöhung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Samenertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
„Greenness”-Index
Der „Greenness-Index” wird im vorliegenden Zusammenhang aufgrund von digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem pflanzlichen Subjekt des Bilds gehört, wird das Verhältnis zwischen dem Grünwert und dem Rotwert (im RGB-Modell für die Farbkodierung) berechnet. Der „Greenness-Index” wird als Prozentsatz Pixel, bei denen das Grün/Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt, ausgedrückt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Nährstoffmangel-Wachstumsbedingungen wird der „Greenness-Index” von Pflanzen beim letzten Imaging vor der Blüte gemessen. Im Gegensatz dazu wird der „Greenness-Index” von Pflanzen unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen beim ersten Imaging nach der Trockenheit gemessen.
Pflanze
Der Begriff „Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, darunter Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Der Begriff „Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, zählen all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die folgende umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), lpomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tricale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. und viele andere mehr.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, die im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, erhöht, bereit.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Erhöhen der Expression in einer Pflanze von: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein „unovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, zu Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden führt: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Gemäß einer ersten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von verschiedenen Pflanzenertragsmerkmalen bereitgestellt, dadurch, dass man in einer Pflanze die Expression von (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein „Synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, erhöht, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden verbessert sind: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert.
Die erhöhten Ertragsmerkmale umfassen einen oder mehrere der folgenden Faktoren: erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhte Samenfüllungsrate, erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen, erhöhter Harvest Index sowie erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
Detaillierte Beschreibung der „Growth-Regulating Factor(GRF)”-Polypeptide
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, in einer(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Wird im folgenden Text ein „GRF-Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so versteht man darunter ein GRF-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im folgenden Text eine „GRF-Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist,” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für solch ein GRF-Polypeptid zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäuresequenz (und die daher beim Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede beliebige Nukleinsäuresequenz, die für die Art von Polypeptid, die nun beschrieben werden wird, kodiert, und wird im Folgenden auch „GRF-Nukleinsäuresequenz” oder „GRF-Gen” genannt.
Ein „GRF-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst).
Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein „GRF-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert auf ein beliebiges Polypeptid, das Folgendes umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014978 (PFAM-Eintrag PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014977 (PFAM-Eintrag PF08879); sowie (iii) eine „Effector of Transcription”(ET)-Domäne umfassend drei Cys- und einen His-Rest in konservierter Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H).
Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein „GRF-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert auf ein beliebiges Polypeptid, mit in ansteigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder zu einer beliebigen Volllängenpolypeptidsequenz gemäß Tabelle A.1 im vorliegenden Text.
Alternativ oder zusätzlich interagiert ein „GRF-Polypeptid” mit einem „GRF-Interacting Factor” (GIF; (GIF1 bis GIF3; auch „Synovial Sarcoma Translocation” SYT1 bis SYT3) genannt)-Polypeptiden wie denjenigen, die in Tabelle A.2 im vorliegenden Text dargestellt sind, in einem Hefe-zwei-Hybrid-Interaktions-Assay.
Die Begriffe „Domäne” und „Motiv” werden im vorliegenden Text in dem Abschnitt „Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al, (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al, (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315-318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30(1): 276280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die in-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)).
Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 ist unten in den Beispielen 2 und 4 im vorliegenden Text dargestellt. So umfasst zum Beispiel ein GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 eine QLQ-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014978 (PFAM-Eintrag PF08880) und eine WRC-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014977 (PFAM-Eintrag PF08879) in der InterPro-Domänendatenbank. Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie zum Beispiel mittels Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Ein Alignment der QLQ-Domäne der Polypeptide von Tabelle A.1 im vorliegenden Text ist in dargestellt, und ein Alignment der WRC-Domäne der Polypeptide von Tabelle A.1 im vorliegenden Text ist in dargestellt. Solche Alignments eignen sich zum Identifizieren der am zwischen dem GRF-Polypeptiden am stärksten konservierten Aminosäuren, wie den QLQ- und WRC-Aminosäureresten.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der „matches” maximiert und die Anzahl der „gaps” minimiert.
Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden ((Campanella et al., (2003) BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie dem Fachmann klar wird, kleine händische Veränderungen vorgenommen werden. So können außerdem statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt. Außerhalb der QLQ-Domäne und der WRC-Domäne weisen die GRF-Polypeptide angeblich eine niedrige Aminosäuresequenzidentität auf. Beispiel 3 im vorliegenden Text beschreibt in Tabelle B.1 den Prozentsatz der Identität zwischen dem GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und den GRF-Polypeptiden in Tabelle A, welcher nur 15% Aminosäuresequenzidentität betragen kann. Der Prozentsatz der Identität kann wesentlich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der QLQ-Domäne SEQ ID NO: 2 (gemäß SEQ ID NO: 115 innerhalb SEQ ID NO: 2; QLQ-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A.1 gemäß ) und den QLQ-Domänen der Polypeptide, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind, durchgeführt wird. Auf ähnliche Art und Weise kann der Prozentsatz der Identität wesentlich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der WRC-Domäne SEQ ID NO: 2 (gemäß SEQ ID NO: 116 innerhalb SEQ ID NO: 2; WRC-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A.1 gemäß ) und den WRC-Domänen der Polypeptide, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind, durchgeführt wird. Der Prozentsatz der Identität über die QLQ-Domäne liegt bei den Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zwischen 25% und 99% Aminosäureidentität, und der Prozentsatz der Identität über die WRC-Domäne beträgt bei dem Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zwischen 60% und 99% Aminosäureidentität. Auch ist, wie aus hervorgeht, die WRC-Domäne bei den unterschiedlichen GRF-Polypeptiden besser konserviert als die QLQ-Domäne, siehe .
Bei der Vorhersage der subzellulären Lokalisation eines Proteins handelt es sich um eine wichtige Aufgabe, die gut untersucht ist. Die Kenntnis der Lokalisation eines Proteins hilft bei der Aufklärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden für die Lokalisierung von Proteinen reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Diese Methoden sind zwar präzise, jedoch im Vergleich zu computergestützten Methoden arbeitsaufwendig. In jüngster Zeit sind bei der computergestützten Vorhersage der Lokalisierung von Protein aufgrund von Sequenzdaten große Erfolge erzielt worden. Zu den Algorithmen, mit denen der Fachmann gut vertraut ist und die am ExPASy Proteomics-Server, das vom Swiss Institute for Bioinformatics gehustet wird, zählen zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale sowie andere.
Die GRF-Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind (zumindest in ihrer nativen Form), weisen außerdem typischerweise, jedoch nicht zwingend, Transkriptionsregulationsaktivität sowie die Fähigkeit, mit anderen Proteinen zu interagieren, auf. GRF-Polypeptide mit reduzierter Transkriptionsregulationsaktivität, ohne Transkriptionsaktivität, mit reduzierter Fähigkeit für die Protein-Protein-Interaktion oder mit keiner Fähigkeit zur Protein-Protein-Interaktion können daher bei den Methoden der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich sein. Die DNA-Bindungsaktivität und die Protein-Protein-Interaktionen können leicht in vitro oder in vivo unter Verwendung von fachbekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Die GRF-Polypeptide sind zur transkriptionellen Aktivierung von Reportergenen in Hefezellen befähigt (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101(36): 13374–13379). Die GRF-Polypeptide sind auch zur in-vivo-Interaktion mit „GRF-Interacting Factor”-Polypeptiden (GIF1 bis GIF3; auch „Synovial Sarcoma Translocation” (SYT) genannt) in Hefezellen befähigt, und zwar unter Verwendung eines Hefe-zwei-Hybrid-Protein-Protein-Interaktions-Assays (Kim & Kende, oben). In-vitro-Bindungsassays werden auch verwendet, um nachzuweisen, dass es sich bei den GRF-Polypeptiden und SYT-(oder GIF-)Polypeptiden um interagierende Partner handelt (Kim & Kende, oben).
Die vorliegende Erfindung wird dadurch, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die für die GRF-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert, dargestellt. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit jeder Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, wie sie im vorliegenden Text definiert ist, durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, finden sich in Tabelle A.1 des hier angegebenen Beispiels 1. Solche Nukleinsäuresequenzn sind bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. Die in Tabelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen für Orthologe und Paraloge des GRF-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein „BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A.1 des Beispiels 1 aufgeführten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gewünschtenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der „Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das „Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mittels dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten nützlich sein. Zu Beispielen für solche Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen, wobei die Begriffe „Homolog„ und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen beliebiger der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, Allelvariante und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Nukleinsäuresequenzen die für GRF-Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuresequenzen sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Abschnitte, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein GRF-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A.1 von Beispiel 1 oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle A.1 von Beispiel 1 kodiert. Vorzugsweise beträgt die Länge des Abschnitts mit ansteigender Bevorzugung mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1190 aufeinanderfolgende Nukleotide, wobei es sich bei den aufeinanderfolgenden Nukleotiden um beliebige der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A.1 von Beispiel 1 oder um eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der Polypeptidsequenzen in Tabelle A.1 von Beispiel 1 kodiert, handelt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer Nukleinsequenz, die für ein Polypeptidsequenzpolypeptid umfassend Folgendes kodiert: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst). Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text zu hybridisieren vermag.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, zu hybridisieren vermag, einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein GRF-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer beliebigen der in Tabelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder worin die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, zu hybridisieren. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für eine Polypeptidsequenz, die Folgendes umfasst, kodiert: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst). Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante einer beliebigen der in Tabelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Spleißvariante um eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst).
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Allelvariante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Die Allelvarianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das GRF-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist von den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. Bevorzugt ist die Allelvariante eine Allelvariante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante einer Polypeptidsequenz, die Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst).
„Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen, wobei der Begriff „gene shuffling” wie oben definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer beliebigen der in tAbelle A.1 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Variante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenz mittels „gene shuffling” erhalten wird.
Vorzugsweise kodiert die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäuresequenzvariante für eine Polypeptidsequenz, die Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115 (in SEQ ID NO: 2 umfasst); und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116 (in SEQ ID NO: 2 umfasst).
Nukleinsäuresequenzvarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäuresequenz, die für das GRF-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, weiterhin vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz von Arabidopsis thaliana.
Detaillierte Beschreibung der „Synovial Sarcoma Translocation(SYT)”-Polypeptide
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Wird im vorliegenden Text ein „SYT-Protein, das in den erfindungsgemäßen Methoden nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies ein SYT-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert. Wird im vorliegenden Text eine „SYT-Nukleinsäuresequenz, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist” erwähnt, so bedeutet dies eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für solch ein SYT-Polypeptid zu kodieren. Die in eine Pflanze einzuführende Nukleinsäuresequenz (und die daher bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist) ist jede Nukleinsäuresequenz, die für die Art von Polypeptid, die nun beschrieben werden soll und die im Folgenden auch „SYT-Nukleinsäure” oder „SYT-Gen” genannt wird, kodiert.
Der Begriff „SYT-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich auf ein Polypeptid, das vom N-terminalen Ende Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die am stärksten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263, und ist in schwarz dargestellt.
Alternativ dazu oder zusätzlich betrifft ein „SYT-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert ein beliebiges Polypeptid umfassend eine Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SSXT-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR007726 (PFAM-Eintrag PF05030, SSXT-Protein (N-terminale Region)) von SEQ ID NO: 264.
Alternativ dazu oder zusätzlich betrifft ein „SYT-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert ein beliebiges Polypeptid umfassend eine Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 oder zu einer beliebigen der Volllängenpolypeptidsequenzen in Tabelle A.2 im vorliegenden Text.
Alternativ dazu oder zusätzlich interagiert ein „SYT-Polypeptid” mit „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptiden in einem Hefe-zwei-Hybrid-Interaktionsassay, zum Beispiel mit den GRF-Polypeptidsequenzen in Tabelle A.1 im vorliegenden Text.
Die Analyse der SYT-Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 121 ist unten in den Beispielen 2 und 4 im vorliegenden Text dargestellt. So umfasst zum Beispiel ein SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 eine SSXT-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR007726 (PFAM-Eintrag PF05030) in der InterPro-Domänendatenbank. Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie zum Beispiel mittels Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Ein Alignment der SNH-Domäne der Polypeptide von Tabelle A.2 im vorliegenden Text ist in dargestellt. Solche Alignments eignen sich zum Identifizieren der zwischen den SYT-Polypeptiden am stärksten konservierten Aminosäuren, wie den am stärksten konservierten Resten gemäß SEQ ID NO: 263
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, wie vorstehend kurz beschrieben. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Außerhalb der SNH-Domäne und der SSXT-Domäne weisen die SYT-Polypeptide angeblich eine niedrige Aminosäuresequenzidentität auf. Beispiel 3 im vorliegenden Text beschreibt in Tabelle B.2 den Prozentsatz der Identität zwischen dem SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 und den SYT-Polypeptiden in Tabelle A.2, welcher nur 25% Aminosäuresequenzidentität betragen kann. Der Prozentsatz der Aminosäureidentität kann wesentlich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der SNH-Domäne SEQ ID NO: 262 (in SEQ ID NO: 121 umfasst) und der SNH-Domäne der SYT-Polypeptide von Tabelle A.2 (in dargestellt) erfolgt. Auf ähnliche Weise kann der Prozentsatz der Identität wesentlich erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der SSXT-Domäne gemäß SEQ ID NO: 264 (in SEQ ID NO: 121 umfasst) und den SSXT-Domänen der SYT-Polypeptide, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind, erfolgt. Die SNH-Domäne, die in der SSXT-Domäne umfasst ist, ist zwischen den unterschiedlichen SYT-Polypeptiden besser konserviert als die SSXT-Domäne.
Die SYT-Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind (zumindest in ihrer nativen Form), weisen außerdem typischerweise, jedoch nicht zwingend, Transkriptionsregulationsaktivität sowie die Fähigkeit, mit anderen Proteinen zu interagieren, auf SYT-Polypeptide mit reduzierter Transkriptionsregulationsaktivität, ohne Transkriptionsaktivität, mit reduzierter Fähigkeit für die Protein-Protein-Interaktion oder mit keiner Fähigkeit zur Protein-Protein-Interaktion können daher bei den Methoden der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich sein. Die DNA-Bindungsaktivität und die Protein-Protein-Interaktionen können leicht in vitro oder in vivo unter Verwendung von fachbekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Die SYT-Polypeptide sind auch zu in-vivo-Interaktion mit GRF-Polypeptiden in Hefezellen befähigt, und zwar unter Verwendung eines Hefe-zwei-Hybrid-Protein-Protein-Interaktions-Assays (Kim & Kende, oben). In-vitro-Bindungsassays werden auch verwendet, um nachzuweisen, dass es sich bei den GRF-Polypeptiden und SYT-Polypeptiden um interagierende Partner handelt (Kim & Kende, oben).
Die vorliegende Erfindung wird dadurch erläutert, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 120, die für die SYT-Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 121 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit einer beliebigen ein SYT-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodierenden Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, sind in Tabelle A.2 des Beispiels 1 des vorliegenden Textes angegeben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind beispielhafte Sequenzen für Orthologe und Paraloge des SYT-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 121, wobei die Begriffe „Orthologe” und „Paraloge” wie im vorliegenden Text definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer (wie im Vorstehenden beschrieben) reziproken Blast-Suche identifiziert werden.
Nukleinsäurevarianten können ebenfalls bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sein. Zu Beispielen für solche Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegeben sind, kodieren, wobei die Begriffe „Homolog” und „Derivat” wie im vorliegenden Text definiert sind. Nützlich in den erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, die mittels „gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe „hybridisierende Sequenz”, „Spleißvariante”, „Allelvariante” und „gene shuffling” sind wie im vorliegenden Text beschrieben.
Bei den Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, muss es sich nicht um Volllängen-Nukleinsäuresequenzen handeln, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht von der Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen abhängig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze einen Teil einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Teil einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere Kodiersequenzen (oder Nichtkodiersequenzen) fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion an andere Kodiersequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Abschnitte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind und die für ein SYT-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodieren, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenz gemäß Tabelle A.2 des Beispiels 1 auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer beliebigen der in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise beträgt die Länge des Abschnitts in steigender Bevorzugung mindestens 100, 125, 150, 175, 200 oder 225 aufeinanderfolgende Nukleotide, vorzugsweise mindestens 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 oder 475 aufeinanderfolgende Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700 oder 725 aufeinanderfolgende Nukleotide oder die Länge einer Volllängen-SYT-Nukleinsäuresequenz, wobei es sich bei den aufeinanderfolgenden Nukleotiden um eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen in Tabelle A.2 von Beispiel 1 oder um eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle A.2 von Beispiel 1 kodiert, handelt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Nukleinsäuresequenzabschnitt, der für ein Polypeptidsequenzpolypeptid kodiert, das vom N-terminalen Ende in Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die meisten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263 und ist in schwarz dargestellt. Am stärksten bevorzugt handelt es sich beim dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 120.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert kodiert, oder mit einem Abschnitt wie im vorliegenden Text definiert zu hybridisieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, das man eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, mit einer beliebigen der in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, an eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, zu hybridisieren, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kodieren für ein SYT-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen gemäß Tabelle A.2 von Beispiel 1 aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer beliebigen der in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen zu hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz fähig ist, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, zu hybridisieren. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, welche vom N-terminalen Ende in Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die meisten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263 und ist in schwarz dargestellt. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 120 oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren.
Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Spleißvariante einer beliebigen der in Tabelle A.2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 120 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 121 kodiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Spleißvariante um eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die vom N-terminalen Ende in Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die meisten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263 und ist in schwarz dargestellt.
Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei eine Allelvariante wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante von einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Die Allelvarianten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 und einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung von diesen natürlichen Allelen ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. Bevorzugt ist die Allelvariante eine Allelvariante gemäß SEQ ID NO: 120 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 121 kodiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante einer Polypeptidsequenz, die vom N-terminalen Ende in Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die meisten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263 und ist in schwarz dargestellt.
„Gene shuffling” oder gerichtete Evolution können ebenfalls eingesetzt werden, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide wie oben definiert kodieren, zu erzeugen, wobei der Begriff „gene shuffling” wie im vorliegenden Text definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Erhöhung von Ertragsmerkmalen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert, oder wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle A.2 des Beispiels 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, wobei diese Nukleinsäuresequenzvariante durch „gene shuffling” erhalten wurde, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert.
Vorzugsweise kodiert die durch „Gene-Shuffling” erhaltene Nukleinsäuresequenzvariante für eine Polypeptidsequenz, die vom N-terminalen Ende in Richtung C-terminales Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne. Vorzugsweise umfasst die SNH-Domäne die meisten konservierten Reste gemäß SEQ ID NO: 263 und ist in schwarz dargestellt.
Nukleinsäuresequenzvarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Methoden auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Verlegt bei Wiley).
Nukleinsäuresequenzen, die für SYT-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezieltes menschliches Eingreifen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäuresequenz, die für das SYT-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, weiter bevorzugt von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz von Arabidopsis thaliana.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, d. h. die Erhöhung der Expression in einer Pflanze von Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, führt zu Pflanzen, die im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der folgenden (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Begriffe „Ertrag” und „Samenertrag” sind ausführlicher im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben.
Wählt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Erhöhte Anzahl Pflanzen, die pro Hektar oder Acre etabliert sind, Erhöhung der Anzahl Ähren pro Pflanze, Erhöhung der Anzahl Reihen, der Anzahl Körner pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, Ährenlänge/-durchmessers, Erhöhung der Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert) und viele andere mehr. Wählt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich einem oder mehreren der folgenden Merkmale ausdrücken: Anzahl Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl Rispen pro Pflanze, Anzahl Ährchen pro Rispe, Anzahl Blüten pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl der gefüllten Samen zu der Anzahl der Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen und multipliziert mit Hundert), erhöhtes Tausendkorngewicht und viele andere mehr.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, d. h. die Erhöhung der Expression in einer Pflanze von Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, führt zu Pflanzen, die im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der folgenden (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem erhöhten Ertragsmerkmal um eines der folgenden Merkmale: (i) erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samenfüllungsrate; (v) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; (vi) erhöhter Harvest Index; oder (vii) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
Da die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindestens während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
„Kontrollpflanzen” können, wie im Abschnitt „Definitionen” angegeben, entsprechende Wildtypflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen oder entsprechende Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der folgenden (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, beinhalten. Eine „Kontrollpflanze” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze braucht, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, „Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenabreifung beeinflusst werden. Die erhöhte Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann erhöhte (frühe) Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können, als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen; verzögertes Blühen ist normalerweise kein erwünschtes Merkmal bei Kulturpflanzen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, so kann dies ein weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen innerhalb einer traditionellen Wachstumsperiode). Auf ähnliche Weise kann, wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, dies ein weiteres Aussäen von Samen von unterschiedlichen Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließendes z. B. Aussäen und gewünschtenfalls Ernten von Sojabohnen, Kartoffeln oder sonstigen geeigneten Pflanzen). Bei manchen Kulturpflanzen kann es auch möglich sein, dass man zusätzlich mehrmals von demselben Wurzelstock ernten kann. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (und zwar aufgrund einer Erhöhung der Häufigkeit (z. B. pro Jahr), mit der eine bestimmte Pflanze herangezogen und geerntet werden kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau von transgenen Pflanzen in einem weiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Begrenzungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt wird. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten von verschiedenen Parametern von Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter folgendes sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und viele mehr.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren die Expression von Folgendem in einer Pflanze erhöht: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen.
Erhöhte Ertragsmerkmale treten auf, egal, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen wachsenden Kontrollpflanzen verschiedenen Stressfaktoren unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum einstellen. Leichter Stress wiederum wird im vorliegenden Zusammenhang als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze ihr Wachstum völlig einstellt, ohne ihr Wachstum wieder aufnehmen zu können. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund der Fortschritte bei den landwirtschaftlichen Kulturmaßnahmen (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starken Stress. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Milder Stress ist der alltägliche biotische und/oder abiotische Stress (Umweltstress), dem eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und Hitze, Kälte oder Minustemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise Stressfaktoren, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten verursacht werden. Der Begriff „Nichtstress”-Bedingungen bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum der Pflanzen gestatten. Die Fachwelt ist mit den normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen heranwachsen, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression von Folgendem erhöht: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und von (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, und die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die bei Wachstum unter abiotischen Stressbedingungen einen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen wachsen, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Wie von Wang et al, (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al, (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. So äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Das Ergebnis ist, dass diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen aktivieren, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Da unterschiedliche Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, ist die beispielhafte Darstellung der vorliegenden Erfindung bezüglich Trockenheitsstress nicht als Beschränkung auf Trockenheitsstress anzusehen, sondern mehr als ein Screening, das die Beteiligung der GRF-Polypeptide wie oben definiert an der Erhöhung von Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen wachsen, an abiotischem Stress im Allgemeinen anzeigt.
Der Begriff „abiotischer Stress” wie im vorliegenden Text definiert soll einen oder mehrere Stressfaktoren der folgenden bedeuten: Wasserstress (durch Trockenheit oder zu viel Wasser bedingt), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch Hitze, Kälte oder Temperaturen unter Null bedingt), durch toxische Chemikalien bedingter Stress sowie oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress ausgewählt aus der Reihe Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionenbedingter Stress. Bevorzugt ist der Wasserstress Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann durch einen oder mehrere der folgenden Substanzen verursacht werden: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ sowie andere.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression von Folgendem in einer Pflanze erhöht: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die reduzierte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von den Pflanzen für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine enorme Menge Dünger auf die Felder ausgebracht, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von drei Hauptnährstoffen, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, begrenzt, wobei von diesen drei Hauptnährstoffen üblicherweise Stickstoff das limitierende Element der Pflanzenwachstumsrate darstellt. Das wichtigste Nährelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher der Stickstoff (N). Er ist Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die in lebenden Zellen auftreten, darunter Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren sowie Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins ist Stickstoff. Die Stickstoffverfügbarkeit ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Wachstum und die Produktion von Kulturpflanzen (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und die Aminosäurezusammensetzung. Unter Stickstofflimitierungsbedingungen herangezogene Kulturpflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen sind daher von großem Interesse.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die, wenn sie unter reduzierten Nährstoffverfügbarkeitsbedingungen, insbesondere unter reduzierten Stickstoffverfügbarkeitsbedingungen, herangezogen werden, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen, die unter reduzierten Nährstoffverfügbarkeitsbedingungen, vorzugsweise unter reduzierten Stickstoffverfügbarkeitsbedingungen, herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Expression von Folgendem in einer Pflanze erhöht: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Die reduzierte Nährstoffverfügbarkeit kann durch einen Mangel oder einen Überschuss an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Kadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor bedingt sein. Vorzugsweise bedeutet reduzierte Nährstoffverfügbarkeit reduzierte Stickstoffverfügbarkeit.
Die vorliegenden Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen davon, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen davon umfassen (i) ein isoliertes Nukleinsäuretransgen, das für ein „Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; sowie (ii) ein isoliertes Nukleinsäuretransgen, das für ein „Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert.
Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression von: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, darin, dass man in eine(r) Pflanze Folgendes einführt und exprimiert: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Verfahren zum Einführen und Exprimieren von zwei oder mehr Transgenen (auch als „Gene Stacking” bezeichnet) in transgene(n) Pflanzen sind in der Fachwelt gut bekannt (siehe zum Beispiel Übersichtsartikel von Halpin (2005) Plant Biotech. J. (3): 141–155). Das „Gene Stacking” kann mit Hilfe von iterativen Schritten erfolgen, wobei zwei oder mehr Transgene der Reihe nach in eine Pflanze dadurch eingeführt werden, dass man eine Pflanze, die ein Transgen enthält, mit Einzelpflanzen, die andere Transgene bergen, kreuzt, oder alternativ dadurch, dass man eine Pflanze, die ein Transgen enthält, mit neuen Gene retransformiert (bzw. supertransformiert).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, der Reihe nach einführt und exprimiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Vorzugsweise werden die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii) durch Kreuzen der Reihe nach eingeführt und exprimiert. Es wird zwischen einer weiblichen Elternpflanze, die eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, umfasst, und einer männlichen Elternpflanze, die eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, umfasst, oder umgekehrt, eine Kreuzung vorgenommen und durch Selektieren innerhalb der Nachkommenschaft auf das Vorhandensein und die Expression von beiden Transgenen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, und zwar dadurch, dass man zwischen einer weiblichen Elternpflanze, die eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, umfasst, und einer männlichen Elternpflanze, die eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, umfasst, oder umgekehrt, eine Kreuzung vornimmt und durch Selektieren innerhalb der Nachkommenschaft auf das Vorhandensein und die Expression von beiden Transgenen, wobei die Pflanzen im Vergleich zu den Elternpflanzen oder im Vergleich zu beliebigen sonstigen Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Alternativ dazu werden die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii) der Reihe nach durch Retransformation eingeführt und exprimiert. Die Retransformation erfolgt dadurch, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, in einen/einem Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle umfassend eine eingeführte und exprimierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert, oder umgekehrt, und durch Selektieren innerhalb der Nachkommenschaft auf das Vorhandensein und die Expression von beiden Transgenen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Retransformation bereitgestellt, und zwar dadurch, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, in einen/einem Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle umfassend eine eingeführte und exprimierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert, oder umgekehrt, und durch Selektieren innerhalb der Nachkommenschaft auf das Vorhandensein und die Expression von beiden Transgenen, wobei die Pflanzen im Vergleich zu den Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, bzw. im Vergleich zu beliebigen sonstigen Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Alternativ dazu kann das „Gene Stacking” über gleichzeitige Transformation oder Kotransformation erfolgen, was rascher ist und bei verschiedensten Transformationstechniken eingesetzt werden kann, wie dies im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben wird.
Verwendet man zum Beispiel die Agrobacterium-Transformation, so können die Transgene (mindestens zwei) in verschiedenen Konformationen, die in der Fachwelt gut bekannt sind, vorliegen, von denen nun einige im Folgenden angeführt werden:

(i) die Nukleinsäurekodiersequenzen sind so fusioniert, dass sie, wenn sie translatiert werden, ein einziges Polypeptid bilden, und werden unter die Kontrolle eines einzigen Promoters gestellt;
(ii) die Nukleinsäurekodiersequenzen befinden sich der Reihe nach stromabwärts von einem einzigen Promoter, sind durch Nukleinsäuresignale, die die mRNA-Synthese (interne Ribosomeneintrittsstellen IRES, 2A-„stuttering”-Signale usw.) oder die Polypeptidsynthese (Polyproteine, die durch Proteasesubstratstellen getrennt sind, usw.) beeinflussen, getrennt;
(iii) die Nukleinsäurekodiersequenzen werden unabhängig von separaten Promotern vorangetrieben, und die Promoter/Nukleinsäurekodiersequenz-Kombinationen befinden sich innerhalb einer T-DNA;
(iv) die Nukleinsäurekodiersequenzen werden unabhängig von separaten Promotern vorangetrieben, und die Promoter/Nukleinsäurekodiersequenz-Kombinationen befinden sich in unterschiedlichen T-DNAs auf einem Plasmid;
(v) die Nukleinsäurekodiersequenzen werden unabhängig von separaten Promotern vorangetrieben, und die Promoter/Kodiersequenz-Kombinationen befinden sich in unterschiedlichen T-DNAs auf unterschiedlichen Plasmiden, die in einem bzw. in separaten Agrobacterium-Stämmen vorliegen.

Bei der direkten genetischen Transformation unter Verwendung von physikalischen oder chemischen Abgabesystemen (z. B. Beschuss mit der Genkanone, PEG, Elektroporation, Liposomen, Glasnadeln usw.) können die Transgene (mindestens zwei) ebenfalls in einer Anzahl von Konformationen vorliegen, müssen jedoch im Wesentlichen nicht in einem Vektor umfasst sein, der fähig ist, in Agrobakterien oder in Viren, den Vermittlern der genetischen Transformation, repliziert zu werden. Die beiden Transgene können in einem oder in mehreren Nukleinsäuremolekülen, die jedoch gleichzeitig für das genetische Transformationsverfahren eingesetzt werden, umfasst sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, gleichzeitig einführt und exprimiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii), die gleichzeitig eingeführt und exprimiert werden, sind in einem oder in mehreren Nukleinsäuremolekülen umfasst. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man in eine(r) Pflanze (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, enthalten in ein oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, gleichzeitig einführt und exprimiert, wobei diese Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder erhöhte Expression von Nukleinsäuresequenzn, die für GRF-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt umfassend

(a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(c) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Erhöhung der Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) und gemäß (b) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls
(d) eine Transkriptionsterminationssequenz

Die Nukleinsäuresequenzen von (a) und (b) können in einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO: 267 oder gemäß SEQ ID NO: 268 umfasst sein, wobei dieses Nukleinsäuremolekül für eine Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 269 oder gemäß SEQ ID NO: 270 kodiert.
Die Begriffe „Kontrollsequenz” und „Terminationssequenz” sind wie im vorliegenden Text definiert. Vorzugsweise handelt es sich bei einer der Kontrollsequenzen eines Konstrukts um einen konstitutiven Promoter. Ein Beispiel für einen konstitutiven Promoter ist ein GOS2-Promoter, vorzugsweise ein Reis-GOS2-Promoter, stärker bevorzugt ein GOS2-Promoter gemäß SEQ ID NO: 117.
In einem Konstrukt wird eine einzige Kontrollsequenz verwendet, um die Expression von beiden Nukleinsäuresequenzen gemäß (a) und (b), die in einem Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO: 267 oder gemäß SEQ ID NO: 268 umfasst sind, voranzutreiben, wobei dieses Nukleinsäuremolekül für eine Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 269 oder gemäß SEQ ID NO: 270 kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Mischung von Konstrukten bereit, die sich zum Beispiel für die gleichzeitige Einführung und Expression von (a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert; und von (b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in Pflanzen eignet, wobei mindestens ein Konstrukt Folgendes umfasst:

(a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die fähig sind, die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben; sowie gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz, und wobei mindestens das andere Konstrukt Folgendes umfasst:
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert;
(e) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die fähig sind, die Expression der Nukleinsäuresequenz von (d) voranzutreiben; sowie gegebenenfalls
(f) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise handelt es sich bei einer der Kontrollsequenzen eines Konstrukts um einen konstitutiven Promoter. Ein Beispiel für einen konstitutiven Promoter ist ein GOS2-Promoter, vorzugsweise ein Reis-GOS2-Promoter, stärker bevorzugt ein GOS2-Promoter gemäß SEQ ID NO: 117.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Konstrukts bereit, das Folgendes umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, oder eine Mischung von Konstrukten umfassend (a) und (b) wie oben definiert in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgendem: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei es sich bei den erhöhten Ertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samenfüllungsrate; (v) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; (vi) erhöhter Harvest Index; oder (vii) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
Die Erfindung stellt auch Pflanzen, Pflanzenteile oder Pflanzenzellen bereit, die mit einem Konstrukt, das Folgendes umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert; und (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, oder mit einer Mischung von Konstrukten umfassend (a) und (b) wie oben definiert transformiert sind.
Die Pflanzen werden mit einem oder mehreren Vektoren umfassend eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen transformiert. Der Fachmann ist mit den genetischen Elementen, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren, vertraut. Die interessierende Sequenz ist operativ mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) verbunden.
Für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz kann vorteilhaft jede Art von Promoter, egal, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist bei den Verfahren besonders nützlich.
Sonstige organspezifische Promoter, z. B. für die bevorzugte Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), eignen sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Für Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe den Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text.
Es ist klar, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf Folgendes beschränkt ist: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für das GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 1 kodiert, wobei die Expression von einem konstitutiven Promoter vorangetrieben wird; oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für das SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 120 kodiert, wobei die Expression von einem konstitutiven Promoter vorangetrieben wird.
Bei dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, kann/können gewünschtenfalls eine oder mehrere Terminatorsequenzen verwendet werden. Zu zusätzlichen Regulationselementen können Transkriptionserhöher sowie Translationserhöher zählen. Die Fachwelt ist mit Terminator- und Enhancer-Sequenzen, wie sie für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können, vertraut. Um die Menge der reifen Botschaft, die im Cytosol akkumuliert wird, kann eine Introsequenz auch zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der Kodiersequenz hinzugefügt werden, wie im Abschnitt „Definitionen” beschrieben. Andere Kontrollsequenzen (neben Promoter-, Erhöher-, Silencer-, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt bzw. können von diesem leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Zu bevorzugten Replikationsursprüngen zählen der f1-ori und colE1, sind jedoch hierauf nicht beschränkt.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanze, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (bzw. Reportergene) zu verwenden. Das Genkonstrukt kann daher gewünschtenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind genauer im Abschnitt „Definitionen” im vorliegenden Text beschrieben.
Es ist bekannt, dass bei der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen, je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik, nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und gegebenenfalls in ihre Genom integriert. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise gemeinsam mit dem interessierenden Gen ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen Selektionsmarker) kodiert, in die Wirtszelle eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel bei Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene zum Beispiel durch Deletion mittels traditionellen Verfahren nicht funktionell sind. Weiterhin können auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert oder der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, oder auch auf einem separaten Vektor, Nukleinsäuresequenzmoleküle, die für einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die übrigen Zellen absterben). Die Markergene können, wenn sie nicht mehr gebraucht werden, aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden. Techniken für die Entfernung von Markergenen sind in der Fachwelt bekannt, und nützliche Techniken sind oben im Abschnitt „Definitionen” beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen bereit, welches das Einführen und Exprimieren von Folgendem in eine(r) Pflanze umfasst: (i) eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert; und (ii) eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, wobei die Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von Folgendem: (i) einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie oben definiert kodiert; oder (ii) einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten Ertrapmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit erhöhter Expression entweder (i) einer für ein GRF-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder (ii) einer für ein SYT-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz bereit, wobei man

a. eine für ein GRF-Polypeptid mit der wie oben angegebenen Bedeutung kodierende Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung eines konstitutiven Promoters in eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle einführt und darin exprimiert und
b. eine für ein SYT-Polypeptid mit der wie oben angegebenen Bedeutung kodierende Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung eines konstitutiven Promoters in eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle einführt und darin exprimiert und
c. die Pflanzenzelle, den Pflanzenteil oder die Pflanze unter Pflanzenwachstum und -entwicklung fördernden Bedingungen kultiviert.

Bei der Nukleinsäuresequenz von (i) kann es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für ein wie im vorliegenden Text definiertes GRF-Polypeptid zu kodieren, handeln und bei der Nukleinsäuresequenz von (ii) kann es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die fähig ist, für ein wie im vorliegenden Text definiertes SYT-Polypeptid zu kodieren, handeln.
Die Nukleinsäuresequenz kann in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst direkt eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen sonstigen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze vorzugsweise mittels Transformation eingeführt. Der Begriff „Transformation” wird im vorliegenden Text im Abschnitt „Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Arbeiten von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, selektiert, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden; beide Techniken sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. So kann es sich um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen handeln; um klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); um Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf einen untransformierten Edelreis gepfropft wurde).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jegliche Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf alle Pflanzenteile und alles Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die (i) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein wie oben definiertes GRF-Polypeptid kodiert, in operativer Verknüpfung mit einem konstitutiven Promoter; und (ii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie oben definiert kodiert, in operativer Verknüpfung mit einem konstitutiven Promoter enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenzen oder Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die fähig sind, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide zu synthetisieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen zählen zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen zählt zum Beispiel das Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden zählen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mohrenhirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze umfassend Folgendes: (i) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für einen GRF (wie oben definiert) kodiert; und (ii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT (wie oben definiert) kodiert, wie zum Beispiel, jedoch nicht einschränkend, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntbaren Teil von solch einer Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Verfahren zum Erhöhen der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen, oder Genprodukten, sind in der Fachwelt gut beschrieben, und Beispiele finden sich im Abschnitt „Definitionen”.
Wie oben erwähnt besteht ein bevorzugtes Verfahren für das Erhöhen der Expression (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, darin, dass man (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Auswirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. des Erhöhens der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung von anderen gut bekannten Techniken erzielt werden, darunter, jedoch nicht einschränkend, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnit „Definitionen”.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von (i) Nukleinsäuresequenzen, die für wie im vorliegenden Text beschriebene GRF-Polypeptide kodieren und Nukleinsäuresequenzen, die für wie im vorliegenden Text beschriebene SYT-Polypeptide kodierten, und die Verwendung dieser GRF-Polypeptide und SYT-Polypeptide bei der Erhöhung von einem der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen, unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stresswachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stresswachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit reduzierter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter reduzierten Stickstoffverfügbarkeitsbedingungen.
Nukleinsäuresequenzen, die für wie im vorliegenden Text beschriebene GRF-Polypeptide und SYT-Polypeptide kodieren, bzw. die GRF-Polypeptide selbst, können in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, in denen ein DNA-Marker, der genetisch mit einem für ein GRF-Polypeptid kodierenden Gen verbunden sein kann, identifiziert wird. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen bzw. die GRF-Polypeptide und SYT-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Zuchtprogrammen eingesetzt werden, um Pflanzen zu selektieren, die wie oben in den erfindungsgemäßen Verfahren definierte, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen.
Allelvarianten eines Gens/einer Nukleinsäuresequenz, die/das für ein GRF-Polypeptid und SYT-Polypeptid kodieren, können ebenfalls in Marker gestützten Zuchtprogrammen Verwendung finden. Für solche Zuchtprogramme ist es manchmal erforderlich, dass mittels mutagener Behandlung von Pflanzen, zum Beispiel mittels EMS-Mutagenese, eine Allelvariation eingeführt wird; alternativ dazu kann dem Programm eine Kollektion von Allelvarianten so genannten „natürlichen” Ursprungs, die unabsichtlich erzeugt wurden, als Ausgangsmaterial dienen. Anschließend findet die Identifikation von Allelvarianten statt, zum Beispiel mittels PCR. Danach schließt sich ein Schritt für die Selektion von überlegenen Allelvarianten der jeweiligen Sequenz, die erhöhte Ertragsmerkmale geben, an. Typischerweise wird die Selektion dadurch durchgeführt, dass man die Wachstumsleistung von Pflanzen, die unterschiedliche Allelvarianten der jeweiligen Sequenz enthalten, verfolgt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Zu weiteren optionalen Schritten zählt das Kreuzen von Pflanzen, in denen die überlegene Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Damit könnte man zum Beispiel eine Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen erzeugen.
Nukleinsäuresequenzen, die für GRF-Polypeptide und SYT-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verbunden sind, eingesetzt werden. Solche Informationen können in der Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit erwünschten Phänotypen zu entwickeln. Für solch eine Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für ein GRF-Polypeptid und/oder ein SYT-Polypeptid kodieren, ist nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden erforderlich. Die Nukleinsäuresequenzen, die für ein GRF-Polypeptid und/oder ein SYT-Polypeptid kodieren, können als Marker für den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von pflanzlicher genomischer DNA, mit der ein Restriktionsverdau durchgeführt wurde, können mit den Nukleinsäuresequenzen, die für ein GRF-Polypeptid kodieren, als Sonde behandelt werden. Mit den erhaltenen Bandierungsmustern kann man anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al, (1987), Genomics 1: 174–181) genetische Analysen durchführen, um eine Genkarte zu konstruieren. Weiterhin kann man mit den Nukleinsäuresequenzen als Sonde Southern-Blots behandeln, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs eines Satzes von Einzelorganismen, die Elter und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, enthalten. Die Aufspaltung der DNA-Polymorphismen wird notiert und für die Berechnung der Position der Nukleinsäuresequenz, die für ein spezifisches Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al, (1980), Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und die Verwendung von Sonden, die von pflanzlichen Genen abstammen, für die Verwendung in der genetischen Kartierung ist bei Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Die genkartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik bzw. Variationen davon ist in zahlreichen Publikationen beschrieben. So können für die Kartierung zum Beispiel F2-Heterozygotenkreuzungspopulationen, Rückkreuzungspopulationen, Populationen mit zufälliger Paarung, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Einzelorganismen verwendet werden. Diese Methodiken sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. die Platzierung von Sequenzen auf physikalische Karten; siehe Hoheisel et al, In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996,. S. 319–346, und darin genannte Literaturhinweise).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzsonden für ein direktes „fluorescence in situ hybridisation mapping” (FISH) verwendet werden (Trask (1991), Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl man bei den derzeitigen FISH-Kartierungsmethoden lieber größere Klone verwendet (mehrere kB bis mehrere Hundert kB; siehe Laan et al, (1995), Genome Res. 5: 13–20), können es Verbesserungen bezüglich der Empfindlichkeit ermöglichen, ein FISH-Mapping mit kürzeren Sonden durchzuführen.
Mit den Nukleinsäuresequenzen können verschiedene Verfahren für die genetische und physikalische Kartierung, die auf der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen beruhen, durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), der Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al, (1993), Genomics 16: 325–332), die allelspezifische Ligation (Landegren et al, (1988), Science 241: 1077–1080), Nukleotidextensionsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic Acid Sequence Res. 18: 3671), „Radiation Hybrid Mapping” (Walter et al, (1997), Nat. Genet. 7: 22–28) und „Happy Mapping" (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Sequence Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren verwendet man die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz, um Primer-Paare für die Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen zu entwickeln und herzustellen. Die Entwicklung von solchen Primern ist dem Fachmann gut bekannt. Bei Verfahren, bei denen eine Genkartierung auf PCR-Basis verwendet wird, kann es erforderlich sein, Unterschiede bezüglich der DNA-Sequenz zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch allgemein für Kartierungsmethoden nicht erforderlich.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, wie oben beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren ertragserhöhenden Merkmalen, Toleranz für abiotische und biotische Stressfaktoren, Toleranz für Herbizide, Insektizide, Merkmalen, die verschiedene Architekturaspekte und/oder biochemische und/oder physiologische Aspekte modifizieren, kombiniert werden.
Beschreibung der Abbildungen
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden Abbildungen beschrieben werden, in denen Folgendes dargestellt wird.
ist eine Darstellung eines GRF-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, das die folgenden Merkmale umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014978 (PFAM-Eintrag PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014977 (PFAM-Eintrag PF08879); und (iii) eine Transkriptionseffektordomäne (Effector of Transcription, ET-Domäne), die drei Cys- und einen His-Reste in konservierter Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H) umfasst und die innerhalb der WRC-Domäne liegt.
zeigt ein AlignX (von Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) multiples Sequenz-Alignment der QLQ-Domäne von GRF-Polypeptiden von Tabelle A.1 (gemäß SEQ ID NO: 115 für SEQ ID NO: 2). Die konservierten QLQ-Aminosäurereste befinden sich oben in dem multiplen Alignment. Zwei weitere sehr stark konservierte Reste (schwarz hinterlegt) sind E (Glu) und P (Pro).
zeigt ein AlignX (von Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) multiples Sequenz-Alignment der WRC-Domäne von GRF-Polypeptiden von Tabelle A.1 (gemäß SEQ ID NO: 116 für SEQ ID NO: 2). Die konservierten WRC-Aminosäurereste sind in der Konsensus-Sequenz fett gedruckt. Die drei Cys-Reste und der eine His-Rest in einer konservierten Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H), als „Effector of Transcription” (ET) bezeichnete Domäne, sind senkrecht über das Alignment hinweg eingerahmt und auch im Alignment unten angegeben. Das mutmaßliche Kernlokalisierungssignal (NLS), das in der WRC-Domäne vorliegt, ist doppelt unterstrichen.
zeigt die typische Domänenstruktur von SYT-Polypeptiden aus Pflanzen und Säugetieren. Die konservierte SNH-Domäne befindet sich am N-terminalen Ende des Polypeptids. Der C-terminale Rest des Polypeptids besteht aus einer QG-reichen Domäne mit pflanzlichen SYT-Polypeptiden und einer QPGY-reichen Domäne in Säugetier-SYT-Polypeptiden. Eine Met-reiche Domäne liegt in Pflanzen oder in QPGY-reichen Säugetieren typischerweise innerhalb der ersten Hälfte der QG-reichen vor (vom N-terminalen Ende Richtung C-terminales Ende). Bei pflanzlichen SYT-Polypeptiden kann eine zweite Met-reiche Domäne der SNH-Domäne vorangehen.
zeigt ein multiples Alignment des N-terminalen Endes von verschiedenen SYT-Polypeptiden unter Verwendung des multiplen Alignment-Programms VNTI AlignX, das auf einem modifizierten ClustalW-Algorithmus basiert (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), und zwar mit den Default-Einstellungen „Gap Opening Penalty” 10 und „Gap Extension” 0,05. Die SNH-Domäne ist über die pflanzlichen und humanen SYT-Polypeptide eingerahmt. Die letzte Linie in dem Alignment besteht aus einer Konsensus-Sequenz, die von den Sequenzen im Alignment abgeleitet ist.
zeigt ein multiples Alignment von verschiedenen pflanzlichen SYT-Polypeptiden unter Verwendung des multiplen Alignment-Programms VNTI AlignX, das auf einem modifizierten ClustalW-Algorithmus basiert (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), und zwar mit den Default-Einstellungen „Gap Opening Penalty” 10 und „Gap Extension” 0,05. Die zwei Hauptdomänen vom N-Terminus in Richtung C-Terminus sind eingerahmt und als SNH-Domäne und Met-reiche/QG-reiche Domäne identifiziert. Zusätzlich ist auch die N-terminale Met-reiche Domäne eingerahmt, und die Positionen von SEQ ID NO: 90 und SEQ ID NO: 91 sind fett unterstrichen.
zeigt links eine Rispe einer Reispflanze (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare), die mit einem Kontrollvektor transformiert ist, und rechts eine Rispe von einer Reispflanze (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare), die mit zwei Konstrukten transformiert ist: (1) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert; sowie (2) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert;
zeigt in der oberen Reihe von links nach rechts 30 reife Reissamen (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare) von:

a. Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, transformiert wurden;
b. Pflanzen, die mit zwei Konstrukten transformiert wurden: (1) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert; sowie (2) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert;
c. Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, transformiert wurden;
d. nullizygote Pflanzen (Kontrollpflanzen) von a;
e. nullizygote Pflanzen (Kontrollpflanzen) von c.

zeigt den binären Vektor für die erhöhte Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, in Oryza sativa bzw. für die erhöhte Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, in Oryza sativa.
In sind Einzelheiten von Sequenzbeispielen dargestellt, die bei der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung dienen, beschrieben. Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Erfindung nicht vollständig definieren oder auf andere Weise begrenzen.
DNA-Manipulation: Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach den Standardprotokollen durchgeführt, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: (Sambrook (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standardmaterial und -verfahren für molekularbiologische Arbeiten an Pflanzen sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993), von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK).
Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al, (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, verwandt sind, identifiziert. Das Programm wird dazu verwendet, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen aufzufinden, und zwar dadurch, dass man Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken verglich und die statistische Signifikanz der „Matches” berechnete. Beispielsweise wurde das Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kodiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment zufallsmäßig vorkommt, widerspiegeln (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenz(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. So kann zum Beispiel der E-Wert erhöht werden, um Matches mit niedrigerer Stringenz aufzuzeigen. Auf diese Weise können kurze, beinahe exakte Matches identifiziert werden.

Tabelle A.1 stellt eine Aufzählung von verwandten Nukleinsäuresequenzen bereit, die für GRF-Polypeptide kodieren, welche bei der Durchfürhung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind. Tabelle A.2 stellt eine Aufzählung von verwandten Nukleinsäuresequenzen bereit, die für SYT-Polypeptide kodieren, welche bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind. Tabelle A.1: Beispiele für GRF-Polypeptidsequenzen sowie kodierende Nukleinsäuresequenzen:

Bezeichnung	Herkunftsorganismus	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Polypeptid SEQ ID NO:	Datenbank-Eintragsnummer
Arath_GRF_At3G13960.1	Arabidopsis thaliana	1	2	AT3G13960.1
Arath_GRFAt2G06200.1	Arabidopsis thaliana	3	4	At2G06200.1
Arath_GRF_At2G22840.1	Arabidopsis thaliana	5	6	At2G22840.1
Arath_GRF_At36400.1	Arabidopsis thaliana	7	8	At2G36400.1
Arath_GRF_At2G45480.1	Arabidopsis thaliana	9	10	At2G45480.1
Arath_GRF_At3G52910.1	Arabidopsis thaliana	11	12	At3G52910.1
Arath_GRF_At4G24150.1	Arabidopsis thaliana	13	14	At4G24150.1
Arath_GRF_At4G37740.1	Arabidopsis thaliana	15	16	At4G37740.1
Arath_GRF_At5G53660.1	Arabidopsis thaliana	17	18	At5G53660.1
Aqufo_GRF	Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens	19	20	DT756681.1 DR946716.1
Brana_GRF	Brassica napus	21	22	CN730217.1
Horvu_GRF	Hordeum vulgare	23	24	AK250947.1
Lyces_GRF	Lycopersicon esculentum	25	26	BT013977.1
Medtr_GRF	Medicago truncatula	27	28	AC144645.17
Medtr_GRF like	Medicago truncatula	29	30	AC174350.4
Orysa_GRF_Os02g47280.2	Oryza sativa	31	32	Os02g47280.2
Orysa_GRF_Os02g53690.1	Oryza sativa	33	34	Os02g53690.1
Orysa_GRF_Os03g51970.1	Oryza sativa	35	36	Os03g51970.1
Orysa_GRF_Os04g48510.1	Oryza sativa	37	38	Os04g48510.1
Orysa_GRF_Os04g51190.1	Oryza sativa	39	40	Os04g51190.1
Orysa_GRF_Os06g02560.1	Oryza sativa	41	42	Os06g02560.1
Orysa_GRF_Os11 g35030.1	Oryza sativa	43	44	Os11g35030.1
Orysa_GRF_Os12g29980.1	Oryza sativa	45	46	Os12g29980.1
Orysa_GRF_Os03g47140.1	Oryza sativa	47	48	Os03g47140.1
Orysa_GRF-gi_115447910_ref_NM001054270.1	Oryza sativa	49	50	NM_001054270.1
Orysa_GRF-gi_115460325_ref_NM_001060298.1	Oryza sativa	51	52	NM_001060298.1
Orysa_GRF_gi_115471984_ref NM_001066126.1	Oryza sativa	53	54	NM_001066126.1
Poptr_GRF_lcl_scaffXIV.399	Populus tremuloides	55	56	lcl_scaff_XIV.39
Poptr_GRF_lcl_scaffII.1070	Populus tremuloides	57	58	lcl_scaff _II.1070
Poptr_GRF_lcl_scaffI.1018	Populus tremuloides	59	60	lcl_scaff_I.1018
Poptr_GRF_lcl_scaff28.10	Populus tremuloides	61	62	lcl_scaff_28.10
Poptr_GRF_lcl_scaff_I.995	Populus tremuloides	63	64	lcl_scaff_I.995
Poptr_GRF_lcl_scaffIII.741	Populus tremuloides	65	66	lcl_scaff_III.741
Poptr_GRF_lcl_scaffVII.1274	Populus tremuloides	67	68	lcl_scaff_VII.1274
Poptr_GRF_lcl_scaffXII.277	Populus tremuloides	69	70	lcl_scaff_XII.277
Poptr_GRF_lcl_scaff_XIII.769	Populus tremuloides	71	72	lcl_scafXIII.769
Poptr_GRF_lcl_scaffXIV.174	Populus tremuloides	73	74	lcl_scaff_XIV.174
Poptr_GRF_lcl_scaffXIV.51	Populus tremuloides	75	76	lcl_scaff_XIV.51
Poptr_GRF_lcl_scaffXIX.480	Populus tremuloides	77	78	lcl_scaff_XIX.480
Poptr_GRF_lcl_scaff28.309	Populus tremuloides	79	80	lcl_scaff_28.309
Poptr_GRF_lcl_scaffI.688	Populus tremuloides	81	82	lcl_scaff_I.688
Sacof_GRF	Saccharum officinarum	83	84	CA084837.1 CA238919.1 CA122516.1
Vitvi_GRF	Vitis vinifera	85	86	AM468035
Zeama_GRF10_gi_146008494_gb_RF515849.1	Zea mays	87	88	EF515849.1
Zeama_GRF11_gi_146008515_gb_EF515850.1	Zea mays	89	90	EF515850.1
Zeama_GRF12_gi_146008534_gb_EF515851.1	Zea mays	91	92	EF515851.1
Zeama_GRF13_gi_146008539_gb_EF515852.1	Zea mays	93	94	EF515852.1
Zeama_GRF14_gi_146008560_gb_EF515853.1	Zea mays	95	96	EF515853.1
Zeama_GRF1_gi_146008330_gb_EF515840.1	Zea mays	97	98	EF515840.1
Zeama_GRF2_gi_146008352_gb_EF515841.1	Zea mays	99	100	EF515841.1
Zeama_GRF3_gi_146008368_gb_EF515842.1	Zea mays	101	102	EF515842.1
Zeama_GRF4_gi_146008393_gb_EF515843.1	Zea mays	103	104	EF515843.1
Zeama_GRF5_gi_146008412_gb_EF515844.1	Zea mays	105	106	EF515844.1
Zeama_GRF_gi_146008429_gb_EF515845.1	Zea mays	107	108	EF515845.1
Zeama_GRF7_gi_146008440_gb_EF515846.1	Zea mays	109	110	EF515846.1
Zeama_GRF8_gi_146008461_gb_EF515847.1	Zea mays	111	112	EF515847.1
Zeama_GRF9_gi_146008475_gb_EF515848.1	Zea mays	113	114	EF515848.1

Tabelle A.2: Beispiele für SYT-Polypeptidsequenzen sowie kodierende Nukleinsäuresequenzen:

Bezeichnung	Herkunftsorganismus	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Translatierte Polypeptid SEQ ID NO:	Datenbank-Eintragsnummer
Arath_SYT1	Arabidopsis thaliana	120	121	AY102639.1
Arath_SYT2	Arabidopsis thaliana	122	123	AY102640.1
Arath_SYT3	Arabidopsis thaliana	124	125	AY102641.1
Allce_SYT2	Allium cepa	126	127	CF437485
Aqufo_SYT1	Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens	128	129	DT758802.1
Aqufo_SYT2	Aquilegia Formosa x Aquilegia pubescens	130	131	TA15831_33861 8 T25K16.15
Aspof_SYT1	Aspergillus officinalis	132	133	CV287542
Betvu_SYT2	Beta vulgaris	134	135	BQ594749.1 BQ594658.1
Bradi_SYT3	Brachypodium distachyon	136	137	DV480064.1
Brana_SYT1	Brassica napus	138	139	CD823592
Brana_SYT2	Brassica napa	140	141	CN732814
Chlre_SYT	Chlamydomonas reinhardtii	142	143	BQ814858, jgi_Chlre3_194013_estExt_fgenesh2_pg.C_510025
Citsi_SYT1	Citrus sinensis	144	145	CB290588
Citsi_SYT2	Citrus sinensis	146	147	CV717501
Cryja_SYT1	Cryptomeria japonica	148	149	TA3001_3369_2
Curlo_SYT2	Curcuma longa	150	151	TA2676_136217
Eupes_SYT	Euphorbia esula	152	153	DV144834
Frave_SYT2	Fragaria vesca	154	155	DY668312
Glyma_SYT1.1	Glycine max	156	157	TA55102_3847
Glyma_SYT1.2	Glycine max	158	159	TA51451_3847
Glyma_SYT2.1	Glycine max	160	161	BQ612648
Glyma_SYT2.2	Glycine max	162	163	TA48452_3847
Glyso_SYT2	Glycine soya	164	165	CA799921
Gosar SYT1	Gossypium arboretum	166	167	BM359324
Goshi_SYT1	Gissypium hirsutum	168	169	DT558852
Goshi_SYT2	Gossypium hirsutum	170	171	DT563805
Helan_SYT1	Helianthus annuus	172	173	TA12738_4232
Horvu_SYT2	Hordeum vulgare	174	175	CA032350
Lacse_SYT2	Lactuca serriola	176	177	DW110765
Lyces_SYT1	Lycopersicon esculentum	178	179	AW934450.1 BP893155.1
Maldo_SYT2	Malus domestica	180	181	CV084230 DR997566
Medtr_SYT1	Medicago trunculata	182	183	CA858507.1
Medtr_SYT2	Medicago trunculata	184	185	CA858743 B1310799.1 AL382135.1
Orysa_SYT1	Oryza sativa	186	187	AK058575
Orysa_SYT2	Oryza sativa	188	189	AK105366
Orysa_SYT3	Oryza sativa	190	191	BP185008
Panvi_SYT3	Panicum virgatum	192	193	DN152517
Phypa_SYT1.1	Physcomitrella patens	194	195	TA28566_3218
Phypa_SYT1.2	Physcomitrella patens	196	197	TA21282_3218
Phypa_SYT1.3	Physcomitrella patens	198	199	TA20922_3218
Phypa_SYT1.4	Physcomitrella patens	200	201	TA29452_3218
Picsi_SYT1	Picea sitchensis	202	203	DR484100 DR478464.1
Pinta_SYT1	Pinus taeda	204	205	DT625916
Poptr_SYT1	Populus trichocarpa	206	207	DT476906
Poptr_SYT2	Populus trichocarpa	208	209	scaff_XIV.493
Poptr_SYT1.2	Populus trichocarpa	210	211	CV257942.1
Prupe_SYT2	Prunus persica	212	213	DT454880.1
Sacof_SYT1	Saccharum officinarum	214	215	Ca078249.1 CA078630 CA082679 CA234526 CA239244 CA083312
Sacof_SYT2	Saccharum officinarum	216	217	CA110367
Sacof_SYT3	Saccharum officinarum	218	219	CA161933.1 CA265085
Soltu_SYT1.1	Solanum tuberosum	220	221	CK265597
Soltu_SYT1.2	Solanum tuberosum	222	223	BG590990
Soltu SYT3	Solanum tuberosum	224	225	CK272804
Sorbi_SYT1	Sorghum bicolor	226	227	TA40712_4558
Sorbi_SYT2	Sorghum bicolor	228	229	CF482417 CW376917
Sorbi_SYT3	Sorghum bicolor	230	231	CX611128
Taxof_SYT2	Taraxacum officinale	232	233	TA1299_50225
Taxof_SYT3	Taraxacum officinale	234	235	TA5000_50225
Triae_SYT1	Triticumaestivum	236	237	TA105893_4565
Triae_SYT2	Triticur aestivum	238	239	CD901951
Triae_SYT3	Triticum aestivum	240	241	BJ246754 BJ252709
Vitvi_SYT1.1	Vitis vinifera	242	243	DV219834
Vitvi_SYT1.2	Vitis vinifera	244	245	EE108079
Vitvi_SYT2.1	Vitis vinifera	246	247	EC939550
Vitvi_SYT2.2	Vitis vinifera	248	249	EE094148.1 EC964169.1
Volca_SYT	Volvox carteri	250	251	JGI_CBHO11121.fwdjGI_CBHO11121.rev
Welmi_SYT	Welwitschia mirabilis	252	253	DT598761
Zeama_SYT1	Zea mays	254	255	BG874129.1 CA409022.1
Zeama_SYT2	Zea mays	256	257	AY106697
Zeama_SYT3	Zea mays	258	259	CO468901
Homsa_SYT	Homo sapiens	260	261	CR542103

In manchen Fällen wurden verwandte Sequenzen vorläufig assembliert und von Forschungsinstituten, wie The Institute for Genomic Research (TIGR) der Öffentlichkeit bekannt gemacht. Um solche verwandten Sequenzen zu identifzieren, kann man sich der Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank bedienen, und zwar entweder durch Schlagwortsuche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz- oder Polypeptidsequenz. In anderen Fällen wurden spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen geschaffen, wie zum Beispiel von Joint Genome Institute zum Beispiel für die Pappel und für Ostreococcus tauri.
Bespiel 2: Alignment von Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Alignment von GRF-Polypeptidsequenzen
Unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (von Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) wurde ein multiples Sequenz-Alignment von allen GRF-Polypeptidsequenzen in Tabelle A.1 durchgeführt. Die Ergebnisse des Alignment für die QLQ-Domäne der GRF-Polypeptide aus Tabelle A.1 (gemäß SEQ ID NO: 115 für SEQ ID NO: 2) sind in der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Die konservierten QLQ-Aminosäurereste befinden sich oben in dem multiplen Alignment. Zwei weitere sehr stark konservierte Reste (schwarz hinterlegt) sind E (Glu) und P (Pro). Die Ergebnisse des Alignment für die WRC-Domäne der GRF-Polypeptide aus Tabelle A.1 (gemäß SEQ ID NO: 116 für SEQ ID NO: 2) sind in der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Die konservierten WRC-Aminosäurereste sind in der Konsensus-Sequenz fett gedruckt. Die drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H) umfassende „Effector of Transcription”(ET)-Domäne ist im Alignment unten identifiziert.
Alignment von SYT-Polypeptidsequenzen
Ein multiples Sequenz-Alignment von allen SYT-Polypeptidsequenzen in Tabelle A.2 wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (der auf einem modifizierten ClustalW-Algorithmus beruht; von Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt, und zwar mit den Default-Einstellungen „Gap Opening Penalty” 10 und „Gap Extension” 0,05 und ist in dargestellt. Die zwei Hauptdomänen vom N-terminalen Ende Richtung C-terminales Ende sind eingerahmt und als SNH-Domäne und Met-reiche/QG-reiche Domäne identifiziert. Außerdem ist die N-terminale Met-reiche Domäne ebenfalls eingerahmt.
Die Ergebnisse des Alignment für die SNH-Domäne der SYT-Polypeptide aus der Tabelle A.2 (gemäß SEQ ID NO: 115 für SEQ ID NO: 2) sind in der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Die am stärksten konservierten Aminosäurereste innerhalb der SNH-Domäne gemäß SEQ ID NO: 263 sind schwarz hinterlegt.
Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Die Prozentsätze für Gesamtähnlichkeit und -identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003, 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; die Software wird von Ledion Bitincka gehustet) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrices für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening Penalty 12, gap extension Penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
Scoring matrix: Blosum62
First Gap: 12
Extending gap: 2
Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B.1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der GRF-Polypeptidsequenzen (ausschließlich der Polypeptid-Partialsequenzen) und in Tabelle B.2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der SYT-Polypeptidsequenzen dargestellt.
Der Prozentsatz der Identität zwischen den Volllängen-GRF-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, kann nur 15% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 betragen.
Der Prozentsatz der Identität kann wesentlich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der QLQ-Domäne SEQ ID NO: 2 (gemäß SEQ ID NO: 115 innerhalb SEQ ID NO: 2; QLQ-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A.1 gemäß ) und den QLQ-Domänen der Polypeptide, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind, durchgeführt wird. Auf ähnliche Art und Weise kann der Prozentsatz der Identität wesentlich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der WRC-Domäne SEQ ID NO: 2 (gemäß SEQ ID NO: 116 innerhalb SEQ ID NO: 2; WRC-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A.1 gemäß ) und den WRC-Domänen der Polypeptide, die bei der Durchführung der Erfindung nützlich sind, durchgeführt wird. Der Prozentsatz der Identität über die QLQ-Domäne liegt bei den Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zwischen 25% und 99% Aminosäureidentität, und der Prozentsatz der Identität über die WRC-Domäne beträgt bei den Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, zwischen 60% und 99% Aminosäureidentität. Auch ist, wie aus hervorgeht, die WRC-Domäne bei den unterschiedlichen GRF-Polypeptiden besser konserviert als die QLQ-Domäne, siehe .
Die Prozentsätze der Aminosäureidentität zwischen den QLQ-Domänen und der Prozentsatz der Identität zwischen den WRC-Domänen sind signifikant höher als der berechnete Prozentsatz Aminosäureidentität zwischen den Volllängen-GRF-Polypeptidsequenzen.
Die prozentuale Identität zwischen den bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Volllängen-SYT-Polypeptidsequenzen kann so wenig wie 25% Aminosäureidentität im Vergleich zu der Polypeptidsequenz der SEQ ID NO: 121 betragen (siehe Tabelle B.2 und ).
Die prozentuale Identität kann wesentlich höher liegen, wenn die Identitätsberechnung zwischen der SNH-Domäne, wie sie durch die SEQ ID NO: 262 (enthalten in SEQ ID NO: 121) repräsentiert ist, und den SNH-Domänen der bei der Durchführung der Erfindung geeigneten Polypeptide vorgenommen wird. Die prozentuale Identität über die SNH-Domäne liegt unter den bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Polypeptidsequenzen zwischen 30% und 99% Aminosäureidentität.
Die Prozentwerte der Aminosäureidentität zwischen der SNH-Domäne der Polypeptide von Tabelle A.2 liegen deutlich höher als die zwischen den Volllängen-SYT-Polypeptidsequenzen berechnete Aminosäureidentität.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird von dem European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.

Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle C.1 dargestellt. Tabelle C.1: InterPro-Scanning-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2

InterPro-Eintragsnummer und -Bezeichnung	Bezeichnung in der integrierten Datenbank	Eintragsnummer in der integrierten Datenbank	Eintragsnummer in der integrierten Datenbank
IPR014977 WRC-Domäne	PFAM	PF08879	WRC
IPR014978 QLQ-Domäne	PFAM	PF08880	QLQ

Die Ergebnisse des InterPro-Scanning der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 121 sind in Tabelle C.2 dargestellt. Tabelle C.2: InterPro-Scanning-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2

InterPro-Eintragsnummer und -Bezeichnung	Bezeichnung in der integrierten Datenbank	Eintragsnummer in der integrierten Datenbank	Eintragsnummer in der integrierten Datenbank
IPR007726 SSXT-Domäne/Familie	PFAM	PF05030	SSXT-Protein (N-terminale Region)
IPR007726 SSXT-Domäne/-Familie	Panther	PTHR23107	SYNOVIAL-SARCOMA-ASSOCIATED-SS18-PROTEIN

Außerdem kann das Vorliegen einer Met-reichen Domäne oder einer QG-reichen Domäne in den SYT-Polypeptidsequenzen ebenfalls leicht nachgewiesen werden. Wie in dargestellt folgt die Met-reiche Domäne und die QG-reiche Domäne auf die SNH-Domäne. Die QG-reiche Domäne kann im Wesentlichen als der C-terminale Rest des Polypeptids (minus der SHN-Domäne) bezeichnet werden; die Met-reiche Domäne liegt typischerweise innerhalb der ersten Hälfte der QG-reichen Domäne (vom N-Terminus in Richtung C-Terminus). Die primäre Aminosäurezusammensetzung (in %) für die Bestimmung, ob eine Polypeptiddomäne reich an spezifischen Aminosäuren ist, kann unter Verwendung von Software-Programmen des ExPASy-Servers (Gasteiger E et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788), insbesondere des ProtParam-Programms, berechnet werden. Die Zusammensetzung des interessierenden Polypeptids kann dann mit der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (in %) in der Datenbank Swiss-Prot Protein Sequence verglichen werden (Tabelle C.3). Innerhalb dieser Datenbank ist der durchschnittliche Met(M)-Gehalt 2,37%, der durchschnittliche Gln(Q)-Gehalt 3,93% und der durchschnittliche Gly(G)-Gehalt 6,93% (Tabelle C.3). Im vorliegenden Zusammenhang wird eine Met-reiche Domäne oder eine QG-reiche Domäne als eine Domäne mit einem Met-Gehalt (in %) bzw. einem Gln- und Gly-Gehalt (in %) oberhalb der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (in %) der Datenbank Swiss-Prot Protein Sequence definiert. So weist zum Beispiel in SEQ ID NO: 121 die Met-reiche Domäne am N-terminalen Ende vor der SNH-Domäne (von Aminosäureposition 1 bis Aminosäureposition 24) einen Met-Gehalt von 20,8% auf, und eine QG-reiche Domäne (von Aminosäureposition 71 bis Aminosäureposition 200) weist einen Gln(Q)-Gehalt von 18,6% und einen Gly(G)-Gehalt von 21,4% auf. Vorzugsweise weist die Met-Domäne wie im vorliegenden Zusammenhang definiert einen Met-Gehalt (in %) auf, der mindestens 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25, 5,0, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75, 10 oder mehr wie die durchschnittliche Aminosäurezusammensetzung (in %) dieser Art von Proteinsequenzen, die in der Datenbank Swiss-Prot Protein Sequence vorliegen, beträgt. Vorzugsweise weist die QG-reiche Domäne wie im vorliegenden Zusammenhang definiert einen Gln(Q)-Gehalt und/oder einen Gly(G)-Gehalt auf, der mindestens 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25, 5,0, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75, 10 oder mehr wie die durchschnittliche Aminosäurezusammensetzung (in %) dieser Art von Proteinsequenzen, die in der Datenbank Swiss-Prot Protein Sequence vorliegen, beträgt. Tabelle C.3: Mittlere Aminosäurezusammensetzung (%) der Proteine in der Datenbank SWISS PROT Protein Sequence (Juli 2004):

Rest	%	Rest	%
A = Ala	7,80	M = Met	2,37
C = Cys	1,57	N = Asn	4,22
D = Asp	5,30	P = Pro	4,85
E = Glu	6,59	Q = Gin	3,93
F = Phe	4,02	R = Arg	5,29
G = Gly	6,93	S = Ser	6,89
H = His	2,27	T = Thr	5,46
I = Ile	5,91	V = Val	6,69
K = Lys	5,93	W = Trp	1,16
L = Leu	9,62	Y = Tyr	3,09

Beispiel 5: Vorhersage der Lokalisierung der GRF-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, innerhalb der Zelle
Experimentelle Methoden für die Lokalisierung von Proteinen reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). So wurde zum Beispiel ein GRF-Polypeptid in Fusion mit einem GUS-Reportergen eingesetzt, um Zwiebelepidermiszellen transient zu transformieren (van der Knapp et al. (2000) Plant Phys. 122: 695–704). Als Kompartiment des GRF-Polypeptids innerhalb der Zelle wurde der Zellkern identifiziert. Solche Verfahren zum Identifizieren der Kompartimentalisierung von GRF-Polypeptiden innerhalb der Zelle sind in der Fachwelt gut bekannt.
Durch multiples Sequenz-Alignment und anschließende visuelle Betrachtung wurde ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS) in der WRC-Domäne (CRRTDGKKWRC) des GRF-Polypeptids von Tabelle A gefunden. Bei einem NLS handelt es sich um eine oder mehrere kurze Sequenz(en) von positiv geladenen Lysin- oder Argininresten.
Es wurde eine computergestützte Vorhersage der Lokalisierung von Proteinen aus Sequenzdaten durchgeführt. Zu den Algorithmen, mit denen der Fachmann gut vertraut ist und die am ExPASy Proteomics-Server, das vom Swiss Institute for Bioinformatics gehostet wird, verfügbar sind, zählen zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale sowie andere.

Bei LOCtree handelt es sich um einen Algorithmus, mit dem die Lokalisierung und DNA-Bindungsneigung von Nichtmembranproteinen in nichtpflanzlichen und pflanzlichen Eukaryonten sowie in Prokaryonten innerhalb der Zelle vorhergesagt werden kann. LOCtree teilt eukaryontische tierische Proteine in eine von fünf subzellulären Klassen ein, während pflanzliche Proteine in eine von sechs Klassen und prokaryontische Proteine in eine von drei Klassen eingeteilt werden. In Tabelle D unten wird der Output von LOCtree unter Verwendung der Polypeptidsequenzinformation gemäß SEQ ID NO: 2 dargestellt. Vorhersagen mit hoher Konfidenz weisen einen Verlässlichkeitsindex von mehr als 5 auf. Tabelle D: Output von LOCtree unter Verwendung der Polypeptidsequenzinformation von SEQ ID NO: 2

Vorhergesagte Lokalisierung	Verlässlichkeitsindex	Lokalisierungszwischenvorhersage (Output von unterschiedlichen SVM in hierarchischen Baumstrukturen)	Verlässlichkeitsindex
DNA-Bindung	6	Nicht sezerniert, Zellkern, DNA-Bindung	8, 6, 9

Das vorhergesagte subzelluläre Kompartiment des GRF-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2 unter Verwendung des LOCtree-Algorithmus ist der Zellkern.
Beispiel 6: Assay der Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind
Die GRF-Polypeptide und SYT-Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind (zumindest in ihrer nativen Form) weisen typischerweise, jedoch nicht zwingend, Transkriptionsregulationsaktivität sowie die Fähigkeit, mit anderen Proteinen zu interagieren, auf. Die DNA-Bindungsaktivität und die Protein-Protein-Interaktionen können leicht in vitro oder in vivo unter Verwendung von fachbekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Die GRF-Polypeptide sind zur transkriptionellen Aktivierung von Reportergenen in Hefezellen befähigt (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101(36): 13374–13379). Die GRF-Polypeptide sind auch zur in-vivo-Interaktion mit SYT-Polypeptiden (auch GRF Interacting Factor oder GIF genannt) in Hefezellen befähigt, und zwar unter Verwendung eines Hefe-zwei-Hybrid-Protein-Protein-Interaktions-Assays (Kim & Kende, oben). In-vitro-Bindungsassays werden auch verwendet, um nachzuweisen, dass es sich bei den GRF-Polypeptiden und SYT-Polypeptiden um interagierende Partner handelt (Kim & Kende, oben). Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Versuche eignen sich für die Charakterisierung von GRF-Polypeptiden und SYT-Polypeptiden und sind in der Fachwelt gut bekannt.
Beispiel 7: Klonierung von Nukleinsäuresequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind:
Falls nicht anders erwähnt werden die DNA-Rekombinationstechniken nach Standardprotokollen durchgeführt, die bei Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York oder in Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols beschrieben sind. Standardmäßige Materialien und Methoden für pflanzenmolekulare Arbeiten sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, herausgegeben von BIOS Scientific Publications Ltd (GB) und Blackwell Scientific Publications (GB) beschrieben.
Klonieren einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1
Die Arabidopsis-thaliana-cDNA, die für die GRF-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert, und zwar unter Verwendung einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek, welche aus mRNA, die aus einer Pflanzengewebemischung extrahiert worden war, synthetisiert wurde. Primer prm08136 SEQ ID NO: 42;;: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaaaccattttaacgcacg). Für die PCR-Amplifizierung wurden die folgenden Primer verwendet, die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalten:

1) Prm 10010 (SEQ ID NO: 118, sense):
2) Prm 10011 (SEQ ID NO: 119, reverse, komplementär):

Klonieren einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 120
Die Arabidopsis-thaliana-cDNA, die für die SYT-Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 121 kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert, und zwar unter Verwendung einer Arabidopsis-cDNA-Bibliothek, welche aus mRNA, die aus einer Pflanzengewebemischung extrahiert worden war, synthetisiert wurde. Für die PCR-Amplifizierung wurden die folgenden Primer verwendet, die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination beinhalten:

1) Prm06681 (SEQ ID NO: 265, sense):
2) Prm 06682 (SEQ ID NO: 266, reverse, komplementär):

Für SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 120 wurden unabhängig PCR-Reaktionen durchgeführt, und zwar unter Verwendung der Hifi-Tag-DNA-Polymerase unter Standardbedingungen. Ein PCR-Fragment mit der erwarteten Länge (einschließlich der attB-Stellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden. Anschließend wurde der erste Schritt der Gateway-Vorgehensweise, die Bp-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung – gemäß Gateway-Terminologie – eines „entry clone, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde käuflich von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^® Technik erworben.
Beispiel 8: Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 120
Die „entry clones” unabhängig umfassend SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 120 wurden unabhängig anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine visuelle Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette für die LR-in-vivo-Rekombination, wobei die interessierende Nukleinsäuresequenz bereits in den „entry clone” kloniert war. Ein Reis-GOS2-Promoter (SEQ ID NO: 117) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die erhaltenen Expressionsvektoren pGOS2::GRF und pGOS2::SYT ( ) nach fachbekannten Techniken unabhängig in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 transformiert.
Beispiel 9: Pflanzentransformation
Reistransformation
Mit dem Agrobacterium, das den Expressionsvektor pGOS2:: SYT enthielt, wurden Oryza-sativa-Pflanzen transformiert. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt (Kallusinduktionsmedium) keimen gelassen. Nach vierwöchigem Inkubieren im Dunkeln wurden embryogene, von Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli vervielfacht oder vermehrt, und zwar durch Subkultur auf demselben Medium für weitere 2 Wochen. Embryogene Kallusstückchen wurden auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultivierung subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium–Stamm LBA4404, der jeden einzelnen Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale gegeben und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft und auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden von den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden.
Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Für jedes Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für die Selektionsmittel zurückbehalten, um T1-Samen zu ernten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al, 1993, Hiei et al, 1994).
Retransformation von Reis
Unter „Retransformation von Reis” versteht man im vorliegenden Zusammenhang die Transformation von Reispflanzen, die bereits für ein anderes Konstrukt transgen sind.
Insbesondere wurden Samen, die von transgenen homozygoten Pflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, exprimieren, mit dem Expressionsvektor von Beispiel 7 retransformiert. Abgesehen von diesem Unterschied bezüglich des ursprünglichen Pflanzenausgangsmaterials unter Verwendung eines unterschiedlichen Selektionsmarkers für die Retransformation im Vergleich zu dem Selektionsmarker für die ursprüngliche Transformation ging man ansonsten wie oben beschrieben vor.
Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
10.1 Aufbau der Auswertung
Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reisretransformanten erzeugt. Diese Pflanzen wurden weiterhin für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgestellt. Die Gewächshausbedingungen waren kurze Tage (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C in der Dunkelheit, und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
Für die Überprüfung des Vorliegens von (i) des isolierten Nukleinsäuretransgens, das für ein GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert; sowie von (ii) des isolierten Nukleinsäuretransgens, das für ein SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 kodiert, wurden PCR-Tests durchgeführt. PCR-Tests wurden auch bezüglich des Vorliegens und der Kopienzahl von Promotern, Terminatoren und pflanzlichen Selektionsmarkern durchgeführt. Die selektierten transgenen Pflanzen wurden weiter herangezogen, bis sie für beide Transgen-Loci homozygot waren.
10.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Events, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte als Überprüfung auf einen Effekt des Gens über alle Transformations-Events und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, auch unter der Bezeichnung globaler Geneffekt bekannt. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
10.3 Messparameter
Samenparameter-Messwerte
Die einzelnen Samenparameter (darunter Breite, Länge, Fläche) wurden mit einem speziell angefertigten Gerät gemessen, das aus zwei Hauptkomponenten, nämlich einem Wäge- und einem Imaging-Gerät bestand, die mit Software für die Image-Analyse verbunden waren.
Beispiel 11: Ergebnisse der Samengrößenmessungen von von retransformierten Reispflanzen geernteten Samen
Homozygote transgene Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters exprimieren, wurden mit dem Expressionsvektor von Beispiel 7 oben, der die Nukleinsäuresequenz, die für das GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, ebenfalls unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters, umfasst, retransformiert. Die retransformierten Reispflanzen wurden weiter herangezogen, bis sie für beide Loci homozygot waren.
zeigt links eine Rispe einer Reispflanze (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare), die mit einem Kontrollvektor transformiert ist, und rechts eine Rispe von einer Reispflanze (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare), die mit zwei Konstrukten transformiert ist: (1) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert; sowie (2) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert. Die mit beiden Konstrukten transformierten Reispflanzen sind für beide Loci homozygot. In dem retransformierten Reis sind Pflanzenbiomasse, Anzahl Rispen, Rispengröße, Anzahl Samen und Samengröße im Vergleich zu denselben Parametern bei mit einem Kontrollvektor transformiertem Reis eindeutig erhöht.
Samen, die von den retransformierten Reispflanzen geerntet worden waren und die für beide Loci homozygot waren, wurden geernet, und Stichproben von 30 Samen wurden fotografiert. zeigt in der oberen Reihe von links nach rechts 30 reife Samen (Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare) von:

(a) Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 120 unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, transformiert wurden;
(b) Pflanzen, die mit zwei Konstrukten transformiert wurden: (1) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert; sowie (2) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 120 unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert;
(c) Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 unter der Kontrolle eines GOS2-Promoters (pGOS2) aus dem Reis kodiert, transformiert wurden;
(d) nullizygote Pflanzen (Kontrollpflanzen) von a;
(e) nullizygote Pflanzen (Kontrollpflanzen) von c.

Anschließend wurde mit den homozygoten Samen von 6 transgenen Events ein Imaging durchgeführt, um die durchschnittliche Samenfläche, die durchschnittliche Samenlänge und die durchschnittliche Samenbreite abzuschätzen, und die Werte wurden anschließend mit denselben Parametern, die an (i) homozygoten Samen von Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, transformiert worden waren, sowie (ii) Samen von Kontrollpflanzen (Nullizygoten) von (i) gemessen worden waren, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle E unten angeben. Tabelle E: Ergebnisse der Samenflächen-, Samenlängen- und Samenbreitenmessungen von Samen, die von homozygoten retransformierten Reispflanzen geernet worden waren, im Vergleich zu entsprechenden Kontrollsamen.

	Im Vergleich zu homozygoten Samen von Pflanzen, die mit einem Konstrukt umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, transformiert worden waren	Im Vergleich zu Samen von Kontrollpflanzen (Nullizygoten)
Samenfläche	mindestens 11% Erhöhung	mindestens 26% Erhöhung
Samenlänge	mindestens 8% Erhöhung	mindestens 21% Erhöhung
Samenbreite	mindestens 3% Erhöhung	mindestens 6% Erhöhung

Beispiel 12: Beispiele für die Transformation von anderen Kulturen
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt unter Abwandlung der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Transformation beim Mais ist genotypabhängig, und nur bestimmte Genotypen eignen sich für die Transformation und Regeneration. Gute Herkünfte von Donormaterial für die Transformation sind die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elter, es können jedoch auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP), wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt, werden die Kolben von den Maispflanzen geerntet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Die herauspräparierten Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Maisregenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Maisbewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit der von Ishida et al, (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50 beschriebenen Methode. Die Sorte Bobwhite (vom CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Die unreifen Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, der den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolidinon, es können jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) herangezogen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang oder bis sich Sprosse entwickeln in Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium umgesetzt und 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Die Transformation von Sojabohne erfolgt unter Abwandlung der im Texas A&M Patent US 5,164,310 beschriebenen Methode. Für die Transformation nach dieser Methode eignen sich mehrere im Handel erhältliche Sojabohnensorten. Die Sorte Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird häufig für Transformationszwecke verwendet. Sojabohnensamen werden sterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Hypokotyl, Keimwurzel und ein Keimblatt werden von sieben-Tage-alten Jungkeimpflanzen herauspräpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter herangezogen, um Achselnodien zu entwickeln. Diese Achselnodien werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedium umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von nicht mehr als 1 cm werden auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps/Canola-Transformation
Als Explantate für die Gewebekultur werden Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5-6-Tage alten Jungkeimpflanzen verwendet und nach dem Verfahren von Babic et al, (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für Transformationszwecke verwendete Standardsorte, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Canola-Samen werden oberflächensterilisiert, um in vitro ausgesät zu werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit dem daran haftenden Keimblatt werden aus den in-vitro-Keimpflanzen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden anschließend bei 23°C und 16 Stunden Licht 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0.7% Phytagar kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterum werden die Petiolenexplantate 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxime, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Sobald die Sprosse 5–10 mm lang sind, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0.5, mit 0.5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zur Induktion von Wurzeln auf Bewurzelungsmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erde umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Luzernetransformation
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird nach dem Verfahren von (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und es ist daher eine regenerierende Pflanze erforderlich. Verfahren zur Gewinnung von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Diese können zum Beispiel wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) aus der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen sonstigen im Handel erhältlichen Luzernesorte selektiert werden. Alternativ dazu wurde die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur selektiert (Walker et al, 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Es werden Petiolenexplantate mit einer Obernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al, 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthält, cokultiviert. Die Pflanzen werden 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium mit 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4.35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon cokultiviert. Die Explantate werden mit halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dasselbe SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, jedoch mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden die somatischen Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium ohne Wachstumsregulatoren, ohne Antibiotika, jedoch mit 50 g/l Saccharose umgesetzt. Somatische Embryonen keimten anschließend auf halbkonzentriertem Murashige-Skoog-Medium aus. Bewurzelte Keimlingspflanzen wurden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gebildet, die eine Toleranz für das Selektionsmittel aufweisen und die eine einzelne Kopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypocotylexplantaten transformiert. Bei den im Handel erhältlichen Kultivaren wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) handelt es sich um Standardsorten, die für die Transformation verwendet werden, es können jedoch auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln keimen gelassen. Von den gekeimten Keimpflanzen werden Hypocotylexplantate in Längen von ungefähr 1–1,5 cm geschnitten. Das Hypocotylexplantat wird in dem Agrobacterium-tumefaciens-Inoculum, das den Expressionsvektor enthält, 5 Minuten lang eingetaucht, und dann ungefähr 48 Stunden lang auf MS + 1,8 mg/l KNO₃ +2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden auf dasselbe Medium, das entsprechende Bakterien- und Pflanzenselektionsmarker enthält (und das mehrmals erneuert wird) umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden können. Die Kalli werden abgetrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen erscheinen. Die Pflänzchen, die aus den somatischen Embryonen entstehen, werden auf Bewurzelungsmedium reifen gelassen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von den Pflanzen, die eine Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufweisen und die eine einzige Kopie des T-DNA-Inserts enthalten, produziert.
Zusammenfassung
Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Erhöhung verschiedener Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Erhöhung der Expression von Folgendem in einer Pflanze: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Growth-Regulating Factor(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”synovial sarcoma translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer der folgenden erhöht sind: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer erhöhten Expression von (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; und von (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einer der folgenden: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert; oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Erhöhung von pflanzlichen Ertragsmerkmalen, bei dem man die Expression von Folgendem: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”Growth-Regulating Factor”(GRF)-Polypeptid kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”Synovial Sarcoma Translocation”(SYT)-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht, wobei die Ertragsmerkmale im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, erhöht sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das GRF-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne gemäß SEQ ID NO: 115; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne gemäß SEQ ID NO: 116.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das GRF-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014978 (PFAM-Eintrag PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR014977 (PFAM-Eintrag PF08879); und (iii) eine ”Effector of Transcription”(ET)-Domäne umfassend drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Beabstandung (CX₉CX₁₀CX₂H).
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das GRF-Polypeptid in steigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRF-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 oder zu einer der Polypeptidsequenzen in Tabelle A.1 im vorliegenden Text aufweist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, von einer der Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs in Tabelle A.1 oder einem Teil davon, oder einer Sequenz, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NOs in Tabelle A.1 zu hybridisieren, dargestellt wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einer der GRF-Polypeptidsequenz-SEQ ID NOs in Tabelle A.1 kodiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, operativ mit einem konstitutiven Promoter, stärker bevorzugt mit einem GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promoter aus Reis gemäß SEQ ID NO: 117, verknüpft ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei das SYT-Polypeptid vom N-terminalen zum C-terminalen Ende Folgendes umfasst: (i) eine SNH-Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SNH-Domäne von SEQ ID NO: 262; und (ii) eine Met-reiche Domäne; und (iii) eine QG-reiche Domäne.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 9, wobei das SYT-Polypeptid weiterhin die am stärksten konservierten Reste der SNH-Domäne gemäß SEQ ID NO: 263 umfasst und in schwarz dargestellt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9 oder 10, wobei das SYT-Polypeptid eine Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu der SSXT-Domäne mit einem InterPro-Eintrag IPR007726 gemäß SEQ ID NO: 264 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9 oder 10, wobei das SYT-Polypeptid eine Domäne mit in steigender Bevorzugung mindestens 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem SYT-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 121 oder zu einem der Volllängen-Polypeptidsequenzen in Tabelle A.2 im vorliegenden Text aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9, 10, 11 oder 12, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, von einer der Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs in Tabelle A.2 oder einem Teil davon, oder einer Sequenz, die fähig ist, mit einer der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NOs in Tabelle A.2 zu hybridisieren, dargestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9, 10, 11, 12 oder 13, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einer der SYT-Polypeptidsequenz-SEQ ID NOs in Tabelle A.2 kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, operativ mit einem konstitutiven Promoter, stärker bevorzugt mit einem GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promoter aus Reis gemäß SEQ ID NO: 117, verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, von einer Pflanze, vorzugsweise von einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt von der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt von Arabidopsis thaliana, stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erhöhte Expression dadurch bewirkt wird, dass man in eine(r) Pflanze Folgendes einführt und exprimiert: (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii) der Reihe nach in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert werden, vorzugsweise durch Kreuzen, stärker bevorzugt durch Retransformation.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Kreuzen zwischen einer weiblichen Elternpflanze umfassend eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, und einer männlichen Elternpflanze umfassend eine eingeführte und exprimierte isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, oder umgekehrt, und durch Selektieren in der Nachkommenschaft auf das Vorliegen und die Expression von beiden Transgenen erfolgt, wobei die Pflanze im Vergleich zu jeder Elternpflanze erhöhte Ertragsmerkmale aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Retransformation dadurch erfolgt, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, einen/einem Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle umfassend eine eingeführte und exprimierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, oder umgekehrt, einführt und exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii) gleichzeitig in eine(r) Pflanze eingeführt und exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Nukleinsäuresequenzen von (i) und (ii) in einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen umfasst sind.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei dem erhöhten Ertragsmerkmal um eines oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samenfüllungsrate; (v) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; (vi) erhöhter Harvest Index; oder (vii) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert und die Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, operativ und sequentiell mit einem konstitutiven Promoter, bevorzugt mit einem pflanzlichen konstitutiven Promoter, stärker bevorzugt mit einem GOS2-Promoter, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promoter aus Reis gemäß SEQ ID NO: 117, verknüpft sind.
Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die nach einem Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich sind, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon Folgendes umfasst: (i) ein isoliertes Nukleinsäuretransgen, das für ein GRF-Polypeptid kodiert, und (ii) ein isoliertes Nukleinsäuretransgen, das für ein SYT-Polypeptid kodiert.
Konstrukt, das Folgendes umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert kodiert; (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 9 bis 13 definiert kodiert; (c) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Erhöhung der Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) und gemäß (b) voranzutreiben vermag/vermögen; sowie gegebenenfalls (d) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 26, wobei es sich bei der Kontrollsequenz um mindestens einen konstitutiven Promoter, vorzugweise um einen GOS2-Promoter, stärker bevorzugt einen GOS2-Promoter gemäß SEQ ID NO: 117, handelt.
Mischung von Konstrukten, wobei mindestens ein Konstrukt Folgendes umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die fähig sind, die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) voranzutreiben; sowie gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, und wobei mindestens ein anderes Konstrukt Folgendes umfasst: (d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 9 bis 13 definiert kodiert; (e) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die fähig sind, die Expression der Nukleinsäuresequenz von (d) voranzutreiben; sowie gegebenenfalls (f) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 28, wobei es sich bei der Kontrollsequenz von (b) und/oder (e) um mindestens einen konstitutiven Promoter, vorzugweise um einen GOS2-Promoter, stärker bevorzugt einen GOS2-Promoter gemäß SEQ ID NO: 117, handelt.
Verwendung eines Konstrukts nach den Ansprüchen 26 oder 27 oder von einer Mischung von Konstrukten nach Anspruch 28, bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert oder (b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei es sich bei den erhöhten Ertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samenfüllungsrate; (v) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; (vi) erhöhter Harvest Index; oder (vii) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach den Ansprüchen 26 oder 27 oder einer Mischung von Konstrukten nach Anspruch 28 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit erhöhter Expression entweder (i) einer für ein GRF-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz oder (ii) einer für ein SYT-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz, wobei man a. eine für ein GRF-Polypeptid mit der in einem der Ansprüche 2 bis 6 angegebenen Bedeutung kodierende Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines konstitutiven Promoters in eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle einführt und darin exprimiert und b. eine für ein SYT-Polypeptid mit der in einem der Ansprüche 9 bis 13 angegebenen Bedeutung kodierende Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines konstitutiven Promoters in eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder eine Pflanzenzelle einführt und darin exprimiert und c. die Pflanzenzelle, den Pflanzenteil oder die Pflanze unter Pflanzenwachstum und -entwicklung fördernden Bedingungen kultiviert.
Transgene Pflanze mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) eines Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, die das Ergebnis einer erhöhten Expression von Folgendem sind: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert kodiert; und (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 13 definiert kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die/der von der transgenen Pflanze abstammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 25, 31 oder 33, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine monokotyle Pflanze oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, oder um eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt, handelt.
Erntbare Teile einer Pflanzen nach Anspruch 34, umfassend: (i) Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert eine isolierte, oder (ii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei es sich bei den erntbaren Teilen vorzugsweise um Samen handelt.
Produkte, die von einer Pflanze nach Anspruch 34 und/oder von erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 35 abstammen.
Verwendung von (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert kodiert; und von (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 9 bis 13 definiert kodiert, bei der Erhöhung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Pflanzen mit einer erhöhten Expression von einem der Folgenden: (i) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GRF-Polypeptid kodiert, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein SYT-Polypeptid kodiert, wobei es sich bei den erhöhten Ertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhte Jungpflanzenwüchsigkeit; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samenfüllungsrate; (v) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; (vi) erhöhter Harvest Index; oder (vii) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).