DE112008001879T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu irer Herstellung - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, in einer Pflanze und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzen-Ertragsmerkmale durch Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20),
    einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)-Polypeptid ist),
    einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid, und
    einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit erhöhter Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen für kulturpflanzen- und gartenbauliche Verbesserungen nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
  • Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung von einem oder mehreren der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
  • Der Harvest index, das Verhältnis von Samenertrag zum Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, und so kann oft eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (beispielsweise Rebetzke et al 2002 Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil der Großteil der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten Photosyntheseproduktivität der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängt (Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Daher wurde die Selektion auf Pflanzengröße sogar in frühen Entwicklungsstufen als Indikator für einen zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet (beispielsweise Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Bei der Untersuchung auf die Auswirkung genetischer Unterschiede auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung der Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit und Lichtintensität ein intrinsischer Vorteil von den Umgebungen im Gewächshaus oder in der Pflanzenwachstumskammer im Vergleich zum Feld. Künstliche Einschränkungen des Ertrags aufgrund einer schlechten Bestäubung wegen des Fehlens von Wind oder Insekten oder eines unzureichenden Raums für das Wachstum der reifen Wurzel oder Krone, können die Verwendung solcher kontrollierten Umgebungen zur Untersuchung der Ertragsunterschiede einschränken. Daher sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder in einem Gewächshaus Standard-Praktiken, die potentielle genetische Ertragsvorteile anzeigen.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrema, chemische Toxizität, Überschuss oder Fehlen von Nährstoffen (Makroelementen und/oder Mikroelementen), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für eine korrekte Boden-Verankerung in wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf der Basis von dem im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasma im Europäischen Atlantik.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextrema, chemische Toxizität, Überschuss oder Fehlen von Nährstoffen (Makroelementen und/oder Mikroelementen), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Ertragsmerkmale von Pflanzen zu verbessern, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
  • Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
  • Ein Ansatz zur Steigerung der Ertragsmerkmale (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
  • Es wurde jetzt entdeckt, dass verschiedene Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ohne verzögerte Blüte durch Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein kernlokalisiertes AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20) Polypeptid kodiert, in einer Pflanze verbessert werden können. Die verbesserten Samenertragsmerkmale umfassen ein oder mehrere Merkmale aus den folgenden: erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe, gesteigerter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerte Anzahl gefüllter Samen und gesteigerter Harvest Index.
  • Es hat sich weiter herausgestellt, dass die Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)-Polypeptid ist, unter abiotischen Stressbedingungen gewachsene Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gewachsenen Pflanzen ergibt.
  • Es wurde zudem gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, in oberirdischen Pflanzenteilen, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere gesteigertem Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Es wurde zudem entdeckt, dass die Ertragsmerkmale der unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsenen Pflanzen verbessert werden können, indem die Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, in solchen Pflanzen moduliert wird.
  • Stand der Technik
  • Bei DNA-bindenden Proteinen handelt es sich um Proteine, die eine beliebige von vielen DNA-Bindemotiven enthalten, und somit eine spezifische oder allgemeine Affinität für DNA haben. Zu den DNA-bindenden Proteinen gehören z. B. Transkriptionsfaktoren, die den Prozess der Transkription modulieren, Nukleasen, die DNA-Moleküle spalten und Histone, die an der DNA-Verpackung im Zellkern beteiligt sind.
  • Das AT-hook Motiv ist ein kurzes DNA-bindendes Proteinmotiv, das zuerst in der Hochmobilitätsgruppe chromosomaler Nicht-Histon-Proteine, HMG-I/Y, beschrieben wurde (Reeves und Nissen (1990) J Biol Chem 265: 8573–8582). Der AT-hook interagiert bekanntlich mit der kleinen Furche AT-reicher Nukleinsäuresequenzen (Huth et al. (1997) Nat Struc Biol 4: 657–665). AT-hook Motive wurden in vielen verschiedenen DNA-bindenden Proteinen aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen identifiziert. Im Gegensatz zu mehreren gut charakterisierten DNA-bindenden Motiven ist das AT-hook Motiv kurz, d. h. bis zu 13 Aminosäurereste, und besitzt eine typische Tripeptidsequenz mit einem Glycin-Arginin-Prolin (Gly-Arg-Pro oder GRP) in seiner Mitte.
  • In Arabidopsis thaliana, umfassen etwa 30 Polypeptide, die mindestens ein AT-hook Motiv aufweisen zudem eine in Pflanzen und Prokaryoten konservierte (plant and prokaryotes conserved (PPC)) Domäne, die als DUF296 (Domäne unbekannter Funktion 296) in der InterPro Domänen-Datenbank des European Bioinformatics Institute (EBI) beschrieben ist (Fujimoto et al. (2004) Plant Molec Biol 56: 225–239). Eines dieser Proteine ist Befunden zufolge im Nukleoplasma lokalisiert und wird demnach als kernlokalisiertes Protein 1 mit AT-hook-Motiv (AT-hook motif nuclear localized protein 1 (AHL1; Fujimoto et al., siehe oben)) bezeichnet. Die paralogen Polypeptide wurden entsprechend bezeichnet, d. h. AHL, und fortlaufend nummeriert.
  • In US Patent 7,193,129 , und in der US Patentanmeldung 2005/0097638 , wurden ein Arabidopsis thaliana AHL Polypeptid, AHL19 (nach Fujimoto et al., siehe oben) (identifiziert als G2153) in Arabidopsis transformiert und mit dem 35S CaMV Promotor exprimiert. Transgene Pflanzen zeigten modifizierte Merkmale, wie eine gesteigerte Salzstressresistenz, gesteigerte Resistenz gegenüber osmotischem Stress, gesteigerte Trockenheitsresistenz, gesteigerte Toleranz gegenüber Gefrieren und gesteigerte Pflanzenreaktion gegen Zucker. In der US Patentanmeldung 2005/0097638 verzögerte die Überexpression (unter der Kontrolle eines 35S CaMV Promotors) des AHL19 Polypeptids, sowie verschiedener paraloger AHL Polypeptide, signifikant die Blüte in den transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, so dass der Ertrag gesteigert wurde.
  • Zusammenfassung
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Samenertragsmerkmale umfassen ein oder mehrere Merkmale aus gesteigerter Anzahl Blüten pro Rispe, gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen und gesteigertem Harvest Index.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale einer unter abiotischen Stressbedingungen gewachsenen Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen ein oder mehrere aus gesteigerter oberirdischer Biomasse, gesteigertem Gesamtsamenertrag pro Pflanze, gesteigerter Anzahl gefüllter Samen, gesteigerter Gesamtsamenzahl, gesteigerter Anzahl Primärrispen und gesteigerter Samenfüllrate.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, in oberirdischen Pflanzenteilen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, moduliert (vorzugsweise erhöht), indem man die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft, der in oberirdischen Pflanzenteilen aktiv ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, die unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsen sind, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
  • Homologon/Homologa
  • ”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten.
  • Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest konservative Substitutionen Rest konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bestens bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins.
  • ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Überblick über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholg(a)/Paralog(a)
  • Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologa sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
  • Motiv/Konsensussequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
  • Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter Tm liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter Tm liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen, und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
  • Bei dem Tm-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der Tm-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem Tm-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden sinkt der Tm-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der Tm-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]–1 – 0,61 × % Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (In) a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau. b nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau. c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren. d oligo, Oligonukleotid; In, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).
  • Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuremoleküle mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
  • Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden, oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder künstlich hergestellt. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismus (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Genshuffling/gerichtete Evolution
  • Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die diejenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, exprimieren können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäuresequenzkontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression auf Entwicklungsreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, der in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuresequenzmoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
  • Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Der ”pflanzliche Promotor” stammt vorzugsweise von einer Pflanzenzelle ab, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Nukleotidsequenzen gelegenen Promotoren können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man beispielsweise den Promotor funktionsfähig mit einem Reporter-Gen verknüpft und das Expressionsausmaß und/oder das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bestens bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase. Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert. ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripten, bis etwa 1/500000 Transkripten pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel, oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle. Ein ”mittelstarker Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem Spiegel steuert, der in allen Fällen unter demjenigen Spiegel liegt, der sich unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Promotors ergibt.
  • Funktionsfähig verknüpft
  • Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Pflanzenpromotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Actin McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990
    HMGB WO 2004/070039
    GOS2 de Pater et al, Plant J Nov; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
    Ubiquitin Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
    Reis-Cyclophilin Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837–43, 1994
    Mais H3-Histon Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
    Luzerne H3-Histon Wu et al. Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
    Actin 2 An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996
    Rubisco kleine Untereinheit US 4,962,028
    OCS Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553
    SAD1 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    V-ATPase WO 01/1 4572
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsregulierter Promotor
  • Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturstelle
    RCc3 Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
    Arabidopsis PHT1 Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
    Medicago Phosphat-Transporter Xiao et al., 2006
    Arabidopsis Pyk10 Nitz et al. (2001) Plant Sci 161(2): 337–346
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    auxininduzierbares Gen aus Tabak Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
    β-Tubulin Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.
    wurzelspezifische Gene aus Tabak Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
    B. napus G1-3b Gen United States Patent No. 5, 401, 836
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    BTG-26 Brassica napus US 20050044585
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    KDC1 (Daucus carota) Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
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    OsRAB5a (Reis) Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
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    Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys 91: 124–129
    wurzelspezifisches hydroxyprolinreiches Protein Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3: 1639–1646
    Arabidopsis CDC27B/hobbit Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16: 2566–2575
  • Ein samenspezifischer Promotor ist vorwiegend in Samengewebe transkriptionell aktiv, aber nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (in Fällen einer leaky Expression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2c angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, deren Offenbarung hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen ist. Tabelle 2b: Beispiele für samenspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen EMBO J. 3: 1409–15, 1984
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    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
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    Reis-OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
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    Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157–68, 1997
    Mais-ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    α-Kafirin aus Sorghumhirse DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
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    PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis WO 2004/070039
    PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, Reis-WSI18 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis-RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
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    Cathepsin β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
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    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38,1998
  • Ein ”in oberirdischen Teilen aktiver Promotor” ist ein Promotor, der vorzugsweise die Transkription in oberirdischen Teile einer Pflanze initialisieren kann, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss jeglicher anderer Pflanzenteile (insbesondere unterirdischer Teile), wobei sie aber noch eine ”leaky” Expression in diesen anderen Pflanzenteilen ermöglichen. Die nachstehende Tabelle 2d zeigt Beispiele für solche Promotoren, die vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv sind.
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ein ”leaky” Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Beispiele für Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind und die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2d dargestellt. Tabelle 2d: Beispiele für Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind:
    Gen Expression Literaturangabe
    Orthophosphatdikinase aus Mais Blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Mais Blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Reis Blattspezifisch Liu et al., 2003
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Reis Blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Beta-Expansin EXBP9 aus Reis Sprossspezifisch WO 2004/070039
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Straucherbse Blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    RBCS3A aus Erbse Blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky” Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promotoren, die für das grüne Meristem spezifisch sind und die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2e dargestellt. Tabelle 2e: Beispiele für meristemspezfische Promotoren:
    Herkunftsgen Expressionsmuster Literaturangabe
    Reis-OSH1 Sprossapikalmeristem, von globulärem Embryostadium bis zum Keimlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein Meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK2 Spross- und Wurzelapikalmeristeme, sowie in sich ausbreitenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
    Tabelle 2f: Beispiele für endospermspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al., (1987), FEBS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
    LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2
    Weizen-SPA Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184
    Weizen-Gliadine Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15
    Itr1-Promotor aus der Gerste Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    B1, C, D, Hordein aus der Gerste Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
    Gersten-DOF Mena et al., (1998), Plant J. 116(1): 53–62
    blz2 Onate et al., (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., (1998), Plant J. 13: 629–640
    Reis-Prolamin NRP33 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis-Globulin Glb-1 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
    Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68
    Mais-ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46
    Sorghumhirse-Kafirin DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2g: Beispiele für embryospezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Reis-OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2h: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin-β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gersten-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38,1998
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Modulation
  • Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze geändert ist, bevorzugt, dass das Expressionsausmaß erhöht ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine Art Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” bedeutet eine Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation des letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie es hier verwendet wird, steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegels hinaus geht.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren getrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die das interessierende Polypeptid kodiert, aufwärtsreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise hergeleitet sein von Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Genen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen.
  • Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz zugegeben werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in Pflanzen- und Tier-Expressionskonstrukten steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebenen bis zu 1000fach (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intron-Steigerung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind im Stand der Technik bekannt. Für eine allgemeine Information siehe: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ein ”endogenes” Gen betrifft nicht nur das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form gefunden wird (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen, (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure bzw. Gen) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Eine transgene Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann beispielsweise eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren.
  • Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” der Expression soll eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung ist in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge der im Wesentlichen durchgehenden Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen, alternativ kann dies sogar das ganze Gen sein (u. a. mit der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann von der Nukleinsäuresequenz, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer Nukleinsäuresequenz hergeleitet werden, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann. Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Präferenz 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Erfordernis für die verschiedenen hier erörterten Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäuresequenz oder einem Teil davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine kodieren kann), d. h. vorzugsweise eine Hairpin-Struktur bilden kann. Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) in Sense-Orientierung in eine Pflanze. Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Das Gen-Silencing kann auch durch Insertions-Mutagenese erzielt werden (beispielsweise T-DNA Insertion oder Transposoninsertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. beschrieben sind von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ). Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können spezifisch genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., (2005) Dev Cell 8(4): 517–27). Zweckmäßige Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121–33).
  • Genauer:
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA) kloniert wird, in einer Pflanze.
  • In einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einem Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), der vorzugsweise eine Hairpin-Struktur bilden kann, reduziert oder im Wesentlichen eliminiert. Der inverted repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fragment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker, etc.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebracht sind (RISC). Der RISC spaltet zudem die mRNA-Transkripte, wodurch im Wesentlichen die Anzahl der mRNA-Transkripte in Polypeptide translatiert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten können beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ) herangezogen werden.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, aber eine oder mehrere einiger bekannter ”Gen-Silencing”-Verfahren kann zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
  • Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) getriggert, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird weiter durch die Pflanze in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der zu einem Polypeptid zu translatierenden mRNA-Transkripte im Wesentlichen verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht vorzugsweise einem Zielgen.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäure-Sequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Reduktion der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Triggern der Co-Suppression gibt.
  • Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotid-Sequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem zu silencenden endogenen Gen. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nicht- kodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'- untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß der Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon des interessierenden Proteins kodieren kann), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz Antisense-Orientierung aufweist (wie auch mRNA 5' und 3' UTR). Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotid-Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotid-Sequenz) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bestens bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen umfassen Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch produziert werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die aus der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, ist zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung). Die Produktion der Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die Nukleinsäuremoleküle, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Silencen verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden, oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Anzielen ausgewählter Zellen modifiziert werden und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch auf Zellen übertragen werden, und zwar mit den hier beschriebenen Vektoren.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch mit Ribozymen durchgeführt werden. Die Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz spalten können, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die ein Polypeptid kodieren, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, zur Auswahl einer katalytischen mRNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen ausgewählt werden (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Das Gensilencing kann ebenfalls durch Insertionsmutagenese erzielt (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. von Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben wurden.
  • Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Ein Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutationen und/oder Verkürzungen können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), die aber ihre normale Funktion nicht ausüben können (beispielsweise als signalgebender Ligand).
  • Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens komplementär sind (beispielsweise Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifach helikale Strukturen erzeugt werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass sich von Menschenhand gemachte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, eignet.
  • Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Genvarianten identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
  • Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (miRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten Pflanzen-mikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Mismatches. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie durch Bindung an ihre Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht. MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC), da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und die Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
  • Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können spezifisch genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckmäßige Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
  • Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer vollständigen Pflanze oder in Teilen davon durch die Verwendung beispielsweise eines geeigneten Promotors erzielt wird.
  • Selektionsmarker(gen)/Reportergen
  • ”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuresequenzen erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuresequenzen erfolgreich Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Das Cotransformations-Verfahren setzt 2 Vektoren ein, die simultan zur Transformation eingesetzt werden, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält, oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien, erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette veranschaulicht. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäuresequenz-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/lox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert, wird er entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
    • (b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promotor, oder
    • (c) a) und b)
    sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es sich bei der Modifikation zum Beispiel um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten handeln kann. Unter der natürlichen genetischen Umgebung versteht man den natürlichen genomischen oder chromosomalen Locus in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bank. Bei einer genomischen Bank wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest auf einer Seite und weist eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 Bp, auf. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, das bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch unnatürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren wie zum Beispiel mutagene Behandlung modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuresequenzen homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäuresequenzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein T M et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben tansgene Pflanzen. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, K A und Marks M D (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, S J und Bent A F (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungstagging
  • T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) in der genomischen Region des interessierenden Gens von bis zu 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer solchen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium Infektion und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuresequenzen, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei G P und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua N H, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz E M, Somerville C R, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods on Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, N J, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bestens bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz in ein Genom, an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen verwendet wird, wie Hefe und das Moos Physcomitrella. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077–84) sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030–4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einher geht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro Acre für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten Acres dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse, Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
  • Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde gut balancierte Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit einer Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen erreicht im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien) und oft einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
  • Samenertrag
  • Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro Hektar oder Acre; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe und/oder pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) eine erhöhte Anzahl von Primärrispen; g) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
  • Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
  • Greenness Index
  • Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen, und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen, wird der Greenness Index der Pflanzen in der erste Bildnahme nach dem Trockenstress gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
  • Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (bspw. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (bspw. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (bspw. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (bspw. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (bspw. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (bspw. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (bspw. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (bspw. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (bspw. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (bspw. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen ohne verzögerte Blüte im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird in einer Ausführungsform auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein AHL19/20 Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Jede Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” bedeutet im Folgenden eine Nukleinsäuresequenz, die ein solches AHL19/20 Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäuresequenz, die für den Typ Polypeptid kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und sie wird im Folgenden auch als ”AHL19/20 Nukleinsäuresequenz” oder ”AHL19/20 Gen” bezeichnet.
  • Ein ”AHL19/20 Polypeptid”, wie es hier definiert ist, steht für ein Polypeptid, das eine Domäne aufweist, die mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne (CD) nach SEQ ID NO: 36 (enthalten in SEQ ID NO: 2) hat.
  • Alternativ oder zusätzlich steht ”AHL19/20 Polypeptid” wie es hier definiert ist, für ein Polypeptid, umfassend: (i) ein Motiv mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem AT-hook Motiv nach SEQ ID NO: 37; und (ii) eine Domäne mit mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer in Pflanzen und Prokaryoten konservierten (plant and prokaryote conserved, PPC) Domäne nach SEQ ID NO: 38.
  • Alternativ oder zusätzlich steht ”AHL19/20 Polypeptid” wie es hier definiert ist, für ein Polypeptid, umfassend: (i) ein Kernlokalisationssignal; (ii) ein AT-hook DNA-Bindungsmotiv mit einem InterPro Eintrag IPR014476; und (iii) einer in Pflanzen und Prokaryoten konservierten (plant and prokaryote conserved, PPC) Domäne mit einem InterPro Eintrag IPR005175.
  • Alternativ oder zusätzlich steht ”AHL19/20 Polypeptid” wie es hier definiert ist, für eine Polypeptidsequenz, die bei Verwendung zur Konstruktion eines AHL Stammbaums, wie er in 1 und in 2 gezeigt ist, eher mit der AHL19/20 Gruppe der Polypeptide, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, Cluster bildet als mit irgend einer anderen AHL Gruppe.
  • Alternativ oder zusätzlich steht ”AHL19/20 Polypeptid” wie es hier definiert ist, für ein Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 aufweist oder zu einer der in der Tabelle A hierin angegebenen Volllängen-Polypeptidsequenzen.
  • Es wurde nun weiter entdeckt, dass die Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist, Pflanzen ergibt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen bereit, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GRP Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird in einer Ausführungsform auf ein ”Polypeptid, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein GRP-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Jede Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” steht für eine Nukleinsäuresequenz, die ein solches GRP-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid-Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäuresequenz, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und sie wird im Folgenden auch als ”GRP Nukleinsäuresequenz” oder ”GRP Gen” bezeichnet.
  • Ein ”GRP-Polypeptid”, wie es hier definiert ist, steht für die Proteine nach SEQ ID NO: 46, und für Orthologa, Paraloga, und Homologa davon.
  • Die Orthologa, Paraloga und Homologa von SEQ ID NO: 46 haben vorzugsweise einen InterPro Eintrag IPR000347, der als Pflanzen-Metallothionein, Familie 15, beschrieben ist.
  • Alternativ oder zusätzlich steht ein ”GRP Polypeptid” wie es hier definiert ist, für ein Polypeptid, das in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRP Polypeptid nach SEQ ID NO: 46 aufweist.
  • Metallothioneine sind in Stand der Technik bestens bekannt. Für einen aktuellen Überblick siehe Cobbett and Goldsbrough (2002). Metallothioneine sind kleine Proteine mit hantelförmiger Konformation, die ihren Ursprung in konservierten N-terminalen und C-terminalen cysteinreichen Domänen finden, die durch einen Bereich variabler Länge und Aminosäure-Zusammensetzung voneinander getrennt sind. Auf der Basis der Primärstruktur werden 4 Arten von Metallothioneinen unterschieden. Das Metallothionein von SEQ ID NO: 46 umfasst eine N-terminale Domäne, die für Metallothioneine des Typs 2 typisch sind, wie von Cobbett und Goldsbrough (2002) definiert, wobei die Domäne die folgende Konsensussequenz ”MSCCGG(N/S)CGCG(T/S/A)(G/A/S)C(K/Q/S)C” umfasst. Folglich sind die bevorzugten Homologa, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, Metallothioneine, die die konservierte Domäne umfassen.
  • Es wurde zudem gefunden, dass ein bevorzugtes Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, in oberirdischen Pflanzenteilen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die bevorzugte Modulation der Expression in oberirdischen Pflanzenteilen durch Verwendung eines Promotors, der in oberirdischen Pflanzenteilen aktiv ist. Der Begriff ”Promotor, der in oberirdischen Teilen aktiv ist”, ist im Abschnitt ”Definitionen” hier beschrieben.
  • Es wurde zudem entdeckt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, Pflanzen, die unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsen sind, verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, in Pflanzen, die unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsen sind.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der in oberirdischen Pflanzenteilen aktiv ist, erfolgt, indem man eine Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der in oberirdischen Pflanzenteilen aktiv ist, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise Steigerung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, erfolgt, indem man eine Nukleinsäure, die ein AAT-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
  • Wird in einer Ausführungsform auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein AAT-ähnliches Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Jede Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” steht im vorliegenden Text für eine Nukleinsäure, die ein solches AAT-ähnliches Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und sie wird im Folgenden auch als ”AAT-ähnliche Nukleinsäure” oder ”AAT-ähnliches Gen” bezeichnet.
  • Wird in einer Ausführungsform auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein AAT-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Jede Bezugnahme auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” steht im vorliegenden Text für eine Nukleinsäure, die ein solches AAT-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und sie wird im Folgenden auch als ”AAT-Nukleinsäure” oder ”AAT Gen” bezeichnet.
  • Ein ”AAT-ähnliches Polypeptid” oder ein ”AAT Polypeptid” wie hier definiert, betrifft ein beliebiges Polypeptid mit einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften:
    • (a) die Fähigkeit, die folgende Reaktion zu katalysieren: L-Alanin + 2-Oxoglutarat ☐ Pyruvat + L-Glutamat
    • (b) gehört zum Enzym-Klassifizierungscode: EC 2.6.1.2.
    • (c) hat eine Aminotransferase-Domäne (Verweis in InterPro durch IPR004839; und in PFAM durch PF00155)
    • (d) hat eine 1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase-Domäne (Verweis in InterPro durch IPR001176)
    • (e) wird zu den Mitochondrien geleitet
    • (f) bildet bei Verwendung bei der Konstruktion eines Stammbaums mit AAT-Sequenzen eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide oder AAT-Polypeptide, die die SEQ ID NO: 51 oder SEQ ID NO: 56 umfassen, Cluster als mit einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen.
  • Die Begriffe ”Domäne” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al. (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs und its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASY-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Eine Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 ist nachstehend in den Beispielen 2 und 4 gegeben. Ein AHL19/20 Polypeptid der SEQ ID NO: 2 umfasst ein AT-hook DNA Bindungsmotiv mit einem InterPro Eintrag IPR014476, und eine in Pflanzen und Prokaryoten konservierte (plant and prokaryotes conserved, PPC) Domäne, die als DUF296 (Domäne unbekannter Funktion 296) beschrieben ist, mit einem InterPro Eintrag IPR005175 in der InterPro Domänen-Datenbank. Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Eine solche Domäne ist die konservierte Domäne (conserved Domain (CD)) von SEQ ID NO: 2, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36. Die CD umfasst ein vorhergesagtes NLS, ein AT-hook DNA-Bindungsmotiv, und eine PCC-Domäne, wie es schematisch in 3 und in 4 dargestellt ist.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologa können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus Clustal W (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10;4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologa auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Das Beispiel 3 beschreibt hier in der Tabelle B die Prozent Identität zwischen dem AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 und den AHL19/20 Polypeptiden, die in der Tabelle A aufgeführt sind, wobei die Aminosäuresequenzidentität zwischen 50 und 99% variiert. In Tabelle B1, reicht die Prozent Identität zwischen der CD nach SEQ ID NO: 36 (enthalten in SEQ ID NO: 2) und der CD der AHL19/20 Polypeptide, die in der Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführt sind, von 70 bis 99% Aminosäuresequenzidentität.
  • Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Proteinlokalisation ist wichtig und gut untersucht. Das Wissen über die Lokalisierung eines Proteins unterstützt die Aufklärung seiner Funktion. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP). Solche Verfahren sind zwar präzise aber verglichen mit Computer-Verfahren arbeitsintensiv. Neuerdings wurde ein großer Fortschritt hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisation aus Sequenzdaten gemacht. An der ExPASy sind dem Fachmann bestens bekannte Algorithmen zugänglich, wie u. a beispielsweise die Proteomics-Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, die vom Schweizer Institut für Bioinformatik gehosted werden. Die Identifikation der subzellulären Lokalisierung des erfindungsgemäßen Polypeptids ist in Beispiel 6 gezeigt. Ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS) befindet sich im AHL19/20 Polypeptid von SEQ ID NO: 2. Bei dem NLS handelt es sich um eine oder mehrere kurze Sequenzen positiv geladener Lysine oder Arginine. Insbesondere SEQ ID NO: 2 der vorliegenden Erfindung wird dem Kern-Kompartiment eukaryotischer Zellen zugeordnet.
  • AHL19/20-Polypeptide, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen (zumindest in ihrer nativen Form), haben darüber hinaus gewöhnlich, aber nicht unbedingt transkriptionsregulatorische Aktivität und die Fähigkeit, mit anderen Proteinen Wechselwirkungen einzugehen. Daher können AHL19/20 Polypeptide mit reduzierter transkriptionsregulatorischer Aktivität, ohne transkriptionsregulatorische Aktivität, mit reduzierter Protein-Protein-Wechselwirkungs-Kapazität oder ohne Protein-Protein-Wechselwirkungs-Kapazität gleichermaßen für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein. Die DNA-Bindungs-Aktivität und die Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo mittels Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden (beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Zur Bestimmung der DNA-Bindungs-Aktivität von AHL19/20 Polypeptiden stehen mehrere Tests zur Verfügung, wie die DNA-Bindungs-Gelshift-Tests (oder Gelretardations-Tests; Korfhage et al. (1994) Plant C 6: 695–708), in vitro DNA Bindungstests (Schindler et al. (1993) Plant J 4(1): 137–150), oder Transkriptionsaktivierung von AHL19/20 Polypeptiden in Hefe-, Tier- und Pflanzenzellen (Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28(18): 3542–3550). Spezifische DNA-Bindungssequenzen können mit der statistischen Oligonukleotid-Selektionstechnik bestimmt werden (Viola & Gonzalez (May 26, 2007) Biochemistry).
  • Bei einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung anhand der Transformation von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 gezeigt, die die AHL19/20 Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert. Die erfindungsgemäße Leistung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft mit einer Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, wie es hier definiert ist.
  • Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, sind in der Tabelle A von Beispiel 1 hierin beschrieben. Solche Nukleinsäuresequenzen sind zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispiel-Sequenzen für Orthologa und Paraloga des durch SEQ ID NO: 2 veranschaulichten AHL19/20-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” die hier definierte Bedeutung haben. Weitere Orthologa und Paraloga können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel eine der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann erfolgt das zweite BLASTing daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von derselben Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • GRP Polypeptide, insofern als SEQ ID NO: 46, und ihre Orthologa, Paraloga, und Homologa betroffen sind, haben gewöhnlich eine Metallbindungsaktivität, die in einem Metallsättigungstest gemessen werden kann (Scheuhammer et al., Toxicol. Appl Pharmacol. 82, 417–425, 1986) und/oder können als Redoxsensor wirken (Fabisiak et al., Methods Enzymol. 353, 268–281 (2002)).
  • In einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung dadurch veranschaulicht, dass Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 45, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 46 kodiert, transformiert werden. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft durchgeführt werden, indem man eine GRP-kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein GRP-Polypeptid wie hier definiert, verwendet.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können in im Stand der Technik bekannten Datenbanken gefunden werden. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologa und Paraloga, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” wie hier definiert sind, können leicht mittels Durchführen eines so genannten reziproken Blasting identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit der SEQ ID NO: 46) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 45 oder SEQ ID NO: 46, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • In einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung dadurch veranschaulicht, dass Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 50, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 51 kodiert, transformiert werden. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft durchgeführt werden, indem man eine AAT-ähnliche Nukleinsäure oder ein AAT-ähliches Polypeptid wie hier definiert, verwendet.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen Orthologa und Paraloga des AAT-ähnlichen Polypeptids nach SEQ ID NO: 51, wobei die Begriffe ”Orthologa” und ”Paraloga” wie hier definiert sind. Orthologa und Paraloga können leicht mittels Durchführen eines so genannten reziproken Blasting identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit der SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 51) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 51, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Chlamydomonas). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • In einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung dadurch veranschaulicht, dass Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 55, die die Polypeptid-Sequenz nach SEQ ID NO: 56 kodiert, transformiert werden. Die Leistungsfähigkeit der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft durchgeführt werden, indem man eine AAT-kodierende Nukleinsäure oder ein AAT-Polypeptid wie hier definiert, verwendet.
  • Ein Beispiel dafür, wie man Nukleinsäuren, die AAT-Polypeptide kodieren, sowie Orthologa und Paraloga davon, auffindet, ist in Beispiel 1 angegeben. Solche Nukleinsäuren eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Orthologa und Paraloga können leicht mittels Durchführen eines so genannten reziproken Blasting identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise ein erstes BLASTing, bei dem mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel mit der SEQ ID NO: 55 oder SEQ ID NO: 56) ein BLASTing gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 55 oder SEQ ID NO: 56, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Reis). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralogon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Orthologon wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Stand der Technik bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man Clustal W und anschließend einen Neighbour-Joining-Stammbaum dazu verwenden, Cluster verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologa und Paraloga zu identifizieren. Jedes Sequenz-Clustering innerhalb der Gruppe, die SEQ ID NO: 2 (AHL19 Polypeptid; in den 1 und 2 eingekreist) umfasst, liegt in der vorstehend genannten Definition für ein AHL19/20 Polypeptid, und wird somit zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet angesehen.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Beispiele für solche Varianten umfassen Homologa und Derivate von einer der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A von Beispiel 1 angegeben sind, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga von einer der Polypeptidsequenzen kodieren, die in der Tabelle A von Beispiel 1 angegeben sind. Homologa und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf, wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuren, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäuresequenzvarianten, die Homologa und Derivate der SEQ ID NO: 46 kodieren, geeignet sein, wobei die Begriffe ”Homologa” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga der SEQ ID NO: 46 kodieren. Homologa und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäuresequenzvarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuresequenzen sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist.
  • Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 45 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 46 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Beispiele für solche Varianten umfassen Nukleinsäuren, die Homologa und Derivate von SEQ ID NO: 51 kodieren, wobei die Begriffe ”Homologon” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuren geeignet, die Homologa und Derivate von Orthologa oder Paraloga des AAT-ähnlichen Polypeptids nach SEQ ID NO: 51 oder des AAT-Polypeptids nach SEQ ID NO: 56 kodieren. Homologa und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide oder AAT-Polypeptid kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 55 oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 51 oder SEQ ID NO: 56 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein AHL19/20- Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 940 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die eine Polypeptidsequenz kodiert, die, wenn sie zur Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie er in 1 oder 2 dargestellt ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der AHL19/20-Polypeptide, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit irgendeiner anderen AHL-Gruppe Cluster bildet. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1.
  • Abschnitte, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein GRP Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen in SEQ ID NO: 46. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der in SEQ ID NO: 45 angegebenen Nukleinsäuresequenz, oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon der in SEQ ID NO: 46 angegebenen Polypeptidsequenz kodiert. Der Abschnitt ist vorzugsweise mindestens 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, oder mehr aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide von SEQ ID NO: 45, oder von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder ein Paralogon von SEQ ID NO: 46 kodiert, stammen. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 45.
  • Abschnitte, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein AAT-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 51. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide von SEQ ID NO: 50 oder von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 51 kodiert, stammen,.
  • Der Abschnitt kodiert vorzugsweise ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die bei Verwendung zur Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die SEQ ID NO: 51 umfassen, als mit irgend einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen Cluster bildet.
  • Abschnitte, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kodieren ein AAT-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 56. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide von SEQ ID NO: 55 oder von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 56 kodiert, stammen.
  • Der Abschnitt kodiert vorzugsweise ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die bei Verwendung zur Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, eher mit der Gruppe der AAT-Polypeptide, die die SEQ ID NO: 56 umfassen, als mit irgend einer anderen Gruppe von AAT-Sequenzen Cluster bildet.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenz, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter reduzierten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (Growth Regulating Protein, einem wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert.
  • Erfindungsgemäß wird bei einer Ausführungsform ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer der in Tabelle A in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein AHL19/20-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, hybridisieren. Die hybridisierende Sequenz kann vorzugsweise mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die eine Polypeptidsequenz codiert, die bei Verwendung zur Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie in der 1 oder 2 gezeigt, eher mit der Gruppe der AHL19/20 Polypeptide, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, als mit einer anderen AHL-Gruppe Cluster bildet. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 oder einen Abschnitt davon hybridisieren.
  • Erfindungsgemäß wird bei einer Ausführungsform ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit SEQ ID NO: 45 hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 46 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 46 genannten Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit der SEQ ID NO: 45 oder mit einem Abschnitt von dieser Sequenz hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 46 kodiert, oder einem Abschnitt davon, hybridisieren.
  • Erfindungsgemäß wird bei einer Ausführungsform ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit SEQ ID NO: 50 hybridisieren kann, einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 51 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein AAT-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 51 genannten Aminosäuresequenz aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 51 kodiert, oder einem Abschnitt einer solchen Nukleinsäure hybridisieren, wobei Abschnitt wie vorstehend definiert ist. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 50 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit SEQ ID NO: 55 hybridisieren kann, oder eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 56 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein AAT-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in SEQ ID NO: 56 genannte Aminosäuresequenz aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure, die ein Orthologon oder Paralogon der SEQ ID NO: 56 kodiert, oder einem Abschnitt dieser Nukleinsäure hybridisieren, wobei Abschnitt weiter oben erläutert ist. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 55 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Die hybridisierende Sequenz kodiert vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die wenn sie in Volllänge vorliegt und zur Konstruktion eines Stammbaums mit AAT-Sequenzen verwendet wird, eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 51 umfassen, oder mit der Gruppe der AAT-Polypeptide, die die SEQ ID NO: 56 umfassen, als mit einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen Cluster bildet.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem kernlokalisierten AT-hook-Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wie hierin definiert, wobei eine Spleißvariante wie hierein definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A in Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bei einer Ausführungsform handelt es sich bei den Spleißvarianten und Spleißvarianten einer Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 2 kodiert. Bei der Spleißvariante handelt es sich vorzugsweise um eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die eine Polypeptidsequenz kodiert, die bei Verwendung bei der Konstruktion eine AHL-Stammbaums, wie er in der 1 oder in der 2 gezeigt ist, eher mit der Gruppe der AHL19/20 Polypeptide, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen AHL-Gruppe Cluster bildet.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in eine (r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 45 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 46 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine (r) Pflanze eine Spleißvariante von SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 55 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 51 oder SEQ ID NO: 56 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die von der Spleißvariante kodierte Aminosäuresequenz bildet bei der Verwendung bei der Konstruktion eines Stammbaums mit AAT-Sequenzen eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die SEQ ID NO: 51 umfassen, oder mit der Gruppe der AAT-Polypeptide, die die SEQ ID NO: 56 umfassen, eher Cluster als mit irgend einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen.
  • Eine weitere Nukleinsäuresequenzvariante, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem kernlokalisierten AT-hook-Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wie hierin definiert, wobei eine allelische Variante wie hierein definiert ist.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine (r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das AHL19/20 Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und eine der in Tabelle A von Beispiel 1 gezeigten Polypeptidsequenzen. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist in den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst. Die allelische Variante ist vorzugsweise eine allelische Variante von SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon oder Paralogon von SEQ ID NO: 2 kodiert. Die allelische Variante ist vorzugsweise eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz, die bei Verwendung bei der Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie er in der 1 oder 2 gezeigt ist, eher mit den AHL19/20-Polypeptiden, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit einer anderen AHL-Gruppe Cluster bildet.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bei dem man in eine (r) Pflanze eine allelische Variante von SEQ ID NO: 45 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon der Polypeptidsequenz nach von SEQ ID NO: 46 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten allelischen Varianten haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität, wie das GRP-Polypeptid nach SEQ ID NO: 46. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und die Verwendung dieser natürlichen Allele ist in den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine (r) Pflanze eine allelische Variante von SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 55 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon der Aminosäuresequenz nach von SEQ ID NO: 51 oder SEQ ID NO: 56 kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten allelischen Varianten haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das AAT-ähnliche Polypeptid von SEQ ID NO: 51 bzw. wie das AAT-Polypeptid nach SEQ ID NO: 56. Allelische Varianten kommen in der Natur vor, und in den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung dieser natürlichen Allele umfasst. Die von der allelischen Variante kodierte Aminosäuresequenz bildet bei der Verwendung bei der Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, vorzugsweise mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die SEQ ID NO: 51 umfassen, oder mit der Gruppe der AAT-Polypeptide, die die SEQ ID NO: 56 umfassen, eher Cluster als mit irgend einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen.
  • Genshuffling oder gerichtete Evolution kann ebenfalls zur Erzeugung von Varianten von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die ertragssteigernde Polypeptide kodieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem kernlokalisierten AT-hook-Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wie hierin definiert, wobei der Begriff ”Genshuffling” wie hierein definiert ist.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Samenertragsmerkmalen bereitgestellt, bei dem man in eine (r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante durch Genshuffling erhalten wurde.
  • Die durch Genshuffling erhaltene Nukleinsäuresequenzvariante kodiert vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, die bei der Verwendung bei der Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie er in der 1 und in der 2 gezeigt ist, eher mit der Gruppe der AHL19/20- Polypeptide, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit einer anderen AHL-Gruppe Cluster bildet.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bei dem man in eine (r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 45 oder eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 46 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante durch Genshuffling erhalten wird.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine (r) Pflanze eine Variante von SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 55 oder eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Orthologon, Paralogon oder Homologon von SEQ ID NO: 51 oder SEQ ID NO: 56 kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante durch Genshuffling erhalten wird.
  • Die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleinsäuresequenzvariante kodiert wird, die durch Genshuffling erhalten wird, bildet bei der Verwendung bei der Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, eher mit der Gruppe von AAT-ähnlichen Polypeptiden, die die SEQ ID NO: 51 umfassen, oder mit der Gruppe von AAT-Polypeptiden, die die SEQ ID NO: 56 umfassen Cluster als mit einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen.
  • Nukleinsäuresequenzvarianten können ebenfalls durch ortgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, mit denen sich eine ortsgerichtete Mutagenese erzielen Isst, wobei die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind. (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
  • Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
  • Nukleinsäuren, die GRP-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze. Im Fall der SEQ ID NO: 45 stammt die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit erhöhter Jungpflanzenvitalität und erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Biomasse und/oder Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit erhöhter Jungpflanzenvitalität, erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Jungpflanzenvitalität, Biomasse und/oder Samenertrag von Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen sind.
  • Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die AAT-ähnliche Nukleinsäure aus einer Alge, vorzugsweise aus der Gattung Chlamydomonas, weiter bevorzugt aus der Art Chlamydomonas reinhardtii.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen.
  • Nukleinsäuren, die AAT-Polypeptide kodieren, können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein POI Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, bevorzugt aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Oryza sativa.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder (erntbare) unterirdische Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verbesserte Samenertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen unter abiotischen Wachstumsbedingungen, insbesondere Biomasse und/oder Samenertrag von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen sind, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, die unter abiotischen Wachstumsbedingungen gewachsen sind, verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus und unter vergleichbaren Wachstumsbedingungen.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid oder AAT-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen im Vergleich zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte (Jungpflanzen-)Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen, eine verzögerte Blüte ist gewöhnlich kein gewünschtes Merkmal bei Kulturpflanzen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kulturpflanze häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen). Die hier definierte Wachstumsrate soll keine verzögerte Blüte bedeuten.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, erhöht.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedinungen gewachsen sind, mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, erhöht.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in oberirdischen Pflanzenteilen die Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid oder AAT-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung von Ertragsmerkmalen tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nicht-Stressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen waren, verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Eine Erhöhung von Ertragsmerkmalen (eine Erhöhung des Samenertrags und/oder der Wachstumsrate) tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nicht-Stressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nicht-Stressbedingungen durchgeführt. Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt jedoch unabhängig davon auf, ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen unter Nicht-Stressbedingungen steht, oder ob die Pflanze verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wurde. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nicht-Stressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, bezieht sich auf solche Umweltbedingungen, die ein optimales Pflanzenwachstum gestatten. Der Fachmann kennt die normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen gegebenen Standort.
  • Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zu einer Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Gemäß einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die unter Nichtstress-Bedingungen oder leichten Stressbedingungen gewachsen sind, mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen waren, verbesserten Samenertragsmerkmalen. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale von Pflanzen, die unter Nichtstress-Bedingungen oder leichten Stressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Gemäß einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die unter leichten Stressbedingungen gewachsen sind, mit im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen sind, verbesserten Ertragsmerkmalen. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird daher ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale von Pflanzen, die unter leichten Stressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Wie von Wang et al., (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Produktivität negativ beeinflussen. Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress stehen bekanntlich miteinander in Verbindung und können über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Trockenheit und/oder Versalzung äußern sich beispielsweise in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig Hoch- oder Niedertemperatur-, Salinitäts- oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Demzufolge aktivieren diese verschiedenen Umweltstressfaktoren häufig ähnliche Signalleitungswege der Zelle und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Aufwärtsregulation von Antioxidantien, die Anreicherung kompatibler gelöster Stoffe und ein Einstellen des Wachstums. Da verschiedene Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, sollte das erfindungsgemäße Beispiel mit Trockenheitsstress nicht als Einschränkung auf Trockenheitsstress angesehen werden, sondern es soll lediglich die Beteiligung der AHL19/20-Polypeptide wie vorstehend definiert bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, unter abiotischen Stressbedingungen im Allgemeinen, gewachsen sind, anzeigen.
  • Da verschiedene Umweltstressfaktoren ähnliche Stoffwechselwege aktivieren, sollte das erfindungsgemäße Beispiel mit Trockenheitsstress und Salzstress nicht als Einschränkung auf Trockenheitsstress oder Salzstress angesehen werden, sondern es soll lediglich die Beteiligung der GRP-Polypeptide wie vorstehend definiert bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen, unter abiotischen Stressbedingungen im Allgemeinen, gewachsen sind, anzeigen.
  • Der Begriff ”abiotischer Stress” wie im vorliegenden Text definiert soll einen oder mehrere der folgenden Stressfaktoren bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund von Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen), chemischer Toxizitätsstress und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Natriumchlorid (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei unter Anderem um einen beliebigen Stress handeln, der durch eines oder mehrere der folgenden Salze verursacht wird: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Der abiotische Stress ist vorzugsweise Trockenheitsstress. Bei dem abiotischen Stress handelt es sich alternativ um Salzstress.
  • Bei einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren unter abiotischen Stressbedingungen zu Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, erhöht. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
  • Bei einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren unter abiotischen Stressbedingungen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen waren. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, erhöht. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Bei dem abiotischen Stress handelt es vorzugsweise um Trockenheitsstress. Alternativ oder zusätzlich handelt es sich bei dem abiotischen Stress um Salzstress.
  • Ein weiteres Beispiel für einen abiotischen Umweltstress ist die reduzierte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von der Pflanze für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses, den die Nährstoffverwertungseffizienz auf den Ertrag und die Produktqualität einer Pflanze ausübt, wird eine enorm hohe Menge Dünger auf die Felder gestreut, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von den drei Hauptnährstoffen Phosphor, Kalium und Stickstoff begrenzt, der von diesen drei Nährstoffen üblicherweise das geschwindigkeitsbestimmende Element des Pflanzenwachstums ist. Das wichtigste Nährstoffelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, wie u. a. von Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse ist Stickstoff und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins. Die Verfügbarkeit von Stickstoff ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Kulturpflanzenwachstum und die Kulturpflanzenproduktion (Frink et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und auf die Aminosäurezusammensetzung. Kulturpflanzen, die bei Wachstum unter Stickstoffmangelbedingungen verbesserte Samenertragsmerkmale aufweisen, sind daher von großem Interesse.
  • Bei einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Samenertragsmerkmale, im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gewachsenen Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale, bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen, gewachsen sind, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, erhöht. Nährstoffmangel kann sich unter Anderem aus einem Fehlen oder Überschuss von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben. Die Nährstoffmangelbedingungen sind vorzugsweise Stickstoffmangelbedingungen.
  • Bei einer Ausführungsform führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Ertragsmerkmale, im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen gezüchteten Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gewachsen sind, wobei man bei dem Verfahren in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, erhöht. Nährstoffmangel kann unter Anderem eine reduzierte Verfügbarkeit von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, umfassen.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen gewachsen sind, mit einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Steigerung des Ertrags bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen gewachsen sind, bereitgestellt, bei dem in oberirdischen Pflanzenteilen die Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, erhöht wird.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (darunter Samen) oder Zellen davon, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das ein erstragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (wachstumsregulierendes Protein, Growth Regulating Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wie vorstehend definiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder erhöhte Expression von Nukleinsäuresequenzen, die ertragssteigernde Polypeptide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (wachstumsregulierendes Protein, Growth Regulating Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in handelsübliche Vektoren eingeführt werden, die für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines wie im vorliegenden Text definierten Genkonstrukts in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer ausgedrückt stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20), einem GRP (wachstumsregulierendes Protein, Growth Regulating Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a) Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wie vorstehend definiert, kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß (a) steigern kann bzw. können; sowie gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Eine der Kontrollsequenzen eines Konstrukts ist vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert wurde. Ein Beispiel für einen konstitutiven Pflanzenpromotor ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, stärker bevorzugt ein GOS2-Promotor, der durch die SEQ ID NO: 35 veranschaulicht ist.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, bei einer Ausführungsform wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid oder ein AAT-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Der Begriff ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Dem Fachmann sind die genetischen Elemente, die auf einem Vektor zur erfolgreichen Transformation, Selektion und Vermehrung der Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, vorhanden sein müssen, geläufig. Die interessierende Sequenz ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) verknüpft.
  • Jede Art von Promotor kann unabhängig davon, ob er natürlich oder synthetisch ist, vorteilhafterweise zur Steigerung der Expression der Nukleinsäuresequenz, verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor ist bei den Verfahren besonders geeignet, vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Der konstitutive Pflanzenpromotor steuert die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem Niveau, das in allen Fällen unter demjenigen ist, das unter der Kontrolle eines 35S CaMV-Virus-Promotors erhalten wird.
  • Andere organspezifische Promotoren, beispielsweise zur bevorzugten Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe Abschnitt ”Definitionen” im vorliegenden Text.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die AHL19/20-Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 1 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer AHL19/20-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen konstitutiven Promotor gesteuert wird.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die GRP-Polypeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 45 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer GRP-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen konstitutiven Promotor gesteuert wird.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 47 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 47 wiedergegeben. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2 im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die AAT-ähnliche Nukleinsäure eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 50 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer AAT-ähnlichen Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz eingeschränkt, wenn sie durch einen Protochlorophyllid-Reduktase-Promotor gesteuert wird.
  • Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin. Besonders eignet sich in den erfindungsgemäßen Verfahren ein wurzelspezifischer Promotor, insbesondere ein wurzelepidermisspezifischer Promotor. Der wurzelspezifische Promotor ist vorzugsweise ein Nitrattransporter-Promotor, weiter bevorzugt aus Reis (OsNRT1 Promotor wie beschrieben von Lin, 2000). Der Promotor wird durch SEQ ID NO: 59 veranschaulicht. Eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 59 ähnelt, eignet sich ebenfalls bei den erfindungsgemäßen Verfahren. Beispiele für andere wurzelspezifische Promotoren, die ebenfalls zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der Tabelle 2b im vorstehenden Abschnitt ”Definitionen” veranschaulicht.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die AAT-Nukleinsäure eingeschränkt ist, die durch SEQ ID NO: 55 veranschaulicht ist, entsprechend ist die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die Expression einer AAT-Nukleinsäure eingeschränkt, wenn sie durch einen Nitrattransporter-Promotor aus Reis, OsNRT1, gesteuert wird.
  • Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingebrachten Konstrukt verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translations-Enhancer umfassen. Der Fachmann kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen. Eine Intronsequenz kann ebenfalls zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, damit die Menge der reifen Botschaft gesteigert wird, die sich im Cytosol anreichert, wie es im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Andere Kontrollsequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können leicht von ihm erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Bei einem Beispiel muss ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element aufrechterhalten werden (z. B. Plasmid- oder Cosmidmolekül). Bevorzugte Replikationsursprünge umfassen f1-ori und colE1, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, und/oder für die Selektion der transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, werden vorteilhafterweise Markergene (oder Reportergene) verwendet. Das Genkonstrukt kann daher gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier eingehender im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder gespalten werden, sobald sie nicht mehr vonnöten sind. Techniken zur Markerentfernung sind Stand der Technik, geeignete Techniken sind oben im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen Selektionsmarker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Entfernung des Markergens sind im Stand der Technik bekannt, wobei geeignete Techniken vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben sind.
  • Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors, in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuresequenzen handeln, die ein AHL19/20-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Züchten der Pflanze, des Pflanzenteils oder der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuresequenzen handeln, die ein GRP-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in oberirdischen Pflanzenteile(n) eine Nukleinsäuresequenz, die ein AAT-ähnliches Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer AAT-ähnlichen Nukleinsäure unter der Kontrolle eines in oberirdischen Pflanzenteilen aktiven Promotors, in oberirdischen Pflanzenteile(n) oder in eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz unter (i) kann es sich um eine der AAT-ähnlichen Nukleinsäuren handeln, wie hier definiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem (Samen)-Ertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer AAT-Nukleinsäure in eine(r) Pflanze oder in eine(r) Pflanzenzelle und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz unter (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein AAT-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder einen irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, regeneriert werden. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppen auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Markern selektiert, die von den mit dem interessierenden Gen gemeinsam transferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial im Allgemeinen Selektionsbedingungen unterworfen, so dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase durch Spritzen einer geeigneten Selektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten heranzieht, wobei man ein geeignetes Selektionsmittel verwendet, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers wie die oben beschriebenen gescreent.
  • Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation ausgewertet werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA mittels Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden; wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können mit unterschiedlichen Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder durch klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanze) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in verschiedener Form vorliegen. Sie können beispielsweise Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z. B. alle Zellen wurden dahingehend transformiert, dass sie die Expressionskassette enthalten); Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wurde, und auf sämtliche Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft einer/eines primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie von dem Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren gezeigt wird.
  • Die Erfindung beinhaltet in einer Ausführungsform auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes AHL19/20-Polypeptid kodiert, enthalten, die funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpft ist.
  • Die Erfindung beinhaltet in einer Ausführungsform auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes GRP-Polypeptid kodiert, enthalten.
  • Die Erfindung beinhaltet in einer Ausführungsform auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein wie oben definiertes AAT-ähnliches Polypeptid oder ein AAT-Polypeptid kodiert, enthalten.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren oder den Vektor, für die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor, sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, die die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturpflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Zu den Kulturpflanzen gehören zum Beispiel Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Zu den monokotylen Pflanzen gehört zum Beispiel Zuckerrohr. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Zu den Getreiden gehören zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntefähige Teile einer Pflanze, die eine funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verknüpfte isolierte Nukleinsäuresequenz umfasst, die eine AHL19/20 (wie vorstehend definiert) kodiert, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die von einem erntefähigen Teil einer solchen Pflanze abstammen, vorzugsweise direkt abstammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt Definitionen angegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Samenertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Wie vorstehend erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Wie vorstehend erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid oder ein AAT-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid oder ein AAT-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die AHL19/20-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser AHL19/20-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Samenertragsmerkmale, in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen und unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die GRP-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser GRP-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale, in Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die AAT-ähnliche Polypeptide und AAT-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser AAT-ähnlichen Polypeptide bzw. AAT-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale, in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ertragssteigernde Polypeptide kodieren, oder die ertragssteigernden Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein ertragssteigerndes Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die AAT-ähnlichen Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier definiert, in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die ohne Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die einen erhöhten Ertrag liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuren, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung der Nukleinsäuren, die ertragssteigernde Polypeptide kodieren, benötigt nur eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die Nukleinsäuren, die ertragssteigernde Polypeptide kodieren, können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch E F and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktions-gespaltener genomischer Pflanzen-DNA kann mit den AAT-ähnlichen Nukleinsäuren sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Computerprogrammen unterworfen werden, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), so dass man eine genetische Karte erhält. Die Nukleinsäuren können zudem zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die die Eltern und die Nachfahren einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert in der genetischen Karte verwendet, die mit dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann sehr geläufig.
  • Die Nukleinsäuresequenzsonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Literaturstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung durch direkte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf der Basis von Nukleinsäuresequenzamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic acid sequence Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic acid sequence Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und zu erzeugen, die bei der Amplifikationsreaktion oder Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren ertragssteigernden Merkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, mit verbesserten Ertragsmerkmalen wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren ertragssteigernden Merkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 1: Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein kernlokalisiertes AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20) Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das AHL19/20-Polypeptid eine Domäne mit mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne (conserved Domain (CD)) nach SEQ ID NO: 36 aufweist, und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen, die verbesserte Samenertragsmerkmale, aufweisen.
    • Punkt 2: Verfahren nach Punkt 1, wobei das AHL19/20 Polypeptid umfasst: (i) ein Motiv mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem AT-hook Motiv nach SEQ ID NO: 37; und (ii) eine Domäne mit mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer in Pflanzen und Prokayonten konservierten (plant and prokaryote conserved (PPC)) Domäne nach SEQ ID NO: 38.
    • Punkt 3: Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei das AHL19/20 Polypeptid umfasst: (i) ein Kernlokalisierungssignal; (ii) ein AT-hook DNA Bindungsmotiv mit einem InterPro Eintrag IPR014476; und (iii) eine in Pflanzen und Prokayonten konservierte (plant and prokaryote conserved (PPC)) Domäne mit einem InterPro Eintrag IPR005175.
    • Punkt 4: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei das AHL19/20 Polypeptid, bei Verwendung zur Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie in 1 oder in 2 gezeigt, eher mit der AHL19/20 Gruppe von Polypeptiden, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit einer anderen AHL-Gruppe Cluster bildet.
    • Punkt 5: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei das AHL19/20 Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 oder zu einer der in Tabelle A hier angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
    • Punkt 6: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, veranschaulicht wird durch eine der in der Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die mit einer der in Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NOs hybridisieren können.
    • Punkt 7: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID NOs kodiert.
    • Punkt 8: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren herbeigeführt wird: T-DNA Aktivierungstagging, TILLING, oder homologe Rekombination.
    • Punkt 9: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression herbeigeführt wird, indem in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, eingeführt und exprimiert wird.
    • Punkt 10: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei das verbesserte Samenertragsmerkmale eines oder mehrere der Folgenden ist: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
    • Punkt 11: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Samenertragsmerkmale in Pflanzen auftreten, die unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen, gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 12: Verfahren nach Punkt 11, wobei das verbesserte Samenertragsmerkmal eines oder mehrere der Folgenden ist: (i) erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze; (ii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iii) erhöhter Harvest Index.
    • Punkt 13: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, stärker bevorzugt einem GOS2 Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis nach SEQ ID NO: 35, verbunden ist.
    • Punkt 14: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
    • Punkt 15: Pflanzen, Teile davon (darunter Samen), oder Pflanzenzellen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhalten werden, wobei die Pflanze, das Teil oder die Zelle davon ein mit einem funktionsfähig an einen konstitutiven Pflanzenpromotor gebundenes isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein AHL19/20 Polypeptid kodiert.
    • Punkt 16: Konstrukt, umfassend:
    • (a) Eine Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 5 kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern kann bzw. können; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 17: Konstrukt nach Punkt 16, wobei die Kontrollsequenz ein konstitutiver Pflanzenpromotor, stärker bevorzugt ein GOS2 Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2 Promotor aus Reis nach SEQ ID NO: 35 ist.
    • Punkt 18: Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 16 oder 17 in einem Verfahren zur Produktion von Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die verbesserten Samenertragsmerkmale eines oder mehrere der Folgenden sind: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
    • Punkt 19: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/das mit einem Konstrukt nach Punkt 16 oder 17 transformiert ist.
    • Punkt 20: Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 6 kodiert unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die -entwicklung fördern.
    • Punkt 21: Transgene Pflanze mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die aus einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 5 kodiert, die mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor funktionsfähig verbunden ist, hervorgehen, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgenes Pflanzenteil, das von der transgenen Pflanze hergeleitet ist.
    • Punkt 22: Transgene Pflanze nach Punkt 15, 19 oder 21, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze hergeleitet ist.
    • Punkt 23: Erntefähige Teile einer Pflanze, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein AHL19/20-Polypeptid nach Punkt 22 kodiert, wobei es sich bei den erntefähigen Teilen vorzugsweise um Samen handelt.
    • Punkt 24: Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Punkt 22 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 23.
    • Punkt 25: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20-Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 6 kodiert, bei der Verbesserung von Samenertragsmerkmalen in Pflanzen, umfassend eines oder mehrere der Folgenden: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
    • Punkt 26: Verwendung nach Punkt 25, wobei die verbesserten Samenertragsmerkmale unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen, auftreten.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 27: Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid nach SEQ ID NO: 46 ist, oder ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind, und verbesserte Ertragsmerkmale aufweisen.
    • Punkt 28: Verfahren nach Punkt 27, wobei das GRP Polypeptid nach SEQ ID NO: 46 und ein Orthologon, Paralogon oder Homologon davon einen InterPro Eintrag IPR000347, beschrieben als Pflanzen-Metallothionein, Familie 15, aufweisen.
    • Punkt 29: Verfahren nach Punkt 27 oder 28, wobei das GRP Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem GRP Polypeptid nach SEQ ID NO: 46 aufweist.
    • Punkt 30: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 29, wobei die Nukleinsäuresequenz, die eine GRP Polypeptid kodiert, durch die Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 45 oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 45 oder einen Abschnitt davon hybridisieren kann, veranschaulicht wird.
    • Punkt 31: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 30, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid kodiert, in eine Pflanze, herbeigeführt wird.
    • Punkt 32: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 31, wobei es sich bei dem abiotischen Stress um osmotischen Stress handelt, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
    • Punkt 33: Verfahren nach Punkt 32, wobei es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress handelt.
    • Punkt 34: Verfahren nach Punkt 32, wobei es sich bei dem ionenbedingten Stress um Salzstress handelt.
    • Punkt 35: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 34, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale eines oder mehrere der Folgenden sind: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl gefüllter Samen, erhöhte Anzahl Primärrispen und erhöhte Samenfüllrate, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 36: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 35, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2 Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis verbunden ist.
    • Punkt 37: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 27 bis 36, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, stammt.
    • Punkt 38: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid kodiert, bei der Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen gewachsen sind.
    • Punkt 39: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid nach Punkt 38 kodiert, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale aus einem oder mehreren der Folgenden ausgewählt sind: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamtsamenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl gefüllter Samen, erhöhte Anzahl Primärrispen und erhöhte Samenfüllrate, im Vergleich zu Kontrollpflanzen
    • Punkt 40: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid nach Punkt 39 kodiert, wobei es sich bei dem abiotischen Stress um osmotischen Stress handelt, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress.
    • Punkt 41: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid nach Punkt 40 kodiert, wobei es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress handelt.
    • Punkt 42: Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRP Polypeptid nach Punkt 40 kodiert, wobei es sich bei dem ionenbedingten Stress um Salzstress handelt.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 43: Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein Alaninaminotransferase(AAT)-ähnliches Polypeptid kodiert, in oberirdischen Pflanzenteilen.
    • Punkt 44: Verfahren nach Punkt 43, wobei das AAT-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Merkmale umfasst:
    • (i) die Fähigkeit, die folgende Reaktion zu katalysieren: L-Alanin + 2-Oxoglutarat ⇔ Pyruvat + L-Glutamat
    • (ii) es gehört zum Enzymklassifizierungscode: EC 2.6.1.2.
    • (iii) es hat eine Aminotransferasedomäne (Verweis in InterPro durch IPR004839; und in PFAM durch PF00155)
    • (iv) es hat eine 1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase-Domäne (Verweis in InterPro durch IPR001176)
    • (v) es wird in die Mitochondrien gesteuert
    • (vi) bei der Verwendung zur Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, bildet es eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die SEQ ID NO: 51 umfassen, als mit irgend einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen Cluster.
    • Punkt 45: Verfahren nach Punkt 43 oder 44, wobei die modulierte Expression herbeigeführt wird durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der in oberirdischen Pflanzenteilen aktiv ist, in eine(r) Pflanze.
    • Punkt 46: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 45, wobei die Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, mit der Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 50 hybridisieren kann.
    • Punkt 47: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 46, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon des Proteins nach SEQ ID NO: 51 kodiert.
    • Punkt 48: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 47, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 49: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 48, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • Punkt 50: Verfahren nach einem der Punkte 45 bis 49, wobei der in oberirdischen Teilen aktive Promotor ein sprossspezifischer und/oder blattspezifischer Promotor ist.
    • Punkt 51: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 50, wobei die Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, aus Alge, vorzugsweise aus der Gattung Chlamydomonas, weiter bevorzugt aus der Art Chlamydomonas reinhardtii stammt.
    • Punkt 52: Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 43 bis 51, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert.
    • Punkt 53: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid nach einem der Punkte 44, 46 oder 47 kodiert;
    • (b) eine Promotorsequenz, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in oberirdischen Teilen steuern kann; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 54: Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 53 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 55: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/das mit einem Konstrukt nach Punkt 53 transformiert ist.
    • Punkt 56: Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid nach einem der Punkte 44, 46 oder 47 kodiert, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in oberirdischen Teilen aktiv ist, in eine(r) Pflanze; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die – entwicklung fördern.
    • Punkt 57: Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid nach einem der Punkte 44, 46 oder 47 kodiert, hervorgeht, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in oberirdischen Teilen aktiv ist, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 58: Transgene Pflanze nach Punkt 52, 55 oder 57, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt.
    • Punkt 59: Erntefähige Teile einer Pflanze, wobei es sich bei den erntefähigen Teilen um Samen handelt.
    • Punkt 60: Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Punkt 58 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 59.
    • Punkt 61: Verwendung einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines in oberirdischen Teilen aktiven Promotors steht, zum Erhöhen des Ertrags, insbesondere zum Erhöhen des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Aufgaben, die folgendermaßen zusammengefasst sind:
    • Punkt 62: Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die eine Alaninaminotransferase (AAT) kodiert, in einer Pflanze, wobei die Pflanzen unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsen sind.
    • Punkt 63: Verfahren nach Punkt 62, wobei das AAT-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Merkmale umfasst:
    • (i) die Fähigkeit, die folgende Reaktion zu katalysieren: L-Alanin + 2-Oxoglutarat ⇔ Pyruvat + L-Glutamat
    • (ii) es gehört zum Enzymklassifizierungscode: EC 2.6.1.2.
    • (iii) es hat eine Aminotransferasedomäne (Verweis in InterPro durch IPR004839; und in PFAM durch PF00155)
    • (iv) es hat eine 1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase-Domäne (Verweis in InterPro durch IPR001176)
    • (v) bei der Verwendung zur Konstruktion eines Stammbaums, der AAT-Sequenzen enthält, bildet es eher mit der Gruppe der AAT-ähnlichen Polypeptide, die die SEQ ID NO: 56 umfassen, als mit irgend einer anderen Gruppe von AATs oder AAT-ähnlichen Sequenzen Cluster.
    • Punkt 64: Verfahren nach Punkt 62 oder 63, wobei die modulierte Expression herbeigeführt wird durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
    • Punkt 65: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 62 bis 64, wobei die Nukleinsäure, die ein AAT-ähnliches Polypeptid kodiert, mit der Nukleinsäure nach SEQ ID NO: 55 hybridisieren kann.
    • Punkt 66: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 62 bis 65, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon des Proteins nach SEQ ID NO: 56 kodiert.
    • Punkt 67: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 62 bis 66, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • Punkt 68: Verfahren nach einem der Punkte 64 bis 67, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem gewebespezifischen Promotor, vorzugsweise einem wurzelspezifischen Promotor, am stärksten bevorzugt einem wurzelepidermisspezifischen Promotor, verbunden ist.
    • Punkt 69: Verfahren nach Punkt 68, wobei der wurzelepidermisspezifische Promotor ein Nitrattransporter-Promotor, vorzugsweise aus Reis, ist.
    • Punkt 70: Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 62 bis 69, wobei die Nukleinsäure, die eine AAT kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa stammt.
    • Punkt 71: Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt 62 bis 70, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die eine AAP kodiert.
    • Punkt 72: Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die eine AAP nach Punkt 63 kodiert;
    • (b) einen Nitrattransporter-Promotor vorzugsweise aus Reis; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • Punkt 73: Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 72 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • Punkt 74: Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/das mit einem Konstrukt nach Punkt 71 transformiert ist.
    • Punkt 75: Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit erhöhterm Ertrag unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die eine AAP nach Punkt 63 kodiert, in eine(r) Pflanze; und
    • (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die – entwicklung fördern.
    • Punkt 76: Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen, insbesondere mit erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der aus einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure, die eine AAP nach Punkt 63 kodiert, hervorgeht, oder eine tansgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
    • Punkt 77: Transgene Pflanze nach Punkt 71, 74 oder 76, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer handelt.
    • Punkt 78: Erntefähige Teile einer Pflanze nach Punkt 77, wobei es sich bei den erntefähigen Teilen vorzugsweise um Sprossbiomasse und/oder um Samen handelt.
    • Punkt 79: Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Punkt 77 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Punkt 78.
    • Punkt 80: Verwendung einer Nukleinsäure, die eine AAT kodiert, zum Erhöhen des Ertrags unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen, insbesondere zum Erhöhen des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren beschrieben. Es zeigt:
  • 1 einen Neighbour-joining-Stammbaum, konstruiert nach einem Alignment sämtlicher Polypeptide, die zur AHL Familie gehören (beschrieben in Fujimoto et al., (2004) Plant Molec Biol, 56: 225–239) und der mit dem Clustal-Algorithmus (1.83) des progressiven Alignment durchgeführt wurde, wobei Default-Werte verwendet wurden. Die interessierende Gruppe, die die beiden Arabidopsis-Paraloga AHL19 (SEQ ID NO: 2 oder AT3G04570), und AHL20 (SEQ ID NO: 4 oder AT4G14465) umfasst, sind eingekreist.
  • 2 einen Neighbour-joining-Stammbaum, konstruiert nach einem Alignment sämtlicher Polypeptide, die zur AHL Familie gehören (beschrieben in Fujimoto et al., (2004) Plant Molec Biol, 56: 225–239) und sämtlicher AHL19/20 Orthologa und Paraloga von Tabelle A in Beispiel 1 hierin, und der mit dem Clustal-Algorithmus (1.83) des progressiven Alignment durchgeführt wurde, wobei Default-Werte verwendet wurden.
  • 3 ein Schaubild eines AHL19/20 Polypeptids nach SEQ ID NO: 2, das die folgenden Eigenschaften aufweist: ein vorhergesagtes NLS, ein AT-hook DNA Bindungsmotiv (dessen Kern das Tripeptid GRP ist; und das sich in InterPro Eintrag IPR014476 befindet (vorhergesagte AT-hook DNA-Bindung)), eine PPC Domäne (plant and prokaryotes conserved domain, eine in Pflanzen und Prokaryonten konservierte Domäne; die sich in InterPro Eintrag IPR005175 befindet (Protein unbekannter Funktion DUF296)), und die konservierte Domäne (Conserved Domain (CD)), die sowohl ein AT-hook DNA-Bindungsmotiv als auch eine PPC Domäne aufweist.
  • 4 ein mehrfaches CLUSTAL W (1;83) Sequenzalignment der konservierten Domäne der AHL19/20 Polypeptide aus Tabelle A (wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38 für SEQ ID NO: 2), wobei eine Reihe von Eigenschaften identifiziert werden. Vom N-Terminus zum C-Terminus der Polypeptide, sind dies: (i) ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS); (ii) ein AT- hook DNA-Bindungsmotiv, mit dem Kerntripeptid GRP; und (iii) eine PPC Domäne (DUF 296).
  • 5 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines GOS2 Promotors (pGOS2) aus Reis.
  • 6 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 7 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer GRP-kodierenden Nukleinsäuresequenz (wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist) unter der Kontrolle eines Reis-GOS2 Promotors (pGOS2::GRP)
  • 8 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 9 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer AAT-ähnlichen Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-Protochlorophyllid-Promotors.
  • 10 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 11 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer AAT-Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis OsNRT1 Promotors.
  • 12 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
  • Die DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, die beschrieben sind in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Übereinstimmungen. Das Polypeptid, das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kodiert wird, wurde zum Beispiel für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und anhand der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment zufällig vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter so eingestellt werden, dass die Stringenz der Suche eingestellt wird. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze fast genaue Übereinstimmungen identifizieren.
  • Die Tabelle A stellt eine Liste der Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle A: Beispiele für AHL19/20 Polypeptide:
    Name Herkunftsorganismus Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO: Datenbank Zugangsnummer Status
    Arath_AHL19 Arabidopsis thaliana 1 2 AT3G04570 NP_566232 Volllänge (FL)
    Arath_AHL20 Arabidopsis thaliana 3 4 AT4G14465 NP_567432 FL
    Aqufo_AHL19/20 Aquilegia formosa × Aquilegia pubescens 5 6 Contig von DT758489, DT758488.1 FL
    Brana_AHL19/20 Brassica napus 7 8 CS226287 FL
    Brara_AHL19/20 Brassica rapa 9 10 AC189468 FL
    Glyma_AHL19/20 Glycine max 11 12 CS137412 FL
    Goshi_AHL19/20 Gossypium hirsutum 13 14 DW519458 FL
    Lacsa_AHL19/20 Lactuca sativa 15 16 DW047323 FL
    Lotja_AHL19/20 Lotus japonicus 17 18 AP004971 FL
    Orysa_AHL19/20 Oryza sativa 19 20 AK110263 Os08g0563200 FL
    Orysa_AHL19/20 II Oryza sativa 21 22 CT837915 Os02g0820800 FL
    Poptr_AHL19/20 Populus tremuloides 23 24 scaff_XIII.441 FL
    Soltu_AHL19/20 Solanum tuberosum 25 26 Contig von CN215397.1 CK276075.1 FL
    Thlca_AHL19/20 Thlaspi caerulescens 27 28 DQ022564 FL
    Vitvi_AHL19/20 Vitis vinifera 29 30 AM463589 FL
    Vitvi_AHL19/20 II Vitis vinifera 31 32 AM429692 FL
    Zeama_AHL19/20 Zea mays 33 34 AC190270 FL
  • In einigen Fällen sind zudem verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), der Öffentlichkeit zugänglich gemacht worden. Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz. In anderen Fällen wurden spezielle Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt, wie von dem Joint Genome Institute, beispielsweise für Pappel und Ostreococcus tauri.
  • Beispiel 2: Alignment der erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm von dem Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1 und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, können kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt wurden. Mit einem ”Neighbour-joining”-Clustering-Algorithmus, wie er von dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wurde ein Stammbaum der Polypeptide konstruiert.
  • Das Alignment sämtlicher Arabidopsis thaliana AHL Polypeptidsequenzen, die in Fujimoto et al. (2004; Tabelle A1 unten) identifiziert wurden, wurde mit dem Clustal Algorithmus (1.83) des progressiven Alignments, mit Default Werten durchgeführt (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Anschließend wurde ein Neighbour-joining Stammbaum konstruiert. Dieser ist in der 1 der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Die interessierende Gruppe, die zwei Arabidopsis Paraloga AHL19 (SEQ ID NO: 2 oder AT3G04570), und AHL20 (SEQ ID NO: 4 oder AT4G14465) umfasst, ist eingekreist. Jedes Polypeptid, das in dieser AHL19/20 Gruppe liegt (nach einem neuerlichen mehrfachen Alignment-Schritt wie hierin) wird bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet angesehen. Tabelle A1: In Arabidopsis thaliana identifizierte AHL Polypeptide
    AHL Nummer Tair Zugangsnummer NCBI Zugangsnummer
    AHL1 At4g12080 NP_192945
    AHL2 At4g22770 NP_194008
    AHL3 At4g25320 NP_194262
    AHL4 At5g51590 NP_199972
    AHL5 At1g63470 NP_176536
    AHL6 At5g62260 NP_201032
    AHL7 At4g00200 NP_191931
    AHL8 At5g46640 NP_199476
    AHL9 At2g45850 NP_182109
    AHL10 At2g33620 NP_565769
    AHL11 At3g61310 NP_191690
    AHL12 At1g63480 NP_176537
    AHL13 At4g17950 NP_567546
    AHL14 At3g04590 NP_187109
    AHL15 At3g55560 NP_191115
    AHL16 At2g42940 NP_181822
    AHL17 At5g49700 NP_199781
    AHL18 At3g60870 NP_191646
    AHL19 At3g04570 NP_566232
    AHL20 At4g14465 NP_567432
    AHL21 At2g35270 NP_181070
    AHL22 At2g45430 NP_182067
    AHL23 At4g17800 NP_193515
    AHL24 At4g22810 NP_194012
    AHL25 At4g35390 NP_195265
    AHL26 At4g2050 NP_192942
    AHL27 At1g20900 NP_173514
    AHL28 At1g14490 NP_172901
    AHL29 At1g76500 NP_177776
  • Ein zweites multiples Sequenzalignment wurde mit sämtlichen orthologen AHL19/20 Polypeptiden der Tabelle A und sämtlichen AHL-Sequenzen der Tabelle A1 durchgeführt. Anschließend wurde ein Neighbour-joining Stammbaum konstruiert. Dieser ist in der 2 der vorliegenden Anmeldung dargestellt. Die interessierende Gruppe, die zwei Arabidopsis Paraloga AHL19 (SEQ ID NO: 2 oder AT3G04570), und AHL20 (SEQ ID NO: 4 oder AT4G14465) umfasst, ist eingekreist. Jedes Polypeptid, das in dieser AHL19/20 Gruppe liegt wird bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren als geeignet angesehen.
  • Die konservierte Domäne (Conserved Domain (CD)) von SEQ ID NO: 2, wie durch SEQ ID NO: 36 veranschaulicht, wurde nach einem multiplen Sequenzalignment der AHL19/20 Polypeptide von Tabelle A identifiziert. In einem zweiten Schritt wurden die CDs der AHL19/20 Polypeptide der Tabelle A selektiert (aus der Volllängen-Polypeptidsequenz) und einem Alignment unterworfen, wobei der Clustal-Algorithmus (1.83) des progressiven Alignments, mit Default-Werten verwendet wurde. Es kann eine Reihe von Eigenschaften identifiziert werden, und diese sind in der 4 gekennzeichnet. Vom N-Terminus zum C-Terminus der Polypeptide sind dies: (i) ein vorhergesagte Kernlokalisierungssignal (NLS); (ii) ein AT-hook DNA Bindingsmotiv, mit dem Kerntripeptid GRP; und (iii) einer PPC Domäne (DUF 296).
  • Mit einem ”Neighbour-joining”-Clustering-Algorithmus, wie er von dem AlignX-Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wurde ein Stammbaum der AAT-ähnlichen Polypeptide und der AAT-Polypeptide konstruiert.
  • Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella J J, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    • Scoring matrix: Blosum62
    • First Gap: 12
    • Extending gap: 2
  • Eine MATGAT Tabelle für ein lokales Alignment einer spezifischen Domäne oder die Daten der Prozent Identität bzw. Ähnlichkeit zwischen den Domänen können ebenfalls erzeugt werden.
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die Gesamtähnlichkeit und -identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen (ausschließlich der Partial-Polypeptidsequenzen) dargestellt. Der Identitätsprozentsatz ist über der Diagonale und der Ähnlichkeitsprozentsatz unter der Diagonale angegeben.
  • Die Prozent Identität zwischen den Polypeptidsequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, kann nur 52% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 betragen.
  • Tabelle B: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 00890001
  • Die Prozent Identität kann erheblich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der konservierten Domäne (CD) von SEQ ID NO: 2 (wie durch SEQ ID NO: 36 veranschaulicht wird) und den CDs der Polypeptide, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, durchgeführt wird. Eine CD umfasst ein AT-hook DNA Bindungsmotiv (wie es durch SEQ ID NO: 37 für SEQ ID NO: 2 veranschaulicht wird) und eine PPC Domäne (wie sie durch SEQ ID NO: 38 für SEQ ID NO: 2 veranschaulicht wird). Die Prozent Identität über die CDs zwischen den Polypeptidsequenzen, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, liegen zwischen 75% und 99% Aminosäureidentität, wie es in Tabelle B1 gezeigt ist. Dies ist signifikant höher als die Prozent Aminosäuresequenzidentität, die zwischen den Volllängen-AHL19/20 Polypeptidsequenzen berechnet wird.
  • Tabelle B1: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die CDs Domänen zwischen den Polypeptidsequenzen.
    Figure 00900001
  • Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. InterPro wird vom European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse des Interpro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sind in Tabelle C angegeben Tabelle C: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    InterPro Zugangsnummer und Name Integrierter Datenbankname Integrierte Datenbank-Zugangsnummer Integrierter Datenbank-Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO: 2
    IPR005175 Domäne: Protein unbekannter Funktion DUF296 PFAM PF03479 DUF296 107–232
    InterPro IPR014476 Familie: Vorhergesagtes AT-hook DNA-Bindungsmotiv PIR PIRSF016021 ESCAROLA 315
  • Die GRP-Polypeptidsequenzen werden als Abfragesequenz für die Durchsuchung der InterPro Datenbank verwendet. GRP Polypeptide, die sich bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, stimmen mit einem InterPro Eintrag überein, wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist:
    InterPro Zugangsnummer Integrierter Datenbankname Integrierte Datenbank-Zugangsnummer Integrierter Datenbank-Zugangsname
    InterPro IPR000347 Pflanzen Metallothionein, Familie 15 ProDom PD001611 Metallthion_15p
    Pfam PF01439 Metallothio_2
  • Die Ergebnis des InterPro Scans der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 51 und SEQ ID NO: 56 sind nachstehend aufgeführt
    • InterPro: IPR001176: Domäne 1-Aminocyclopropan-1-carboxylatsynthase, Region [203–224][256–280][292–315] IPR004839: Domäne Aminotransferase, Klasse I und II, Region [145–314]
    • PFAM: PF00155 Domäne Aminotransferase Klasse I und II, mit Score 8.4e-19, Region [108–509]
  • Beispiel 5: Vorhersage der subzellulären Lokalisierung für Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 2 veranschaulicht wird, sind in Tabelle D7 dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt und keine Ausschlussgrenzen definiert. Die vorhergesagte subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 ist nicht in den Chloroplasten, nicht in den Mitochondrien und nicht im sekretorischen Weg, sondern höchstwahrscheinlich im Kern.
  • Ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS) lässt sich (beispielsweise durch multiples Sequenzalignment, gefolgt von visueller Untersuchung) in dem AHL19/20 Polypeptid von SEQ ID NO: 2 ermitteln. Bei dem NLS handelt es sich um eine oder mehrere kurze Sequenzen positiv geladener Lysine oder Arginine. Die erfindungsgemäße SEQ ID NO: 2 ist den Vorhersagen gemäß im Kernkompartiment eukaryontischer Zellen lokalisiert. Tabelle D: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Länge (AA) 315
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,100
    Mitochondriales Transitpeptid 0,278
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,033
    Anderes subzelluläres Ziel 0,703
    Vorhergesagte Lokalisierung Andere
    Verlässlichkeitsklasse 3
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1 Analyse der Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 51 sind nachstehend angegeben.
    • TargetP Vorhersage: Mitochondrien (0,837, Qualität 2)
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada, gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 6: Test in Bezug auf Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • Das AAT-ähnliche Polypeptid kann die folgende Reaktion katalysieren:
    L-Alanin + 2-Oxoglutarat ☐ Pyruvat + L-Glutamat
  • Ein Fachmann kann eine solche Aktivität leicht überprüfen.
  • Beispiel 7: Klonierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
  • Wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, die beschrieben sind in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
  • Die Arabidopsis thaliana cDNA, die das AHL19 Polypeptid kodiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine Arabidopsis cDNA Bank verwendet wurde, die aus gemischten Pflanzengeweben synthetisiert wurde. Die Primer prm8135 (SEQ ID NO: 41; Sense: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgaatccatggtg-3') und Primer prm08136 SEQ ID NO: 42; revers, komplementär,: 5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaaaccattttaacgcacg-3'), die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten, wurden zur PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR wurde mittels Hifi-Taq-DNA-Polymerase in Standard-Bedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (darunter die attB-Stellen) wurde amplifiziert und ebenfalls mit Standard-Verfahren gereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Klonierung von SEQ ID NO: 45:
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 45, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Mischgeweben (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm03240 (SEQ ID NO: 48; Sense:
    5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgtcttgctgtggaggaa 3'
    und prm03241 (SEQ ID NO: 49; revers, komplementär):
    5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcacttgcaggtgcaag 3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 50, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix verwendet wurde. Die verwendeten Primer waren prm08408 (SEQ ID NO: 53; Sense, Startcodon fett):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcggaaggaagcgac-3'
    und prm08409 (SEQ ID NO: 54; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgaattgctaagctgttacga-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pAAT-ähnlich rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 55, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine cDNA-Bank aus Oryza sativa (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm001646 (SEQ ID NO: 58; Sense, Startcodon fett):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggctgctcccagc-3'
    und prm001647 (SEQ ID NO: 59; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaattcagtcgcggtacg-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, pATT, rekombinierte. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Beispiel 8: Expressionsvektorkonstruktion mit der offenbarten Nukleinsäuresequenz
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 35) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::AHL19/20 (5) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 45 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein HMGB-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 47) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::GRP (7) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 50 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein putativer Chlorophyllid-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 52) für die spross- und blattspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor (9) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 55 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein NRT1-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 52) für die wurzelepidermis- und wurzelhaarspezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pNRT1::ATT (11) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 9: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Agrobacterium, das die Expressionsvektoren enthielt, wurde unabhängig zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und mittels Subkultur auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man unabhängig den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der jeweils den einzelnen Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach dem Umsetzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 10.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening auf Nährstoff-(Stickstoff)-Mangel
  • Pflanzen aus sechs Ereignissen (T2 Samen) wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen angezogen, außer der Nährlösung. Die Töpfe wurden von der Umsetzung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff(N)-Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8mal niedriger, aufwies. Die Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 10.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht
  • Vier T1-Ereignisse wurden weiterhin in der T2-Generation nach dem gleichen Bewertungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis bewertet.
  • Wenn zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Trockenheits-Screening bei GRP-Polypeptiden
  • Reis-Pflanzen aus T1-, T2- oder weiteren Generationen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten.
  • Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte ansonsten wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Salzstress-Screen beim GRP-Polypeptid
  • Reispflanzen aus T1-, T2- oder weiteren Generationen wurden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wurde eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurde die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertrags-Parameter wurden aufgezeichnet wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen eingehend beschrieben wurde.
  • Trockenheits-Screening bei AAT-ähnlichem Polypeptid und AAT-Polypeptid
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte ansonsten wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung bei AAT-ähnlichem Polypeptid und AAT-Polypeptid
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 10.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging- Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Ein Anstieg der Wurzelbiomasse ist ausgedrückt als Anstieg der Wurzelbiomasse (gemessen als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet wird); oder als Anstieg des Wurzel/Spross-Index (gemessen als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross).
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Das Gesamtsamengewicht pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Einzelblüten) definiert.
  • Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Reispflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, welche das AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2 Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, und die unter normalen Wachstumsbedingungen gewachsen sind, sind nachstehend gezeigt.
  • Es gab einen signifikanten Anstieg der Anzahl Blüten pro Rispe, des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, der Gesamtanzahl gefüllter Samen und des Harvest Index der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in der Tabelle E gezeigt ist. Tabelle E: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, welche das AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2 Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, unter normalen Wachstumsbedingungen
    Merkmal Durchschn. % Anstieg bei 6 Ereignissen in der T1 Generation
    Anzahl Blüten pro Rispe 14%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 17%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 17%
    Harvest Index 17%
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die unter Nichtstressbedingungen gewachsen waren, und die eine AAT-ähnliche Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Protochlorophyllid Reductase-Promotors aus Reis exprimieren, zeigten einen signifikanten Anstieg des Harvest Index (HI) für transgene Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Ein Anstieg der Jungpflanzenvitalität, des Gesamtsamengewichts und der Anzahl gefüllter Samen wurde ebenfalls bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen beobachtet.
  • Die Untersuchung transgener Reispflanzen, die unter Nicht-Stickstoffmangelbedingungen gewachsen waren, und die eine AAT-Nukleinsäure unter der Kontrolle eines NRT1-Promotors aus Reis exprimieren, zeigte einen Anstieg der oberirdischen Fläche, der Pflanzenhöhe, und der Jungpflanzenvitalität im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beispiel 12: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Reispflanzen unter Nährstoff-(Stickstoff)mangel-Wachstumsbedingungen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, welche das AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2 Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, und die unter Nährstoff-(Stickstoff)mangel-Wachstumsbedingungen gewachsen sind, sind nachstehend gezeigt.
  • Es gab einen signifikanten Anstieg des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, der Gesamtanzahl gefüllter Samen und des Harvest Index der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in der Tabelle F gezeigt ist. Tabelle F: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, welche das AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 kodiert, unter der Kontrolle des GOS2 Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren, unter Nährstoff-(Stickstoff)mangel-Wachstumsbedingungen.
    Merkmal Durchschn. % Anstieg in 2 Ereignissen in der T1 Generation
    Jungpflanzenvitalität 18%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 26%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 27%
    Gesamtanzahl Samen 24%
  • Beispiel 13: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Reispflanzen unter Salz und/oder Trockenheitsstress-Wachstumsbedingungen
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 45 unter der Kontrolle des GOS2-Promotors exprimieren und unter Salzstress-Bedingungen gewachsen waren, zeigten einen Anstieg von mehr als 5% für die oberirdische Biomasse, Gesamtsamenertrag pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen, Gesamtanzahl Samen und Anzahl Primärrispen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen waren, wie es in der nachstehenden Tabelle gezeigt ist.
    Durchschn. Gesamt % Anstieg in der T2 Generation
    Oberirdische Biomasse 20%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 32%
    Anzahl gefüllter Samen 29%
    Gesamtanzahl Samen 19%
    Anzahl Primärrispen 23%
  • Die transgenen Reispflanzen, die die GRP-Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 45 unter der Kontrolle des GOS2-Promotors exprimieren und unter Trockenheitsstress-Bedingungen gewachsen waren, zeigten einen Anstieg von mehr als 5% für die oberirdische Biomasse, Gesamtsamenertrag pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen, Gesamtanzahl Samen und Samenfüllrate, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gewachsen waren, wie es in der nachstehenden Tabelle gezeigt ist.
    Durchschn. % Anstieg für das beste Ereignis in der T1 Generation
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 39%
    Anzahl gefüllter Samen 38%
    Gesamtanzahl Samen 19%
    Samenfüllrate 12%
  • Beispiel 14: Beispiele für die Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Alfalfatransformation
  • Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird) umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 13: Beispiele für abiotische Stress-Screens
  • Trockenheitsstress-Screen
  • Pflanzen aus einer ausgewählten Anzahl von Ereignissen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte ansonsten wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertrags-Parameter wurden aufgezeichnet wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen eingehend beschrieben wurde.
  • Beispiel 14: Abiotische Stressscreens
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T1-, T2- oder weiteren Generationen wurden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe wurden vom Umsetzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufwies. Die Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entsprach ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • Zusammenfassung
  • Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzen-Ertragsmerkmale durch Steigerung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
    einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20),
    einem GRP (Growth Regulating Protein, wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP-Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)-Polypeptid ist),
    einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid, und
    einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (26)

  1. Verfahren zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Steigern der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, in einer Pflanze und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ertragssteigernde Polypeptid ein kernlokalisiertes AT-hook Motiv (AT-hook motif nuclear localized) 19/20 (AHL19/20) Polypeptid ist, wobei das AHL19/20 Polypeptid eine Domäne mit mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne (Conserved Domain (CD)) nach SEQ ID NO: 36 umfasst oder das AHL19/20 Polypeptid umfasst: (i) ein Motiv mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem AT-hook Motiv nach SEQ ID NO: 37; und (ii) eine Domäne mit mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer in Pflanzen und Prokaryonten konservierten (plant and prokaryote conserved (PPC)) Domäne nach SEQ ID NO: 38.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das AHL19/20 Polypeptid umfasst: (i) ein Kernlokalisierungssignal; (ii) ein AT-hook DNA Bindungsmotiv mit einem InterPro Eintrag IPR014476; und (iii) eine in Pflanzen und Prokaryonten konservierte (plant and prokaryote conserved (PPC)) Domäne mit einem InterPro Eintrag IPR005175.
  4. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das AHL19/20 Polypeptid bei der Verwendung zur Konstruktion eines AHL-Stammbaums, wie er in der 1 oder 2 gezeigt ist, eher mit der AHL19/20 Gruppe von Polypeptiden, die die Polypeptidsequenz nach SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgend einer anderen AHL Gruppe Cluster bildet.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ertragssteigernde Polypeptid in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem AHL19/20 Polypeptid nach SEQ ID NO: 2 oder zu einer der in Tabelle A hier angegebenen Polypeptidsequenzen oder zu dem GRP Polypeptid nach SEQ ID NO: 46, oder zu dem AAT-ähnlichen Polypeptid nach SEQ ID NO: 51, bzw. zu dem AAT-ähnlichen Polypeptid nach SEQ ID NO: 56 aufweist.
  6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID NOs oder einen Abschnitt davon veranschaulicht wird, oder eine Sequenz, die mit einer der in Tabelle A angegebenen SEQ ID NOs hybridisieren kann.
  7. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Orthologon oder Paralogon von einer der in Tabelle A angegebenen Polypeptidsequenz SEQ ID NOs kodiert.
  8. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die erhöhte Expression durch eines oder mehrere der folgenden herbeigeführt wird: T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, oder homologe Rekombination.
  9. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die erhöhte Expression herbeigeführt wird durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze.
  10. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei dem verbesserten Samenertragsmerkmal um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
  11. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die verbesserten Samenertragsmerkmale in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen, gewachsen sind, im Vergleich zu Kontrollpflanzen auftreten.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem verbesserten Samenertragsmerkmal um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (ii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iii) erhöhter Harvest Index.
  13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, stärker bevorzugt einem GOS2 Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis nach SEQ ID NO: 35, verbunden ist.
  14. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein AHL19/20 Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
  15. Pflanzen, Teile davon (darunter Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Pflanze, das Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäuresequenztransgen umfasst, das ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid, das funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verbunden ist.
  16. Konstrukt, umfassend: (a) Eine Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  17. Konstrukt nach Anspruch 16, wobei die Kontrollsequenz ein konstitutiver Pflanzenpromotor, vorzugsweise ein GOS2 Promotor, stärker bevorzugt ein GOS2 Promotor nach SEQ ID NO: 35 ist.
  18. Verwendung eines Konstrukts nach den Ansprüchen 16 oder 17 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei es sich bei den verbesserten Samenertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
  19. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 16 oder 17 transformiert sind.
  20. Verfahren zur Produktion transgener Pflanzen mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors in eine(r) Pflanze, ein(em) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die -entwicklung fördern.
  21. Transgene Pflanze mit verbesserten Samenertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die aus einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz hervorgehen, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, funktionsfähig verbunden mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor oder einer transgenen Pflanzenzelle oder einem transgenen Pflanzenteil, das aus der transgenen Pflanze stammt.
  22. Transgene Pflanze nach Anspruch 15, 19 oder 21, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide ist wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
  23. Erntefähige Teile, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid einer Pflanze nach Anspruch 22, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  24. Produkte, hergeleitet von einer Pflanze nach Anspruch 22 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 23.
  25. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein ertragssteigerndes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem kernlokalisierten AT-hook Motiv 19/20 (AHL19/20), GRP (wachstumsregulierenden Protein, wobei das GRP Polypeptid ein Metallothionein 2a(MT2a)Polypeptid ist), einem Alaninaminotransferase(AAT)-ähnlichen Polypeptid und einem Alaninaminotransferase(AAT)Polypeptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, zur Verbesserung der Samenertragsmerkmale, umfassend eines oder mehrere der Folgenden: (i) erhöhte Anzahl Blüten pro Rispe; (ii) erhöhtes Gesamtsamengewicht pro Pflanze; (iii) erhöhte Anzahl gefüllter Samen; oder (iv) erhöhter Harvest Index.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die verbesserten Samenertragsmerkmale unter Nährstoffmangelbedingungen, vorzugsweise unter Stickstoffmangelbedingungen, auftreten.
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