BRPI0620312A2 - plantas monocotiledÈneas com eficiencia de nitrogenio - Google Patents

Abstract

PLANTAS MONOCOTILEDONEAS COM EFICIéNCIA DE NITROGENIO São descritos métodos para aumento da eficiencia de utilização de nitrogenio em plantas monocotiledóneas através de modificação genética para aumentar os níveis de expressão de alanina aminotransferase e plantas produzidas a partir da mesma. Em particular, são descritos métodos para aumento da biomassa e rendimento de plantas monocotiledóneas transgenicas cultivadas sob condições de limitação de nitrogenio comparado com plantas não transgenicas. Dessa forma, plantas monocotiledóneas podem ser produzidas, ao mesmo tempo em que se reduz a necessidade de altos níveis de aplicação de nitrogenio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS COM EFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO" REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o benefício do Ped. U.S. No. 60/753.818, depositado em 23 de Dezembro de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a plantas monocotiledôneas tendo eficiência de utilização de nitrogênio intensificada (EUN), a métodos para intensificação de EUN em plantas monocotiledôneas e a métodos de aumento da biomassa e rendimento de semente em plantas monocotiledôneas crescidas sob condições de limitação de nitrogênio. A presente invenção também se refere a promotores de antiguitina de monocotiledônea.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em muitos ecossistemas, naturais e agrícolas, a produtividade de plantas está limitada por três nutrientes primários: nitrogênio, fósforo e potássio. O mais importante desses três nutrientes limitativos usualmente é o nitrogênio. Fontes de nitrogênio são, freqüentemente, os principais componentes em fertilizantes (Hageman e Lambert, I. Corn and Corn Improvement, 3a ed., Sprague & Dudley, American Society of Agronomy, páginas 431-461, 1988). Uma vez que o nitrogênio usualmente é o elemento taxa- limitativo no crescimento de plantas, a maioria das safras de campo têm uma dependência fundamental de fertilizante nitrogenado inorgânico. A fonte de nitrogênio no fertilizante usualmente é nitrato de amônio, nitrato de potássio ou uréia.

A cada ano, aproximadamente 85 a 90 milhões de toneladas métricas (MMt) de fertilizantes nitrogenados são adicionados ao solo no mundo todo. Isso foi de apenas 1,3 MMt em 1930 e de 10,2 MMt em 1960. É previsto um aumento para 240 MMt em torno de 2050 (Tilman et al. , Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 96: 5995-6000, 1999) . Estima-se que 50% a 70% do nitrogênio aplicado são perdidos do sistema de planta-solo. Em virtude do fato de o NO3" ser solúvel e não retido pela matriz do solo, NO3" em excesso pode lixiviar para a água e ser eliminado por microorganismos. Na verdade, a maioria do nitrogênio aplicado é rapidamente eliminado por microorganismos no solo, lixívia e outros fatores, antes de ser captado pelas plantas.

Eficiência de utilização de nitrogênio aumentada por plantas teria uma série de efeitos benéficos. Por exemplo, plantas com utilização eficiente de nitrogênio seriam capazes de crescer e ter um rendimento melhor do que plantas convencionais em solos pobres em nitrogênio. 0 uso de plantas eficientes quanto ao nitrogênio reduziria o requisito da adição de fertilizantes nitrogenados às safras. Uma vez que a aplicação de fertilizante responde por um percentual significativo de custos associados à produção da safra, tal redução no uso de fertilizante resultaria em economias monetárias diretas.

Uma redução na aplicação de fertilizante também diminuiria o dano ambiental resultante de uso extensivo de fertilizante nitrogenado. Esses efeitos prejudiciais de uso de fertilizante nitrogenado sobre o ambiente são manifestados em eutrofização aumentada, chuva ácida, acidificação do solo e o efeito estufa.

Monocotiledôneas representam um grande percentual das safras crescidas nos 3,7 bilhões de acres de terra cultivável no mundo. Nos Estados Unidos apenas, mais de 80 milhões de acres de milho, 59 milhões de acres de trigo, 4 milhões de acres de cevada e 3 milhões de acres de arroz foram plantados em 2004.

Dada a demanda mundial por monocotiledôneas e a diminuição da fertilidade de campos existentes, é desejável gerar plantas monocotiledôneas que são capazes de crescer sob condições sub-ótimas de nutriente. Um meio para realizar esse objetivo é gerar plantas monocotiledôneas que podem utilizar nitrogênio mais eficientemente. Tais plantas monocotiledôneas teriam a vantagem de ser capazes de crescer em solos que são mais pobres quanto ao nitrogênio, como um resultado de serem capazes de usar mais eficientemente o nitrogênio que está disponível.

Adicionalmente, tais plantas monocotiledôneas podem demonstrar produtividade intensificada em solos que têm níveis normais de nitrogênio também.

Arroz é rotineiramente usado como a safra modelo para estudos genéticos e fisiológicos em outras safras de monocotiledôneas, incluindo milho, trigo, cana-de-açúcar, cevada, sorgo, centeio e grama. Em virtude de sua importância como uma safra modelo, o arroz foi a primeira planta de safra a ser seqüenciada. O International Rice Genome Sequencing Project, um consórcio de laboratórios publicamente custeado, completou o seqüenciamento do genoma de arroz em Dezembro de 2004. O arroz tem um genoma diplóide pequeno que é bem conservado e sintênico dentre monocotiledôneas. Ele é facilmente transformado e estudos transgênicos foram realizados em arroz para estudar uma série de traços fenotípicos, incluindo floração, resposta a estresse abiótico, resistência à doença, tolerância à estiagem e desenvolvimento morfológico.

Em virtude da importância clínica do nitrogênio para o crescimento da planta, estudos anteriores tentaram aumentar a eficiência de utilização de nitrogênio em plantas usando uma variedade de meios. Esses métodos têm incluído programas de cruzamento convencionais dirigidos ao desenvolvimento de plantas que são mais eficientes quanto à utilização de nitrogênio. Métodos de ácido deóxiribonucleico (DNA) e planta transgênica também têm sido empregados em uma tentativa de gerar plantas eficientes quando ao nitrogênio.

Uma variedade de diferentes genes foram superexpressos em plantas dicotiledôneas para aumentar a eficiência de uso de nitrogênio com resultados variáveis (para revisão veja Good et al., Trends Plant Sci 9: 597-605, 2004). Contudo, monocotiledôneas e dicotiledôneas diferem umas das outras em muitas formas, incluindo morfologicamente, quanto ao desenvolvimento, metabolicamente, fenotipicamente e. geneticamente. Em virtude dessas numerosas diferenças, não seria previsível que abordagens com sucesso para aumentar a eficiência de utilização de nitrogênio em dicotiledôneas funcionem necessariamente em monocotiledôneas.

Na dicotiledônea canola, superexpressão da enzima alanina aminotransferase (AlaAT) sob a direção do promotor do gene-26 de turgência de Brassica (também conhecido como antiquitina), eleva os níveis de AlaAT e aumenta a EUN (Patente U.S. No. 6.084.153). Contudo, se superexpressão de AlaAT aumentaria a EUN em plantas monocotiledôneas não foi anteriormente reportado.

Aumento da EUN dentro de plantas monocotiledôneas é desejado na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção se dirige à necessidade de plantas monocotiledôneas com características de crescimento e eficiência na utilização de nitrogênio intensificadas quando crescidas sob condições de baixa pressão de nitrogênio através do fornecimento de tais plantas e métodos para geração de plantas monocotiledôneas transgênicas com níveis elevados de AlaAT.

Em um aspecto, a invenção proporciona plantas monocotiledôneas transgênicas incluindo uma seqüência de DNA recombinante que codifica uma AlaAT. A planta monocotiledônea transgênica pode ser cevada, arroz, cana- de-açúcar, milho, sorgo, centeio, trigo ou grama, gramas incluem gramado, turfa, forragem e semelhantes. De preferência, a AlaAT é operavelmente ligada a um promotor, mais preferivelmente um promotor de antiquitina de monocotiledôneas. Sementes de plantas monocotiledôneas transgênicas são também proporcionadas.

Em outras modalidades, arroz, milho, trigo, sorgo, cevada e cana-de-açúcar transgênicos incluem uma seqüência de DNA recombinante que codifica uma AlaAT e sementes das mesmas.

Em outro aspecto da invenção, um método de produção de uma planta monocotiledônea transgênica ê proporcionado, incluindo as etapas de: (1) seleção de um ácido nucleico que codifica uma AlaAT, (2) seleção de um promotor que é operável em uma planta monocotiledônea, (3) acoplamento do ácido nucleico selecionado ao promotor selecionado para formar uma estrutura genética, (4) transformação de uma célula de planta monocotiledônea com a estrutura genética para formar uma célula transformada e (5) crescimento de uma planta monocotiledônea transgênica a partir da célula transformada para produzir uma planta transgênica. Nessa modalidade, superexpressão de AlaAT causa um aumento de' pelo menos 5% a 7,5%, 7,5 a 10%, 10 a 15% ou 15 a 20% ou mais na biomassa e/ou rendimento de semente da planta quando expressa em uma planta monocotiledônea transgênica comparado com a biomassa ou rendimento de semente da planta de uma planta monocotiledônea comparável não expressando essa estrutura quando as plantas são crescidas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

Em outras modalidades da invenção, é fornecido um método similar de produção de plantas transgênicas de arroz, milho, trigo e sorgo. Em ainda outro aspecto da invenção, plantas monocotiledôneas transgênicas são descritas, em que a planta monocotiledônea transgênica expressa uma AlaAT recombinante e exibe um aumento de pelo menos 5% na biomassa ou rendimento de semente da planta comparado com a biomassa ou rendimento de semente de uma planta comparável carecendo de AlaAT recombinante. Também descritas são sementes produzidas a partir das monocotiledôneas transgênicas. As monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas a, milho, trigo, arroz, cevada e centeio.

Um método para aumento da biomassa de uma planta monocotiledônea através de Contato e introdução, em uma planta, de uma região de codificação de AlaAT em ligação operativa com o promotor de antiquitina de monocotiledônea é descrito. Métodos similares para aumento do rendimento de semente de uma planta também são proporcionados.

Os ácidos nucléicos que codificam AlaAT que são usados nas estruturas genéticas da invenção podem ser derivados de qualquer organismo, de preferência de uma planta e, mais preferivelmente, de uma planta monocotiledônea incluindo, mas não limitado a, cevada, arroz, cana-de-açúcar, centeio, trigo, milho ou grama.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma seqüência promotora de antiquitina de monocotiledônea isolada. A seqüência promotora de monocotiledônea pode ser de cevada, arroz, cana-de-açúcar, milho, sorgo, centeio, trigo ou grama. Em determinadas modalidades, ela é um promotor de sorgo que inclui SEQ ID NO: 9 ou um fragmento ativo da mesma. Em outras modalidades, ela é um promotor de milho que inclui SEQ ID NO: 10 ou um fragmento ativo da mesma.

Também proporcionados são métodos para direcionar a expressão de um gene alvo através de contato e introdução, em uma planta, de um gene alvo em ligação operativa com um promotor de antiquitina de monocotiledônea.

Também descritas são estruturas genéticas, plantas transformadas e sementes de planta incluindo uma seqüência promotora de antiquitina de monocotiledônea operativamente ligada a um gene alvo. De preferência, o gene alvo codifica uma proteína de utilização de nitrogênio tal como, por exemplo, um transportador de nitrato de alta afinidade, um transportador de nitrato de baixa afinidade, um transportador de amônio, um transportador de amônia, um transportador de aminoácido, alanina desidrogenase, glutamina sintetase, arparaginase sintetase, glutamato sintase, glutamato 2:oxoglutarato amino transferase, asparaginase, glutamato desidrogenase, nitrato redutase, aspartato aminotransferase ou AlaAT. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIGURA 1 mostra uma representação esquemática das etapas chave na utilização de nitrogênio em uma célula de planta. Nitrato (NO3-) é transportado para a célula de planta e convertido em nitrito (NO2-) pela nitrato redutase (NR). Nitrito é translocado do citoplasma para o cloroplasto, onde ele é reduzido pela nitrito redutase (NiR) a amônio (NH4+). A glutamina sintetase (GS) funciona na assimilação ou reciclagem de amônio. Um par de enzimas, glutamina sintetase (GS)/ glutamato sintase (GOGAT, catalisa a conversão de glutamina (Gln) em glutamato (Glu). Glutamato é um bloco de construção para muitos aminoácidos. Além disso, alanina é sintetizada pela enzima alanina aminotranaferase (AlaAT) a partir de piruvato e glutamato em uma reação reversível.

A FIGURA 2 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácido (SEQ ID NO :s 29 a 45) de AlaAT de vários organismos. Note que algumas das seqüências usadas para esses alinhamentos são seqüências truncadas as quais contêm menos da seqüência completa da AlaAT citada. O alinhamento foi realizado usando a metionina (M) da seqüência de AlaAT de cevada como o primeiro resíduo de referência.

A FIGURA 3 mostra um alinhamento das seqüências de aminoácido (SEQ ID N0:s 29 a 40) de AlaAT de várias espécies de planta. Note que algumas das seqüências usadas para esses alinhamentos são seqüências truncadas que contêm menos da seqüência completa da AlaAT citada. O alinhamento foi realizado usando a metionina (M) da seqüência de AlaAT de cevada como o primeiro resíduo de referência.

A FIGURA 4 mostra a seqüência de nucleotídeo para o promotor OsAntl da presente invenção (SEQ ID NO: 1) . A seqüência foi isolada usando uma busca pelo blastn do banco de dados NCBI usando a seqüência de nucleotídeo (366-3175 bp) do gene btg26 de Brassíca (Stroeher et al. , 1995, Plant Mol. Biol. 27: 541-551) para identificar a seqüência de nucleotídeo de arroz homóloga (número de acesso AF323586). Essa seqüência foi, então, usada, por sua vez, contra o projeto de seqüenciamento de Oryza sativa TIGR (veja: tigr.org/tdb/e2kl/osal/), conforme apresentado no Exemplo 1. A TATA box putativa é mostrada em negrito e os primers usados em amplificação por PCR da seqüência a partir do genoma de arroz estão sublinhados.

A FIGURA 5 mostra uma representação esquemática das etapas para produção da estrutura genética OsAntIpro-Gus, usando o gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) de acordo com o método descrito no Exemplo 1. A FIGURA 6 mostra uma representação esquemática das etapas para produção da estrutura genética OsAntlpro-AlaAT de acordo com o método descrito no Exemplo 1.

A FIGURA 7 mostra a expressão do gene repórter GUS dirigida pelo promotor OsAntl da presente invenção. Expressão está presente na área de expansão celular de pontas da raiz e raízes em desenvolvimento (Painel A) ; em pêlos da raiz de raízes em desenvolvimento (Painel B) ; e em raízes laterais de raízes (Painel C) de uma planta Oryza sativa transformada com a estrutura genética OsAntlpro-Gus, conforme mostrado na FIGURA 5, de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Áreas coradas mais escuras indicam expressão do gene repórter GUS.

A FIGURA 8 mostra a biomassa média em peso seco (gramas) de plantas Oryza sativa transformadas com a estrutura genética OsAntIpro-AlaAT, conforme mostrado na FIGURA 6, comparado com a biomassa média em peso seco (gramas) de plantas Oryza sativa do tipo silvestre crescidas sob as mesmas condições de crescimento, conforme fornecido no Exemplo 1.

A FIGURA 9 mostra o peso médio total de sementes (gramas) de sementes coletadas de plantas Oryza sativa transformadas com a estrutura genética OsAntlpro-AlaAT, conforme mostrado na FIGURA 6, comparado com o peso médio total de sementes (gramas) de sementes coletadas de plantas Oryza sativa do tipo silvestre de controle crescidas sob as mesmas condições de crescimento, conforme fornecido no

Exemplo 1.

A FIGURA 10 mostra a relação entre a biomassa em peso seco (gramas) e o peso total de semente (gramas) para cada planta transgênica.

A FIGURA 11 mostra a seqüência de nucleotídeo do promotor de antiquitina do sorgo da invenção (SEQ ID NO: 9) . A seqüência foi derivada do acesso CW033386 conforme descrito no Exemplo 5 e inclui 44 3 nucleotídeos da seqüência a montante do códon inicial ATG de um gene de antiquitina de sorgo.

A FIGURA 12 mostra a seqüência de nucleotídeo de um promotor de antiquitina de milho parcial (SEQ ID NO: 10). A seqüência foi derivada do acesso BH215004, conforme descrito no Exemplo 5 e contém 2 04 bp a montante de um gene de antiquitina de milho.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Plantas monocotiledôneas tendo EUN intensificado, métodos para intensificação de EUN em plantas monocotiledôneas e métodos de aumento da biomassa e rendimento de semente em plantas monocotiledôneas sob condições limitadas de nitrogênio são descritos aqui. Condições limitadas de nitrogênio são condições sob as quais a biomassa ou rendimento de semente da planta são reduzidas como um resultado de níveis reduzidos de nitrogênio. Sob tais condições, a biomassa ou rendimento de semente da planta pode ser aumentado por meio de aumento da quantidade de nitrogênio disponível através de fertilização ou outros meios. Condições limitativas são também conhecidas como condições sub-ótimas.

Assimilação e metabolismo de nitrogênio em plantas ocorrem através da ação coordenada de uma variedade de enzimas que atuam sobre uma variedade de substratos (Figura 1). A assimilação de nitrogênio ocorre primariamente através das atividades da glutamina sintetase(GS) e glutamato sintase (GOGAT). A partir do ciclo de GS-GOGAT, o glutamato é usado como uma fonte de nitrogênio para fornecer nitrogênio para outras reações metabólicas requeridas. O fluxo metabólico de nitrogênio é principalmente mediado através de reações de transaminação nas quais um grupo amino do glutamato é transferido para outros esqueletos de carbono. A transferência do grupo amino do glutamato para esses outros esqueletos de carbono resulta na disposição de nitrogênio em formas mais prontamente utilizáveis, tais como outros aminoácidos, tal como aspartato ou alanina. Exemplos de tais enzimas são aminotransferases. A Figura 1 mostra a reação catalisada pela enzima AlaAT, a qual catalisa a transferência de um grupo amino de glutamato para piruvato, assim, gerando alanina.

Embora não limitando a invenção a um mecanismo em particular, acredita-se que superexpressão de AlaAT aumenta a eficiência de nitrogênio eliminando os reservatórios disponíveis de aminoácidos que armazenam nitrogênio, tal como glutamato o que, por sua vez, leva à super-regulação das vias de captação e assimilação na planta. Transferindo um grupo amino do glutamato para o piruvato, a ação de AlaAT elimina os reservatórios de glutamato, um composto de armazenamento de nitrogênio. Além disso, o reservatório de alfa-cetoglutarato é reposto. Para compensar a eliminação de glutamato, a planta aumenta a captação e assimilação de nitrogênio para restaurar o equilíbrio. A atividade de captação e assimilação aumentada permite que a planta utilize mais eficazmente níveis menores (sub-õtimos) de nitrogênio presente no solo.

Promotores de antiquitina de monocotiledônea, tais como arroz, sorgo e milho, também são descritos aqui para uso com qualquer tipo de região de codificação de interesse.

Definições A expressão "transgênica" se refere a uma planta monocotiledônea que contém uma molécula de ácido nucléico exógeno que pode ser derivada da mesma espécie de planta monocotiledônea, de uma espécie de planta heteróloga ou de uma espécie não vegetal.

Um "promotor" é uma seqüência de ácido nucléico regulatória, tipicamente localizada a montante (51) de um gene ou seqüência de codificação de proteína que, em conjunto com várias proteínas celulares, é responsável pela regulação da expressão do gene ou seqüência de codificação de proteína. Tais promotores podem ser o promotor de comprimento total ou fragmentos ativos do mesmo. Por "fragmento ativo" entenda-se um fragmento que tem pelo menos cerca de 0,1%, de preferência pelo menos cerca de 10% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 25% da atividade de uma seqüência promotora de referência, conforme testado via métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica para detecção da atividade promotora, por exemplo, medição dos níveis do gene repórter GUS. Seqüências de DNA necessárias para atividade podem ser identificadas através da síntese de vários fragmentos e teste de expressão ou introdução de mutações de ponto em determinadas regiões e teste de perda de atividade. Fragmentos heterólogos de promotores ou outras seqüências promotoras podem ser combinadas para mediar a atividade de uma seqüência promotora. Por exemplo, o promotor CaMV 35S ou outras seqüências promotoras conhecidas podem ser combinadas com a seqüência promotora descrita aqui para mediar a expressão de uma região de codificação de interesse.

A expressão "região de codificação de interesse" inclui qualquer gene que ê, desejavelmente, expresso em um ou mais de um tecido de planta. Da mesma forma, uma "proteína alvo" se refere a qualquer proteína que é desejavelmente expressa em um ou mais de um tecido de planta. Exemplos de uma região de codificação de interesse a qual pode ser vantajosamente utilizada em conjunto com os métodos descritos aqui incluem seqüências de ácido nucléico que codificam uma ou mais de uma proteína envolvida em assimilação de nitrogênio, utilização de nitrogênio, captação de nitrogênio ou combinações dos mesmos.

O termo "níveis elevados" de uma proteína de interesse, conforme usado aqui em referência aos níveis de proteína em uma planta monocotiledônea transgênica, significam níveis maiores de proteína quando comparado com os níveis de proteína de uma variedade de planta monocotiledônea correspondente carecendo do transgene, tal como uma molécula de ácido nucléico superexpressa que codifica uma AlaAT.

As estruturas genéticas descritas aqui também podem incluir outros intensificadores, quer intensificadores de tradução ou transcrição, conforme possa ser requerido. Essas regiões intensificadoras são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem incluir o códon inicial ATG e seqüências adjacentes. O códon inicial deve estar em fase com a rede de leitura aberta da seqüência de codificação para assegurar tradução da seqüência inteira. Os sinais de controle de tradução e códons iniciais podem ser de uma variedade de origens, naturais e sintéticas. Regiões de início de tradução podem ser proporcionadas da fonte da região de início de transcrição ou do gene estrutural. A seqüência também pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada para aumentar a tradução do ácido ribonucléico mensageiro (mRNA).

As estruturas genéticas da invenção podem ainda incluir uma região não traduzida 3' (ou terminadora) que contém um sinal de poliadenilação e outros sinais regulatórios capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão de gene. Exemplos não limitativos de regiões 3' adequadas são as regiões não traduzidas 3' transcritas contendo um sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium, tal como a nopalina sintase (gene Nos), genes de plantas, tais como os genes de proteína de armazenamento de soja, e a pequena subunidade do gene de carboxilase de 5-bifosfato, ribulose- 1 (ssRUBISCO).

Por "operativamente ligado" ou "ligação operativa" entenda-se que as seqüências em particular interagem, direta ou indiretamente, para realizar uma função pretendida, tal como mediação ou modulação de expressão de gene. A interação de seqüências operativamente ligadas pode ser mediada, por exemplo, por proteínas que interagem com as seqüências operativamente ligadas.

O termo "exógena", conforme usado aqui em referência a uma molécula de ácido nuclêico, significa uma molécula de ácido nuclêico originária do exterior da planta. Uma molécula de ácido nuclêico exógena pode ter uma seqüência de nucleotídeo que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que uma molécula de ácido nuclêico exógena pode ser uma molécula de ácido nuclêico heteróloga derivada da mesma espécie de planta ou uma espécie de planta diferente da planta na qual a molécula de ácido nuclêico é introduzida.

Alternativamente, ela pode ser uma molécula de ácido nucléico derivada de uma espécie não vegetal, tal como fungos, levedos, bactérias ou outros organismos não vegetais.

A descrição a seguir é de uma modalidade preferida.

Visão geral de aminotransferases de alanina (AlaAT)

Como uma classe geral de enzimas, aminotransferases são enzimas fosfato de piridoxal-dependentes que catalisam reações conhecidas como reações de transaminação. A reação de transaminação catalisada por aminotransferases envolve a transferência de um grupo α-amino de um aminoácido para a posição α-ceto de um a-ceto ácido. No processo, o aminoácido se torna um α-ceto ácido, enquanto que o aceptor de α-ceto ácido se torna um α-aminoácido. A aminotransferase específica, AlaAT, utiliza glutamato como o doador de grupo amino e piruvato como o aceitador de grupo amino. Transaminação de piruvato para formar alanina é encontrada virtualmente em todos os organismos. Conseqüentemente, enzimas com atividade de AlaAT também são encontradas em virtualmente todos os organismos também. Esse grupo de formas de AlaATs formam uma base para o isolamento e seleção das AlaATs da invenção.

Identificação de AlaATs Em virtude do fato de maioria dos organismos possuir atividade de AlaAT e enzimas, uma série de métodos podem ser usados para identificar e isolar essas seqüências de diferentes espécies. Dada a forte correlação entre estrutura e função, pode-se usar conhecimento das seqüências de membros conhecidos da família AlaAT para coletar membros adicionais da família que podem servir como AlaATs candidatas para uso na invenção.

Busca em um banco de dados: Um método que pode ser usado para gerar um grupo de seqüências de AlaAT para uso na invenção é busca em banco de dados. Em virtude do fato de os genomas de uma série de organismos terem sido seqüenciados, busca em banco de dados baseada em computador baseado em homologia de aminoácido ou ácido nucléico revelarão seqüências que são homólogas a uma AlaAT conhecida que é usada como a seqüência de query. Uma ferramenta comum para tal busca em banco de dados de computador é o programa BLAST disponível do NCBI. A Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) do NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol 215(3): 403-410, 1990) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e na Internet, para uso com relação aos programas de análise de seqüência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Eles podem ser acessados no website do NCBI. Uma descrição de como determinar a identidade de seqüência usando esse programa está disponível no website do NCBI. Um exemplo de uso de um programa BLAST para identificar membros da família AlaAT é descrito no Exemplo 7. O uso de programas de computador, tais como Softberry e PSORT, pode ser usado para determinar a localização subcelular dessas enzimas para excluir enzimas que são objetivadas a locais menos ótimos, isto é, ao peroxissoma.

Dentre os métodos para alinhamento de seqüência os quais são bem conhecidos na técnica estão programas e algoritmos de alinhamento descritos em: Smith e Waterman, J. Mol. Biol. 147(1): 195-197, 1981; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (3): 443-453, 1970; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S .A. 85 (8): 2444-2448, 1988; Higgins e Sharp, Gene 73(1): 237-244, 1988; Higgins e Sharp, Cowput. Appl. Biosci. 5(2): 151-3. (1989); Corpet, Nucleic Acids Res. 16(22): 10881-90, 1988; Huang et al., Comput. Appl. Biosci. 8(2): 155-65, 1992; e Pearson et al. , Methods Mol. Biol. 25: 365-389, 1994. Altschul et al. (Nature Genet. 6(2): 119-129, 1994) apresentam uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia. Dependendo da extensão e colocação de regiões de homologia, seqüências homólogas, identificadas usando métodos de busca baseados em computador, tais como aqueles descritos acima, podem ser razoavelmente suspeitas de codificar uma AlaAT. Se tal seqüência realmente codifica uma AlaAT pode ser determinada através de uma série de meios. Como um primeiro identificador, a notação a uma entrada no GenBank é usada. Muitas seqüências foram anteriormente identificadas e testadas por investigadores como correspondendo à atividade de AlaAT e a anotação a tal entrada no GenBank assim indicaria.

Alternativamente, uma seqüência identificada a partir de uma busca pode ser testada experimentalmente para determinar se ela codifica uma atividade de AlaAT. No caso de uma seqüência de ácido nucléico que tenha sido identificada, ela pode ser isolada para testes usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a seqüência de interesse pode ser amplificada através de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando primers que correspondem às extremidades 5' e 3' do DNA complementar (cDNA). Tais métodos de PCR são bem conhecidos na técnica e são divulgados em fontes tal como o manual de laboratório PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications por M. Innes e colaboradores, Academic Press, 1989. Alternativamente, a seqüência desejada pode ser obtida através de triagem por hibridização convencional usando oligonucleotídeos correspondendo à seqüência de ácido nucléico conhecidos por selecionar uma biblioteca de cDNA.

Métodos de triagem baseados em hibridização são bem conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 a edição, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., 1987).

Uma vez que uma seqüência de DNA que codifica a AlaAT candidata tenha sido obtida, ela pode ser clonada em uma variedade de vetores de expressão usando métodos de biologia molecular convencionais para verificar se a AlaAT foi isolada.

A região de codificação de AlaAT pode ser modificada através de qualquer forma adequada. Por exemplo, ela pode ser modificada para ser passível de transcrição e traduzível no sistema da planta; por exemplo, a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de AlaAT pode ser modificada de modo que ela contenha todas as seqüências de poliadenilação, sítios de início e sítios de término adequados os quais permitem que a seqüência de codificação seja transcrita em mRNA e o mRNA seja traduzido na planta monocotiledônea. Ainda, a região de codificação pode ser modificada de modo que seu uso de códon seja mais similar do que aquele de genes nativos da planta monocotiledônea (isto é, seqüência de planta otimizada pode ser usada). Tais modificações da seqüência de nucleotideo e os métodos pelos quais elas podem ser feitas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Muitos vetores para expressão em E. coli, levedo, células de mamífero ou plantas estão comercialmente disponíveis. Expressão de tal estrutura contendo uma AlaAT em uma célula hospedeira apropriada, tal como E. coli, usando um plasmídeo, tal como vetores pET disponíveis da Novagen (www.Novagen.com), revelará se o plasmídeo codifica uma atividade de AlaAT. Métodos para ensaio de atividade de AlaAT são bem conhecidos na técnica. Um de tais métodos é divulgado na Patente U.S. No. 6,084,153, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Nesse método, tecido de folha é pesado e, então, triturado com areia em um mortar e pilão em tampão de extração contendo Tris-HCl a O1IM (pH de 8,5), ditiotreitol a 10 mM, glicerol a 15% e PVPP a 10% (peso/v) . 0 extrato é clarificado através de centrifugação a 6000 rpm e o sobrenadante foi ensaiado com relação à atividade enzimática. Alanina é adicionada para iniciar a reação conforme descrito. Veja Good e Crosby, Plant Physiol. 90: 13 05-13 09, 1989. Esse ensaio pode ser utilizado para outros organismos, tais como bactérias e levedo, simplesmente substituindo extrato de bactéria ou levedo pelo extrato de tecido de folha.

Métodos de hibridização e PCR

Outros métodos podem ser usados para isolar AlaATs que podem ser usadas na invenção. Em particular, métodos de hibridização em alta, média ou baixa estringência podem ser usados para isolar ortólogos ou homólogos de AlaATs conhecidas que podem ser usados na prática da presente invenção. condições de hibridização são seqüência- dependentes e variam de acordo com os parâmetros experimentais usados. Geralmente condições de hibridização estringentes são selecionadas para ser cerca de 50C a 200C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma determinada resistência iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência alvo se hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada. Condições para hibridização de ácido nucléico e cálculo de estringências podem ser encontradas em Sambrook et al.(1989) e Tijssen (Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte II, páginas 415. Elsevier, Amsterdã, Países Baixos, 1993). Exemplos de fatores que afetam a hibridização de ácido nucléico incluem: temperatura, condições de sal, a presença de solventes orgânicos nas misturas de hibridização e os comprimentos e composições de base das seqüências a serem hibridizadas e a extensão de combinação errônea de base. Um exemplo de condições de alta estringência para hibridização de uma sonda a um DNA ligado a filtro é 5 X SSC, dodecil sulfato de sódio a 2% (SDS) , 100 ug/mL de DNA fita simples a 55-65°C durante a noite e lavagem duas vezes em 0,1 X SSC e SDS a 0,1% a 60-65°C durante 20 minutos.

Condições de estringência reduzida podem ser usadas para isolar seqüências de ácido nucléico que são relacionadas, mas têm combinações erradas. Exemplos de tais condições incluem diminuição das temperaturas de hibridização e lavagem ou elevação das concentrações de sal das soluções de lavagem. Protocolos para tais métodos de hibridização em baixa e média estringência podem ser encontrados em manuais de biologia molecular comumente usados, tais como as referências Sambrook et al. e Ausubel et al. antes mencionadas.

Outros métodos que podem ser usados para isolar ortólogos ou homólogos adequados para uso na invenção incluem clonagem por PCR. Primers únicos ou degenerados podem ser projetados para codificar regiões conservadas em seqüências de nucleotídeo ou aminoácido de AlaAT. Tais regiões conservadas podem ser identificadas através de alinhamento das seqüências de AlaATs conhecidas usando os alinhamentos descritos acima. Os primers de PCR assim projetados podem ser usados em reações de PCR para gerar uma porção de uma seqüência de AlaAT de uma espécie de interesse a qual, então, pode ser usada para isolar um cDNA de comprimento total através de métodos convencionais de seleção de biblioteca ou por meio de métodos de PCR adicionais, tais como Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA (RACE). Protocolos para tais métodos de PCR são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em fontes tal como PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications por M. Innes et al., Academic Press, 1989.

Uma estratégia alternativa para identificação de AlaATs para uso na invenção requer a purificação bioquímica de AlaATs de uma fonte de interesse baseado na atividade enzimática. Em virtude do fato de ensaios enzimáticos para atividade de AlaAT serem bem conhecidos na técnica, aqueles habilitados serão capazes de fracionar uma célula ou tecido de interesse e usar métodos bioquímicos convencionais, tal como cromatograf ia, para purificar uma AlaAT até homogeneidade. Tais métodos bioquímicos estão disponíveis em fontes tais como Protein Purification: Principies and Practice por Robert K. Scopes, Springer Advanced Texts in Chemistry, 3a edição, 1994; Guide to Protein Purification (Methods in Enzymology Series, Vol. 182, 1990) por Abelson et al., Protein Purification Techniques: A Practical Approaeh (Praetieal Approaeh Series, 2001) por Simon Roe (Editor). A AlaAT, uma vez purificada até homogeneidade, pode ser usada para derivar seqüências de aminoácido parciais, das quais oligonucleotídeos podem ser projetados para clonar o cDNA correspondente através de métodos de biologia molecular convencionais, tais como seleção de biblioteca ou PCR, conforme descrito acima.

As Figuras 2 e 3 e Tabelas 1 e 2 mostram alinhamentos entre AlaATs de uma variedade de espécies, oscilando de E. coli a seres humanos, e incluindo uma série de espécies de planta. As homologias percentuais oscilam de mais de 90% a menos de 25% quando a seqüência de cada AlaAT é comparada com aquela de cada uma das outras AlaATs, conforme mostrado na Tabela 1. Uma série de seqüências de aminoácido altamente conservadas que estão presentes em todas seqüências de AlaAT são realçadas em negrito nas Figuras 2 e 3. Tais seqüências de aminoácido evolucionariamente conservadas representam seqüências de consenso ou motivos de seqüência que são característicos de AlaATs. Freqüentemente, tais seqüências formam sítios ativos ou outras regiões funcionalmente significativas de uma proteína. Tabela 1

<table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> Tabela 2

<table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> Superexpressão de AlaAT em plantas monocotiledôneas

Uma vez que AlaAT tenha sido identificada e verificada como correspondendo a uma AlaAT Jbona fide, uma estrutura para superexpressão da AlaAT em uma planta monocotiledônea de interesse é gerada usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma variedade de plasmídeos está disponíveis para essa finalidade, conforme divulgado abaixo. Uma variedade de promotores, tais como promotores constitutivos, vários promotores induzíveis ou promotores tecido-específicos podem ser usados para expressão. Protomores

Os promotores adequados para uso nas estruturas da presente invenção são funcionais em plantas monocotiledôneas e em organismos hospedeiros usados para expressão das estruturas descritas. Muitos promotores de planta estão publicamente disponíveis e vários exemplos são listados acima. Esses incluem promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores tecido- e cêlula- específicos e promotores regulados pelo desenvolvimento. Métodos são divulgados abaixo para a seleção de promotores que são adequados para uso na prática da invenção.

Promotores podem ser isolados através de procedimentos bem conhecidos na técnica de biologia molecular de planta. Promotores exemplificativos, mas não limitativos que podem ser usados na prática da presente invenção incluem: o promotor de antiquitina de arroz (OsAntl), o qual é descrito no Exemplo 1 abaixo, bem como outros promotores de antiquitina, conforme descrito no Exemplo 5 abaixo; o promotor de actina 1 de arro2 (Act-I) , o qual é descrito na Patente U.S. No. 5.641.8 76; o promotor de ubiquitina-1 de milho (Ubi-I) , o qual é descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.510.474, 6.054.574 e 6.977.325; o promotor de desidrogenase-1 de álcool de milho (Adhl), o qual é descrito em Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 228 (1-2): 40- 48, 1991; e os promotores CaMV 35S e 19S, os quais são descritos na Patente U.S. No. 5.352.605. Para outros promotores úteis em monocotiledôneas veja cambia.org.

Um tipo de promotor particularmente útil para expressão de um gene alvo, tal como AlaAT, em uma planta é um promotor de antiquitina de monocotiledônea. 0 promotor de antiquitina de arroz é descrito no Exemplo 1. Outros promotores de antiquitina são descritos no Exemplo 5. Conhecendo os promotores de antiquitina de monocotiledônea divulgados nesses Exemplos, aqueles habilitados poderão identificar prontamente outros promotores de antiquitina de monocotiledônea usando métodos similares àqueles descritos no Exemplo 1 para identificação do promotor de antiquitina de arroz usando o gene btg26. Por exemplo, a seqüência pode ser submetida à análise com um software de previsão de promotor, tal como o software de previsão de promotor de planta TSSP encontrado em http://softberry.com para identificar prováveis seqüências de TATA box e outros elementos de seqüência promotora e analisar adicionalmente motivos promotores que podem ser sítios de reconhecimento para fatores de transcrição usando o Signal Scan Software (Prestridge, 1991; disponível em bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal).

Seqüências que provavelmente codificam promotores podem ser confirmadas através de síntese de vários fragmentos e teste com relação à expressão ou introdução de mutações de ponto em determinadas regiões e teste da perda de atividade usando qualquer sistema de ensaio conhecido por aqueles habilitados na técnica como sendo úteis para medição da atividade de promotor, tal como expressão de um gene repórter sob o controle de uma seqüência promotora. Genes repórteres podem ser qualquer polinucleotídeo, a transcrição deste sob o controle de uma seqüência promotora, a subseqüente tradução do mesmo ou ambos, pode ser prontamente detectada por aqueles habilitados. O gene repórter não tem de codificar uma proteína de comprimento total. Em alguns casos, o gene repórter pode mesmo ser um oligonucleotídeo. Mais comumente, o gene repórter codifica uma proteína com atividade detectável. Genes repórteres comuns incluem GUS, luciferase, GFP, beta-galactosidase, CAT, fosfatase alcalina, etc. Em modalidades preferidas, o gene repórter é GUS.

A expressão do gene repórter pode ser medida a nível de mRNA ou proteína usando qualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, os níveis de mRNA podem ser detectados usando um ensaio de transcrição isento de células. Alternativamente, os níveis de proteína podem ser medidos através de detecção de atividade enzimática, usando anticorpos específicos para a proteína ou um ensaio de transcrição-tradução, o qual permite detecção do nível de mRNA e do nível de proteína ou peptídeo.

Promotores de genes que são regulados similarmente aos genes de antiquitina em plantas poderiam também encontrar uso na invenção. Esses genes poderiam ser genes responsáveis pela turgência que são expressos em tecidos de raiz e poderiam ser induzidos por ABA e/ou sob condições de estresse, tais como estiagem e sal.

Métodos de transformação

Após uma estrutura adequada ter sido feita, plantas transgênicas de interesse podem ser geradas usando métodos de transformação bem conhecidos na técnica e descritos aqui, bem como nos Exemplos abaixo. Uma molécula de ácido nucléico exógena pode ser introduzida em uma planta monocotiledônea para expressão ectópica usando uma variedade de metodologias de transformação, incluindo transformação mediada por Agrobacterium e métodos de transferência direta de gene, tais como eletroporação e transformação mediada por microprojétil (veja, geralmente, Wang et al. (eds) , Transformation of Plants and Soil Microorganisms, Cambridge, Reino Unido: University Press, 1995, o qual é incorporado aqui por referência).

Métodos de transformação baseados em bactérias no solo, Agrobacterium tumefaciens, são particularmente úteis para introdução de uma molécula de ácido nucléico exógena em uma planta com semente. A forma do tipo silvestre de. Agrobacterium contém um plasmídeo Ti (indução de tumor) que direciona a produção de crescimento de excreções tumorigênicas sobre plantas hospedeiras. A transferência da região de T-DNA de indução de tumor do plasmídeo Ti para o genoma de uma planta requer os genes de virulência codificados pelo plasmídeo Ti, bem como bordas de T-DNA, as quais são um conjunto de repetições de DNA diretas que delineiam a região a ser transferida. Um vetor baseado em Agrobacterium é uma forma modificada de um plasmídeo Ti, no qual as funções de indução de tumor são substituídas pela seqüência de ácido nucleico de interesse a ser introduzida no hospedeiro vegetal.

Transformação mediada por Agrobacterium geralmente emprega vetores co-integrados ou, de preferência, sistemas de vetor binário, nos quais os componentes do plasmídeo Ti são divididos entre um vetor auxiliar, o qual reside permanentemente no hospedeiro Agrobacterium e traz os genes de virulência e um vetor de derivação, o qual contém o gene de interesse ligado por seqüências de T-DNA. Uma variedade de vetores binários são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Clontech (Paio Alto, CA).

Métodos de co-cultura de Agrobacterium com células de planta cultivadas ou tecido ferido, tal como explantes de raiz, hipocotilédones, pedaços de caule ou tubérculos, por exemplo, também são bem conhecidos na técnica (Glick e Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, FL, páginas 179- 20519, 1993). Células feridas dentro do tecido de planta que foram infectadas por Agrobacterium podem desenvolver órgãos de novo quando cultivadas sob condições apropriadas; os brotos transgênicos resultantes eventualmente dão origem a plantas transgênicas que expressam ectopicamente uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de AlaAT. Agrobacterium também pode ser usada para transformação de semente inteira, conforme descrito em Bechtold et al., CR. Acad. Sei. Paris. Life Sei. 316: 1194- 1199, 1993 (o qual é incorporado aqui por referência).

Transformação é útil para a produção de uma variedade de plantas com semente transgênicas (Wang et al., supra, 1995).

Transformação mediada por microprojétil também pode ser usada para produzir uma planta transgênica que expressa ectopicamente AlaAT. Esse método, primeiro descrito por Klein et al. (Nature 327: 70-73, 1987, o qual é incorporado aqui por referência), conta com microprojéteis, tais como ouro ou tungstênio, que são revestidos com a molécula de ácido nucléico desejada através de precipitação com cloreto de cálcio, espermidina ou PEG. As partículas de microprojétil são aceleradas em alta velocidade em um tecido de planta usando um dispositivo, tal como o BIOLISTIC PD-1000 (Biorad, Hercules, CA).

Distribuição mediada por microprojétil ou "bombardeamento de partícula" é especialmente útil para transformar plantas que são difíceis de transformar ou regenerar usando outros métodos. Transformação microprojétil-mediada foi usada, por exemplo, para gerar uma variedade de espécies de plantas transgênicas, incluindo algodão, tabaco, milho, álamo híbrido e papaia (veja Glick e Thompson, supra, 1993), bem como safras de cereais, tais como trigo, aveia, centeio, sorgo e arroz (Duan et al., Nature Biotech. 14: 494-498, 1996; Shimamoto, Curr. Opin. Biotech. 5: 158-162, 1994; cada um dos quais é incorporado aqui por referência). Em vista do acima, o técnico habilitado reconhecerá que transformação mediada por Agrobacterium ou por microprojétil, conforme divulgado aqui ou outros métodos conhecidos na técnica, podem ser usados para produzir uma semente de planta transgênica da invenção.

Métodos alternativos de transferência de gene e transformação úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, lipossomas, eletroporação ou captação química-mediada de DNA livre, técnicas de co-precipitação com fosfato de cálcio, microprojéteis objetivados e micro- ou macro-injeção, transformação direta de DNA e podem envolver plasmídeos Ti, plasmídeos Ri ou vetores de vírus de planta. Tais métodos de transformação são bem documentados na técnica.

Ensaios de crescimento e EUN

A planta transgênica resultante de interesse é testada com relação à expressão do transgene de AlaAT e aquelas linhagens de planta que expressam o transgene de AlaAT são testadas com relação ao efeito do transgene expresso sobre o crescimento da planta ou utilização de nitrogênio. Testes adequados para crescimento de uma planta monocotiledônea podem incluir uma variedade de ensaios, tais como medição da altura da planta, peso de semente, diâmetro de caule, número de folhas da planta, biomassa da planta conforme medido em peso fresco ou peso seco de raízes, folhas, brotos, rebentos e flores, para mencionar uns poucos desses parâmetros de medição. Testes para EUN podem incluir crescimento de plantas transgênicas sob diferentes condições sub-ótimas de nitrogênio. Testes podem ser testes no campo, testes na estufa ou câmara de crescimento ou testes in vitro. As plantas podem ser crescidas hidroponicamente em Perlite™, outro material de crescimento comercialmente disponível, solo ou em meio baseado em agar. Uso de promotores de antiqultina de monocotiledônea para direcionar a expressão de outras regiões

Promotores de antiquitina de monocotiledônea também podem ser usadas para direcionar a expressão de outras regiões de codificação que não AlaAT.

A região de codificação de interesse, ou um gene alvo, da invenção pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que é, desejavelmente, expressa dentro de uma planta de arroz. Classes gerais de regiões de codificação as quais podem ser, vantajosamente, empregadas nos métodos e estruturas da invenção incluem seqüências de nucleotídeo que codificam proteínas estruturais; proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio; proteínas envolvidas na captação de nitrogênio; proteínas envolvidas no transporte e captação de nitrogênio; enzimas e proteínas envolvidas em utilização de nitrogênio; proteínas envolvidas em resistência, em plantas, em pesticidas ou herbicidas; proteínas envolvidas em resistência a nematóides, vírus, insetos ou bactérias; proteínas envolvidas em resistência ao estresse em plantas, por exemplo, mas não limitado a, estresse osmótico, temperatura, pH ou oxigênio; proteínas envolvidas em estimulação ou continuação de crescimento de planta; proteínas envolvidas em fito-remediação; ou proteínas tendo propriedades farmacêuticas ou enzimas de codificação as quais produzem compostos tendo propriedades farmacêuticas.

Por exemplo, a região de codificação de interesse pode codificar uma proteína de utilização de nitrogênio e, em particular, uma enzima que assimila amônia em aminoácidos ou usa os aminoácidos formados em reações biossintéticas. Essa proteína pode ser selecionada de, mas não limitando a, um transportador de nitrato (alta ou baixa afinidade), um transportador de amônio, um transportador de amônia, um transportador de aminoácido, alanina desidrogenase, glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase (AS), glutamato sintase (também conhecida como glutamato 2: oxoglutarato amino transferase e GOGAT), asparaginase (ANS), glutamato desidrogenase (GDH), nitrato redutase, aspartato aminotransferase (AspAT), alanina aminotransferase (AlaAT) e outras aminotransferases conhecidas. Tais proteínas são divulgadas na Publicação de Pedido de Patente US Número 2005/0044585, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

O gene alvo ou região de codificação de interesse pode ser naturalmente expresso na planta de arroz ou pode ser heteróloga à planta de arroz. 0 gene pode se originar de qualquer fonte, incluindo fontes virais, bacterianas, vegetais ou animais. De preferência, a região de codificação de interesse é heteróloga a seqüência promotora de antiquitina de monocotiledônea à qual ela está operativamente ligada, pelo fato de que ela não é do gene ao qual a seqüência promotora de antiquitina de monocotiledônea está naturalmente relacionada.

A região de codificação pode ser modificada de qualquer forma adequada de forma a manipular um gene ou planta de arroz com propriedades desejáveis. A região de codificação pode ser modificada para ser passível de transcrição e tradução no sistema de planta; por exemplo, a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode ser modificada de modo que ela contenha todas as seqüências de poliadenilação, sítios iniciais e sítios terminais necessários os quais permitem que a seqüência de codificação seja transcrita em mRNA (ácido ribonucléico mensageiro) e o mRNA seja traduzido na planta de arroz. Ainda, a região de codificação pode ser modificada de modo que seu uso de códon seja mais similar àquele de genes nativos da planta de arroz (isto é, seqüência otimizada de planta pode ser usada). Tais modificações de seqüência de nucleotídeo e os métodos pelos quais elas podem ser feitas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os métodos e estruturas descritos aqui permitem a produção de plantas e sementes tendo expressão de um ou mais genes desejados na planta. Há uma ampla variedade de possíveis aplicações das plantas descritas aqui incluindo, mas não limitado a, produção de plantas tendo tolerância aumentada ao estresse, captação aperfeiçoada de nitrogênio, utilização aperfeiçoada de nitrogênio, teor aumentado de nutriente, rendimento aumentado de nutrientes de compostos desejados e propriedades fito-remediativas. Aplicações específicas são ainda descritas abaixo. Os exemplos a seguir demonstram adicionalmente várias modalidades preferidas da presente invenção. Embora os exemplos ilustrem a invenção, eles não se destinam a limitar a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo Is Demonstração de EtJN em arroz expressando AlaAT de cevada

Identificação e caracterização de um promotor de antiquitina de arroz (OsAntl)

A seqüência de nucleotídeo (bp 366-3175) do gene btg26 (Stroeher et al. , 1995, Plant Mol. Biol. 27: 541-551; número de acesso S77096) foi usada para busca no banco de dados de nucleotídeo no NCBI usando a ferramenta de busca blastn. Uma seqüência de arroz (número de acesso AF323586) foi identificada e essa seqüência de nucleotídeo foi usada para busca no projeto de seqüenciamento de Oryza sativa TIGR (tigr.org/tdb/e2kl/osal/). O homólogo de arroz de btg26, antiquitina de Oryza sativa (OsAntl), foi identificado sobre o cromossoma 9 de arroz (número de acesso AP005570; 98524-101189 pares de base). Uma seqüência de 973 bp (nucleotídeos 101189-100216 de AP005570) a montante do códon inicial de OsAntl é mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 1). A seqüência dos 403 bps a montante (5·) do códon inicial ATG do gene de OsAntl foi selecionada para análise. Para determinar se a seqüência poderia funcionar como uma seqüência promotora, a seqüência foi analisada usando o software de previsão de promotor de planta TSSP encontrado em http://softberry.com/. A análise previu que a seqüência era uma seqüência promotora de planta. A localização mais provável da TATA box (negrito na Figura 2) , bem como outros elementos da seqüência promotora, foi determinada.

Uma vez que a seqüência promotora OsAntl projetada foi prevista como contendo elementos promotores de acordo com análise Softberry, as seqüências foram analisadas com relação a motivos promotores que podem ser sítios de reconhecimento para fatores de transcrição usando o Signal Scan Software (Prestridge, 1991; http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal). Cinco seqüências sinalizadoras diferentes foram previstas no promotor OsAnt1, incluindo sítios de ligação de fator de transcrição ADRl , DBF-A, GAL4, HSTF e RAF.

A seqüência OsAntl foi comparada com seqüências de ácido nucléico de seqüências promotoras de bgt26 de Brassica napus e Arabídopsis usando o software de alinhamento de múltiplas seqüências ClustalW 1.8 na homepage BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/) e o servidor BOXSHADE (ch.embnet.org/software/BOX_/orm.htmL) . Inspeção de nucleotídeos conservados revelou que as seqüências promotoras do gene-26 de turgência de Brassica e Arabidopsis são mais similares uma â outra do que a seqüência OsAntl. Uma característica dentre todas as três seqüências promotoras (arroz, Brassica, Arabidopsis) é a dos tratos de polipirimidina (CT) evidentes dentro das seqüências de nucleotídeo. Esses tratos oscilam de 20-22 bases e são encontrados exatamente a montante das prováveis TATA box em todas as três seqüências promotoras. Além disso, a seqüência OsAntl tem um segundo trato de polipirimidina exatamente a montante do códon inicial ATG.

Clonagem de um promotor de antiquitina de arroz

DNA genômico de arroz foi isolado do cv. Kitaake. Os seguintes primers de PCR (posições sublinhadas na Figura 2) correspondendo à região promotora OsAntl foram selecionados:

Primer 1: AGGAAGTGATTTTTAGCGTAGCTG (SEQ ID NO: 2)

Primer 2: ATGGCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGG (SEQ ID NO: 3).

0 PCR "touch-down" foi conduzido usando o DNA genômico de arroz e os primers acima. Um fragmento de 975 bp foi produzido. O fragmento amplificado por PCR foi ligado no vetor pCR®II-T0P0 (Invitrogen) e transformado em células TOP10 de Ε. coli. O plasmídeo resultante é designado pT- riceOsAntlpro.

Análise de seqüência indicou que o fragmento de PCR de 975 bp codifica uma seqüência promotora designada a seqüência promotora OsAnt1. Comparação do promotor OsAntl do cv. Kitaake com aquela do cv. Nipponbare (obtida do banco de dados) revelou que elas compartilham 99,9% de identidade. A TATA box putativa foi encontrada 145 bps a montante do códon inicial.

Produção da estrutura OsAntlpro-GUS

0 gene repórter de beta-glucuronidase (GUS) acionado por OsAntl foi produzido usando as etapas mostradas esquematicamente na Figura 5. A estrutura RiceOsAntIpro-GUS foi produzida através de amplificação do modelo pT- RiceOsAntlpro usando os seguintes primers:

Primer 3: seqüência promotora EcoRI-OsAntl GGAATTCAGGAAGTGATTTTT (SEQ ID NO:4)

Primer 4: seqüência promotora NcoI-OsAntl CATGCCATGGATGGCAGAAGA (SEQ ID NO:5)

Os fragmentos de PCR resultantes foram ligados no vetor binário de planta, pCAMBlA13 05.1, digerido com EcoRI e NcoI para produzir uma estrutura pCAMBIA13 05.1 riceOsAntlpro-GUS. As seqüências de EcoRI e NcoI na extremidade dos primers 3 e 4, respectivamente, permitem a inserção do fragmento de PCR no vetor pCAMBIA13 05.1, substituindo o promotor CaMV35s existente pela seqüência promotora OsAntl. A seqüência de NcoI (CCATGG) inclui um códon de Met, ATG, o qual está em rede com o gene repórter GUS e permite expressão do gene repórter GUS a partir da seqüência promotora OsAntl. Produção da estrutura OsAntlpro-AlaAT

O gene de AlaAT de cevada acionado por OsAntl foi produzido usando as etapas mostradas esquematicamente na Figura 3. A estrutura RiceOsAntlpro-AlaAT foi produzida através de amplificação do modelo pT-RiceOsAntlpro usando os seguintes primers:

Primer 3: seqüência promotora EcoRI-OsAntl GGAATTCAGGAAGTGATTTTT (SEQ ID NO: 4) Primer 5: seqüência promotora PstI-OsAntl

AACTGCAGATGGC AGAAGA (SEQ ID NO: 6)

Os fragmentos de PCR resultantes digeridos com EcoRI e PstI foram ligados no vetor binário de planta, pCAMBIA13 00, digerido com EcoRI e PstI para produzir pCAMBlAl3 00- riceOsAntlpro.

Um fragmento de DNA de AlaAT foi amplificado através de PCR usando pAGOOl como um modelo. pAGOOl é descrito na Patente U.S. No. 6,084,153, onde ele é identificado como pbtg26/AlaAT/nos. Ele contém o promotor de btg26 ligado ao gene AlaAT de cevada com um terminador de nopalina sintase. As seqüências AlaAT/terminador nos de cevada foram amplificadas a partir do pAGOOl usando os seguintes primers:

Primer 6: seqüência PstIAlaAT AACTGCAGATGGCTGCCACCG (SEQ ID NO: 7)

Primer 7: seqüência HindIII-terminador NOS CCCAAGCTTCCCGATCTAGTA (SEQ ID NO: 8)

O fragmento AlaAT/nos resultante foi digerido com PstI e HindIII e ligado na pCAMBIA13 00-riceOsAntlpro digerido com PstI e HindIII para produzir uma estrutura pCAMBIA1300- riceOsAntlpro-AlaAT.

Transformação do arroz

Métodos de transformação do arroz são bem conhecidos na técnica (Sridevi et al., Cxirrent Sei. 88: 128-132, 2005; Saharan et al., African J. Biotech 3 (11): 572-575, 2004; Khanna et al., Aust. J. Plant Physiol. 26: 311-324, 1999; Zhang et al., Molecular Biotechnology 8 (3): 223-231, 1988; Rashid et al., Plant Cell Rep. 15: 727-730, 1996; Aldemita e Hodges, Planta 199: 612-617, 1996; Hiei et al., Plant J. 6: 271-282, 1997; Li et al. , Plant Cell Rep. 12: 250-255, 1993; Christou et al. , Biotechnology 9: 957-962, 1991). Transformação mediada por Agrobaeterium de arroz foi realizada conforme modificado a partir da Patente U.S. No. 5.591.616 conforme descrito abaixo.

PCAMBIA1305.1-riceOsAntlpro-GUS e pCAMBIA1300- riceOsAntlpro-AlaAT foram transferidos para a cepa EHA 105 de Agrobacterium (Hood et al., (1993) Transgenic Res. 2: 208-218) através de eletroporação (Sambrook et al., 1989). Células de Agrobacterium foram colocadas sobre meio AB sólido (Chilton et al. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 71:3672- 3676, 1974) contendo 50 mg/L de canamicina e incubadas a 28°C durante 3 dias. As bactérias foram, então, coletadas com uma espátula plana e re-suspensas em meio de cultura líquido (R2-CL, Tabela 3) através de ligeiro turbilhonamento anterior à transformação dos tecidos de arroz.

Sementes maduras de arroz (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) foram usadas no experimento de transformação. As sementes foram descascadas e a superfície esterilizada através de imersão (1 min) em etanol a 70% (v/v), seguido por embebimento em alvejante a 50% mais Tween-20 a 0,1% durante 10 min e, então, enxãgüe cinco vezes em água destilada estéril. Após esterilização, as sementes foram cultivadas sobre meio de indução de caule (NB, Tabela 3) e incubadas durante três semanas no escuro a 28°C. Tabela 3. Meio usado para indução de caule, inoculação, co- cultura, fase de repouso, seleção, regeneração e enraizamento

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b Opcional

Após três semanas, unidades nodulares embriogênicas de 3-5 mm de comprimento liberado do caule derivado de escutelo na interface explante/meio foram imersas em 25 mL de meio de co-cultura líquida (R2-CL, Tabela 3) contendo células de Agrobacterium na densidade de 3-5 χ 10^9 células/mL (OD600 = 1) sm uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro durante 10-15 minutos. Unidades embriogênicas foram, então, secas sobre papel filtro esterilizado, transferidas para uma placa de Petri contendo meio de co- cultura sólido (R2-C2, Tabela 3) e incubadas durante três dias a 25°C no escuro. Caule embriogênico co-cultivado foi, então, transferido para meio de repouso (R2-AS, Tabela 3) e incubada a 28°C no escuro durante uma semana.

Após uma semana, unidades embriogênicas não contaminadas foram, então, individualmente transferidas para meio de seleção (R2S, Tabela 3) contendo higromicina para seleção de tecido transformado e incubadas a 280C no escuro. Após 3 semanas de seleção sobre meio R2S, as unidades embriogênicas se tornaram marrons escuras com protuberâncias de cor marrom surgindo por toda a superfície do caule foram transferidas para meio de seleção NBS (Tabela 3). Após 5 semanas de co-cultura, as protuberâncias desenvolveram estruturas globulares de cor marrom que foram gentilmente separadas do caule e incubadas durante 2 semanas na placa de Petri novamente selada. Após 2 semanas, essas estruturas globulares se converteram em caules de formato redondo, compactos e amarelados.

Os caules resistentes à higromicina, supostamente transgênicos, foram gentilmente separados, transferidos, cultivados sobre meio de pré-regeneração (PRN, Tabela 3) e, então, incubados durante mais uma semana. Todos os caules resistentes originários de uma única unidade nodular embriogênica co-cultivada foram agrupados em um setor da placa com PRN. Caules lobulados, de cor creme-branco, com uma aparência uniforme e seca foram individualmente transferidos para meio de regeneração (RN, Tabela 3) , incubados durante 2 dias no escuro, então, mantidos durante três semanas sob um foto-período de 12/12-h (dia/noite) com luz proporcionada em uma intensidade de 55 μmoles/m por seg. Brotos verdes que se regeneraram de um caule resistente foram dissecados e sub-cultivados no tubo de ensaio contendo meio de enraizamento (R,Tabela 1) durante 1-2 semanas para promover raízes e brotos vigorosos antes de serem transferidos para vasos nas salas de crescimento.

Plantas transgênicas cresceram até a maturidade em vasos de 16 cm contendo mistura para plantio em vaso sem solo (Metromix 220) . As plantas foram mantidas em salas de crescimento ajustadas 28°C e fotoperíodos de 14/10 horas dia/noite. Fertilizante foi aplicado duas vezes por semana, começando duas semanas após plantio nos vasos. A mistura de fertilizante continha 225g de fertilizante 20/20/20, 50 g de micronutrientes para planta, 6,1g de CuSO4. SH2O, 14 0 g de FeEDTA, 13,8g de ZnSO4.7H2O, 260g de MgSO4.7H2O, 3,7 g de H3BO3 para um total de 712,4g. Dois gramas da mistura de fertilizante são dissolvidos em 8 litros de água e aplicados duas vezes por semana a 24 plantas.

Análise de expressão dirigida pela seqüência promotora OsAnt1 Indução de expressão dirigida pela seqüência promotora OsAntl foi examinada usando plantas de arroz transformadas com a estrutura OsAntlpro-GUS. As plantas foram germinadas e crescidas hidroponicamente em condições estéreis em jarros Magenta. Plantas de duas semanas de idade foram coradas para atividade do GUS in vivo através de injeção, no meio de enraizamento, de 5 mL de tampão de fosfato a 50 mM (pH de 7,5) contendo X-gluc a 0,2 mM (ácido 5-bromo-4- cloro-3-indolil-beta-glucurônico) e incubando as plantas nesse meio durante 1-24 horas. Tecido de raiz foi, então, visualizado sob um microscópio de dissecação e fotografias foram tiradas, as quais são mostradas na Figura 7.

As áreas coradas de negro na Figura 7 indicam expressão do gene repórter GUS. Não há expressão do gene repórter GUS acionado pelo promotor OsAntl na ponta da raiz (especificamente, as células em divisão); contudo, expressão começa muito rapidamente na zona de expansão celular, exatamente atrás da ponta da raiz. A seqüência promotora OsAntl direcionou a expressão do gene repórter GUS para os pêlos da raiz também. Ainda, da ponta de raízes mais maduras, a expressão é perdida da raiz principal, mas raízes laterais coram muito intensamente, indicando que OsAntl direciona expressão nessas raízes laterais muito fortemente. Análise de plantas transformadas contendo a estrutura AlaAT

Cinqüenta e oito plantas transgênicas OsAnt1/AlaAT/NOS foram geradas e medições de floração, número de brotos, pesos da semente e biomassa na maturidade foram registrados para as plantas da geração TO.

A biomassa em peso seco de plantas OsAntl/AlaAT e plantas de controle foi medida na maturidade e os dados são apresentados na Figura 8. A biomassa média das plantas transgênicas OsAntl/AlaAT foi maior do que a biomassa media de plantas de controle.

Sementes foram coletadas de plantas OsAntl/AlaAT e plantas de controle na maturidade e o peso total das sementes foi medido. Os resultados são mostrados na Figura 9, a qual mostra que o peso total das sementes coletadas de plantas OsAntl/AlaAT era maior do que o peso das sementes de plantas de controle.

A Figura 10 mostra a relação entre a biomassa em peso seco e peso total de sementes para cada planta transgênica.

Uma correlação substancialmente linear é mostrada, a qual indica que um aumento na biomassa resulta em um aumento correspondente em um peso total de semente em plantas OsAnt1/AlaAT.

Esses resultados indicam que plantas transgênicas OsAntl/AlaAT são capazes de otimizar a utilização de nutrientes disponíveis, desse modo, resultando em um aumento na biomassa da planta, rendimento de semente ou uma combinação dos mesmos.

Exemplo 2: Demonstração de EUN em milho usando OsAnt1/AlaAT de cevada

A estrutura OsAnt1-pro-AlaAT pode ser incorporada em vetores binários de planta adequados para uso em transformação mediada por Agrobacterium de milho. Muitos métodos para transformação de embriões imaturos de milho usando uma variedade de marcadores selecionáveis são conhecidos na técnica (Ishida et al. , Nature Biotech. 14: 745-750, 1996; Lupotto, Maydica 44: 211-218, 1999; Zhao et al., Molec. Breeding 8: 323-333, 2001; Frame et al. , Plant Physiol 129: 13-22, 2002 e Miller et al. , Transgenic Res. 11: 381-396, 2002, Patente U.S. No. 5.591.616). Contratar produção de plantas de milho transgênicas também é possível através de facilidades tal como a Plant Transformation Facility, Iowa State University, Ames, Iowa.

Alternativamente, a seqüência OsAntlpro-AlaAT pode ser usada similarmente em métodos de transformação biolística para milho (Wright et al., Plant Cell Reports 20(5): 429- 436, 2001; Brettschneider et al. , Theorel. Appl Genet. 94: 737-748, 1997; Gordon-Kamm et al. , Plant Cell 2 (7): 603- 618, 1990; Fromm et al., Biotechnology (Ν Υ). 8(9): 833-9. 1990).

Plantas de milho podem ser testadas com relação à EUN através de medição da biomassa e rendimento de semente durante crescimento sob vários regimes de fertilizante de nitrogênio, incluindo limitação de nitrogênio. A biomassa da planta pode ser o peso fresco ou peso seco, peso total da planta, peso da folha ou peso da raiz. Condições sub- ótimas de nitrogênio são aquelas condições nas quais concentrações de nitrogênio limitam o crescimento. Sob tais condições, a adição de nitrogênio extra, tal como em fertilizantes, aumentará o crescimento. Para cada um desses testes, a biomassa e o rendimento de semente podem ser avaliados em uma câmara de crescimento, estufa ou testes no campo.

Exemplo 3: Demonstração de EUN em trigo usando OsAntl/AlaAT de cevada

Similar ao milho, a estrutura OsAntl-pro-AlaAT pode ser usada para métodos de transformação de trigo através de bombardeamento com pistola dè partícula (Pastori et al., J. Exp. Bot. 52 (357): 857-863, 2001; Becker et al. , Plant J. 5: 299-307, 1994) ou incorporada em vetores binários de planta adequados para uso em transformação Mediada por Agrobacterixm de trigo (Cheng et al., Plant Physiol. 115: 971-980, 1997; Pedido de Patente U.S. US2003/0024014A1). Outros métodos para transformação de trigo são estabelecidos na técnica.

Plantas de trigo podem ser testadas com relação à EUN através de medição da biomassa e rendimento de semente durante crescimento sob vários regimes de fertilizante de nitrogênio, incluindo limitação de nitrogênio. A biomassa da planta pode ser o peso fresco ou peso seco, peso total da planta, peso da folha ou peso da raiz. Condições sub- ótimas de nitrogênio são aquelas condições nas quais concentrações de nitrogênio limitam o crescimento. Sob tais condições, a adição de nitrogênio extra, tal como em fertilizantes, aumentará o crescimento. Para cada um desses testes, a biomassa e o rendimento de semente podem ser avaliados em uma câmara de crescimento, estufa ou testes no campo.

Exemplo 4: Demonstração de EUN em sorgo usando OsAnt1/AlaAT de cevada

Transformação de sorgo mediada por Agrobacterium de embriões imaturos com um vetor binário contendo qualquer uma das estruturas de promotor OsAntl/AlaAT pode ser obtida de acordo com métodos estabelecidos na técnica (Zhao et al., Plant Mol. Biol. 44 (6): 789-98, 2000; Gao et al. , Genome 48(2): 321-33, 2005; Zhao, Z. Y., Methods Mol Biol 343: 233- 44, 2006; Howe et al. , Plant Cell Rep. 25(8): 784-91, 2006) .

Plantas de sorgo podem ser testadas com relação à EUN através de medição da biomassa e rendimento de semente durante crescimento sob vários regimes de fertilizante de nitrogênio, incluindo limitação de nitrogênio. A biomassa da planta pode ser o peso fresco ou peso seco, peso total da planta, peso da folha ou peso da raiz. Condições sub- ótimas de nitrogênio são aquelas condições nas quais concentrações de nitrogênio limitam o crescimento. Sob tais condições, a adição de nitrogênio extra, tal como em fertilizantes, aumentará o crescimento. Para cada um desses testes, a biomassa e o rendimento de semente podem ser avaliados em uma câmara de crescimento, estufa ou testes no campo.

Exemplo 5: Identificação de seqüências promotoras alternativas (antiquitina) para uso em estruturas com EUN

Outras seqüências promotoras de antiquitina úteis em monocotiledôneas podem ser identificadas em bancos de dados de seqüência. Conforme descrito para isolamento do promotor do arroz no Exemplo l, a seqüência de nucleotídeo (bp 3 66- 3175) do gene btg26 (Stroeher et al. , Plant Mol. Biol. 27: 541-551 , 1995; número de acesso S77096) é usada para busca no banco de dados de nucleotídeo no NCBI usando a ferramenta de busca blastn. Além da seqüência de arroz identificada, outras seqüências de antiquitina de monocotiledônea são identificadas no banco de dados, incluindo sorgo (número de acesso U87982), milho (números de acesso AY103614 e BT017791), cacau (Theobroma cacao; número de acesso DQ448866; e Curculigo latifolia, número de acesso X64110). ESTs para trigo, cana-de-açúcar e Panicum virgatum também podem ser identificadas em bancos de dados usando as seqüências de nucleotídeo ou aminoácido de antiquitina de arroz identificadas usando vários algoritmos de busca.

Similar à identificação do promotor OsAntl, uma seqüência promotora de sorgo foi identificada usando a seqüência de nucleotídeo de arroz do clone de antiquitina (número de acesso AF323586) em uma busca pelo BLAST das seqüências de sorgo no NCBt Genome Sequence Survey (gss) Database. O clone CW033386 foi identificado como contendo 443 nucleotídeos de seqüência a montante do códon inicial ATG de um gene de antiquitina de sorgo (SEQ ID NO: 9;

Figura 11) . Essa seqüência pode ser usada como uma seqüência promotora sozinha ou métodos para clonar e seqüenciar fragmentos genômicos mais longos podem ser usados para identificar outras seqüências a montante. Esses fragmentos podem ser partes de seqüências BAC ou de outros esforços de seqüenciamento de genoma em sorgo ou semelhante. Aqueles habilitados na técnica também poderiam determinar o genoma usando métodos tais como RCP invertida e kits de determinação de genoma.

Uma seqüência a montante do gene de antiquitina de milho foi identificada em uma busca pelo BLAST usando a seqüência do clone de antiquitina de arroz contra as seqüências de Zea mays no NCBI Genome Survey Sequences Database. Acesso BH215004 foi identificado como contendo uma seqüência de 2 04-bp a montante de um gene de antiquitina de milho (SEQ ID NO: 10, Figura 12) . Essa seqüência foi usada como uma seqüência promotora sozinha ou métodos para clonar e seqüenciar fragmentos genômicos mais longos podem ser usados para identificar seqüências de até 1,5 kb a montante desse gene de antiquitina em particular, seqüências incluindo os promotores mais longos poderiam ser usadas para projetar estruturas de promotor/gene de AlaAT conforme descrito abaixo.

Exemplo 6: Construção de cassetes de expressão alternativos para estruturas com EUN

Cassetes promotores para expressão de vários genes são construídos através de combinação do promotor de interesse com um terminador nos com sítios de restrição convenientes entre o promotor e o terminador para clonagem de gene. Outros sítios de restrição flanqueiam o promotor e o terminador para facilitar movimento do cassete para um vetor binário para transformação de planta.

Um vetor base contendo o terminador nos é construído através de amplificação por RCP da região nos contida nos vetores binários descritos na Patente U.S. No. 6.084.153 com os primers NOSupper2: 5' - CCTAGGCCATGGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTT-3 ' (SEQ ID NO: 11) e NOSlower: 5 '-TTAATTAACGATCTAGTAACATAGATGACA-3 ' (SEQ ID NO: 12). N0Supper2 fornece sítios de restrição AvrII e NcoI à extremidade 5' do terminador nos e NOSlower fornece um sítio PacI à extremidade 3' do fragmento amplificação. PCR foi realizada usando o kit BD Advantage™ 2 PCR seguindo as instruções do fabricante. 0 fragmento de 263 bp resultante é clonado no vetor pCRe2. l-TOPO® usando um kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen) e células de E. coli One Shot® seguindo as instruções do fabricante. Esse plasmídeo é Nos/PCR2.1.

O sítio NcoI no gene de resistência à canamicina na parte principal do Nos/pCR2.1 é removido usando o kit QuikChange"8 XL Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) seguindo as instruções do fabricante. Primers que podem ser usados para introduzir uma alteração de nucleotídeo silenciosa são NcoIpCR2.1 Inferior 5·- GCAGGCATCGCCATGAGTCACGACGAGATC-3' (SEQ ID NO: 13) e NcoIpCR2.1 Superior 5'-GATCTCGTCGTGACTCATGGCGATGCCTGC-S' (SEQ ID NO: 14). Deleção do sítio NcoI pode ser verificada através de análise por restrição e crescimento de E. coli sobre canamicina. O plasmídeo resultante é Nos/pCR2.1mut.

Um cassete de expressão alternativo para expressão de genes a partir do promotor OsAntl é feito da seguinte maneira. O promotor OsAntl é clonado de DNA genômico de arroz var. Nipponbare (feito através das recomendações do fabricante, Sigma Extract-n-AMP™) usando PCR. Primers para uma versão ligeiramente mais longa do promotor OsAntl que não aqueles mostrados em SEQ ID NO: 1 são: Primer dianteiro 5' -ATTAAACCTAGGTTAATTAAGTTTAAACGACCTATAAAGTCAAATGCAAAT- 3' (SEQ ID NO:15) e primer reverso 5'- TTTAATTCATGAGACGTCTTTGCGATCGCGCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGGTAG - 3' (SEQ ID NO: 16).

O primer dianteiro incorpora sítios de restrição AvrII, PacI e PmeI e o primer reverso incorpora sítios de restrição BspIII, AatII e AsiSI para facilitar outras etapas de clonagem. O fragmento de 1,1 kb resultante (correspondendo aos nucleotídeos 101336-100216 de AP005570) é clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® usando um kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen) e células de E. coli One Shot seguindo as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante é digerido com as enzimas de restrição AvrII e BspIII e é clonado no Nos/pCR2.Imut que tinha sido digerido com AvrII e NcoI. A estrutura resultante tem um promotor OsAnt1 e uma região nos 3' com sítios AsiSI e AatII únicos entre os mesmos para clonagem de genes de interesse. O cassete de expressão é flariqueado por sítios de restrição AvrII, PacI e Pmel sobre a extremidade 5' e um sítio de restrição PacI sobre a extremidade 3' para facilitar movimento em um vetor de expressão binário de planta.

Um cassete de expressão utilizando um promotor Ant de sorgo é projetado de uma maneira similar. O primer dianteiro 5 ' -

ATTAAACCTAGGTTAATTAAGTTTAAACGATTCGACAATATTTATCAAAT- 3' (SEQ ID NO: 17) e o primer reverso 5 - TTTAATTCA

TGAGACGTCTTTGCGATCGCGGCGCCGGCGGCGTTGGCAGGT- 3' (SEQ ID NO: 18) podem ser usados para amplificar um promotor Ant de 443-bp (SEQ ID NO: 9) de DNA genômico de sorgo, conforme descrito acima para o promotor OsAnt1 e DNA de arroz. O fragmento promotor clonado é flanqueado por sítios de restrição AvrII, PacI e PmeI sobre a extremidade 5' e sítios BspIII, AatII e AsiSI sobre a extremidade 3. 0 fragmento promotor é digerido com as enzimas de restrição AvrII e BspIII e é clonado no Nos/pCR2. tmut que foi digerido com AvrII e NcoI. A estrutura resultante tem um promotor Ant de sorgo e uma região nos 3' única com sítios AsiSI e AatII entre os mesmos para clonagem de genes de interesse. O cassete de expressão é flanqueado por sítios de restrição AvrII, PacI e PmeI sobre a extremidade 5' e um sítio de restrição PacI sobre a extremidade 3' para facilitar movimento em um vetor de expressão binário.

Um cassete de expressão utilizando um promotor Ant de milho (veja Exemplo 5) também é projetado de uma maneira similar àquela descrita para arroz e sorgo. Regiões promotoras de outros genes de antiquitina também podem ser usadas à medida que elas são identificadas a partir de projetos de seqüenciamento de genoma e outras tecnologias.

Exemplo 7: Identificação e clonagem de genes alternativos de aminotransferase de alanina (AlaAT) para uso em estruturas com EUN

Aminotransferases são enzimas as quais catalisam a transferência reversível de grupos amino de aminoácidos em oxo ácidos. Elas podem ser divididas em quatro subgrupos, baseado em relações estruturais mútuas (Mehta e colaboradores, Eur. J. Biochem. 214(2): 549-561, 1993). Enzimas AlaAT catalisam a interconversão reversível de alanina e 2-oxoglutarato em piruvato e glutamato e pertencem ao subgrupo 1. Além de aminotransferase de alanina de cevada, outras aminotransferases de alanina são úteis para conferir EUN em monocotiledôneas.

Para identificar genes homólogos de AlaAT, a seqüência de proteína de AlaAT de cevada (número de acesso ao NCBI CAA81231) foi usada como referência para busca no banco de dados de seqüência de proteína do NCBI usando o algoritmo BLAST. Genes com um alto grau de homologia de seqüência à AlaAT de cevada foram encontradas em todas as principais classes de eucariotas. Seqüências relacionadas também foram encontradas em bactérias. Uma busca pelo tBlastn do banco de dados EST do NCBI revelou que homólogos de AlaAT são disseminados em plantas, mas em virtude do fato de a maioria dessas seqüências não serem de comprimento total, elas não foram adicionalmente analisadas. À medida que seqüências genômicas adicionais para monocotiledôneas se tornam disponíveis, homólogos adicionais podem ser identificados usando esses métodos.

Seqüências de comprimento total identificadas na busca pelo BLAST foram ainda analisadas usando o programa AlignX (parte do pacote de programa Vector NTI, Invitrogen). Uma série de seqüências representativas e a tabela de homologia correspondente usando seqüências de uma variedade de organismos é mostrada na Figura 2 e Tabela 1. Note que algumas das seqüências usadas para esses alinhamentos foram truncadas, de modo que elas contêm menos do que a seqüência completa da AlaAT citada. O alinhamento foi realizado usando a metionina (M) da seqüência de AlaAT de arroz como o primeiro resíduo de referência.

Isolamento de mRNA e síntese de cDNA

Tecido para isolamento de RNA foi preparado a partir de milho (A188) e arroz (Nipponbare) da seguinte maneira. Sementes foram germinadas em H2O sobre papel de germinação a 24°C em um saco vedado (milho, arroz). Após 7 dias, tecido de raiz foi coletado e armazenado em RNAlater® (Ambion) para isolamento de RNA. Mudas de pimenta (Capsicum annuum, Pepper Hot Ásia, Santaka, Botanical Interests Broomfield, CO) foram esterilizadas e germinadas em MS com meia resistência e mudas inteiras foram usadas. Folhas de plantas Arabidopsis crescidas no solo (Columbia 0) foram usadas.

RNA foi preparado a partir de tecidos de planta usando o kit RNAqueous™-4 PCR (Ambion). cDNA foi sintetizado a partir de RNA purificado usando o kit Superscript III platinum® 2-step q-RT-PCR (Invitrogen) conforme as instruções do fabricante.

Amplificação por PCR de AlaAT

Genes de AlaAT podem ser amplificados através de PCR a partir de cDNA de muitas fontes, incluindo milho (Zea mays) , arroz (Oryza sativa) , Arabidopsis thaliana ou pimenta (Capsicum annuum) . 0 modelo para AlaAT de cevada (Hordeum vulgare L. cv Himalaya) é o plasmídeo pAGOOl (obtido de Allen Good, University of Alberta) o qual contém as seqüências de codificação de AlaAT de cevada conforme descrito em Muench e Good, 1994, acesso ao GenBank CAA81231. Primers de PCR contém um sítio de restrição AsiSI sobre a extremidade 5' e um sítio de restrição AatII sobre a extremidade 3' para facilitar a clonagem em cassetes de expressão. Os pares de primer para genes individuais são listados abaixo:

Dianteiro dé Cevada:5'- ATTAAAGCGATCGCACCATGGCTGCCACCGTCGCCGTGGA-3' (SEQ ID NO: 19) Reverso de cevada: 5' -TAGTGAGACGTCTTAGTCACGATACTCTGACA- 3' (SEQ ID NO: 20)

Dianteiro de milho:5'- ATTAAAGCGATCGCACCATGGCCGCCAGCGTCACCGTGGA-3 ' (SEQ ID NO: 21) Reverso de milho:

5 -TAGTGAGACGTCTTAGTCGCGGTACTCGGCCAA-3' (SEQ ID NO : 22) Dianteiro de arroz:

5'-ATTAAAGCGATCGCACCATGGCTGCTCCCAGCGTCGCCGT-3' (SEQ ID NO: 23)Reverso de arroz:

5'-TAGTGAGACGTCTCAGTCGCGGTACGCTGCCATGAA-3' (SEQ ID NO: 24) Dianteiro de Arabidopsis Atlgl7290: 5' -ATTAAAGCGATCGCACCATGCGGAGATTCGTGATTGGCCAA-3 ' (SEQ ID NO: 25)

Reverso de Arabidopsis Atlgl7290: 5 1 -TAGTGAGACGTCTTAGTCGCGGAACTCGTCCATGAA-3' (SEQ ID NO: 26)

Dianteiro de pimenta:

5' -ATTAAAGCGATCGCACCATGGATTCCATCACTATrGAT-3 1 (SEQ ID NO: 27)

Reverso de pimenta: 5' -TAGTGAGACGTCTTAGCCGCAGAATTCATCCAT-3 ' (SEQ ID NO : 28)

Genes de AlaAT podem ser amplificados usando o kit de PCR BD Advantage™ 2 seguindo as instruções do fabricante (Clontech, Mountain View, CA) . Os produtos de PCR resultantes podem ser purificados usando o kit QIAquick™ Purification (Qiagen®, Hilden, Alemanha) e digeridos com as enzimas de restrição AsiSI e AatII. Os produtos podem ser ligados aos cassetes de expressão de OsAntl, Ant de milho ou Ant de sorgo descritos acima que tenham sido digeridos com as enzimas de restrição AsiSI e AatII.

O gene de AlaAT em cada uma das estruturas de expressão tem a seqüência verificada através de PCR de alta fidelidade e integridade do códon inicial ATG.

Exemplo 8: Construção de vetor binário e transformação de planta Os cassetes de expressão do promotor Ant/gene de AlaAT/nos 3' são clonados em um vetor binário para transformação de planta através de digestão com PmeI e PacI e ligação com pARCHO digerido com as mesmas enzimas. pARCl10 é um vetor binário de Agrobacterium originalmente baseado no pZP100 (Hajdukiewicz e colaboradores, Plant Mol. Biol. 25, 989-994, 1994). pARCHO utiliza um marcador selecionável Basta acionado por um promotor CaMV 3 5S e um terminador nos. O marcador selecionável está localizado próximo da borda esquerda e os sítios de restrição únicos XbaI, AvrIl, Pacl e PstI foram manipulados próximo do RB para clonagem de gene. O marcador selecionável bacteriano cloranfenicol na parte principal do pZPlOO também foi repetido com o gene de resistência à canamicina (nptIII) a partir do vetor pCAMBIA1304 (encontrado na internet no site cambia.org.au).

Os vetores binários promotor/AlaAT/gene nos 3' podem ser introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens para transformação mediada por Agrobacterium de plantas monocotiledôneas de safra ou DNA de vetor é usado para métodos de transformação de planta com bombardeamento com pistola de partículas. Exemplo 9: Uso de estruturas de antiquitina/AlaAT alternativas em transformação de arroz usando seleção sobre bialaphos

Transformação de arroz mediada por Agrobacter±um com a estrutura OsAnt1/AlaAT ou qualquer estrutura Ant/AlaAT alternativa é obtida usando um método de transformação baseado no método descrito na Patente U.S. No. 7.060.876 e Patente Européia No. 672752B1. Uma descrição detalhada segue.

Plasmídeos foram transferidos para a cepa EHA105" de Agrobacterium (Hood et al., Transgenic Res. 2: 208-218, 1993) através de eletroporação (Sambrook et al. em Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Labóratory Press, 1989). Células de Agrobacterium foram colocadas sobre meio AB sólido (Chilton et al.. 1974) contendo 50 mg/L de canamicina e incubadas a 28°C durante 3 dias. As bactérias foram, então, coletadas com uma espátula plana e resuspensas em meio de cultura líquido (R2-CL, Tabela 4) através de ligeiro turbilhonamento antes de transformação dos tecidos de arroz.

Sementes maduras de arroz (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) foram usadas no experimento de transformação. As sementes foram descascadas e a superfície esterilizada através de imersão (1 min) em etanol a 70% (v/v), seguido por embebimento em alvejante a 50% mais Tween-20 a 0,1% durante 10 min e, então, enxágüe cinco vezes em água destilada estéril. Após esterilização, as sementes foram cultivadas sobre meio de indução de caule (N6C, Tabela 4) e incubadas durante três semanas no escuro a 26°C.

Tabela 4. Meio usado para indução de caule, inoculação, co- cultura, fase de repouso, seleção, regeneração e enraizamento

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Após três semanas, unidades nodulares embriogênicas de 3-5 mm de comprimento liberado do caule derivado de escutelo na interface explante/meio foram imersas em 25 mL de meio de co-cultura líquida (R2-CL, Tabela 4) contendo células de Agrobacterixm na densidade de 3-5 χ 10^9 células/mL (OD60O = 0,3) em um placa de petri de 100 mm de diâmetro durante 10-15 minutos. As unidades embriogênicas foram, então, secas sobre papel filtro esterilizado, transferidas para um placa de petri contendo meio de co- cultura sólido (R2-C2, Tabela 4) e incubadas durante três dias a 25°C no escuro. Caule embriogênico co-cultivado foi, então, transferido para meio líquido N6 contendo 400 mg/L de Timentina para desinfecção e colocado durante 4 horas sobre um agitador orbital (100 rpm) a 26°C no escuro. Após secagem em papel filtro estéril, os caules foram colocados sobre meio de seleção N6 (N6S, Tabela 4) e mantidos a 26°C no escuro.

Após 4 semanas de cultura, unidades embriogênicas não contaminadas tinham se desenvolvido em grandes estruturas globulares amareladas que foram transferidas para meio N6S fresco e cultivadas durante mais 4-5 semanas a 26 0C no escuro.

As estruturas globulares tinham proliferado muitos caules de formato arredondado, compactos e amarelados.

Esses caules supostamente transgênicos, resistentes a bialaphos, foram gentilmente selecionados, transferidos e cultivados sobre meio de regeneração (RH, Tabela 4), incubados durante 1 semana no escuro, então, mantidos durante 4-5 semanas sob um fotoperíodo de 14/10 horas de dia/noite com luz fornecida em uma intensidade de 70 μmoles/m por seg. Brotos verdes que se regeneraram de um caule resistente foram dissecados e sub-cultivados em vasos de cultura contendo meio de enraizamento (R, Tabela 4) durante 2 semanas para promover raízes e brotos vigorosos antes de serem transferidos para vasos de 2 polegadas cheios de Sunshine Mix #3 estéril. As mudas transgênicas foram aclimatadas mantendo as mesmas em salas de crescimento ajustadas para 26°C, fotoperíodo de 14/10 horas dia/noite e alta umidade. Fertilizante foi aplicado três vezes por semana, começando düas semanas após plantio nos vasos. A mistura fertilizante é Simmons Solution (San Joaquin Sulphur Co., Lodi, CA) com adição de nitrato de cálcio. Dezesseis g de simmons e 60 g de nitrato de cálcio são misturados para 4 0 galões de fertilizante. Plantas monocotiledôneas com eficiência de nitrogênio incluindo, mas não limitado a, milho, sorgo, cevada, trigo, centeio e grama, podem ser desenvolvidas usando os métodos esboçados nos exemplos acima.

A invenção foi descrita com relação a uma ou mais modalidades. Contudo, será evidente para aqueles habilitados na técnica que uma série de variações e modificações podem ser feitas sem se desviar do escopo da invenção, conforme definido nas reivindicações. As afirmações a seguir da invenção se destinam a caracterizar possíveis elementos da invenção de acordo com a descrição precedente fornecida na especificação. Em virtude do fato de o presente pedido ser um pedido provisório, essas afirmações podem ser alteradas quando de preparo e depósito do pedido completo. Tais alterações não se destinam a afetar o escopo de equivalentes de acordo com as reivindicações que surgem do pedido completo, se tais alterações ocorrerem.

Todas as citações listadas aqui são aqui incorporadas por referência.

Claims (14)

1. Método de produçãò de uma planta monocotiledônea transgênica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (1) seleção de Um ácido nuclèico que codifica uma alanina aminotransferase, (2) seleção de um promotor que é operável em uma planta monocotiledônea, (3) acoplamento do ácido nuclèico selecionado ao promotor selecionado para formar uma estrutura genética (4) trárisformação de uma célula de planta monocotiledônea com a estrutura genética para formar uma célula transformada e (5) crescimento de uma planta monocotiledônea transgênica a partir de uma célula transformada para produzir uma planta monocotiledônea transgênica, em qüe á expressão do referido ácido nuclèico na referida planta monocotiledônea transgênica cáusa um aumento de pelo menos 5% a 7,5%, 7,5 a 10%, 10 a 15% oü 15 a 20% ou mais na biomassa da planta e/ou rendimento de semente quando comparado com. a biomassa da planta óu rendimento de semente de uma planta monocotiledônea comparável que não expressa à referida estrutura quando as plantas que expressam a estrutura e as plantas que não expressam a estrutura, são cultivadas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida alanina aminotransferase é selecionada do grupo consistindo de alanina aminotransferase de cevada, arroz, cana-de-açucár, milho, sorgo, centeio, trigo e grama.

3. Método de produção de uma planta transgênica de arroz, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de (1) seleção de um ácido nucleico que codifica uma alanina aminotransíerasè, (2) seleção de um prpmotor que é operável em uma planta de arroz, (3) coplamento do ácido nucleico selecionado ao promotor selecionado, para, formar uma estrutura genética, (4) transformação de uma célula de planta de arroz com a estrutura genética para formar uma célula de arroz transformada e (5) crescimento, de uma planta de arroz transgênica a partir da célula de arroz transformada para produzir uma planta de arroz transgênica, em que a expressão do referido ácido nucleico na referida planta dè arroz transgênica causa um aumento de pelo menos - 5% a 7,5%, 7,5 a 10%, 10 a 15% ou 15 a 20% ou mais na biõmassa da planta, e/ou rendimento de semente comparado com a biomàssa da planta ou rendimento de semente de uma planta de arroz comparável que não expressa a referida estrutura quando as plantas de arroz que expressam a estruturá e as que não expressam a estrutura são cultivadas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado, pelo fato.· de que-..a referida alanina· aminotransferase é selecionada do: grupo' consistindo de alanina aminotransferases de cevada, arroz, cana-de-açúcar, milho, sorgo," centeio, trigo e grama.

5. Método de produção de uma planta de milho transgênica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(1) seleção de um ácido nucleico que codifica uma alanina aminotransferase, (2) seleção de um promotor que é operável1 em uma planta de milho, (3)acoplamento do ácido nucleicp selecionado- ao promotor selecionado para formar uma estrutura genética., (4) transformação de uma célula de planta de milho com ã estrutura genética para formar uma célula"de milho.transformada e (5) crescimento de uma planta de 'milho, transgênica a partir da célula de milho transformada para produzir uma planta de milhô transgênica, em que a expressão do referido ácido nucleico na referida planta de milhó -transgênica causa um aumento de pelo menos 5% a 1,5%,r 7,5 a 10%,· 10. a 15%. ou 15' a 20% ou mais na. biomassa da planta e/ou ' rendimento de. semente- em comparação com a ,biomassa da. planta ou rendimento da semente de uma planta de milho comparável não expressando o referido constructo quando as plantas de milho expressando o constructo β não. expressando o constructo crescem sob condições de nitrogênio sub-ótimas.

6. Método, de acordo' com a reivindicação 5 carácterizado pelo fato - deque a referida alanina aminotransfèrase é selecionada do grupo consistindo de alanina aminotransferases de, cevada, arroz, cana-de-açúcar milho,sorgo, centeio, trigo e grama.

7. Método de produção cfe uma plarita . de trigo transgênica, caracterizado pelo fato de compreender- as etapas de: (1) seleção de· um ácido nucleico que codifica uma alanina aminotran'sferase, (2) seleção de um promotor que é operávêl em. uma planta de trigo, (3) acoplamento-'do- ácido nucleico selecionado ao promotor selecionado para formar uma estrutura genética,(-4) transformação de uma célula de planta de trigo com a estrutura genética para formar uma Célula de trigo transformada e (5). crescimento de uma planta de trigo ,transgênica a partir de uma célula de trigo transformada para produzir uma planta de trigo transgênica, em que a expressão do referido .ácido nucleico na referida planta' de trigo transgêríica causa um aumento de pelo menos 5% a 7, 5%, 7,5 a 10%, 10 a 15% ou 15 a 20% ou mais na biomassa dá planta e/ou rendimento de semente, comparado com a biomassa da planta ou rendimento de semente de Uma planta' de trigo comparável que não /expressa a referida estrutura quando as plantas de trigo que expressam a estrutura e as plantas que não expressam a estrutura são cultivadas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

8. Método, de acordo com a reivindiçação 7,. caracterizado pelo fato de que a referida alanina aminotransferase é selecionada do grupo consistindo dê alanina aminotransferase de cevada, arroz, cana-de-açúcar, milho, sorgo, centeio, trigo e grama.

9. Método de prodpçâo de umá planta de sorgo transgênica, caracterizado pêlo fato de compreender as etapas de: (1) seleção de um ácido nucleico que codifica uma alanina aminotransferase, (2) seleção de um promotor que é operável em uma planta de sorgo, (3) acoplamento do ácido nucleico selecionado ao promotor selecionado para formar uma estrutura genética, (4) transformação de uma célula de planta de sorgo com a estrutura genética para formar uma célula de sorgo transformada e (5) crescimento de uma planta dé sorgo transgênica a partir de uma célula de sorgo transformada para produzir uma planta de sorgo transgênica, ém que a expressão do referido tácido nucleico na referida planta de sorgo transgênica causa um aumento de pelo menos 5% a 7,5%, 7,5 a 10%, 10 a 15% ou 15 a 20% ou mais na biomassa da planta e/ou rendimento de semente, em comparação com a biomassa da planta ou rendimento da semente de uma planta de sorgo comparável que não expressa a referida estrutura quando as plantas de sorgo que expressam a estrutura e as plantas que não expressam a estrutura são cultivadas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

10. Método, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida alanina aminotransferase é selecionada do grupo consistindo de alanina aminotransferase de cevada, arroz, cana-de-açúcar, milho, sorgo, centeio, trigo · e grama.

11. Planta monocotiledônea transgênica, expressando uma alanina aminotransferase recombinante, caracterizada pelo fato de que a referida planta monocotiledônea transgênica "exibe um aumento de pelo menos 5% na biomassa ou rendimento de semente da planta comparado com uma planta monocotiledônea comparável que não possui aminotransferase. de alanina recombinante quando a referida planta transgênica e a referida planta comparável são cultivadas sob condições sub-ótimas de nitrogênio.

12. Semente de planta monocotiledônea transgênica, caracterizada pelo fato de ser como definida pela reivindicação 11.

13. Planta monocotiledônea transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida planta monocotiledônea transgênica é selecionada do grupo consistindo de milho, arroz, trigo, cevada e centeio.

14. Planta monocotiledônea transgênica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida álanina aminotransferase é selecionada, do grupo consistindo de alanina aminotransferases de cevada, arroz, cana-de-açúcár, milho, sorgo, centeio,, trigo e grama.