CN109112138B

CN109112138B - 一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1

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Publication number: CN109112138B
Application number: CN201711252951.8A
Authority: CN
Inventors: 赵云德; 张涛; 王荣臣
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN109112138A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到同时参与水稻生长素和乙烯合成途径基因OsVAS1，发现利用CRISPR技术定点突变OsVAS1基因，可以改良水稻株型并增加产量，生物功能验证证实了该基因的功能及应用途径。本发明的调控水稻理想株型的基因OsVAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因的第一转录本编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO:3所示；该基因的第二转录本编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO:5所示。

Description

一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到同时参与水稻生长素和乙烯合成途径基因OsVAS1，发现用CRISPR技术定点突变 OsVAS1基因，可以改良水稻株型并增加产量，并证实了该基因的功能及应用途径。

背景技术

水稻理想株型是根据生产实际的需要在上世纪80年代由国际水稻所提出，相关领域成果就不断产出，受到广泛关注。比如OsIPA1,OsNPT1等(Jiao et al.,2010；Miura etal.,2010；Wang et al.,2017)；理想株型主要包括茎的粗壮度，分蘖数，穗型等农艺性状。理想株型有助于水稻产量和水稻抗倒伏等性状的提升，对水稻粮食安全具有重要意义。

生长素是最早研究开发的激素之一，对植物的生长发育具有重要作用，近年来对生长素的研究越来越深入。生长素合成途径在拟南芥中研究较深，现已知生长素主要由色氨酸依赖途径中的IPA合成途径生成，即由TAA酶催化色氨酸生成吲哚丙酮酸，再由YUC酶催化吲哚丙酮酸生成生长素(Zhao,2001；Cheng et al., 2006；Cheng et al.,2007；Mashiguchi et al.,2011；Won et al.,2011；Zhao,2012)。在2013年，Zheng等在拟南芥中通过遗传筛选得到了一个能互补sav的突变体，命名为vas1，vas1同时参与生长素与乙烯的合称途径，直接证明了两种激素之间的紧密联系(Zheng et al.,2013)。但是生长素研究在水稻中并不深入，尤其关于生长素与理想株型之间的关系的报道则更为少见。

本发明通过在水稻中分离筛选候选基因，分离并克隆了水稻中的OsVAS1基因，并利用CRISPR技术对该基因进行定点突变，后续再用超量表达等手段验证了该基因的功能，该基因突变之后，株型变化显著，产量提升明显，并且还未见报道，可以作为潜在的育种工具。

发明内容

本发明的目的涉及一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1。本发明的OsVAS1基因利用CRISPR技术定点突变以后能显著提高产量，减少分蘖数，茎杆强壮度等农艺性状。超量表达该基因则会显著增加籽粒大小，分蘖数增加，叶夹角增大等；其中，所述的含有OsVAS1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为5835bp，它对应的第一个转录本氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其对应的氨基酸序列为394 个。它的第二个转录本氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示,其对应的氨基酸序列为208个。

携带有本发明OsVAS1基因的超表达载体可通过使用Ti质粒使用农杆菌介导进行DNA转化，也可以通过微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

可使用包括本发明的OsVAS1基因的表达载体转化宿主,其中宿主可以是包括水稻在内的多种植物，培育理想株型植物新材料。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有OsVAS11基因开放阅读框(Openreading frame)的核苷酸序列，序列长度为5835bp。

序列表SEQ ID NO:2是OsVAS1基因的第一个转录本的核苷酸序列(长度为1185bp)，也是该转录本的编码的氨基酸序列(1-1185bp)，编码394个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:3是OsVAS1基因的第一个转录本编码的蛋白质的序列，编码394个蛋白质。

序列表SEQ ID NO:4是OsVAS1基因的第二个转录本的核苷酸序列(长度为627bp)，也是该转录本的编码的氨基酸序列(1-627bp)，编码208个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:5是OsVAS1基因的第二个转录本编码的蛋白质的序列，编码208个蛋白质。

图1.CRISPR定点突变pCXUN-CAS9载体的图谱。附图标记说明：在Rice CAS9元件后的Nos terminator 之后的多克隆酶切位点引入sgRNA可以达到基因编辑效应。本发明在KpnI处引入。

图2.OsVAS1基因结构图以及定点突变靶位点位置。附图标记说明：图中上下两个图为该基因的两个不同的转录本。其中图2中的A图对应序列表序列表SEQ ID NO:2的转录本。图2中的B图对应序列表SEQ ID NO:3的转录本.红色箭头表示设计的CRISPR靶位点所在的位置。黑色实心部分为编码区外显子，白色空心部分为非编码区，实线部分为非编码内含子区。

图3.VCR-1和VCR-2突变体的植株表型。附图标记说明：图3中的A图表示VCR-1、VCR-2突变体与野生型ZH11的整体植株表型对照；图3中的B图表示VCR突变体与野生型ZH11的主茎的粗细对比；图3中的C图和D图分别表示株高和分蘖数的统计结果，n＝15；E,F表示VCR突变体与野生型ZH11的的一次枝梗数对比和统计结果，n＝15。

图4.OsVAS1超量表达T0代的基因相对表达量。附图标记说明：纵坐标为相对倍数。

图5.OsVAS1超量表达阳性植株的表型。图5中的A有表示VOE超表达家系与野生型ZH11的整体植株表型对照；图5中的B图表示VOE超表达与野生型水稻中花11(ZH11)的主茎的粗细对比；图5中的C图和D 图)分别表示株高和分蘖数的统计结果，n＝15。

图6.用于OsVAS1基因超量表达的载体1301U的图谱。

具体实施方式

实施例1

1、OsVAS1候选基因的确定以及该基因定点突变载体的构建和转化

申请人为了研究水稻中生长素的合成机制，将拟南芥中相关同源基因AtVAS1的氨基酸序列在水稻数据库Rice Genome Annotation Project中做了同源性比对分析，发现LOC_Os01g08270的氨基酸序列与其同源性最高，达到66.5％。确定该基因为水稻中的OsVAS1基因。

随后我们利用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)设计该基因CRISPR定点突变的靶位点，将该基因序列或者ID输入网站提示的位置即可得到候选靶位点序列，最终我们选择靶位点序列如下：AGATGCAGGAATTGCTTCGAGGG，其中下划线部分为PAM(Protospacer Adjacent Motif) 序列，该靶位点位于SEQ ID NO:1序列的615bp-636bp，可以同时对该基因的两个转录本进行定点突变，见图2。CRISPR载体的构建使用报道的pCXUN-CAS9载体(载体结构见图1)，该载体已申请专利，申请号为2016106398543。该基因定点突变载体的构建以及转化水稻具体实施步骤如下：

1)pCXUN-CAS9载体(载体结构见图1)的构建

扩增水稻CAS9基因，以克隆到pH-Ubi-cas9-7的质粒(miao et al.,2013)为模板，以Cas9-F(5’- ATGGCCCCAAAGAAGAAGCG-3’和Cas9-R(5’-TCAATCGCCGCCGAGTTGTG-3’)为引物进行PCR扩增 PCR扩增，获得了约4.1kb的CAS9基因片段，将所获得的PCR产物克隆到pCXUN载体上(chen et al.,2009)，将阳性克隆对应样品测序(北京擎科生物科技有限公司测序)，以验证目的PCR产物的正确性。

PCR过程如下：

Cas9目的片段经凝胶电泳并挖胶回收(使用QIAGEN公司的回收柱)后用于载体pCXUN-CAS9的构建。

然后将质粒pCXUN用XcmI酶酶切，形成T载体，反应体系如下：

37℃反应3个小时，然后挖胶、过柱、回收。

再将步骤1)中的Cas9片段经T4连接酶16℃反应过夜连入XcmI酶酶切过的pCXUN载体形成中间载体pCXUN-Cas9.

2)以携带U3启动子的质粒为模板，设计U3启动子前后接头引物(用KpnI限制性内切酶消化载体，大写字母部分为载体末端序列，用于Gibson Assembly一步法(Gibson etal.,2009)连接)，引物序列如下：

OsU3-F:CCCCTTTCGCCAGGGGTACCgtaattcatccaggtctccaag，

OsU3-R:TACGAATTCGAGCTCGGTACCgctgtgccgtacgacggtacg；

3)将设计的特异性靶位点序列通过重叠PCR方法引入U3启动子中，据此设计的OsVAS1靶序列sgRNA 引物，序列如下：

U3OsVAS1CR-F:AGATGCAGGAATTGCTTCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA

其中下划线部分为设计的OsVAS1的定点突变靶位点序列，斜体序列部分为靶位点互补配对序列。

重叠PCR程序如下：

PCR 1反应，反应体系如下：

同时我们进行PCR 2反应，如下：

4)以PCR 1和PCR 2产物为模板，进行PCR 3反应，如下：

挖胶并利用QIAGEN试剂盒回收PCR 3产物，并用Gibson assembly一步法(Gibsonet al.,2009)将纯化过的PCR 3产物和KpnI切过的载体pCXUN-CAS9连接，50℃反应一小时，取1μl电转(1800V)，并涂布在含卡那霉素(50μg/ml)抗性的LB培养基上。挑取单克隆菌落，抽提质粒并进行阳性检测，将质粒DNA送测序公司测序核实。

将测序后证明序列正确的阳性质粒pCXUN-Cas9-sgRNA(OsVAS1-CR)电转化到农杆菌(EHA105) 中，并侵染水稻愈伤组织。转化品种为水稻中花11(ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所),具体转化步骤如下：

1)将水稻品种中花11的成熟胚去壳，用70％乙醇泡1min，0.15％升汞消毒20min，无菌水洗3～4次；将所得的外植体接种到诱导培养基上，于26℃暗培养诱导愈伤组织；

2)诱导培养35d后，取活力强、颗粒状的愈伤组织转入继代培养基进行继代培养；

3)取继代培养20d的愈伤组织的颗粒，接入预培养培养基上，于26℃下暗培养4d；

4)在预培养的第三天，用LA(LB中加入1.5％琼脂)划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2d；之后，将农杆菌全部刮入悬浮培养基；于28℃，200r/m振荡培养0.5-1h；在分光光度计600nm波长光测定菌液浓度，调至OD值＝1.0；

5)将预培养后的愈伤组织接入100ml锥形瓶(大约到40ml处)，加入调制好的农杆菌菌液，浸泡30min，期间摇动数次。配制悬浮培养基:(500μl乙酰丁香酮AS(Acetosringone)+5ml50％葡萄糖；

6)倒去菌液，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干表面菌液(一定要吸干菌液，使愈伤组织的表面发白)，但不能直接用电吹风吹干)，接入共培养培养基(250μl乙酰丁香酮AS+5ml50％葡萄糖)，暗培养3d，再转入250ml共培养培养基上进行共培养；

7)将共培养后的愈伤组织用无菌水先快速摇动清洗两次；然后加入无菌水浸泡10min，使愈伤组织内部的菌体游离出来；倒去洗液，再加入含400mg/L的羧苄青霉素(Cn)无菌水浸泡15min；倒干洗液，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基；26℃暗培养。每3周继代一次，共继代两次。每转化一个质粒，需灭菌单蒸水1～2瓶，其中第一次筛选时，在300ml筛选培养基中加入500ul羧苄青霉素(Cn)和300ul 潮霉素(Hn)；第二次继代筛选时，在筛选培养基中加入400ul羧苄青霉素(简称Cn)和300ul潮霉素(简称Hn)。

8)将筛选培养基培养的抗性愈伤组织接入预分化培养基，26℃暗培养一周。

9)将预分化培养一周的抗性愈伤组织转入分化培养基(50ml/瓶；改用三角瓶或平底试管做培养瓶)； 25℃，2000Lux光照培养，通过再生获得转基因植株。

10)待小植株3～5cm；转入生根培养基上促进生根。

11)将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3～5d；然后移到自然条件下生长，直至成熟。

以上各种培养基的具体配方及其配制方法见说明书的末尾的附录。

2、OsVAS1定点突变体的鉴定

具体步骤如下：

1)取成熟的水稻叶片，并经CTAB法提取DNA样品；

设计检测转基因植物的阳性引物的序列如下：

CAS9CHECK-F:GCATGAAGAGGATCGAGGAG，

CAS9CHECK-R:GATCTCTTGCTCGGACTTGG；

用该引物进行PCR扩增,条带大小在750bp的即为阳性。随后挑取鉴定为阳性的植株进行测序，设计测序引物的序列如下所述：

OsVAS1CR-SEQF:TGACCCTAACATCGTATCCAAC，

OsVAS1CR-SEQR:TTGACCCAAACAGTAAAGGAAC；

挑取测序为纯合的两个家系继续在田间种植，命名为VCR-1,VCR-2(见图2)，其突变形式分别为：

参考序列:TGTGCTCTTTTTTCAGATGCAGGAATTGCTTCGAGGGAACAAGGATGTGA

野生型:TTTTCAGATGCAGGAATTGCTTCGAGGGAACAAGGAT

VCR–1:TTTTCAGATGCAGGAATTGC--CGAGGGAACAAGGAT(2bp缺失)

野生型:CTTTTTTCAGATGCAGGAATTGCTTCGAGGGAACAAGGATGTGATGTCGCT。

野生型:CTTTTTTCAGATGCAGGAATTGCTTCGAGGGAACAAGGATGTGATGTCGCT

VCR–2:CTTTTTTCAGATGCAGGAAT------GTGATGTCGCTTGCG(20bp缺失)

说明：上述引物序列的下划线部分为本发明设计的CRISPR靶位点序列。

2017年在湖北武汉的田间水稻自然生长发育整个阶段，申请人对突变体植株表型进行了考察，发现相比于野生型，突变体植株表现为理想株型所需要的农艺性状，具体表现为，分蘖数变少(见图3中的A图, D图)；株高略有增加(见图3中A图,C图)；主茎变粗(见图3中的B图)；一次枝梗数增加(见图3 中的E图,F图)。本发明的突变体具体表型图见图3所示。说明本发明克隆的基因功能缺失之后，符合理想株型的型态建成，有助于为后续育种改良提供有益的遗传资源。

3、OsVAS1基因的功能鉴定

基于该基因定点突变以后的表型，接下来通过构建超量表达载体来进一步研究该基因功能。具体实施步骤如下：

根据使用的超量表达载体1301U(载体图谱见图6)，首先设计超表达载体OsVAS1的引物：

其中上述引物的下划线部分为KpnI消化1301U产生的载体上的粘性末端重复序列，斜体部分为该基因转录区间上的序列。本发明取水稻品种中花11的水稻叶片立即存放于液氮中，按常规方法抽提水稻叶片的总RNA，进行反转录。以反转录产物cDNA为模板进行扩增，得到包含最长阅读框的OsVAS1全长序列。然后利用QIAGEN试剂盒纯化回收PCR产物和KpnI消化酶切过的1301U载体，并用Gibson assembly 一步法(Gibson et al.,2009)将这两者连接，电转然后挑单克隆，最后得到阳性质粒并转化水稻，后续的转化详细制备步骤参见本实施例1。

随后将得到的T0代植株，按常规方法提取T0代植株总DNA并用GUS引物进行阳性检测，GUS引物序列如下：

GUS-F:CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC，

GUS-R:GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACC；

抽提总RNA并反转录来检测该基因表达量，设计RT引物如下：

VAS1-RTF:GAATTGCTCATGGAAGCGATGTCTCC

VAS1-RTR:CTGTACCATTCCCTCAGTCACAAGTTCTT

T0代植株相对表达量见图4所示；最终选取两个VOE-2，VOE-3，VOE-4三个阳性家系进行后续的实验。通过对这两个家系在海南和武汉的连续表型考察，这两个家系植株相比于野生型主要表现为分蘖数增加(图5A,D)，茎杆变细(图5B)，植株变矮(图5A,C)。证实了该基因参与水稻各个时期的生长发育过程。

附录：本发明涉及的各种组培培养基配方

诱导培养基

继代培养基

预培养基

共培养培养基

悬浮培养基

筛选培养基

分化培养基

生根培养基

主要参考文献

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控水稻理想株型的基因OsVAS1

<141> 2017-12-01

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5835

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza Sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(5835)

<400> 1

gtctcatgct tatcctccaa cttcgcggcg caccctccgc aaacgtaagc caaaaagatc 60

aggaaaagag acagaaaaat cggaataaaa gagtgataga tagatagata gatactccgt 120

agatactaga tcagcagcga tttttttttc agtttttgtt ttttcatttc ttcctctgtc 180

ttgtttagat gttggggttg gtgagccctt ggggggaatc agttggtgac tgactcgaga 240

agttcagagg ttgttgtctc cgaattcttt aaccccaacc tctcctcttc tcttctcttc 300

tctcctcttc ttccttatac tgcttcttgg gctcgccgct gcgctgttct ttggtcttct 360

tggatctctg accctaacat cgtatccaac ttctccagtt cttgttcttg gaggggtgag 420

gaagaggagg aggaggaggt gagatgggta gcttcgggag gctggcgagg agggccgtgg 480

agacggaagc gccggtcatg gtcaaggtga tggagaagaa gctccctgcc tcgtcgaaat 540

cgcatctttc ccttctgatt tctttggtct tgattgatga gttctatctc tcttgtgcct 600

tgtgctcttt tttcagatgc aggaattgct tcgagggaac aaggatgtga tgtcgcttgc 660

gcaggtatcg gatcgcaatt tctttcggtt atctgtccaa tgattgtgtg tgtgtgtgtg 720

tgttttcatg agagtaccaa tgagtttgtg ttgttgttgg tacttggtca caggcatttt 780

gatgtttgca tttgattggg aagagtgttc gaaatggatt agtgaaatga tcatttgtat 840

tgttccttta ctgtttgggt caattgtctc agtaaactgt tcacgttgta aggtgaatca 900

ggagagttta gtacatctga taacatattg tgctttgtat aacacaacta tttatcaagc 960

atggaatttg gaaactaaaa tggttgtatt cctgcttagt tcctgaaaat ggcgtttaac 1020

tgcttatgct agccaaataa gatatccaaa tatatatatt agtggcagtg gtgtgtgtgc 1080

tggcctccta ttactgccaa cagaacatgt gatatttact ggaaattatt tgctttcttt 1140

taaactaatg taaatcttgg atgcagggag ttgtttattg gcagcctcct gaggcagcta 1200

tgaataagat taaagaaatt gtatgggaac catcaatcag taaatatggc tctgatgatg 1260

gtcttcctga actccgagaa gcacttctcg agaaggtaat ttttcaattg ggatttgtta 1320

gataatggtt tccatggccc atgttatcaa gccttcccag ttatcacaaa gcaattacca 1380

tgtgagacaa atgcacttgg ttgcctactg ctaagccttt atcatgtgag acaaaggaac 1440

ctgtgtgcct actactaagc ctttgtcatg tgagaaattg attctggaat tttttttacc 1500

tcgatactga gagagtgaga gtaaggccat tcccaaccca aaacattaga catagtttcc 1560

ataaactcca catcatcaag aaataagtac tagacactac tcttccaatg caaacactac 1620

tatttcatac ttaaatttaa tgctacttat ctcacataat gtcttggatg ttgtgtagaa 1680

accatgtctc atgcaagaca tagtttcctc ctctttcctc atttattcac ttgccacatc 1740

agttttcatc ctatgtgaca gcttatttaa tgctatggac actatcctag tcattgggtt 1800

gggaatagcc taatatcagg aatcacatgc tatccttaca aaattttatc aacgagaaag 1860

tttcagaaag tatctctcag cttctgtggg ggcttggggg ggagggaagc taagggcccc 1920

tttgaatcgt aggattgaga aaacatagta atagaaaaaa cgtaggattt tgataggaat 1980

gtaagtgtaa aatagaggat tacaaaacgc aggaaaaaca caggaatgac cgtttgattg 2040

aaccgcagga aaaacgcagg atttggatga gagagataga ctcaaagaaa agttactaag 2100

aggttgaagc tcttgcttaa tttcctccaa aatttctata ggattgttca ttccatagga 2160

attttaaagg attggatagg attcaatcct ttgattcaaa ggacttcata ggaaattttc 2220

ctataggatt gaaatcctcc aaaattccta tgtttttcct ccaaatcaaa ggggccctaa 2280

gctctgttga gagctataat agttcaatgc taccatgtaa cagtgcagta gcacagttct 2340

gagacattgc ccttggtact accgatgccc cctcatgtag agatgggtgt tatattcact 2400

gatttctctt actgcgataa tattttattg aaaaactaat aatatgaatg gtaattatta 2460

taaacatgtt cgttgccttc cctctatttt cttcctgaaa tttttagcat acattttgca 2520

gctgcgcaga gagaataagc taaccaagtc gtcaattatg gttacctctg gtgcaaatca 2580

ggtaatgcac atgctttcca gtttccacct gatttattac agctttgtca tcttattccg 2640

gttttcctct gtgtattttg ccttgtttag ctagactata ggatgccaat ttgtttttct 2700

tcttcagttc tatgagatgc tttcttactt ttctgtatga ctgcttcacc taaaccttgt 2760

ttaccaacta ggttagccaa ataaaagtca aataaagtga tgtcttctat caaattttgg 2820

caggcctttg taaatgtggt cctcaccctt tgtgatgctg gggatgcagt tgtcatgttt 2880

gcaccatatt acttcaattc ctacatgtca ttccagatga caggagttac tgacatatta 2940

gttggtgcaa gcaatcctga gactcttcat cctgatgtcg gtaagatagt tcttcccttt 3000

ttctttttgt tggagaaatt ggttagatgt ctattatcaa cagtcaatta taaactagtt 3060

gccacttttt ttccgcttct gagatcttcc actttgtaag ttgataagtt ctatcacttg 3120

atacattttc tctcagttca attgagagct atatggtttt tgatcattcg atttggttca 3180

cttaaggact gtaaaagaat agttcattct ggtagtacaa tttatatttg tttaataaaa 3240

tgcagattgg ttggagaagg ttctgcaaga aaacaaccct atccctaaac ttgttagtgt 3300

tgtaaatcct ggaaacccct ctggagcttt cattccgaag ccgatgctcg aagtaacctg 3360

tctctctcat tcacagttca cgcacacttg cattcgaggt gactttaatt atttcttaat 3420

attgcaccat tgttccagag aatttcagaa ctgtgcagaa atgctggtgc atggcttgta 3480

gttgacaata cctatgagta agttagtact caattactga ttattgctca actgcaacgt 3540

cattttggtg cttcttttct ttctgttgtt gataaagctc ctcagtccct tcagaaattg 3600

atattactta aagcaattgt aaagacgagg cactacgaaa gaatgaacta cacatggaca 3660

tgatcacctt aagtagtagt ttaaaaggac agttcaccat aagcagttga gcaactgtgc 3720

ttgacttctt gaagttgagt cctggatgac gccctctctg atagattaaa taaataggac 3780

ttcaagaatg tggtatctct ttcaaaaagt atctgcaaac cacccgccag taagggtttg 3840

tcaaatgtag ttatcttcac atgctcagct tattcaagta gggaaaatct tccatttctt 3900

ctcaacacta gaattggaca catggaacaa ctcgttttct tttgaaggtc ccatttcagt 3960

tcctcaattt cagtgatgcc caaaataaac cctccagtca cttacaggca gagtggaaga 4020

ctcactgaca agagcctaaa ttgaatcacg gattagactc ttccctcaag aaaagtctta 4080

ctttcagcag cctagcatcc gctgtgcggc attgggaaga atatatctgt tgttagttct 4140

gatcaaatca gaaatatttg atctcttgct aatctaccct tgctctatat ttcagatcat 4200

gtttaccttt tcttgtctgg ctctgtagtt gagtaatgga aattgatatt agtttttgcc 4260

atttccttac cctgatgttg atgttaaaag gatgctatgg gtccttttcg aatataagct 4320

tgatggactt cccaatgtta atacaccacc gaatttgaca tgtgtaaatc ttgtatatga 4380

taaaagtata atttggaaac tttcaattat catcacattg atttttagat aatctgtatt 4440

caaaatgttt gcacgaatac tgaaattcaa gaaaacattt tctcggaaga attcttttcc 4500

ataaaaggtg actgaccttt tactttctgt aaaataattc tacatatggg gctattttgg 4560

attctgtata actttgatgt tgaacttgct tgcaaaattg gtgggtggtc tccaggtact 4620

ttatgtatga tggaatggag cactattgct tagagggtaa tcacattgtc aacctcttct 4680

cattctcgaa ggcttacgga atgatgggct ggcgtgtagg atacgtaagt ttgcctctct 4740

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ttctttcatc ctctgcttag gcttgaaaat 4800

gctgatgtaa gagtcaatat tgagttcttt cagtttcatg aatttcccgc atccacttga 4860

atcttttacc agggcattcc cttaaattat caccatagca atgcagtata agtaacttag 4920

tggctgcaca atctgtgttg atcagtgagt cttacaagaa ctgatgagct gactgctgca 4980

gattgcccac ccaaacgaag ctgacggtct tcatgcacag ctgctcaaag tgcaagataa 5040

catacctatc tgtgcttcca tcatcgggca gcgcctggcg ctctacgcat tagaggctgg 5100

tccagaatgg atcagagaaa gggtgagaga tctagtgaaa aaccgtgaat tgctcatgga 5160

agcgatgtct ccgcttggca aggactctgt caagggtggt gagggtgcca tttacctctg 5220

ggcaaaacta cccgagaaat gctcagatga ttttgaagtt gtcagatggc ttgcaaacaa 5280

gcatggtgtg gctgtgatcc ccgggagcgc cagtggaggt cccggatata tccgggtttc 5340

tttcggaggg ttgaaagaat cggatacaag gcttgctgct gagaggttaa ggcgcggctt 5400

gcaagaactt gtgactgagg gaatggtaca gtgacagccc aatggatgca agaaatacat 5460

gacatacaaa tcacaaaagt gaaaattttc agttacataa taattctggg attagttcaa 5520

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ttcatgttta gtacttactg ttgcttgata acctctttcc ctacaatcag gacagcagct 5760

gtacacaagt aagatataat aagatataat agcaacaata agtgttcatg atgtgctttt 5820

atttcagctt tttta 5835

<210> 2

<211> 1185

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza Sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1185)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1185)

<400> 2

atg ggt agc ttc ggg agg ctg gcg agg agg gcc gtg gag acg gaa gcg 48

Met Gly Ser Phe Gly Arg Leu Ala Arg Arg Ala Val Glu Thr Glu Ala

1 5 10 15

ccg gtc atg gtc aag atg cag gaa ttg ctt cga ggg aac aag gat gtg 96

Pro Val Met Val Lys Met Gln Glu Leu Leu Arg Gly Asn Lys Asp Val

20 25 30

atg tcg ctt gcg cag gga gtt gtt tat tgg cag cct cct gag gca gct 144

Met Ser Leu Ala Gln Gly Val Val Tyr Trp Gln Pro Pro Glu Ala Ala

35 40 45

atg aat aag att aaa gaa att gta tgg gaa cca tca atc agt aaa tat 192

Met Asn Lys Ile Lys Glu Ile Val Trp Glu Pro Ser Ile Ser Lys Tyr

50 55 60

ggc tct gat gat ggt ctt cct gaa ctc cga gaa gca ctt ctc gag aag 240

Gly Ser Asp Asp Gly Leu Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Lys

65 70 75 80

ctg cgc aga gag aat aag cta acc aag tcg tca att atg gtt acc tct 288

Leu Arg Arg Glu Asn Lys Leu Thr Lys Ser Ser Ile Met Val Thr Ser

85 90 95

ggt gca aat cag gcc ttt gta aat gtg gtc ctc acc ctt tgt gat gct 336

Gly Ala Asn Gln Ala Phe Val Asn Val Val Leu Thr Leu Cys Asp Ala

100 105 110

ggg gat gca gtt gtc atg ttt gca cca tat tac ttc aat tcc tac atg 384

Gly Asp Ala Val Val Met Phe Ala Pro Tyr Tyr Phe Asn Ser Tyr Met

115 120 125

tca ttc cag atg aca gga gtt act gac ata tta gtt ggt gca agc aat 432

Ser Phe Gln Met Thr Gly Val Thr Asp Ile Leu Val Gly Ala Ser Asn

130 135 140

cct gag act ctt cat cct gat gtc gat tgg ttg gag aag gtt ctg caa 480

Pro Glu Thr Leu His Pro Asp Val Asp Trp Leu Glu Lys Val Leu Gln

145 150 155 160

gaa aac aac cct atc cct aaa ctt gtt agt gtt gta aat cct gga aac 528

Glu Asn Asn Pro Ile Pro Lys Leu Val Ser Val Val Asn Pro Gly Asn

165 170 175

ccc tct gga gct ttc att ccg aag ccg atg ctc gaa aga att tca gaa 576

Pro Ser Gly Ala Phe Ile Pro Lys Pro Met Leu Glu Arg Ile Ser Glu

180 185 190

ctg tgc aga aat gct ggt gca tgg ctt gta gtt gac aat acc tat gag 624

Leu Cys Arg Asn Ala Gly Ala Trp Leu Val Val Asp Asn Thr Tyr Glu

195 200 205

tac ttt atg tat gat gga atg gag cac tat tgc tta gag ggt aat cac 672

Tyr Phe Met Tyr Asp Gly Met Glu His Tyr Cys Leu Glu Gly Asn His

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att gtc aac ctc ttc tca ttc tcg aag gct tac gga atg atg ggc tgg 720

Ile Val Asn Leu Phe Ser Phe Ser Lys Ala Tyr Gly Met Met Gly Trp

225 230 235 240

cgt gta gga tac att gcc cac cca aac gaa gct gac ggt ctt cat gca 768

Arg Val Gly Tyr Ile Ala His Pro Asn Glu Ala Asp Gly Leu His Ala

245 250 255

cag ctg ctc aaa gtg caa gat aac ata cct atc tgt gct tcc atc atc 816

Gln Leu Leu Lys Val Gln Asp Asn Ile Pro Ile Cys Ala Ser Ile Ile

260 265 270

ggg cag cgc ctg gcg ctc tac gca tta gag gct ggt cca gaa tgg atc 864

Gly Gln Arg Leu Ala Leu Tyr Ala Leu Glu Ala Gly Pro Glu Trp Ile

275 280 285

aga gaa agg gtg aga gat cta gtg aaa aac cgt gaa ttg ctc atg gaa 912

Arg Glu Arg Val Arg Asp Leu Val Lys Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu

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gcg atg tct ccg ctt ggc aag gac tct gtc aag ggt ggt gag ggt gcc 960

Ala Met Ser Pro Leu Gly Lys Asp Ser Val Lys Gly Gly Glu Gly Ala

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att tac ctc tgg gca aaa cta ccc gag aaa tgc tca gat gat ttt gaa 1008

Ile Tyr Leu Trp Ala Lys Leu Pro Glu Lys Cys Ser Asp Asp Phe Glu

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gtt gtc aga tgg ctt gca aac aag cat ggt gtg gct gtg atc ccc ggg 1056

Val Val Arg Trp Leu Ala Asn Lys His Gly Val Ala Val Ile Pro Gly

340 345 350

agc gcc agt gga ggt ccc gga tat atc cgg gtt tct ttc gga ggg ttg 1104

Ser Ala Ser Gly Gly Pro Gly Tyr Ile Arg Val Ser Phe Gly Gly Leu

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aaa gaa tcg gat aca agg ctt gct gct gag agg tta agg cgc ggc ttg 1152

Lys Glu Ser Asp Thr Arg Leu Ala Ala Glu Arg Leu Arg Arg Gly Leu

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caa gaa ctt gtg act gag gga atg gta cag tga 1185

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<210> 3

<211> 394

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza Sativa)

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Met Gly Ser Phe Gly Arg Leu Ala Arg Arg Ala Val Glu Thr Glu Ala

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Pro Val Met Val Lys Met Gln Glu Leu Leu Arg Gly Asn Lys Asp Val

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Met Ser Leu Ala Gln Gly Val Val Tyr Trp Gln Pro Pro Glu Ala Ala

35 40 45

Met Asn Lys Ile Lys Glu Ile Val Trp Glu Pro Ser Ile Ser Lys Tyr

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Gly Ser Asp Asp Gly Leu Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Lys

65 70 75 80

Leu Arg Arg Glu Asn Lys Leu Thr Lys Ser Ser Ile Met Val Thr Ser

85 90 95

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Gly Asp Ala Val Val Met Phe Ala Pro Tyr Tyr Phe Asn Ser Tyr Met

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Pro Glu Thr Leu His Pro Asp Val Asp Trp Leu Glu Lys Val Leu Gln

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Glu Asn Asn Pro Ile Pro Lys Leu Val Ser Val Val Asn Pro Gly Asn

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Pro Ser Gly Ala Phe Ile Pro Lys Pro Met Leu Glu Arg Ile Ser Glu

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Leu Cys Arg Asn Ala Gly Ala Trp Leu Val Val Asp Asn Thr Tyr Glu

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza Sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(627)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(627)

<400> 4

atg ggt agc ttc ggg agg ctg gcg agg agg gcc gtg gag acg gaa gcg 48

Met Gly Ser Phe Gly Arg Leu Ala Arg Arg Ala Val Glu Thr Glu Ala

1 5 10 15

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Pro Val Met Val Lys Met Gln Glu Leu Leu Arg Gly Asn Lys Asp Val

20 25 30

atg tcg ctt gcg cag gga gtt gtt tat tgg cag cct cct gag gca gct 144

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Gly Ser Asp Asp Gly Leu Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Lys

65 70 75 80

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Leu Arg Arg Glu Asn Lys Leu Thr Lys Ser Ser Ile Met Val Thr Ser

85 90 95

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Gly Ala Asn Gln Ala Phe Val Asn Val Val Leu Thr Leu Cys Asp Ala

100 105 110

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Gly Asp Ala Val Val Met Phe Ala Pro Tyr Tyr Phe Asn Ser Tyr Met

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130 135 140

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Pro Glu Thr Leu His Pro Asp Val Asp Trp Leu Glu Lys Val Leu Gln

145 150 155 160

gaa aac aac cct atc cct aaa ctt gtt agt gtt gta aat cct gga aac 528

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Gly Ser Asp Asp Gly Leu Pro Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Lys

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Pro Ser Gly Ala Phe Ile Pro Lys Pro Met Leu Glu Arg Ile Ser Glu

180 185 190

Leu Cys Arg Asn Ala Gly Ala Trp Leu Val Val Asp Asn Thr Tyr Glu

195 200 205

Claims

1.水稻OsVAS1基因在调控水稻株高、分蘖数和茎秆粗度性状中的应用，其特征在于，所述水稻OsVAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.水稻OsVAS1基因的第一转录本在调控水稻株高、分蘖数和茎秆粗度性状中的应用，其特征在于，所述水稻OsVAS1基因的第一转录本编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。