UA116086C2 - Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту - Google Patents
Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту Download PDFInfo
- Publication number
- UA116086C2 UA116086C2 UAA201403599A UAA201403599A UA116086C2 UA 116086 C2 UA116086 C2 UA 116086C2 UA A201403599 A UAA201403599 A UA A201403599A UA A201403599 A UAA201403599 A UA A201403599A UA 116086 C2 UA116086 C2 UA 116086C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- promoter
- plants
- plant
- aminotransferase
- biomass
- Prior art date
Links
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 158
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 71
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 314
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 91
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 91
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 53
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 36
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 29
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 29
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 27
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 claims description 21
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 claims description 18
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 12
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 11
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 8
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 101000850431 Homo sapiens Synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog Proteins 0.000 claims 2
- 102100033475 Synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog Human genes 0.000 claims 2
- OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 3-aminobutanoic acid Chemical compound CC(N)CC(O)=O OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 claims 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 claims 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims 1
- 241000940915 Hermya Species 0.000 claims 1
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 claims 1
- 101001134172 Homo sapiens Otoancorin Proteins 0.000 claims 1
- 241000277269 Oncorhynchus masou Species 0.000 claims 1
- 102100034199 Otoancorin Human genes 0.000 claims 1
- 101000588931 Thalassianthus aster Delta-thalatoxin-Tas1a Proteins 0.000 claims 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 230000014075 nitrogen utilization Effects 0.000 abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 107
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 45
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 18
- 108050003084 Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenases Proteins 0.000 description 15
- 102000014241 Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenases Human genes 0.000 description 14
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 10
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 10
- 101001018196 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Proteins 0.000 description 9
- 102100033127 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Human genes 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-pentanol Chemical compound CC(C)CC(C)O WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 4
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 description 4
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 3
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 3
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 3
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 3
- 102100023927 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000021231 nutrient uptake Nutrition 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009244 rapid viral response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100039338 Aminomethyltransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108050001492 Ammonium transporters Proteins 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 244000289527 Cordyline terminalis Species 0.000 description 2
- 235000009091 Cordyline terminalis Nutrition 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710180399 Glycine-rich protein Proteins 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 101100107522 Mus musculus Slc1a5 gene Proteins 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102100028262 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm4 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008650 pH stress Effects 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- VVJYUAYZJAKGRQ-UHFFFAOYSA-N 1-[4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C(O)C1 VVJYUAYZJAKGRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOKUMXABRRXHAR-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-3-oxopropanoic acid Chemical compound O=CC(C)C(O)=O VOKUMXABRRXHAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 3-oxopropanoate Chemical compound [O-]C(=O)CC=O OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150072844 APOM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100037324 Apolipoprotein M Human genes 0.000 description 1
- 241000408923 Appia Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101100291267 Drosophila melanogaster Miga gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070878 Ereg gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108090000836 Nitrate Transporters Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101150030170 Paat gene Proteins 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108010040093 cellulose synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001295 genetical effect Effects 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- QBQQKHZEHKZMJF-NXUSYKNTSA-N mioe Chemical compound C=1([C@@H]2OC(=O)C[C@@H]3[C@@]2(C)CC[C@H]2C3=C[C@@H]3[C@@H](OC(=O)C(C)C)C(C)(C)[C@@H]([C@@]2(C)C3=O)CC(=O)OC)C=COC=1 QBQQKHZEHKZMJF-NXUSYKNTSA-N 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 1
- 235000021232 nutrient availability Nutrition 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
- C12Y206/01002—Alanine transaminase (2.6.1.2), i.e. alanine-aminotransferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01027—Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase (acylating) (1.2.1.27)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Abstract
Винахід стосується трансгенної однодольної рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує амінотрансферазу, таку як аланінамінотрансферазу або аспартатамінотрансферазу, який функціонально зв'язаний з РВрr1 промотором, який містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1; насіння з вказаної рослини, клітини однодольної рослини, генетичної конструкції, вектора, клітини-хазяїна, що містять полінуклеотид, який кодує амінотрансферазу, функціонально зв'язану з РВрr1 промотором з послідовністю SEQ ID NO: 1; способів одержання вказаної рослини з підвищеною ефективністю використання азоту, біомасою та врожайністю насіння; застосування вказаної генетичної конструкції для підвищення ефективності використання азоту, біомасою та врожайністю насіння в однодольних рослин.
Description
(57) Реферат:
Винахід стосується трансгенної однодольної рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує амінотрансферазу, таку як аланінамінотрансферазу або аспартатамінотрансферазу, який функціонально зв'язаний з РВрі!1 промотором, який містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 1; насіння з вказаної рослини, клітини однодольної рослини, генетичної конструкції, вектора, клітини-хазяїна, що містять полінуклеотид, який кодує амінотрансферазу, функціонально зв'язану з РВрі1 промотором з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1; способів одержання вказаної рослини з підвищеною ефективністю використання азоту, біомасою та врожайністю насіння; застосування вказаної генетичної конструкції для підвищення ефективності використання азоту, біомасою та врожайністю насіння в однодольних рослин. ів шви Загальна кількість пагонів
Кількість насінин, що утворюють паго ів що т . -
Ж а 10. !
КХ сен
В їх га !
До г ПОКНХ хан Й й ж а. і Сх і. 4 пе З кВ о.
ШОВ ТУЯ ЕТО КУ
Па Тако й Ся - пк м хм си
М У З й м м ще
Кс с (2
Ко Ко є т, ЛІНІЇ
Її Я.
Фіг. З
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Винахід належить до однодольних рослин, які мають підвищену урожайність (і/або ефективність використання азоту (пійгодеп ші2айоп ейісіепсу-«МОЄЕ), способів підвищення урожайності та МОЕ у однодольних рослин, та способів підвищення біомаси і врожаю насіння у однодольних рослин, наприклад, при вирощуванні за умов азотного дефіциту.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Продуктивність рослин у більшості природних та сільськогосподарських екосистем лімітується трьома основними поживними елементами: азотом, фосфором і калієм. Загалом, азот є найважливішим серед трьох лімітуючих поживних елементів і основним компонентом добрив. Оскільки азот, як правило, є елементом, що лімітує швидкість росту у рослин, урожайність більшості сільськогосподарських культур значною мірою залежить від внесення неорганічних азотних добрив. Джерелом азоту в добриві, як правило, є нітрат амонію, нітрат калію або сечовина.
Підвищена ефективність використання азоту рослинами має низку переваг, обумовлюючи, наприклад, прискорений ріст та підвищений врожай у порівнянні з традиційними рослинами, що вирощуються на грунтах з низьким вмістом азоту, і знижена потреба у внесенні азотних добрив під сільськогосподарські культури. Витрати на добрива складають істотну частку коштів, пов'язаних з виробництвом сільськогосподарських культур, відповідно, використання меншої кількості добрив призвело б до зменшення витрат виробниками. Зменшення кількості добрив також призвело б до зменшення негативного впливу на середовище, який викликає надмірне застосування азотних добрив. Надмірне застосування добрива призводить до підвищеної евтрофікації, кислотних дощів, ацидифікації грунту і парникового ефекту. Ці загрози навколишньому середовищу обумовлюють наступні проблеми, такі як загибель риби, втрата біорізноманіття, підвищене водоростеве "цвітіння" води, втрата орних земель і прискорення глобальних змін клімату, які впливають на населення землі як у соціальному, так і в економічному масштабі.
Однодольні складають значний відсоток сільськогосподарських культур, які вирощуються у світі, при цьому у 2007 році пшеницею було засіяно приблизно 217 мільйонів гектарів і 158 мільйонів гектарів кукурудзою та рисом. У глобальному масштабі приблизно половина калорій і
Зо потреби у протеїні походять від пшениці, рису та кукурудзи. Рис здебільшого використовують як модельну сільськогосподарську культуру для генетичних та фізіологічних досліджень у інших однодольних культур, включаючи кукурудзу, пшеницю, цукрову тростину, ячмінь, сорго, жито та інші злаки. Рис має невеликий диплоїдний геном, який добре зберігається і відтворюється серед однодольних.
Промотори - це послідовності нуклеїнової кислоти, що регулюють транскрипцію гена чи нуклеотидної послідовності. Промотори можуть використовуватись для конститутивної експресії, такі як добре відомий промотор віруса мозаїки цвітної капусти Самм 355, індуцибельної експресії, такий як промотор гаг29А, що індукується стресом (Ріпо еї аї., 2007), тканиноспецифічної експресії, такий як коренеспецифічний промотор О5АМТІ1 (Публікація заявки на Патент США Мо 2009/0288224) і стадієспецифічної експресії, такі як ІРТ промотори, що індуються старінням (Ма еї аїЇ., 2009). Промотори також можуть бути слабкими або сильними, залежно від того, коли і де вони індукуються, вони можуть використовуватись для експресії прикріпленого гена або нуклеотидної послідовності на різних рівнях.
Якщо промотор зливається з 5" кінцем гена або нуклеотидної послідовності, він може регулювати експресію гена або нуклеотидної послідовності. Разом з тим, не всі промотори можуть успішно експресувати всі гени або всі нуклеотидні послідовності у рослин всіх типів.
Наприклад, промотор дводольних може функціонувати у інший спосіб при введенні в систему однодольних і навпаки. Аналогічно, промотор однодольних може функціонувати по-іншому при введенні у різні роди однодольних, так як, наприклад, промотор рису - у пшеницю. Для трансгенних досліджень існують різні типи промоторів, які можуть використовуватись, залежно від мети експерименту. Промотори часто класифікуються як конститутивні, тканиноспецифічні іМабо індуцибельні. Багато трансгенних досліджень наразі використовують універсальні конститутивні промотори, такі як вірус мозаїки цвітної капусти (САММ355) і убіхітиновий промотор 1 кукурудзи (ибі-1), для того щоб викликати надекспресію гена інтересу у рослин. Це може бути недоліком, тому що це було б енергетично несприятливим для рослин - експресувати ген протягом усього часу - і призвело б до аномального розвитку, оскільки рівні експресії трансгена не регулюються (ЗПпекоп еї аї., 2002). Наприклад, конститутивна надекспресія гена целюлозосинтази типу С5ІРб промотором глобуліну вівса РгоАБОЇ. часто призводить до зниженого проростання насіння чи росту сіянців та появи некрозів на кінчиках 60 листків та у серйозних випадках обумовлює загибель (Вигіоп еї аї., 2011).
Використання індуцибельних або тканиноспецифічних промоторів є кращим вибором, для того щоб викликати експресію трансгена. Індуцибельні промотори активують експресію гена лише у тому випадку, коли застосовуються специфічні фізичні, біологічні або хімічні стимули чи чинники навколишнього середовища. Промотор гена Нуип5р17 пшениці, який індукується теплом, може бути використаний для забезпечення високого рівня експресії гена інтересу, коли рослини зазнають впливу температури від 38 до 40 "С протягом 1-2 годин (Егеетап еї аї., 2011). Це стимулює експресію гена чи нуклеотида протягом короткого проміжку часу і дає змогу контролювати особливості розвитку, однак тут існують обмеження щодо тканин, які не зазнають суттєвих температурних змін. Надекспресія білка МАС (ТамМмАСб9) у Тгтйісит аевіїмит, який кодує транскрипційний фактор, що бере участь у водному стресі, через індукцію промотора Нуирппа5, який ініціюється посухою, забезпечує рослини пшениці з істотно вищою біомасою пагонів на ранніх стадіях вегетативного розвитку за умов слабкого сольового стресу та водного дефіциту порівняно з рослинами дикого типу. На противагу, конститутивний промотор НуиОпп85, який індукує ТамМмАСб9, не виявив істотних відмінностей порівняно з нетрансформованими контрольними рослинами (Хие еї. аї., 2011). При використанні промотора гаА2г9, який індукується водним та холодовим стресом, для того щоб викликати надекспресію ОКЕВТА гена, що кодує фактор транскрипції, залучений до стійкості до стресу у рослин АгаБбідорбвів, утворюються нормальні рослини, в той час як конститутивна експресія, викликана САМУЗ355 промотором, за нормальних умов культивування призводить до затримки росту (Казида еї аї., 1999).
Тканиноспецифічні промотори залучаються при органоспецифічній і стадієспецифічній експресії у трансгенних рослин. Наприклад, у картоплі, ЗІКСАр вбудовується в листки як захисний механізм проти комах-шкідників, однак не експресується у їстівних частинах рослини, що продукує цей токсин (У/ерег, 2003; Рагк апа допе5, 2008). Використання 355 промотора викликає також проблему продовольчої безпеки, у тому випадку, коли токсин, що продукується у "нецільових" органах, може зробити бульби картоплі небезпечними для споживання. Крім того, у метаболічному відношенні це є значним навантаженням для рослини, оскільки змушує її постійно продукувати вторинні метаболіти, незалежно від стадії розвитку органа, що призводить до ослаблення рослини та ризику зниження врожаїв.
Зо У випадку конструювання МОЕ рослини, тканиноспецифічна експресія генів може підвищити ефективність поглинання М, його використання та транспорт у рослині. Навпаки, використання конститутивного промотора може підтвердити витрати енергії тому що надекспресія нелімітуючих швидкість ферментів у деяких органах може не призвести до прояву будь-якого фенотипу, або може навіть знизити врожай. Отримання МОЄ рослини може також включати трансформацію множинних генів або "генне пакетування", для того щоб отримати задовільний
МИОЕ фенотип, оскільки метаболізм і транспорт азоту є надзвичайно складними процесами.
До того ж, використання САММУЗ355 промотора може не призвести до будь-якого фенотипу, тому що експресія гена чи експресія білка були недостатніми у специфічному органі чи на певній стадії розвитку. Також, рослини можуть "вимикати" експресію трансгена, коли виявлється, що це є несприятливим у енергетичному відношенні. Якщо НмАПаАТ індукується
САММУЗ355 промотором, він не виявляє ніякого МОЕ фенотипу. Однак, при використанні коренеспецифічного промотора рід26, продукуються рослини, яким притаманні вищі значення ефективності використання азоту (МОЕ) (Сбооа еї аї., 2007).
Подібно до надекспресії генів інтересу, при використанні у різних видів промотори можуть не відтворювати паттерн експресії їх природних видів. Насіннєспецифічні промотори ячменю (В-пог і О-пог) та пшениці (НММУУ-СІш) не індукують насіннєспецифічну експресію у рису; натомість промотори індукують високий рівень експресії в листках, пагонах і материнських тканинах насінин у рослин рису (уми еї аї., 1998; Ом апа Такаїма, 2004; Рипадо еї аї., 2008).
РВрі1 промотори - походять з генів, що кодують метилмалонат семіальдегід дегідрогеназу (ММ5ОН). РВрі1 промотор розташований вище О5ЗАГОНб гена, який кодує ген метилмалонат семіальдегід дегідрогенази у рису (Інвентарний номер: ген: АК 121280.1 і мРНК: АБО45770.1).
АК121280.1 і АР045770.1 являють собою сплайсингові варіанти один одного, причому АБО45770 є коротшим, ніж АК121280.1. АК121280.1, очевидно, є гіпотетичним білком, сконструйованим
СепВапк, тоді як було описано АБО45770.1 (Одиспі еї а! (2004). О5АГОНб є гомологічним до гена АГОНбБВАІ2 у Агабрідорзі5, який також кодує метилмалонат семіальдегід дегідрогеназу. Ген
О5АЇГ ОН високо експресується в молодих коренях та стеблах (Сабо апа Нап, 2009).
Метилмалонат семіальдегід дегідрогеназа (ММ5ОН) каталізує незворотнє окисне декарбоксилювання малонату семіальдегіду до ацетил-СОоА і метилмалонат семіальдегіду до пропіоніл-СОА в дистальних частинах катаболічного шляху валіну та піримідину. Оскільки бо ММ5ОН генерує ацетил-СоА, це є важливим чинником у гліоксилатному циклі, циклі трикарбонових кислот (ТКК) і утворенні жирних кислот.
ММ5ОН даун-регулюється протягом окиснювального стресу завдяки рестрикції в циклі трикарбонових кислот і утворення АТФ (ЗмеейЙоме евї а!., 2002). У двотижневих рослин рису були виявлені високі рівні МРНК ММ5ОН у коренях та піхвах листків, тоді як накопичення білка було найвищим у коренях, після чого йдуть листкові пластинки (Одиспі єї а!..., 2004). При додаванні ауксину, рівні ММ5ОН у коренях зростають разом зі зростанням укорінення. Тапака еї а!. (2005) висловили припущення, що ММ5ОН бере участь у рості коренів, диференціації тканин та у рості в товщину завдяки його експресії в кореневому чохлику, бічних коренях та кореневих волосках.
Було виявлено, що ММ5ОН локалізується у мітохондріальному матриксі Агарідорбзів5, рису, людини, бика і щура, що дає підстави висловити припущення про подібність функцій ММ5ОН у цих організмів.
Ця інформація стосовно передумов винаходу забезпечується з метою ознайомлення з інформацією, яка, на думку заявника, може мати відношення до даного винаходу. Не існує жодної потреби в отриманні дозволу і не повинно тлумачитись, що будь-яка попередня інформація містить прототип цього винаходу.
СТИСЛИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Мета цього винаходу полягала у тому, щоб забезпечити рослини, які мають підвищену ефективність використання азоту. Згідно з одним аспектом цього винаходу забезпечується трансгенна рослина або частина рослини, яка включає полінуклеотид, що кодує білок, який відповідає за утилізацію азоту, функціонально пов'язаний з РВрі1 промотором.
Згідно з іншим аспектом, забезпечується насіння, отримане від трансгенної рослини винаходу.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується рослинна клітина, трансформована за допомогою полінуклеотиду, що кодує білок, який відповідає за утилізацію азоту, функціонально пов'язаний з РВрі1 промотором.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується генетична конструкція, яка включає полінуклеотид, що кодує білок, який відповідає за утилізацію азоту, функціонально пов'язаний з
РВрі1 промотором.
Згідно з іншим аспектом забезпечується вектор, який включає генетичну конструкцію винаходу.
Згідно з іншим аспектом забезпечується клітина-господар, яка включає генетичну конструкцію або вектор згідно з винаходом.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується спосіб отримання рослини, що має підвищену ефективність використання азоту, який включає трансформовану рослинну клітину з генетичною конструкцією або вектором винаходу і культивування трансформованої рослинної клітини для отримання рослини, що експресує білок, який відповідає за утилізацію азоту, з
РВріг1 промотора, що призводить до отримання рослини, яка має підвищену ефективність використання азоту, де підвищена ефективність використання азоту порівнюється з ефективністю використання азоту рослинами дикого типу, вирощеними за ідентичних умов.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується спосіб отримання рослини, що має підвищену біомасу, який включає: трасформацію рослинної клітини за допомогою генетичної конструкції чи вектора винаходу, вирощування трансформованої рослинної клітини для отримання рослини, яка експресує білок, що відповідає за утилізацію азоту, за допомогою РВрг1 промотора, що призводить до отримання рослини, яка має підвищену біомасу, де підвищена біомаса порівнюється з біомасою рослини дикого типу, вирощеної за ідентичних умов.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується спосіб отримання рослини, що має підвищену врожайність насіння, який включає; трансформацію рослинної клітини за допомогою генетичної конструкції чи вектора винаходу, вирощування трансформованої рослинної клітини для отримання рослини, що експресує білок, який відповідає за утилізацію азоту, за допомогою
РВрії промотора, що призводить до отримання рослини, яка має підвищену врожайність насіння, де підвищена врожайність насіння порівнюється з врожайністю насіння рослин дикого типу, вирощених за ідентичних умов.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується спосіб отримання рослини, що має підвищену ефективність використання азоту, підвищену біомасу, підвищену врожайність насіння, або їх комбінацію, який включає: (а) забезпечення рослини, частини рослини або насіння, який включає генетичну конструкцію або вектор винаходу, і (б) вирощування рослини, частини рослини або насінини, внаслідок чого отримують рослину, яка має підвищену здатність до поглинання азоту, підвищену біомасу, підвищену врожайність насіння або комбінацію цих ознак, де поглинання азоту, біомаса і врожайність насіння є підвищеними у порівнянні з бо поглинанням азоту, біомасою та врожайністю насіння у рослин дикого типу, вирощених за ідентичних умов.
Згідно з іншим аспектом, забезпечується використання трансгенних рослин винаходу для отримання потомства.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується використання генетичної конструкції або вектора винаходу для підвищення ефективності використання азоту, біомаси або врожайності насіння у рослин.
Згідно з іншим аспектом винаходу, забезпечується процес для підвищення ефективності використання азоту, біомаси або врожайності насіння у рослин, або комбінації цих ознак, у рослини, який включає: забезпечення насіння, що включає генетичну конструкцію або вектор винаходу, застосування гербіциду, інсектициду, добрива або їх комбінації щодо насіння, вирощування рослини з насінини, де рослина має підвищену здатність до використання азоту, підвищену біомасу, підвищену врожайність насіння або комбінацію цих ознак, і де поглинання азоту, біомаса і врожайність насіння є підвищеними у порівнянні з поглинанням азоту, біомасою та врожайністю насіння у рослин дикого типу, вирощених за ідентичних умов.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб створення рослини з підвищеною ефективністю використання азоту, який включає, введення нуклеїнової кислоти, що кодує один або більше білків, які відповідають за утилізацію азоту, функціонально пов'язаної зі специфічним промотором, активним у епідермісі кореня, і отримання рослини, що включає підвищені рівні одного або більше білків, що відповідають за утилізацію азоту, а саме тих, що локалізовані в епідермісі кореня.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для спрямованої тканиноспецифічної експресії гена-мішені або нуклеотидної послідовності у рослин, включаючи отримання рослини з трансформованої рослинної клітини, так що тканиноспецифічна експресія гена-мішені або нуклеотидної послідовності відбувається в межах обраної тканини рослини, де трансформована клітинна рослина містить ген-мішень або нуклеотидну послідовність, яка функціонально пов'язана з елементом промотора РВріт1. В одному втіленні тканиноспецифічна експресія має місце у коренях рослини.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для спрямованої тканиноспецифічної або стадієспецифічно-регульованої експресії, або експресії, що регулюється чинниками оточуючого
Зо середовища, гена-мішені або нуклеотидної послідовності у рослини, включаючи отримання рослини з трансформованої рослинної клітини, так що тканиноспецифічна, або регульована у процесі розвитку чи під впливом чинників оточуючого середовища, експресія гена чи нуклеотидної послідовності відбувається в межах обраної тканини, де трансформована рослинна клітина містить ген-мішень або нуклеотидну послідовність у оперативному зв'язку з
РВрі1 промоторним елементом. В одному втіленні, тканиноспецифічна експресія має місце у коренях чи листках рослини і експресія, що регулюється умовами середовища або стадією розвитку, відбувається за умов стресу - недостатньої кількості поживних речовин.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для підвищення біомаси рослини, що вирощується за умов впливу одного або більше несприятливих чинників навколишнього середовища, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності, оперативно зв'язаних з РВрі!ї елементом промотора для отримання трансформованих рослин, ген-мішень або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, який бере участь в асиміляції та метаболізмі азоту; і вирощування трансформованих рослин. В одному втіленні ферментом є аланінамінотрансфераза (АїаАТ).
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для підвищення біомаси рослини, що вирощується за умов низького вмісту азоту, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності, оперативно зв'язаних з елементом промотора РВрії, для отримання трансформованої рослини, ген-мішень або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції азоту; і вирощування трансформованої рослини. В одному втіленні, ферментом є АїаАТ.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для підвищення біомаси рослини, яка росте під дією одного або більше несприятливих чинників зовнішнього середовища, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена або нуклеотидної послідовності, що кодують АїЇаАТ, оперативно пов'язані з елементом промотора для отримання трансформованої рослини; і вирощування трансформованої рослини. В одному втіленні, промотором є РВрі!1.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для збільшення врожайності насіння, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності або нуклеотидної послідовності, оперативно пов'язаних з елементом промотора
РВрії, для отримання трансформованої рослини, ген-мішень або нуклеотидну послідовність бо або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції або метаболізмі азоту; і вирощування трансформованої рослини. В одному втіленні, ферментом є
АіаАТ.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для збільшення врожаю насіння рослини, яка вирощується за умов низького вмісту азоту, що включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності або нуклеотидну послідовність, оперативно пов'язану з елементом промотора РВрі1 для отримання трансформованої рослини, ген-мішень або нуклеотидну послідовність чи нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції азоту; і вирощування трансформованої рослини. Переважно, ферментом є АйаАТ.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує спосіб для збільшення урожайності насіння рослини, яка вирощується за умов високого вмісту азоту, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності, або нуклеотидної послідовності, оперативно пов'язаної з елементом промотора РВрії, для отримання трансформованої рослини, ген-мішень або нуклеотидну послідовність або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції азоту; і вирощування трансформованої рослини. В одному втіленні, ферментом є АПаАТт.
Цей короткий опис винаходу не охоплює обов'язково всі особливості винаходу і жодним чином не є обмежуючим.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Ці та інші особливості винаходу стануть більш очевидними з наступних описів, в яких зроблено посилання на креслення, що додаються.
На ФІГ. 1 представлена карта конструкції РВрії: НмАІ(ад45тї в рСсАМВІА1Т300. НмуАІаАатТ контролюється РВрг1! промотором і визначається поб5-термінатором. Селективним маркером для добору плазміди є ген стійкості до канаміцину та гігроміцину.
На ФІГ. 2 представлено порівняння загальної надземної біомаси (г) і врожайності насіння (г)
Ті РВрІи ліній, МВ ії АСК1/7 при дозріванні. Кожна величина була отримана з 5-7 повторностей, а планки похибок - це стандартне відхилення. Чорні стовпчики: загальна надземна біомаса (г); сірі стовпчики: загальна врожайність насіння (г).
На ФІГ. З представлено кількість пагонів та репродуктивних пагонів, що утворились на Ті
Зо РВрі! рослинах, у порівнянні з МВ і АСК1/7 при дозріванні. Кожне вимірювання було отримано як середнє значення, щонайменше, із 4-ох повторностей, а планки похибок відображають стандартне відхилення (СВ). Чорні стовпчики: загальна кількість пагонів; сірі стовпчики: кількість репродуктивних пагонів (що несуть насіння).
На ФІГ. 4 представлено порівняння між Т2 РВрг1 рослинами, МВ ії АСК1/7 щодо надземної біомаси (г) і врожайності насіння (г) при дозріванні. Величини з кожної лінії були отримані із 7 повторностей, а планки похибок відображають СВ. Чорні стовпчики: загальна надземна біомаса (г); сірі стопвчики: загальна врожайність насіння (г).
На ФІГ. 5 представлена: (А) суха надземна біомаса Тз РВрі1 рослин (г) на 52 день після проростання; кожна лінія була представлена 5 рослинами, а планки похибок відображають стандартне відхилення СВ, і (В) сира маса (г) трьох РВрі1:АІіІаАТтТ надекспресуючих ліній рису у порівнянні з диким типом (ДК) (МВ; Мірропраге) при дозріванні при вирощуванні у грунтових умовах.
На ФІГ. 6 представлена активність пагоноспецифічної Аіадт у мксмМ МАОН/хв.мг білка Ті
РВріІ1 ліній, вирощених у грунті, на 40 день після проростання у порівнянні з МВ і АСКТ1/7. Всі лінії помічені буквою М, - це "нульові сегреганти". Кожна точка даних на графіку для трансгенних рослин була отримана в середньому у трьох повторностях; планки похибок означають стандартне відхилення (СВ) при трьох повторностях.
ФІГ. 7 відображає активність аланінамінотрансферази (мкмМ МАОН/хв"мг білка) у ліній ДТ (МВ), АОК 1/7 (О5АМТ1:АпалдтТ) і трьох незалежних РВрі1:АІаАТ надекспресуючих Тз ліній рису (РВрі1-11, РВри1-12, РВрі1-21) у п'яти (5) різних періодів росту протягом вирощування у грунтових умовах при високому рівні М. Планки похибки означають стандартне відхилення (СВ).
На ФІГ. 8 представлено АйІаАТ активність пагонів Т2 РВрі1 ліній в мкмМ МАОН/хв.мг білка у 28-денних та 52-денних рослин, вирощених в умовах гідропонної культури. РВрг1-21-2 і РВрг1- 21-3 є потомками однієї й тієї ж лінії. Кожна точка даних на графіку базується на 5 повторностях, а планки похибок означають стандартне відхилення (СВ).
На ФІГ. 9 представлена АїаАТ активність у коренях Те» РВрІ1 ліній у 28-денних та 52-денних рослин, вирощених в умовах гідропонної культури. Кожна точка даних на графіку базується на 5 повторностях, а планки похибок означають стандартне відхилення (СВ). РВрг1-21-2 і РВрг1-21-3 є потомками однієї й тієї ж лінії. Чорні стовпчики: 28-денні рослини; сірі стовпчики: 52-денні (516) рослини.
На ФІГ. 10 представлені результати Вестерн-блот аналізу білкових екстрактів 52-денних рослин Тз РВрг/ ліній, детекція яких була проведена з використанням НмуАІаАТ-2 специфічної 19 імунної сироватки. Доріжка 1: АОК1/7, доріжка 2: дикий-тип Мірропраге, доріжка 3: РВрг1-10, доріжка 4: РВрг1-11, доріжка 5: РВрі1-11-2М, доріжка 6: РВрг1-12 і доріжка 7: РВрг1-21.
Концентрацію білка стандартизували поперек доріжок за допомогою методу кількісного аналізу білка Бредфорда.
На ФІГ. 11 представлені результати Вестерн-блот аналізу білкового екстракту коренів рослин Т2, вирощених за умов гідропонної культури (А), і пагонів (В) 28-денних рослин ліній рису за допомогою Нм АїЇаАТ 12 детекції антитіл, для того щоб виявити кількість НуиАЇаАТ білка у кожному зразку. Доріжка 1: РВрг1-11, доріжка 2: РВрг1-11-2М, доріжка 3: РВрг1-21-2, доріжка 4:
РВрі1-21-3, доріжка 5: РВрі1-21-3 повторність, доріжка 6: РВрг1-21-М, доріжка 7: АОК1/7 і доріжка 8: дикий тип Мірропраге. Концентрацію білка стандартизували поперек доріжок за допомогою методу кількісного аналізу білка Бредфорда.
На ФІГ. 12 представлена І 0д2 відносного кількісного аналізу (4аСТ) РВрі1 пагонів, Т2 РВри пагонів і Т2 РВрі!ї коренів, АОК1/7 і "нульових сегрегантів" РВрг1! ліній у порівнянні з МВ рослинами. 7 транскриптів (багієу НмиАїаАТ: АїаАТ; СЕР: білок, багатий на гліцин, І КЕ: часті потори лейцину) були визначені за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу (ДКТ-РСК). Рослини вирощували за умов гідропонної культури і збирали через 52 дні після проростання. Використовувались ті ж зразки тканини, що й при дослідженні АїаАатТ активності, результати представлені на Фігурі 9. (2-кратні зміни представляє 1 Заст. Годг2-1).
На ФІГ. 13 представлена нуклеотидна послідовність РВрг1 промотора, яка включає АТО старт-кодон та початкові нуклеотиди кодуючої послідовності (ЗЕО ІЮ МО:6) і представляє сайти рестрикції ЕсоКІ і засі, які використовуються для клонування.
На ФІГ. 14 представлена (А) нуклеотидна послідовність гена Аі(аАТ ячменю (Ногдеит миїЇдаге) (ЗЕО ІЮ МО:2) і (В) амінокислотна послідовність білка АіаАТ (ЗЕО ІО МО:3).
На ФІГ. 15 представлено 55 забарвлювання (А) 3З-денного РВрі1:зИ5ріи5 (РВрІі1сО лінія) сіянця, (В) З-денних О5БАМТ1:зИ5ріи5 (О5АМТ1:(05 лінії) сіянців як позитивний контроль. (С) до (М) - це би5-забарвлені тканини сіянців віком від 7 до 10 днів РВрг1б і ОБАМТ1:50З5 ліній. (С) стебло РВрі10б, (0), (0), і (Н) базальна ділянка пагона /межа розподілу пагін/корінь, що містить
Зо залишки насінини РВрг1б, (Е) базальна ділянка пагона/межа розподілу пагін/корінь, що містить залишки насінини О5АМТ1И5, (Б) стебло О5АМТ1ОИ5, (І) межа розподілу між листковою піхвою і листковою пластинкою О5АМТ10И5, (У) листкова пластинка і жилки РВріг1б, (К) листкова пластинка і жилки ОБАМТ1ТИ5, (І) корені та кореневі волоски РВрі10, і (М) корені та кореневі волоски ОБАМТ1ТИ5.
ФІГУРА 16 представляє таблицю, в якій наведено концентрацію амінокислоти у листках сорту дикого типу (культивар Мірропраге) рису у порівняні з Ббагіеу Аі(аАТ надекспресуючими трансгенними лініями рису; АСК 1/7 (О5АМТ1:НмАїаАтТ) ї РВрг1-11, РВрі1-12, РВрі1-21 (О5РВрі1:НуАіаАТ). Концентрація амінокислоти (нМ/г СМ) отримана із чотирьох повторностей.
На ФІГ. 17 представлений (А) РВрг2 промотор, який контролює експресію АїаАТ у рослин рису, Т1 покоління, вирощеного у грунті в умовах кліматичної камери; порівняння висоти рослини, загальної біомаси і ваги насіння з культиваром рису дикого типу су. Мірропбаге (МВ), і (В) РВрг2 промотор, який ініціює експресію АїаАТ у рослин рису, Т2 покоління, вирощеного у грунті в умовах кліматичної камери; порівняння загальної біомаси і ваги насіння з культиваром рису дикого типу см. Мірропбраге (МВ).
На ФІГ. 18 представлена (А) нуклеотидна послідовність РВрг1 промотора (ЗЕО ІЮ МО), і (В) нуклеотидна послідовність РВрг2 промотора (ЗЕО ІЮ МО:4).
На ФІГ. 19 представлено вирівнювання нуклеотидних послідовностей О5АМТ1 промотора (ЗЕО ІО МО:5), РВрІ1 промотора (5ЕО ІО МО':1) і РВрг2 промотора (5ЕО ІО МО 4).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується однодольних рослин, які мають підвищену врожайність і/або ефективність використання азоту (МОЕ), способів підвищення врожайності і МОЕ у однодольних рослин, способів підвищення біомаси та врожайності насіння у однодольних рослин. Цей винахід пов'язаний з РВрг1 промоторами, що є промоторами з генів, які кодують метилмалонат семіальдегід дегідрогеназу (ММ5ОН).
Беручи до уваги світові потреби в однодольних рослинах і зменшення родючості існуючих орних земель, бажано отримувати однодольні рослини, які здатні рости за субоптимальних умов живлення. Одним із засобів досягнення цієї мети є отримання однодольних рослин, які можуть більш ефективно використовувати азот. Такі однодольні рослини мають перевагу, оскільки здатні рости на грунтах з низьким вмістом азоту, а, отже, здатні більш ефективно бо використовувати наявний азот без втрати врожайності. Крім того, такі однодольні рослини можуть також демонструвати підвищену врожайність на грунтах, що мають нормальні рівні азоту. Ефективність використання азоту рослинами є результатом двох складових (підкомпонентів); ефективності поглинання М і ефективності використання М. Рослина, яка фенотипово виявляє ефективність використання азоту, може мати вдосконалення щодо її здатності до поглинання азоту з грунту, що є бажаною ознакою у рослин, які вирощуються на грунтах з низьким рівнем поживних речовин. Інакше, МОЄ рослини можуть мати пристосування стосовно їх здатності використовувати М, який поглинається, внаслідок чого наявний М (незалежно від того, низький його рівень чи високий) ефективно включається у субклітинні компоненти (такі як нуклеїнові кислоти, білки, запасаючі речовини, тощо), транспортуються до потрібних тканин і накопичуються на певній стадії розвитку в насінині. Або існує інша можливість, коли МОЕ рослина має пристосування як до покращеного поглинання М, так і до його утилізації. Будь-яка з-поміж цих можливостей забезпечила б підвищену врожайність МОЄ сільськогосподарських культур при вирощуванні за нормального вмісту азоту, тому що ці рослини були б здатні поглинати необмежену кількість азоту і були б здатні використовувати азот для підвищення біомаси та врожайності насіння, або внаслідок збільшення кількості насінин, або внаслідок збільшення ваги насінин чи внаслідок обох чинників. Певні втілення винаходу забезпечують трансгенні рослини, що мають покращену ефективність використання азоту у порівнянні з рослинами дикого типу.
Протягом росту та розвитку рослини зазнають впливу цілої низки неоптимальних умов навколишнього середовиаща. Такі умови можуть включати водний дефіцит, надлишкове засолення, лужні або кислі грунти, зараження шкідниками, захворювання чи температурний стрес, будь-який з-поміж яких окремо взятий може істотно негативно відбитись на рості та/або врожайності сільськогосподарської культури. Деякі втілення даного винаходу забезпечують способи, за допомогою яких можуть бути сконструйовані рослини та їх насіння, здатні рости та добре розвиватись за змінних умов навколишнього середовища, які, зазвичай, непридатні для розвитку рослин. В деяких втіленнях забезпечуються способи отримання рослин, які можуть підтримувати або нарощувати свою біомасу і врожайність, зростаючи за умов, що не є оптимальними, з точки зору застосування добрив, як описується.
У деяких втіленнях даний винахід переважно дозволяє користувачеві отримувати рослини,
Зо переваги яких для оточуючого середовища полягають у тому, що користувачі можуть підтримувати врожайність, зменшуючи при цьому потребу у підтриманні високого рівня внесення добрив. У деяких втіленнях, цей винахід дозволяє користувачу отримувати рослини, які за умов високих рівнів поживних речовин мають здатність до покращеного поглинання поживних елементів, що дає змогу рослинам екстрагувати більше поживних речовин з їх середовища протягом проміжку часу, коли поживні речовини є у достатній кількості.
Використовуючи способи та композиції певних втілень винаходу, рослини можуть бути вдосконалені для вирощування за умов навколишнього середовища, що є зазвичай непридатними для вирощування рослин. В деяких втіленнях, способи та композиції винаходу дають змогу генетично конструювати рослину, для того щоб змінити одну або більше характерних особливостей рослини лише в обраних тканинах рослини.
Якщо не визначено щось інше, всі технічні та наукові терміни, які тут використовуються, мають те ж саме значення, що зазвичай зрозуміле будь-якому фахівцеві зі звичайним досвідом роботи в галузі, до якої цей винахід належить.
Як тут використовується, терміни "який включає", "що має", "включаючи" і "що містить" та граматичні їх варіанти, є інклузивні або неостаточні і не виключають додаткових, неописаних елементів і/або етапів способу. Термін "складається істотно з" при використанні тут у зв'язку з композицією, застосуванням або способом, свідчить, що можуть бути присутні додаткові елементи і/або етапи способу, однак ці доповнення по суті не впливають на характер функціонування викладеної композиції, способу або застосування. Термін "складається з" при використанні тут у зв'язку з композицією, застосуванням або способом, виключає присутність додаткових елементів і/або етапів способу. Композиція, застосування або спосіб, тут описані, які включають деякі елементи і/або етапи можуть також, у деяких втіленнях складатись по суті з тих же елементів і/або етапів, і в інших втіленнях складатись з тих елементів і/або етапів, яких ці втілення конкретно стосуються чи ні.
До того ж, застосування слів у однині, включає й множину, і "або" означає "і/або", якщо не стверджується інше.
Як тут використовується, термін "близько" стосується приблизно ж/-10 95 варіювання від заданої величини. Зрозуміло, що таке варіювання завжди включається в будь-яке наведене значення величини, незалежно від наявності чи відсутності спеціального посилання на це. бо Термін "значною мірою ідентичний", як тут використовується стосовно нуклеотидної або амінокислотної послідовності, свідчить, що при оптимальному вирівнюванні, наприклад з використанням методів, наведених нижче, нуклеотидна або амінокислотна послідовності поділяють, щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 96, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичності послідовності порівняно з іншою визначеною нуклеотидною або амінокислотною послідовністю (або "референс-послідовністю"). "Істотна ідентичність" може використовуватись при посиланні на різні типи і довжину послідовностей, таких як повна послідовність, функціональний домен, кодуючі і/або регуляторні послідовності, промотори і геномні послідовності. Відсоток ідентичності між двома амінокислотними або нуклеотидними послідовностями може бути визначений у різний спосіб, що знаходяться в межах компетенції фахівців у цій галузі, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як 5тіййп Умаїептап АїЇдптепі (тій, Т. Р. апа
М. 5. УУаїептап (1981) У Мої Віо! 147:195-7); "Вевібії" (Зтій апа М/аіептап, Адмапсез іп Арріїєд
Маїшйетаїсз, 482-489 10 (1981)), включеного в сепеМаїспег Ріиз "м, 5спм/аг2 апа Оаупої (1979)
Айаз ої Ргоївіп Зедиєпсе апа бігосіиге, ЮОауної, М. О., ЕЯ рр 353-358; ВІ А5ЗТ програми (Вавіс
Ї оса! АІїдптепі Зеагсп Тоо! (Айбспи!, 5. Е., МУ. Сівп, єї аІ. (1990) У Мої Віо! 215: 403-190), і її видозмін, включаючи ВІ А5Т-2, ВІ АБТ-Р, ВІ АБЗТ-М, ВІАБТ-Х, МО-ВІАБТ-2, АПОМ, АПИмМ-г,
СГО5ТАЇ, і програмне забезпечення Медаїїдп (ЮМАБЗТАК). Крім того, ці досвідчені фахівці можуть застосовувати прийнятні параметри для вимірювання вирівнювання, включаючи алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання уздовж всієї довжини послідовностей, що порівнюються. Загалом, для амінокислотних послідовностей, довжина послідовностей, що порівнюються, повинна становити, щонайменше, 10 амінокислот. Будь-який фахівець з досвідом роботи в галузі має розуміти, що дійсна довжина буде залежати від загальної довжини послідовностей, що порівнюються, і може становити, щонайменше 20, щонайменше 30, щонайменше 40, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 110, щонайменше 120, щонайменше 130, щонайменше 140, щонайменше 150, або щонайменше 200 амінокислот, або це може бути повна (непроцесована) амінокислотна послідовність. Для нуклеотидних послідовностей, довжина послідовностей, що беруться для порівняння, як правило, становлять щонайменше 25 нуклеотидів, однак можуть становити, щонайменше 50, щонайменше 100, щонайменше 125, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 300, щонайменше 350, щонайменше 400, щонайменше 450, або щонайменше 500, або це може бути повна (непроцесована) нуклеотидна послідовність.
Термін ""«каниноспецифічна експресія" нуклеотидної послідовності-мішені відомий з рівня техніки і включає експресію нуклеотидних послідовностей-мішеней переважно в обраних тканинах. Тканиноспецифічна експресія може призводити до експресії нуклеотидної послідовності-мішені лише в обраній тканині, у випадку якої нуклеотидна послідовність-мішень може бути присутня у багатьох тканинах, але експресуватись лише у підсукупності (підмножині) цих тканин. Альтернативно, тканиноспецифічна експресія може призводити до вищих рівнів експресії нуклеотидної послідовності-мішені в обраних тканинах, якщо експресія може також спостерігатись в інших тканинах, то на нижчому рівні, ніж у тканині(ах)-мішені(ях), наприклад, на 50 95 нижче, на 40 95 нижче, на 30 95 нижче, на 25 95 нижче або на 20 95 нижче. Така селективна експресія можлива завдяки впливу одного або більше регуляторних генетичних елементів, наприклад, але не обмежуючись ними, елементів промоторів, елементів репресора, елементів енхансора або інших регуляторних факторів, які можуть взаємодіяти з ДНК та РНК.
Терміни "ген-мішень" або "нуклеотидна послідовність-мішень" є загальновизнаними в галузі та включають нуклеотидні послідовності, які бажано експресувати в одній або більше обраних рослинних тканинах. Необмежуючі приклади генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей, які можуть бути використані у поєднанні зі способами винаходу, включають гени або нуклеотидні послідовності, що беруть участь в асиміляції і/або утилізації азоту, гени або нуклеотидні послідовності, які беруть участь у стійкості до стресу, гени або нуклеотидні послідовності, які беруть участь у стійкості до захворювань та шкідників, і гени або нуклеотидні послідовності, які беруть участь у поглинанні та утилізації поживних речовин. Такі гени або нуклеотидні послідовності добре відомі кожному фахівцеві в цій галузі.
Терміни "оперативний зв'язок" "оперативно зв'язаний" і "функціонально зв'язаний" використовуються тут поперемінно, при посиланні на розташування нуклеотидної послідовності- мішені відносно регуляторної послідовності нуклеїнової кислоти, внаслідок чого експресія нуклеотидної послідовності-мішені контролюється регуляторною послідовністю. Ця регуляторна послідовність може виявляти позитивний вплив (підвищувати) на експресію гена-мішені або бо нуклеотидної послідовності (напр., регуляторна послідовність - це промотор або енхансерний елемент), або регуляторна послідовність може зменшувати експресію гена-мішені або нуклеотидної послідовності (напр., регуляторна послідовність - це елемент репресора).
Регуляторна послідовність може фізично бути розташована на 5" або 3" кінцях гена-мішені або нуклеотидної послідовності, може бути всередині кодуючої послідовності гена-мішені або нуклеотидної послідовності, або може міститись на інтроні в межах гена-мішені або нуклеотидної послідовності.
Термін "нульові лінії" є загальновизнаним у галузі і включає рослини, які були вирощені в культурі тканин, але не несуть трансгена або селективного маркера.
Тут описується отримання рослин, які експресують один або більше генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей у тканиноспецифічний спосіб. У деяких втіленнях, винахід забезпечує насіння, яке містить один або більше генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей під контролем промоторного елемента, який специфічно ініціює тканиноспецифічну експресію гена або нуклеотидної послідовності. У деяких втіленнях, способи винаходу дозволяють отримання рослин, які мають одну або більше бажаних ознак або властивостей у обраних тканинах; напр., здатність специфічно змінювати генетичні і/або фізіологічні властивості плодів або коренів рослин. Деякі втілення винаходу, крім того, забезпечують способи отримання рослин, які виявляють коренеспецифічну або листкоспецифічну експресію однієї або більше бажаних нуклеотидних послідовностей, з використанням елемента промотора РВри!.
Способи винаходу для отримання рослин, які мають тканиноспецифічну експресію одного або більше генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей, втілюються через застосування генетичного регуляторного елемента, який ініціює тканиноспецифічну експресію гена(ів)- мішені(ей). Активність регуляторних елементів може бути негативною або позитивною: тканиноспецифічний промотор рослини або енхансерний елемент дозволяють експресію гена- мішені або нуклеотидної послідовності(тей) в одній або більше специфічних тканин, тоді як тканиноспецифічний репресор рослини пригнічує експресію генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей в одній або більше специфічних тканин; натомість експресія в іншій тканині (ах) не припиняється. З метою впровадження винаходу, слід розуміти, що послідовності промотора утворюють кращі генетичні регуляторні елементи винаходу.
Зо Тканиноспецифічні промотори, що використовуються у цьому винаході, можуть бути гомологічні або гетерологічні стосовно рослини, до якої вони використовуються. Промотори, які ініціюють експресію оперативно зв'язаного гена або нуклеотидної послідовності в одній або більше рослинній тканині, однак виключають можливість експресії зчепленого гена або нуклеотидної послідовності в одній або більше рослинній тканині, можуть бути використані у способах і конструкціях винаходу. Прийнятні рослинні клітини включають, але не обмежені ними, напр., корінь, листок, пелюстку, чашолисток, тичинку, пиляк, приймочку, зав'язь, стовпчик, епідерміс, флоему, ксилему, кору, серцевину, камбій, стебло або стовбур, кореневі волоски, черешок, плід і бульбу.
Переважно, промотор - РВрі1 промотор. Згідно з деякими втіленнями винаходу, промотор є
РВрії промотором, що має нуклеотидну послідовність, яка є значною мірою ідентичною до послідовності, що представлена у ЗЕО ІЮ МО:1 (Фігура 13).
Будь-якому фахівцеві з досвідом роботи в галузі має бути зрозуміло, що можуть бути зроблені модифікації промоторів, які використовуються у способах та конструкціях винаходу, для того щоб оптимізувати або змінити активність промотора. Численні копії відібраного промотора можуть бути оперативно зв'язані з єдиним геном-мішенню або нуклеотидною послідовністю, що призводить до зміни рівня експресії зчепленого гена або нуклеотидної послідовності, або відібраний промотор може бути оперативно зв'язаний з одним або більше генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей, в результаті чого експресія кожного гена- мішені або нуклеотидної послідовності узгоджено регулюється. Промотор може мати будь-який розмір, прийнятний для забезпечення тканиноспецифічного функціонування промотора.
Промотор може бути модифікований (напр., шляхом мутагенезу, делеції, інсерції або внаслідок усічення), для того щоб змінити ступінь, до якого оперативно зв'язаний ген або нуклеотидна послідовність експресуються в обраній тканині, або для того щоб змінити специфічність експресії в тканині, ініційованої промотором. Далі, розміщення промотора по відношенню до оперативно зв'язаного гена-мішені або нуклеотидної послідовності, може бути змінене (напр., переміщене далі, або розташоване ближче), для того щоб досягти бажаного рівня промотор- спрямованої експресії.
Промотор може контролювати експресію оперативно зчепленого гена або нуклеотидної послідовності в одній або більше відібраних тканин рослини, а також ініціювати експресію гена бо або нуклеотидної послідовності у відповідь на специфічні фізіологічні умови або умови навколишнього середовища. Наприклад, промотори можуть бути активовані за умов стресу (напр., водного стресу, сольового стресу, температурного стресу, окиснювального стресу, рн- стресу, або стресу, викликаного важкими металами), за умов дефіциту поживних речовин, за умов впливу захворювань та шкідників. В іншому прикладі, промотори можуть бути активовані під впливом специфічних умов розвитку (напр., під час пагоноутворення, плодоношення або утворення насіння) або у відповідь на зміну умов оточуючого середовища (напр., від умов дефіциту поживних речовин до їх надходження або від гіпоксії - до нормоксії).
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує конструкції, що включають ген-мішень під контролем РВрі1 промотора, який при трансформації в прийнятній клітині-господарі, призводить до тканиноспецифічної експресії генного продукту. Наприклад, експресія може переважно відбуватись у коренях і/або в пагонах рослини. У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує конструкції, які включають ген-мішень під контролем РВрі1 промотора, який при трансформації в прийнятній клітині-господарі, призводить до регульованої в процесі розвитку експресії генного продукту.
Ген-мішень або нуклеотидна послідовність винаходу є ген або нуклеотидна послідовність, яку бажано експресувати в рослині. Загальні класи генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей, які можуть переважно бути використані у способах та конструкціях винаходу, включають гени або нуклеотидні послідовності, що кодують структурні білки рослин, гени або нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у транспорті і/або поглинанні поживних речовин, гени або нуклеотидні послідовності, що кодують ферменти і білки, які беруть участь в утилізації поживних речовин, гени або нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у стійкості рослин до гербіцидів, гени або нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у стійкості рослин до нематод, вірусів, комах або мікроорганізмів; гени або нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у стійкості рослин до стресів (напр., осмотичного, температурного, рН-стресу або окиснювального стресу), гени або нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у стимуляції або відновленні росту рослини, або гени чи нуклеотидні послідовності, що кодують білки, які беруть участь у фіторемедіації. Крім того, ген-мішень або нуклеотидна послідовність можуть бути нуклеотидною послідовністю, яка при транскрибуванні є антисмисловою до природної послідовності,
Зо транскрипцію та трансляцію якої бажано пригнічувати.
У деяких втіленнях винаходу, гени-мішені або нуклеотидні послідовності є такими, що кодують ферменти, які беруть участь в асиміляції і/або метаболізмі азоту. Гени або нуклеотидні послідовності, що становлять інтерес, можуть включати гени або нуклеотидні послідовності, які кодують більки, які беруть участь в асиміляції амонію в амінокислотах або використанні утворених амінокислот у реакціях біосинтезу, що являє собою "білок, який відповідає за утилізацію азоту". Приклади білків, які відповідають за утилізацію азоту, включають, але не обмежені ними, нітрат амонію і транспортери амінокислот, глутамінсинтазу (5), аспарагінсинтазу (АБ), глутаматсинтазу (відому також як глутамат 2:оксоглутурат амінотрансфераза і СОСАТ) аспарагіназу (АМ5), глутаматдегідрогеназу (СОН), аспартатамінотрансферазу (А5рАТ) і аланінамінотрансферазу (АїаАТ) і ті гени або нуклеотидні послідовності, які можуть бути залучені до визначення ефективності використання азоту (МОЕ), як описано Веацйу еї аї. (2009), та у Патенті США Мо 7,589,257. Послідовності прийнятних генів- мішеней і нуклеотидні послідовності є легко досяжними з публічних джерел, наприклад з генного банку СепВапк, або можуть бути визначені за допомогою стандартних методик, добре відомих фахівцям у цій галузі.
Ген-мішень або нуклеотидна послідовність можуть бути геном або нуклеотидною послідовністю, які природно експресуються в обраній рослині, або вони можуть бути гетерологічними щодо відібраної рослини. Ген або нуклеотидна послідовність можуть походити з цілої низки джерел, включаючи, вірусні, бактеріальні, рослинні або тваринні джерела.
Деякі втілення винаходу забезпечують генетичні конструкції, які включають ген-мішень або нуклеотидну послідовність, оперативно пов'язані з РВгрі1 промотором. У деяких втіленнях, ген або нуклеотидна послідовність є гетерологічними до РВгр1 промотора, з яким вони зчеплені.
Ген-мішень або нуклеотидна послідовність може бути модифікована у випадку необхідності.
Наприклад, ген або нуклеотидна послідовність модифікуються, для того щоб бути прийнятними для транскрипції та трансляції в рослинній системі, наприклад, за допомогою оптимізації кодону. У деяких втіленнях, ген або нуклеотидна послідовність можуть бути модифіковані таким чином, що вони містять всі необхідні послідовності поліаденилювання, сайти ініціації та термінації, які дають змогу кодуючій послідовності бути транскрибованою в інформаційній (матричній) рибонуклеїновій кислоті (МРНК) і мРНК - бути трансльованою у функціональний 60 білок в обраній рослинній системі.
Таким чином, деякі втілення винаходу забезпечують генетичні конструкції, які включають ген-мішень або нуклеотидну послідовність, функціонально пов'язані з РВгр1 промотором і також включають одну або більше послідовностей поліаденилювання, сайти ініціації і/або термінації транскрипції. Такі модифікації гена-мішені або нуклеотидної послідовності і способи, за допомогою яких вони можуть бути створені, добре відомі з рівня техніки. У деяких втіленнях, ген-мішень або нуклеотидна послідовність кодує білок, який відповідає за утилізацію азоту, наприклад, транспортер азоту, транспортер амонію, траспортер амінокислоти, глутамінсинтазу (05), аспарагінсинтетазу (А5), глутаматсинтазу (відому також як глутамат 2:оксоглутурат амінотрансферазу і СБОСАТ), аспарагіназу (АМ5), глутаматдегідрогеназу (СОН), аспартатамінотрансферазу (А5рАТ), або аланінамінотрансферазу (АіїаАТ). Інші приклади включають ті гени або нуклеотидні послідовності, які можуть брати участь у ефективності використання поживних речовин (МОЕ), як описано Веацу еї аї. (2009), і в Патенті США Мо 7,589,257.
У деяких втіленнях, цей винахід забезпечує вектори, що включають генетичні конструкції.
Будь-який фахівець у цій галузі розуміє, що застосування чітко визначеного вектора не є критично важливим для даного винаходу і прийнятні вектори легко можуть бути відібрані досвідченою особою. Приклади експресуючих векторів та клонуючих носіїв включають, але не обмежені ними, вірусні частинки, бакуловіруси, фаги, плазміди, фагміди, косміди, фозміди, штучні бактеріальні хромосоми, ретровірусні вектори, вірусну ДНК (наприклад, вірусу вісповакцини, аденовірусу, вірусу курячої віспи, РКМ-вірусу і похідних 5М40), штучні хромосоми на основі РІ'1, дріжджові плазміди, штучні дріжджові хромосоми та інші відомі вектори, специфічні для специфічних клітин-господарів, що становлять інтерес.
Деякі втілення забезпечують клітини-господарі, які включають генетичні конструкції або вектори згідно з винаходом. Генетична конструкція або вектор може бути інтродукований в прийнятну клітину-господаря за допомогою цілої низки стандартних методів. Такі методи добре відомі з рівня техніки і включають, наприклад, стабільну або транзієнтну трансфекцію, ліпофекцію, електропорацію і введення рекомбінатних вірусних векторів. Кожен фахівець з досвідом роботи у цій галузі має зрозуміти, що добір прийнятної клітини-господаря буде залежати від обраного вектора. Приклади клітин-господарів включають, але не обмежені ними, бактеріальні, дріжджові, рослинні клітини, клітини комах та ссавців. У деяких втіленнях, клітина- господар - це рослинна клітина.
Способи і генетичні конструкції, тут розкриті, можуть бути використані для створення рослини або частини рослини будь-якого виду, здатного використовувати промотор, внаслідок чого трансгенна (неприродна) рослина, має тканиноспецифічну експресію одного або більше бажаних генів або нуклеотидних послідовностей. Винахід призначений для конкретного застосування щодо, наприклад, рослин сільськогосподарських культур (особливо тих, що належать до роду Огуга), декоративних рослин, і дерев (зокрема, шпилькових та представників роду Роршив5). Особливо прийнятні рослини для практики в цьому винаході включають, але не обмежені ними, канолу, ячмінь, цукрову тростину, кукурудзу, тютюн, сою, бавовник, люцерну, томати, пшеницю, картоплю, осику, тополю та дерева шпилькових порід, або частини будь-яких з цих рослин, наприклад, корені, кореневі кінчики, листки, стебла, квітки, апікальні бруньки, меристематичні тканини тощо. У деяких втіленнях, рослин для застосування у винаході включають канолу, ячмінь, маїс, рис, тютюн, сою, бавовник, люцерну, томати, пшеницю, картоплю, і деякі роди дерев, включаючи шпилькові та види Рориїи5.
У деяких втіленнях, способи, використання та конструкції винаходу застосовуються щодо рослин роду Огула та інших родів, що є близько спорідненими з Огула, такими як Рогегевзіа і
Ї еегвіа. Приклади видів з цих родів включають, але не обмежені ними, Огула заїїма, Огуа рипсіаїа, Огула опПісіпаійє, Огула таіари2папепві5, Огула Іайоїйа, Огула айзігаійеєпвів, Огуа ргаспуапіна, Огуга дгапціайе, Огуга Іопдідіштів, Огуга 5спіІеснієгі, Ропегевзіа соагсіаїйа, І еегзіа реггієгі, І еегбіа пехапага та І! еегіа гі5зегапнці.
Трансгенна (неприродна) рослина, частини рослини і насіння, отримані згідно з даним винаходом, можуть бути далі використані у селекційних програмах для отримання видів рослин, які мають більше, ніж одну бажану властивість. Наприклад, дві трансгенні рослини винаходу, кожна з-поміж яких має експресія бажаного трансгена в різних тканинах рослини, можуть бути схрещеними для отримання в потомстві трансгенних рослин, які мають тканиноспецифічну експресію обох трансгенів; або дві трансгенні рослини винаходу, кожна з яких має експресію різних бажаних трансгенів у тій же рослинній тканині, можуть бути схрещеними для того, щоб отримати у потомстві трансгенні рослини, які мають тканиноспецифічну експресію обох трансгенів. У такий спосіб можливо отримати трансгенні рослини, що мають комбінацію 60 бажаних властивостей у обраній тканині (ах) рослини.
До того ж, будь-якому фахівцеві з досвідом роботи у галузі має бути зрозуміло, що різні види рослин можуть бути більшою чи меншою мірою прийнятними для генетичних маніпуляцій загалом, і що, відповідно, передусім бажано спочатку трансформувати споріднені види бажаних рослин за допомогою способів і конструкцій винаходу, а потім вже індукувати тканиноспецифічну експресію гена-мішені або нуклеотидної послідовності у бажаних видів рослин шляхом селекційних методик. Такі методики і прийнятні споріднені види рослин добре відомі кожному досвідченому фахівцеві у цій галузі.
Рослинні клітини або протопласти, які були трансформовані за допомогою генної конструкції даного винаходу, можуть бути регенеровані в диференційованих рослинах за допомогою стандартних живильних середовищ, доповнених гормонами, що індукують розвиток пагонів та коренів, використовуючи методи, загальновідомі фахівцям з досвідом роботи в галузі (див., наприклад, Патент США Мо 4,634,674 і представлені тут посилання). Насіння може додатково бути зібране з таких трансгенних рослин за допомогою загальновідомих методів та використане у подальшому для репродукції трансгенних рослин та гібридів винаходу.
Застосування
Способи і конструкції винаходу роблять можливим отримання рослин і насіння, які мають експресію одного або більше бажаних генів або нуклеотидних послідовностей, наприклад, в одній або більше відібраних тканин рослини. Таким чином, у деяких втіленнях, способи і конструкції винаходу дозволять отримати рослини, які мають одну або більше бажаних ознак, забезпечуючи у такий спосіб спрямування ознаки до тканини, яка є для неї найбільш прийнятною, або внаслідок уникнення експресії бажаного гена або нуклеотидної послідовності, якщо їх вплив є небажаним. Існує широкий спектр специфічних втілень винаходу, включаючи, але не обмежуючись цим, отримання рослин, які мають підвищену врожайність, стійкість до стресу, які мають покращену здатність до поглинання поживних речовин і/або її утилізації, які мають покращений вміст поживних речовин і/або врожай (вихід) бажаних складових, і які мають фіторемедіаційні властивості. Специфічні втілення винаходу наводяться нижче.
Одне застосування винаходу полягає у отримання рослин, краще пристосованих до розвитку на бідних грунтах. Добре відомо з рівня техніки, що деякі види рослин, особливо рослини сільськогосподарських культур, виснажують грунт, споживаючи поживні речовини,
Зо необхідні для забезпечення постійного росту, такі як азот, фосфор і калій. Для того щоб відновити втрату поживних речовин, необхідно або вносити добриво в грунт (витратна практика, яка завдає шкоди навколишньому середовищу) або культивувати рослини, відомі своєю здатністю відкладати в грунт спожиті поживні речовини (напр., конюшина або соя у випадку виснаження вмісту азоту), якими можуть бути сільськогосподарські культури, що є менш прибутковими або менш поживними і, відповідно, їх вирощування є менш бажаним. Часте внесення добрива у грунт потребує значних витрат з точки зору вартості сільськогосподарської продукції, таких як оплата праці та пального; з цієї причини рослини сільськогосподарських культур знаходяться, як правило, або в стані надлишку поживних речовин, або їх дефіциту. Інше втілення винаходу полягає в отриманні рослин, краще пристосованих до захоплення та утилізації азоту, якщо він присутній у адекватній чи достатній кількості у грунті, до того, як відбувається втрата азоту через вилужування (вимивання), випаровування або мікробну деградацію.
У деяких втіленнях, способи винаходу дають змогу здійснювати цільову експресію генів або нуклеотидних послідовностей, що беруть участь у поглинанні поживних речовин (напр., транспорту молекул) до тих тканин, у яких це поглинання відбувається (напр., коренів або кореневих волосків), покращуючи таким чином здатність рослини абсорбувати поживну речовину з оточуючого середовища. В деяких втіленнях винахід може бути використаний для отримання рослин, які експресують гетерологічні нуклеотидні послідовності, пов'язані з утилізацією поживних речовин, або оптимізовані (наприклад, оптимізовані для рослинної експресії) природні нуклеотидні послідовності, що відповідають за утилізацію поживних речовин, які сприяють ефективнішому використанню поживної речовини, в результаті чого зменшується потреба у поживній речовині для нормального росту і функціонування рослини. У деяких втіленнях, експресія таких послідовностей спрямовується до певних тканин (напр., коренів або листків). У деяких втіленнях, способи винаходу роблять можливою експресію генів або нуклеотидних послідовностей, що беруть участь у використанні та поглинанні поживних речовин, які зазвичай не використовуються рослиною у цих рослинних танинах, які безпосередньо відкриті для різних поживних речовин (напр., кореня і листка). У такий спосіб можуть бути отримані рослини, які здатні рости і добре розвиватись на різних джерелах поживних речовин (напр., різних джерелах азоту). Особливо цінні гени-мішені або нуклеотидні бо послідовності для оптимізації ефективності використання азоту рослинами включають:
транспортери нітрату, транспортери амонію і траспортери амінокислот, глутамінсинтазу (5), аспарагінсинтетазу (АБ), глутаматсинтазу (відому також як глутамат 2:оксоглутуратамінотрансфераза і СОСАТ), аспарагіназу (АМ5), глутаматдегідрогеназу (СОН), аланіндегідрогеназу, аспартатамінотрансферазу(А5рАТ) їі аланінамінотрансферазу (АїаАТ), а також ті гени або нуклеотидні послідовності, які можуть брати участь у визначенні ефективності використання поживних речовин, описані Веацу еї аї. (2009) і в Патенті США Ко 7,589,257.
У деяких втіленнях рослини, отримані за допомогою способів цього винаходу, можуть більш ефективно використовувати внесені добрива за рахунок швидкого засвоєння азоту з добрива і накопичення його протягом часу застосування, зменшуючи тим самим кількість азотних добрив, які втрачаються в результаті вимивання тощо. Це може дати змогу зменшити кількість азотних добрив, потрібних для внесення під сільськогосподарські культури, для того щоб отримати врожаї, які можна порівняти з врожаями, які можна отримати при застосуванні звичайних методів культивування, і рослин, що не були модифіковані відповідно до даного винаходу.
Додаткові агрономічні переваги можуть включати швидший ріст та збір врожаю, де внесення азотних добрив підтримується на рівнях, що використовуються при загальноприйнятих способах культивування сільськогосподарських культур.
Створення зернових сільськогосподарських культур
Як описується нижче, трансформовані рослини Огу;ла заїїма, що ектопічно експресують нуклеотидну послідовність, яка кодує ферменти, що беруть участь в асиміляції або метаболізмі азоту, наприклад, але не обмежені ними, аланіндегідрогеназу, глутамінсинтазу, аспарагінсинтетазу, глутаматсинтазу, аспарагін азу, глутаматдегідрогеназу, аспартатамінотрансферазу, аланінамінотрансферазу, і ті нуклеотидні послідовності, які беруть участь в ефективності використання поживних речовин, описані Веайу еї аї. (2009), і в Патенті
США Мо 7,589,257, були створені за допомогою РВрг1 промотора і вирощені в лабораторних умовах, для того щоб визначити, чи може бути отриманий позитивний вплив на ріст рослин та врожайність у контрольованих умовах. Наприклад, було досліджено, чи впливає кількість доступного азоту на біомасу рослини і врожайність насіння у рослин, що експресують
РВрі1/АІіІадТ, вирощених в лабораторних умовах, у порівнянні з подібними рослинами, які ектопічно не експресують нуклеотидну послідовність-мішень.
Зо Було досліджено врожайність насіння у контрольних і трансгенних рослин, вирощених в лабораторних умовах. Трансгенні рослини, які експресують ген або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції або метаболізмі азоту, виявили вищу біомасу і врожайність насіння, ніж контрольні рослини, за умови наявності адекватної кількості азоту.
Узагальнені результати свідчать про те, що трансгенні рослини, які ектопічно експресують фермент, що бере участь в асиміляції або метаболізмі азоту, здатні оптимізувати використання наявного азоту при різноманітних умовах навколишнього середовища, що призводить до збільшення біомаси рослини, підвищення врожайності або до обох цих показників.
Таким чином, в одному аспекті, цей винахід забезпечує спосіб для збільшення врожайності насіння, який включає; трансформацію рослини за допомогою гена-мішені або нуклеотидної послідовності в оперативному зв'язку з елементом промотора РВргї, для отримання трансформованої рослини; ген-мішень або нуклеотидну послідовність, які кодують фермент, що бере участь в асиміляції або метаболізмі азоту; і вирощування трансформованої рослини.
Наведений вище опис не має на меті обмежити формулу винаходу жодним чином, тим більше, обговорена сукупність особливостей може не бути абсолютно необхідною для винахідницького рішення.
Для того щоб досягти кращого розуміння винаходу, який тут описано, наведено наступні приклади. Слід зрозуміти, що ці приклади призначені для того, щоб в ілюстративному вигляді описати втілення винаходу, і не мають на меті жодним чином обмежити сферу застосування винаходу.
ПРИКЛАДИ
ПРИКЛАД 1: Промотор РВрІт, злитий з геном аїаАаТ
Конструювання бінарних векторів і трансформація, опосередкована Адгобасіегійт
Був обраний РВрігї промотор і сконструйований для клонування за допомогою СепеАгі (Іпмігодеп, І їе Тесппоіодієх, Карлобад, Каліфорнія, США). НмАІіаАТ КкДНК (ЗЕО ІЮО МО: 2) була введена в рСАМВІАТ300 за допомогою РеШЦ/Ніпапй зшивки, тоді як РВргї промотор був вставлений вище НуА|ПаАТ для ініціювання експресії з використанням ЕсокКіІ/зЗасі сайтів (Фігури 1,13,14). Промотор РВрІг1 був введений в РСАМВІА1305.1, щоб ініціювати ЗО5ріи5 для аналізу паттерна промотора з використанням ЕсоКіІ/Мсо! сайтів. Конструкції були трансформовані окремо у штамі Адгобасієгішт Іштеїасіеєпе ЕНАТО5 за допомогою методу заморожування- бо розморожування (Уеїде! апа СіІагергоок, 2002). Калус рису (Огула займа с.м. Мірропраге (МВ))
був трансформований з використанням обох конструкцій за допомогою системи трансформації на основі Адгобасіегішт, розробленої в нашій лабораторії (Зпгаулаї апа Соод, 2011). Лінії, трансформовані за допомогою РВрі1:НмиАїаАТтТ, названі тут як РВрІт1 лінії, натомість лінії, трансформовані за допомогою РВрі1:зИ5ріи5, називаються тут як РВріт1О лінії.
Лінії трансформовані за допомогою РВрг1:НмАїаАТ, були раніше названі Ар «лінії.
Відповідність між попередньою номенклатурою та номенклатурою, яка тут використовується, представлена в Таблиці 1. Аналогічно, лінії трансформовані з використанням РВрі1:зИ5рісив, раніше мали назву Арос ліній.
Виходячи з урожайності насіння, загальної надземної біомаси і кількості пагонів при достиганні, були відібрані дві То лінії, які містять РВрг1:НуАЇаАТ, для отримання наступних генерацій. Тканина листка була відібрана у двотижневих рослин для визначення, чи є вони трансгенними, шляхом аналізу геномної ДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з використанням праймерів, специфічних до гена резистентності до гігроміцину. Були відібрані, виходячи з однакового розміру та висоти, трансгенні рослини і "нульові сегреганти" для отримання наступних поколінь. Первинні трансгенні лінії були позначені, як То лінії.
Грунтові експерименти у кліматичній камері
То, Ті, ї Т» генерації рослин рису вирощували у безгрунтовій суміші З,п5піпе Міх 24 (З!ип Ого
Ногпісикиге) у кліматичній камері при 28 "С, відносній вологості 70 956, тривалості фотоперіоду 14г/10г світло/темрява, щільність світлового потоку 750 мкКЕ на рівні стелажа, як описано у
З Ппауаї вї а!., 2008.
У Тз покоління, три насінини були пророщені у 7-дюймовому горщику і вирощувались протягом двох тижнів. Два з-поміж трьох сіянців були відібрані, виходячи з однорідної висоти і розміру рослин, що залишались у кожному горщику. Режим підживлення був аналогічним тому, який було застосовано щодо рослин Т» покоління у З-тижневому віці. Всі статистичні порівняння були виконані для цих результатів експериментів у кліматичній камері з використанням 5ішдепі ї-тесту.
Гідропонний експеримент у кліматичній камері
Гідропонний експеримент було проведено в кліматичній камері при 28 "С, вологість 70 Ор, фотоперіод 14г/10г світло/темрява, щільність світлового потоку 750 мкмЕ на висоті полиці, як описано у Зпгамаї єї а!., 2008. Рослинний матеріал відбирали з 28-денних і 52-денних рослин для кількісного аналізу АгаАТ і РНК експериментів.
Селекція гомозиготних ліній і підтримання нульових ліній
Т2 насіння, отримане від Ті рослин, пророщували на середовищі М5 з гігроміцином; визначали співвідношення стійкості до антибіотика, для того щоб з'ясувати співвідношення гомозиготність/гетерозиготність, як описано у зЗпгаучаї єї а!., 2008. "Нульові лінії" ідентифікували за допомогою ПЛР на стадії рослин Т: з використанням праймерів, специфічних до гігроміцину.
Відповідно, були відібрані та підтримувались "нульові лінії" для порівняння між МВ, АСК1/7 і
РВрі!1 лініями.
Екстракція АІіаАТ та імуноферментний аналіз
Тканини як пагонів, так і коренів були зібрані для імуноферментного аналізу АІаАТ в умовах гідропонного експерименту, тоді як у рослин, що вирощувались у горщиках, була відібрана лише тканина пагона, як це рекомендовано Миепсі апа сова, 1994.
Електрофорез білка в поліакриламідному гелі (52О5-РАСЕ) та Вестерн-блот аналіз
Для того, щоб підтвердити результати імуноферментного аналізу АїаАТ, 5О5-РАСЕ електрофорез та Вестерн-блоттинг були виконані за допомогою протоколу Миепсп апа Соса (1994).
Екстракція РНК, синтез кДНК і полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) у режимі реального часу
Екстракція РНК, синтез кДНК і кількісна ПЛР в режимі реального часу була проведена за допомогою протоколу Веайцу еї. аіІ., 2009. Генспецифічні праймери і пари зондів, попередньо використані Веацу еї аї. (2009), були застосовані для того, щоб виявити відмінності у генній експресії через надекспресію НуАІаАТ. МВ рослини були використані як негативний контроль, а 185ГРНК була використана як ендогенний контроль.
Біоінформаційний аналіз промотора
РВргї нуклеотидна послідовність була обрана, грунтуючись на гомології з О5АМТ1 промотором, з використанням програм ВІГАб5Тп Національного центру біотехнологічної інформації (НСВІ); далі вона була досліджена за допомогою генних біоінформаційних засобів
Сепбапк і Кеїзед МСВІ.
Ии5 гістохімічне забарвлювання бо Загалом 20 насінин Ті трансгенних ліній РВрі1:зОЗріи5, названих РВрг1с лінії, були стерилізовані та пророщені на стерильному рідкому середовищі М5 (4,4 г Ли, рН 5,8) для забарвлювання. Для кожної лінії були відібрані п'ять насінин на кожному етапі відбору зразків для забарвлювання. Сіянці були відібрані на 3-їй день після проростання (ДПП) і від 7 до 10
ДПП і забарвлені для 5ИЗ5 експресії.
РЕЗУЛЬТАТИ:
Врожайність насіння гетерозиготного То і попередній скринінг біомаси
На стадії То, незалежні РВрі1 рослини мали вищу надземну біомасу і врожайність насіння у порівнянні з МВ (Таблиця 1). Дві незалежні РВргї лінії були відібрані, беручи до уваги високу врожайність насіння і біомасу, для відтворення цих ознак у Т: поколінні. При порівнянні шести ліній, відібраних з МВ, вони мали значно вищу врожайність насіння (р«е0,001) і надземну біомасу (р-0,001) у порівнянні з МВ.
Таблиця 1
Висота рослин, біомаса і урожайність насіння То РВрі! рослин та нетрансформованих Мірропраге рослин. СВ означає стандартне відхилення
Зміни . загальної Й Зміни | Загальна що Попередня Висота | Загальна надземної Врожай- врожайності) надземна
Лінії назва ліні Рослини надземна| біомаси ність насіння біомаса (см) | біомаса (г) порівняно насіння (г)| порівняно з без з МВ, 95 МВ, о насіння (г)
РВри-3 Ар | 865 | 11,6 | 6 | зи | -20 | 847
РВри-8 ЇАрі5 | 792 | 142 | 30 | 427 | 9 | 993
РВри-ї2 Арі | 872 | 203 | 86 | 831 | 113 | 1199
РВри-ї18 ЦАра5 | 673 | 135 | 24 | 425 | 9 | 925
РВри-2го Арг7 | 854 | 1,7 | .К«КйЗТ | 416 | 6 | 754
РВри-2г! |Ара8 | 860 | 174 | 60 | 733 | 87 | 10,07
РВри-2г2 Арго | 76,0 | 214 | 96 | 750 | 92 | 139 середнє | | 780 | 141 | 39 | 545 | 40 | 970 св' ЇЇ 77/71 68 | 363 | 2 щБх | 205 | щ -хБ | 162
Мірропрає | | 752 | 109,.1Й. и 591 | щЩщ (Б | 703 св ЇЇ 77777171 63 | 2717 | щющЦБ. 1 163 | щ(Б | 125
Попередній скринінг врожайності насіння і біомаси гетерозиготних ліній Ті РВргі
Для подальшого фенотипового аналізу і для отримання гомозиготного насіння, рослини
РВрі1-11 і РВрг1-21 ліній Тіпокоління вирощували до настання дорослої стадії; були зібрані дані стосовно біомаси та врожайності насіння. РВрг1-11 і РВрг1-21 мали значно вищу надземну біомасу, ніж МВ (р«е0,05) ії АОМК1/7 (р«е0,001) (Фігура 2). З точки зору утворення насіння, РВрг1-11 і РВрі1-21 мали значно вищу врожайність насіння, ніж МВ (р«0,05).
Аналіз біомаси та врожайність насіння рослин гомозиготних лінії, вирощених у кліматичній камері
Тег гомозиготні РВрг1 лінії були вирощені у грунтових умовах до настання дорослої стадії, після чого були зібрані дані щодо загальної надземної біомаси та врожайності насіння (Фігура 4). Дві з-поміж п'яти РВрі1 ліній мали вищу надземну біомасу, ніж МВ. Лише одна серед цих ліній, РВрг1-21, мала істотно більшу, ніж МВ ії АСК1/7 біомасу (р «0,001). Було показано, що
РВрі1-10 ї РВрг1-11 мали вищу врожайність насіння, ніж МВ та АСК 1/7, однак ці відмінності були неістотними (р»0,05).
Надземна біомаса гомозиготних РВрг! ліній у поколінні Тз
Гомозиготні РВргї Тз рослини були зібрані через 52 ДПП, для того щоб оцінити зміни біомаси на різних стадіях розвитку (Фігура 5). Рослини РВрг1-11 і РВрг1-21 ліній мали вищу суху надземну масу, ніж МВ і "нульові лінії" на 52 ДПП. РВрг1-21 мали значно вищу надземну масу, ніж як МВ, так і "нульові лінії" (р«0,03). РВрі1-11-2М рослини мали надземну біомасу, подібну до
МВ, що узгоджується з результатами попередніх експериментів у Ті і Т» поколіннях. РВрг1-11, з іншого боку, мали вищу біомасу, ніж МВ та "нульові лінії".
Біомаса, врожайність насіння та МОЕ у рослин РВрі!
Рослини РВрг1-21, потягом всіх трьох поколінь, мали значно вищу надземну біомасу, ніж
МВ. У Ті ї Т» поколіннях, РВрг1-21 призводить до формування більшої надземної біомаси, ніж
АСКІ1/7, однак, ця різниця не є суттєвою (Фігура 2 і 4). РВрг1-11 також виявили стійку тенденцію до розвитку вищої надземної біомаси, ніж МВ у Т|. і Тз поколіннях, але не в Т» поколінні (Фігури 2, 4 і 5). У всіх поколіннях, РВрг1-21 мали вищу врожайність насіння, ніж МВ ії АСК1/7; натомість
РВрі1-11 мали вищу врожайність насіння, ніж МВ в Т', але не в Т2поколінні.
Продуктивність пагонів Т: РВрг!1 ліній
Крім вимірювання біомаси і врожайності насіння, на стадіях стиглості була визначена кількість продуктивних і непродуктивних пагонів. Продуктивність пагоноутворення і висота рослини були відмічені лише у рослин, вирощених у грунтових умовах. Була визначена продуктивність пагоноутворення у рослин РВргї ліній у порівнянні з АСКІ/7 і МВ; було встановлено, що всі РВрг!1 лінії мали більше пагонів і більше продуктивних пагонів, ніж рослини дикого типу сорту МВ (Фігура 3). РВрг1-11 ії РВрг1-21 мали істотно (р«0,01) більше пагонів і більше продуктивних пагонів, ніж АСК1/7. РВрі1-11 мали найвищу загальну кількість пагонів і продуктивних пагонів серед всіх РВріг!і ліній, АСК1// і МВ. Це узгоджувалось з іншими параметрами, що оцінюють загальний розмір рослини, оскільки рослини РВрг1-11 лінії були найбільшими серед усіх інших РВрі1 ліній. У порівнянні з АСК1/7, РВрі1-11 і РВрг1-21 мали значно більше продуктивних пагонів (р«е0,05).
Ті скринінг щодо АїЇаАТ активності для надекспресії НуАїаАТ у рослин, які вирощуються у грунтовій культурі
Зо Пагони РВрі1 рослин Ті покоління, вирощених у грунті, були зібрані у проміжок часу між активним кущінням і стадією максимального кущіння (40 ДПП), для того щоб визначити їх специфічну АаАТ активність. Різні РВри лінії мали від 2,5 до 8 разів вищу активність АаАТ у пагонах порівняно з "нульовими сегрегантами" і МВ (Фігура 6). Специфічна активність АїаАтТ була найвищою у РВріі-12 і РВрі1-21 при значеннях від 3,3 до 4,3 мкмолів МАОН хв" мг білка.
АСК1/7, яка містить О5БАМТ1:НуАІаАТ, мала вищу специфічну активність АПїаАТ, ніж "нульові лінії»і МВ, що узгоджується з даними Зпгаумаї єї аї!. (2008). З-поміж всіх РВрі1 ліній лише РВрг1- 12 мала вищу середню специфічну активність АІаАТ, ніж АСК1/7, але РВрі1-11 і РВрі1-21 мали рівні АІіІаАТ активності, порівнянні з АОК1/7. Використана АСК1/7 була гомозиготною лінією Т»5; натомість протестовані РВрі1 лінії Тї: ще зазнавали розщеплення. "Нульові сегреганти" різних
РВрІи ліній (РВрі1-10-М, РВрі1-11-М, РВрі1-12-М і РВрі1-21-М) мали таку ж активність АіаАТ, що й МВ. Оскільки було підтверджено, що ці лінії дійсно є "нульовими" (не містять інсерта), вони були використані як негативні контрольні лінії.
Аналіз активності Аі(аАТ пагонів гомозиготних рослин Тз, вирощених в умовах грунтової культури
Незалежні рослини генерації Тз від ліній РВрі/1-10, РВрі1-11, РВри1-12 і РВр/і1-21 були ідентифіковані як гомозиготні рослини і вирощувались у кліматичній камері до 52 ДПП, коли зразки тканини були відібрані для визначення АїЇаАТ активності. Тенденції, які спостерігались у
Тз поколінні, узгоджувались з тенденціями, характерними для Ті рослин (Фігура 7). РВріІ! лінії мали до 5,3 разів вищу активність АіаАТ у пагонах, ніж рослини МВ лінії або "нульових ліній".
Відповідно до досліджень рослин Ті покоління, вирощених у грунті, РВрг/1-142 мали найвищу активність АїаАТ, після чого йдуть РВрі1-11 і РВрі1-21, тоді як РВрг1-10 мали найнижчу активність АІаАТ.
Активність АЇіаАТ пагонів гомозиготних рослин Тег, вирощених в умовах гідропонної культури
Для того, щоб оцінити активність АІаАТ у коренях, були відібрані гомозиготні РВрг! лінії для вирощування в гідропонних умовах. Корені та тканина пагона РВрг1 були відібрані на початку активного кущіння (28 ДПП) і в період максимального кущіння (52 ДПП).
А|аАТ активність пагона
РВрі1 лінії виявляють до 8 разів вищу АїЇаАТ активність пагонів у порівнянні з "нульовими лініями" і МВ (Фігура 8). Як на 28 ДПП, так і на 52 ДПП, РВрі1-11 і РВрІі1-21 мали до 1,2 і 1,7 60 разів вищу АїаАТ активність, ніж АОК1/7 відповідно. Активність АіІаАтТ пагона РВріг1-11 і РВрі1-
21 була вищою на 52 день після проростання, ніж на 28 ДПП, тоді як було встановлено, що дІіаАТ активність природних пагонів (РВрі1 "нульові лінії" ї В) дещо знижувалась між 28 і 52 днями після проростання.
Між 28-им і 52-им днями після проростання (ДПП), АіаАтТ активність у пагонах деяких трансгенних, "нульових" і МВ ліній, за якими проводилось спостереження, знижувалась, за винятком РВрі1-21. Для всіх РВрІї ліній, зміни активності АіІ(аАТ між 28 і 52 ДПП становили лише від 1,1 до 1,2 разів.
Активність АЇаАТ у коренях
Не зважаючи на те, що всі РВрг! лінії мали вищу активність АІаАТ в коренях, ніж МВ, подібні рівні активності АіаАТ в коренях були виявлені між РВріи! лініями та їх відповідними "нульовими" сіблінгами (Фігура 9). АСК1/7 була єдиною трансгенною лінією, що мала значно вищий рівень активності АіІаАТ в коренях, ніж всі інші лінії. Однак, було з'ясовано, що активність АїаАТтТ в коренях спадала у всіх випадках на 52-ий ДПП у порівнянні з 28-им ДПП. Це зниження було очевидним у "нульових сегрегантів" та МВ, у яких, як було встановлено, рівні активності АіаАТ в коренях знижувались від 2 до З разів. Менше зниження -- від 1,2 до 1,4 разів - активності АїаатТ в коренях від 28 до 52 ДПП було виявлено у РВрг! лінії і АСК1/7. При зниженні активності АїаАатТ в коренях на 52 ДПП, РВрІи лінії і АСК1/7 мали до З разів вищу АїаАТ активність, ніж МВ і "нульові лінії". Активність АіаАТ у пагонах рослин нетрансгенних ліній була завжди низькою - як на 28-ий, так і на 52-ий ДПП (Фігура 8). Активність АіІаАТ в коренях, з іншого боку, яка була високою на 28 ДПП, різко зменшувалась на 52 ДПП. Загальна активність АіаАТ в коренях у рослин нетрансгенних ліній була завжди була вищою, ніж АІаАТ активність у коренях.
Імуноблоттинг (Вестерн-блоттинг) НуАІаАТ для підтвердження даних аналізу Аіїадт 50 рослин, вирощених за умов грунтової культури, вік яких становив 2 дні, РВрі1 лінії Тз покоління були зібрані для визначення стабільності РВрг!7 промотора у надекспресуючих
НУАаАТ, за допомогою аналізу активності АІаАТ та Вестерн-блоттингу. Згідно з результатами
Вестерн-блоттингу, пагони Тз рослин всіх РВрг1 ліній, які були досліджені, мали високі рівні
АЇаАТ білка (Фігура 10). Крім того, було виявлено, що рівні білка НмАїадТ у АСК1/7 були порівнянними, хочі дещо вищими, з такими у РВрг1 ліній. Це узгоджується з результатами, отриманими в АїаАТ аналізі (Фігура 7). Смуга 52кДа НуАаАТ відсутня у "нульових ліній" і МВ, що свідчить про відсутність НуАІаАТ білка.
Корені рослин Тег покоління, вирощених за умов гідропонної культури, були зібрані на 28 день (Фігура 11). У ліній, які не несуть НмАїаАТ трансгенну інсерцію, НмуАаАТтТ антитіло зв'язувалось з нативною АїаАтТ. Корені РВрії і АОК1//7 утворювали ширшу та інтенсивнішу смугу, яка маскувала дві неспецифічні вужчі смуги, що відповідали нативній АІаАТтТ в ділянці 52кДа (Фігура 11А). Відповідно, корені 28-денних РВрі1 рослин мали вищі рівні НуАїаАТт білка, ніж "нульові лінії" і МВ.
Рівні білка НмАїаАТ у пагонах рослин РВрг! ліній покоління То, вирощених за умов гідропонної культури, були також оцінені на 28 день (Фігура 118). Було встановлено високий рівень білка НмАіаАТ в пагонах всіх РВрг! ліній. Знову ж, АСК1/7 мали той же рівень інтенсивності смуги, що й всі РВрг!1 лінії, що свідчить про високі рівні НуАЇаАТ білка у порівнянні з "нульовими лініями" і МВ. На 28 день, рівні білка НуАЇаАТ були присутні, високі у РВрг! лінії і відсутні у нетрансгенних рослин.
ПЛР аналіз в режимі реального часу (4ВТ-РСК) для визначення змін генної експресії внаслідок надекспресії НуиАїада Т
Рівень експресії мРНК трьох генів-мішеней або нуклеотидних послідовностей (Бапеу АіаАатТ (НУАаАт), збагачені лейцином повтори (І РЕ) і збагачені гліцином білки (СЕР)) були відібрані з переліку генів або нуклеотидних послідовностей, що, як було виявлено, диференційно експресуються при мікро-еррей аналізі, порівнюючи АСК1/7 з МВ (Веацкцу еї аї., 2009).
НУАїаАТ був приблизно від 400 до 1400 разів вищим в експресії мРНК у пагонах рослин Тз покоління, вирощених у грунтових умовах, РВрг1 лінії і АСК1/7, у порівнянні з МВ, за винятком "нульових ліній", які не експресують диференційовано НуАїаАТтТ у порівнянні з МВ (Фігура 12А).
Аналіз з використанням полімеразно ланцюгової реакції в режимі реального часу (48Т-РСВ), кількісний імуноферментний аналіз АйЇаАТ і Вестерн-блоттинг (імуноблоттинг) підтвердили, що
РВрІ лінії були надекспресуючими НуАіаАТ у порівнянні з "нульовими сегрегантами". З-поміж досліджених РВрг1 ліній, РВрг1-21 мала найвищий рівень експресії НуАІаАТ, який був у 1400 разів вищий, після чого йшли РВрг1-12 - у 1000 разів вищий рівень експресії порівняно з МВ (Фігура 2.18). Ап-регуляція СКР становила приблизно від 10 до 30 разів у всіх РВрІгї ліній, "нульових ліній" та АСК1/7. Ап-регуляція | КЕ була 9-20-кратною у РВрі! ліній та АОК1/7 у порівнянні з МВ і "нульовими лініями", у яких ап-регуляція була 3,4-кратною у порівнянні з МВ. бо Пагони Т2 РВрі1 рослин, вирощених в умовах гідропонної культури, аналізували шляхом
ЯаВТ-РСК для того, щоб визначити рівні експресії мРНК у порівнянні з МВ. Згідно з результатами попереднього кількісного аналізу активності АіІаАТ та результатами Вестерн-блоттингу, рівень експресії НуАІаАТ мРНК був високим у всіх РВргі ліній - від 400 до 800 разів вищим порівняно з
МВ, причому слід зазначити, що РВрг1-21 пагони мали найвищий рівень ап-регуляції, тоді як рівень експресії НуАаАТ у "нульової лінії" не відрізнявся порівняно з МВ (Фігура 128). Всі РВрг1 лінії, "нульова лінія" та АСК1/7 показали 20-40-кратну ап-регуляцію ОКР порівняно з МВ. І КК мав найвищий рівень ап-регуляції у АСК1/7, у 29 разів вищий порівняно з МВ, тоді як трансгенна РВрі1 лінія мала 7-11-кратну ап-регуляцію, а "нульова лінія" мала 16-кратну ап- регуляцію.
РНК коренів РВрг! рослин покоління То, вирощених у гідропонних умовах, було проаналізовано для з'ясування змін у рівнях транскрипції у порівнянні з АСОКІ1/7 і МВ. Рівні експресії НуАІаАТ мРНК були високими у РВрг/ ліній - приблизно від 700 до 2000 разів вищими, ніж у МВ. Корені АОК1/7 мали 2500-кратне перевищення рівня експресії НмАІаАТ порівняно з МВ (Фігура 12С). Як очікувалось, "нульова лінія" не виявила диференційованої експресії НмАїаАТ порівняно з МВ. Рівень ап-регуляції СЕР був у 200-500 разів вищим у РВрг! лінії, "нульової лінії" і АОК1/7 порівняно з МВ.
Рівень ап-регуляції ОКР був значно вищим у коренях, ніж у пагонах, порівняно з МВ, в обох
РВрі! лініях та АСКІ1/7. Аналогічно, рівень експресії НуАІаАТ мРНК був також значно вищим у коренях, ніж в пагонах всіх трансгенних ліній, порівняно з МВ (Фігура 128 і С).
ИЗ гістохімічне забарвлювання РВрі1б рослин
Триденні сіянці РВріїс і рослини віком від 7 до 10 днів забарвлювали для 505 експресії з метою визначення паттерну експресії РВргї промотора на стадії сіянця (Фігура 15). 505 забарвлення з'являлось на кінчиках новоутворених пагонів у З-денних рослин. У РВріІ1О рослин віком від 7 до 10 днів, забарвлення було виявлено на межі розподілу між пагонами та коренями, а також всередині залишків насінної оболонки. Слабке 505 забарвлення було також виявлено на жилках листкових пластинок і пагонів, а також на верхній поверхні пагонів РВрІії1сО рослин, яке може бути ендогенним 55 забарвленням. При використанні ОБАМТ1:И5Зріи5 ліній як позитивного контролю, 505 забарвлення з'являлось протягом однієї години інкубування в СО5 фарбуючому буфері, і 505 зафарбовування виявлялось у кореневих волосках, кореневих
Зо кінчиках і жилках листків.
РВрі1 надекспресія НуАіаа Т
Цей висновок підтримується наступними спостереженнями: високі рівні АїаАтТ активності спостерігали у всіх РВрг! ліній постійно у всіх поколіннях, які аналізували; імунодетекція показала, що існує високий рівень НуАйЇаАТт білка у трансгенних рослин і, насамкінець, ЧРСК аналіз показав підвищення НмуАПаАТ мРНК у всіх РВрг! ліній.
Експресія з РВрі1 промотора
На рівні транскрипції, обидва - О5АМТІ1 і РВрі1 - промотори контролюють високий рівень
НеУАпаАТт генної експресії у коренях та пагонах у порівнянні з Мірропраге (МВ), але О5АМТ1 ініціює вищі рівні НуАЇІаАТ генної експресії у коренях, ніж РВріт, тоді як РВрі1 контролює вищі рівні НуАзаАТ генної експресії у пагонах, ніж О5АМТІ (Фігура 12).
Аналіз паттерну РВрі1: зЗИ5ріи5 ліній (РВрі1с лінії) виявив ендогенне бО5 забарвлювання у З-денних сіянців, а також у сіянців віком від 7 до 10 днів, тоді як інтенсивне 5И5 забарвлювання спостерігалось у ОБАМТ1:сИ5Зріиз лінії. РВрг1 може не виявляти 5ИЗ5 експресії, але він контролює високі рівні НуиАіаАТ експресії. Це узгоджується з фактом, що РВріг1 може регулюватись у процесі розвитку в коренях після періоду активного кущіння, тоді як О5АМТ1 контролює високі рівні експресії протягом усього часу як у коренях, так і в пагонах.
Трансгенний НмАїадтТ
На білковому рівні, РВрі1:НмАЇїаАтТ лінії (РВрг1 лінії) ії О5АМТ1:НмУАЇІаАТт лінії (АСК1/7) продемонстрували високі рівні НуАйаАТ білка як у коренях, так і в пагонах від періоду активного до періоду максимального пагоноутворення (кущіння) у порівнянні з МВ (Фігури 10 ії 11).
На ферментативному рівні, АіІаАтТ активність АСК1/7 була вищою, ніж у МВ, як у період активного, так і максимального кущіння в обох органах - у коренях та пагонах. РВрг1 лінії виявили подібні високі рівні АїІ(аАдТ активності у пагонах від періоду активного до періоду максимального пагоноутворення у порівнянні з МВ, тоді як було виявлено, що активність АЇаАТ у коренях РВрі! була вищою, ніж у рослин МВ лише після періоду активного кущіння, а, отже, її активність, очевидно, регулюється у процесі розвитку в коренях, тоді як в коренях ДОК 1/7, як було встановлено, ця активність регулюється конститутивно. У пагонах АЇаАтТ активність очевидно є вищою протягом всього часу завдяки дії РВрі1 промотора.
НуУАаАТ надеспресуючих рослинних ліній бо Морфологічно, РВрг!1 лінії забезпечили вищу врожайність насіння і біомасу у порівнянні з МВ і АОК1/7 у Ті, Те і Тз поколіннях. Крім того, РВрг!1 лінії виявили підвищене кущіння у порівнянні з
МВ ії АСК1/7.
Завдяки О5АМТ1 промотору посилення генної експресії призвело до вищих рівнів НмАїаАатТ білка і, відповідно, вищих рівні АіаАТ активності як у коренях, так і в пагонах рослин АСК1/7. На противагу, хоча РВрі1 промотор забезпечив високі рівні НуАЇіаАТ експресії та високі рівні білка
НУАпаАдАт, це не призвело до підвищення АїйаАТ активності в коренях до настання часу активного пагоноутворення. В пагонах зростання генної експресії НуАпаАТт, ініційоване РВрі1 промотором, призвело як до підвищення рівнів білка, так і до зростання АЇаАТ активності. Це дає підставу зробити припущення, що активність РВрг1 промотора може регулюватись у процесі розвитку в коренях рису.
Ефективність використання азоту (МОЕ) рослинами трьох незалежних РВрІг! ліній, ДОК 1/7 і
МВ була розрахована, виходячи з врожаю насіння на грам азоту, внесеного під рослину (Таблиця 2). Всі три РВрг!1 лінії мали вищі значення МОЕ, ніж АСК 1/7 - на 5-12 95 і МВ - на 11- 18 95. Найвище значення МОЕ мали рослини лінії РВрг1-21, найнижче - МВ.
Таблиця 3 представляє результати оцінки врожайності та агрономічні показники трьох
РВрі1:АіІаАТ надекспресуючих ліній рису (РВрг1-11, РВрі1-12, РВрі1-21 (О5РВрі1:НуАїаАТт).) порівняно з ДТ (МВ; Мірропбаге) на стадії стиглості у грунтових умовах при високому рівні М.
На Фігурі 16 представлено концентрації амінокислот в листках рису дикого типу (су.
Мірропвраге) порівняно з надекспресуючими трансгенними лініями рису Брагіеу АіаАатТ; АСК 1/7 (О5АМТ1:НмуАїахатТ) ії РВрі1-11, РВрі1-12, РВрі1-21 (О5РВри1:НуАїаАТ). Вимірювання були виконані на 28, 40, 52 і 95 дні після проростання (ДПП) відповідно до стадій активного кущіння, середнього кущіння, максимального кущіння і появи "прапорцевого" листка, відповідно.
Наведено середні значення концентрації амінокислот (нМ/гСбВ), отримані з чотирьох повторностей.
Таблиця 2
МИЕ рослин Те» гомозиготних РВрІг1 ліній, АОК1/7 і Мірропбаге (МВ) (грунтуючись на врожайності насіння на грам азоту, внесеного під рослину, і надземній біомасі без насіння. Кожна точка графіка отримана щонайменше з чотирьох повторностей (МОЕ- врожай зерна / внесений М)) ви (р насіння (г) (г) внесеного 7"
Таблиця З
Оцінка врожайності та агрономічні показники трьох РВрі1:АЇїаАТ надекспресуючих ліній рису порівняно з ДТ
Генеративні пагони. 17765 | 66 | 64 | 72 (Негенеративніпагони.ї/ 17025 | 06 | 02 | 04 (жсухавагавідМВ 7777/1777 17711 10896 | 10296 | 10395
ПРИКЛАД 2: РВрга2 промотор, злитий з аіаАТ геном
Вибір промотора, який застосовується для ініціації експресії гена, такого як ген
Зо аланінамінотрансферази, у рослин сільськогосподарських культур, є важливим для оптимальної експресії гена у правильний час (стадія розвитку) і у правильному місці в рослині (тканиноспецифічність). Промотор, обраний для ініціації експресії, впливатиме на фенотиповий прояв рослини. В літературі існують ПРИКЛАДИ, де промотор, обраний для ініціації гена інтересу, впливав на фенотиповий прояв. Наприклад, Муазийа еї аї., (2007) використав
Саммуз355 промотор для ініціації експресії АіІаАТ у Агарідорзіз і не виявив ніякого фенотипу.
Еипайдо еї аї., (2008) дослідив здатність різних промоторів ініціювати експресію зеленого флуоресцентного білка (СЕР) у трансгенного рису і показав, що три з-поміж п'яти очікуваних специфічних промоторів, активних в ендоспермі рису, ячменю і пшениці, не призвели до експресії СЕР у колоскових лусках/нижніх квіткових лусках/ верхніх квіткових лусках тканин квітки, тоді як два інших - робили можливою експресію СЕР у цих частинах квітки. Таким чином, вибір промотора для застосування потребує як ретельного конструювання, так і експериментальних досліджень, для того щоб з'ясувати його ефективність щодо оптимізації
МИЕ.
Перед дослідженнями, наведеними в Прикладі 1, був відібраний промотор, названий "РВргг", тому що його природний ген є гомологічним до альдегіддегідрогеназ рису, такого як ген
О5АМТІ. Послідовність РВрг2 промотора представлена на Фігурі 18 (ЗЕО ІЮ МО: 4). Виходячи з подібності послідовності, ген РВрг2 є геном очікуваної альдегіддегідрогенази, однак, її функції невідомі.
Вирівнювання послідовностей РВрі1ї, РВрг2 і ОБАМТ1 промоторів (ЗЕО ІЮО МО5: 1, 4 ї 5, відповідно) представлено на Фігурі 19. Не зважаючи на те, що ні програмне забезпечення
Зопреггу, ні програмне забезпечення Ріапірготоїе(В не передбачало наявності ТАТА-боксу у
РВрі! у тому ж положенні, де воно має місце у ОБАМТІ1 або РВрі-, у цьому положенні існує консервативна ТАТОАС послідовність. Також, РВр/г1! включає регуляторний елемент, розташований, приблизно на 30 нт вище ТАТА-боксів, і хоча програмне забезпечення для пошуку промотора не дає можливості передбачити регуляторний елемент у відповідному положенні для двох інших промоторів, він знаходиться на ділянці ДНК, що є високо консервативною для трьох послідовностей. Ідентичність послідовності між РВргї і РВрі2 послідовностями, яка виходить з вирівнювання, представленого на Фігурі 19, становить приблизно 50 95 по всій довжині (733 нуклеотиди) РВрг1 послідовності.
РВрг2 промотор був злитий з аіаАТ геном і Моз5-термінатором та використаний для ініціації експресії АіаАТ у рису, використовуючи протоколи, аналогічні тим, що наведені у Прикладі 1.
Результати цих експериментів представлені на Фігурі 17 і свідчать, що РВрг2 не підвищує висоту рослини, надземну біомасу або врожайність насіння у порівнянні з контрольним диким
Зо типом рису (Мірропбваге), а також не забезпечує прояв МОЕ фенотипу.
Узагальнення результатів, наведених у Прикладах 1 і 2, свідчать, що, попри їх подібність, включаючи, приблизно, 50 95 ідентичності послідовності, РВрі1 і РВрі2 промотори при злитті з діаАТ геном виявляють різний вплив на прояв фенотипу.
Розкриття всіх патентів, заявок на патенти, публікацій і баз даних, на які є посилання у цій специфікації, включені тут шляхом посилань у повному їх обсязі тією ж мірою, якби кожен такий окремий патент, заявка на патент, публікація або база даних були окремо визначені для включення шляхом посилання.
Хоча цей винахід був описаний шляхом посилань на певні специфічні втілення, різноманітні його модифікації будуть очевидні кожному, хто має досвід роботи у цій галузі без порушення ідеї та обсягу (меж) винаходу. Всі такі модифікації, що було б очевидним для кожної особи з досвідом роботи в галузі, претендують на включення у межі винаходу.
ПОСИЛАННЯ
Веацну, Р.Н., 5Нгаулаї, А.К., Сатої!, В.Т., 7Ни, Т., апа Сосд, Аа. (2009) Ріапі ВіоїєснпоЇоду
Уоигтаї 7, 562-576
Випоп, В.А., єї аї. (2011). Ріапі ВіотесппоЇоду уоитгпаї 9, 117-135.
Егеетап, у., зрагк5, С.А, Уеві, уУ., Зпемлту, Р.В., апа допев, Н.О. (2011). Ріапі БіотесппоЇоду ошигтпаї 9 (7): 788-796.
Еипадо, А., Непгу, В.у., апа ТаКаїма, Р. (2008) Ріапі Віотесппоіоду доштпаї 6, 679-693.
Сабо, С., апа Нап, В. (2009). Сепе 431, 86-94.
Сооа А.С. апа Веану Р.Н. (20115) Віоїєснпоіодіса! Арргоаспев 0 Ітргоміпд Мігодеп ве
ЕНісієпсу іп Ріапів: АіІапіпе Атіпоїгапвіегазе аз а Сазе Зщшау. Іп, Те Моїієсшціаг апа РНузіоіодісаї
Вазів ої МиїШіепі Ове ЕПісіепсу іп Сторв, Рігвї Едййоп. Еайей Бу Маїсоїт 9. Нам/Кезіога, Реїег
Ваїітасіоцдни. Чоп УМіеу б 5опв5, Іпс. Рибіїєпей 2011 Бу донп УМіеу 4 5опв, Іпс.
Сооадй, А... допп5оп, 5.., ОеРацйм, М.О., Сатої, В.Т., Замідом, М., Мідатіг, 9У., Си, 2., Тауїог, ща. апа б5гоенег, У. (2007) Сападіап дошигтаї ої Воїапу 85, 252-262.
Казида, М., іш, О., Міга, 5., Матадисні-5піпогакі, К., апа 5Ніпогакі, К. (1999). Маїшйге
Віоїесппоіоду 17, 287-291
Ма є! а)ї., 2009, Ріапі Сеї! Вер. 28(11):1759-65. Ериб 2009 Осі 10.
Миепси, 0.а., апа Соса, А.С. (1994) Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду 24, 417-427. бо Одисні, К., ТапакКа, М., Котаїви, 5., апа АкКао, 5. (2004) Ріапі сеї! герогіз 22, 848-858.
Рак, Т.Н., апа допев, У.0.а. (2008) ЄирНуїїса 166, 331-339.
Ріпо єї а!., 2007 Ріапі Віоїтесппої 9. 5(5):591-604. Ериб 2007 дип 8.
Ои, С.0., апа ТаКаїма, Е. (2004) Ріапі Віоїеснпоіоду уоишгпаї 2, 113-125. зпеїюп, А.М., 2Нао, ., апа Воиви, В.Т. (2002). Аппиа! Неміємув іп Епіотоіоду 47, 845-881 зпгамаї, А.К., апа Соод, Аа. (2011). Меїнод3з іп тоїІесшціаг Біоіоду 710, 355-372.
Зпгамаї, А.К., СатоїІ, В.Т., ОсеРацм, М., Тауїог, С.). апа Сосад, А.С. (2008) Ріапі ВіоїєсппоЇоду
УЧоигтаї 6, 722-732. зЗмееіоме, Г..у., Неалемооа, ..Г., Негаїд, М., Нопгаріїеї, В., Оау, О.А., Міїаг, А.Н. (2002) Ріапі
ЩЧоштаї 32, 891-904
ТапакКа, М., ТаКанавні, Н., Кіапо, Н.,МаїзцоКа, М., АКао, 5., Оспітіуа, Н., апа Котаїви, 5. (2005). уЧоигпаї ої ргоївоте гезеагсйі 4 (5), 1575-1582.
Муебетг, 0. (2003). Резіїсіде ОшШоок 14, 256-259.
МУвідеї, О., апа Сіагергоок, 9. (2002) Агарідорвів: А І арогаїютгу Мапиа!. Соїд ріпа Натбог
І абогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпа Набог, МУ.
Ми, С.У., Адасні, Т., Наїапо, Т., Мавніда, Н., 5и2икКі, А., апа ТаКаїма, ЕР. (1998) Ріапі Сеї!
Рпузіоіоду 39, 885-889.
Хие, а-Р., Мау, Н.М., Віснагазоп, Т., Огепій, у)., дУоусе, Р.А., апа Мсіпіугте, С.І. (2011).
Моїесшіаг Ріапі 1-16.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ГУД, Аллен
ЛОК, ИЇї Иінг
БІТТІ, Перрін Х. «120» РОСЛИНИ, ЩО МАЮТЬ ПІДВИЩЕНУ ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ АЗОТУ -1305» У84334МО -1505 61/532,016 -1515 2011-09-07
Зо -160» 6 «1705» Версія патенту 3.5 -2105 1 «2115 733 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» 223» РВрі1 промотор -4005 1 даансідаа адінссдіс саааїсдсас сіцаассуд Шодааааас аїасааасдуа (610) ааааїааїсі аіаїснНааї саддаадааа дадіасдааа даюаасся ісдааасіаї 120
Ісаїгазасої сдісідісіс аїдааааааа аааїісааїсс адааддаїас дадасасш 180 їТаснсааса ааїаіадаса Ідадснцай сіасіаддан юдноШшШа аїаадасдаа 240 адааагасаї щонадн Нсанаааа ааїааїсдії дасюдасаїааассіадда 300 аагасіддаї їдадаїадаї садіаддай аадаїссасі дащіаацші сссасідай 360 даосіда садіддасс Ідададної діддосісас ашісаааїс асоддідааса 420 діасдїсасод аганада дойссісії ссададаїас НПаїасдааі Шосодааа 480 60 ссідсааасі Кдаїдздасу айдаддсда ашШаднсії ааашнісйсаааснс 540 тТаасіціс аїсасаїсді Нсаацса аїсаааснс сааїцдіїдас дідаасіааа 600 сасассіаю адаїадада адсддднода сасіїдасаа діссюасаї дсідюйнад 6бо і содщдадсссс ассідссасо ісаддіссад сіссдддіда Подошоа дсшссда 720 їТаддсасдад сіс 733 -2105 2 «2115 1455 «212» ДНК «213» Ногдаєит миЇдаге й «4005 2 аддсідсса ссдісдссді ддасаассід аассссаадд Щааааю дадіадстсі (10) дідсдіддад аданодісаї ссаїдсісад сдсідсаду аасадсіааа дасісаасса 120 7 дувісісіас сійдагда даїссісіаї іаасацо ддаасссаса аісісноді 180 садсаассад Пасайсії садддададй сндсссійї дідаїсаїсс адассідноа 240 сааадададу аааїсаааас анднсаді дсідайсіа Шсісдадс ааадсадай зо спдссащюа їіассіддаад адсаасадда дсаїасадсс аїадссаддудіайааадда 360 спсущдаїй саанодснс доадаїсодсі ісасдадаєд дайсссідс іааюсідаї 420 7 дасаїшіс Ісасадаща адсаадіссі дддаїдсасс Ідаїдаїдса ацасідата /- 480 аддааюдада аадаюдаосаї ісідісссу айссісаді ассссндіа сісдасцсс 0540 агадсісне адддсддадс ісцдіссса іасіаїсіса аїдааїсдас ддасідддаї 600 пддааассі сідадцнаа даадсаасії даададсіс ддісаададо саїсаасон 660 аддасшо99 опйаїсаа іІссаддаааї ссаасіддас аддіасідсідаадаааас 720 7 саагаідаса їадідаадії сідсааааа! дадоддісно НсНсіадсідаюдадда 780
Тассаадада асаїсіащі Ідасаасаад ааайссасі сшсаадаа даїадідада 840 їсспддааї асддсдадда додаїсісссі сіадіаїгсаї аїісааїсіді Нсіаадада 900 танадою адшщідаїаа аададащдаї їасйдада Насідодсії садідсіоса 960 діаадададс адаїсіасаа ааіадсаїса дідаассіаї дсіссааїаї сасіддссад 1020 7 аїссндсіа дісндісаї даасссасса ааддсіацдія адааїсаїа сдсісайас 1080 ааддсадааа агададаоааї ссісдсаїсі Падсісдіс дідсдааддс апддадсаї 1140 дсансаага аасідад9ад аапйаснос аасдадосід ааддадсаа! діасаїдйс 1200 ссісаааїсі дісідссаса дааддсаай даддсідсіа аадсідсіаа сааадсассі 1260 даюсаїйсі агдсіснсд ісіссісдаяд ісдасіддаа ісаїсоайої сссіддаїюа 1320 60 ддашодсс адднссідо сасащдасас йсаддідса сдаїсснсс дсаддаддаї 1380 аадаїсссдо садісаїсіс ссдснсаса дідйссаїд адосодйсаї дісададіаї 1440 суюдасіааа сідді 1455 «2105» З «2115» 482 «212» РАТ «213» Ногдаєит миЇдаге «4005 З
Меї Аїйа Аа Тнг Маї Ага Маї Азр Авп ГІ ви Авп Рго Гуз Маї І еи Г ув 1 5 10 15
Суз Сім Туг Аа Маї Агу Сіу Спи Пе Маї Пе Ні Аа Сіп Ага Гей 20 25 Зо
Сіп Си п Гей Гуз Тк Сп Рго Спу Зег І єи Рго Рпе Авр Си Пе 35 40 45
Ї єи Тут Суз Авп Пе Сіу Авп Рго Сіп 5ег І еи Спу Сп Сп Рго Маї 50 55 бо
Зо
ТАг Рне Рнеє Аго Сі Маї І єи Аа І єи Суз Авр Ні Рго Авр І ей Ї еи 65 70 75 80 іп Агу Спи Спи Пе Гу5 ТНг Геи Ре 5ег Аа Авр 5ег Пе Зег Ага 85 90 95
Аа Гуз Сп Пе Гей Аа Ме! Пе Рго Сіу Агу Аїа Тниг Стпу Аа Туг 100 105 110 зег Ні бег Сп СІу Пе Гуз Спу Геи Ага Азвр Аа Іе Аа бег Су 115 120 125
Пе Аа 5ег Агу Авр Сіу РНе Рго Аїа Авп Аа Азр Азр Іе РнНеє Гей 130 135 140
Тпиг Авр Су Аа 5ег Рго Спу Маї Ніз І єи Меї Меї Сп І єи Геи Пе 145 150 155 160
Ага Авп Си Гуз Азр СІу Пе ГІ еи Маї Рго Пе Рго Сіп Туг Рго І єи 165 170 175
Туг Зег Аа 5ег Пе Аа Геи Нів Спу Стпу Аа ГІ єи Маї Рго Туг Туг бо 180 185 190
Ї еи Авп Сі Зег ТНг Спу Ттр СпУу Геи Спи Тк 5ег Авр Маї Гуз Гуз 195 200 205
Сіп Геи Спи Авр Аа Агу 5ег Ага Стпу Пе Авп Маї Ага Аїа І єи Маї 210 215 220 ма! Ме Авп Рго Сіу Авп Рго Тнг Спу Сіп Ма! Г еи Аа Спи Сі Авп 225 230 235 240 ап Туг Авр Іе Маї Гуз Рне Суз Гуз Авп Сім СПУ І еи Ма! І еи І єи 245 250 255
Аа Авр Сіи Маї Туг Сип Спи Авп Пе Туг Ма! Авр Авп Гуз Гуз Рпе 260 265 270
Нів 5ег Рне І уз І уз Пе Маї Агу 5ег І єи Спу Туг Спу Спи Спи Авр 275 280 285
Ї еи Рго І єи Маї Зег Туг Сп Зег Ма! Зег Гуз Спіу Туг Туг Сіу СИи 290 295 00
Зо
Суз Сіпу Гуз Агу Сіу Спу Туг Рне Сіи Пе ТАг Спу Рпє 5ег Аа Рго 305 з10 315 з20
Маї Агу Спи Сп Пе Туг Гуз Пе Аа 5ег Маї Авп Геи Суз Зег Авп 325 330 335
Пе Тиг Спу Слп Пе Г еи Аа 5ег ГІ еи Маї Меї Авп Рго Рго Гуз Аа 340 345 350 зЗег А5р Сім 5ег Туг АІа бег Туг Гуз Аа Спи Гуз Азр Сту Пе І єи 355 360 365
Аа з5ег І еи Аїа Аго Ага Аа Гуз Аїа І єи Сім Нів Аа РНе Авп Гуз 370 375 380
Ї ви Спи Су Пе Тиг Суз Авп Си Аа Спи Спіу Аа Меї Туг Ма! Рне 385 390 395 400
Рго Сп Пе Суз І еи Рго Сп ГІ уз Аіа Пе Сіи Аїа Аїа Гуз Аа Аа 405 до 415
Авп Гуз Аа Рго Азвр Аа Ре Туг Айа І єи Ага Г еи І єи Спи Бег ТНг бо 420 425 430 сСіу Пе Маї Маї Маї Рго Спу 5ег Спу Ре Спу Сип Маї Рго СіІу ТНг 435 440 445
Тер Ні Рнє Ага Суз ТА Пе І еи Рго Сп Спи Авр Гуз Пе Рго Аа 450 455 460 ма! Ме Зег Агу Ре Тнг Маї Ре Ніз Сім Аа Рпе Меї Зег Сім Туг 465 470 475 480
Ага Азр «-210» 4 «2115 931 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» «223» РВрі2 промотор «400» 4 даансаїаї адіаїст9 таїдндадс айадіанс аддаонаа аасшагад (610)
Зо понадоа ашадноа чішадодаї надіддоаді анпаіааш саддіаада (120 таддатдаов! азаагаайнй ададдайцнааа Насааїан нНааоддаїса їаїсдайай 180 саааасааїа ннищша адаюдаї9о ааїсаації сідадаїац ісссусюда 240 дюіїссасаа ісідсасдсс азасюасі асасаїаїас аасодсссаїс сісідісдаї 300 сіссцо ші ааасасаасс діссдідаса сдіасоїаса дададаїад сНодссісіс 360 сднсаднод сдюдасаасі ааїіаааагас іІаасасаа!д іІснааіссі ссаааааааа /--420 асіссіаваї аайаайцаа адаіааддса адааайцааї ссаааїацдісє саааасааїа /-- 480 ддаїааадад дададсаааа сіссаааїдд ісасасдісі сісуддідіса Шисісдіє 540 дусносій дидансс ададшессс ааасісісіа дададсаадісааасадаїс 600 ісаїсдаїсд сссаадаада адасасаїсс асаааїааїйа аїсісаїсц аїсдіасіаа 660 щшаїснаа їасадщіаа іїааасіаїаї садйдада їацнціс сідісїааай 720
Іаіїсіссааа ссдіаддаа!ї Шсдсассс дасодаїсісї Шсипдан шсааасса 780 аасодассаа іІсісісісдс діїайага! адсаадоїдао адсісдадсі ссаїдссідс 840
Нссіссіда сіссісіссї дсансісіс дснсідасу дсддсаасіа ассцщнода 900 дайнсдайс даддаддадао щдаїдододаїс с 931 бо
-2105 5 «2115» 973 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» «223» О5АМТ1 промотор «-4005 5 аддаадщюдаї Шадсодіа дсідіща їадсдіаай дсоїааадіє стісааці (10) тдсіаїаїсі сасісдааад ашшсії аїсісісасі сдашісіс асісаааш 120 асадіотан йпспоїаад Насадідїа ашаюааа снасасідіаасійдіа 180 аоцасасід їаайцйоа аїснсасаї діаааїна аашоа дашодді 240 сишена аддатащтаї аашаагці ісайацді сошсНааідсншос 300 ишШайаї аїсіаісода ІШааїаса аадацаааа аїсідідідаїасдацаїа 360 ааааїсцс дааадащшіа їаддіасісс саадсссій їаадаааді Шсаадаса 420 аааачншо дадааацчаї аднагадоад аааааддааї дідсуоашас ощшашос 480 ацйдснайн адсаассааа аасіаайсіа іІаадіаааїс іІШаїагас дсосцаа 540
Іаайсаааа дсааайсаї діааааіааа адсдаїдаа дааасшаа аааднаїса 600
Зо аашадайн Чанааайн Кадшаса ададсодсіас дадаадосі йааааадаї 660 дддааааїаа аассцдас сшсіддас Нсассааас адсісасдсі Псдуснсу (720
Тдссдісісу ісссоюсіа сідсіасссос сіссідассс сасссдссасіссасодсісс 780 сцсіссісс ссцсссоїд асасасацдіс сссасіссас сдссіссдіа аадіаїссс 840 псснНассу ссддссадсс асадссассод ссісссссас сссассссда ссссіссос 900 дссдіас9д99 сдсадаадда асссдіснсе їадааддада аддададсіа ссісісісіс 960
Ісісіснсї дос 973 -2105 6 «2115» 745 «212» ДНК -213» штучна послідовність «220» «223» послідовність РВрі1 промотора, включаючи старт-кодон «4005» 6 даансідаа адінссдіс саааїсдсас сіцаассуд Шодааааас аіасааасда (610) ааааїааїсі аіаїснНааї саддаадааа дадіасдааа даюаасся ісдааасіаї 120
Ісаїгазасої сдісідісіс аїдааааааа аааїсааїсс адааддатас дадасасійй 180 їТаснсааса ааїаіадаса Ідадснцай сіасіаддан юдношШа аїаадасдаа 240 бо адааагасаї щонадн Нсанаааа ааїааїсдії дасюдасаїааассіадда 300 аагасіддаї їдадаїадаї садіаддай аадаїссасі дащіааші сссасідай 360 даосіда садіддасс Ідададної діддосісас ашісаааїс асоддідааса 420 діасдїсасд агаїнада донссісії ссддадаїас Чаїасдааі Шосодааа 480 ссідсааасі Кдаїдздасу айдаддсда ашШаднсії ааашнісйсаааснс 540 тТаасіціс аїсасаїсді Нсаацса аїсаааснс сааїцдіїдас дідаасіааа 600 сасассіаю адайадада адсддднода сасідасаа діссідасаї асічнода 6бо содщдадсссс ассідссасо ісаддіссад сіссдддіда Подошоа дсшссда 720 їаддсасдаяд сісаддсід ссасс 745
Claims (1)
- ФОРМУЛА ВИНАХОДУ1. Трансгенна однодольна рослина або частина однодольної рослини, яка містить полінуклеотид, який кодує білок, що відповідає за утилізацію азоту, який вибирають з амінотрансферази, такої як аланінамінотрансферази або аспартатамінотрансферази, який функціонально зв'язаний з РВрі1 промотором, який містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 1.2. Трансгенна однодольна рослина або частина однодольної рослини за п. 1, де рослиною є рис, ячмінь, пшениця або кукурудза.3. Трансгенна однодольна рослина або частина однодольної рослини за п. 1, де рослиною є рис.4. Трансгенна однодольна рослина або частина однодольної рослини за будь-яким із пп. 1-3, де амінотрансферазою є аланінамінотрансфераза.5. Трансгенна однодольна рослина або частина однодольної рослини за будь-яким із пп. 1-4, де амінотрансферазою є аланінамінотрансфераза, яка містить амінокислотну послідовність зЕО ІО МО: 3.6. Насіння, одержане з трансгенної однодольної рослини за будь-яким із пп. 1-5, яке містить полінуклеотид, що кодує амінотрансферазу, таку як аланінамінотрансфераза або аспартатамінотрансфераза, який функціонально зв'язаний з РВрігї промотором, який містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1.7. Клітина однодольної рослини, трансформована за допомогою полінуклеотиду, що кодує амінотрансферазу, таку як аланінамінотрансфераза або аспартатамінотрансфераза, який функціонально зв'язаний з РВрі1 промотором, який містить нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ МО: 1.8. Клітина однодольної рослини за п. 7, де рослинна клітина є рослинною клітиною рису, рослинною клітиною ячменю, рослинною клітиною пшениці або рослинною клітиною кукурудзи.9. Клітина однодольної рослини за п. 7, де рослинна клітина є рослинною клітиною рису.10. Клітина однодольної рослини за будь-яким із пп. 7-9, в якій амінотрансферазою є аланінамінотрансфераза.11. Рослинна клітина за будь-яким із пп. 7-9, в якій амінотрансферазою «є аланінамінотрансфераза, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 3.12. Генетична конструкція, яка містить полінуклеотид, що кодує амінотрансферазу, таку як аланінамінотрансфераза або аспартатамінотрансфераза, який функціонально зв'язаний з РВрі1 промотором, який містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1.13. Генетична конструкція за п. 12, в якій амінотрансферазою є аланінамінотрансфераза.14. Генетична конструкція за п. 12, в якій амінотрансферазою є аланінамінотрансфераза, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3.15. Генетична конструкція за будь-яким із пп. 12-14, в якій конструкція додатково містить послідовність термінації транскрипції, ділянку поліаденілування або обидві з них.16. Вектор, який містить генетичну конструкцію за будь-яким із пп. 12-15.17. Клітина-хазяїн, яка містить генетичну конструкцію за будь-яким із пп. 12-15.18. Спосіб одержання однодольної рослини, що має підвищену ефективність використання азоту, який включає трансформацію клітини однодольної рослини за допомогою генетичної конструкції за будь-яким із пп. 12-15, і вирощування трансформованої клітини однодольної рослини для одержання однодольної рослини, що експресує амінотрансферазу з РВрі промотором, що приводить до створення однодольної рослини, яка має підвищену ефективність використання азоту, де підвищена ефективність використання азоту порівнюється з ефективністю використання азоту однодольними рослинами дикого типу, вирощеними за ідентичних умов.19. Спосіб одержання однодольної рослини, яка має підвищену біомасу, який включає трансформацію клітини однодольної рослини за допомогою генетичної конструкції за будь-яким із пп. 12-15, і вирощування трансформованої клітини однодольної рослини для одержання однодольної рослини, що експресує амінотрансферазу з РВрі1 промотором, що приводить до створення однодольної рослини, яка має підвищену біомасу, де підвищена біомаса порівнюється з біомасою рослин дикого типу, вирощених за ідентичних умов.20. Спосіб одержання однодольної рослини, яка має підвищену врожайність насіння, який включає трансформацію клітини однодольної рослини за допомогою генетичної конструкції за будь-яким із пп. 12-15, і вирощування трансформованої клітини однодольної рослини для одержання однодольної рослини, що експресує амінотрансферазу з РВріг1 промотором, що приводить до створення однодольної рослини, яка має підвищену врожайність насіння, де підвищена врожайність насіння порівнюється з врожайністю насіння рослин дикого типу, вирощених за ідентичних умов.21. Застосування генетичної конструкції за будь-яким із пп. 12-15 для підвищення ефективності використання азоту, біомаси або врожайності насіння в однодольних рослин. поз-термінитор, дв Авт / бабі сс АЩІІ «ну : Жасї и як /БтТАцІлянказ УВІ плазкідя Твори промотою.:! Ж Ебояг ставі. ча кан З й РСАМВІАІ300-РВргї -АізАТ-поє 1 РУВЕНЕР: сайтініцівції ремлікаіції від БУВА автаз Нр: . Зав ТОНІВ няння Що оюотент зрвиЗ. Есові(ваоВу р щі ре слая сов 12 нок "рВКЗ22 свібт ініціації реплікації Віко; Масу врожотор ра Ша, іо і М З55 промотів Кл і х Канд: ПОНІ гем (разистентностідо певовіцини і їв ам зт іполі-А еменал)Фіг. 1 що : ши Загальна надзамня біомяса її) й ЕЕ Загальна вага насіння (п Зо Кея щ- т й 8 й 5 10 - Ве вх МІФ хе -р її і ШО п во Б (ач жк : Кк ле К КУ х У я Кай гій й т, пініїФіг. 218 ше Загальна кіпькість пагонів І Кількість насінин, що утворюють пагону ; ІІ 12 за ке в - - рес лтих ко 8 ща в -- ання я К: 5 І Б 5 Е о яка века ї г о о При КЕНЕ Е СН ОО ! о Ме БО що їх їх гі в з у З це м -- я с су ай й т , ЛІНІЇФіг. З Зо н | ший Загальна надземна біомаса (г) загальний врожай насіння (г | В | : пі г я 20 и й ЕНН; ; - т Ж щу УК т ВОВК Ту п ! Бо Бех ГІ ! МВ в о. п Б Я 5 в о вану т М й ло с БУ І. с п І шщЕше і б . й й ші. в ий Не п Бо ра 5 В І ШЕ А о І ще Ге З Бо І ше р я с. с т її. у т. . що ЩО бр по КУ М о р: и ту ки Сей Ка хх ще х Фу й у а кожи ж и М і нн Ф А Та ЛініїФіг. 4А. 7 пи ши е з і в. 5, Е щи ву в Ше "ши ше сн ня Я де : ж ок я щої ч Я А я я шк Ту ЛІНК в. | пня кінні пісня Сира вага (г) на 95х5ий ДІТИ 6000. рт50.00. р-н в т 4000 ет ще Що30.00 ше шк 0 шк щ 2000 --ї --- --- ----- ше10.00 ! М 000 Я (ЖИ ((МШ. (ЖШШШ що Ки КА У й «Й о жФіг. 5 ин ке С пн нн и пн а р В І: т г п яв й Кий В -83 о МО Ко ЩОКУ КО, ж ВЕН КУ КОеВ КОЗА ТК М 02 КО НІ Таня КО МОЖЕ о Б п ГО в в ря РУБ Р ГО ат МОУ ВУ СЕ я БО вен і: с в В тих о. г 01 В Я Ле КУ мож ! х ко ЖЖ МІХ НОУсНО пи, о Ес ве Б ВУ МОЯ ВЕ и Ж І БІ В шен Б щен Б КО Ка ОХ ко ТУ ОБ МОНЕ ШІ я Я гі и ЕЕ шЕ и и и шк и. Я ГК МИ Бу Ах КУ БА ДН МКК ГУКЕ. нач В ен с ее Бе Б Б БОЮ о пп -- ВАК ря СЗЗ ме (КМ 0 КеНи -А В ГЗК - ї Сл как а ие БО ММ м У В А ДИ ши ШИ ШИ: Б М М СМ МУ Кз ши ие сис; фо Т, ЛІНІЇФіг. 6035 а- У. Ж 05 Ея Ф - ше 020 г секінея вве ПО ВЕ е дея комент КО. з ЕЯ Б ВЕ є . і. ее ЗОВ 015 шшщщ щ. БО КБ Кая о Езаеа Ки КУШЕННЕ НИ о. «і З Кр ММК КАБ Ге хх М Я ЕСЕОУ п ін о ЗБ т Ко он: Ся ех у - 0 ря п ОНКО М, о ОО М, Я В ВЕН ПО и ТшКЕ КО пе Вас м о о ЩЕ: я в шо КОХ о що ш. щі п 5 ВеУоОХ ХУ пе МОХ о о. ПО ши м І щ шщ. ово ЩО щ. о що і хо ОАЕ ЕМО КОН У оС. і й. в М І в. с. о СУ ях гу ро» М в о Є , г СО ; | н НО «х я а ї КИ Ї К є Ко то4 є. З й ? у я К є де ? є й Та ВініїФіг. 7035 : : І як 2бденні рослини й |! І век 52-денні рослини0.30 Я Бо денні рост КІ : Е 1 8025» ен -- БО но БО і | о. ТЕ Б г Го ЩО м а ЕІ АК МЕ Ж» А З У ММА Я в 0 - Б Б пи й 050 о. І ШЕ. ! Є о о о Ко му ке ! Ба У Що в ще 015 що с ШЕ, г. в 3 пн пе Бо і. Кк РОщ У ЦИМ КИ КІ ж вла ІЗ ко Бе Я і. . Й МКК ЖК М ЖИМ КІМ е що ЩЕ що З 05 Б І о в. Ї и о ! 5 ЖЕ й й в хх в 5 КЕ що ге а я ни ни нн па й ! і « ці : з ши и А т в ох в - 5) що «є ; жТ. ЛІНІЇ 2Фіс. 8 о. Що; Й й Е їй жах 28-денні рослинь в. ва бе-денні рослини, Ж 14 ; я і І; і 12 ГУ Її | шо Я псабюст Її ГЗК ів ЩО Во ВО ее с ж Ме ЗА | В «Її мя М рах Е М ВХ я Кос й БОКУ в ІВ В жо Бо ЕХО КИ КО х Щи; ОВ Ве Ки МЕ І що - КОХ М рон СУ ! оч ке п І Я г. У в і Ше і. ВХ ЖЕ Баня КЛІ ЗУ ш 05 о й г. Кз о що . з т Її ша М БА ше Я в. КІВ Вл пе |. ! я 4 5 воя Ко Ж в КЕ БУ Бо КА я що ; їх со КУ Ти щхОХ КОИКиХ их т Кх ГО Млия Сас ПОМ МЕМ ром С К МКУ ІШОВ во. ОСЕВ ЕМ МОХ маш ще І: БОС ТЕ дя ун Тл ВХ КОЖ, Га0.2 ГІ ме пи ВО КО М І в я Р. Б і рей МЕ ко я о РАКУ Шия, МУ Гени МОВ ЕЕ ХМ Я и НО В ГУ КИ М ря | ; СОУ ЖИ Б ау У ПК КЕ Сх У п О ПЕ Ма Ко КО Б і. ЩЕ М ББ, поко М ху БО іх по ГО ГУ Я М Та Я о о Й і Б й Б ГУВе а ШІ ! те 7 цей у то 5 ж ві кх з РК р реч я че К 7 «ех йо у ту | соч гот й їх ФУ їх С з с ге ой 4 ху чу КУ ЙТо. лініїФіг. 9 х дк ви З вк ж с ж оон я о о во онВ ОО ж Ех по М в п Ен о ж вх пове я с о В А КК ТО ОО КК ЕН ях о и МК Ех ПОФМ ві ПОВ о о и Кн ни: у ши ше й не КО ВУ Я КК й що що й х Б косо еще КЕ є ше ск КЗ ОК Не ОО в о Й НЯ. ОМ Ех Ух М ен М во АТМ я ооо: о не в У З Я КК ко ЕІ МКК о и я ще Де о о ММК КОН с ; п нн ОО ЗА ен и ОКУ ОК ен о ке п . в РООВ ТАНК ЕВ Пенн п йФіг. 1 іт. 10А , оф осак - «ж «ок у, ся У 7 ТК кованої ХМ вана Б езнс: И Я щі : Фобн бшжоое 0 ЗВБдх За Кк ПО р: п нано ее и Ноя - т ік ооо ця У й БОНН ше ши ни ся З На ЕН ННЯ МН в . своей. У. о, ще т о Ко пнекея: в іш ній нн а к Ви М ДК ок ОН НОВ СВ: ТИ ж ЕЕ а и ЧИ НН НЯ ще ОдИеБОМ. файно: НИ М ШО Заря; ух ко оди ві КК МО рани ви Ява вне же ик з ранах х ЗВКрая вия Зевва Жак й Ко -к хоку тео Ж тя З ле ЗЕ ак й (й їх тю м й ши на ШЕ «7 се в -, е що й 7 5 7 й ЗФіг. 11 Ії хо рення - та т Її є "и ! іо до іб 18 -! і. ! КЗ З я . В Кт " - В х - г КЕ кот В Е ; ї- кЕ. - а. Жя- і м ЩІ Гей Е ї ! у з ЕЕ пк й бі ЩІ . ба . і : ї ї І ке Я я | в Е І. й Е з Х в ГУ х їх з 4 і. Є з | 2 ії В с і Х й їх Я г х. З ГУ я Ї І : я і і ! о ЯКІ З Ка В. й || і... - ї гу З у Ж. Е. і кре ШИ зи І Ї " МРКня - ши вні 2 Рвие 24 -- ревіння ШИ обох ЖШНЯ зі і ШИК вві - Дол Рна й -й Гаве Д Ж «4 КО евня Мій хати В ов? ШИ мок 8 се 4 шенні в Ж ж я ї- й - ж ДИ ЛЕ й ше я й см жк йо й є ж й У жа Я 5 иТ. пагони т. пагони т. корені й жФіг. 12 ж Жеокі І1ГОААТІСКОАА ВОТТТССОТО САААТОБСАС ПТТТРААССО ТІТОЛАБААС КТАСАЛАСЯА ААААТВАТСТ АТАТСЕТААТ СВССААСАВА ОВСТАСОАВА ОСТІАВБАСІТ ТСАААССАС СТТТАБКИТО СААААТТОСО АДАСТТЕРС ТАТСТТТОСТ ТУТТАТТАСА ТАТАСАВТТЬ СТОСТУСТТТ СТСАТОСТІТ 101 ЗОСТОАВССС ТОПАЛАСТАТ ТСАТАТАСОТ ССТСТОТСТС АТОВАВАААА ААВТСАУТСС АСАЛСОАТАС САСАСАСТТТ ТАСТТСАДСА ДАТАТАСАСА ВССАСТТОСО АОСТТТОАТК АЕТАТАТОСА БСАСАСАСВО ТАСТТІТТТЕ ТТТАСТТАОС ТСТТССТАТО СТСТОТОААА АТОЛАСТІСЇ ТТАТАТСТОТ 7аї1 ТОВОСТТАХТ СТАСТАЄЗТТ ТОСРТОМУТА ДТААПАСЯАА АСЛААТАСАТ ТООТІАОТІТ ТІСАТТАААА АВТААТОСТІ ТОВСТОВСАТ АААССТАОСА АСТОСААТАХ ЗАТСАТОСАА ЛЮСАЛЄАААТ ТАТТСТОСТТ ТОТТТАТОТА АССААТОВАА ААСТЛАТТТ: ТТАТТАОСАА АСТОВСТОТА ТТТОСАТССТ 301 ВАТАСТОСАТ ТАВСАТМСАТ САСТВСОАТО АВОАТССАЄТ ОАСОТААТТТ СОСВСТОВТУ ЗООТЕВСТоА САТСТОЛСС ТОДеАОТУСТ ЗТОЛОСТоСКС ЖТАТОАССІА АТТСТАТСТА СТОВТОСТАА ТТСТАбСТОА СТАСАТТАВА СОСТалЛоТВМ ВОСАССОВСТ СТАСАССТОС АСТСТСААСВ САСССОВОТО 401 АТОТСАЖАТС АОСОСТСААСА СТАСОТСАОО АТАТОТТАСА бОЗТТОСТОТТ СООПАСЬТАС ТІТАТАСОВАТ ТТТОСОПААВ ССТОСАААСТ ТЕБАТЕВАСЯ ТАСАСТЕІТАб ТОПСАСТТОТ САТОСАСТОЄ ТАТАСЬКТСТ ССВАОСАСАА ОбОСТСТАТО ВАТАТОСТІА ВААСосССТТТ ОоВСстТІТСв ДАСІАССТОС: 503) КТТСсВОСССА СТТТАСХІТСТ ВААТТТТТТО ТТОВААСТТС ТААСІТТТТС АТСАСАТОСТ ТІСАВТТТСВ АТСАААСТТС ПААТСТТОВО ЗТОВАСТАВА ТАДСТОСОСТ САЛАТСААСА ТТТААААААС ААСТТТОДАС АТТОВАЛААС ТАСТОТАССА ААсТТАААОТ ТАОТТТОВАС СТТАСАЛСТО САСТТОАТТТ Б) САСАССТАТО ПОАТАТСАСА лЛоССОСТтТОоВ САСТТодсвА СІССТСАСАТ бстетвтТІва сСотбовсСсо АССТоСеАСО ТСАВОТеСАВ СТССВЗОСТОЄ СсТОТОСАТАЄ ТСТАТАСТСТ ТСОПССАВСТ СТОААСТСТТ САОСАСТОТА ССАСАСВАСС ОСАСОСОСОС ТООАлОСТИС МІТОСАСОТО. ОАСОСОСАСО Бхсі 701 тТтсестуТос ТОСТуТОСоВ ТАСОСАОВАЄ ТС АТООСТоО СОМ ААСССАААСС АСОАААСОСТ АТССОТІ Ай ЗАСССАС стТЯйФіг. 13А. асудсеЕцссассогсоссосодасазестдавесссаача се ссазаасокаво сагчссогоасосодасазассоассаєссасусьсвзоасуєстасауазсаста авдасісавесазцаєсесстасссєкєдуаєдазаєсссссаесєвасвссо9 авсссасаассесстдассадсаассачссасазесстссазачаас встає сексу счаєсаєссадасстасечеааачазачуазаєсавзасаєсвсссац четчаєєставевсссоадсазадсечаскстсассаєвчасасссадзасчацосв асаддадсасасауссаєвоссадвдубєаставзауаассссЯявчасдсзавєкаеє гскЗсоассуссісасзачаєоадаттссстостааєзсєваєвасаєтскссіс всачакоуазусавуєсстччуасасассудаєсагсозастастазезавазвії дадазадатуддсаввсьсогоссдаєсостсадіассссьбарасісдассксс зквасесттсагадсузастсстЧесссатастсаеЕсссваєсчаакссчасодус сода Есдааасстссдагусєсавуавасвзассттовачасастсудссаавча азсассзасаусачччсстЧоасчассвссвзасссаздазассозастадасад зсаскєосідзадаааассзакаєуасаєсадбсувайстстодсаваазавечадааі оєкчсесеессваассдасоадасасассазвадазсаєссасастовсвасаво азассссасестсссаачлазасазсцавуассстссочЧасасопсавадасадя сессстстацдсаєсасаєсвзаєссьосссссвазачаєзесаєчасовоасвг ве азвазазчсуустастесвачаєтассозчсстсаасастссавсзадачацчеа акстасвазаєаасаєсачіозасстаєаосссазкаєсасссассаувксстя чегадесісагссасдавсссассазаадстізуєдасодзаєсасасостеєсагас задасацазавзадасачоваєссстссахстскадстсоесасосовзоадсаєвд чазсаєосаєєсзагааасеЕ с дачоцдаастасегадсаасувудстоваавувоса акасасчсчікссстовазтставососсвсаддаавчсаат качок ставя Фдстаствасзаачсазсссдсасосаєссстасосествсакстоесісуазчтсоасх чагассуксоктуєсестозаєсвовзасксазссада се сскодсасавооасас тссзазсосасзаєссесссусадоаоачасзазчассссчасачсовістессооує геЕсасодсавЕссасдачоасуєєсаєосседчазсаєсясовстазассуцуВ. МААТУАМОМЬМРЕУЬКОСЕТАУКОВІМІНАОМБОКОЬКТОВОЗБРЕрЕТБТСМТО МРОБІОООРУТЕЕВЕМПАБСОНРОСБТЬОВЕВІКТСЕВАОВІЗВАКОТБАМІРОСНА ТОАХВНЗОСІКВЕВРАТАЗОТАБАРОКРАМАВОТЕНТОСАБРОУНЬММОМЬТВМ ЕКОСХТУВІРОУРЬХВАБТАБЬНОСАЬУРУЧІНЕВТСИСЬЕТЗОУККОБЕВАВОВ: ЗІМУВАБУУІМРОСМЕТСОМЬАБЕМНОТОЇ МКЕРСКМБОСБУТАВЕУ ХОМ ОВК. КЕНВЕККІУВВрОСХСЕЕВИРЬУВТУОБУБВКОХУСВООККОСУКЕТТОЕВАРУВЕО ІУКІАЗУМІСЯМІТОСОІБАЗІУММРРКАЗОКОХАЗУКАЕКОСІТБАВГАВНКАКАЇ; ЕНПАРЕКРЕСІТСМЕАБСАМУУКРОТСТРОКАКЕААКААМКАРОАКХАВЬЬЕЯТ спьУУУрсВОКОСУрРСТИН ЕЕСТІБРОБОКІРАУТОВЕТУЄНЕДЕНОЕУВОФіг. 14 їй їх ий . ге Нм - Ден зе окт во се ННДЯ. - по ; ЕЕ : е у рю о кл г х Е п ай ; о : ЖЖ ши Я и МО З Кк он СК ї Я -ї - ; зв ЕЗ Я. що З Крах п З й х її ; и я з РЕННЯ шо ня ! ов води ; й з Во З це ї до о ОКУ й й мо е К Я ОО З Б : т ке ле В ч нка о ; ПУХ Ме Я с Ж ой пилки Е ЕК . Боже и Й о пЙД ! т М о зе ше я; Ж. ;. т х про и БИК не ще Ех я ше А е - В'Я Б о ехАт. На ті у . - и Ми. Її за пок вах Е Кк Вася й Ге Е ПИ ди я Е В ша з ! їх Бай ее В Є хи ПТ хо Зк З ек і сх со свй ок проку Й ан ск ДЯ Й п веоко ККЯ м с зе ьФіг. 15Дкіноюнлота НА АЯВТ ері рвеа? архі МО 00000 АБАУ берет. ОРВІХ. бввіТь ви з3138 ззаад ад 45: ой 3352,5 5 зла 5ре3,У 589. Ак звіза Зі зве жвава з515я весУКу зако З 23184 365322 дер їй тю італ з155и 10388 люд ле іще зіва іхгв? Бе ! з5Б85 азад. 1958: нову БЕ ява БІ ї3350 яка ССРКу тн; Бай. 852 73555 БАБА чи 455,7 5352 кб «Ву «ат Ат вад аа СЕ БІВ за 79 ваз 1573 зе 58,4 вік 8975 ія 505, зі8вж зааа з «381 вів 253 За, вх ой ат БУС 5302 354,8 3928 275,7. зе зі5аЕ 1к2 алва за 175,5 зав 25859 1803 2253 201,5. ЗУ 1832 зу Ук дао 2355 від 379,8 359/7 хе мзє ТАБ з 325 я Но 1593 021 зві 13371 83,4 1552 луго чя22 їю5 мус ї1562 зда 154 зе лов тд зїзи3 152,4 зп КІКЯ рез з134 За ютЕ 868 х яз ва їмо вка кл ще зв зо 358 ха дк 5259 ча БЕВН 503 «а їв зна зва кт іа Ба 326 32 5 Ах зад Ти і 323. За ВЕ. за 49,2 « а 19 нав. «не Ав; роив як Та в то Ех 25 як мо ІЗ сує І в «в ке як ча ка ко ие ве зв. ще -а не АВ це. не ке кб. "в за яв і Зер | най тА кеКи 15,7 не у МЕ 243 че «в. ве і ка ка я іа 145 яв ів за зах За яко | ха з ізая 385 з їде зік й з3 зії фатальний ! вийст 1. 253552 іа іт76Ій 13251,8 тІ8350 1 З1Батт 138517 155555: З3МИЖ ізаузА. п педа в дп с Най ЗБДЛМ. ! Аміноннсматх | МО 00000 ваяИР ВВ; їж овишергї |В давл? рерінх: РАогіЯІ РВрисі бік ай ЗІБ аЗде 530а «40 83932 52 3231,5 ЯКІВ ЗУ509 ак Зцещух зп аби та3ба ізкі ззвяе 33щї 35412 2255 міх дв вод іх 1255 іБІЗА 1Б25Ю о їшаж ібвх8 А СС 1255 Бех ОК 1395, 1188 я. зт вра зах З336 зна 5238 т Гоа БЕ Ям, а «350 5? 3478 з81ї зво. ІВ вик 169 те зо 1553 368,3 тов хв зва тА ха б аз 2 кб, зач зов які 2823 ода зво Бе су зп зд 87 3784 зіва з 3334 зма 4954 зпа СА іона 158,3 зва й ії зна ії 13958 3284 226 Уа і зва а зп ГРшжя 213 з 357,8 253 ї2Бд МЕ !нь. | КЕхЯ За зм А пл ор;ояюа «53 327,8. зви зма мух тн. 53 315 за 973 пл 585 ГЕ ца За Ї зо ро 58 Ж й яд 2323 Е: ах я вія ї5 Її к че но не че о жож я кк че т їву Її як як жа ни йе 78, 15я 295 че на те "в й ке ка ве | нев яв з «к ев аж ка ке -к ме яв ка Гу ні на за сук ЕС «в не на ща на хе ес кв на Ме ОнЕ не т. кв ні кв вк ке не ка "че їз: Т- в. ав: Бо ей не мк ме ма Тке Ще 33 39 ла «м а 1207 вод ве 58 Зе ас. ме 321 317 37 кт 13 за хз ме яма. і 358857 1335339 12915 із087А з3а375 | 165046 інв 523,8. їіхино 85943,5: т Фіг, 16А. Ин вшншнНнннни ЗО 80 і і о БО ; 5040.0 ще збо що щ зоо ЩЕ ЩЕ і Е оо ШЕ їх; с. МІВ середнє РВргд-а-3 РЕерга-4-2 РБОга-й4-19 Рергі-4-15 шбисотароєтини В Загапьна біомаса й Бега насінняВ. | | | І БІВ, и й 25 ! Ій | ! ШИ ! р і в НИНи ШИНИ Ши МО. і Я 5 ІЙ і ! ЩЕ МВ 2-2-14 4-2-20 4-4-6 ау 00 АЛІ контроль рВгз я Біомаса гі Ж вага насіння)Фіг. 17А. ОААТТСТОАААСТТТОСОТССАЛАТСОСАССТІТТААССОТТТОАЛАА АСАТАСЛААСВАААААТААТСТАТАТСТТААТСАВОЛАВАЛАСАЮТА СОВААЛАТОСТОААССОТСОАЛАСТАТТСАТАТАСОТСОТСТОТСТСАТО АКАЛААЛАЛААТСААТССАОААОСАТАСОДОАСАСТТТТАСТТСААСА ААТАТАПАСАТОАОСТТАТТСТАСТАОСТТТОСТТОТТТААТААСАСО АДАСАААТАСАТТОСТТАОТТТТТСАТТААЛАЛАТААТСОТТТОАСТО АСАТААЛАССТАСЙОАААТАСТОВАТТАЛОАТАВАТСАОТАОСАТТААО АТССАСТОАТОТААТТТСССАСТОАТТТОСТООСТОАСАТОТОвАССТО АОАОТТОТОТОООСТСАСАТОТСАААТСАСОСТОЛАСАОТАСОТСАСО АТАТОТТАСАСОТТССТСТТОСОПАСАТАСТТАТАСОСААТТТТОСОбА ААССТОСАХАСТТТОАТОВАСОАТТОАПОСОАОТТТАОТТСТАААТТТ ТТТСТТСАААСТТСТААСТТТТТСАТСАСАТСОТТТСААТТТСААТСААА СТТОСААТОТТОАОСТОААСТАДАСАСАССТАТОАСАТАТОААЛОСО ОСТТОАСАСТТОАСААСТССТОАСАТОСТОТОТТООСОТОСОССССАС стоССсАСОТСАООСТССХОСТОСОООТОСТТОсОТТТОСТОоСтТІТССОАТ дайСАсалаєтТе в. ОЛАТТСАТАТАСТАТСТТТОТАТОТТОАОСАТТАСТАТТСАОТОАСТТА АААСТТТАТАСТТОТТАСТОСАТОАОТТТОАОТТТТАОВАТТТАОТОСО СТАТТАТААТТТСАТОСТААСАТАОСАТОАОТАТАТАТААТТАСОСАТ ТАЛАТТАСААТАТТТТААОСАТСАТАТОПАТАТТСЛАЛАСААТАТОТТТ ТТТТААСАТОСАТООААТСААТТТТСТОАСАТАТОТСОСОСТОбОСТО ТССАСААТСТОСАСОССАТАТСТОАСТАСАСАТАТАСААСОСССАТСС ТСТОТСОАТСТОСТТОТОТАААСАСААССОТССОТОАСАСОТАССТАС АТООООВАТАОСТТОССТСТОССТТСАОТТОСОТОАСААСТААТАААА ТАСТААСАСААТОТСТТААТОСТОСААЛАЛАДАААСТОСТАААТААТТА АТТАААПАТАЛООСЛАЧАЛАТТААТССАААТАЙТССААААСААТАОЮ АТАААПСАОСАСАССААААСТОСАААТОСТСАСАСОТСТСТСОСТОТС АТТТТСТООТОбОСТТОСТТТОТТТОАТТОСАВАСТТТСССАААСТСТСТ АОАВАОСААОТСАЛАСАСАТСТСАТСОСАТСОСССААОЛАОААСАСАС АТОСАСАААТААТААТСТСАТСТТАТСОСТАСТААТТТАТСТТААТАЄАО ТОТААТАААСТАТАТСАСТТТОАСАТАТТТТТТТОСТОТСТАЛАТТАТС ТССАЛАССОТАСОАЛАТТТТСОСАСССОАСОСАТСТСТТТТСТТОАТТТТТ САААССАДАСОВАССААТСТСТСТООСОТОТАТАТАТАОСОАОИТОСА ОСТСОЛОСТОСАТОССТОСТТССТОСТОАСТОСТСТОСТОСАТТСТСТС ОСТТСТОАСООСООСААСТААССТТТТТООСАТТСОАТТСОАОСАОСА БОТСАТООбАТССФіг. 18Фі вакіча (3) кобАкотоВИ т ТИВ ВИ ВИСО В во В ев ок а ВВС ввркї фронтит ит тт тт тт тт тях РЕРкї нн шо оо ОБ свв вне Я (З тт тА бота СТ тот тот б о А То ТТ щі | 399 ою. вакіми (51) стоВЕ тт осв гаус пово НИ тт у В тстодеу ввккі промотор ііїї не Я жк Хек Ж нт інт Кт кл ЖЖ Є ук ниж мет нюх Ж по ть кт ік кю жкння РВК Промотор се Мох ови св вк в ще в: ЯК консенсує 51; тт Ах тт та тато А ТІ тота тА І ї5о б: васїув 100) ДОБА КСТОВОВСАА ТАС ТОСТИ сто ВоОЩОСВ ВВРКТ промотор Ду нм кі дник ою житнє юка ну ска жикх Кота ки куки їм ХА т ікодажькох са кн ББРЕЗ промотор 5 Водосфіфта тт то Васі Кк ТАССКВСАСВІ ТАТИ АВК жонсенсує (ою то тт АТ Ж Же т тв а лтх 5151. І | вою О: вапіча (187; ТОВ ВАСТТ АН ВОВААСТТТТОВВАСВЙСАСТОВКАТТТ ввикі промотор одн м и о й ми си ше В и Я век? промотор (зав) АТ ТТВСАКТАТІ ТАНКА ЯВИ С АЯДАсА НД хансвнеус 1153) тТААатТТаАтТокАй ТІТСЯОТ ТсА АТО ТА ТІТАМАС ТА ОоТт зах 258. о, ваті 1197) ОВтСттсАВАТ ДАНІ ТАКТ сТВдтосктттовт РЕВЕ проватор із) Бся- Нет ДЕССВІДААТААТД ІВ т АВТ АЯ РВЕ? проштор їхав; ДІТИ ---асаТсАтос САЙТА --- ЩАТАТОД онЕВнсуЄ. і2в1) ТТ кад САТ ААА АТЕКАТТТТСТАТ Іст її 251 ою о. засіуа (247) СТІВИСВТЙТСВИЙЗ АТ АТНИ ТОЙ ТАН ТІТОВА Т-ТоСТВ ВВгкї промотою їв: САВДЯХСВ нс вв шо: У вяРке Промотою (333) СОДСТСооТиТеСАВАВЙС ВК АСОСВАТАТО ВВ ВС ВАТИ ТКСАХ консенкує 1251) с ОсАЗоА до ЗТАС АТАТОСТ АС Т ОТОдСТАТТСАТАТАЄ т за БО о. засіта (296) ТІЙ ТЕТ КВІТИ ВОосАД ТИТА ТА Аа ТетТВ вВРгі промотор (ізі)3 ВІД То И ТАМАДА АС АТ- АсАТ МТ ЕВРк? промотьр 283) ВОЖИДИЩВЕСТИТСОВТСТоМ Вот АВАЛСССТОВИ ВВ хонсенсує. (їз01) сотсс ТСТТАТОХ КА я сот ТТ ААСАСАА АТ ССАСААСС 35 40о ой, закічв (3463 вн сне М АТКАНАНИСТТТСоТААсАтТО ТАТО Ас ТНЕ вВРЕЗ, промото ї179р ТІВАСЙТСХАЄ ЛИС ВИОВНН к-- Кк я роко МК РВРЖша Проматор ІЗ3ВУ де ХО ПИСАНИЙ ССИВ Тобто АсВВИЯЯ консзнеує щу ох ВССБАТКТАСА КТ АсСТТА ТОТ С ОТАсаТеТОС ТУ 401 450 о. васіча (393) тт іс сА КАВОВЕ оХАОСТХО РВРЕї промотор. (аать тов КАЙ ВАС АТ КНТ А АВ ВВРКХ промотон 13753 ПОСАД АТАСВМИСКО АВ ГОЛ АТЕСТОЇ БАБІ консенсус і301р д АСТАКтТалОХАВОТАВТАСВАТО ТТАСТІТТТСАКТІВКАКХ ОйО. закіта (493) ТТАТВОЩОЛАЙААСВАДІОТОСВ ТТ ТАТ РТ ВАЙТОСТТАТИО вВрРКї промотор 127 сот хв М иа СИ ТАКОВС РВЕсЕК проватор (ва5р СТАВИ ТАЛА ТВА АКВА НН ТОВ ТАКО консентгує г45І) СТяКХ 5 тА тТеАА ятТАлОо СтаОБАЖТТА ТОСАТ ТЕ ОТЖЕ 5ВХ . І й ваСО. шекіуа (483) СЦАССДАААСТАКТОВАТА АЙ ВІТ Т ІВТАДАСО СОС ТЕААТВВР. промотой 1317) ЩОАТСВСВАВЩ АТ нон о І Мі ан и ННЯ РЕНРЕЇ промотов (472; кас АВВАИЯ- АТ АВАКОВ ОО АКЕСТоСАКАТВОВСЯ хангенсує І50Х5; ДАХ СААТАВО АТ ТАКСЯАЄ А А СА т АЖОТАА ТО Те ФАСТ ББї І що ва Ск ваті (58 АВДІНАХАМИСВАКИНСВВОТА АК АСУ ТОА ВА ТВАФіг. 19 тВРкї із5т; ОВТ ПЕС -ДоАСІотОвай свачі ПОДНОДИНИ САДА тот ВРХ: (518) ра ЯК НИКА му ВУ ВИЗ КМТ тс (5я1) ОДТТСОстТоосСА ТТТСКТОТ еАЄСТТОА ТО т ОТОА боса КСТІТ вх | | І 50 о. зяхіув (590) АЙХАОТИАВНАВАТТТ ВАТИ ТАТИ ВТАВ ТВ АВАВСЗВСсСВ вВРкї 1405) ВКАКТВАЦОС -тозАс СВ А со ВВС АДОВІССТоВТ РВРг? оо сс ван и В Кв с ве сс а (вату св сте Т АОХОТА ОТСАКА АТАТТТТА сот Бо СТЬ 551 той б. вахіує (640) ВОЖТЩАКООСТК АДАМ СОВАКАКТА ня ВМВСВТТТОАОДКТТС РЕркі (4513 ВС- ВН ресее і тя Я фужери вврЕя (бів: ЗАЙВА СОВА ТВА ТАНЙСТСАТСТТАТССТАЦТАВТТАТ Бах с одпЗАвА СТІ й й АТ САКТ Т АКОТ С Кот 7ві | 75а о. векіув (585) тоофстІАЙ МСА ТОВВОВВ ІЙ осі тоссстсі оо РВРкІ (4821 в вени В и ни КЕН Ву рЕРк2 тев6у с АКАСТИ ТАК ВСТИВАТВЯ ВОВНИ Га ТАКТ САС САЛК О Во АСОАТІТСАСТТІ А Ат ТТ ві Ой схозабіча 735; БАТОН САС садссхва с РЕРЕХ промотор (535 АСТТВВАВТІТТСАТОИС ТВО ПА С ААЩСАЖ- ВСТВЕ БЕРЕ? прометов 0713) Щ--ПДААТЕАТ-СТВСВАВ ДАО ПІСС ДС СС КОВО хонесвнеуе і753р ж тТстадетТТ т ос се АСССТ СААТТІ С САСТЄ АССАТСТе Ва 850 о. Забсіта (782) ПИШИИННННИНЕССТВАСАДАСЬО шк о ! ВВЕ промотер (582; СААТОЖІННИСТ ее ВАВ ТАН СС ВАЩА- ТАТ РиРЕй промотор ож ни м Би н хоневнеус 1804) ТТ ОТСТТоАС ТТ СААССААКС САССАВТе с б ТАТ ві зи б. вабіуа (532) ВДЙВМКЕСССІЩеСТТАСВОССОСС АВС ОСС АВС ВНС РЯРкі промотов 537) ОНАЗ ай яна Си А-- ДАТОСІВ То РБеЕЙ промотор і8о7; ВИ АВО-- то АЦОовссторат св ЗМИВ ХоневнЕУє їазіу АДОоТАсСсЯ ШЕ ТО сОост сЬ СА ССТОС ССТОСтТо С Аст 593 . п о ЗБо о. васітв (882) ВЩАСООХ нос я АСВОДСВС ЗАВІВ ТОЯТИТ ВВРЕЇї промотор 1658, ВИЛО сте - ВАВВВСКОсЮТття РВРЕ2 проматор (853) ШУТСТШЕТВНАТТВИСВІОЮт тс то ОВ ВАМИ ИШТТтВто- комеенеук зах; ес сосеоссосостетос сот доо бедостАССоаК ТТ 551 ах 1ова ой. закхта (9351 АЗААФОЙОСАСВАВСВСВАЯ шк ЕСТІСЛАТО ВВРЕЇ промотор (303) чн ООСВЕТОВИ ТТ КС А ТАН ВНАТстттАТО ОВЕВте прометор СО не ОВС АВ ТАС АКОАСВИСЙ ТИСА ТИСК конеонете (951) ОСОКТТ Сетоса то ото ото АТ "фіг. 19 (продовження)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161532016P | 2011-09-07 | 2011-09-07 | |
| PCT/CA2012/050622 WO2013033846A1 (en) | 2011-09-07 | 2012-09-07 | Plants having enhanced nitrogen efficiency |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA116086C2 true UA116086C2 (uk) | 2018-02-12 |
Family
ID=47831406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201403599A UA116086C2 (uk) | 2011-09-07 | 2012-07-09 | Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10246720B2 (uk) |
| EP (1) | EP2753698B1 (uk) |
| AU (1) | AU2012307006B2 (uk) |
| CA (1) | CA2847715A1 (uk) |
| IN (1) | IN2014DN01849A (uk) |
| UA (1) | UA116086C2 (uk) |
| WO (1) | WO2013033846A1 (uk) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA116086C2 (uk) * | 2011-09-07 | 2018-02-12 | Байєр Кропсаєнс Аг | Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту |
| CA2903930A1 (en) * | 2013-03-06 | 2014-09-12 | Bayer Cropscience Lp | Plants having enhanced nitrogen use efficiency and methods of producing same |
| CN106906191B (zh) * | 2017-03-02 | 2020-06-12 | 湖南大学 | 提高氮素高效利用的真菌TrGDH蛋白及其应用 |
| US11702670B2 (en) | 2018-02-15 | 2023-07-18 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking |
| CN111926024B (zh) * | 2020-08-18 | 2022-07-08 | 南京农业大学 | OsDNR1基因的应用 |
| CN111876519B (zh) * | 2020-08-21 | 2022-01-21 | 中山大学 | 水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用 |
| CN111972286A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-11-24 | 河南省农业科学院粮食作物研究所 | 一种耐低氮玉米品种的筛选方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4634674A (en) | 1983-03-25 | 1987-01-06 | Atlantic Richfield Company | Plant regeneration from protoplasts |
| US7390937B2 (en) * | 1996-02-14 | 2008-06-24 | The Governors Of The University Of Alberta | Plants with enhanced levels of nitrogen utilization proteins in their root epidermis and uses thereof |
| AU782263B2 (en) | 2000-01-28 | 2005-07-14 | Governors Of The University Of Alberta, The | Tissue-specific expression of target genes in plants |
| CA2634925C (en) * | 2005-12-23 | 2015-06-23 | Arcadia Biosciences, Inc. | Nitrogen-efficient monocot plants |
| BRPI0620315B1 (pt) | 2005-12-23 | 2018-06-19 | Arcadia Biosciences, Inc. | Seqüência promotora obtida do arroz e métodos de uso |
| US7589257B2 (en) | 2006-02-09 | 2009-09-15 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants |
| UA116086C2 (uk) * | 2011-09-07 | 2018-02-12 | Байєр Кропсаєнс Аг | Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту |
-
2012
- 2012-07-09 UA UAA201403599A patent/UA116086C2/uk unknown
- 2012-09-07 US US14/343,813 patent/US10246720B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-07 IN IN1849DEN2014 patent/IN2014DN01849A/en unknown
- 2012-09-07 WO PCT/CA2012/050622 patent/WO2013033846A1/en active Application Filing
- 2012-09-07 CA CA2847715A patent/CA2847715A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-07 AU AU2012307006A patent/AU2012307006B2/en not_active Ceased
- 2012-09-07 EP EP12829500.3A patent/EP2753698B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2012307006B2 (en) | 2017-08-03 |
| IN2014DN01849A (uk) | 2015-05-15 |
| CA2847715A1 (en) | 2013-03-14 |
| EP2753698A1 (en) | 2014-07-16 |
| EP2753698B1 (en) | 2018-10-24 |
| AU2012307006A1 (en) | 2014-04-17 |
| WO2013033846A1 (en) | 2013-03-14 |
| EP2753698A4 (en) | 2015-02-11 |
| US20140380525A1 (en) | 2014-12-25 |
| US10246720B2 (en) | 2019-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shao et al. | Using CRISPR/Cas9 genome editing system to create MaGA20ox2 gene‐modified semi‐dwarf banana | |
| Okamura et al. | Starch reduction in rice stems due to a lack of OsAGPL1 or OsAPL3 decreases grain yield under low irradiance during ripening and modifies plant architecture | |
| UA116086C2 (uk) | Трансгенна однодольна рослина з підвищеною ефективністю використання азоту | |
| Wang et al. | Roles of plasmalemma aquaporin gene StPIP1 in enhancing drought tolerance in potato | |
| CN101466259A (zh) | 用于植物改良的基因及其用途 | |
| CN109694872A (zh) | 调控基因表达的方法 | |
| CN104592373B (zh) | Myb28蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用 | |
| Zhao et al. | DEP1 is involved in regulating the carbon–nitrogen metabolic balance to affect grain yield and quality in rice (Oriza sativa L.) | |
| Okamura et al. | Suppression of starch synthesis in rice stems splays tiller angle due to gravitropic insensitivity but does not affect yield | |
| US10704053B2 (en) | Methods and compositions for enhanced forage quality | |
| Lian et al. | Physiological and photosynthetic characteristics of indica Hang2 expressing the sugarcane PEPC gene | |
| CN101213304A (zh) | 含异源黄素血红蛋白基因的植物及其使用方法 | |
| CN109152344A (zh) | 具有增强性状的转基因植物 | |
| US11525142B2 (en) | Zea mays NLP transcription factor ZmNLP5 and use thereof | |
| CN105483154B (zh) | Ots1蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用 | |
| Zhou et al. | Overexpression of V-type H+ pyrophosphatase gene EdVP1 from Elymus dahuricus increases yield and potassium uptake of transgenic wheat under low potassium conditions | |
| Geda et al. | Enhancement of drought tolerance in rice through introgression of Arabidopsis DREB1A through transgenic approach | |
| CN111826364A (zh) | 一种抗病虫害相关基因及其应用 | |
| CN113416238B (zh) | ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN105461790B (zh) | Myb99蛋白及其编码基因在调控植物种子萌发中的应用 | |
| Li et al. | The tomato WRKY transcription factor SLWRKY17 positively regulates drought stress tolerance in transgenic tobacco plants | |
| CN101864429B (zh) | 利用玉米Lc基因培育抗棉铃虫植物的方法 | |
| CN105566470A (zh) | 一种通过下调PAB2和PAB8提高植物对NaCl耐受性的方法 | |
| UA124831C2 (uk) | Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин | |
| Milner et al. | OsPSTOL but not TaPSTOL can play a role in nutrient use efficiency and works through conserved pathways in both wheat and rice |