CN111876519B - 水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性、提高水稻对稻飞虱抗性和构建抗稻飞虱的水稻中的应用。本发明证实了OsCslF6基因是水稻β‑D‑葡聚糖合成的关键基因，并且高表达水平的OsCslF6基因可以显著提高水稻对稻飞虱的抗性。基于对OsCslF6基因表达与稻飞虱抗性关系的研究，本发明还提供了一种提高水稻对稻飞虱抗性的方法，即过表达水稻的OsCslF6基因。本发明为水稻抗稻飞虱的关键分子遗传机理提供了依据，对培育抗性水稻品种、提高水稻质量和品质具有重要指导意义。

Description

水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，更具体地，涉及水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用。
背景技术
水稻是亚洲地区最重要的粮食作物之一，稻飞虱作为水稻专一性害虫，以其突发性、迁飞性和猖獗性等特性，已成为水稻最具毁灭性的害虫之一，每年给亚洲稻区水稻品质和产量造成巨大影响。在水稻和稻飞虱长时间协同进化中，一方面，稻飞虱从生理、形态、行为、遗传和分子等方面逐渐适应并克服水稻防御系统；另一方面，水稻也针对稻飞虱危害演化出特定的防御机制，而水稻抵抗稻飞虱的关键分子遗传机理还未明确。
目前，在水稻生产中抵抗稻飞虱主要以喷施农药为主，然而化学农药不仅会造成环境污染和稻米农药残留，也会导致稻飞虱种群耐药性提高，产生抗药性。
因此，进行水稻抗稻飞虱的分子机理研究、选育高抗水稻品种是稻飞虱防治最为经济有效的途径，对提高水稻的质量和品质具有至关重要的作用。其中，水稻响应稻飞虱胁迫的分子机制非常复杂，目前为止，已鉴定到了Bph14(何光存，水稻抗褐飞虱基因Bph14的分离和功能分析，武汉大学)、Bph6(CN201510172218.X)等多个水稻抗稻飞虱基因位点，为保障水稻产量和品质提供了很好的认知。因此，深入挖掘水稻响应稻飞虱重要基因在农业生产中至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有水稻抵抗稻飞虱方法的缺陷和不足，提供水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用，为水稻抗稻飞虱的关键分子遗传机理提供依据。
本发明的第二个目的是提供水稻OsCslF6基因在提高水稻对稻飞虱抗性中的应用。
本发明的第三个目的是提供水稻OsCslF6基因在构建抗稻飞虱的水稻中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种提高水稻对稻飞虱抗性的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用。
本发明还提供了水稻OsCslF6基因在提高水稻对稻飞虱抗性中的应用。
本发明还提供了水稻OsCslF6基因在构建抗稻飞虱的水稻中的应用。
所述OsCslF6基因的核苷酸序列的Accession：AP014964.1。
优选地，所述鉴定的方法包括以下步骤：
S1.培养野生型水稻和待测水稻，接种稻飞虱；
S2.筛选并定量野生型水稻中高表达的OsCslF6基因，与待测水稻OsCslF6基因的表达检测结果进行比较，判断所述待测水稻是否抗稻飞虱。
优选地，所述稻飞虱为3～5龄期稻飞虱若虫。
更优选地，所述稻飞虱为3龄期稻飞虱若虫。
优选地，所述水稻生长发育至四叶期时，接种稻飞虱。
优选地，所述判断的方法为：若所述待测水稻OsCslF6基因的表达量和所述野生型水稻OsCslF6基因的表达量相等，则所述待测水稻对稻飞虱无抗性；若所述待测水稻OsCslF6基因的表达量高于野生型水稻OsCslF6基因的表达量，则所述待测水稻对稻飞虱有抗性；若所述待测水稻中的OsCslF6基因的表达量低于或显著低于野生型水稻OsCslF6基因的表达量，则待测水稻对稻飞虱敏感。
本发明还提供了一种提高水稻对稻飞虱抗性的方法，过表达水稻的OsCslF6基因。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了水稻OsCslF6基因在鉴定水稻对稻飞虱抗性、提高水稻对稻飞虱抗性和构建抗稻飞虱的水稻中的应用。本发明研究发现，高表达水平的OsCslF6基因可以显著提高水稻对稻飞虱的抗性。本发明还提供了提高水稻对稻飞虱抗性的方法，可显著提高水稻对稻飞虱的抗性。本发明为水稻抗稻飞虱的关键分子遗传机理提供了依据，对培育抗性水稻品种、提高水稻质量和品质具有重要指导意义。
附图说明
图1是稻飞虱诱导水稻基因OsCslF6表达的结果图。
图2是通过CRISPR-Cas9技术构建得到的oscslf6-Cas9转基因植物结果图；其中，图a是OsCslF6基因的基因结构以及CRISPR-Cas9打把位点设计图；图b是oscslf6-Cas9转基因植物鉴定结果图。
图3是oscslf6-Cas9转基因水稻相对野生型NIP水稻在稻飞虱处理前后的表型结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所用的材料：
水稻(野生型NIP，Oryza.Sativa L.spp.japonica)，oscslf6-Cas9转基因水稻；
标准品：β-D-葡聚糖；
单子叶植物CRISPR-Cas9系统：由华南农业大学刘耀光院士提供。
实施例1水稻基因OsCslF6表达与对稻飞虱抗性的关系
利用qRT-PCR方法筛选稻飞虱诱导基因，筛选到基因OsCslF6被稻飞虱显著诱导，具体实验方法及结果如下：
1、实验方法
S1.在温度28℃、光周期12h光照/12h黑暗的培养条件下，萌发野生型NIP水稻，在1/2MS培养基上生长2周；
S2.将步骤S1所得水稻转移至水稻盆中，在温度28℃、光周期10h光照/14h黑暗的培养条件下，生长至四叶期；
S3.在步骤S2所得水稻上接种10头3龄期稻飞虱，分别在接种0h、6h、12h、24h取水稻茎部材料；
S4.运用Trizol法提取步骤S3得到的水稻材料RNA，并且反转录为cDNA；
S5.以步骤S4所得cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。
2、实验结果
稻飞虱诱导水稻基因OsCslF6表达量的结果如图1所示，可以看出，在接种稻飞虱6h、12h、24h后，水稻茎部材料中的OsCslF6基因表达量显著升高，表明水稻基因OsCslF6被稻飞虱显著诱导。
实施例2 oscslf6-Cas9转基因水稻相对野生型水稻在稻飞虱处理前后的表型分析
一、通过CRISPR-Cas9技术构建oscslf6-Cas9转基因植物，具体实验方法及结果如下：
1、实验方法
S1.在OsCslF6基因第一个外显子上设计CRISPR-Cas9打靶序列；
S2.利用单子叶植物CRISPR-Cas9系统将打靶序列克隆到双原载体；
S3.将所得载体转化至农杆菌EHA105后，遗传转化得到稳定植物。
2、实验结果
通过CRISPR-Cas9技术构建得到的oscslf6-Cas9转基因植物结果如图2所示，可以看出，oscslf6基因已被成功沉默掉。
二、转基因植物oscslf6-Cas9相对野生型NIP对稻飞虱耐受性明显降低，具体实验方法及结果如下：
1、实验方法
S1.在温度28℃、光周期12h光照/12h黑暗的培养条件下，萌发野生型NIP水稻和oscslf6-Cas9转基因水稻，在1/2MS培养基上生长2周；
S2.将步骤S1所得水稻转移至水稻盆中，在温度28℃、光周期10h光照/14h黑暗的培养条件下，生长至四叶期；
S3.在步骤S2所得水稻上接种10头3龄期稻飞虱，观察水稻生长状况并统计水稻存活率。
2、实验结果
oscslf6-Cas9转基因水稻相对野生型NIP水稻在稻飞虱处理前后的表型结果如图3所示，可以看出，在稻飞虱处理前，与野生型NIP水稻相比，oscslf6-Cas9转基因水稻植株矮小；在稻飞虱处理后，与野生型NIP水稻相比，转基因水稻植株长势较好，生长状况均有所改善，且存活率提高。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.检测水稻OsCslF6基因表达水平的试剂在鉴定水稻对稻飞虱抗性中的应用，其特征在于，鉴定的标准是：OsCslF6基因表达量越高，水稻对稻飞虱抗性越强；反之抗性越弱。
2.水稻OsCslF6基因表达激活剂在构建抗稻飞虱的水稻品种中的应用。
3.一种水稻OsCslF6基因表达对稻飞虱抗性的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：
S1.培养野生型水稻和待测水稻，接种稻飞虱；
S2.分别定量检测野生型水稻和待测水稻中OsCslF6基因表达量，检测结果进行比较，判断所述待测水稻是否抗稻飞虱；
判断方法为：
若所述待测水稻OsCslF6基因的表达量和所述野生型水稻OsCslF6基因的表达量相等或相差不显著，则所述待测水稻对稻飞虱无抗性；
若所述待测水稻OsCslF6基因的表达量高于或显著高于野生型水稻OsCslF6基因的表达量，则所述待测水稻对稻飞虱有抗性；
若所述待测水稻OsCslF6基因的表达量低于或显著低于野生型水稻OsCslF6基因的表达量，则待测水稻对稻飞虱敏感。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，S1步骤中接种稻飞虱为3～5龄期稻飞虱若虫。
5.一种提高水稻对稻飞虱抗性的方法，其特征在于，过表达水稻的OsCslF6基因。
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