CN105586348A - 赋予植物黄萎病抗性的lrk2基因及其应用 - Google Patents

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CN105586348A CN201610112767.2A CN201610112767A CN105586348A CN 105586348 A CN105586348 A CN 105586348A CN 201610112767 A CN201610112767 A CN 201610112767A CN 105586348 A CN105586348 A CN 105586348A
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刘廷利
顾周航
周雪平
张保龙
杨郁文
陈天子
凌溪铁
王金彦
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Abstract

本发明涉及赋予植物黄萎病抗性的<i>LRK2</i>基因及应用，属于生物技术领域。<i>LRK2</i>基因是从陆地棉品种奥3503品种中获得的一个表面受体蛋白基因，<i>LRK2</i>完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。<i>LRK2</i>转基因拟南芥对落叶型黄萎病菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗病性明显增强，转基因拟南芥发病率均低于20%，而对照野生型发病率均大于50%。

Description

赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及其应用
一、技术领域
本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及应用，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。
二、背景技术
目前，生产上黄萎病危害十分严重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病害，造成减产甚至绝收，尚无有效的防治措施。黄萎病的病原主要为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，以微菌核(microsclerotia)形式长期存在于土壤中。黄萎病菌在寄主植物上会表现出致病性差异，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAPD指纹图谱聚类分析将我国棉花黄萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分复杂(张天真,2000)。另外，由转座子和DNA水平转移等引起黄萎病菌的遗传变异也限制了棉花抗黄萎病育种(AmyotteSG，etal.,2012；deJonge,etal.,2012)。因此，克隆抗性基因、解析抗病机制对抗黄萎病育种意义重大而迫切。
然而，目前对黄萎病具有抗性的基因较少，尤其对棉花黄萎病具有稳定广谱高抗的基因未见报道。Fradin等(2011)将番茄中Ve1转化拟南芥，获得了对黄萎病菌的抗性，而该基因转化烟草和棉花后，不具有黄萎病抗性，表明该基因在植物上的应用具有物种特异性(刘琳琳等，棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Ve1，中国科学:生命科学，2014(44)卷第8期:803-814)。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Ve1基因(Fradinetal.,2009)和棉花GbVe基因(Zhangetal.,2011)部分同源的Gbve1基因，该基因也具有典型的植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默Gbve1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失；并且，Gbve1基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明Gbve1基因对强致病力的落叶型和非落叶型黄萎病菌都具有抗性(Zhangetal.,2012a)，但是并未获得高抗黄萎病品种。除了Ve基因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPR1基因的转基因棉花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Parkhietal.2010)。另外，水稻黄单胞菌harpin蛋白、几丁质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、防御素(θ-Defensins)(Miaoetal.,2010；Munis,2010；NiMetal.,2013)也对黄萎病表现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、以及抗性效果未达到预期目标等，从而限制了这些基因在生产上的应用。
本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503的转录组进行分析，发现一个受黄萎病侵染诱导表达的基因LRK2，该基因与雷蒙德氏棉LYK2-Like基因(GossypiumraimondiiproteinLYK2-like，登录号XM_012602491)相似度98％，以该基因的序列为模板设计引物将LRK2基因克隆，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株对落叶型以及非落叶型菌系均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因LRK2的分离可以进一步丰富抗性基因资源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性LRK2基因的应用，该基因编码一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高受体植物对落叶黄萎病病原菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。
技术方案
赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，其序列为SEQIDNO.1。该基因来源于陆地棉品种奥3503。LRK2基因完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。
本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。
本发明赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991(徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496)的诱导后表达量增加，将LRK2与pCambia2301(上海北诺生物科技有限公司)载体构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因对棉花黄萎病强致病力落叶型菌株V991以及强致病力非落叶型菌株BP2均具有较高抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或用在棉花黄萎病抗性改良中。
LRK2的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。
所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。包括：
1)LRK2基因的克隆以及植物表达载体的构建
以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物
P1:5’-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3’，
P2:5’-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3’
扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用XbaI/BamHI酶切，连接到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301:LRK2；2)转基因植株的获得
将步骤1)中构建好的pCambia2301:LRK2质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸花法转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代，T1代种子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达：
用引物
P3:5’-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3’
P4:5’-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3’
扩增候选的阳性T1代植株的DNA和cDNA进行PCR鉴定，在DNA和cDNA水平均能扩增获得821bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株。收获的种子为T2代。T2代阳性转基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上生长，且具有黄萎病抗性。
有益效果
1.本发明获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因。本发明获得的LRK2基因来源于陆地棉品种奥3503，该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将LRK2与构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因在转基因植株中表达后对落叶型强致病力黄萎病菌V991和非落叶型强致病力黄萎病菌BP2均具有较强的抗性，平均发病率分别为18.95％、16.6％，而对照野生型的发病率分别为61.20％、55.70％。LRK2的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。
2.本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。LRK2的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。LRK2是怎样将抗性信号传导的，此基因参与了哪些信号传导过程，可以利用该基因的转基因植株进行进一步分析，从而获得抗性信号传导通路。LRK2的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。
3.本发明应用于黄萎病抗性育种。LRK2抗性效果良好，对测试的落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型黄萎病菌系BP2，发病率均低于20％，而对照的发病率在50％以上，大幅提高了对黄萎病的抗性，在育种中有较大的应用价值。
四、附图说明
图1落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2处理陆地棉品种奥3503后LRK2的表达。
图2LRK2转基因植株的DNA水平分子检测。M,Marker。WT为未转化植株；LRK2为卡那霉素筛选出的抗性转化株。
图3LRK2转基因植株的RNA水平检测。WT为未转化植株；LRK2为卡那霉素筛选出的抗性转化株。上排以cDNA为模板，LRK2引物扩增，下排是内参Actin引物扩增。
图4落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种LRK2转化植株和对照株的发病率调查。WT为未转化植株，LRK2为转化株。
图5落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种LRK2转化植株和对照株的表型。WT为未转化植株，LRK2为转化株。
图6落叶型黄萎病菌系V991和非落叶型菌系BP2接种LRK2转化植株和对照株的相对菌丝含量。WT为未转化植株，LRK2为转化株。
五、具体实施方式
下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。本实验中基因来源于陆地棉品种奥3503(Gossypiumhirsutum)(刘小双，刘廷利，袁洪波，张保龙，王荣富.棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析.中国农业科学,2015,48(12):2306-2316)。
(一)棉花LRK2克隆以及序列分析
根据雷蒙德氏棉LYK2-Like基因(Gossypiumraimondii,proteinLYK2-like，登录号XM_012602491)设计引物
P1:5’-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3’，
P2:5’-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3’
以陆地棉品种奥3503的cDNA模板扩增，在25μl反应体系中加入cDNA模板1μl，引物各5nmol，5μl5×primeSTARbuffer(Mg2+plus)PCR缓冲液，0.2mMdNTP，1UprimeSTARHSDNAPolymerase(TaKaRa公司)进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃3′后94℃45″，56℃45″，72℃2′，循环36次，再72℃延伸10′。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上检测，得到片段为2016bp，将该片段命名为LRK2基因，其序列为SEQIDNO.1。将该片段进行末端加A处理(北京天恩泽基因科技有限公司)并与pGEM-Teasy载体(Promega公司)连接。连接产物用JM109(北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞进行热激转化。测序由上海英骏生物工程公司完成，成功构建的质粒命名为pGEM-Teasy:LRK2。用DNAclub进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST分析。数据库ExPASy(http://cn.expasy.org/)进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。该基因编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。
(二)棉花LRK2的诱导表达分析
所用棉花为3个星期苗龄，病原菌培养条件为：菌株为落叶型强致病力病原菌V991(徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496；张天真,周兆华,闵留芳,等.棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技术.作物学报,2000,26(6):673-680)和非落叶型菌株BP2(BaolongZhang,YuwenYang,TianziChenetal.IslandCottonGbve1GeneEncodingAReceptor-LikeProteinConfersResistancetoBothDefoliatingandNon-DefoliatingIsolatesofVerticilliumdahliae,PloSONE,7(12):e51091)。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入PDB培养液(马铃薯200g，沸水煮40分钟，双层纱布过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L，121℃高温高压灭菌20min)，25℃，120r·min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。接种方法为蘸根法(FradinF.,Abd-El-HaliemA.,MasiniL.etal,InterfamilyTransferofTomatoVe1MediatesVerticilliumResistanceinArabidopsis,PlantPhysiology,2011,156:2255–226)，将分生孢子浓度调整为1×107/mL，将棉花根系洗净在分生孢子野种浸泡5min后，栽入土中。分别采集未诱导和诱导后棉花根系，提取总RNA并合成cDNA，并进行后续的RT-PCR分析(RNA提取方法及cDNA合成方法见附录)，引物序列为：
P5:5’-ATTGGGAACTTTGGTATGGCAAG-3’
P6:5’-CATAAGCAAATATGTCAATGCCTG-3’。
表达分析结果显示V991和BP2处理2d后，根系中LRK2基因表达量明显增加，上调表达，V991处理在8天达到最高，而BP2处理在12天达到最高(图1)。
(四)LRK1基因植物表达载体的构建以及植物转化
以上述已经构建好的pGEM-Teasy:LRK2质粒为模板，用XbaI/BamHI酶切，并回收2016bp片段，与pCambia2301载体连接，经测序验证100％匹配，获得的阳性质粒命名为pCambia2301:LRK2。提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404(上海北诺生物科技有限公司)。用蘸花法转化拟南芥，在1/2MS卡那抗性(25μg/mL)筛选获得T1代植株，用基因PCR以及RT-PCR分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，在DNA以及RNA水平均能扩增获得片段的则视为阳性转化株，引物为
P3:5’-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3’
P4:5’-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3’
扩DNA扩PCR鉴定821bp大小片段(图2)。通过PCR鉴定可扩增片段的T1代植株为候选，再利用RT-PCR检测，可扩增出821bp片段的则为表达的T1阳性株(图3)。收获T1代转基因植株种子为T2代。将转基因植株种子T2代播种于含有25mg/L卡那霉素的1/2MS培养基，挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于抗病性鉴定。
(五)T2代转化株的抗病性鉴定
对LRK2基因可以正常表达的转化株系进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选的绿苗转入营养土中，每盆移栽1株幼苗。待拟南芥生长2周后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为棉花黄萎菌落叶型强致病力菌株V991(徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496；张天真,周兆华,闵留芳,等.棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技术.作物学报,2000,26(6):673-680)和非落叶型菌株BP2(BaolongZhang,YuwenYang,TianziChenetal.IslandCottonGbve1GeneEncodingAReceptor-LikeProteinConfersResistancetoBothDefoliatingandNon-DefoliatingIsolatesofVerticilliumdahliae,PloSONE,7(12):e51091)。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入PDB培养液，25℃，120r·min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数，调整孢子浓度为1×107，每种病原菌的鉴定株数40株，接种后每天观察病害的发生情况，在15天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。抗病性鉴定结果显示，对于落叶型黄萎病V991，对照野生型病指达到61.2％，而转基因株系的平均病指仅为18.95％；对于非落叶型黄萎病BP2，对照野生型病指达到55.7％，而转基因株系的平均病指仅为16.6％(图4，图5)。进一步提取发病拟南芥植株DNA，并通过PCR对发病的拟南芥的菌丝进行定量。数据显示定量结果与表型一致，接种V991的转基因植株中的菌丝含量仅为野生型拟南芥18.73％，而接种BP2的转基因植株中菌丝含量仅为野生型含量的15.87％(图6)。表明LRK2可显著增强拟南芥对落叶型菌系V991以及非落叶型菌系BP2的抗性。
附录：
1.RNA提取方法
(1)取材料加液氮充分研磨成粉末状转运至离心管中；
(2)加10倍体积的RNA提取缓冲液，震荡混匀，50℃水浴约20min，中途可混合2-3次；
(3)加0.6倍体积的氯仿，混匀，静置冰浴20min；
(4)12000rpm离心20min，将上清转运至一新离心管中；
(5)加1/2体积的8MLiCl溶液，冰浴过夜(12h以上)；
(6)12000rpm离心20min，弃上清，用70％酒精洗沉淀1次并将沉淀转运至一新的离心管中；
(7)12000rpm离心20min，弃乙醇溶液，沉淀抽干20min；
(8)加200ul无RNase的水溶解沉淀，加1倍体积的水饱和酚/氯仿＝1:1充分混匀，静置5min；
(9)12000rpm离心20min，将上清转运至另一新的离心管中，再加1倍体积的水饱和酚/氯仿＝1:1重复抽提一次；
(10)12000rpm离心20min，上清加1倍体积的氯仿抽提一次；
(11)12000rpm离心20min，上清加1/2体积8MLiCl溶液，冰浴过夜(12h以上)；
(12)12000rpm离心20min，沉淀用70％酒精洗一次。抽干后溶于100-200ul无RNase的水中。取2ul检测质量。
2.cDNA的合成
将提取的RNA用DNaseI37℃纯化处理30min后备用。用TransScriptReverseTranscriptase试剂盒(Transgen公司)合成第一链cDNA。体系如下：
42℃45min，85℃5min。于-20℃保存。
LRK2基因，其序列为SEQIDNO.1：
ATGGCATCTGTAATGAGTAAAATATACTTGATAGCTTTGGTCTTATTAATATGGTTACTTGTCTCTCCACTTGGACAGAACTTGCTTAGCTGTAACGTTACATCTCCAGATGCTTTGGGTTACCGTTGTCGTATAAATAGATCAGAGGATCAATGCGGCACGTTCGTGGTGCTTCGAGCTACATCATACTACTCATCTCTTTCCAATCTGAGCTTTTATTTAGGCTTCAACAGGGTTGCAATTGCTGAAGCTAATGGCTTCTCTGCACAAACTGAGTTTCTACCAAGAGATCAGCCTTTGCTGTTGCCAATTGATTGTAAATGCAACAATGGTTTGTTCCATGCTGATTTAACAAAAACTACAATCAAAGGGGAGAGCTTCTATGGTATTGCTGAATCACTGCAAGGCTTGACAACCTGCAAAGCAATCCAAGACAAGAATCCCGGGGTCTCACCATGGGGTCTTGGTGACAAAGTCCGGTTAGTGGTACCACTAAGATGCGCATGTCCGTCGCCGTCTGAAGTCGCTTTGAAAGTAAGGCTCTTACTTTCTTACCCTGTAAGTCCAGGTGATACAATTTTTAACTTGGCTGCTGCCTTCAATACAACCTCAGAAGCTATAATATCAACAAATAACAGATCTTTAGAGACTTTTGAACCTGAAAGTTTAGCTACTCTTACATCTCTTTTGATTCCACTTAATGGTGAGCCCCTTCCTCATTTTCCGGAAACCAGCATTCCTATAATTAACCCTCAGAAGAAAAAGCCAAGGATGTGGAAAGTGGGAGTTTATATTGCTGTAAGTGGTGTTGTAATTGGGACTATCATTGCTGTTGCAGCAACCTTCTTGGTGATCCGATTGAAGAGGAAAAAGAAGAAGCAAAACTTAAGCAAGGATGATGATTTGGAACTGCAGCAGCTTAGCTTAAGTGTGCGGACTGCAAGCGAGAAGAAAGTCTCGTTTGCAGGATCTCAGAATGCCGGAGACGGTCGGCTGATAGACAGTGTTACACCTCGTAAGGCGCTACTGGAGTTATATACCATAGAGGAGCTCAGGAAAGCTACCGAGGATTTCAATCCGAGTACTCAGATAGAGGGAAGTGTGTATCATGGTCATCTCAATGGGAAAAGCATGGCAATAAGGCGCACTAGAACAGAAAATATTTCAAAGGTTGAGACTAGATTCTTTACTGATGCAACTCATCACCACCCAAACATAATTAGATTACTCGGAACATGTGTGACTGAGGGCTCCCATTCATTTTTGGTCTTTGAATATGCAAAAAATGGTTCCTTGAAGGATTGGTTACATGGTGGATTGGCAATGAAAAATCAGTTCATAGCCTCATGTTACTGCTTCTTGACATGGAAGCAAAGGCTGAAGATCAGTTTCGATATAGCCGTGGCATTACAGTATATGCATCAAGTTATGAATCCGAGCTATGTTCATAGAAATATCAAGAGCCGAAGCATATTCCTGGATGAAGATTTGAATGCAAAGATTGGGAACTTTGGTATGGCAAGGTGTGTTGAAGATGATACAAAATATCCTGATCTTTCAACAAACCCTTCCAGTTGGAGCTTGGGTTATCTAGCTCCTGAATATCTTCACCAAGGTGTGATCTCCCCAGGCATTGACATATTTGCTTATGGGATAGTTTTGCTCGAAATCTTATCGGGACAAACCCCGATAAGCCGACCGGATAAGAAAGGAGGCGGGAACGTTTGGCTTTCGGAGAAAATCAAGGCCATATTACAATCAGAAAGCGCAGATGAATTAAGGGCATGGATGGACAGTGCATTAGGGGAGAATTACTCATTTGATATGGCAGTCACATTGGCAAACCTTGCAAGAGCTTGCACTGAAGAAGACCCTTGCTTGAGACCAAGTGCTGGAGAGATCGTTGGCAGGTTATCAAGATCGGTGGAAGAACCAACAGAAGGAGAACACACATTGATCTTCGAAAGCTCTTCCAAACCTCTGGTAAACACATCATCCACAACATCCAATCTGTGA。
SEQUENCELISTING
<110>江苏省农业科学院
浙江理工大学
<120>赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及其应用
<130>0
<160>7
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>2016
<212>DNA
<213>陆地棉品种奥3503（Gossypiumhirsutum）
<220>
<221>LRK2基因
<222>(1)..(2016)
<223>
<400>1
atggcatctgtaatgagtaaaatatacttgatagctttggtcttattaatatggttactt60
gtctctccacttggacagaacttgcttagctgtaacgttacatctccagatgctttgggt120
taccgttgtcgtataaatagatcagaggatcaatgcggcacgttcgtggtgcttcgagct180
acatcatactactcatctctttccaatctgagcttttatttaggcttcaacagggttgca240
attgctgaagctaatggcttctctgcacaaactgagtttctaccaagagatcagcctttg300
ctgttgccaattgattgtaaatgcaacaatggtttgttccatgctgatttaacaaaaact360
acaatcaaaggggagagcttctatggtattgctgaatcactgcaaggcttgacaacctgc420
aaagcaatccaagacaagaatcccggggtctcaccatggggtcttggtgacaaagtccgg480
ttagtggtaccactaagatgcgcatgtccgtcgccgtctgaagtcgctttgaaagtaagg540
ctcttactttcttaccctgtaagtccaggtgatacaatttttaacttggctgctgccttc600
aatacaacctcagaagctataatatcaacaaataacagatctttagagacttttgaacct660
gaaagtttagctactcttacatctcttttgattccacttaatggtgagccccttcctcat720
tttccggaaaccagcattcctataattaaccctcagaagaaaaagccaaggatgtggaaa780
gtgggagtttatattgctgtaagtggtgttgtaattgggactatcattgctgttgcagca840
accttcttggtgatccgattgaagaggaaaaagaagaagcaaaacttaagcaaggatgat900
gatttggaactgcagcagcttagcttaagtgtgcggactgcaagcgagaagaaagtctcg960
tttgcaggatctcagaatgccggagacggtcggctgatagacagtgttacacctcgtaag1020
gcgctactggagttatataccatagaggagctcaggaaagctaccgaggatttcaatccg1080
agtactcagatagagggaagtgtgtatcatggtcatctcaatgggaaaagcatggcaata1140
aggcgcactagaacagaaaatatttcaaaggttgagactagattctttactgatgcaact1200
catcaccacccaaacataattagattactcggaacatgtgtgactgagggctcccattca1260
tttttggtctttgaatatgcaaaaaatggttccttgaaggattggttacatggtggattg1320
gcaatgaaaaatcagttcatagcctcatgttactgcttcttgacatggaagcaaaggctg1380
aagatcagtttcgatatagccgtggcattacagtatatgcatcaagttatgaatccgagc1440
tatgttcatagaaatatcaagagccgaagcatattcctggatgaagatttgaatgcaaag1500
attgggaactttggtatggcaaggtgtgttgaagatgatacaaaatatcctgatctttca1560
acaaacccttccagttggagcttgggttatctagctcctgaatatcttcaccaaggtgtg1620
atctccccaggcattgacatatttgcttatgggatagttttgctcgaaatcttatcggga1680
caaaccccgataagccgaccggataagaaaggaggcgggaacgtttggctttcggagaaa1740
atcaaggccatattacaatcagaaagcgcagatgaattaagggcatggatggacagtgca1800
ttaggggagaattactcatttgatatggcagtcacattggcaaaccttgcaagagcttgc1860
actgaagaagacccttgcttgagaccaagtgctggagagatcgttggcaggttatcaaga1920
tcggtggaagaaccaacagaaggagaacacacattgatcttcgaaagctcttccaaacct1980
ctggtaaacacatcatccacaacatccaatctgtga2016
<210>2
<211>29
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>P1
<222>(1)..(29)
<223>
<400>2
ThrGlyCysThrCysThrAlaGlyAlaAlaThrGlyGlyCysAlaThr
151015
CysThrGlyThrAlaAlaThrGlyAlaGlyThrAlaAla
2025
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>P2
<222>(1)..(28)
<223>
<400>3
cgcggatcctcacagattggatgttgtg28
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>P3
<222>(1)..(20)
<223>
<400>4
caggatctcagaatgccgga20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>
<220>
<221>P4
<222>(1)..(20)
<223>
<400>5
tgcccttaattcatctgcgc20
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>
<220>
<221>P5
<222>(1)..(23)
<223>
<400>6
attgggaactttggtatggcaag23
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>
<220>
<221>P6
<222>(1)..(24)
<223>
<400>7
cataagcaaatatgtcaatgcctg24

Claims (6)

1.赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因,其序列为SEQIDNO.1。
2.权利要求1所述LRK2基因的应用。
3.权利要求1所述LRK2基因在植物黄萎病抗性中的的应用。
4.权利要求1所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，包括：
1)LRK2基因的克隆以及植物表达载体的构建
以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物
P1:5’-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3’，
P2:5’-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3’
扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用XbaI/BamHI酶切，连接到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301:LRK2；
2)转基因植株的获得
将步骤1)中构建好的pCambia2301:LRK2质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸花法转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代，T1代种子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达：
用引物
P3:5’-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3’
P4:5’-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3’
扩增候选的阳性T1代植株的DNA和cDNA进行PCR鉴定，在DNA和cDNA水平均能扩增获得821bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株。
6.权利要求5所述应用中构建的重组载体pCambia2301:LRK2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107586782A (zh) * 2017-10-09 2018-01-16 南京农业大学 一种通过干扰黄萎病菌VdRGS1基因表达显著提高棉花对黄萎病抗性的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174529A (zh) * 2011-03-18 2011-09-07 江苏省农业科学院 棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用
CN104988159A (zh) * 2015-07-22 2015-10-21 江苏省农业科学院 棉花耐旱基因GhEXP1及其应用
EP3056569A2 (en) * 2009-12-28 2016-08-17 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3056569A2 (en) * 2009-12-28 2016-08-17 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
CN102174529A (zh) * 2011-03-18 2011-09-07 江苏省农业科学院 棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用
CN104988159A (zh) * 2015-07-22 2015-10-21 江苏省农业科学院 棉花耐旱基因GhEXP1及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾周杭: "棉花叶皱缩病毒诱导的基因沉默体系的建立及其应用", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107586782A (zh) * 2017-10-09 2018-01-16 南京农业大学 一种通过干扰黄萎病菌VdRGS1基因表达显著提高棉花对黄萎病抗性的方法

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