CN103320467B - 赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因及应用，属于生物技术领域。GrVe基因是从黑峰葡萄品种中获得的一个表面受体蛋白基因，该基因含有12个LRR保守结构域，C端有1个跨膜结构域。GrVe转基因表达株的黄萎病抗病性明显增强，不仅可以延迟发病，并且病指也大为降低。在病原菌接种后16，19，27天后，对于落叶型黄萎病V991，转基因株系黄萎病抗病性均明显增强。

Description

赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用

一、技术领域

本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用，涉及植物基因克隆以及功能分析，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)侵染引起的广泛存在于世界各地区的最严重的土传真菌性维管束系统病害。病原物以微菌核（microsclerotia）形式长期存在于土壤中，受到根分泌物的刺激而萌发，形成的芽管侵染植物根部，在根部皮层的细胞间或细胞内生长，最终蔓延到木质部以及整个植株（Veronese P etal.,2003）。黄萎菌属非专性寄生菌，寄主十分广泛，不同菌系间致病力悬殊。病原菌在寄主植物上所表现的致病性差异是病原菌与寄主植物互作的程度不同所造成的，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAPD指纹图谱聚类分析将我国棉花黄萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分复杂（张天真,2000）。

棉花黄萎病为土传病害，可造成蕾、铃的大量脱落，发病严重时脱落成光杆，甚至死亡，使棉花减产20～60％，是中国棉花生产最主要病害。到目前为止，尚无有效的防治药剂，只能依靠种植抗病品种为主的综合防治措施(简桂良等,2003；张保龙等，2012)。但我国近年来推广的棉花新品种多为感病或耐病，抗病品种的匮乏，致使该病的危害日益严重（简桂良等,2003）。黄萎病抗性资源主要存在亚洲棉和海岛棉等野生种质资源中，但由于回交选择的和杂交的障碍，很难直接利用。黄萎病菌是广谱寄生菌，能侵染二百多种植物，且其微菌核在无寄主的情况下，可以顺利越冬，并可在土壤中存活数年(Klimes and Dobinson,et al.,2006)。另外，由于转座子和DNA水平转移等引起黄萎病菌遗传变异也限制了棉花抗黄萎病育种（Amyotte SG，et al.,2012；de Jonge,et al.,2012）。因此，克隆抗性基因、解析抗病机制对抗黄萎病育种意义重大而迫切。

番茄(Lycopersicon esculentum)的Ve基因是第一个克隆的抗黄萎病基因，Ve基因位点包含Ve1和Ve2两个基因，是一种受体蛋白（receptor-like protein，RLP）基因，将其转入感病马铃薯品种后能提高对黑白轮枝菌的抗性(Kawchuk et al.2001)。当把Ve1和Ve2基因单独转化番茄以及VIGS（virus-induced gene silencing）沉默番茄内源Ve基因后，发现只有Ve1为黄萎病抗性基因，而Ve2不具有黄萎病抗性(Fradin et al.,2006)。番茄Ve1基因的克隆为通过转基因进行抗黄萎病育种奠定了基础。Fradin等(2011)将番茄Ve1和Ve2基因转化拟南芥，转Ve1基因植株对黄萎病菌产生了抗性，而转Ve2基因植株则感病，证明番茄Ve1基因可用于其它作物的抗黄萎病育种。

根据同源克隆方法，相继克隆了与番茄Ve基因同源的二倍体番茄的SlVe1、水茄的StVe、野生薄荷的mVe1(Vining and Davis2009)等基因。Zhang等（2011）从海岛棉Pima90-53中克隆了GbVe基因，该基因也属于RLP蛋白基因，与番茄Ve1和Ve2基因相似性分别为55.9%和57.4%，具有典型的植物抗病蛋白结构域，并且过量表达GbVe基因的转基因拟南芥对落叶型黄萎病菌的抗性明显提高。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Ve1基因(Fradin et al.,2009)和棉花GbVe基因(Zhang et al.,2011)部分同源的Gbve1基因，该基因也具有典型的植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默Gbve1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失；并且，Gbve1基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明Gbve1基因对强致病力的落叶型和非落叶型黄萎病菌都具有抗性（Zhang et al.,2012a）。

除了Ve基因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPR1基因的转基因棉花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Parkhiet al.2010)。将杆状病毒抗凋亡蛋白基因转入棉花，转基因T1-T3代对黄萎病产生了良好的抗性（Tian et al.,2010）。水稻黄单胞菌harpin蛋白、几丁质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、防御素(θ-Defensins)（Miao et al.,2010；Munis,2010；Ni Metal.,2013）也对黄萎病表现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、以及抗性效果未达到预期目标等，从而限制了这些基因在生产上的应用。一直以来，黄萎病抗性基因的克隆都是抗病研究的热点与难点，2001年抗病基因克隆在番茄中取得了突破，Kawchuk等利用图位克隆从番茄抗黄萎病材料中克隆了抗病基因Ve1，Ve2。它们属于表面受体蛋白（RLPs），具有跨膜结构域和胞外富含亮氨酸重复（LRRs）结构域。通过LRRs这种结构识别并结合病原物蛋白质，参与抗病信号传递，诱导植物防卫基因的表达，使植物获得系统抗性。已经证明该类蛋白在植物很多抗病过程中起着重要的作用。进一步研究发现这2个基因位于一个位点，分别转入感病土豆中，转Ve1和Ve2基因的土豆都表现为抗黄萎病生理小种1（Kawchuk L M et al.,1999）。但是后来的研究却发现，只有Ve1具有抗性，Ve2没有抗性。Fradin等对番茄4个抗病品种和2个感病品种的Ve1和Ve2进行序列比较分析，发现在所有感病品种中，Ve1基因都在1220bp处出现终止密码子，而抗病品种的Ve1基因都有完整的读码框（Fradin E F,etal.,2009）。Ve基因的克隆使利用转基因获得抗性材料成为可能。陈玉辉等将来源于水茄的Ve1相似基因StVe转化番茄，转基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种1生长的作用（陈玉辉等,2008）。

黄萎病严重威胁棉花、番茄等农作物产量与品质，已经成为农作物生产的重要限制因子之一。发掘和推广抗黄萎病能力强的品种一直是农业生产中的一个重要课题。但是抗黄萎病资源缺乏，是棉花抗黄萎病育种的主要限制。我国现存棉花品种资源中高抗黄萎病的资源多为海岛棉（G.barbadenseL），如海岛棉品种H7124高抗落叶型和非落叶型黄萎病（朱龙付等,2005）。虽然海岛棉抗性很好、植株高大、生长势强，但是其生育期很长、铃小、在我国大部分棉区不仅成熟晚、而且产量较低。另外，利用常规杂交育种方法将海岛棉中的抗性基因转入陆地棉，要进行大量的杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量，而植物基因工程的发展则为培育抗病品种提供了一条崭新的途径。通过对棉花黄萎病抗性机制进行多年分析，确认棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。而Ve基因属于RLPs类基因，这类基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种提供条件。另外，棉花转基因方法的不断成熟完善为转基因育种提供了重要的保证，通过多基因转化或聚合育种，将多个抗性基因转化得到抗性更为良好可以应用于育种的核心种质，可以大大加快育种进程，是未来抗病育种的一个长期趋势。黄萎病病原菌变化多变异快，只有从抗性材料中分离出更多的抗性基因，才能为进一步研究其抗性机制并利用转基因创制抗性新种质成为可能。

通过对葡萄基因组进行生物信息学分析，找到4个抗病相关基因，将黑峰葡萄接病V991后，提取RNA做荧光定量分析，发现其中一个基因接病相对接病前有上调表达，从而筛选出GrVe，并进行后续抗病性鉴定，结果显示此基因为黄萎病抗性基因。葡萄黄萎病抗性基因GrVe的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性GrVe基因的应用，该基因编码一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高受体植物对落叶黄萎病病原菌V991的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及一个植物基因GrVe（XM_002263197,位置1-3006）的功能分析和应用，属于植物基因工程领域，该基因来源于黑峰葡萄。GrVe完整编码框长度为3006个碱基，编码蛋白含1002个氨基酸，分子量为112KD，等电点为6.17。尽管该基因与番茄Ve1、Ve2的相似性只有39%左右，但它与LRR类抗病基因结构类似，同样含有LRR重复单元和跨膜区。比较分析发现该基因含有12个LRR保守结构域，C端有1个跨膜结构域，将该基因命名为GrVe。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991（徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496）的诱导后表达量增加，将GrVe与pK2GW7,0载体构建植物表达载体转化本氏烟，结果该基因表达可以延迟黄萎病发病，并大幅降低病指，说明该基因具有对棉花黄萎病强致病力菌株V991的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或用在棉花黄萎病抗性改良中。

GrVe的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用，包括：

1）GrVe基因的克隆

以黑峰葡萄的cDNA模板，用引物

P1:5’-ATGTATCGAATCCTTTGCTTC-3’，

P2:5’-CTAACTTCTTCTTGCTCCATG-3’

扩增得到3006bp片段，将该片段命名为GrVe基因（XM_002263197,位置1-3006），GrVe基因进行末端加A处理并与pGEM-Teasy载体连接，连接产物用JM109感受态细胞进行热激转化，测序后成功构建的质粒命名为pGEM-Teasy:GrVe；

2）GrVe基因植物表达载体的构建

根据基因序列，设计引物P3和P4，

P3:’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGTTTCCTGTGGACATTGAC-3’

P4:’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGTCGCCGGGTTCTTCGC-3

以步骤1)以构建好的pGEM-Teasy:GrVe为模板进行扩增并回收，用TOPO法连接目的片段与Entry载体，经测序验证100%匹配，然后再将此载体与pK2GW7,0载体进行LR反应，转化大肠感菌DH5a，获得的阳性克隆即为含有pK2GW7,0载体和GrVe基因片段的重组载体，命名为pK2GW7,0:GrVe，经HindIII酶切验证正确，说明载体构建成功；

3）转基因植株的获得

将步骤2)中构建好的pK2GW7,0:GrVe提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404，用叶盘法侵染转化本氏烟，将浸染好的烟草放在共培养基上，黑暗处培养2d，转换到筛选分化培养基上，每15d继代一次，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中，根系发达后移到土壤培养；移栽后两周在其新叶上进行卡那筛选；PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，用引物

P5:5’-ATGGTCACATAAGCGGTTCAAAT-3’

P6:5’-TCAGACTTGTCAACTCCCTTGGA-3’

扩增植株DNA进行PCR鉴定(产物大小为447bp)，获得具有黄萎病抗性的阳性转基因植株。

有益效果

1..本发明获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因。本发明获得的GrVe基因来源于黑峰葡萄，该基因是一个全新的受体蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将GrVe与构建植物表达载体转化本氏烟，结果该基因在转基因植株中表达后可以延迟黄萎病发病，并大幅降低病指，说明其具有对棉花黄萎病强致病力菌株V991的抗性。GrVe的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

2..本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。GrVe的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。GrVe是怎样将抗性信号传导的，此基因参与了哪些信号传导过程，可以利用该基因转基因植株进行进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以GrVe的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。

3..本发明应用于黄萎病抗性育种。GrVe抗性效果良好，并且明显延迟落叶黄萎病发病时间，并且大幅降低病指，所以在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1GrVe,番茄SlVe1和番茄SlVe2的氨基酸序列相似性比较。SlVe1（登录号：AAP20228.1），SlVe2（登录号：AAQ18798.1）。

图2GrVe的结构预测图。LRR为富含亮氨酸重复序列。

图3黄萎病病原菌V991处理黑峰葡萄后4d后GrVe的表达。CK，V991-4d，M（Marker）。

图4GrVe植物表达载体pK2GW7,0-GrVe的构建验证。

图5GrVe转基因植株的分子检测。A,DNA水平检测；M,Marker。WT为未转化植株；1-21为卡那霉素筛选出的抗性转化株。

图6从DNA检测后的转基因植株中选择7株进行RNA水平检测，进行荧光定量实验；WT为未转化植株；其它为转基因不同株系。

图7落叶型黄萎病菌系V991处理GrVe转化植株和对照株的平均病指调查。3月29日接种，4月14日、4月17日、4月25日为调查日期；WT为未转化植株；GrVe为转化株。

图8接种V99127天后单株发病情况对比。WT为未转化植株；1-20为转化株。

图9接种V99127天后的群体发病情况对比。WT为未转化植株；1-20为转化株。

图10接种V991株系的病指。WT为未转化植株；其它为转化株不同植株。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于黑峰葡萄（Vitis vinifera）。

（一）葡萄GrVe克隆以及序列分析

根据黑峰葡萄基因组中公布的一个类受体蛋白基因（登录号：XM_002263197）设计引物

P1:5’-ATGTATCGAATCCTTTGCTTC-3’，

P2:5’-CTAACTTCTTCTTGCTCCATG-3’

以黑峰葡萄的cDNA模板扩增，在25μl反应体系中加入cDNA模板1μl，引物各5nmol，5μl5×primeSTARbuffer（Mg²⁺plus）PCR缓冲液，0.2mMdNTP，1UprimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃3'后94℃45''，56℃45''，72℃3'，循环36次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。得到片段为3006bp，将该片段命名为GrVe基因。GrVe基因完整编码框长度为3006个碱基，编码蛋白含1002个氨基酸，分子量为112KD，等电点为6.17。尽管该基因与番茄Ve1、Ve2的相似性只有39%左右，但它与LRR类抗病基因结构类似，同样含有LRR重复单元和跨膜区。比较分析发现该基因含有12个LRR保守结构域，C端有1个跨膜结构域。

将该片段进行末端加A处理（北京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-Teasy载体（Promega公司）连接。连接产物用JM109（北京全式金生物技术有限公司）感受态细胞进行热激转化。测序由上海英俊生物工程公司完成，成功构建的质粒命名为pGEM-Teasy:GrVe。用DNAclub进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST分析。数据库ExPASy（http://cn.expasy.org/）进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。该片段测序结果，与网上公布的序列一致，得到了该基因的全长序列。分析结果表明扩增得到的片段长度为3006bp，编码蛋白含1002个氨基酸，分子量为112KD，等电点为6.17。相似性分析发现该基因编码蛋白与番茄SlVe1和SlVe2的相似性为39%左右（图1），将该基因命名为GrVe，为GrVe.ST25序列文件中编号为1。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测和功能分析，该基因含有12个LRR保守结构域，C端各有1个跨膜结构域（图2），这些结构域的存在说明该基因为1个RLP（表面受体类蛋白）类基因。

（二）葡萄GrVe的诱导表达分析

所用葡萄为3个月苗龄，病原菌诱导条件为：菌株为落叶型强致病力病原菌V991。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液（g/l）：NaNO₃2g、K2HPO₄1g、MgSO₄-7H₂O0.5g、KCl0.5g、FeSO₄-7H₂O0.01g、蔗糖30g，25℃，180r·min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为植株茎部渡注射法，每盆接种孢子数为1×10⁸。诱导时间别为4d。分别采集未诱导和诱导后葡萄材料的叶片，总RNA提取以及RT-PCR模板制备方法见附录。表达分析结果显示V991处理4d后，在叶片中基因表达量明显增加，为上调表达（图3）。

（四）GrVe基因植物表达载体的构建以及植物转化

根据基因序列，设计引物P3和P4，

P3:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGTTTCCTGTGGACATTGAC-3’

P4:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGTCGCCGGGTTCTTCGC-3

以上述已经构建好的pGEM-Teasy:GrVe为模板进行扩增并回收，用TOPO法连接目的片段与Entry载体（Invitrogen公司），经测序验证100%匹配，然后再将此载体与pK2GW7,0载体（Invitrogen公司）进行LR反应，转化大肠感菌DH5a，获得的阳性克隆即为含有pK2GW7,0载体和GrVe基因片段的重组载体，命名为pK2GW7,0:GrVe，经HindIII酶切验证正确（图4），说明载体构建成功。提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/）。用叶盘法侵染转化本氏烟，将浸染好的烟草放在共培养基上，黑暗处培养2d。转换到筛选分化培养基上，每15d继代一次，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中。根系发达后移到土壤培养。移栽后两周在其新叶上进行卡那筛选。PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，用引物P5和P6

P5:5’-ATGGTCACATAAGCGGTTCAAAT-3’

P6:5’-TCAGACTTGTCAACTCCCTTGGA-3’

扩DNA扩PCR鉴定447bp大小片段（图5）。通过PCR鉴定，共获得18株含有GrVe基因的转化株，利用RT-PCR检测，发现其中有4株目的基因高表达（图6）。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子T1代播种于含有40mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于抗病性鉴定。

（五）T1代转化株的抗病性鉴定

对4株GrVe基因可以正常表达的转化株系进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的MS培养基筛选的绿苗转入营养土中，每盆移栽1株幼苗。待烟草生长1个月后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为棉花黄萎菌落叶型强致病力菌株V991（徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496;张天真,周兆华,闵留芳,等.棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技术.作物学报,2000,26(6):673-680）。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，180r·min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1×10⁷。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数40株，接种后每天观察病害的发生情况，在15天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。病指按照以下标准进行鉴定，0级：无病植株；1级：0.1%～25%叶片发病的植株；2级：25%～50%叶片发病的植株；3级：50%～75%叶片发病的植株；4级：75%以上叶片发病的植株。抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后16，19，27天后，对于落叶型黄萎病V991，对照病指分别达到54.4%，66.3%，73.1%；而转基因株系的平均病指仅分别为34.1%，41.3%，52.9%。

抗病性鉴定说明GrVe不仅可以延迟发病时间，而且可以使病指显著降低（图7）。转基因植株出现病症的时间明显延迟，虽然叶片也出现部分黄化（图8），但是病症扩展缓慢，而且植株死亡率较低，而对照在27天时已经有超过一半的植株死亡（图9），说明GrVe可以赋予受体植株黄萎病抗性。附录：

1．RNA提取方法

（1）取材料加液氮充分研磨成粉末状转运至离心管中；

（2）加10倍体积的RNA提取缓冲液，震荡混匀，50℃水浴约20min，中途可混合2-3次；

（3）加0.6倍体积的氯仿，混匀，静置冰浴20min；

（4）12000rpm离心20min，将上清转运至一新离心管中；

（5）加1/2体积的8MLiCl溶液，冰浴过夜（12h以上）；

（6）12000rpm离心20min，弃上清，用70%酒精洗沉淀1次并将沉淀转运至一新的离心管中；

（7）12000rpm离心20min，弃乙醇溶液，沉淀抽干20min；

（8）加200ul无RNase的水溶解沉淀，加1倍体积的水饱和酚/氯仿=1:1充分混匀，静置5min；

（9）12000rpm离心20min，将上清转运至另一新的离心管中，再加1倍体积的水饱和酚/氯仿=1:1重复抽提一次；

（10）12000rpm离心20min，上清加1倍体积的氯仿抽提一次；

（11）12000rpm离心20min，上清加1/2体积8MLiCl溶液，冰浴过夜（12h以上）；

（12）12000rpm离心20min，沉淀用70%酒精洗一次。抽干后溶于100-200ul无RNase的水中。取2ul检测质量。

2．cDNA的合成

将提取的RNA用DNaseI37℃纯化处理30min后备用。用TransScript Reverse Transcriptase试剂盒（Transgen公司）合成第一链cDNA。体系如下：

RNA模板                    6.0μL

引物(500μmolμL^-1)         1.0μL

dNTP(10mmolμL^-1)           1.0μL

5×RTbuffer                4.0μL

RibonucleaseInhibitor(RI)  0.5μL

TranscriptRT               1.0μL

DEPCddH₂O                  补至20.0μL

42℃45min，85℃5min。于-20℃保存。

                        SEQUENCE LISTING<110>  江苏省农业科学院<120>  赋予植物黄萎病抗性GrVe基因的应用<130>  0<160>  6     <170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  21<212>  DNA<213>  人工<220><221>  扩增葡萄全长引物P1<222>  (1)..(21)<223> 

 

<400>  1

atgtatcgaa tcctttgctt c                                               21

 

 

<210>  2<211>  21<212>  DNA<213>  人工<220><221>  扩增葡萄全长引物P2<222>  (1)..(21)<223> 

 

<400>  2

ctaacttctt cttgctccat g                                               21

 

 

<210>  3<211>  55<212>  DNA<213>  人工<220><221>  GrVe基因引物P3<222>  (1)..(55)<223> 

 

<400>  3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatgttt cctgtggaca ttgac          55

 

 

<210>  4<211>  48<212>  DNA<213>  人工<220><221>  GrVe基因引物P4<222>  (1)..(48)<223> 

 

<400>  4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt agtcgccggg ttcttcgc                  48

 

 

<210>  5<211>  23<212>  DNA<213>  人工<220><221>  GrVe检测引物P5<222>  (1)..(23)<223> 

 

<400>  5

atggtcacat aagcggttca aat                                             23

 

 

<210>  6<211>  23<212>  DNA<213>  人工<220><221>  GrVe检测引物P6<222>  (1)..(23)<223> 

 

<400>  6

tcagacttgt caactccctt gga                                             23

 

Claims (1)

1.赋予植物黄萎病抗性的GrVe基因的应用，包括：

1)      GrVe基因的克隆

以黑峰葡萄的cDNA模板，用引物

P1: 5’- ATGTATCGAATCCTTTGCTTC-3’，

P2: 5’- CTAACTTCTTCTTGCTCCATG -3’

扩增得到3006bp片段，将该片段命名为GrVe，登录号：XM_002263197，位置1-3006，GrVe基因进行末端加A处理并与pGEM-T easy载体连接，连接产物用JM109感受态细胞进行热激转化，测序后成功构建的质粒命名为pGEM-T easy:GrVe；

2）GrVe基因植物表达载体的构建

根据基因序列，设计引物P3和P4，

P3: ’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGTTTCCTGTGGACATTGAC-3’

P4: ’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGTCGCCGGGTTCTTCGC-3

以步骤1)以构建好的pGEM-T easy:GrVe为模板进行扩增并回收，用TOPO法连接目的片段与Entry载体，经测序验证100%匹配，然后再将此载体与pK2GW7,0载体进行LR反应，转化大肠感菌DH5a，获得的阳性克隆即为含有pK2GW7,0载体和GrVe基因片段的重组载体，命名为pK2GW7,0:GrVe，经Hind III酶切验证正确，说明载体构建成功；

3）转基因植株的获得

将步骤2)中构建好的pK2GW7,0:GrVe提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌LBA4404，用叶盘法侵染转化本氏烟，将浸染好的烟草放在共培养基上，黑暗处培养2d，转换到筛选分化培养基上，每15d继代一次，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中，根系发达后移到土壤培养；移栽后两周在其新叶上进行卡那筛选；PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，用引物

P5: 5’-ATGGTCACATAAGCGGTTCAAAT-3’ 

P6: 5’-tcagacttgtcaactcccttgga-3’

扩增植株DNA进行PCR鉴定447bp大小片段，获得具有黄萎病抗性的阳性转基因植株。