CN102229938B

CN102229938B - 赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因及应用

Info

Publication number: CN102229938B
Application number: CN201110163078A
Authority: CN
Inventors: 杨郁文; 张保龙; 王坤波; 陈天子; 任永哲
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: CN102229938A

Abstract

本发明涉及赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因及应用，属于生物技术领域。Gbvdr5基因是从抗黄萎病材料海岛棉品种H7124中获得的一个表面受体蛋白基因，核苷酸序列SEQIDNo.1，及其编码的蛋白质氨基酸序列SEQIDNo.2。该基因含有12个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域。GbVdr5基因过量表达株的黄萎病抗病性明显增强，不仅可以延迟发病，并且病指也大为降低。在病原菌接种后17，20，23，26天后，对于落叶型黄萎病V991和非落叶型黄萎病Bp2，转基因株系黄萎病抗病性均明显增强。

Description

赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因及应用

一、技术领域

本发明提供了一个赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因及应用，涉及植物基因克隆以及功能分析，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)侵染引起的广泛存在于世界各地区的最严重的土传真菌性维管束系统病害。病原物以微菌核（microsclerotia）形式长期存在于土壤中，受到根分泌物的刺激而萌发，形成的芽管侵染植物根部，在根部皮层的细胞间或细胞内生长，最终蔓延到木质部以及整个植株（Veronese P, Narasimhan M L, Stevenson R A, et al. Identification of a locus controlling Verticillium disease symptom response in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2003, 35:574–587.）。黄萎菌属非专性寄生菌，寄主十分广泛，不同菌系间致病力悬殊。病原菌在寄主植物上所表现的致病性差异是病原菌与寄主植物互作的程度不同所造成的，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响下，常产生生理分化，出现新的致病类型。对于棉花黄萎病的分类，根据病菌侵染后引起棉花叶片落叶与否，把病菌分为落叶型或非落叶型；用病菌人工接种棉花品种后，根据品种的抗感反应，将病菌分为致病力强、中、弱等不同的致病类群。张天真等用RAPD 指纹图谱聚类分析将我国棉花黄萎病菌株划分为8 类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分复杂（张天真,周兆华,闵留芳, 等. 棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐) 病品种的选育技术. 作物学报,26(6):673-680.）。

关于黄萎病的抗性机制一直都存在两种不同的结论：一种认为陆地棉的抗(耐)病性为质量性状遗传, 另一种认为黄萎病抗(耐) 性属于数量性状遗传。但是通过大量的实验证明，温室或生长室单一菌系苗期接种鉴定时, 多倾向于抗性由显性单基因控制，而在田间病圃鉴定并在生长后期调查时, 多倾向于抗性呈数量性状遗传, 加性、显性和上位性基因效应都存在, 但以加性效应为主。这表明不同菌系的抗性品种可能存在不同的抗性基因（房卫平,祝水金, 季道藩. 棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展. 棉花学报, 2001, 13(2): 116-120.）。

黄萎病菌的寄主范围极为广泛，早期报道的寄主植物达660 种，在农作物中除了侵染棉花之外，常见的侵染寄主还有番茄、土豆、茄子、花生、橄榄等，但是一般不侵染禾本科的植物（赵凤轩, 戴小枫. 棉花黄萎病菌的侵染过程. 基因组学与应用生物学, 2009, 28(4), 786-792）。在对黄萎病的研究中，由于生产中黄萎病对于棉花，番茄的影响较大，所以相关研究最多。拟南芥作为模式植物，由于其易感黄萎病，研究方便快捷，其与黄萎病的互作、生理生化影响等都可以作为研究其他植物的借鉴，所以关于拟南芥对黄萎病的相关抗性研究也较多。如通过对拟南芥相关突变体进行研究，发现乙烯和ABA信号通路突变体的抗性明显增强，说明乙烯和ABA信号通路影响黄萎病抗性，而水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MJ）信号通路与黄萎病抗性并没有明显关系（Veronese P, Narasimhan M L, Stevenson, R A, et al. Identification of a locus controlling Verticillium disease symptom response in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2003, 35:574–587; Pantelides I, Tjamos S E, Paplomatas E J. Ethylene perception via ETR1 is required in Arabidopsis infection by Verticillium dahliae. Molecular Plant Pathology, 2010, 11: 191-202）。很多抗病基因在拟南芥上最先进行验证，不仅快捷而且可以有效地应用于生产。棉花非共生血红蛋白基因（GhHb1）受病原菌诱导增量表达，将该基因在拟南芥中过量表达，发现转基因植株对假单胞杆菌和黄萎病的抗性大大增强（Qu Zhan-Liang, Zhong Nai-Qin, Wang Hai-Yun, et al. Ectopic Expression of the Cotton Non-symbiotic Hemoglobin Gene GhHbd1 Triggers Defense Responses and Increases Disease Tolerance in Arabidopsis. Plant and Cell Physiology, 47(8):1058-1068）。

一直以来，黄萎病抗性基因的克隆都是抗病研究的热点与难点，2001年抗病基因克隆在番茄中取得了突破，Kawchuk等利用图位克隆从番茄抗黄萎病材料中克隆了抗病基因Ve1，Ve2。它们属于表面受体蛋白（RLPs），具有跨膜结构域和胞外富含亮氨酸重复（LRRs）结构域。通过LRRs这种结构识别并结合病原物蛋白质，参与抗病信号传递，诱导植物防卫基因的表达，使植物获得系统抗性。已经证明该类蛋白在植物很多抗病过程中起着重要的作用。进一步研究发现这2个基因位于一个位点，分别转入感病土豆中，转Ve1和Ve2基因的土豆都表现为抗黄萎病生理小种1（Kawchuk L M, Hachey J, Lynch D R, et al. Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 98(11): 6511-6515.）。但是后来的研究却发现，只有Ve1具有抗性，Ve2没有抗性。Fradin等对番茄4个抗病品种和2个感病品种的Ve1和Ve2进行序列比较分析，发现在所有感病品种中，Ve1基因都在1220bp处出现终止密码子，而抗病品种的Ve1基因都有完整的读码框（Fradin E F, Zhang Z, Juarez Ayala J C, et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology, 2009, 150:320-332.7）。Ve基因的克隆使利用转基因获得抗性材料成为可能。陈玉辉等将来源于水茄的Ve1相似基因StVe转化番茄，转基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种1 生长的作用（陈玉辉, 赵凌侠, 柴友荣, 等. 抗黄萎病基因StVe转化番茄的研究. 园艺学报, 2008, 35(5): 693-700）。

黄萎病严重威胁棉花、番茄等农作物产量与品质，已经成为农作物生产的重要限制因子之一。发掘和推广抗黄萎病能力强的品种一直是农业生产中的一个重要课题。但是抗黄萎病资源缺乏，是棉花抗黄萎病育种的主要限制。我国现存棉花品种资源中高抗黄萎病的资源多为海岛棉（G. barbadense L），如海岛棉品种H7124高抗落叶型和非落叶型黄萎病（朱龙付, 涂礼莉, 张献龙, 等. 黄萎病菌诱导的海岛棉抗病反应的SSH文库构建及分析. 遗传学报, 2005, 32 (5) : 528-532）。虽然海岛棉抗性很好、植株高大、生长势强，但是其生育期很长、铃小、在我国大部分棉区不仅成熟晚、而且产量较低。另外，利用常规杂交育种方法将海岛棉中的抗性基因转入陆地棉，要进行大量的杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量，而植物基因工程的发展则为培育抗病品种提供了一条崭新的途径。通过对棉花黄萎病抗性机制进行多年分析，确认棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。而Ve基因属于RLPs类基因，这类基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种提供条件。另外，棉花转基因方法的不断成熟完善为转基因育种提供了重要的保证，通过多基因转化或聚合育种，将多个抗性基因转化得到抗性更为良好可以应用于育种的核心种质，可以大大加快育种进程，是未来抗病育种的一个长期趋势。黄萎病病原菌变化多变异快，只有从抗性棉花材料中分离出更多的抗性基因，才能为进一步研究其抗性机制并利用转基因创制抗性新种质成为可能。棉花黄萎病抗性基因Gbvdr5的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因，该基因编码一个表面受体蛋白基因。该基因受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因过量表达可以显著提高受体植物对落叶和非落叶型黄萎病病原菌V991和Bp2的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因Gbvdr5，属于植物基因工程领域，该基因来源于海岛棉品种H7124。Gbvdr5是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE（15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA）、 0.1×SSC（15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠）、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由3234个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3234位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为3234个碱基，编码蛋白含1078个氨基酸，分子量为118KD，等电点为6.32。尽管该基因与Ve1、Ve2的相似性只有50%左右，但它与LRR-TM类抗病基因结构类似，同样含有LRR重复单元和跨膜区。比较分析发现该基因含有12个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域，将该基因命名为GbVdr5。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991（徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等. 棉花黄萎病菌T-DNA 插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学, 2010, 43(3): 489-496）和Bp2（张天真, 周兆华, 闵留芳, 等. 棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技术. 作物学报, 2000, 26(6): 673-680）的诱导后表达量增加，将Gbvdr5与35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥植株，结果该基因过量表达可以明显延迟黄萎病发病，并大幅降低病指，说明该基因具有对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或用在棉花黄萎病抗性改良中。

Gbvdr5的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果

1、本发明获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因。本发明获得的GhVdr5基因来源于高抗黄萎病材料海岛棉品种H7124，该基因是一个全新的受体蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将Gbvdr5与35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥植株，结果该基因过量表达可以明显延迟黄萎病发病，并大幅降低病指，说明其具有对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。Gbvdr5的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

、本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。 Gbvdr5的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。Gbvdr5是怎样将抗性信号传导的，哪些基因参与了信号传导过程，可以利用该基因过量表达植株进行进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以Gbvdr5的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。

、本发明应用于黄萎病抗性育种。 Gbvdr5抗性效果良好，并且明显延迟落叶和非落叶型黄萎病发病时间，并且大幅降低病指，所以在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1 GbVdr5, 番茄Ve1和番茄Ve2的氨基酸序列相似性比较。Ve1（索取号：AF272367_1），Ve2（索取号：AF365929_1）。

图2 GbVdr5的结构预测图。LRR为富含亮氨酸重复序列。

图3 GbVdr5在不同器官中的表达。GbVdr5为目的基因，组蛋白为内参。

图4 棉花黄萎病病原菌处理H7124后2d和4d后GbVdr5的表达。CK，水处理；V991-2d，V991-4d，落叶型强致病力菌株V991处理2天和4天；Bp2-2d，Bp2-4d：非落叶型强致病力菌株Bp2处理2天和4天；M, Marker。

图5 GbVdr5过量表达载体PCAMBIA2301-35S-GbVdr5的构建。

图6 GbVdr5转基因植株的分子检测。A, DNA水平检测；B, RNA水平检测；M, Marker: λ-EcoT14 Ⅰdigest （TAKARA公司，产品编号：D3401A）。CK1，CK2为未转化植株；1-9为卡那霉素筛选出的抗性转化株。

图7落叶型和非落叶型黄萎病菌系V991 和Bp2处理GbVdr5转化植株和对照株的平均病指调查。17d，20d，23d，26d分别为接种后天数；CK为未转化植株；GbVdr5为转化株。

图8 GbVdr5提高受体植物的黄萎病抗性。A，C分别为用落叶型和非落叶型强致病力菌株V991和Bp2接种未转化株（CK）后的表型；B，D分别为用落叶型和非落叶型强致病力菌株V991和 Bp2接种GbVdr5转化株后的表型。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于海岛棉品种H7124（Gossypium barbadense），该品种高抗黄萎病。拟南芥品种为哥伦比亚型，该品种易感黄萎病（Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, et al. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature 1999; 16; 402(6763):761-8.）。

（一）棉花GbVdr5克隆以及序列分析

根据Gene Index中一段棉花EST序列（登录号：TC121084）设计引物5’- TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3’，5’-CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3’扩增陆地棉DNA模板，得到约1Kb左右条带，将该片段测序，发现其与原来的EST片段只有76%的相似度，该片段编码1个全新的棉花表面受体蛋白基因，根据该片段设计引物通过染色体步移进一步得到了该基因的全长序列，将该基因命名为GhVdr2（专利：棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用，申请号：201110066390.9）。由于这类表面受体蛋白基因在基因组中有很多相似序列，为了得到更多的这类基因，根据GhVdr2设计引物GhVdr2-F595：5’- CTTGATGGGGTGAATATTAGAGCA-3’，GhVdr2-R1021：5’-ATTGCCCAAGGTTACCGATAGAAT-3’扩增陆地棉DNA模板。用得到的约400bp片段作为探针筛选棉花BAC（细菌人工染色体组）文库（构建文库所用棉花品种为maxxa，文库来源于Clemson University），共得到40个BAC阳性克隆。对阳性克隆C9进行序列分析发现，它含有1个具有完整阅读框的表面受体蛋白基因，该基因编码的氨基酸序列与GhVdr2具有63%的相似性。为了进一步得到H7124中该基因的序列，设计扩增基因全长的引物F64- BamH1: 5’-CTTGGATCC GCATACATTGTAGCGTGAGATAA-3’, R3488-Kpn1: 5’- CTAAGGTACC AAAACAGCATACAGTGGAAACAG-3’。引物末端分别带有限制性内切酶BamH1和Kpn1的识别位点，为构建植物表达载体做准备。用这对引物扩增海7124的cDNA模板，在25μl反应体系中加入cDNA模板1μl，引物各5 nmol，5μl 5×primeSTAR buffer （Mg²⁺ plus）PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1 U primeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 3'，循环36次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。得到约3.5Kb片段，将该片段进行末端加A处理（北京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-T easy载体（Promega公司）连接。连接产物用JM1090（北京全式金生物技术有限公司）感受态细胞进行热激转化。测序由上海英俊生物工程公司完成。用DNA club进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行BLAST分析。数据库ExPASy（http://cn.expasy.org/）进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。分析结果表明扩增得到的片段长度为3572bp，自5’端第188位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3421位碱基为转录终止位点。编码蛋白含1078个氨基酸，分子量为118KD，等电点为6.32。相似性分析发现该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性为50%左右（图1），将该基因命名为GbVdr5，为序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测和功能分析，该基因含有12个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域（图2），这些结构域的存在说明该基因为1个RLP（表面受体类蛋白）类基因。

（二）棉花GbVdr5在不同器官中的表达量分析

在H7124同一棉花植株上，采集植株的叶片、花蕾、根、茎、种子以及棉纤维，其中棉纤维和种子的取样时间为开花后15 d。用CTAB法提取总RNA（骆萍，王国栋，陈晓亚. 亚洲棉C4H同源cDNA 的分离和表达特征分析. 植物学报, 2001, 43(1): 77-81.）。用RQ1 DNnase（Promega公司）处理棉花各器官的总RNA，参照CLONTECH公司的“SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit”的说明书中3’RACE模板制备方法来制备RT-PCR模板。反转录引物为（5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30N-1N 3’）。用于半定量RT-PCR的基因特异引物为GbVdr5-2050F: 5’-ATCGATATGCAGCAGTACATCTCTT-3’, GbVdr5-2550R: 5’-CTCTAACAGGTTACTATATGGGTTA-3’。根据棉花持家基因组蛋白设计的引物HF：5’-GAAGCCTCATCGATACCGTC- 3’和HR：5’-CTACCACTACC ATCATGGC- 3’作为参照以及检测是否有DNA污染。用这两对引物分别扩增H7124的cDNA模板，在25 μl反应体系中加入cDNA模板1 μl，引物各5 nmol，2.5 μl 10×PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1.5 mM MgCl2，1 U rTaq（TaKaRa公司）进行PCR扩增。GbVdr5扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 1'，循环35次，再72℃延伸10'。组蛋白扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 1'，循环23次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。棉花组蛋白扩增长度为300bp，GbVdr5扩增长度为500bp。以棉花组蛋白作为参照，对GbVdr5在叶片、花蕾、根、茎、种子以及棉纤维的表达分析发现，其在各个器官中的表达量不同，茎，种子和纤维中的表达量要高于叶，蕾和根（图3）。

（三）棉花GbVdr5的诱导表达分析

将脱绒H7124种子直接播种于营养土中。待棉苗长到2～3 片真叶时进行处理，每盆1-2颗棉苗。

病原菌诱导条件为：菌株为落叶型和非落叶型强致病力病原菌V991和Bp2。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液（g/l）：NaNO₃ 2g、K2HPO₄ 1g、MgSO₄-7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄-7H₂O 0.01g、蔗糖30g，25 ℃，180 r ·min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为棉花苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁸。诱导时间分别为2d和4d。分别采集未诱导和诱导后棉花材料的茎，总RNA提取以及RT-PCR模板制备方法见上文。表达分析结果显示V991和Bp2处理2d 后表达量未见明显变化，而两种病原菌处理4d后，在茎中基因表达量都明显增加，其中V991处理后增加量更大一些（图4）。

（四）GbVdr5基因过量表达载体的构建以及植物转化

用BamH1和Kpn1分别酶切含有GbVdr5基因的阳性克隆载体和植物表达载体PCAMBIA2301（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/），分别回收3.4Kb和13Kb的目的片段。将两个片段用T4 ligase连接（Promega公司）并转化JM1090感受态，获得的阳性克隆即为含有CaMV 35S启动子和GbVdr5基因片段的重组载体，命名为PCAMBIA2301-35S-GbVdr5（图5），用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/）。用花浸染方法（Clough S J, Bent A F. Floral dip: A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16:735-743）转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达。通过PCR鉴定，共获得9株含有GbVdr5基因的转化株，利用RT-PCR检测，发现其中有7株目的基因可以表达（图6）。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子T1代播种于含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于抗病性鉴定。

（五）T1代转化株的抗病性鉴定

对7株GbVdr5基因可以正常表达的转化株系进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的MS培养基筛选的绿苗转入营养土中，每盆移栽4株幼苗。待拟南芥生长1个月后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为落叶型和非落叶型强致病力病原菌V991和Bp2（徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等. 棉花黄萎病菌T-DNA 插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学, 2010,43(3):489-496; 张天真, 周兆华, 闵留芳, 等. 棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐) 病品种的选育技术. 作物学报, 2000, 26(6):673-680）。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25 ℃，180 r ·min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁷。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数需大于24株，接种后每天观察病害的发生情况，在15天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。病指按照以下标准进行鉴定，0 级：无病植株；1 级：0. 1 %～25 %叶片发病的植株；2 级：25 %～50 %叶片发病的植株；3 级：50 %～75 %叶片发病的植株；4 级：75 %以上叶片发病的植株。抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后17，20，23，26天后，对于落叶型黄萎病V991，对照病指分别达到56%，61%，78%和83%；

而转基因株系的平均病指仅分别为11.5%，13%，33.5%和45.5%。对于非落叶型黄萎病Bp2，在病原菌接种后17，20，23，26天后，对照病指分别达到35%，47%，70%和85%

转基因株系的平均病指仅为6%，10%，24%和37.5%。抗病性鉴定说明GbVdr5不仅可以延迟发病时间，而且可以使病指显著降低（图7）。从表型上看，未转化植株叶片明显黄化萎蔫，植株生长延缓，开花时间提前，但是花多为不育到最后不能结实。而转基因植株出现病症的时间明显延迟，虽然叶片也出现部分黄化，但是病症扩展缓慢，而且植株可以正常结实（图8），说明GbVdr5可以赋予受体植株黄萎病抗性。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 赋予植物黄萎病抗性的Gbvdr5基因及其应用

<130> 0

<160> 10

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3234

<212> DNA

<213> Gossypium barbadense L.

<400> 1

atgaggattt tactgctttc atggctctta tttagttcat attttgcaat tttccttggt 60

attagcaact tagttttagt ttctggtcaa tgtcgaaacg atcaaaaaca gttgttgctc 120

gacttgaatt tgacaagcag ctccgatctt tttatatatc ctattccatt aggaaagctg 180

atgaaatgga accaagccat ggagtgctgt tcctgggatg gtgtaagttg cgatggcggt 240

ggtcatgtta tcggtcttga cttgagcaac cgagcaattt caagctcaat tgacggttca 300

agtagtcttt ttcgtcttca acatcttcag cgactcaatt tggcttctaa tcagttcatg 360

actgcttttc ccgctggatt tgataaattg gagaatttga gttatcttaa tttatccaat 420

gctggcttta caggacaaat cccagctaag attccacgct tgacaaggtt gattactctc 480

gatttatcta cagatccatt cttgagtgga gaaccattga aacttgagaa gccgaaccta 540

gagatgcttg ttcaaaatct gacgaggcta agatttctct atcttgatgg cgtaaatata 600

tcagctatgg ggaatgaatg gtgtcgggca ttatcgccgt tgactgagtt gcaagttttg 660

agcatgtcca actgttatct ttcaggacct atacattctt cactttccaa gctccaatct 720

ctctcagtaa tttgcttgga ctacaacaac ttgtctgctt cagttccaca attctttgca 780

gaattcccaa acctgacttc ccttagtctt agaagcactg ggttgaatgg aagactgcca 840

gatgaaattt tccagatacc taccttacag acacttgatt tgtcatacaa catgttactc 900

aaaggttcat ttccaaattt tcctctcaat gcttctcttc aagctctcgc acttagcagc 960

acaaagtttg ggggacaaat tccagaatct ctcgataacc taggacaact gacaagaata 1020

gagcttgctg gttgcaattt cagcggaccc atacccaaag cagttgagaa acttacccaa 1080

cttgtctctt tggatttttc caataacaat ttttctggcc caataccgtc cttctcttca 1140

tcgaggaatc ttaccaacct aagccttgct cataataagt tagtcggcac aattcattcc 1200

actgactggt caagcctttc aaagctagaa gatgctgact taggagacaa caagctaagt 1260

ggaaccattc caccaacttt gtttggcatt ccatcactgc agagacttga cctttctcac 1320

aatcaattca atggcagcat tggtgacttt catgataagg cctcttcact gcttaatacc 1380

cttgatctta gcaacaacaa gttaaaaggg caatttccaa cgcctttgtt tgaactccgt 1440

ggtctagaaa tcctacatct ttcttcaaac aacttcagcg gtttgatacc aatgaatgcc 1500

tttcagaact tggggaatct tttgtctctt gatctctcac ataacaggtt gtctattgat 1560

gccactgcta ctaatatttc cttgctttct ttccccacat ttaccggact ggggctggca 1620

tcttgcaact taacagagtt ccctggtttc ttgaaaaatc agtccagctt aatgtacctt 1680

gacctttcca acaaccatat tcatgggaaa atacccgatt ggatttggaa accaatagat 1740

cttttgcgcc taaatctttc tgataacttt cttgttgggt tcgaaagacc tttgaagaac 1800

ataacttcta gtgttcagat tattgacctg catgtcaacc aattacaagg ggaaatccca 1860

attcctacat tagatgccac ctatctggat tactcagaca acaatttcag ctccgtttta 1920

ccagctcaca ttggtgactc cctccagcgt gtttctttct tttccatctc aaataacaac 1980

attcatggga gtatccctcc atcgatatgc agcagtacat ctcttagagt actcgatttg 2040

tctaataatt cattgagtgg gccaattcct caatgcctct ttcagatgag cggatctctt 2100

ggagtattgg atttaagaca aaacaatctc agtggcataa tttctgacac tttttcaaaa 2160

agttgtaagt tacaaactct caaactcgat caaaaccgat tggaaggaaa ggttccaaaa 2220

tcactaggga attgcaaaat gctggaggtt ttagacattg gcaacaatca gatcaatgat 2280

tcattcccat ggcatttgaa gaatatagcc aagttgcacg tccttgtttt acgttccaac 2340

aaattcaacg gtcacattga ttgttctgga aataacggtg gatggtcaat gcttcagatt 2400

tttgacttag catccaacaa ttttagtggt aaactgcatc tgacatgttt ggggacgtgg 2460

gatgctatgc agcataaccc atatagtaac ctgttagagc tcaaacatct ccattttgta 2520

gattctggtt ctggaggcgg tactagatat caagatgcaa taacaattac caccaaaggt 2580

ttagagttgg agctggtgaa gatcctgccc gtattcacct ccattgacat ttcatggaac 2640

aactttgaag ggccaatacc agaagtaatc ggcaaattca aagaacttca tggccttaac 2700

ttttcgcata atgctttcac aggtccaatc ccatcatctt tcggaaacct gcgagagctt 2760

gagtccttgg acctctcaag caatagccta cgcggtgaga tccctttgca gctagcaaac 2820

ctcaatttcc tttcatgtct taatgtctca aataataagc tagtgggtcc aatcccaacg 2880

agcacccaac ttcaatcatt tccagaagct tcatttgaga acaatgccgg attatgtgga 2940

cctcctttga aaacaaagtg cggattgcca ccaggtaagg aagacagccc ttcagattct 3000

gagacaggga gcattataca ctggaatcat ttaagtatcg agatagggtt tacctttgga 3060

ttgggaatta tcattgtacc tcttatctat tggaagagat ggaggatctg gtatttcgag 3120

cgtatcgatc ttgctctgtc caggcttttc cctcaccttg gtcgtgaaac aaaaaagcat 3180

gggaggagag caaagcagaa ccaaagggga ggacccagca acgattggga ttaa 3234

<210> 2

<211> 1077

<212> PRT

<213> Gossypium barbadense L.

<400> 2

Met Arg Ile Leu Leu Leu Ser Trp Leu Leu Phe Ser Ser Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Ile Phe Leu Gly Ile Ser Asn Leu Val Leu Val Ser Gly Gln Cys Arg

20 25 30

Asn Asp Gln Lys Gln Leu Leu Leu Asp Leu Asn Leu Thr Ser Ser Ser

35 40 45

Asp Leu Phe Ile Tyr Pro Ile Pro Leu Gly Lys Leu Met Lys Trp Asn

50 55 60

Gln Ala Met Glu Cys Cys Ser Trp Asp Gly Val Ser Cys Asp Gly Gly

65 70 75 80

Gly His Val Ile Gly Leu Asp Leu Ser Asn Arg Ala Ile Ser Ser Ser

85 90 95

Ile Asp Gly Ser Ser Ser Leu Phe Arg Leu Gln His Leu Gln Arg Leu

100 105 110

Asn Leu Ala Ser Asn Gln Phe Met Thr Ala Phe Pro Ala Gly Phe Asp

115 120 125

Lys Leu Glu Asn Leu Ser Tyr Leu Asn Leu Ser Asn Ala Gly Phe Thr

130 135 140

Gly Gln Ile Pro Ala Lys Ile Pro Arg Leu Thr Arg Leu Ile Thr Leu

145 150 155 160

Asp Leu Ser Thr Asp Pro Phe Leu Ser Gly Glu Pro Leu Lys Leu Glu

165 170 175

Lys Pro Asn Leu Glu Met Leu Val Gln Asn Leu Thr Arg Leu Arg Phe

180 185 190

Leu Tyr Leu Asp Gly Val Asn Ile Ser Ala Met Gly Asn Glu Trp Cys

195 200 205

Arg Ala Leu Ser Pro Leu Thr Glu Leu Gln Val Leu Ser Met Ser Asn

210 215 220

Cys Tyr Leu Ser Gly Pro Ile His Ser Ser Leu Ser Lys Leu Gln Ser

225 230 235 240

Leu Ser Val Ile Cys Leu Asp Tyr Asn Asn Leu Ser Ala Ser Val Pro

245 250 255

Gln Phe Phe Ala Glu Phe Pro Asn Leu Thr Ser Leu Ser Leu Arg Ser

260 265 270

Thr Gly Leu Asn Gly Arg Leu Pro Asp Glu Ile Phe Gln Ile Pro Thr

275 280 285

Leu Gln Thr Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Met Leu Leu Lys Gly Ser Phe

290 295 300

Pro Asn Phe Pro Leu Asn Ala Ser Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ser Ser

305 310 315 320

Thr Lys Phe Gly Gly Gln Ile Pro Glu Ser Leu Asp Asn Leu Gly Gln

325 330 335

Leu Thr Arg Ile Glu Leu Ala Gly Cys Asn Phe Ser Gly Pro Ile Pro

340 345 350

Lys Ala Val Glu Lys Leu Thr Gln Leu Val Ser Leu Asp Phe Ser Asn

355 360 365

Asn Asn Phe Ser Gly Pro Ile Pro Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu

370 375 380

Thr Asn Leu Ser Leu Ala His Asn Lys Leu Val Gly Thr Ile His Ser

385 390 395 400

Thr Asp Trp Ser Ser Leu Ser Lys Leu Glu Asp Ala Asp Leu Gly Asp

405 410 415

Asn Lys Leu Ser Gly Thr Ile Pro Pro Thr Leu Phe Gly Ile Pro Ser

420 425 430

Leu Gln Arg Leu Asp Leu Ser His Asn Gln Phe Asn Gly Ser Ile Gly

435 440 445

Asp Phe His Asp Lys Ala Ser Ser Leu Leu Asn Thr Leu Asp Leu Ser

450 455 460

Asn Asn Lys Leu Lys Gly Gln Phe Pro Thr Pro Leu Phe Glu Leu Arg

465 470 475 480

Gly Leu Glu Ile Leu His Leu Ser Ser Asn Asn Phe Ser Gly Leu Ile

485 490 495

Pro Met Asn Ala Phe Gln Asn Leu Gly Asn Leu Leu Ser Leu Asp Leu

500 505 510

Ser His Asn Arg Leu Ser Ile Asp Ala Thr Ala Thr Asn Ile Ser Leu

515 520 525

Leu Ser Phe Pro Thr Phe Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Cys Asn Leu

530 535 540

Thr Glu Phe Pro Gly Phe Leu Lys Asn Gln Ser Ser Leu Met Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Leu Ser Asn Asn His Ile His Gly Lys Ile Pro Asp Trp Ile Trp

565 570 575

Lys Pro Ile Asp Leu Leu Arg Leu Asn Leu Ser Asp Asn Phe Leu Val

580 585 590

Gly Phe Glu Arg Pro Leu Lys Asn Ile Thr Ser Ser Val Gln Ile Ile

595 600 605

Asp Leu His Val Asn Gln Leu Gln Gly Glu Ile Pro Ile Pro Thr Leu

610 615 620

Asp Ala Thr Tyr Leu Asp Tyr Ser Asp Asn Asn Phe Ser Ser Val Leu

625 630 635 640

Pro Ala His Ile Gly Asp Ser Leu Gln Arg Val Ser Phe Phe Ser Ile

645 650 655

Ser Asn Asn Asn Ile His Gly Ser Ile Pro Pro Ser Ile Cys Ser Ser

660 665 670

Thr Ser Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Asn Asn Ser Leu Ser Gly Pro

675 680 685

Ile Pro Gln Cys Leu Phe Gln Met Ser Gly Ser Leu Gly Val Leu Asp

690 695 700

Leu Arg Gln Asn Asn Leu Ser Gly Ile Ile Ser Asp Thr Phe Ser Lys

705 710 715 720

Ser Cys Lys Leu Gln Thr Leu Lys Leu Asp Gln Asn Arg Leu Glu Gly

725 730 735

Lys Val Pro Lys Ser Leu Gly Asn Cys Lys Met Leu Glu Val Leu Asp

740 745 750

Ile Gly Asn Asn Gln Ile Asn Asp Ser Phe Pro Trp His Leu Lys Asn

755 760 765

Ile Ala Lys Leu His Val Leu Val Leu Arg Ser Asn Lys Phe Asn Gly

770 775 780

His Ile Asp Cys Ser Gly Asn Asn Gly Gly Trp Ser Met Leu Gln Ile

785 790 795 800

Phe Asp Leu Ala Ser Asn Asn Phe Ser Gly Lys Leu His Leu Thr Cys

805 810 815

Leu Gly Thr Trp Asp Ala Met Gln His Asn Pro Tyr Ser Asn Leu Leu

820 825 830

Glu Leu Lys His Leu His Phe Val Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr

835 840 845

Arg Tyr Gln Asp Ala Ile Thr Ile Thr Thr Lys Gly Leu Glu Leu Glu

850 855 860

Leu Val Lys Ile Leu Pro Val Phe Thr Ser Ile Asp Ile Ser Trp Asn

865 870 875 880

Asn Phe Glu Gly Pro Ile Pro Glu Val Ile Gly Lys Phe Lys Glu Leu

885 890 895

His Gly Leu Asn Phe Ser His Asn Ala Phe Thr Gly Pro Ile Pro Ser

900 905 910

Ser Phe Gly Asn Leu Arg Glu Leu Glu Ser Leu Asp Leu Ser Ser Asn

915 920 925

Ser Leu Arg Gly Glu Ile Pro Leu Gln Leu Ala Asn Leu Asn Phe Leu

930 935 940

Ser Cys Leu Asn Val Ser Asn Asn Lys Leu Val Gly Pro Ile Pro Thr

945 950 955 960

Ser Thr Gln Leu Gln Ser Phe Pro Glu Ala Ser Phe Glu Asn Asn Ala

965 970 975

Gly Leu Cys Gly Pro Pro Leu Lys Thr Lys Cys Gly Leu Pro Pro Gly

980 985 990

Lys Glu Asp Ser Pro Ser Asp Ser Glu Thr Gly Ser Ile Ile His Trp

995 1000 1005

Asn His Leu Ser Ile Glu Ile Gly Phe Thr Phe Gly Leu Gly Ile

1010 1015 1020

Ile Ile Val Pro Leu Ile Tyr Trp Lys Arg Trp Arg Ile Trp Tyr

1025 1030 1035

Phe Glu Arg Ile Asp Leu Ala Leu Ser Arg Leu Phe Pro His Leu

1040 1045 1050

Gly Arg Glu Thr Lys Lys His Gly Arg Arg Ala Lys Gln Asn Gln

1055 1060 1065

Arg Gly Gly Pro Ser Asn Asp Trp Asp

1070 1075

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ttctggtcca ataccatcat tct 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

cttagattca gtactccaag aga 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

cttgatgggg tgaatattag agca 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<400> 6

attgcccaag gttaccgata gaat 24

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

cttggatccg catacattgt agcgtgagat aa 32

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<400> 8

ctaaggtacc aaaacagcat acagtggaaa cag 33

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Gossipium

<400> 9

atcgatatgc agcagtacat ctctt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<400> 10

ctctaacagg ttactatatg ggtta 25

Claims

1.棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr5，是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白具有12个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域。

3．根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的诱导后上调表达。

4. 根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因过量表达提高受体植物拟南芥对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。

5、含有权利要求1或2所述基因的表达载体。

6、含有权利要求1或2所述基因的宿主菌。

7、权利要求1或2所述基因在植物拟南芥对棉花黄萎病落叶型强致病力病原菌V991和非落叶型强致病力病原菌Bp2抗性改良中的应用。