CN102174529A - 棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用，属于生物技术领域。GhVdr2基因是从抗黄萎病材料常抗棉中获得的一个表面受体蛋白基因，该基因含有11个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域。RT-PCR分析发现GhVdr2在根中的表达量略高于其他器官，落叶型和非落叶型强致病力菌株V991和Bp2处理4天后，GhVdr2在根，茎和叶中表达量都增加，而金属离子，盐，干旱等胁迫并不能使GhVdr2的表达量增加。GhVdr2基因过量表达株的黄萎病抗病性明显增强，在病原菌接种15天后，对于V991平均病指仅为3.6%，而对照达到54%；对于Bp2的平均病指仅为2.1%，而对照达到25%。

Description

棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用

一、技术领域

本发明提供了一个棉花黄萎病抗性相关基因GhVdr2及其应用，涉及植物基因克隆以及功能分析，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

黄萎病是棉花生产中的最主要病害之一，广泛分布于世界各产棉国。由于是土壤传播的维管束病害，防治难度较大，到目前为止，尚未有特效的防治药剂，只能依靠种植抗病品种为主的综合防治措施，但目前我国棉花品种的抗病性只能达到耐病水平，致使该病在环境条件合适的情况下连续流行危害。我国90年代育成近100个抗病品种，大多数抗枯萎病较好，而抗黄萎病较差。从1998年开始推广应用转基因抗虫棉，到2006年，通过国家审定的转基因抗虫棉品种共40个，其中达到高抗枯、黄萎病的品种仅有冀杂1号、邯5158、中植棉2号，而这3个品种的抗黄萎病性仅为低抗病且接近耐病（朱荷琴，吴征彬，邹奎．国家棉花品种区域试验棉花抗枯黄萎病鉴定技术实施方案．中国棉花，2007，34（11）：9-10）。另外，由于黄萎病病菌的生理小种变异很快，常导致抗病品种因“丧失”抗性而被淘汰，因此针对性地选育持久抗性品种应为黄萎病抗性育种的发展趋势。

抗黄萎病资源缺乏，是棉花抗黄萎病育种的主要限制。我国现存棉花品种资源中高抗黄萎病的资源多为海岛棉（马存，简桂良，孙文姬. 我国棉花抗黄萎病育种现状、问题及对策. 中国农业科学, 1997, 30(2): 58-64）。海岛棉抗黄萎病性能虽好，却由于生育期长，产量低而不能直接利用，而陆地棉栽培品种中对黄萎病达到高抗的材料很少，并且相应的农艺性状不是很理想。常抗棉（Gossypium  hirsutum L.）是我国江苏省常熟地区选育的抗落叶型黄萎病棉花品系，该品种属中熟陆地棉类型，在田间表现高抗黄萎病。但是由于其农艺性状差，结铃率低，生产上不能直接利用（王红梅, 张献龙, 李运海等. 陆地棉黄萎病抗性遗传分析.棉花学报, 2004, 16(2):84-88）。

利用传统育种方法进行抗黄萎病育种工作中，由于要打破不利基因连锁，实现有利基因的重组，就要进行大量品种间的杂交，甚至是远缘杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量。

棉花转基因方法的不断成熟完善为转基因育种提供了重要的保证，通过多基因转化或聚合育种，将多个抗性基因转化得到可以应用于育种的核心种质，可以大大加快育种进程，是未来抗病育种的一个长期趋势。

目前应用于转基因黄萎病抗性育种的基因主要有以下几类，一是将一些防卫相关基因如几丁质酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖氧化酶、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽和脂质转运蛋白等转入棉花（吴家和等，2004；程红梅等，2005；Rajasekaran K，et al，2005；齐俊生等，2005；Zhu Hq，et al. Verticillium wilt resistance of a transgenic cotton line with chitinase and glucanase genes. Cotton Science, 2011, 23(1): 58-63）。Parkhi等将拟南芥的防卫相关基因NPR1转化棉花，发现转化株抗非落叶型的黄萎病，但是不抗落叶型病原菌（Parkhi V, Kumar V, Campbell LAM, et al. Expression of Arabidopsis NPR1 in Transgenic Cotton Confers Resistance to Non-defoliating Isolates of Verticillium dahliae but not the Defoliating Isolates. Journal of Phytopathology, 2010, 158(11-12): 822-825）。但是由于这些基因缺乏专一性，以及大多使用组成性启动子，因而，这些基因过量表达的同时会对农艺性状带来不利影响（Murray F, Llewellyn D, McFadden H, James Peacock.  Expression of the Talaromyces flavus glucose oxidase gene in cotton and tobacco reduces fungal inf

Ve基因是目前国际公认的最为有效的黄萎病抗性基因之一，它是一种表面受体蛋白（RLPs），具有跨膜结构域和胞外富含亮氨酸重复（LRRs）结构域。通过LRRs这种结构识别并结合病原物蛋白质，参与抗病信号传递，诱导植物防卫基因的表达，使植物获得系统抗性。已经证明该类蛋白在植物很多抗病过程中起着重要的作用。如番茄叶霉病抗性基因Cf-9（Jones DA, Thomas CM, Hammondkosack KE, et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science，1994，266:789-793），烟草和番茄的绿色木霉抗性基因LeEIX2（Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-like gene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615），苹果黑星病抗性基因HcrVfa1，HcrVfa2（Belfanti E, Silfverberg-Dilworth E, Tartarini S, et al. The HcrVf2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 886-890; Malnoy M, Xu M, Borejsza-Wysocka E, Korban SS, Aldwinckle HS. Two receptor-like genes, Vfa1 and Vfa2, confer resistance to the fungal pathogen Venturia inaequalis inciting apple scab disease. Mol Plant Microbe Interact, 2008, 21: 448-458）等。该类基因多以基因家族形式存在，如大部分Cf基因以成簇的方式分布在染色体上；Ve1和Ve2位于同一个基因位点；LeEIX位点含有3个同源基因；苹果的黑星病抗性位点Vf含有HcrVfa1,HcrVfa2，HcrVfa3和HcrVfa4这4个同源基因。相当多的研究成果证明不同的基因家族成员可能识别不同的病原小种并诱导专一性的抗性反应。如Cf-2, Cf-4, Cf-4E, Cf-5, Cf-9和9DC分别识别叶霉病的效应因子 Avr2, Avr4, Avr4E, Avr5 和 Avr9（Jones DA, Thomas CM, Hammondkosack KE, Balintkurti PJ, Jones JDG Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science，1994，266:789-793；Thomas CM, Jones DA, Parniske M, et al. Characterization of the tomato Cf-4 gene for resistance to Cladosporium fulvum identifies sequences that determine recognitional specificity in Cf24 and Cf29. Plant Cell, 1997, 9: 2209-2224; Kruijt M, Brandwagt BF, de Wit PJGM. Rearrangements in the Cf-9 disease resistance gene cluster of wild tomato have resulted in three genes that mediate Avr9 responsiveness. Genetics, 2004,168: 1655-1663）。另外，同一个位点的基因家族成员有些对已有的病理小种不存在抗性，它们可能在基因进化过程中发挥一定的作用。Ve位点中只有Ve1基因起抗病作用（Fradin EF, Nazar RN, Zhang ZPW, et al. Genetic dissection of receptor-like protein mediated disease resistance against Verticillium wilt pathogens mediated by tomato Ve1. Plant Physiology, 2009, 150: 320–332）；LeEIX位点中只有LeEIX2有抗病作用（Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-like gene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615）；Vf位点中只有HcrVfa1和HcrVfa2有抗病作用（Belfanti E, Silfverberg-Dilworth E, Tartarini S, et al. The HcrVfa2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 886-890; Malnoy M, Xu M, Borejsza-Wysocka E, et al. Two receptor-like genes, Vfa1 and Vfa2, confer resistance to the fungal pathogen Venturia inaequalis inciting apple scab disease. Mol Plant Microbe Interact, 2008, 21: 448-458）。

对于棉花黄萎病的抗性遗传一直存在争议，这可能是由于接种方法的不同而造成的，在温室或生长室由单一菌系接种鉴定时得出的结论为单基因控制，而在田间病圃用多菌系混合鉴定时得出的结论多是多基因遗传（房卫平, 祝水金, 季道藩. 棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展. 棉花学报, 2001, 13 (2) : 116-120）。这就说明棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。RLPs基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种成为可能。棉花黄萎病抗性基因GhVdr2的分离与功能研究为该类基因的深入研究以及进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个能提高棉花黄萎病抗性的新基因GhVdr2，该基因编码一个表面受体蛋白基因。该基因受黄萎病病原菌诱导后表达量增加。该基因过量表达可以显著提高受体植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因GhVdr2，属于植物基因工程领域，该基因来源于陆地棉品种常抗棉（Gossypium  hirsutum L.），该品种高抗落叶型黄萎病。GhVdr2是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2） 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE（15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA）、 0.1×SSC（15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠）、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由3505个碱基组成，自5’端第20位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3417位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为3417个碱基，编码蛋白为1139个氨基酸，分子量为112KD，等电点为6.6。比较分析发现该基因含有11个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域（图1）。该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性为50%（图2），将该基因命名为GhVdr2。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明棉花抗病相关基因GhVdr2的应用，该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量增加。该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白具有11个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域。该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的诱导后上调表达，过量表达明显提高受体植物对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。

将GhVdr2与35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥植株，结果该基因过量表达可以显著提高植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高包括单子叶植物和双子叶植物的抗病性状。

GhVdr2的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果  

1.        本发明获得了一个全新的棉花黄萎病抗性相关基因 GhVdr2 。本发明获得的GhVdr2基因是一个全新的受体蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后上调表达。通过转基因分析发现此基因的过量表达可以显著提高植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后15天，抗性作用十分明显，对于落叶型黄萎病8个转基因株系的平均病指仅为3.6%，而对照达到54%；对于非落叶型黄萎病11个转基因株系的平均病指仅为1.2%，而对照达到25%。黄萎病接种20天后，对于落叶型黄萎病8个转基因株系的平均病指仅为60%，而对照达到100%；对于非落叶型黄萎病11个转基因株系的平均病指仅为30%，而对照达到100%。这样的鉴定结果说明早期抗性效果明显，但是随着病原菌的生长，转基因植株也会显现一定的病症，但是较对照抗性还是较为明显。说明该基因是一个全新的黄萎病抗病相关基因。

本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。 GhVdr2的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。例如可以利用 GhVdr2分离互作的黄萎病病原菌的致病因子，利用该基因过量表达植株可以进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以GhVdr2的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。

本发明应用于抗病育种。 GhVdr2抗性效果显著，并且同时抗落叶和非落叶型黄萎病，在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1 GhVdr2的结构预测。LRR为富含亮氨酸重复序列。

图2 GhVdr2, 番茄Ve1和番茄Ve2的氨基酸序列相似性比较。Ve1（索取号：AF272367_1），Ve2（索取号：AF365929_1）。

图3 GhVdr2在不同器官中的表达。GhVdr2为目的基因的表达，组蛋白为内参。

图4 棉花黄萎病病原菌处理常抗棉4d后GhVdr2的表达。CK，未处理；Bp2，非落叶型强致病力菌株处理；V991，落叶型强致病力菌株处理。

图5 不同处理常抗棉中GhVdr2的表达。CK，未处理；CuSO₄，CuSO₄分别处理24h和48h；PEG，干旱处理24h和48h；NaCl，盐处理24h和48h；ABA，脱落酸分别处理24h和48h；GA，赤霉酸处理24h和48h；冷，4℃处理24h。

图6 GhVdr2过量表达载体的构建。

图7接种15天后GhVdr2转化植株的病指调查。CK为未转化植株；Ch2-1—Ch2-14为GhVdr2的转化株。

图8 接种20天后GhVdr2转化植株的病指调查。 CK为未转化植株；Ch2-1—Ch2-14为GhVdr2的转化株。

图9 GhVdr2提高受体植物的黄萎病抗性。A，C分别为用非落叶型和落叶型强致病力菌株Bp2和V991接种未转化株（CK）15天后的表型；B，D分别为用非落叶型和落叶型强致病力菌株Bp2和V991接种GhVdr2转化植株15天后的表型。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于陆地棉品种常抗棉(Gossypium  hirsutum L.)（王红梅, 张献龙, 李运海等. 陆地棉黄萎病抗性遗传分析.棉花学报, 2004, 16(2):84-88），该品种高抗落叶型黄萎病。拟南芥品种为哥伦比亚型（Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, Benito MI, Town CD, Fujii CY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M, Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA, Lee J, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, Van Aken S, Umayam L, Tallon LJ, Gill JE, Adams MD, Carrera AJ, Creasy TH, Goodman HM, Somerville CR, Copenhaver GP, Preuss D, Nierman WC, White O, Eisen JA, Salzberg SL, Fraser CM, Venter JC. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature 1999; 16; 402(6763):761-8.）。

（一）棉花GhVdr2基因克隆以及序列分析

根据Genbank中一段棉花EST序列（登录号：TC121084）设计引物5’- TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3’，5’-CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3’扩增常抗棉DNA模板，得到约1Kb左右条带，将该片段测序，发现其与原来的EST片段只有76%的相似度。根据该片段设计用于扩增5’和3’未知区域的genomewalking引物。用于扩增5’未知区域的引物为5’-AAGGTGTCAAGCAATGAAGAGGC-3’，5’-GTATCAGTGGCATCAATAGACAA-3’；用于扩增3’未知区域的引物为：5’-CTCTGTCTCGGGCAATAACTTCA-3’，5’-TCCTAAATGCCTGACTCAAATGG-3’。根据genomewalking得到的序列与原来1Kb条带进行拼接，得到完整的阅读框。根据拼接后的序列设计扩增基因全长的引物smaGhVdr2：5’-TGACCCGGGATTGATACTAATGAGGATGTCACTC-3’；sacGhVdr2: 5’- TCAGAGCTCTTTCATCACCCCTTTCCATGGT-3’。引物末端分别带有限制性内切酶SmaⅠ和SacⅠ的识别位点，为构建植物表达载体做准备。用这对引物扩增常抗棉的DNA模板，在25                                                

l反应体系中加入DNA模板1 

l，引物各5 nmol，5 

l  5×primeSTAR buffer （Mg²⁺ plus）PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1 U primeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 3'，循环36次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。得到约3.5Kb片段，将该片段进行末端加A处理（北京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-T easy载体（Promega公司）连接。连接产物用JM1090（北京全式金生物技术有限公司）感受态细胞进行热激转化。测序由上海英俊生物工程公司进行。用DNA club进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行BLAST分析。数据库ExPASy（http://cn.expasy.org/）进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。分析结果表明扩增得到的片段长度为3505bp，自5’端第20位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3417位碱基为转录终止位点。编码蛋白含有1139个氨基酸，分子量为112KD，等电点为6.6。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测和功能分析，该基因含有11个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域（图1），这些结构域的存在说明该基因在蛋白互作及蛋白的细胞定位中起重要作用。同源相似性分析发现该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性为50%（图2），将该基因命名为GhVdr2。

（二）棉花GhVdr2在不同器官中的表达量分析

在常抗棉材料同一棉花植株上，采集植株的花蕾、根、茎、叶片以及棉纤维，其中棉纤维和种子的取样时间为开花后15 d。用CTAB法提取总RNA（骆萍，王国栋，陈晓亚. 亚洲棉C4H同源cDNA 的分离和表达特征分析. 植物学报, 2001, 43(1): 77-81.）。用RQ1 DNnase（Promega公司）处理棉花各器官的总RNA，参照CLONTECH公司的“SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit”的说明书中3’RACE模板制备方法来制备RT-PCR模板。反转录引物为（5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30N-1N 3’）。用于半定量RT-PCR的基因特异引物为GhVdr2-1650F:5’- TCTGCCTTGTCTACCTTTCC CAA-3’, GhVdr2-2040R：5’-GTGGAAGTTATTATCTGAGATGGA-3’。根据棉花持家基因组蛋白设计的引物HF：5’GAAGCCTCATCGATACCGTC 3’和HR：5’CTACCACTACC ATCATGGC 3’作为参照以及检测是否有DNA污染。用这两对引物分别扩增常抗棉的cDNA模板，在25 

l反应体系中加入cDNA模板1 l，引物各5 nmol，2.5 

l  10×PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1.5 mM MgCl2，1 U rTaq（TaKaRa公司）进行PCR扩增。GhVdr2扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 1'，循环33次，再72℃延伸10'。组蛋白扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 1'，循环23次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。棉花组蛋白扩增长度的300bp，GhVdr2扩增长度的390bp。以棉花组蛋白作为参照，对GhVdr2在叶、根、花蕾、茎、种子和纤维中的表达分析发现，其在各个器官中的表达量基本一致，只是根中的表达量略高于其他器官（图3）。

（三）棉花GhVdr2的诱导表达分析

    将脱绒常抗棉种子直接播种于营养土中。待棉苗长到2～3 片真叶时进行处理，每盆1-2颗棉苗。

病原菌诱导条件为：菌株为落叶型和非落叶型强致病力病原菌V991和Bp2（朱荷琴, 宋晓轩, 简桂良. 棉花黄萎病菌致病力变异生理机制的初步研究. 棉花学报, 2004,16 (5): 275～279; 林玲, 陈志石, 龚伟荣, 张爱香, 顾甘雨, 顾本康. 间接ELISA 法检测棉子携带黄萎病菌新方法. 棉花学报, 2006, 18(6): 327~ 331）。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液（g/l）：NaNO₃ 2g、K2HPO₄ 1g、MgSO₄-7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄-7H₂O 0.01g、蔗糖30g，25 ℃，180 r ·min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为棉花苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁷。诱导时间为4d。分别采集诱导前和诱导后棉花材料的根，茎和叶，总RNA提取以及RT-PCR模板制备方法见上文。表达分析结果显示V991和Bp2处理4d后，在根，茎和叶中基因表达量都有增加（图4）。

盐胁迫处理条件为用250mM NaCl溶液直接浇灌棉株；冷胁迫处理将棉株置于4℃生长；干旱处理用20%的PEG8000直接浇灌棉株；重金属处理用10 μM CuSO₄溶液直接浇灌棉株；GA处理用10 ppm 赤霉酸溶液喷洒植株；脱落酸（ABA）处理用15mg/L的ABA溶液直接喷洒植株。取诱导一定时间和未诱导的植物叶片，迅速置于液氮中，-70℃存放备用。RT-PCR的模板制备与棉花不同器官模板制备一样。RT-PCR扩增引物同样为GhVdr2-1650F和GhVdr2-2040R。表达分析结果显示金属离子，盐以及干旱胁迫处理，ABA和GA的激素处理没有增加GhVdr2的表达量（图5）。

（四）GhVdr2基因过量表达载体的构建以及植物转化

通过测序证明了GhVdr2基因插入pGEM-T easy克隆载体（美国promega公司），并且有3417个碱基的完整编码框。用SmaⅠ和SacⅠ分别酶切含有GhVdr2基因的阳性克隆，回收3.4Kb的目的片段。同时用SmaⅠ和SacⅠ分别酶切植物表达载体PCAMBIA2301（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/），回收13Kb的目的片段，将两个片段用T4 ligase连接（Promega公司）并转化JM1090感受态，获得的阳性克隆即为含有CaMV 35S启动子和GhVdr2基因片段的重组载体，命名为PCAMBIA2301-35S- GhVdr2（图6），用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404（中国质粒载体菌株基因库，http://biovector.blog.163.com/）。用花浸染方法（Clough S J, Bent A F. Floral dip: A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16:735-743）转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达。通过PCR鉴定，共获得14株含有GhVdr2基因的转化株，其中11株目的基因可以表达。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子播种于含有25 mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于基因功能以及特征研究。

（五）T1代转化株的抗病性鉴定

对11株GhVdr2基因表达的转化株进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的MS培养基筛选的绿苗转入营养土中，每盆移栽5-6株幼苗。待拟南芥生长1个月后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为落叶型和非落叶型强致病力病原菌V991和Bp2。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25 ℃，180 r ·min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁷。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数需大于24株，接种后每天观察病害的发生情况，在15天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。病指按照以下标准进行鉴定，0 级：无病植株；1 级：0. 1 %～25 %叶片发病的植株；2 级：25 %～50 %叶片发病的植株；3 级：50 %～75 %叶片发病的植株；4 级：75 %以上叶片发病的植株。对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后15天，抗性作用十分明显，对于落叶型黄萎病V991，8个转基因株系的平均病指仅为3.6%，而对照达到54%；对于非落叶型黄萎病Bp2，11个转基因株系的平均病指仅为2.1%，而对照达到25%（图7）。黄萎病接种20天后，对于落叶型黄萎病V991，8个转基因株系的平均病指仅为60%，而对照达到100%；对于非落叶型黄萎病Bp2，11个转基因株系的平均病指仅为30%，而对照达到100%（图8）。从表型上看，未转化植株接菌后15天，叶片明显萎蔫黄化，植株生长延缓，到最后不能结实。而转基因植株植株可以正常生长，尽管接种20天后转基因植株也出现一定的叶片黄化症状，但是植株可以正常结实（图9）。

                         SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用

 

 

<130>  说明书

 

 

<160>  11   

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  3505

<212>  DNA

<213>  Gossypium hirsutum L.

 

 

<220>

<221>  GhVdr2

<222>  (1)..(3505)

<223> 

 

 

 

<400>  1

tgacccggga ttgatactaa tgaggatgtc actcttttca ttgcttttct tgaattcttt     60

 

tgtattggtt atgcttattg ttgatgtggt tttggtttcg gctcaatgtc aaaatgatca    120

 

gagtcggttg ttgcgtcaac ttgaaagcag cttcagctac aatccaactt catcaggaaa    180

 

gctggtgcca ctgaaatgga atcaaagcac agattgttgt ttctgggatg gtgtacattg    240

 

cgatggagat ggtcatgtta tcagtcttga cttgaacagc agatcaattt caagttcaat    300

 

tgacaattca agtagtcttt tccgtcttca acatcttcag tggctcaatt tggcttataa    360

 

caaattcaag ccagtttttc ctactgtgtt tgataagctg gagaatttga gttatcttaa    420

 

cttgtccaat gctggcttta aagggaaaat tccaatagag atatcacgct tgacaaggtt    480

 

ggtcactctt gatttatctg tatcttcact tcttggaaga tcattgaaac ttgagaagcc    540

 

aaacctagag atgcttgttc aaaatctcaa gaggctgaga tttctctatc ttgatggagt    600

 

aaatatatca gctacgggga atgagtggtg caaggcttta ttgccgctga ccgagttgca    660

 

agaattgagc atgtcctact gttatctttc aggacctata ctttcttcac tttccagtct    720

 

ccgatctctc tcggtaattc gcttggacaa taacaatttg tcggcttcag ttccacaatt    780

 

ctttacagaa tttgaaaatt tgacttccct tcgtcttact gccactgggt tgcgtggaag    840

 

agtgccagaa gatattttcc agatacgtac attgcaaatt cttgatttgt caaccaacaa    900

 

attactcgaa ggttcatttc aaaattttcc tctcaatgct tctcttcgaa ctctcacact    960

 

tagtggcaca aatttcaggg gacaagtacc agaatctatc ggtaatcttg agcaattgac   1020

 

aagaatagag cttgtgggtt gcaatttcag tggagccata cccaaaacaa tgaagaacct   1080

 

tacccaactt gtgtatctgg atttttcctt taaccatttt tctggtccaa taccaccatt   1140

 

ctcatcatcc agaaatctta cacaactaag ccttgctcat aatcagttaa agggcacaat   1200

 

tgattccacc aactggtccg gcctttctaa actagtaagt attgacttac aaaacaacat   1260

 

gttaagtgga accattcccc caaatttgct ttgcattcca tcactgcgaa gacttttcct   1320

 

ttctcagaac caattcaagg gtaaccttgg tgaccttcat tgtagggcct cttctttgct   1380

 

tgacaccttt gatcttagta gcaacaagtt acaagggcaa ttcccaatgt ctgtgtttga   1440

 

actccgtggt ctgaagttcc tatcactttc ttcaaacaac ttcagtggtt tgattccgat   1500

 

gagggccctt cagaacctga agaatctttc ctctcttgat ctctcatata acagtttgtc   1560

 

tattgatgcc actgatacta atgtttcctc actttctttc cctaacatca ccacattgaa   1620

 

gttgatatct tgcaacttaa cggagttccc tgattttttg acatatcagt ctagattatc   1680

 

ctatctagac ctttcaaaca accagattca agggaaaata ccgaattgga tttggaaagt   1740

 

gagaagcctt agatacctaa atctttctaa aaacttcctt gtaaaatttg aaagatcttt   1800

 

ggagaatata aattctagtc tcaatgtttt ggacctgcat ggcaatcgat tgcaagggaa   1860

 

aattgaaatt cttccatcaa gtgccgccta tttggattac tcaaacaaca attttaactc   1920

 

tgttttacca gctcagatcg gtgacttcct ccagtttgct tatttcttct ctgtctcggg   1980

 

caataacttc aaggggagta ttcccaagtc gatatgcggt agcttatatc tcagagtact   2040

 

tgatatgtct gataattact tgagtgggcc aattcctaaa tgcctgactc gaatgagtgc   2100

 

atctcttgga gtactgaatc taaggggaaa caatctcagt ggcatcattt ctgacacttt   2160

 

tccagaaagt tgtaagttgc aaactctaga tctcaatcag aaccgattgg aaggaaaggt   2220

 

tccagaatca ctggggaatt gcaaaaagct ggaggttgta aagattggca acaatcagat   2280

 

cagtggcagc ttcccatgcc atttgaagaa tatatctaag ttgcgtatcc ttgttttacg   2340

 

atctaacaaa ttcaatggca gtattcattg tcacaagaac aatattggct ggccaatgct   2400

 

tcagattgtt gacttagcat ccaataattt tagcggtaaa ctgcatcaaa aatgtttggc   2460

 

gacctggaag ggtatgcagg ttcctgagaa tgaagaccag tcaaaggtca aacatcttga   2520

 

gtttcagttt cttgaattct atccaaatta ctatcaagat gcaataacag ttaccatcaa   2580

 

aggtttagag ttggagctgg tgaagatcct aaccgtgttc accaccattg acatttcttg   2640

 

taacaacttt gaagggcgaa taccagaagt cattggaaca ttcaaagaac tttatggcct   2700

 

aaacttttca cataatgctt tcacagggtc aatgccatca tttttaggga acctgcaaca   2760

 

gcttgagtcc ttggacctct caagtaatta cttgagtggt gggattccat tgcagcttgt   2820

 

aaacctcaat ttcctttcat ttcttaatgt ctcgaacaat aagctatttg gacagatccc   2880

 

aactggcacc cagcttcaaa cgttttcaaa agcttcattt gagaacaacc ctggattgtg   2940

 

tggggctcct ctaactgtaa agtgtgcaaa tgtatttcga cctacaacac atacagtgcc   3000

 

ggaattacaa tcagtggatg gattagattg gctgttcata ttcctggggg tgggatttgg   3060

 

tgcaggagca gcagcatttg ctgtaccctt actactttgg aagacagcaa gtaaatgggt   3120

 

tgatggcaac gttgataaaa tccttgagat catccttcca aaggtgggtc tcacttacac   3180

 

acgtcctagt gacttgaagg ttgaggcaga tgaaaatcct gaggaagaca agacagaaat   3240

 

ttatgacgat gatgaagaag acgaagacga agaaagcaag gaaaccacgg aagaattttg   3300

 

cgggagatac tgtgtgtttt gctccaaact tgacaataac accatgaaga aggtaattca   3360

 

tgacctatgt tgtacctgct atgattcacc atatctatcg ccttctactt ccacttcttc   3420

 

ttcattttct ccttagatcc ttcatttttt tgtgcataga taaagaagga atccaccatg   3480

 

gaaaggggtg atgaaagagc tctga                                         3505

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增常抗棉DNA模板引物1

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  2

ttctggtcca ataccatcat tct                                             23

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增常抗棉DNA模板引物2

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  3

cttagattca gtactccaag aga                                             23

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增5'未知区域的引物1

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  4

aaggtgtcaa gcaatgaaga ggc                                             23

 

 

<210>  5

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增5'未知区域的引物2

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  5

gtatcagtgg catcaataga caa                                             23

 

 

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增3'未知区域的引物1

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  6

ctctgtctcg ggcaataact tca                                             23

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  扩增3'未知区域的引物2

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  7

tcctaaatgc ctgactcaaa tgg                                             23

 

 

<210>  8

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  引物smaGhVdr2

<222>  (1)..(34)

<223> 

 

 

 

<400>  8

tgacccggga ttgatactaa tgaggatgtc actc                                 34

 

 

<210>  9

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  sacGhVdr2

<222>  (1)..(31)

<223> 

 

 

 

<400>  9

tcagagctct ttcatcaccc ctttccatgg t                                    31

 

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GhVdr2-1650F

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  10

tctgccttgt ctacctttcc caa                                             23

 

 

<210>  11

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GhVdr2-2040R

<222>  (1)..(24)

<223> 

 

 

 

<400>  11

gtggaagtta ttatctgaga tgga                                            24

Claims (9)

1.棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用，是下述核苷酸序列之一：

序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的条件为0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白具有11个LRR保守结构域，N端和C端各有1个跨膜结构域。

4.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的诱导后上调表达。

5.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因过量表达明显提高受体植物对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。

6.含有权利要求1～5之一所述基因的表达载体。

7.含有权利要求1～5之一所述基因的宿主菌。

8.权利要求1～5之一所述基因在植物抗性改良中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

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