CN103266116A - 棉花黄萎病抗病相关基因GaVdr1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗病基因及其应用，属于生物技术领域。GaVdr1基因是从抗黄萎病材料亚洲棉中获得的一个表面受体蛋白基因，编码蛋白含有1065个氨基酸，分子量为119.8KD，等电点为8.15。该基因含有9个LRR保守结构域，C端有1个跨膜结构域。同源相似性分析发现该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性分别为47%和44.9%。GaVdr1基因过量表达株的黄萎病抗病性明显增强，在病原菌接种24天后，对于V991，6个转基因株系的平均发病率为24.06%，而野生型达到56.67%；对于Bp2，6个转基因株系的平均发病率为仅为24.44%，而野生型达到53.33%。GaVdr1的分离与功能分析为该基因的进一步利用奠定基础。

Description

棉花黄萎病抗病相关基因GaVdr1及其应用

一、技术领域

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花黄萎病抗性相关基因GaVdr1及其应用，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

黄萎病是棉花生产中的最主要病害之一，广泛分布于世界各产棉国。由于是土壤传播的维管束病害，防治难度较大，到目前为止，尚未有特效的防治药剂，只能依靠种植抗病品种为主的综合防治措施，但目前我国棉花品种的抗病性只能达到耐病水平，致使该病在环境条件合适的情况下连续流行危害。我国90年代育成近100个抗病品种，大多数抗枯萎病较好，而抗黄萎病较差。从1998年开始推广应用转基因抗虫棉，到2006年，通过国家审定的转基因抗虫棉品种共40个，其中达到高抗枯、黄萎病的品种仅有冀杂1号、邯5158、中植棉2号，而这3个品种的抗黄萎病性仅为低抗病且接近耐病（朱荷琴，吴征彬，邹奎．国家棉花品种区域试验棉花抗枯黄萎病鉴定技术实施方案．中国棉花，2007，34（11）：9-10）。另外，由于黄萎病病菌的生理小种变异很快，常导致抗病品种因“丧失”抗性而被淘汰，因此针对性地选育持久抗性品种应为黄萎病抗性育种的发展趋势。

抗黄萎病资源缺乏，是棉花抗黄萎病育种的主要限制。我国现存棉花品种资源中高抗黄萎病的资源多为海岛棉（马存，简桂良，孙文姬. 我国棉花抗黄萎病育种现状、问题及对策. 中国农业科学， 1997， 30(2): 58-64）。海岛棉抗黄萎病性能虽好，却由于生育期长，产量低而不能直接利用，而陆地棉栽培品种中对黄萎病达到高抗的材料很少，并且相应的农艺性状不是很理想。亚洲棉是古老的栽培种，因最早在亚洲种植而得名。亚洲棉在中国种植历史至少已有2000年，所以又称中棉。亚洲棉的产量、纤维长度、细度都不及陆地棉，只适宜纺28号以上(21英支以下)的中、粗号纱，而且部分纤维长度在16毫米以下，无纺纱价值，所以已逐渐被陆地棉所代替。由于亚洲棉植株较适应亚洲土壤气候，生长期短，抗逆性强等，对棉花育种有一定价值，至今在亚洲还保留少量的种植，其产量约占世界棉花总产量的4％左右。亚洲棉中，南陵小籽棉光子是我国种质资源库中一个高抗黄萎病的品种，克隆其中的抗病基因，并转化到陆地棉中，有望解决陆地棉抗性不强的劣势。

利用传统育种方法进行抗黄萎病育种工作中，由于要打破不利基因连锁，实现有利基因的重组，就要进行大量品种间的杂交，甚至是远缘杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量。棉花转基因方法的不断成熟完善为转基因育种提供了重要的保证，通过多基因转化或聚合育种，将多个抗性基因转化得到可以应用于育种的核心种质，可以大大加快育种进程，是未来抗病育种的一个长期趋势。

目前应用于转基因黄萎病抗性育种的基因主要有以下几类，一是将一些防卫相关基因如几丁质酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖氧化酶、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽和脂质转运蛋白等转入棉花（吴家和等，2004；程红梅等，2005；Rajasekaran K，et al，2005；齐俊生等，2005；Zhu Hq，et al. Verticillium wilt resistance of a transgenic cotton line with chitinase and glucanase genes. Cotton Science, 2011, 23(1): 58-63）。Parkhi等将拟南芥的防卫相关基因NPR1转化棉花，发现转化株抗非落叶型的黄萎病，但是不抗落叶型病原菌（Parkhi V, Kumar V, Campbell LAM, et al. Expression of Arabidopsis NPR1 in Transgenic Cotton Confers Resistance to Non-defoliating Isolates of Verticillium dahliae but not the Defoliating Isolates. Journal of Phytopathology, 2010, 158(11-12): 822-825）。但是由于这些基因缺乏专一性，以及大多使用组成性启动子，因而，这些基因过量表达的同时会对农艺性状带来不利影响（Murray F, Llewellyn D, McFadden H, James Peacock. Expression of the Talaromyces flavus glucose oxidase gene in cotton and tobacco reduces fungal infection, but is also phytotoxic. Molecular Breeding, 1999, 5: 219–232），到目前为止，转上述基因棉花种质没有能够有效利用；二是将微生物相关基因转入棉花，Tian等将杆状病毒的抗细胞凋亡基因p35以及op-iap转化陆地棉， T1-T3后代转化株的病指<19，抗性达到极显著水平（Tian J, Zhang XY, Liang BG. Expression of Baculovirus Anti-Apoptotic Genes p35 and op-iap in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Enhances Tolerance to Verticillium Wilt. PLoS ONE, 2010, 5(12): e14218）。Miao等将水稻白叶枯病原菌（Xanthomonas oryzae）过敏蛋白基因转化棉花，转化株抗病性增强（Miao W, Wang X, Li M, et al. Genetic transformation of cotton with a harpin-encoding gene hpaXoo confers an enhanced defense response against different pathogens through a priming mechanism. BMC Plant Biol, 2010, 10：67-81）；三是转入植物黄萎病抗病基因。目前，唯一克隆得到的黄萎病抗性基因是番茄的Ve1和Ve2。Kawchuk等（2001）利用图位克隆从番茄抗黄萎病菌大丽轮枝菌材料中克隆了抗病基因Ve1和Ve2，并分别转入感病马铃薯中，转Ve1和Ve2基因土豆表现为高抗黄萎病（Kawchuk L, Hachey J. Lynch D. Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98 (11): 6511–6515），因此利用抗病基因提高黄萎病抗性是可行的，但是这类基因在转基因棉花育种中还没有应用。

Ve基因是目前国际公认的最为有效的黄萎病抗性基因之一，它是一种表面受体蛋白（RLPs），具有跨膜结构域和胞外富含亮氨酸重复（LRRs）结构域。通过LRRs这种结构识别并结合病原物蛋白质，参与抗病信号传递，诱导植物防卫基因的表达，使植物获得系统抗性。已经证明该类蛋白在植物很多抗病过程中起着重要的作用。如番茄叶霉病抗性基因Cf-9（Jones DA, Thomas CM, Hammondkosack KE, et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science，1994，266:789-793），烟草和番茄的绿色木霉抗性基因LeEIX2（Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-like gene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615），苹果黑星病抗性基因HcrVfa1，HcrVfa2（Belfanti E, Silfverberg-Dilworth E, Tartarini S, et al. The HcrVf2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 886-890; Malnoy M, Xu M, Borejsza-Wysocka E, Korban SS, Aldwinckle HS. Two receptor-like genes, Vfa1 and Vfa2, confer resistance to the fungal pathogen Venturia inaequalis inciting apple scab disease. Mol Plant Microbe Interact, 2008, 21: 448-458）等。该类基因多以基因家族形式存在，如大部分Cf基因以成簇的方式分布在染色体上；Ve1和Ve2位于同一个基因位点；LeEIX位点含有3个同源基因；苹果的黑星病抗性位点Vf含有HcrVfa1, HcrVfa2，HcrVfa3和HcrVfa4这4个同源基因。相当多的研究成果证明不同的基因家族成员可能识别不同的病原小种并诱导专一性的抗性反应。如Cf-2, Cf-4, Cf-4E, Cf-5, Cf-9和9DC分别识别叶霉病的效应因子 Avr2, Avr4, Avr4E, Avr5 和 Avr9（Jones DA, Thomas CM, Hammondkosack KE, Balintkurti PJ, Jones JDG Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science，1994，266:789-793；Thomas CM, Jones DA, Parniske M, et al. Characterization of the tomato Cf-4 gene for resistance to Cladosporium fulvum identifies sequences that determine recognitional specificity in Cf24 and Cf29. Plant Cell, 1997, 9: 2209-2224; Kruijt M, Brandwagt BF, de Wit PJGM. Rearrangements in the Cf-9 disease resistance gene cluster of wild tomato have resulted in three genes that mediate Avr9 responsiveness. Genetics, 2004, 168: 1655-1663）。另外，同一个位点的基因家族成员有些对已有的病理小种不存在抗性，它们可能在基因进化过程中发挥一定的作用。Ve位点中只有Ve1基因起抗病作用（Fradin EF, Nazar RN, Zhang ZPW, et al. Genetic dissection of receptor-like protein mediated disease resistance against Verticillium wilt pathogens mediated by tomato Ve1. Plant Physiology, 2009, 150: 320–332）；LeEIX位点中只有LeEIX2有抗病作用（Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-like gene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615）；Vf位点中只有HcrVfa1和HcrVfa2有抗病作用（Belfanti E, Silfverberg-Dilworth E, Tartarini S, et al. The HcrVfa2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 886-890; Malnoy M, Xu M, Borejsza-Wysocka E, et al. Two receptor-like genes, Vfa1 and Vfa2, confer resistance to the fungal pathogen Venturia inaequalis inciting apple scab disease. Mol Plant Microbe Interact, 2008, 21: 448-458）。

对于棉花黄萎病的抗性遗传一直存在争议，这可能是由于接种方法的不同而造成的，在温室或生长室由单一菌系接种鉴定时得出的结论为单基因控制，而在田间病圃用多菌系混合鉴定时得出的结论多是多基因遗传（房卫平, 祝水金, 季道藩. 棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展. 棉花学报, 2001, 13 (2) : 116-120）。这就说明棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。RLPs基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种成为可能。棉花黄萎病抗性基因GaVdr1的分离与功能研究为该类基因的深入研究以及进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个能提高棉花黄萎病抗性的新基因GaVdr1，该基因编码一个表面受体蛋白基因。该基因过量表达可以显著提高受体植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因GaVdr1，属于植物基因工程领域，该基因来源于亚洲棉品种南陵小籽棉光子（Gossypium arboretumL.），该品种高抗落叶型黄萎病。GaVdr1是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2） 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE（15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA）、 0.1×SSC（15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠）、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由3214个碱基组成，自5’端第11位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3208位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为3198个碱基，编码蛋白为1065个氨基酸，分子量为119.8KD，等电点为8.15。比较分析发现该蛋白具有9个LRR保守结构域， C端有1个跨膜结构域，具有信号肽。该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性分别为47%和44.9%（图2），将该基因命名为GaVdr1。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明棉花抗病相关基因GaVdr1及其应用，该基因编码一个表面受体蛋白，受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量增加。将GaVdr1与35S启动子构建植物表达载体转化烟草植株，结果该基因过量表达可以显著提高植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。GaVdr1的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果  

1. 本发明获得了一个全新的棉花黄萎病抗性相关基因 GaVdr1 。本发明获得的GaVdr1基因是一个全新的受体蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。通过转基因分析发现此基因的过量表达可以显著提高植物对落叶和非落叶型黄萎病的抗性。对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后24天，抗性作用十分明显，对于V991， 6个转基因株系的平均发病率为24.06%，抗性最好的株系发病率仅为12%，而野生型达到56.67%；对于Bp2，6个转基因株系的发病率为24.44%，抗性最好的株系发病率仅为12%，而野生型达到53.33%。从表型上看，未转化植株接菌后24天，叶片明显萎蔫黄化，植株生长延缓，到最后不能结实。而转基因植株植株可以正常生长，尽管接种24天后转基因植株也出现一定的叶片黄化症状，但是植株可以正常结实。说明GaVdr1基因是一个全新的黄萎病抗病相关基因。

本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。 GaVdr1的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。例如可以利用 GaVdr1分离互作的黄萎病病原菌的致病因子，利用该基因过量表达植株可以进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以GaVdr1的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。

本发明应用于抗病育种。 GaVdr1抗性效果显著，并且同时抗落叶和非落叶型黄萎病，在育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1 GaVdr1的结构预测。LRR为富含亮氨酸重复序列。

图2 GaVdr1, 番茄Ve1和番茄Ve2的氨基酸序列相似性比较。Ve1（登录号：AF272367_1），Ve2（登录号：AF365929_1）。

图3 GaVdr1过量表达载体的构建。

图4 T1代植株的DNA验证。WT为未转化植株；2, 3,8,11,22,23为GaVdr1的转化株。

图5接种24天后GaVdr1转化植株的发病率调查。WT为未转化植株；2, 3,8,11,22,23为GaVdr1的转化株。V991落叶型强致病力菌株，Bp2为非落叶型强致病力菌株。

图6 GaVdr1提高受体植物的黄萎病抗性。分别为用非落叶型和落叶型强致病力菌株Bp2和V991接种未转化株（WT）24天后的表型。以2，3 号转基因株系为例，其他株系结果相似。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于江苏省农业科学院种质资源库亚洲棉品种南陵小籽棉光子（Gossypium arboretumL.）（蒋玉琴，刘桂玲，我国棉花抗枯黄萎病遗传与育种技术，江苏农业科学，1994年第6期），该品种高抗落叶型黄萎病。烟草品种为本氏烟（Nicotiana benthamiana）（Liu T, Ye W, Ru Y, Yang X, Gu B, Tao K, Lu S, Dong S, Zheng X, Shan W, Wang Y, Dou D.  Two host cytoplasmic effectors are required for pathognesis of Phytophthora sojae by suppression of host defenses. Plant Physiology, (IF 6.2), 155: 490-501）。

（一）棉花GaVdr1基因克隆以及序列分析

根据Genbank中一段棉花EST序列（登录号：TC121084）设计引物

P1: 5’- TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3’ 

P2: 5’-CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3’

扩增常抗棉DNA模板，得到约1Kb左右条带，将该片段测序，发现其与原来的EST片段只有76%的相似度。根据该片段设计用于扩增5’和3’未知区域的genomewalking引物。用于扩增5’未知区域的引物为

P3: 5’- AGGTTACCCTTGAATTGGTT -3’

P4: 5’- GGTGAAGTCCACGCAGTGAT -3’

用于扩增3’未知区域的引物为

P5: 5’- CCTCCAGTTTGCTTATTTCT -3’

P6: 5’- CAGGCAATAACTTCAATGGG -3’

根据genomewalking得到的序列与原来1Kb条带进行拼接，用DNA club进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行BLAST分析，数据库ExPASy（http://cn.expasy.org/）进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。分析结果表明该基因的完整编码框为3198bp，编码蛋白含有1065个氨基酸，分子量为119.8KD，等电点为8.15。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测和功能分析，该基因含有9个LRR保守结构域， C端含有1个跨膜结构域（图1），这些结构域的存在说明该基因在蛋白互作及蛋白的细胞定位中起重要作用。同源相似性分析发现该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性分别为为47%和44.9%（图2），将该基因命名为GaVdr1。根据完整的阅读框序列设计扩增基因全长的引物

KpnGaVdr1 P7：5’- CGGGGTACCATGAGGACGTCACTCTTTTC-3’

BamGaVdr1 P8: 5’- CGCGGATCCCTAGAGCCCCCTCCTTTGG-3’

引物末端分别带有限制性内切酶Kpn I和BamH I的识别位点，为构建植物表达载体做准备。用这对引物扩增亚洲棉南陵小籽棉光子的DNA模板，在25                                                

l反应体系中加入DNA模板1 

l，引物各5 nmol，5 

l  5×primeSTAR buffer （Mg²⁺ plus）PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1 U primeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 3'，循环36次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。得到约3.2Kb片段，将该片段进行末端加A处理（北京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-T easy载体（Promega公司）连接，连接产物用JM109（Takara）感受态细胞进行热激转化，测序由上海英俊生物工程公司进行，构建成功的载体命名为pGEM-T easy:GaVdr1。

（二）GaVdr1基因过量表达载体的构建以及植物转化

将（一）中构建好的pGEM-T easy:GaVdr1质粒用KpnI和BamHI双酶切，回收3.2Kb的目的片段。同时用KpnI和BamHI分别酶切植物表达载体PCAMBIA2301（Cambia），回收13Kb的目的片段，将两个片段用T4 ligase连接（Promega公司）并转化JM109感受态，获得的阳性克隆即为含有CaMV 35S启动子(Kay R, Chan A, Daly M, McPherson J. Duplication of CaMV 35S Promoter Sequences Creates a Strong Enhancer for Plant Genes.Science. 1987, 236(4806):1299-302.)和GaVdr1基因片段的重组载体，命名为PCAMBIA2301-35S- GaVdr1（图3），用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/）。用叶盘法侵染转化本氏烟，将浸染好的烟草放在共培养基上，黑暗处培养2d。转换到筛选分化培养基上，每15d继代一次，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中。根系发达后移到土壤培养。移栽后两周在其新叶上进行卡那筛选。PCR方法分别在DNA水平上检测目的基因是否转入，用引物

P9: 5’- TCTTTCCCTACCATCGTCAC-3’

P10: 5’- TTCACCAGCTCCCACTCTAA-3’

以转基因烟草的DNA为模板进行PCR扩增，通过PCR鉴定，共获得6个株含有GaVdr1基因的转化株（图4）。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子T1代播种于含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基，挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于抗病性鉴定。

（五）T1代转化株的抗病性鉴定

对6个转GaVdr1基因表达的株系进行抗病性鉴定。将经含有卡那霉素的MS培养基筛选的绿苗转入营养土中，每盆移栽5-6株幼苗。待烟草生长1个月后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为落叶型和非落叶型强致病力病原菌V991和Bp2（Zhang B, Yang Y, Chen T, Yu W, Liu T, Li H, Fan X, Ren Y, Shen D, Liu L, Dou D, Chang Y.Island cotton Gbve1 gene encoding a receptor-like protein confers resistance to both defoliating and non-defoliating isolates of Verticillium dahliae. PLoS One. 2012, 7(12):e51091）。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25 ℃，180 r ·min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁷。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数需大于24株，接种后每天观察病害的发生情况，在15天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓，24天后统计发病率。对于V991， 6个转基因株系的平均发病率为24.06%，抗性最好的株系发病率仅为12%，而野生型达到56.67%；对于Bp2，6个转基因株系的发病率为24.44%，抗性最好的株系发病率仅为12%，而野生型达到53.33% (图5)。从表型上看，未转化植株接菌后24天，叶片明显萎蔫黄化，植株生长延缓，到最后不能结实。而转基因植株植株可以正常生长，尽管接种24天后转基因植株也出现一定的叶片黄化症状，但是植株可以正常结实（图6）。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  棉花黄萎病抗病相关基因GaVdr1及其应用

 

 

<130>  0

 

 

<160>  11   

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  3214

<212>  DNA

<213>  Gossypium arboretum L.

 

 

<220>

<221>  GaVdr1

<222>  (1)..(3214)

<223> 

 

 

 

<400>  1

attgatacta atgaggacgt cactcttttc attgcttttc ttttactctt ttgtatcggt     60

 

tatgtttact gtcgatgtgc ttttggtttc ggctcaatgt caaagtgatc agagtcggtt    120

 

gttgcttcaa cttgaaagca acttcagcta cgatcatact tcattaggaa agctggtgcc    180

 

ggtgaaatgg aatcaaaaca cagattgctg ttactgggat ggtgtaagtt gcgatgaagg    240

 

tggtcatgtt atcggtcttg acttgaacag cagatcaatt gcaagttcag ttgacgattc    300

 

aagtagtctt ttccgtcttc aacatcttca gtggctcaat ttggcttata acgaattcaa    360

 

gccagctttt cctactgcgt ttgataagct ggagaatttg agtaatctta acttgtccta    420

 

tgctggcttt gaaggacaaa ttccaataga gatatcacgc ttgacaaggt tggtcactct    480

 

tgatttatct gtatcttcac ttcttggaag atcattgaaa cttgagaagc caaacctaga    540

 

tatgcttgtt caaaatctca cgaggctgag atttctctat cttgatggag taaatatatc    600

 

agctacgggg aacgagtggt gcaaggcttt attgccgctg actgagttgc aagaattgag    660

 

catgtcccgc tgttatctat cgggacctat acattcttca ctttccaatc tccgatctct    720

 

ctcggtaatt cgcttggaca ataacaattt gtcggcttca gttccacaat tctttacaga    780

 

atttgaaaat ttgacttccc ttcgtcttag tgccactagg ttgcgtggaa gactgccaga    840

 

agaaattttc cagataccta cattgcaaat tcttgatttg tcaaccaaca aattactcga    900

 

aggttcattt ccaaattttc ctctcaatgc ttctcttcga actctcgcac ttagtggcac    960

 

aaattatggg gggcaagtac cagaatctat tggtaacctt gagcaattga caagaataga   1020

 

gcttgcgact tgcaatttca gtggagccat acccaaaaca atgaagaaac ttacccaact   1080

 

tgtgtatctg gatttttcct ttaaccgttt ttctggtcca ataccatcat tctcatcagc   1140

 

cagaaatctt atatacctaa gccttagtta taatcagtta aatggtggaa ttcattccac   1200

 

tgattggtca agtctttcta agctagaaat tgtttactta ggaaacaaca agttaagtgg   1260

 

aaccattcca ccggctttgt tttgcattcc atcactgcgt ggacttcacc tttatcaaaa   1320

 

ccaattcaag ggtaacctta atgaccttca tggtaaggcc tctttattgc ttgaggacct   1380

 

tgatcttagt agcaacaagt tacaagggca attcccaatg tctgtgtttg aactccatgg   1440

 

tctgaagttg ctatcccttt cttcaaacaa ctacagtggc tcgataccaa tgagtgcctt   1500

 

tcagaacttg aggaatcttt cttaccttga tctctcatat aacaggttgt ctattgatgc   1560

 

cactgatact aatatttcct cactttcttt ccctaccatc gtcacattga agttgacatc   1620

 

ttgcaactta acggagttcc ctgatttctt gaaatatcag tctagattat catatctaga   1680

 

cctttcaaac aaccagattc aagggaaaat accgaattgg atttggaaag tgagaagcct   1740

 

tggataccta aatctttctc aaaacttcct tgtagaattt gatagatctt tgaagaatat   1800

 

aaattctact ctcaatgttt tggacctgca tggcaatcaa ttgcaagggc aaatccaaat   1860

 

tcttccacca tatgccattt atttggatta ctcaaacaac aatttcagct ctgttttacc   1920

 

agctcagctc ctccagtttg cttatttctt ctctgtctca ggcaataact tcaatgggag   1980

 

tattcccaag tcgatatgca gtagcttata tctcaaagta cttgatatgt cttataatta   2040

 

cttgagtggg tcaattccta aatgcctgac tcaaatgagt gcatctcttg gagtactgaa   2100

 

tctaagggga aacaacctca gtggcatcat ttccgacact tttccagaaa gttgtaagtt   2160

 

gcaaactcta gatctcaatc agaaccgatt ggaaggaaag gttccagaat cattggggaa   2220

 

ttgcaaagag ctggaggttg tagacattgg caacaatcag atcagtggca gcttcccatg   2280

 

ccatttggag aatatatcca agttgcgtgt ccttgtttta cgatctaaca aattcaacgg   2340

 

cagtattcat tgtcacaaga acaataccag ctggccaatg cttcaggttg ttgacttagc   2400

 

atgcaataat tttagtggta aactgcatca aacatggttg gcgacctggc agggtatgca   2460

 

ggttgtcgag gatgaagccc aatcaaaggt caaatatatt cagttccaat ttctggaata   2520

 

cggtccaaat cactatcaag atgcaataac agttaccatc aaaggtttag agtgggagct   2580

 

ggtgaagatc ctaaccgtgt tcaccaccat tggcatttct tgtaacaact ttgaagggcc   2640

 

aataccagag gtcattggaa cattcaaaga actttatggt cttaactttt cacataatgc   2700

 

tttcacaggg ccaatgccat catatttagg gaacctgcga cagcttgagt ccttggacct   2760

 

ctcaagtaat tacttaagtg gtgagatccc attgcagctt gtaaacctca atttcctttc   2820

 

atttcttaac gtctcgaaca ataagctagt tggacagatc ccaactggca cccagcttca   2880

 

aacgttttca aaagcttcat ttgagaacaa ccctggattg tatgggcctc ctctaacagt   2940

 

aaagtatgta aatgtatctc gacctaaaaa tgatagccct tcagattctg agacagagag   3000

 

cattatagac tggaatcatt taagtgtcga gatagggttt atctttgggt tgggaattat   3060

 

cattgtacct ctaatctatt ggaagagatg gaggatctgg tatttcgagc gtatccatcg   3120

 

tgctctctcc aggcttttcc ctcgtcttgg tcgtgaaaca aaaaagcacg ggagaagagc   3180

 

taaccggaac caaaggaggg ggctctagca acga                               3214

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  EST引物P1

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  2

ttctggtcca ataccatcat tct                                             23

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  EST引物P2

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  3

cttagattca gtactccaag aga                                             23

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  genomewalking引物5’P3

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  4

aggttaccct tgaattggtt                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  genomewalking引物5'P4

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  5

ggtgaagtcc acgcagtgat                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  genomewalking引物3'P5

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  6

cctccagttt gcttatttct                                                 20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  genomewalking引物3'P6

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  7

caggcaataa cttcaatggg                                                 20

 

 

<210>  8

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GaVdr1 基因全长引物KpnGaVdr1 P7

<222>  (1)..(29)

<223> 

 

 

 

<400>  8

cggggtacca tgaggacgtc actcttttc                                       29

 

 

<210>  9

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GaVdr1 基因全长引物BamGaVdr1 P8

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  9

cgcggatccc tagagccccc tcctttgg                                        28

 

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GaVdr1 PCR鉴定引物P9

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  10

tctttcccta ccatcgtcac                                                 20

 

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  GaVdr1 PCR鉴定引物P10

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  11

ttcaccagct cccactctaa                                                 20

Claims (8)

1.棉花黄萎病抗病相关基因GaVdr1，是下述核苷酸序列之一：

1） 序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

2） 可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的条件为0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

3.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白具有9个LRR保守结构域， C端有1个跨膜结构域，具有信号肽。

4.根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因过量表达明显提高受体植物对棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。

5.含有权利要求1～4之一所述基因的表达载体。

6.含有权利要求1～4之一所述基因的宿主菌。

7.权利要求1～4之一所述基因在植物抗性改良中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

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