CN102851300A - 棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3的克隆及其应用，属于生物技术领域。GbVdr3基因是从抗高抗黄萎病材料海岛棉7124中获得的一个表面受体蛋白基因，该基因编码蛋白含有10个LRR保守结构域和2个LRR1结构域，C端有1个跨膜结构域，N端有1个信号肽和1个LRRNT2结构域。幼苗期GbVdr3基因在叶片中的表达量最高，其次为根和茎；成熟期GbVdr3在花的表达量最高，茎次之，蕾的表达量最低。GbVdr3基因过量表达株的黄萎病抗病性明显增强，在病原菌接种20天后，对于V991平均病指仅为35.6%，而对照达到91.3%，对于Bp2的平均病指为69.5%，而对照达到88.8%。

Description

棉花黄萎病抗病相关基因 GbVdr3 及其应用

一、技术领域

本发明提供了一个棉花黄萎病抗性相关基因GbVdr3及其应用，涉及植物基因克隆以及功能分析，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。

二、背景技术

棉花是重要的经济作物，在我国国民经济中占有重要的地位。棉花黄萎病是严重危害棉花生产的病害之一，在世界范围内传播危害，严重阻碍着棉花产业的稳步发展。由于棉花黄萎病是一种土传维管束病害，所以防治难度很大，到目前为止，尚未有特效的防治药剂，而种植抗病品种成为解决棉花黄萎病的经济有效的途径（崔淑芳, 李俊兰, 金卫平等. 棉花抗黄萎病种质资源的选育与鉴定. 华北农学报, 2006, 21 (增刊):180-182）。但目前我国棉花品种的抗病性只能达到耐病水平，致使该病在环境条件合适的情况下连续流行危害（张志刚, 曾昭云, 贺云新等. 长江流域棉区黄萎病育种的对策与建议. 江西棉花, 2008, 3(2):8-10）。据统计，近年来，棉花黄萎病的发生面积呈加重的趋势，发病面积占棉花总面积的50%，每年损失皮棉7.5×10^４～10×10^４ｔ，直接经济损失16～20亿元（李凤瑞, 史加亮, 杨秀凤. 棉花抗黄萎病研究进展及前景展望. 山东农业科学, 2009, (9):57-59）。

棉花黄萎病抗病种质资源的缺乏，是限制棉花抗病育种的主要因素。虽然我国拥有大量的棉花种质资源，但高抗黄萎病的资源均为不能直接利用的海岛棉和野生棉（马存,简桂良, 孙文姬. 我国棉花黄萎病育种现状、问题及对策. 中国农业科学, 1997, (302):58-64）。并且，棉花黄萎病的发病机理比较复杂导致抗性品种的选育进展缓慢，远远达不到生产上对棉花抗病的需要。

常规育种虽然取得了不少成果，但是抗病品种的选育需要的时间长、投入的资金多，而且培育出的新品种抗性也不是十分明显，有些农艺性状还不如感病品种。

随着植物转基因技术的发展，应用遗传转化的方法不但可以获得生物的定向变异，而且能够打破物种之间的生殖隔离障碍，提高育种的可操作性和目的性，为创造新的种质资源开拓了无限广阔的前景。利用转基因生物技术将抗黄萎病基因性状转移到农艺性状较好的陆地棉中，创造抗性强、产量和品质较高的新品种是现今棉花抗病育种的新热点。

目前，应用外源基因转化来提高棉花黄萎病抗性的多为从其他植物中克隆得到的抗病相关基因。主要有几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、植物防卫素、硫素及葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GO)等外源抗病基因。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶可以阻碍病原菌的侵入，抑制其生长，是植物的主要防卫反应之一。真菌细胞壁的主要组成成分是几丁质和β- 1, 3-葡聚糖，几丁质酶、β-1, 3-葡聚糖酶可降解真菌的细胞壁。所以，转基因植株受到病原菌侵染后会在短时间内大量的产生几丁质酶和β- 1, 3-葡聚糖酶来降解病原菌的细胞壁, 从而使植株具有抗黄萎病的特性。蔡应繁等（2000）利用遗传转化法将几丁质酶基因和β-1, 3-葡聚糖酶基因导入棉花（蔡应繁, 叶鹏盛, 江怀忠等. 抗真菌基因导入棉花创造高抗黄萎病材料研究. 西南农业学报, 2000, 13 (4) : 45-49）。吴家和等（2004）获得了遗传性稳定且抗病性良好的转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因的棉花植株（吴家和,张献龙,罗晓丽等.转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性.遗传学报, 2004, 31( 2) : 183- 188）。GO基因能够编码葡萄糖氧化酶，该酶能催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H₂O₂，而H₂O₂可以作为信号转导物质诱导棉株系统抗性的获得，也可直接抑制病原菌的生长。张宝红等2001）、刘慧君等（2003）、王志兴等（200）分别将GO基因导入棉花,转基因植株对黄萎病的抗性明显提高（张宝红, 姚长兵, 巩万奎等. 棉花葡萄糖氧化酶基因转化棉花和抗性愈伤组织的获得. 棉花学报, 2001, 13( 2 ): 78- 81; 刘慧君, 简桂良, 邹亚飞. GO基因导入对棉花农艺性状及抗病性的影响. 分子植物育种, 2003, 1(5) : 669- 672；王志兴,转基因抗病棉花和抗虫马铃薯株系的培育.中国科学院植物研究所博士后研究工作报告, 2000）。另外，肖月华等（2000）从棉花中分离克隆了多个具有抗病功能的基因并筛选出了抗性优良的棉花种质材料（肖月华, 罗明, 裴炎等. 棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析. 遗传学报, 2000, 29(7):565-570）。窦道龙(2002)利用35S启动子驱动从拟南芥中克隆得到的NDR1 和NPR1 基因在陆地棉中表达，鉴定结果显示转基因植株的抗病性明显增强（窦道龙. 棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆，中国农业科学院博士研究论文, 2002）。多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁降解酶，它在病原物致病过程中十分重要。James等（2001）研究发现PGIPs ( polygalacturonaseinhibitor proteins, 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)能够有效的抑制大丽轮枝菌多聚半乳糖醛酸酶的活性，转PGIPs基因植物能够增强植物的抗病能力（James JT, Dubery IA. Inhibition of polygalacturonase from Verticillium dahliae by a poly-galacturonase inhibiting protein from cotton. Phytochemistry, 2001, 57( 2) : 149-156）。Zhou等（2001）克隆得到了萝卜Rs-AF1基因并进行大丽轮枝菌的体外抑菌实验，结果显示Rs-AF1对大丽轮枝菌的生长有明显的抑制作用（Zhou XJ, Lu S, Xu YH, et al. A cotton cDNA (GaPR-10) encoding a pathogenesis-related 10 protein with in vitro ribonuclease activity. Science, 2002, 162( 4): 629-637）。在许多细胞生理生化过程中植物非共生血色素具有很重要的作用。QU ZL等（2005）从棉花中克隆得到了一个非共生血色素基因GhHb1，研究发现该基因在抗病反应中具有重要的作用（Qu ZL, Wang HY, Xia GX. GhH b1: a nonsymbiotic hemoglobin gene of cotton responsive to infection by Verticilliumdahliae. Biochim Biophys Acta, 2005, 1730( 2) : 103-113）。

Kawchuk等（2001）从番茄抗黄萎病材料中克隆得到了抗黄萎病基因家族的2个成员基因Ve1和Ve2（Kawchuk L, Hachey J, Lynch D, et al. Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98 (11): 6511-6515）。Ve基因是第一个克隆得到的黄萎病抗性基因，将之转化马铃薯后，转基因马铃薯表现为抗黄萎病，但该基因还没有应用于转基因棉花抗病育种中。

Ve基因属于LRR-TM类抗病基因。该类基因编码一种表面受体蛋白(Receptor like proteins, RLPs)，编码蛋白由6个保守的结构域组成。结构域A是N端信号肽，结构域B由N端成熟蛋白和一个亮氨酸拉链LZ基序组成。结构域C由数量不等的LRR重复单元组成，具有LxxLxxLxxLxLxx(N/C/T)x(x)LxGxIPxx保守序列，该结构域参与蛋白质的相互作用和配体识别。跨膜结构域E是由疏水性氨基酸构成的α螺旋，两侧的结构域则是由带负电的胞外结构域D和带正电的胞内结构域F组成，这两个结构域对蛋白质在细胞膜上的定位和锚定起着重要的作用。LRR-TM类抗病基因还包括番茄抗叶霉菌Cf类基因(Dixon, M.S., Hatzixanthis, K., Jones ,D.A., Harrison, K., &Jones, J.D. The tomato Cf-5 disease resistance gene and six homologs show pronounced allelic variation in leucine-rich repeat copy number. Plant Cell,1998, 10, 1915-1925.)，苹果抗黑星病菌(Venturia inaequalis)基因HcrVf2 (Vinatzer,B.A., Patocchi,A., Gianfranceschi,L., et al. Apple contains receptor-like genes homologous to the Cladosporium fulvum resistance gene family of tomato with a cluster of genes cosegregating with Vf apple scab resistance. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2001,14,508-515.)，拟南芥抗霜霉菌(Peronospora parasitica)基因RPP27(M Tör, D Brown, A Cooper, et al. Arabidopsis downy mildew resistance gene RPP27 encodes a receptor-like protein similar to CLAVATA2 and tomato Cf-9. Plant Physiol, 2004, 135, 1100-1112)以及番茄应答非致病绿色木霉菌(Trichoderma viride)激发子的抗病基因LeEix（Ron M, Avni A. The receptor for the fungal elicitor ethylene-inducing xylanase is a member of a resistance-like gene family in tomato. Plant Cell, 2004, 16: 1604-1615）。大量的研究已经证明，该类蛋白在植物抗病过程中起着重要的作用。

棉花黄萎病抗性遗传的研究涉及实验材料、遗传分析模式、病情分级标准、病原菌菌系和抗性鉴定方法等诸多方面，比较复杂。不同学者的研究成果是不同的。分析前人的结果，海岛棉的抗病性对陆地棉的感病性为显性，表现为单基因显性或部分显性控制的质量性状遗传。从陆地棉种内杂交来看，遗传规律比较复杂：在温室或生长室单一菌系接种鉴定的情况下，抗性多为单基因遗传；在田间病圃条件下鉴定，抗性多为微效多基因遗传（房卫平, 祝水金, 季道藩. 棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展. 棉花学报, 2001, 13 (2) : 116-120）。这就说明棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。RLPs基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种成为可能。棉花黄萎病抗性基因GbVdr3的分离与功能研究为该类基因的深入研究以及进一步利用奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的：提供了一个能提高棉花黄萎病抗性的新基因GbVdr3，该基因编码一个表面受体蛋白基因。该基因过量表达可以显著提高受体植物对落叶型黄萎病的抗性，对非落叶型黄萎病抗性也略有提高。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因GbVdr3，属于植物基因工程领域，该基因来源于海岛棉品种H7124，该品种对黄萎病具有较高的抗性。GbVdr3是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2） 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE（15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA）、 0.1×SSC（15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠）、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由3411个碱基组成，自5’端第81位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3207位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为3207个碱基，编码蛋白为1068个氨基酸，分子量为119.85053KD，等电点为8.53。结构域预测发现该基因编码蛋白含有10个LRR保守结构域和2个LRR1结构域， C端有1个跨膜结构域，N端有1个信号肽和1个LRRNT2结构域（图1）。该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性为49%（图2），将该基因命名为GbVdr3。

本发明棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3的应用，该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白具有含有10个LRR保守结构域和2个LRR1结构域，C端有1个跨膜结构域，N端有1个信号肽和1个LRRNT2结构域。该基因过量表达明显提高受体植物对棉花黄萎病强致病力落叶型菌株V991的抗性，对棉花黄萎病强致病力非落叶型菌株Bp2的抗性也有一定的提高。

将GbVdr3与CaMV35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥植株，转基因植株抗病性鉴定结果表明该基因过量表达可以显著提高植物对落叶型黄萎病菌的抗性，对非落叶型黄萎病菌的抗病性也有一定的提高。因此，可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以改良包括单子叶植物和双子叶植物的抗病性状。

GbVdr3的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果

1. 本发明获得了一个全新的棉花黄萎病抗性相关基因 GbVdr3 。本发明获得的GbVdr3基因是一个全新的受体蛋白类基因，BLAST搜索没有与其高度同源的相似基因。通过转基因分析发现此基因的过量表达可以显著提高植物对落叶黄萎病菌的抗性，对非落叶型黄萎病菌的抗性也略有提高。对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后15天，抗性作用十分明显，对于落叶型黄萎病5个转基因株系的平均病指仅为18.4%，而对照达到51.3%；对于非落叶型黄萎病菌5个转基因株系的平均病指为28.1%，而对照达到33.8%。黄萎病接种20天后，对于落叶型黄萎病菌5个转基因株系的平均病指仅为35.6%，而对照达到91.3%；对于非落叶型黄萎病菌5个转基因株系的平均病指为69.5%，而对照达到88.8%。由抗病性鉴定结果可以得出，转基因植株早期抗性效果明显，但是随着病原菌在植株体内的不断繁殖与积累，转基因植株也会表现一定的病症，但是与对照相比，转基因植株的抗性还是较为显著。说明该基因是一个全新的黄萎病抗病相关基因。

2. 本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。 GbVdr3的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作、抗病信号传导通路奠定基础。例如可以利用 GbVdr3分离与之互作的黄萎病病原菌的致病因子，了解植物与病原菌的互作机理，从而明确植物的抗性信号传导通路，所以GbVdr3的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定了基础。

3. 本发明应用于抗病育种。 GbVdr3抗性效果显著，特别是对落叶型黄萎病菌表现为显著抗病，在抗病育种中有较大的应用价值。

四、附图说明

图1 GbVdr3的结构域预测。LRR、LRR1、LRRNT2均为富含亮氨酸重复序列。

图2 GbVdr3、番茄Ve1和番茄Ve2的氨基酸序列相似性比较。Ve1（索取号：AF272367_1），Ve2（索取号：AF365929_1）。

图3 Gbvdr3基因在棉花不同器官中的表达量分析

图4 GbVdr3过量表达载体的构建。

图5接种15天后GbVdr3转基因株系的病指调查。WT为野生型植株；D4-1—D4-5为GbVdr3的转基因株系。

图6 接种20天后GbVdr3转基因株系病指调查。WT为野生型植株；D4-1—D4-5为GbVdr3的转基因株系。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英骏生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于海岛棉（Gossypium barbadense）品种H7124（马 存, 简桂良, 孙文姬. 我国棉花抗黄萎病育种现状、问题及对策. 中国农业科学, 1997, 30(2): 58-64），该品种高抗黄萎病。拟南芥品种为哥伦比亚型（Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, Benito MI, Town CD, Fujii CY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M, Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA, Lee J, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, Van Aken S, Umayam L, Tallon LJ, Gill JE, Adams MD, Carrera AJ, Creasy TH, Goodman HM, Somerville CR, Copenhaver GP, Preuss D, Nierman WC, White O, Eisen JA, Salzberg SL, Fraser CM, Venter JC. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature, 1999, 16, 402(6763):761-768）。

（一）棉花 GbVdr3 基因克隆以及序列分析

根据Gene Index中一段棉花EST序列（登录号：TC121084）设计引物5’- TTCTGGTCCAATACCATCATTCT-3’，5’-CTTAGATTCAGTACTCCAAGAGA-3’扩增陆地棉DNA模板，得到约1Kb左右条带，将该片段测序，发现其与原来的EST片段只有76%的相似度，该片段编码1个全新的棉花表面受体蛋白基因，根据该片段设计引物通过染色体步移进一步得到了该基因的全长序列，将该基因命名为GhVdr2（专利：棉花黄萎病抗病相关基因GhVdr2及其应用，申请号：201110066390.9）。由于这类表面受体蛋白基因在基因组中有很多相似序列，为了得到更多的这类基因，根据GhVdr2设计引物GhVdr2-F595：5’- CTTGATGGGGTGAATATTAGAGCA-3’，GhVdr2-R1021：5’-ATTGCCCAAGGTTACCGATAGAAT-3’扩增陆地棉DNA模板。用得到的约400bp片段作为探针筛选棉花BAC（细菌人工染色体组）文库（构建文库所用棉花品种为maxxa，文库来源于Clemson University），共得到40个BAC阳性克隆。对阳性克隆D4进行序列分析发现，它含有1个具有完整阅读框的表面受体蛋白基因，该基因编码的氨基酸序列与GhVdr2具有82%的相似性。为了进一步得到H7124中该基因的序列，设计扩增基因全长的引物F389- BamH1: 5’- cttggatcccctcaacctagtgccattgttat-3’, R3781-Kpn1: 5’- ctaaggtaccagggtaatacaaggtggaaacag-3’。引物末端分别带有限制性内切酶BamhⅠ和kpnⅠ的识别位点，为构建植物表达载体做准备。用这对引物扩增H7124的DNA模板，在

反应体系中加入DNA模板1 l，引物各5 nmol，5 l 5×primeSTAR buffer （Mg²⁺ plus）PCR缓冲液，0.2 mM dNTP，1 U primeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 3'后94℃ 45''，56℃ 45''，72℃ 3'，循环36次，再72℃延伸10'。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测。得到约3.5Kb片段，将该片段进行末端加A处理（北京天恩泽基因科技有限公司）并与pGEM-T easy载体（Promega公司）连接。连接产物用DH5a（北京全式金生物技术有限公司）感受态细胞进行热激转化。测序由上海英骏生物工程公司进行。用DNA club进行基因开放阅读框的确定，用DNAMAN进行序列比较分析，同时利用网上数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行BLAST分析。数据库ExPASy（http://cn.expasy.org/）进行蛋白等电点以及分子量的相关分析。分析结果表明扩增得到的片段长度为由3411个碱基组成，自5’端第81位碱基为转录起始位点, 记为+1；第3207位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为3207个碱基，编码蛋白为1068个氨基酸，分子量为119.85053KD，等电点为8.53。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白结构预测和功能分析，发现该基因编码蛋白含有10个LRR保守结构域和2个LRR1结构域， C端有1个跨膜结构域，N端有1个信号肽和1个LRRNT2结构域（图1）。该基因编码蛋白与番茄Ve1和Ve2的相似性为49%（图2），将该基因命名为GbVdr3。

（二）棉花 GbVdr3 在不同器官中的表达量分析

幼苗期，在海岛棉品种H7124材料同一棉花植株上，采集植株的根、茎及叶片；成熟苗，在海岛棉品种H7124材料同一棉花植株上，采集植株的茎、花及蕾，用CTAB法提取总RNA（骆萍，王国栋，陈晓亚. 亚洲棉C4H同源cDNA 的分离和表达特征分析. 植物学报, 2001, 43(1): 77-81）。用RQ1 DNnase（Promega公司）处理棉花各器官的总RNA，参照CLONTECH公司的“SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit”的说明书中3’RACE模板制备方法来制备RT-PCR模板。反转录引物为（5’-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30N-1N 3’）。用于荧光定量定量PCR的基因特异引物为GbVdr3F:5’- TCAGGATTAAGTAGGGAAGGAGTT -3’, GbVdr3R：5’- GTAATACAAGGTGGAAACAGAAGC-3’。根据棉花持家基因组蛋白设计的引物HF：5’- CAACGCTCCATCTTGTCCTT- 3’和HR：5’- TGATCGTCTTTCCCGTAAGC-3’作为内参。采用SYBR Green I 荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa公司）进行荧光定量PCR分析GbVdr3的表达量。重复3次。PCR反应在定量PCR仪器（Crobett Rotor-Gene 6000）上进行，用2^{－△△ CT}方法计算基因在不同器官的的表达量。对GbVdr3在幼苗期叶、根和茎表达分析发现，在该时期叶片中的表达量最高，其次为根和茎；在成熟期茎、花及蕾中的表达分析发现，GbVdr3在花的表达量最高，茎次之，蕾的表达量最低（图3）。

（四） GbVdr3 基因过量表达载体的构建以及植物转化

通过测序证明了GbVdr3基因插入pGEM-T easy克隆载体（Promega公司），并且有3207个碱基的完整编码框。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切含有GbVdr3基因的阳性克隆质粒，回收3.2Kb左右的目的片段。同时用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切植物双元表达载体PCAMBIA2301（中国质粒载体菌株基因库对外提供，http://biovector.blog.163.com/），回收13Kb的目的片段，将两个片段用T4 DNA ligase（Promega公司）于16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，获得的阳性克隆即为含有CaMV 35S启动子驱动GbVdr3基因片段的重组载体，命名为PCAMBIA2301-35S- GbVdr3（图4），用冻融法将重组载体转化农杆菌菌株LBA4404（中国质粒载体菌株基因库，http://biovector.blog.163.com/）。用花浸染方法（Clough S J, Bent A F. Floral dip: A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, 16:735-743）转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入植物基因组以及是否正常转录。通过PCR鉴定，共获得6株含有GbVdr3基因的转化株，其中5株目的基因可以表达。收获转基因工程植株种子。将转基因工程植株种子播种于含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中，用于抗病性鉴定。

（五） T1 代转化株的抗病性鉴定

对获得的5个转GbVdr3基因株系进行抗病性鉴定。将经含有25 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基筛选获得的生长正常的苗转入营养土中，每盆移栽3-4株幼苗。待拟南芥生长1个月后进行抗病性鉴定。所用菌株分别为落叶型强致病力黄萎病菌V991和非落叶型强致病力黄萎病菌Bp2。病原菌经PDA平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25 ℃，180 r min 培养5-6 d ，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。接种方法为苗期孢子悬浮液灌根法，每盆接种孢子数为1 ×10⁷。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数需大于24株，接种后每天观察病害的发生情况，在14天后就可以明显看见发病症状，主要表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。病指按照以下标准进行鉴定，0 级：无病植株；1 级：0. 1 %～25 %叶片发病的植株；2 级：25 %～50 %叶片发病的植株；3 级：50 %～75 %叶片发病的植株；4 级：75 %以上叶片发病的植株。病情指数=（各病级病株数×相应病级）/ (调查总棉株数×4) × 100%。对转基因植物的抗病性鉴定结果显示，病原菌接种15天后，对于落叶型黄萎病菌，5个转基因株系的平均病指仅为18.4%，而对照达到51.3%；对于非落叶型黄萎病菌，5个转基因株系的平均病指仅为28.1%，而对照达到33.8%（图5）。接种黄萎病20天后，对于落叶型黄萎病菌，5个转基因株系的平均病指仅为35.6%，而对照达到91.3%；对于非落叶型黄萎病菌，5个转基因株系的平均病指为69.5%，而对照达到88.8%（图6）。从植株的整个生长期来看，Gbvdr3基因对落叶型黄萎病菌V991的抗性较好，对非落叶型黄萎病菌BP2的抗性不明显。

基因GbVdr3序列：ATGAGGATGTCACTCTTTTCATTGCTTTTCTTGAATTCTTTTGTATCGGTTATGCTTATTGTCAATGTGGTCTTCGTTTCGGCTCAATGTCAAAGTGATCAGAGACAGTTGTTGCTTCAGCTTGAAAGCAGCTTCAGCTACAATCAAACTTCATCAGGAAAGCTGGTGCCAGTGAAATGGAATCAAAGCACAGATTGTTGTTCCTGGGATGGTGTAAGTTGCGATGGAGGTGGTCATGTTATCGGTCTTGACTTGAACAGCAGATCAATTTCAAGTTCAATTGACGATTCAAGTAGTCTTTTCCTTCTTCAACGTCTTCAGTGGCTCAATTTGGCTTATAACGAATTCAAGCTAGCTTTTCCTACTGCGTTTGATAAGCTGGAGAATTTGAGTTATCTTAACTTGTCCTATGCTGGCTTTGAAGGACAAATTCCAATAGAGATATCACGCTTGACAAGGTTGGTCACTCTTGATTTATCTGTATCTTCACTTCTTGGAAGATCATTGAAACTTGAGAAGCCAAACCTAGAGATGCTTGTTCAAAATCTCACGAGGCTGAGATTTCTCTATCTTGATGGAGTAAATATATCAGCTACGGTGAACGAGTGGTGCAAGGCTTTATTGCCGCTGACTGAGTTGCAAGAATTGAGCATGTCCCGTTGTTATCTATCGGGACCTATACATTCTTCACTTTCCAATCTCCGATCTCTCTCGGTAATTCGCTTGGACAATAACAATTTGTCAGCTTCAGTTCCACAATTCTTTACAGAATTTGAAAATTTGACTTCCCTTCGTCTTAGTGCCACTGGGTTGCGTGGAAGACTCCCAGAAGAAATTTTCCAGATACCTACATTGCAAATTCTTGATTTGTCAACCAACAAATTACTCGAAGGTTCATTTCCAAATTTTCCTCTCAATGCTTCTCTTCGAACTCTCGCACTTAGTGGCACAAATTATGGGGGGCAAGTACCAGAATCTATTGGTAACCTTGAGCAATTGACAAGAATAGAGCTTGGGAGTTGCAATTTCAGTGGAGCCATACCCAAAACAATGAAGAAACTTACCCAACTTGTGTATCTGGATTTTTCCTTTAACCGGTTTTCTGGTCCTATACCATCATTCTCATCAGCCAGAAATCTTATATACCTAAGCCTTGGTTATAATCAGTTAAATGGTGCAATTCATTCCACTGATTGGTCAAGTCTTTCTAAGCTAGAAATTGTTGGCTTAGGAAACAACAAGTTACGTGGAACCATTCCACCGGCTTTGTTTTGCATTCCATCACTGCAAAGACTTTTCCTTTCTCAAAACCAATTCAAGGGTAACCTTAGTGACCTTCATGGTAGGGCCTCTTCATTGCTTTACGACCTTGATCTTAGTAGCAACAAGTTACAGGGGCAATTCCCAATGTCTTTGTTTGAACTCCGTGGTCTGAAGTTCCTATCACTTTCTTCAAACAACTTCAGTGGTTTGATTCCGATGAGAGCCCTTCAGAACCTGAGAAATCTTTCCTTTCTTGATCTCTCATATAACAGGTTGTCTATTGATGCTACTGATACTAATATTTCCTCACTTTCTTTCCCTAACATCAGCACATTGAAGTTGACATCTTGCAACTTAACGGAGTTCCCTGATTTCTTGAAATATCAGTCTAGATTATCGTATCTAGACCTTTCAAACAACCAGATTCAAGGGAGAATACCGAATTGGATTTGGAAAGTGAGAAGCCTTAATTACCTAAATCTTTCTCAAAACTTCCTTGTAGAATTTGAAAGATCTTTGGAGAATATAGATTCTAGTCTCAGCGTTTTGGACCTGCATGGCAATCAATTGCAAGGGCAAATCCAAATTCTTCCACCATGTGCCACTTATTTGGATTACTCAAACAACAAATTCAGTTCTGTTTTACCAGCTGAAATTGGTGACTTCCTCCAGTTTGCTTATTTCTTCTCTGTCTCAGGCAATAACTTCAATGGGAGTATTCCCAAGTCGATATGCAGTAGCTTATATCTCAGAGTACTTGATATGTCTGATAATTACTTGAGTGGGCCAATTCCTCAATGCCTAACTCAAATGAGTGCATCTCTTGGAGTACTGAATCTAAGGCAAAACAATCTCAGCGGCATAATTTCTGACACTTTTACAAAAAGCTGTAGTTTACAAACTCTAGATCTCAACCGAAACCAGGTGGAGGGAAAGGTTCCACAATCACTGGGGAATTGCAAAATTCTGGAGGTTTTAGACATTGGCAACAATCAGATCAGTGGCAGCTTCCCATGCCATTTGGAGAATATATCCAAGTTGCGTGTACTTGTTTTACGATCTAACAAATTCAACGGCAGTATTCATTGTCCCAAGAACAATACCGGATGGCCAATGCTTCAGATTTTTGACTTAGCATGCAATAATTTTAGTGGTAAACTGCACCAAACATGGTTGGCGACCTGGAAGGGTATGCAGGTTGTCGACGATGAAGCCCAATCAAAGGTCAAAGATATTCAGTTTCAATTTCTGGAAATCAATCCATATCGCTATCAAGATGCAATAACAGTTACCATCAAAGGTTTAGAGCGGGAGCTGGTGAAGATCCTAACCGTGTTCACCACCATTGACATTTCTTGTAACAATTTTGAAGGGCCAATACCAGAGGTCATTGGAACATTCAAAGAACTTTATGGCCTTAACTTTTCACATAATGCTTTCACAGGGCCAATGCCATCATTTTTAGGGAACCTGCGACAGCTTGAGTCCTTGGACCTCTCAAGTAATTACTTGAGTGGTGAGATCCCATTGCAGCTGGTAAACCTCAATTTCCTTTCATTTCTTAACGTCTCGAACAATAAGCTAGTTGGACAGATCCCAACTGGCACCCAGCTTCAATCGTTTTCAAAAGCTTCATTTGAGAACAACCCTGGATTGTACGGGCCTCCTCTAACTGTAAAGTGTGTAAATGCATCTCGACCAAAAAATGATAGCCCTTCAGATTCTGAGACAGGGAGTATTATAGAGTGGAATCTTTTAAGTGTCGAGATAGGGTTGATCTTTGGGTTGGGAATTATCATTGTACCTCTTATCTATTGGAAGAGATGGAGGATCTGGTATTTCGAGCGTATACATCGTGCTCTCTCCAGGTTTTTCCCTAGTCTTAGTCGTGAAACAAAAAAGCATGGGAGAAGAGCTAACCGGAACGAAAGGAGGAGGCTCTAG。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3及其应用

<130> 说明书

<140> 00

<141> 2011-02-11

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 3207

<212> DNA

<213> Gossypium Barbadense（海岛棉）

<220>

<221> 基因GbVdr3

<222> (1)..(3207)

<223>

<400> 1

atgaggatgt cactcttttc attgcttttc ttgaattctt ttgtatcggt tatgcttatt 60

gtcaatgtgg tcttcgtttc ggctcaatgt caaagtgatc agagacagtt gttgcttcag 120

cttgaaagca gcttcagcta caatcaaact tcatcaggaa agctggtgcc agtgaaatgg 180

aatcaaagca cagattgttg ttcctgggat ggtgtaagtt gcgatggagg tggtcatgtt 240

atcggtcttg acttgaacag cagatcaatt tcaagttcaa ttgacgattc aagtagtctt 300

ttccttcttc aacgtcttca gtggctcaat ttggcttata acgaattcaa gctagctttt 360

cctactgcgt ttgataagct ggagaatttg agttatctta acttgtccta tgctggcttt 420

gaaggacaaa ttccaataga gatatcacgc ttgacaaggt tggtcactct tgatttatct 480

gtatcttcac ttcttggaag atcattgaaa cttgagaagc caaacctaga gatgcttgtt 540

caaaatctca cgaggctgag atttctctat cttgatggag taaatatatc agctacggtg 600

aacgagtggt gcaaggcttt attgccgctg actgagttgc aagaattgag catgtcccgt 660

tgttatctat cgggacctat acattcttca ctttccaatc tccgatctct ctcggtaatt 720

cgcttggaca ataacaattt gtcagcttca gttccacaat tctttacaga atttgaaaat 780

ttgacttccc ttcgtcttag tgccactggg ttgcgtggaa gactcccaga agaaattttc 840

cagataccta cattgcaaat tcttgatttg tcaaccaaca aattactcga aggttcattt 900

ccaaattttc ctctcaatgc ttctcttcga actctcgcac ttagtggcac aaattatggg 960

gggcaagtac cagaatctat tggtaacctt gagcaattga caagaataga gcttgggagt 1020

tgcaatttca gtggagccat acccaaaaca atgaagaaac ttacccaact tgtgtatctg 1080

gatttttcct ttaaccggtt ttctggtcct ataccatcat tctcatcagc cagaaatctt 1140

atatacctaa gccttggtta taatcagtta aatggtgcaa ttcattccac tgattggtca 1200

agtctttcta agctagaaat tgttggctta ggaaacaaca agttacgtgg aaccattcca 1260

ccggctttgt tttgcattcc atcactgcaa agacttttcc tttctcaaaa ccaattcaag 1320

ggtaacctta gtgaccttca tggtagggcc tcttcattgc tttacgacct tgatcttagt 1380

agcaacaagt tacaggggca attcccaatg tctttgtttg aactccgtgg tctgaagttc 1440

ctatcacttt cttcaaacaa cttcagtggt ttgattccga tgagagccct tcagaacctg 1500

agaaatcttt cctttcttga tctctcatat aacaggttgt ctattgatgc tactgatact 1560

aatatttcct cactttcttt ccctaacatc agcacattga agttgacatc ttgcaactta 1620

acggagttcc ctgatttctt gaaatatcag tctagattat cgtatctaga cctttcaaac 1680

aaccagattc aagggagaat accgaattgg atttggaaag tgagaagcct taattaccta 1740

aatctttctc aaaacttcct tgtagaattt gaaagatctt tggagaatat agattctagt 1800

ctcagcgttt tggacctgca tggcaatcaa ttgcaagggc aaatccaaat tcttccacca 1860

tgtgccactt atttggatta ctcaaacaac aaattcagtt ctgttttacc agctgaaatt 1920

ggtgacttcc tccagtttgc ttatttcttc tctgtctcag gcaataactt caatgggagt 1980

attcccaagt cgatatgcag tagcttatat ctcagagtac ttgatatgtc tgataattac 2040

ttgagtgggc caattcctca atgcctaact caaatgagtg catctcttgg agtactgaat 2100

ctaaggcaaa acaatctcag cggcataatt tctgacactt ttacaaaaag ctgtagttta 2160

caaactctag atctcaaccg aaaccaggtg gagggaaagg ttccacaatc actggggaat 2220

tgcaaaattc tggaggtttt agacattggc aacaatcaga tcagtggcag cttcccatgc 2280

catttggaga atatatccaa gttgcgtgta cttgttttac gatctaacaa attcaacggc 2340

agtattcatt gtcccaagaa caataccgga tggccaatgc ttcagatttt tgacttagca 2400

tgcaataatt ttagtggtaa actgcaccaa acatggttgg cgacctggaa gggtatgcag 2460

gttgtcgacg atgaagccca atcaaaggtc aaagatattc agtttcaatt tctggaaatc 2520

aatccatatc gctatcaaga tgcaataaca gttaccatca aaggtttaga gcgggagctg 2580

gtgaagatcc taaccgtgtt caccaccatt gacatttctt gtaacaattt tgaagggcca 2640

ataccagagg tcattggaac attcaaagaa ctttatggcc ttaacttttc acataatgct 2700

ttcacagggc caatgccatc atttttaggg aacctgcgac agcttgagtc cttggacctc 2760

tcaagtaatt acttgagtgg tgagatccca ttgcagctgg taaacctcaa tttcctttca 2820

tttcttaacg tctcgaacaa taagctagtt ggacagatcc caactggcac ccagcttcaa 2880

tcgttttcaa aagcttcatt tgagaacaac cctggattgt acgggcctcc tctaactgta 2940

aagtgtgtaa atgcatctcg accaaaaaat gatagccctt cagattctga gacagggagt 3000

attatagagt ggaatctttt aagtgtcgag atagggttga tctttgggtt gggaattatc 3060

attgtacctc ttatctattg gaagagatgg aggatctggt atttcgagcg tatacatcgt 3120

gctctctcca ggtttttccc tagtcttagt cgtgaaacaa aaaagcatgg gagaagagct 3180

aaccggaacg aaaggaggag gctctag 3207

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> GbVdr3F

<222> (1)..(24)

<223>

<400> 2

tcaggattaa gtagggaagg agtt 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> GbVdr3R

<222> (1)..(24)

<223>

<400> 3

gtaatacaag gtggaaacag aagc 24

Claims (8)

1.棉花黄萎病抗病相关基因GbVdr3及其应用，是下述核苷酸序列之一：

1） 序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

2） 可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的条件为0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

3. 根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因编码一个表面受体蛋白，该蛋白含有10个LRR保守结构域和2个LRR1结构域， C端有1个跨膜结构域，N端有1个信号肽和1个LRRNT2结构域。

4. 根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于，该基因过量表达明显提高受体植物对棉花黄萎病强致病力菌株V991的抗性。

5. 含有权利要求1～4之一所述基因的表达载体。

6. 含有权利要求1～4之一所述基因的宿主菌。

7. 权利要求1～4之一所述基因在植物抗性改良中的应用。

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

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