CN102676540B - 抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY47及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY47及其应用。该基因编码序列表SEQ IDNo：3所示氨基酸序列的蛋白质，其基因组DNA序列和cDNA序列分别如序列表中SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。OsWRKY47基因具有提高植物抗稻瘟病性的功能，利用该基因转化水稻，获得抗病植物品系，使水稻对稻瘟病菌的抗性增强。

Description

抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY47及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗稻瘟病菌的水稻基因及该基因的用途。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是全球重要的粮食作物，稻瘟病是危害最严重的水稻病害，长年均有不同程度的发生，能导致水稻减产10-30％，如何防治稻瘟病就成了关系各国尤其是水稻主产国粮食安全的重大问题。选用抗病品种是防治稻瘟病的重要手段：通过传统的遗传育种，国内外获得了一些具有较好稻瘟病抗性的水稻品种，然而传统育种周期太长且效率低下，并且由于抗病品种的单一化和稻瘟病菌生理小种遗传的复杂性、致病的多样性，往往造成抗病品种在推广种植三到五年后抗性消失，引起稻瘟病暴发和流行，不能有效的防止稻瘟病。化学防治是防止稻瘟病的另一种方法，但该方法既昂贵又缺乏长期有效的杀菌剂，而且污染环境。通过分子生物学方法研究水稻的稻瘟病抗性并进行分子育种有望克服传统防治方法的种种弊端。

水稻-稻瘟病菌相互作用的研究作为研究植物-真菌病理分子机制的模型，近十年来受到植物学家的广泛关注。在水稻-稻瘟病菌的相互作用中，研究比较多的有两类基因：一是识别病原菌的抗性基因，二是与防卫反应相关的基因，这两类基因在水稻的防卫反应中发挥着重要的功能。其中抗性基因的作用是介导植物对稻瘟病菌无毒基因产物的识别，并引起的水稻对稻瘟病菌的特异性的抗性。它们的相互作用模式遵循基因对基因假说，植物与病原微生物的相互作用取决于寄主的抗性基因与病原菌的无毒基因，只有当它们同时存在时植物才表现出抗性。当抗性基因产物与无毒基因产物相互识别后，首先在病菌侵入部位的植物细胞及邻近的细胞中会迅速诱导形成超敏反应，同时诱导水稻的其它防卫反应，如活性氧的释放、植物细胞壁的加固、植保素、植物防御素、几丁质酶、蛋白酶抑制剂的合成以及其他病程相关蛋白和防卫相关蛋白的诱导合成，以求最快的控制或杀死侵入的病菌。植物超敏反应的启动及其引起的防卫信号的传导，最终使寄主的其它组织对随后的病原菌产生广谱抗性，即系统获得性抗性。

除了以上两类基因外，还有一些参与水稻信号途径的基因也参与水稻对稻瘟病菌的防卫反应。2006年Reyna等人对水稻中的17个MAPK进行了研究，发现其中有9个基因可以被稻瘟病菌诱导表达，说明这些MAPK可能在水稻的防卫反应的信号传导中具有一定功能(Molecular Plant-Microbe Interactions，2006，vol.19：530-540)。2009年，Li等人研究了OsWAK1基因的功能，该基因可以被伤害、SA、MeJA还有稻瘟病菌诱导表达，在水稻中组成型表达OsWAK1可以使转基因植株对稻瘟病菌致病小种产生抗性，说明该基因在水稻防卫反应中具有重要作用(Plant Molecular Biology，2009，vol.69：337-346)。此外，在水稻中过表达OsWRKY31或OsWRKY53基因，都会增强植物对稻瘟病菌的抗性(Cell Research，2008，vol.18：508-521；Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression，2007，vol.1769：497-505)。这些基因编码参与水稻防卫反应信号通路的调控，初步的研究发现它们在水稻抗病过程中具有重要功能，它们的具体功能以及作用机制还需要进一步的研究。

通过各种方法找到的参与水稻防卫反应的基因都具有潜在的生产应用价值，而借助成熟的水稻转基因技术可以快速的得到大量转基因株系。20世纪80年代以来，随着生物工程技术的兴起与完善，特别是基因工程技术在作物改良方面的广泛应用，为培育抗病品种提供了新的手段。植物抗病转基因成为生物技术人员的研究热点，高效稳定的水稻转化系统的建立为外源基因转化水稻创造了条件。具体说来，水稻抗病的基因工程主要从抗性(R)基因和防卫基因两个方面进行。

Mackil等人培育出了一套以CO39作为遗传背景的带有Pi-1、Pi-2、Pi-3、Pi-4a和Pi-4b稻瘟病抗性基因的近等基因系(Phytopathology，1994，vol.84：1278-1283)，实验者用这套近等基因系进行接种实验，发现携Pi-3的近等基因系C104PKT抗病时间长、病斑数少并且与其他基因组合的累加系也对稻瘟病有很高的抗性。进而利用C104PKT与带有Pi-1、2的近等基因系A57-119杂交培育出BL13(携带Pi-1、3)、BL-23(携带Pi-2、3)和BL-123(携带Pi-1、2、3)的近等基因系，目前已引种到美国、越南、菲律宾、印尼、日本等国，经3到5年的种植均表现出很高的抗性。而Nishizawa等人将水稻的几丁质酶基因Cht-2、Cht-3分别转入粳稻Nippobare和Koshihikari，发现转基因植株中Cht-2在细胞内积累，而Cht-3在细胞外积累。Cht-2或Cht-3转基因植株的R0及R1代对稻瘟菌致病小种的抗性提高，而且抗性与几丁质酶的表达量具有相关性(Theoretical and Applied Genetics，1999，vol.99：383-390)。Lin等人和Datta等人将水稻中的I类几丁质酶基因Chi11转入籼稻，转基因植株对纹枯病表现出一定抗性，而且几丁质酶的含量和活性与抗性呈正相关(Biotechnology，1995，vol.13：686-691)。Feng等人将水稻几丁质酶基因RC24和苜蓿β-1，3-葡聚糖酶基因同时转入水稻，部分R1代植株对广东省稻瘟菌5个代表小种表现出不同程度的抗性增强(ActaBotanica Sinica，1999，vol.41：1187-1191)。

现有的研究证明，利用转基因技术进行分子育种有望找到具有实际生产应用价值的转基因水稻品种。但是现有的转基因成果还极少有投入到生产应用中，而且现在参与水稻抗稻瘟病的关键基因还有待发现，如何发现这些基因并且大规模的转化水稻进行鉴定还有待深入研究。本发明发现一个基因，其在感病水稻品种中过量表达后，增强了水稻对稻瘟病菌的抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗稻瘟病的基因及其编码蛋白，用于提高水稻等植物的抗病性能。

本发明所提供的抗稻瘟病基因，名称为OsWRKY47，来源于水稻(Oryza sativa)，编码具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID No：3；

2)序列表中的SEQ ID No：3氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，并且所衍生的蛋白质具有抗稻瘟病的功能。

序列表中的SEQ ID No：3序列由333个氨基酸残基组成，其中从122位至183位为保守的WRKY结构域。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白。通过在植物中表达所述蛋白，并测试这些植物的稻瘟病抗性，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有抗稻瘟病菌的功能。

本发明的抗稻瘟病基因OsWRKY47可以是所述基因的cDNA序列，也可以是所述基因的基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO：1所示的基因组DNA序列和SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。

本发明还提供了包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。在一个较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种提高植物对稻瘟病菌的抗性的方法，包括：将所述抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到对稻瘟病菌抗性提高的转基因植物。

在上述提高植物抗稻瘟病性的方法中，抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。与所述基因具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA序列或基因组DNA序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，还可为可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子来驱动其表达。所述组成性表达启动子例如水稻actin1启动子、花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子和玉米Ubiquitin 1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素磷酸转移酶基因、羧苄青霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

携带有本发明抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明抗稻瘟病的水稻基因OsWRKY47或其同源序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的抗病性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

在一个较佳的实施方案中，所述植物为水稻。在使本发明的OsWRKY47基因在水稻中过量表达，并接种水稻最主要的真菌病害——稻瘟病菌的检测后，本发明者发现OsWRKY47基因具有提高抗稻瘟病性的功能。过量表达的OsWRKY47基因cDNA的转基因水稻表现出对稻瘟病的抗性增强。因此，本发明涉及的OsWRKY47基因在植物抗病性基因工程中有广泛的应用价值。

附图说明

图1显示了实施例3中通过实时定量PCR检测OsWRKY47基因在部分转基因水稻植株中的表达情况。

图2显示了实施例3中OsWRKY47转基因水稻幼苗对稻瘟病菌的抗性鉴定和分子鉴定代表结果，其中A为TP309(未转基因的台北309水稻)、OsWRKY47转基因水稻1号株系和16号株系幼苗叶片接种稻瘟病菌96-4-1A小种后7天的表型；B为OsWRKY47基因在TP309和转基因水稻1号、16号株系幼苗中的表达情况；C为抗病标志性基因PR1a在TP309和转基因水稻1号、16号株系幼苗中的表达情况。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

实施例1、基因的克隆

(一)OsWRKY47基因cDNA序列的克隆：

OsWRKY47基因的基因组DNA序列(SEQ ID No：1)、cDNA序列(SEQ ID No：2)和氨基酸序列(SEQ ID No：3)从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

根据OsWRKY47基因的cDNA序列设计基因特异的PCR引物：

F1：5’-ATG GCG TCT CCT GAT GGT GG-3’(SEQ ID No：4)；

R1：5’-TTAAGGATC GAAGCCAAACA-3’(SEQ IDNo：5)。

用这对引物从水稻粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)近等基因系品种IRBL22(由国际水稻所培育)的cDNA中克隆OsWRKY47基因的cDNA序列。由于OsWRKY47基因的cDNA序列中部分区域GC含量高达80％以上，用普通高保真酶克隆不到，在多次实验后，本发明者利用GC缓冲液I(Takara)与Pfu高保真酶扩增得到OsWRKY47基因的全长cDNA序列。PCR产物用T4连接酶连入pBluescript载体，筛选带有正向插入片段(基因的ATG靠近T7测序引物)载体并测序，测序正确的质粒命名为pBS-OsWRKY47用于构建OsWRKY47基因的植物表达载体。

(二)OsWRKY47基因植物表达载体的构建：

为了构建OsWRKY47基因的植物表达载体，本发明者改造了植物表达载体pWM101用于水稻转化。具体的，将pWM101用HindIII/KpnI做酶切并回收酶切质粒，将玉米Ubiquitin1启动子序列克隆连入pBS载体，得到的pBS-pUbi载体的质粒DNA用HindIII/SpeI酶切，回收带有启动子序列的DNA片断。再将OsWRKY47基因的cDNA序列从pBS-OsWRKY47载体SpeI/KpnI切下。以上三个核酸片段回收纯化后，用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用基因特异引物F1和R1进行PCR筛选，从筛选得到的阳性克隆中提取带有OsWRKY47基因序列的pWM101载体质粒，用BamHI酶切验证正确后用于水稻的愈伤转化。

实施例2、组成型表达OsWRKY47基因的转基因水稻的获得

(一)水稻愈伤诱导：

选取饱满的台北309水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在带有2毫克/升2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的灭菌NB固体培养基，32℃持续光照5天诱导愈伤形成。

(二)农杆菌转化：

将带有OsWRKY47基因cDNA片段的pWM101载体用电激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布带有50微克/升卡那霉素的固体LB培养基，28℃黑暗培养2天后，用基因特异引物F1和R1筛选阳性克隆。得到的阳性克隆在含有50毫克/升卡那霉素的固体AB培养基28℃黑暗培养3天，用于水稻转化。

(三)水稻愈伤转化：

用过滤灭菌的含有100微摩尔/升乙酰丁香酮的液体转化培养基从AB培养基上将农杆菌洗下，菌液浓度调至OD600在0.08左右。选取生长状况良好的愈伤组织，在菌液中浸泡2分钟，之后在无菌滤纸上晾干，再将愈伤组织移至含有100微摩尔/升乙酰丁香酮的NB共培养培养基，25℃黑暗下共培养3天。

(四)筛选水稻愈伤：

共培养3天后，用无菌水洗涤愈伤5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧苄青霉素钠的无菌水洗一遍，小心倒去液体，用无菌镊子将愈伤组织夹取至无菌滤纸上，晾干后转移至NB筛选培养基上(含有2毫克/升的2，4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照2周。

(五)阳性愈伤的分化：

选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至NB预分化培养基(含有1毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脱落酸(ABA)、2毫克/升激动素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。2周后挑选生长旺盛的愈伤组织转入MS分化培养基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧苄青霉素钠)，32℃持续光照培养。待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入不含激素和抗生素的MS培养基培养2到3周，之后移入土中置于温室中生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)。

实施例3、组成型表达OsWRKY47基因对稻瘟病的抗性增强

(一)转基因水稻中OsWRKY47基因表达水平的检测：

剪取转基因水稻幼苗的叶片，用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取植物总RNA，DNaseI(Takara公司)处理消化DNA后，用Invitrogen公司的逆转录试剂盒进行逆转录，得到转基因植株的cDNA。根据OsWRKY47基因的cDNA序列设计基因特异的实时定量PCR引物realF和realR，通过实时定量PCR检测OsWRKY47基因在转基因植株的表达水平，内参基因选用水稻的UBQ基因(引物使用realF2和realR2)。各引物序列如下：

realF：5′-GCG CGA GCA CAA GCA GAG TC-3′(SEQ ID No：6)；

realR：5′-CAG TTG GCGAAG CTG CAG GA-3′(SEQ ID No：7)；

realF2：5′-GTG GCC AGT AAG TCC TCA GC-3′(SEQ ID No：8)；

realR2：5′-ACAATG AAA CGG GAC ACG AC-3′(SEQ ID No：9)。

实时定量PCR检测OsWRKY47基因在转基因水稻植株中的表达情况如图1所示，其中基因过表达倍数超过60倍的有3株，分别是第7、13和16号转基因株系；TP309代表未转基因的台北309水稻植株。

(二)转基因水稻的稻瘟病接种实验：

选择稻瘟病菌毒性小种96-4-1a，对转基因水稻幼苗进行离体叶片接种。稻瘟病菌96-4-1A在燕麦培养基上28℃黑暗培养1周左右，用无菌水洗下表面菌丝，涂布到一块新的燕麦培养基上，28℃培养1天后，用无菌棉签轻轻刮去表面菌丝，置于日光灯下产孢。24小时后用含有0.02％Tween-20的无菌水洗下孢子，用血球计数板计算孢子浓度，将孢子浓度调整至1×10⁵孢子/毫升。取四叶期水稻幼苗，进行稻瘟病菌孢子的喷雾接种，每株苗喷雾2-4mL，待所有幼苗的叶片表面均匀的覆盖有一层细小的孢子悬浮液滴后，将其置于100％湿度，26℃的黑暗培养箱中24h。一天后恢复正常光周期培养，7天后观察表型。结果如图2所示。图2中，A为TP309、OsWRKY47转基因水稻1号株系和16号株系幼苗叶片接种稻瘟病菌96-4-1A小种后7天的表型；B为OsWRKY47基因在TP309和转基因水稻1号、16号株系幼苗中的表达情况；C为抗病标志性基因PR1a在TP309和转基因水稻1号、16号株系幼苗中的表达情况。可见，过表达OsWRKY47基因的转基因水稻幼苗对稻瘟病小种96-4-1A的抗性增强，表明OsWRKY47基因的组成型表达增强了水稻对稻瘟病的抗性。

Claims (8)

1.水稻OsWRKY47基因在提高水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用，所述水稻OsWRKY47基因编码序列表中的SEQ ID No：3所示的蛋白质。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因的序列是该基因的cDNA序列或基因组DNA序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，将所述水稻OsWRKY47基因导入水稻细胞、组织或器官，再将被转化的水稻细胞、组织或器官培育成植株，得到抗稻瘟病性提高的转基因水稻。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻OsWRKY47基因通过水稻表达载体导入水稻细胞、组织或器官。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水稻表达载体包含所述水稻OsWRKY47基因的序列和与该基因序列操作性相连的表达调控序列。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表达调控序列是驱动该基因组成型高表达的调控序列。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水稻表达载体中，用玉米Ubiquitin1启动子驱动所述水稻OsWRKY47基因的表达。

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