CN103361325B - 一种与水稻白叶枯抗性相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与水稻白叶枯抗性相关的基因及其编码的蛋白与应用。本发明所提供的水稻白叶枯抗性相关基因OsBAK1，是下列核苷酸序列之一：1）序列表中的序列1；2）编码序列表中的序列2蛋白质序列的核苷酸序列；3）与序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。水稻白叶枯抗性相关基因的编码蛋白，是具有序列表中序列2的氨基酸序列，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明的与水稻白叶枯抗性相关蛋白的编码基因OsBAK1对培育抗病植物品种具有重要意义。

Description

一种与水稻白叶枯抗性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与水稻白叶枯抗性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物。在农业生产中，由于单一品种的大面积种植以及病原微生物致病性的进化，许多品种常常快速丧失对变异病原的抗性，从而导致病害成灾。水稻的重要病害如稻瘟病、纹枯病和白叶枯病越来越成为影响水稻产量提高的重要制约因素。育种学家只有通过不断更新抗病品种来满足生产需求。但是，由于抗源有限和常规育种周期较长，抗病性已经越来越成为限制新品种培育的瓶颈。

植物抗病分子生物学是通过遗传学、生物化学、细胞生物学和生理学等现代生物学手段，研究植物与病原生物之间相互关系和病害防治方法的一门前沿学科。最近10年，分子植物病理学在研究理论体系的发展、关键现象的解释和研究技术的更新等方面均取得了全面的突破。同时，该领域内的诸多基础研究成果，如成功分离的植物抗病基因和病原微生物的关键致病因子，已经被运用于农作物抗病新品种的培育和作为农药分子设计的候选靶标。正因其在生物学理论和农业生产上的重要性，分子植物病理学得到了世界上各科技发达国家的高度重视，也是植物分子生物学进展最为快速的前沿领域之一，尤其是植物先天免疫（innate immunity）以及植物非特异性广谱抗性的分子机理研究上有着突破性进展。

植物免疫系统主要体现在两个方面：（1）植物能识别病原微生物表面物质如鞭毛、胞外多糖、脂多糖等，这些分子统称为病原菌相关分子模式Pathogen-AssociatedMolecular Patterns（PAMPs），而植物具有识别这些分子的细胞表面受体Patternrecognition receptors（PRRs）。在微生物与植物接触时，PRRs感受病原物的PAMPs后免疫系统被启动，即诱导PAMP-triggered immunity（PTI）。这就是植物能抵御绝大部分病原微生物的原因。（2）病原微生物在进化过程中产生了可以抑制PTI的效应分子（Effector），导致植物免疫系统被阻遏，这一过程称为Effector-triggered susceptibility（ETS）；植物经过进化和压力筛选，产生了抗病基因（R gene），可以识别相应的效应分子，这就是R抗性或Effector-triggered immunity（ETI）。与ETI相比，植物的PTI反应（非特异性广谱抗性）具有抗性不易因病原生理小种变异而丧失的优点，因此一直是育种学家和植物病理学家追求的目标。

与基因对基因抗性不同的是，广谱抗性缺乏可以直接转育的抗源基因，需要通过遗传转化调控基因表达。近年来通过对拟南芥非特异性防卫反应和非寄主抗病性研究，使人们对植物广谱、非特异性抗性的意义有了比较深入、系统的认识。许多以前的研究中鉴定的激发子都属于PAMPs，植物对PAMP的识别是通过质膜上的受体来完成的。目前已知的PAMPs信号传导通路中，研究最活跃的当属细菌鞭毛蛋白激活的PTI。感受细菌鞭毛蛋白（flagellin）的是位于拟南芥细胞膜上的受体激酶FLS2（flagellin-sensitive2）（Chinchilla et al，2006；Zipfel et al，2006）。FLS2识别鞭毛蛋白的保守肽flg22后，与类受体激酶BAK1（brassinosteroid-receptor1associated kinase1）结合形成二聚体，激活胞內信号通路，从而开启下游的防卫反应。除鞭毛蛋白外，其他PAMPs（如elongation factor Tu（EF-Tu）、cold shock proteins）所激活的PTI反应也需要BAK1的参与才能完成（Chinchilla et al，2007；Heese et al，2007）。最近也有研究认为，病原菌效应因子对植物免疫系统的阻遏也是通过效应因子与PRRs竞争性的结合BAK1，直接从源头上阻断PAMP信号传导（Huang，2010）。对拟南芥BAK1功能丧失突变体的抗病性分析结果发现，BAK1功能缺失后，转基因植株对芜菁花叶病毒的敏感性大大增加。接种芜菁花叶病毒后病毒的繁殖速度明显快于野生型和BAK1超量表达植株，从而细胞死亡和黄萎提早。有意思的是功能缺失的转基因植株中病程相关基因PR1，PR2，PR5，PDF1.2的表达量都大大增强，似乎植物抗病性的产生更多的依赖于BAK1，而不是早前认为的病程相关蛋白。从现有的研究结果，不难发现BAK1在植物防卫反应中的重要性。

虽然植物先天免疫研究主要集中在对模式植物拟南芥的研究上，但水稻在这方面的研究也开始越来越受到科学家的重视。大量的工作集中在水稻R基因的克隆和ETI信号通路上，对非特异抗性，尤其是PTI和病原菌效应蛋白的致病功能研究很少。但有证据表明，PTI在水稻广谱抗病中同样重要。比如，水稻中有一个明显的FLS2ortholog,最近的报道表明，OsFLS2具有同拟南芥FLS2同样的功能（Takai et al.,2008）。又如，水稻中的CEBiP含有保守的LysM结构域，并以很高的亲和力结合几丁质，很可能是水稻中的几丁质受体（Kakuet al.,2006）。何朝族等（He et al.,1999）克隆并证实了一个水稻MAP kinase基因，该基因在水稻叶片上的表达受稻瘟菌和机械损伤诱导，被命名为BWMK1(blast-and wound-induced MAP kinase)。最近的实验证实过量表达该基因的转基因水稻能提高水稻对多种稻瘟病菌的抗病性（何朝族实验室，未发表数据），进一步证实水稻MPK基因参与广谱抗性。最近在拟南芥中发现蛋白激酶PBL位于受体激酶下游，在PTI通路中起重要作用。近几年通过对拟南芥非特异防卫反应和非寄主抗病性研究，使人们逐渐对植物广谱、非特异性抗性的意义有了比较深入、系统的认识。随着转基因技术的不断发展和完善，通过转基因方法调控水稻先天免疫基因的表达，使其对多种病原菌均有广谱、非特异性抗性，从而创制具有优良抗病性的水稻新种质。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与水稻白叶枯抗性相关的蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白，是如下1）或2）的蛋白质：

1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1）衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述序列表中的序列2由624个氨基酸残基组成。

上述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。

上述编码基因为如下1）-3）中任一种的DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码与植物抗病性相关蛋白的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物抗病性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件下为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

上述编码基因可人工合成，可通过将序列表中序列1的自5′末端第1-1875位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签（如：flag、HA、His-tag）的编码序列得到。

上述序列表中的序列1由1875个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-1875位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白OsBAK1。

上述植物抗病性中的病为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病具体由下述致病菌引起：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain），所述水稻白叶枯病菌（Xanthomonasoryzae strain）进一步具体为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain）PXO99。

上述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。

含有上述编码基因的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围；

上述重组载体A具体为将上述编码基因插入表达载体，得到表达上述蛋白的重组载体。

在本发明的实施例中，表达载体为pCAMBIA1300，重组载体A为将序列表中序列1所示的DNA分子插入表达载体pCAMBIA1300的KpnI和Csp45I位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增上述编码基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述编码基因或上述重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围；

上述应用中，所述调节植物抗病性具体为如下1）或2）：1）提高植物抗病性；2）降低植物抗病性；

所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻；

所述植物抗病性中的病为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病具体由下述致病菌引起：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain），进一步具体为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain）PXO99。

本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物A的方法。

本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物A，所述转基因植物A的抗病性高于所述目的植物；

所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻；

所述抗病性中的病具体为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病进一步具体由下述致病菌引起：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain），所述水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain）尤其进一步具体为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaestrain）PXO99；

所述将上述蛋白的编码基因具体通过上述重组载体A导入目的植物。

上述转基因植物A的抗病性高于所述目的植物体现在所述转基因植物B的病斑长度/病叶长度（病斑长度/病叶长度）小于所述目的植物。

本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物B的方法。

本发明提供的方法，为抑制目的植物中的上述蛋白的活性或表达，得到转基因植物B，所述转基因植物B的抗病性低于所述目的植物；

所述抑制目的植物中的上述蛋白的活性或表达为将重组载体B导入所述目的植物；

所述重组载体B为将DNA分子1和DNA分子2均插入pTCK303载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。

所述重组载体B具体为将序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸插入pTCK303载体的SpeI、SacI酶切位点，且将序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸的反向互补序列插入pTCK303载体的SalI、KpnI位点间，得到的载体。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻；

所述抗病性中的病害具体为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病进一步具体由下述致病菌引起：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain），所述水稻白叶枯病尤其进一步具体为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain）PXO99。

上述转基因植物B的抗病性低于所述目的植物体现在所述转基因植物B的病斑长度/病叶长度（病斑长度/病叶长度）大于所述目的植物。

本发明的第四个目的是提供一种重组载体B。

本发明提供的重组载体B为为将DNA分子1和DNA分子2均插入pTCK303载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列。

所述重组载体B具体为将序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸插入pTCK303载体的SpeI、SacI酶切位点，且将序列1的自5′末端第1099位-1537位核苷酸的反向互补序列插入pTCK载体的SalI、KpnI位点间，得到的载体。

或上述蛋白、上述编码基因在诱导植物中的免疫应答基因表达中的应用也是本发明保护的范围，上述应用中，所述免疫应答基因为FRK1基因，所述FRK1基因的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述植物具体双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

上述诱导是在flg22刺激下进行（一个含有22个氨基酸的肽，来自细菌鞭毛蛋白的保守区域）（Gomez-Gomez L,Boller T.2000.FLS2:An LRR receptor-like kinaseinvolved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis.Mol Cell5:1003–1011）。可用现有的植物表达载体构建含有OsBAK1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2003A、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与水稻白叶枯抗性相关蛋白编码基因OsBAK1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。

使用OsBAK1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记基因（潮霉素标记基因、卡那霉素标记基因等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除草剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述植物既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、棉花、番茄等。

本发明的实验证明，本发明发现了OsBAK1基因，将其过表达导入水稻品种日本晴植株中，转入OsBAK1的日本晴植株对白叶枯病几个生理小种的抗性都有所提高，同时RNA干扰沉默OsBAK1基因，发现沉默后的转基因植物的抗病性低于野生型水稻；说明OsBAK1是与水稻抗性相关的蛋白。本发明对通过基因工程培育抗病性提高的转基因水稻具有重要意义；本发明所产生的抗性新种质为水稻先天免疫分子机理研究提供了基础材料。

附图说明

图1为OsBAK1基因的组织特异性表达分析

图2为OsBAK1基因的诱导特异性表达分析

图3为OsBAK1基因过表达转基因株系的PCR检测

图4为OsBAK1基因过表达转基因株系的southern杂交

图5为OsBAK1基因RNAi转基因株系的PCR检测

图6为OsBAK1基因过表达转基因株系的抗病分析

图7为OsBAK1基因RNAi转基因株系的抗病分析

图8为OsBAK1基因互补拟南芥bak1突变体的mark基因的检测

图9为RNA干扰载体pTCK-OsBAK1的结构示意图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述实验方法如无特别说明均为常规方法。

T₀表示从水稻品种日本晴中扩增OsBAK1基因构建载体转化日本晴愈伤组织得到的转基因植株，T₁表示T₀代植株自交产生的种子及由种子长成的植株。

实施例1、与水稻白叶枯抗性相关蛋白OsBAK1的cDNA序列的获得

1、蛋白OsBAK1的cDNA序列获得

以水稻品种日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare,Sakai H,Lee SS,Tanaka T,et al.2013.Rice Annotation Project Database(RAP-DB):An Integrative andInteractive Database for Rice Genomics.Plant Cell Physiol.54(2):e6，公众可从中国科学院微生物所获得。）为实验材料，提取其根、茎、叶、穗、鞘各组织总RNA，等量混合后，取2μg将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5＇-ATGGCGGCGCATCGGTGGGC-3＇和5＇-TCACCTCGGCCCTGATAGCTC-3＇为引物进行PCR扩增。

反应混合物如下表1：

表1为PCR扩增体系

ddH2O	18.3μL
		10×PCR缓冲液	2.5μL
dNTP Mixture(2.5mmol/L)	2.5μL
		Long Taq酶（5U/μL）	0.2μL
引物（10μmol/L）	0.25μL
		引物（10μmol/L）	0.25μL
模板（反转录的cDNA）	1μL
		Total	25μL

PCR反应条件：先94℃预变性4min；然后94℃变性45S；55℃退火45S；72℃延2min，共29个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得约1800bp左右的条带。切下该目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pGEM-T载体上，得到重组载体pGM-BAK1。对pGM-BAK1进行测序，测序结果表明，该载体上含有1875bp的PCR产物，该PCR产物的基因命名为OsBAK1，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码区为序列表中序列1自5′末端的第1-1875位核苷酸；该基因编码的蛋白命名为OsBAK1，该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、OsBAK1基因的表达分析

水稻日本晴种子盆栽于光照培养箱中，30℃光培养14h，28℃暗培养10h。待四叶一心期，分别利用0.1mmol/L水杨酸（SA）、0.1mmol/L茉莉酸甲酯（JA）进行喷洒处理，无菌去离子水为对照，处理后0，3，6，9，12，24，48h分别采集叶片；病原菌诱导处理采用剪叶接种法，白叶枯病原菌致病小种为PXO99，OD值为0.4-0.6，以蘸有无菌液体培养基的剪子剪切作为对照，接种后0，3，6，9，12，24，48h分别采集叶片，进行样品制备。

分别提取处理后水稻品种日本晴的根、茎、叶、穗、鞘等不同组织及不同诱导条件下叶片组织的总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以引物5’-CACCCACAGAAAGGTTGCTT-3和引物5’-CATCATTGGCTAGACGAGCA-3’进行半定量RT-PCR分析。

表2为反应体系

ddH2O	18.3μL
		10×PCR缓冲液	2.5μL
dNTP Mixture(2.5mmol/L)	2.5μL
		Taq酶（5U/μL）	0.2μL
引物（10μmol/L）	0.25μL
		引物（10μmol/L）	0.25μL
模板（反转录的cDNA）	1μL
		Total	25μL

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性30S；55℃退火30S；72℃延45s min，共29个循环；最后72℃延伸10min。

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1、图2所示。图1中，R表示OsBAK1在水稻品种日本晴的根中的表达情况，L表示OsBAK1在水稻品种日本晴的叶片中的表达情况，S表示OsBAK1在水稻品种日本晴的茎中的表达情况，P表示OsBAK1在水稻品种日本晴的幼穗中的表达情况，H表示OsBAK1在水稻品种日本晴的鞘中的表达情况；图2中JA、SA、PX099分别表示这几种处理不同时间点OsBAK1在水稻品种日本晴叶片中的表达情况，water表示剪叶接种法的对照。

从上述图中的结果表明，OsBAK1基因在水稻各组织中均有表达，其中穗中表达量较低，其它几个组织的表达量相近。JA处理后该基因在水稻品种日本晴叶片中表达量逐渐增强，SA处理后表达量高峰出现在处理后9h，病原菌处理后3h该基因即表达，随着处理时间的延长表达量无明显变化。

实施例2、OsBAK1基因的应用

一、过表达载体和RNA干扰载体的获得

1、过表达载体pCAMBIA1300-OsBAK1的获得

提取水稻品种日本晴叶的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5＇-GGGGGTACCATGGCGGCGCATCGGTGGGC-3＇和5＇-GGGTTCGAATCACCTCGGCCCTGATAGCTC-3＇为引物进行PCR扩增，得到1800bp的PCR产物。

将上述PCR产物经KpnI和Csp45I酶切得到的酶切产物与经过同样酶切的质粒pCAMBIA1300（华美生物公司，CSB-PL200206）连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入质粒pCAMBIA1300的KpnI和Csp45I位点间得到的载体，命名为pCAMBIA1300-OsBAK1，OsBAK1基因置于CAMV35s启动子的控制下。

2、RNA干扰载体的获得

提取水稻品种日本晴的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5′-GTCGACACTAGTCACCCACAGAAAGGTTGCTT-3′和5′-GGTACCGAGCTCCATCATTGGCTAGACGAGCA-3′为引物扩增，得到438bp的PCR产物，该PCR产物具有序列表中序列1自5′末端第1099位-1537位核苷酸；该PCR产物为正向片段。用SpeI和SacI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14610bp的pTCK303载体（Wang Zhen,Chen Changbin,Xu Yunyuan,JiangRongxi,Han Ye,Xu Zhihong and Chong Kang.2004.A Practical Vector for EfficientKnockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa L.)Plant Molecular BiologyReporter22:409-417；公众可从中国科学院微生物研究所获得）骨架连接，使该PCR产物正向插入pTCK303载体的SpeI、SacI位点间，得到中间载体；

再用SalI和KpnI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14612bp的中间载体骨架连接，使该PCR产物反向插入中间载体的SalI和KpnI位点间，得到重组载体，为RNA干扰载体。

经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5′末端第1099位-1537位核苷酸插入pTCK303载体的SpeI和SacI酶切位点间，且将序列表中序列1自5′末端第1099位-1537位核苷的反向互补片段插入pTCK303载体的SalI和KpnI酶切位点间得到的载体，命名为pTCK-OsBAK1（结构示意图如图9所示）。该具有反向重复的重组表达载体的启动子为ubiquitin。

二、过表达转基因株系和RNA干扰转基因株系的获得

1、过表达转基因株系的获得

将pCAMBIA1300-OsBAK1转入农杆菌LBA4404（Takara Bio company，Cat.9115），得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为pCAMBIA1300-OsBAK1，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pCAMBIA1300-OsBAK1。

将LBA4404/pCAMBIA1300-OsBAK1导入到水稻品种日本晴（以下也称为野生型水稻）中，获得了30个T₀代转OsBAK1水稻，即为过表达转基因株系。

对上述获得的30个T₀代转OsBAK1水稻和野生型水稻进行分子鉴定，提取各种水稻的基因组DNA，分别以hpt-F:5`-AGTCAATGACCGCTGTTATGC-3`；hpt-R:5`-CTGATCGAAAAGTTCGACAGC-3`（潮酶素基因）为引物获得750bp片断；PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性30S；55℃退火30S；72℃延45s min，共29个循环；最后72℃延伸10min。以野生型水稻为对照。

图3显示对潮酶素引物扩增的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，图中泳道1为mark；泳道2为质粒pCAMBIA1300-OsBAK1扩增结果，作为阳性对照；泳道3为野生型水稻基因组DNA扩增结果，作为阴性对照；泳道4-11为部分T₀代转OsBAK1水稻基因组DNA的扩增结果；可以看出，T₀代转OsBAK1水稻均得到750bp的目的片段，均为阳性T₀代转OsBAK1水稻。共得到27个阳性T₀代转OsBAK1水稻。

将上述27个潮酶素引物（htp）扩增为阳性的T₀代转OsBAK1水稻用如下RT-PCR方法鉴定：

osbak1-F1：5'-CACCCACAGAAAGGTTGCTT-3'；osbak1-R1：5'-CATCATTGGCTAGACGAGCA-3'（OsBAK1基因）；内参基因为OsGAPDH(GenBank登录号：GQ848032)，内参引物为，OsGAPDH-F1:5'-ACAGGGGAGTTGTGTTTTGC-3'；OsGAPDH-R1:5'-CCCAACCAACCACCATGATA-3'

结果为潮酶素引物（htp）扩增为阳性的T₀代转OsBAK1水稻中osbak1的平均相对表达量为2.0±0.2；

野生型水稻中osbak1的平均相对表达量为1.0±0.01（将野生型设为1，转基因植株半定量扩增亮度与野生型扩增条带亮度的比值表示过表达）；

可以看出，与野生型水稻相比，27个潮酶素引物（htp）扩增为阳性的转基因植株中OsBAK1均过表达。

以上述引物扩增质粒pCAMBIA1300-OsBAK1，回收约750bp左右的hpt基因片段为探针；提取阳性T₀代转OsBAK1水稻和野生型水稻的基因组DNA，以EcoRI酶切基因组DNA并转膜，利用前述探针进行杂交，结果如图4所示（从左到右的泳道1为空白对照；2为阳性对照；3为阴性对照；4-13为转基因植株基因组DNA），从图中可见检测的转基因植株基因组中均有目的基因的插入，进一步证明为阳性T₀代转OsBAK1水稻。

2、RNA干扰转基因株系的获得

将pTCK-OsBAK1转入农杆菌LBA4404（Takara Bio company，Cat.9115），得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为pTCK-OsBAK1，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pTCK-OsBAK1。

将pTCK-OsBAK1转入农杆菌LBA4404（Takara Bio company，Cat.9115），得到重组菌。将该重组菌提取质粒，送去测序，该质粒为pTCK-OsBAK1，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pTCK-OsBAK1。

将LBA4404/pTCK-OsBAK1导入到水稻品种日本晴（以下也称为野生型水稻）中，获得了30个T₀代转OsBAK1RNAi水稻，即为RNA干扰转基因株系。

对上述获得的30个T₀代转OsBAK1RNAi水稻和野生型水稻进行分子鉴定，提取各种水稻的基因组DNA，以hpt-F：5`-AGTCAATGACCGCTGTTATGC-3`；hpt-R：5`-CTGATCGAAAAGTTCGACAGC-3`为引物获得750bp片断。PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性30S；55℃退火30S；72℃延伸45S，共29个循环；最后72℃延伸10min。以野生型水稻为对照。

对hpt为引物扩增得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，为标记基因潮霉素抗性基因Hpt扩增结果；泳道1-21为T₀代转OsBAK1RNAi水稻，泳道22为野生型水稻阴性对照，质粒pTCK303为阳性对照；得到750bp的目的片段为阳性，共得到19个阳性T₀代转OsBAK1RNAi水稻。

将上述19个潮酶素引物（htp）扩增为阳性的阳性T₀代转OsBAK1RNAi水稻用如下RT-PCR方法鉴定：

osbak1-F1：5'-CACCCACAGAAAGGTTGCTT-3'；osbak1-R1：5'-CATCATTGGCTAGACGAGCA-3'（OsBAK1基因）；内参基因为OsGAPDH(GenBank登录号：GQ848032)，内参引物为，OsGAPDH-F1:5'-ACAGGGGAGTTGTGTTTTGC-3'；OsGAPDH-R1:5'-CCCAACCAACCACCATGATA-3'

结果为潮酶素引物（htp）扩增为阳性的T₀代转OsBAK1RNAi水稻中osbak1的平均相对表达量为0.2±0.05；

野生型水稻中osbak1的平均相对表达量为1.0±0.01（将野生型设为1，转基因植株半定量扩增亮度与野生型扩增条带亮度的比值表示过表达）；

可以看出，与野生型水稻相比，19个潮酶素引物（htp）扩增为阳性的T₀代转OsBAK1RNAi水稻中OsBAK1均表达量减低。

随后，19个潮酶素引物（htp）扩增为阳性的RNAi转基因植株经OsBAK1目的基因引物扩增也均为阳性。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1300和pTCK303分别转入野生型水稻中，得到T₀代转pCAMBIA1300水稻和T₀代转pTCK水稻。

将上述阳性T₀代转OsBAK1水稻、阳性T₀代转OsBAK1RNAi水稻、T₀代转pCAMBIA1300水稻和T₀代转pTCK水稻均播种传代，分别得到T₁代转OsBAK1水稻、T₁代转OsBAK1RNAi水稻、T₁代转pCAMBIA1300水稻和T₁代转pTCK水稻。

三、过表达转基因株系和RNA干扰转基因株系抗病表型

1、过表达转基因株系的抗病表型分析

将野生型水稻、T₁代转OsBAK1水稻、T₁代转pCAMBIA1300水稻进行白叶枯病原菌PXO99（Xanthomonas oryzae strain，BMC Genomics，2008，9：204；公众可从中国科学院微生物研究所获得）接种，接种白叶枯菌的培养和浓度调制可以参照Lin等方法（Phytopathology，1996，86：1156-1159，具体如下：

活化的白叶枯病菌株在马铃薯培养基（300g去皮马铃薯切片煮沸，纱布过滤后加入0.5g Ca(NO₃)₂，2g NaH₂PO₄，15g蔗糖，5g蛋白胨，20g琼脂粉，加水至1L后调pH值至6.8-7.0）斜面28℃下培养2-3d，无菌水稀释至约9x10⁹个/mL的浓度悬浮液（比浊法）；孕穗期采用剪叶法（Sun et al.,2004）接种白叶枯病菌悬浮液，每株接种5片完全伸展的叶子，接种后14或21d调查病斑长度和病叶长度，依据病斑长度/病叶长度%来衡量病情（中华人民共和国国家标准-转基因植物及其产品环境安全检测，农业部953号公告-9.1-2007；Chen Y,Hu J,Qian W,Tian Y,He C.Characterization and molecular marker screening of a rice bacteria resistant geneXa-min(t).Progress in Natural Science,2003,13:740-744.），调查数据进行T测验分析显著性（P<0.05））。每个株系10株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图6A和6B所示，6A为T1代转OsBAK1水稻接种后病斑长度/病叶长度%调查结果（其中NB表示野生型水稻，OE6和OE12代表2个T1代转OsBAK1水稻株系），可以看出，T1代转OsBAK1水稻接种PXO99后第12天调查的病斑长度/病叶长度明显小于野生型对照，表明过表达OsBAK1基因增强了转基因水稻对病原菌的抗性（其中NB三片叶的平均病斑长度/病叶长度%为26.3%；OE6株系的平均病斑长度/病叶长度%为17.0%；OE12株系的平均病斑长度/病叶长度%为15.3%）；

6B为转基因株系接种后第10天时拍摄的照片。

统计病斑长度和病叶长度，具体结果如下：

野生型水稻的病斑长度为5.1cm，病叶长度为19.8cm；

T₁代转OsBAK1水稻OE6的病斑长度为3.3cm，病叶长度为19.3cm；

T₁代转OsBAK1水稻OE12的病斑长度为3.05cm，病叶长度为20cm；

野生型水稻和T₁代转pCAMBIA1300水稻的结果无显著差异。

结果表明T₁代转基因植株抗病表型与转基因完全连锁，T₁代转OsBAK1水稻单株病原菌接种后病斑长度和病斑长度/病叶长度均小于野生型水稻。

以上结果表明，过表达OsBAK1基因能提高水稻对白叶枯病的抗性。

2、RNA干扰转基因株系的抗病表型分析

按照上述1的方法，将野生型水稻、T₁代转OsBAK1RNAi水稻和T₁代转pTCK水稻按照上述1所示的方法进行病原菌PXO99（Xanthomonas oryzae strain，BMC Genomics，2008,9：204）接种。每个株系10株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图7所示，其中，A为接种后14天叶片的表型（其中第一片叶为野生型，2-7片为T₁代转OsBAK1RNAi水稻代表性叶片的表型）、B为12天调查的病斑长度/病叶长度（NB为野生型水稻的病斑长度/病叶长度，其他为T₁代转OsBAK1RNAi水稻的病斑长度/病叶长度）；

从图7A中看出，与野生型水稻相比，T₁代转OsBAK1RNAi水稻叶片对病原菌的敏感性明显增加，抗病性下降；

从图7B中看出，野生型水稻的病斑长度为5.1cm，病叶长度为19.8cm，平均病斑长度/病叶长度为25.7%；

ABAK3-4-4的T₁代转OsBAK1RNAi水稻株系平均病斑长度为9.3cm，病叶长度为18.5cm，平均病斑长度/病叶长度%为50.1%；

其他T₁代转OsBAK1RNAi水稻株系的病斑长度/病叶长度也比野生型大。

野生型水稻和T₁代转pTCK水稻的结果无显著差异。

以上结果表明，T₁代转OsBAK1RNAi水稻单株病原菌接种后病斑长度/病叶长度%均大于野生型水稻。

以上结果，进一步证实了OsBAK1基因的表达下降引起水稻抗性下降。

3、OsBAK1基因互补拟南芥bak1突变体的功能

拟南芥bak1突变体记载在如下文献中：Zhang J,Li W,Xiang T,Liu Z,LalukK,Ding X,Zou Y,Gao M,Zhang X,Chen S,Mengiste T,Zhang Y,Zhou JM.2010.Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multipleplant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector.CellHost Microbe.7(4):290-301.公众可从中国科学院微生物研究所获得，且已经证明为bak1基因缺失。

提取水稻品种日本晴（Oryza sativa(japonica group)cv.Nipponbare）叶子的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以5'-CCGCTCGAG ATGGCGGCGCATCGGTGGGC-3'和5'-TAACGTTCGAACCTCGGCCCTGATAGCTC-3'为引物进行PCR扩增，得到1892bp的PCR产物。

将上述PCR产物经XhoI和Csp45I酶切得到的酶切产物与经过同样酶切的质粒pUC19-35S-HA-RBS（Zhang J,Li W,Xiang T,Liu Z,Laluk K,Ding X,Zou Y,GaoM,Zhang X,Chen S,Mengiste T,Zhang Y,Zhou JM.2010.Receptor-like cytoplasmickinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and aretargeted by a Pseudomonas syringae effector.Cell Host Microbe.7(4):290-301.公众可从中国科学院微生物研究所获得）连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。

提取转化子的质粒，送去测序，结果为将序列表中的序列1插入质粒pUC19-35S-HA-RBS的Xho I和Csp45I位点间得到的载体，命名为OsBAK1-FLAG，OsBAK1基因置于CAMV35s启动子的控制下。

将10μg质粒OsBAK1-FLAG、4μg质粒FRK1::LUC（Feng F,Yang F,Rong W,Wu X,Zhang J,Chen S,He C,Zhou JM.2012.A Xanthomonas uridine5'-monophosphatetransferase inhibits plant immune kinases.Nature,485(7396):114-118；公众可从中国科学院微生物研究所获得）、100ng35s::RLUC(Renilla荧光素酶，（Feng F,Yang F,Rong W,Wu X,Zhang J,Chen S,He C,Zhou JM.2012.A Xanthomonas uridine5'-monophosphate transferase inhibits plant immune kinases.Nature,485(7396):114-118；公众可从中国科学院微生物研究所获得）与100μL bak1突变体叶片制备的原生质体混合，PEG介导的转化法进行原生质体转化,具体的方法如下:选择4-5周大状态良好叶片呈青绿色的拟南芥Col-0bak1突变体植株，取完全伸展开的叶片浸没于0.4mol/L甘露醇液体中，用刀切成1mm细丝挑进装有酶解液的三角瓶中，25℃，45-60rpm直到酶解完全。将三角瓶中液体通过120目尼龙滤布过滤，滤出液装入新的50mL离心管中。室温100g离心3min，离心机升降速度均调为3，后续离心步骤均按此设置。轻柔吸弃上清，加入20mL W5溶液，轻轻混匀后离心3min，弃上清再用20mL W5洗一次后加入20mL W5放冰上30min。离心弃上清，根据需要加入适量的MMg溶液，轻柔的混匀即制备好原生质体细胞放冰上备用。解冻质粒，按照每个小反应每种质粒各加10μg，用去掉尖端的枪头吸取200μL原生质体，先将其和质粒混匀，然后再加入等体积的（质粒和原生质体体积之和）的PEG溶液，迅速轻柔混匀后室温放置7min进行转化。加入4倍体积的W5溶液终止反应，离心弃上清，再用3倍体积W5洗原生质体2次去除残留的PEG，最后加入1mL W5,室温（25℃）诱导12h，瞬时表达OsBAK1基因，得到转化后原生质体。以野生型拟南芥col-0（Feng F,Yang F,Rong W,Wu X,Zhang J,Chen S,He C,Zhou JM.2012.A Xanthomonas uridine5'-monophosphatetransferase inhibits plant immune kinases.Nature,485(7396):114-118；公众可从中国科学院微生物研究所获得）和bak1突变体为对照。

室温（25℃）诱导12h后，原生质体被PAMP（1mM flg22或对照H₂O处理3小时（Doelling JH,Pikaard CS.1993,Transient expression in Arabidopsis thalianaprotoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures.PlantCell Reports,12:241-244），其中200μL被转染原生质体使用Promega公司的GloMax^TM96微孔板光度计检测LUC的活性。其余800μL裂解后提取总蛋白，通过FLAG抗体检测OsBAK1的蛋白表达水平。以Rubisco蛋白为内参。

FRK1：：LUC的活性结果如图8A，为水稻来源的OsBAK1的瞬时表达互补了拟南芥bak1突变体的bak1基因的缺失后PTI通路标志基因FRK1的表达，其中，col0为野生型拟南芥col0；bak1为bak1突变体；bak1+OsBAK1为质粒OsBAK1-FLAG转入bak1原生质体；可以看出，通过flg22的诱导，bak1+OsBAK1中基因FRK1的相对表达量为3.8±0.5，bak1中基因FRK1的相对表达量为0.8±0.2，野生型col-0中基因FRK1的相对表达量为5.5±0.5；可以看出，flg22的诱导下，OsBAK1可以激发下游PTI通路标志基因FRK1（其核苷酸序列为序列3）的表达。在拟南芥原生质体中表达的OsBAK1能完全互补拟南芥bak1突变体中的BAK1，在flg22的诱导下激发PTI途径标志基因FRK1的表达。

8B为有（+）、无（-）flg22诱导后的拟南芥bak1突变体（bak1）和转染了pUC19-OsBAK1-FLAG质粒的bak1突变体（bak1+OsBAK1）中OsBAK1的蛋白表达水平，通过FLAG抗体（EarthOx，产品货号：E022060）检测。对照Col-0为野生型拟南芥原生质体和bak1突变体；可以看出，互补后，OsBAK1的蛋白得到表达（因为用的是flag抗体做的杂交，所以在野生型中没有对应的蛋白，因此没有信号，而转染了pUC19-OsBAK1-FLAG质粒的bak1突变体中因为有flag而有杂交信号）。

上述结果表明，水稻OsBAK1基因与拟南芥BAK1基因功能上是保守的，而拟南芥BAK1基因对免疫应答是不可或缺的，这也从侧面证实了OsBAK1基因在水稻广谱抗性中可能发挥积极作用。

Claims (1)

1.一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中的OsBAK1蛋白的活性或表达，得到转基因植物，所述转基因植物的抗病性低于所述目的植物；

所述抑制目的植物中的OsBAK1蛋白的活性或表达具体为将重组载体导入所述目的植物；

所述OsBAK1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2；

所述重组载体为将DNA分子1和DNA分子2均插入pTCK303载体中，得到的载体；所述DNA分子1的核苷酸序列为序列1的自第1099位-1537位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列为所述DNA分子1的反向互补序列；

所述目的植物为水稻；

所述抗病性中的病为水稻白叶枯病，所述水稻白叶枯病具体由下述致病菌引起：水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae strain）。