CN103037682A - 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及用于在植物中增强各种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及通过调节编码目的蛋白(POI)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有经调节的POI多肽编码核酸表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于实施本发明方法的新POI编码核酸和包含其的构建体。

Description

具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
通过引用的方式并入下列优先权申请：US 61/315070和EP10156928.3。
技术领域
本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS,EC 4.1.3.27)的核酸在植物中的表达来增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有经调节的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)编码核酸表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其它对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于本发明方法的构建体。
背景技术
具有特别经济意义的性状涉及增加的产量。产量通常定义为作物的可测量的具有经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造（例如，分枝的数量）、种子生产和叶子衰老。根的发育、营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也可以是决定产量的重要因素。因此优化上述因素可以促进作物产量的增加。
在田间条件下，植物的表现，例如就生长、发育、生物量积累和种子产生而言，取决于植物对许多环境条件、变化和胁迫的耐受性和适应能力。
农业生物技术专家使用几个参数的量度来指示转基因对于作物产量的潜在影响。对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于粮食作物，使用其它参数来估计产量，所述参数例如植物大小，其通过植物总干重和鲜重、地上和地下部分干重和鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、叶长、根长、分蘖数和叶数来度量。早期发育阶段的植物大小通常将与发育后期的植物大小相关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多。对于植物大小和生长速率，存在着强遗传组分，因此对于许多不同基因型，植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关。由此，可以使用标准环境来近似田间作物所遭遇到的多样和动态环境。对一种非生物胁迫表现出耐受性的植物常对另一种环境胁迫表现出耐受性。这种交叉耐受的现象还没有在机制水平上得到理解。尽管如此，可以合理地预期，由于表达转基因而对低温例如寒冷温度和/或冰冻温度表现出增强的耐受性的植物，也可以对干旱和/或盐和/或其它非生物胁迫表现出耐受性。一些在植物中涉及胁迫反应、水分利用和/或生物量的基因已得到了表征。但是至今，成功培育的具有提高的产量的转基因作物还有限。
因此，需要鉴定这样的基因，所述基因在过量表达或下调时，赋予对各种胁迫增加的耐受性和/或在最优和/或次优生长条件下提高的产量。
现已发现，可通过在植物中调节POI(目的蛋白)多肽编码核酸的表达，增加植物的产量和改善植物的多种产量相关性状。
发明概述
令人惊讶地，现已发现，调节邻氨基苯甲酸合成酶(AS)编码核酸的表达可以产生相对于对照植物具有增强的产量和改善的产量相关性状，特别是增加的种子总重量、种子总数、枝条生物量和/或根生物量的植物。
根据一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物改善植物产量相关性状的方法，包括调节邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的编码核酸在植物中的表达。
因此，依照本发明，可以利用本文鉴定的基因，相对于对照植物增强产量相关性状，例如增加的种子总重量、种子总数、枝条生物量和/或根生物量。增加的产量可以通过转基因植物和它们合适的对照植物的大田试验来确定。可选地，可以在模式植物中，于最优的、受控制的生长条件下确定转基因增加产量的能力。可以通过测量下列表型之任一或任何组合，与对照植物进行比较来确定增加的产量性状：植物干燥的可收获部分的产量、植物干燥的地上可收获部分的产量、植物干燥的地下可收获部分的产量、植物可收获部分鲜重的产量、植物地上可收获部分鲜重的产量、植物地下可收获部分鲜重的产量、植物果实(新鲜的和干燥的)的产量、种子(新鲜的和干燥的)的产量、谷粒干重等等。植物增加的内在生产能力可以表现为：其种子产量的提高(例如，增加的种子/谷粒大小、增加的穗数、增加的每穗种子数、改善的种子饱满度、改善的种子组成，等等)、其固有生长和发育的改变(例如，株高、植物生长速率、荚果数、节间数、开花时间、荚果落粒性、根瘤形成和固氮的效率、碳同化的效率、幼苗活力/早期活力的改善、增强的萌发效率、株型的改善、细胞周期的改变等等)。
也可以改善产量相关性状，以增加植物对非生物环境胁迫的耐受性。非生物胁迫包括干旱、低温、盐度、渗透胁迫、荫蔽、高植株密度、机械胁迫和氧化胁迫。可以进行监测以确定对非生物环境胁迫增强的耐受性的另外表型包括但不限于：萎蔫、叶片褐变、膨压、叶片或针叶的下垂或脱落、叶片或针叶的过早衰老、叶片或针叶中叶绿素的丧失、和/或叶片黄化。可以在田间试验作物中，或在受控生长条件下的模式植物中，监测任何上述产量相关表型，以证明转基因植物对非生物环境胁迫具有增加的耐受性。定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在文中可互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸的聚合物。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中可互换使用，是指任何长度的无支链形式的核苷酸聚合物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者两者的组合。
同源物
蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其源自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。
缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。
插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般，氨基酸序列内的插入将小于N-或C-末端的融合，约1到10个残基左右。N-或C-末端融合蛋白或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、
Figure BDA00002415954700041
表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。
取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以是成簇取代，并且可以是1到10个氨基酸；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域公知(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freemanand Company(编辑)和下表1)。
表1：保守氨基酸取代的实例
残基 保守取代 残基 保守取代
Ala Ser Leu Ile;Val
Arg Lys Lys Arg;Gln
Asn Gln;His Met Leu;Ile
Asp Glu Phe Met;Leu;Tyr
Gln Asn Ser Thr;Gly
Cys Ser Thr Ser;Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp;Phe
His Asn;Gln Val Ile;Leu
Ile Leu;Val
可通过本领域公知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法在本领域公知。例如，本领域的技术人员公知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB,Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
衍生物
“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与蛋白质如目的蛋白质的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与多肽的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与氨基酸序列结合以有利于其检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”还可以包括天然形式的蛋白质与标签肽（tagging peptide）例如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物（关于标签肽的综述，参见Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60,523-533,2003)。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。
结构域、基序/共有序列/标签序列(Signature)
术语“结构域”是指在进化相关蛋白质的序列比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其它位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”通过在蛋白质同源物家族的比对序列中其高度的保守性而鉴定，其能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。
术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是结构域的高度保守的部分，但也可以包括仅仅部分的结构域，或者可以是位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。
存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864;Letunic等(2002)Nucleic AcidsRes 30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntaxfor biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94;第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology)Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编辑,53-61页,AAAIPress,Menlo Park;Hulo等,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002))。进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:the proteomics server for in-depthprotein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res 31:3784-3788(2003))。结构域或基序也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定。
为比较而进行序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找两序列之间匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。同源物可以例如，使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等,(2003)BMCBioinformatics,10:29.2003Jul 10;4:29.MatGAT:an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1);195-7)。
交互BLAST
通常，这包括一次BLAST，即以查询序列(例如，利用实施例部分表A中所列的任何序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，而理想地反向BLAST导致查询序列在最高命中事件中，则鉴定到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，且优选地反向BLAST导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直向同源物。
分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还可以对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，继之以邻接树来辅助对相关基因的聚类进行可视化和鉴定直向同源物和旁系同源物。
杂交
本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。
术语“严格性”是指进行杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，在确定的离子强度和pH，对于特定序列而言，低严格条件选择为比热解链温度(Tm)低大约30℃。中等严格条件为温度比Tm低20℃，而高严格条件为温度比Tm低10℃。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。
Tm是在确定的离子强度和pH值时，50%的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度特异性杂交。在低于Tm值大约16℃到32℃获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度不超过0.4M时，这一作用明显(对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50%甲酰胺能够使杂交在30到45℃进行，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1℃。取决于杂交体的类型，Tm值可以利用下列公式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):
Tm＝81.5℃＋16.6×log10[Na+]a＋0.41×%[G/Cb]－500×[Lc]-1－0.61×%甲酰胺
2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体:
Tm＝79.8°C+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd杂交体:
<20个核苷酸:Tm＝2(ln)
20-35个核苷酸:Tm＝22＋1.46(ln)
a或用于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内准确。
b仅对于在30%到75%范围内的%GC是准确的。
cL＝双链体的碱基对长度。
d寡，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)＋(A/T数)。
非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一种来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。对于非同源探针，可以通过改变如下条件之一来进行一系列杂交：
(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃降至42℃)，或
(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%降至0%)。
熟练技术人员知晓可以在杂交过程中改变而保持或者改变严格条件的各种参数。
除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般，适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的适宜严格条件如上文所示设置。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练技术人员知晓可以在洗涤过程中改变从而保持或者改变严格条件的各种参数。
例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在1×SSC中于65℃杂交或者在1×SSC和50%甲酰胺中于42℃杂交，接着在0.3×SSC中于65℃洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4×SSC中于50℃杂交或者在6×SSC和50%甲酰胺中于40℃杂交，接着在2×SSC中于50℃洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml片段化的变性鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠。
为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,N.Y.(1989及年度更新资料)。
剪接变体
本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6:25)。
等位基因变体
等位基因或等位基因变体为位于相同的染色体位置的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然多态性品系中SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。
内源基因
本文述及“内源”基因不仅指见于植物之中的天然形式的所讨论基因(即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离形式的所述基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可遭遇该转基因表达的实质性下降和/或该内源基因表达的实质性下降。该分离的基因可从生物体分离或可以例如通过化学合成进行人造。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化是重复进行DNA改组以及继之的适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等(2004)Science 304(5674):1151-4;美国专利5,811,238和6,395,547)。
构建体
另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于实施本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其它控制序列（除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外）可以有蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。
本发明的遗传构建体可以还包括为在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为染色体外遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于fl-ori和colE1。
为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸的转基因植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。一旦不再需要标记基因，可从转基因细胞将其除去或切除。用于标记去除的技术在本领域内是已知的，有用的技术描述于上文中定义部分。
调控元件/控制序列/启动子
术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，取其广义，是指能够影响与之相连的序列表达的调控性核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与识别和结合RNA聚合酶及其它蛋白质，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括对于精确的转录起始是必需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)，以及其它调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)——它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸序列分子的表达。
“植物启动子”包括可以介导编码序列区段在植物细胞中表达的调控元件。因此，植物启动子不必是植物来源的，还可来源于病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”还可来源于植物细胞，例如，来源于待用欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其它“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，而不干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其它3’调控区的功能或活性。此外，还可以通过修饰启动子的序列而增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须，如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，所述启动子将在恰当的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。
为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将候选启动子与报告基因有效连接、测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。公知的适宜报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活来测定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的密度计量分析、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等,1996Genome Methods 6:986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”表示驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”表示每个细胞约1/10,000个转录物到约1/100,000个转录物、到约1/500,0000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说每个细胞约1/10个转录物到约1/100个转录物、到约1/1000个转录物。一般，“中等强度启动子”表示以低于强启动子的水平，尤其是以在所有情况下都低于在35S CaMV启动子控制下所获得水平的水平，驱动编码序列表达的启动子。
有效连接
本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。
组成型启动子
“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必然是所有阶段，在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。下表2a给出了组成型启动子的实例。
表2a：组成型启动子的实例
Figure BDA00002415954700141
Figure BDA00002415954700151
遍在启动子
遍在启动子基本上在生物体所有的组织或细胞中都有活性。
发育调控型启动子
发育调控型启动子在某些发育阶段或在经历发育改变的植物部分有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子响应化学品(综述参见Gatz 1997,Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.,48:89-108)、环境或物理刺激而诱导或增加转录起始，或者可以是“胁迫诱导型”，即当植物接触多种胁迫条件时被激活，或者是“病原体诱导型”，即当植物接触多种病原体时被激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性的启动子是能够在某些器官或组织(如叶、根、种子组织等)中优先起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是主要在植物根中，基本上排除在植物的任何其它部分中，具有转录活性的启动子，但仍允许在这些其它植物部分中的任何渗漏表达。能够仅在某些细胞中起始转录的启动子在文中称为“细胞特异性”启动子。
根特异性启动子的实例列于下表2b。
表2b：根特异性启动子的实例
种子特异性启动子主要在种子组织中，但不必仅在种子组织中(渗漏表达的情况下)，具有转录活性。种子特异性启动子可以在种子发育和/或萌发期间具有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉层/胚特异性的。种子特异性启动子（胚乳/糊粉层/胚特异性的）的实例列于下表2c至表2f中。种子特异性启动子的更多实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2,113-125,2004)中给出，其公开内容作为参考并入本文，如同充分阐述的那样。
表2c：种子特异性启动子的实例
Figure BDA00002415954700171
Figure BDA00002415954700181
表2d:胚乳特异性启动子的实例
Figure BDA00002415954700191
表2e:胚特异性启动子的实例
基因来源 参考文献
稻OSH1 Sato等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:8117-8122,1996
KNOX Postma-Haarsma等,Plant Mol.Biol.39:257-71,1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
表2f：糊粉特异性启动子的实例
Figure BDA00002415954700201
如文中所定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中，基本上排除在任何其它植物部分中，具有转录活性的启动子，但仍允许在这些其它植物部分中的任何渗漏表达。
可以用来实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例示于下表2g。
表2g：绿色组织特异性启动子的实例
Figure BDA00002415954700211
组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中，基本上排除在任何其它植物部分中，具有转录活性，但仍允许在这些其它植物部分的任何渗漏表达。可以用来实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例示于下表2h。
表2h：分生组织特异性启动子的实例
Figure BDA00002415954700212
终止子
术语“终止子”包括这样的控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，发送初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其它植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。
可选择标记(基因)/报告基因
“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，其中该表型在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因通过一系列不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性、引入新的代谢性状或允许可视选择的标记。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因（例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予抗例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因）、赋予除草剂抗性的基因（例如提供抗
Figure BDA00002415954700221
抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予抗例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲抗性的基因）、或者提供代谢性状的基因（如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或有关木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性）。可视标记基因的表达导致形成颜色（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal）、发光（如萤光素/萤光素酶系统）或荧光（绿色荧光蛋白GFP及其衍生物）。这仅仅是一小部分可能标记的名单。技术人员熟悉此类标记。取决于生物体和选择方法，优选不同的标记。
已知对于核酸在植物细胞中的稳定或瞬时整合，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，仅少数细胞可以摄入该外来DNA，以及，如果期望的话，整合进其基因组。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够在例如突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子可与编码本发明多肽的或用于本发明方法的序列包含在同一个载体中，或者在分开的载体中引入宿主细胞。已经稳定转染了所引入的核酸的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其它细胞死去)予以鉴定。
由于一旦成功引入了核酸后将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明用于引入核酸的方法最好采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体接收，或者在植物的情况下含有(高达40%或以上的转化体)，两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合在转座子中的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体来瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10%)，一旦成功进行了转化，转座子会跳离宿主细胞基因组并丢失。在另外一些情况下，转座子会跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交以消除标记基因。在微生物学领域，已经研发了使得可以或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于所谓的重组系统；其优势在于可以免除杂交消除。最著名的这类系统是称为Cre/lox系统的系统。Cre1为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化成功后，其会因Cre1重组酶的表达而得以切除。其它重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
出于本发明的目的，就例如本发明的核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言，“转基因的”、“转基因”或“重组”是指所有这些构建体通过重组方法产生，其中：
(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或
(b)有效连接于本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或
(c)(a)和(b)
不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，该修饰可以采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为指在原始植物中天然的基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选保持、至少是部分地保持核酸序列的天然遗传环境。该环境至少位于核酸序列的一侧，长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列与该核酸序列的天然启动子之间的天然组合——经非天然的合成（“人工”）方法例如诱变处理而被修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。合适的方法描述在例如，US 5,565,350或WO 00/15815中。
因此，如上文所述，用于本发明目的的转基因植物应理解为指：在所述植物的基因组中,本发明方法中所用的核酸不位于其天然基因座上，其中所述核酸可以进行同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：尽管在植物基因组中根据本发明的或本发明方法中所用的核酸在其天然位置上，但是所述序列已相对于天然序列而被修饰，和/或天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选理解为表示：根据本发明的核酸在基因组中非天然的座位上表达，即同源表达，或者优选发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。
在本发明的一个实施方案中，“分离的”核酸序列位于非天然的染色体环境中。
调节
与表达或基因表达相关的术语“调节”是指与对照植物相比，所述基因表达的表达水平被改变的过程，其中表达水平可增加或降低。原始未调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或随后进行翻译的mRNA的任何类型的表达。术语“调节活性”或术语“调节表达”应理解为本发明核酸序列或编码蛋白质的任何表达改变，该改变导致植物产量增加和/或生长增加。
表达
术语“表达”或“基因表达”是指特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地是指基因(一个或多个)或基因构建体至结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的转录，有或无后者至蛋白质的随后翻译。该过程包括DNA的转录和所获得的mRNA产物的加工。
增加的表达/过表达
如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。
增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，且包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的多肽的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，在体内改变内源启动子(见Kmiec,US5,565,350;Zarling等,WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。
如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。
也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The Maize Handbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。
降低的表达
本文述及“降低的表达”或者表达“减小或基本上消除”应理解为表示，内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物降低。所述减小或基本上消除按照递增的优选顺序为，与对照植物相比，减小至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%、99%或更多。
为减小或基本上消除植物中内源基因的表达，需要一段足够长度的、基本上连续核苷酸的核酸序列。为进行基因沉默，这可以少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更少的核苷酸，可选地，这可以多至完整的基因(包括部分或完整的5’和/或3’UTR)。此基本上连续的核苷酸链可以源自编码目的蛋白质的核酸(靶基因)，或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸链能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸链按照递增的优选顺序与靶基因(有义链或反义链)50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列相同。对于本文所讨论的用于减小或基本上消除内源基因表达的各种方法而言，编码(功能性)多肽的核酸序列并非必需的。
减小或基本上消除表达可以利用常规工具和技术来实现。减小或基本上消除内源基因表达的一个优选方法是通过向植物中引入和表达基因构建体，其中，核酸(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码任一目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)以被间隔子(非编码DNA)分隔开的、(部分或完全地)反向重复的形式克隆在该构建体中。
在这样的优选方法中，利用核酸或其部分(在此情况中，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)的反向重复(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默，实现减小或基本上消除内源基因的表达。将该反向重复序列克隆进包含控制序列的表达载体中。非编码DNA核酸序列(间隔子，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成该反向重复的两个反向核酸之间。该反向重复序列转录后，形成具有（部分或完全）自我互补结构的嵌合RNA。该双链RNA结构称为发夹RNA(hpRNA)。hpRNA被植物加工成可以整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的siRNA。RISC进而切割mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。关于其它一般细节，参见例如Grierson等(1998)WO 98/53083;Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
本发明的方法的实施不依赖于向植物中引入和表达其中以反向重复形式克隆了核酸分子的基因构建体，而是可以使用几种公知的“基因沉默”法中的任一个或多个来实现相同的效应。
用于减小内源基因表达的一个这样的方法是RNA介导的基因表达的沉默(下调)。在该情况下沉默在植物中由双链RNA序列(dsRNA)触发，所述双链RNA序列基本上与靶内源基因相似。该dsRNA被植物进一步加工成称为短干扰RNA(siRNA)的大约20至大约26个核苷酸。siRNA整合入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物切割内源靶基因的mRNA转录物，从而实质性减少待翻译成多肽的mRNA转录物的数量。优选，双链RNA序列相应于靶基因。
RNA沉默法的另一实例包括以有义取向，向植物中引入核酸序列或其部分(在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链)。“有义取向”是指与其mRNA转录物同源的DNA序列。从而至少一个拷贝的核酸序列被引入植物。该额外的核酸序列将减小内源基因的表达，从而产生称为共抑制的现象。如果将几个额外拷贝的核酸序列引入植物，则基因表达的减小将更明显，因为在高转录水平与共抑制的触发之间存在正相关。
RNA沉默法的另一实例包括使用反义核酸序列。“反义”核酸序列包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码蛋白质的“有义”核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录物序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源基因互补。互补性可位于基因的“编码区”和/或“非编码区”中。术语“编码区”是指包含将翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区”是指连接在编码区侧翼的5'和3'序列，其可被转录但不被翻译成氨基酸(也称为5'和3'非翻译区)。
可根据沃尔森和克里克碱基配对法则设计反义核酸序列。反义核酸序列可与整个核酸序列（在这种情况下，源自目的基因、或者源自能够编码目的蛋白质的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸的、一段基本上连续核苷酸的链）互补，但也可以是仅对核酸序列的部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起始位点的区域互补。适宜的反义寡核苷酸序列的长度在本领域内是已知的并且可以开始于长大约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少。可使用本领域内已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应，构建根据本发明的反义核酸序列。例如，反义核酸序列（例如，反义寡核苷酸序列）可使用天然存在的核苷酸或各种修饰核苷酸来化学合成，所述修饰核苷酸经设计用以增加分子的生物学稳定性或增加反义与有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例在本领域是公知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和“加帽”和用类似物例如肌苷对一个或多个天然存在的核苷酸的取代。核苷酸的其它修饰在本领域是公知的。
可使用已将核酸序列以反义取向（即，从插入的核酸转录的RNA针对目的靶核酸是反义取向）亚克隆入其中的表达载体，生物学地产生反义核酸序列。优选，植物中，通过稳定地整合的包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子的核酸构建体，产生反义核酸序列。
用于在本发明的方法中进行沉默的核酸分子（无论引入植物的还是原位产生的）与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达。杂交可通过常规核苷酸互补性以形成稳定的双链体或者，例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中的特定相互作用而产生。可通过转化或在特定组织位置直接注射，将反义核酸序列引入植物。可选地，可修饰反义核酸序列以靶向选择的细胞，然后全身性施用。例如，为了进行全身性施用，可以修饰反义核酸序列，以便其特异性结合选择的细胞表面上表达的受体或抗原（例如，通过将反义核酸序列连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体）。还可使用本文中描述的载体将反义核酸序列递送至细胞。
根据另一个方面，反义核酸序列是α-异头物核酸序列。α-异头物核酸序列与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与常见的b单元（b-units）不同，链走向彼此平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15:6625-6641)。反义核酸序列还可包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucl Ac Res15,6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215,327-330)。
还可使用核酶减少或基本上消除内源基因的表达。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，该分子能够切割与其具有互补区的单链核酸序列例如mRNA。因此，核酶(例如，锤头核酶(Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334,585-591)中描述的)可用于催化切割编码多肽的mRNA转录物，从而显著减少待翻译成多肽的mRNA的数量。可设计具有对于核酸序列的特异性的核酶(参见例如:Cech等美国专利号4,987,071;和Cech等美国专利号5,116,742)。可选择地，可以使用相应于核酸序列的mRNA转录物，从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science 261,1411-1418)。核酶用于在植物中进行基因沉默的用途在本领域是已知的(例如,Atkins等(1994)WO 94/00012;Lenne等(1995)WO 95/03404;Lutziger等(2000)WO 00/00619;Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO 97/38116)。
基因沉默还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)或通过Angell和Baulcombe((1999)Plant J 20(3):357-62)、(Amplicon VIGSWO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)等所述的策略来实现。
如果在内源基因上存在突变和/或在随后引入植物的分离基因/核酸上存在突变，那么基因沉默也可发生。减少或基本上消除可通过非功能性多肽引起。例如，多肽可能结合多种相互作用的蛋白质；因此，可以通过一个或多个突变和/或截短，提供仍然能够结合相互作用的蛋白质（例如受体蛋白）但不能展示其正常功能（例如信号转导配体）的多肽。
进行基因沉默的另一个方法是通过用与基因的调控区（例如启动子和/或增强子）互补的核酸序列来打靶以形成三螺旋结构，所述结构阻止基因在靶细胞中的转录。参见Helene,C.,Anticancer Drug Res.6,569-84,1991;Helene等,Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-361992;和Maher,L.J.Bioassays14,807-15,1992。
其它方法，例如应用针对内源多肽的抗体在植物原位(in planta)抑制其功能、或干扰多肽所参与的信号传递通路，对于技术人员是公知的。特别地，可预期人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能，或用于干扰其中靶多肽参与的信号转导途径。
可选择地，可设置筛选程序以鉴定植物群体中基因的天然变体，该变体编码具有减少的活性的多肽。这样的天然变体也可用于例如进行同源重组。
人工和/或天然微小RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源miRNA为单链小RNA，一般长度19-24个核苷酸。它们主要用于调控基因表达和/或mRNA翻译。大多数植物microRNA(miRNA)具有与其靶序列完全或几乎完全的互补性。然而，存在具有达到5个错配的天然靶。miRNA利用Dicer家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的更长的非编码RNA加工而来。一旦加工后，它们通过结合RNA诱导的沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白，而掺入到RNA诱导沉默复合物中。miRNA充当RISC的特异性组件，因为它们与细胞质中的靶核酸（大多数为mRNA）碱基配对。随后的调控事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的效应常反映为靶基因的降低的mRNA水平。
人工微小RNA(amiRNA)一般长度21个核苷酸，可以特异地遗传改造以负调控单个或多个目的基因的基因表达。植物微小RNA靶标选择的决定因素在本领域公知。已经定义了靶标识别的经验参数，并且可用来辅助设计特异性amiRNA(Schwab等,(2005)Dev Cell 8:517-527,2005)。设计和生成amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的(Schwab等,(2006)Plant Cell 18(5):1121-1133,2006)。
为优化性能，用来减小植物中内源基因表达的基因沉默技术需要应用来自单子叶植物的核酸序列转化单子叶植物，而使用来自双子叶植物的核酸序列转化双子叶植物。优选，将来自任何给定植物物种的核酸序列引入到相同物种中。例如，来自稻的核酸序列转化到稻植物中。然而，待引入的核酸序列来源于与其待引入的植物相同的植物物种并非是绝对必需的。内源靶基因与待引入的核酸之间基本上同源就足够了。
上文描述了减小或基本上消除植物中内源基因表达的多种方法的实例。本领域技术人员将能够容易地调整上述沉默方法，以便例如通过应用适当的启动子而实现内源基因在整株植物或其部分中的表达减小。
转化
本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可用于和最适于待转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。
外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用若干转化方法的任一种向适当的祖先细胞引入目的基因。可以利用公开的转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和微粒轰击。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等,(1882)Nature 296,72-74;Negrutiu I.等,(1987)Plant Mol.Biol.8:363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等,(1985)Bio/Technol 3,1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等,(1986)Mol.Gen Genet 202:179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等,(1987)Nature 327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。优选通过农杆菌介导的转化，产生转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化法是植物原位转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。已经证明，根据本发明尤为有利的是使转化的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括公知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开内容并入本文作为参考，如同充分阐述的那样。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,在Transgenic Plants,卷1,Engineeringand Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如模式植物，像拟南芥属植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范围内不视为作物植物)；或者作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤的叶子或切碎的叶子浸在农杆菌溶液中，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化由例如，
Figure BDA00002415954700331
和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877中描述，或者尤其可以参见F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页。
除了转化体细胞（其之后不得不再生为完整植株），还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例的植物被转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).Mol Gen Genet208:274-289;Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和J Shell编辑Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。然而，特别有效的方法是改良的真空浸润法，如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空浸润，减压下用农杆菌悬液处理完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[Nature Biotechnology 22(2),225-229]系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology.Trends Biotechnol.21，20-28给出。最近报道了其它生物技术进步，无标记的质体转化体，这可通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,Nature Biotechnology 22(2),225-229)。
遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者
Figure BDA00002415954700341
和Willmitzer的出版物。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，接着使转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与未转化的植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能性方案是在使用合适的选择剂的琼脂板上生长种子（酌情在灭菌后），从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对可选择标记例如上文所述标记的存在，筛选转化的植物。
DNA转移和再生之后，还可例如用Southern分析(DNA印迹)，评价推定转化的植物，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所公知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以呈多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞已转化而含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。
在整个本申请中，转化了(或可以互换地，被转化了)构建体或核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞，应被理解为表示：由于通过生物技术手段引入了所述构建体或所述核酸，而携带所述构建体或所述核酸作为转基因的植物、植物部分、种子或植物细胞。该植物、植物部分、种子或植物细胞由此包含所述重组构建体或所述重组核酸。在之前的引入过后不再包含所述重组构建体或所述重组核酸的任何植物、植物部分、种子或植物细胞称为无效分离子、无效合子或无效对照，且不被视为在本申请含义之内的转化了所述构建体或所述核酸的植物、植物部分、种子或植物细胞。
T-DNA激活标记
T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将T-DNA[通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)]插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb处，从而在构型上使启动子能够指导靶基因的表达。通常破坏天然启动子对靶基因表达的调控，而使基因落入新引入的启动子的控制下。启动子一般包含于T-DNA中。此T-DNA可以例如通过农杆菌感染而随机插入植物基因组中，并导致所插入T-DNA附近的基因的表达被修饰。得到的转基因植物由于位于引入的启动子附近的基因的修饰表达而表现出显性表型。
TILLING
术语“TILLING”为“靶向诱导的基因组局部损伤”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的缩写，是一种用于生成和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以在强度、位置或时间(例如，如果突变影响启动子的话)上呈现出修饰的表达。这些突变变体可以比其天然形式基因呈现更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C,(1992)In Methods in Arabidopsis Research,Koncz C,Chua NH,Schell J编辑,新加坡,World Scientific Publishing Co,第16-82页;Feldmann等,(1994)In Meyerowitz EM,Somerville CR编辑,Arabidopsis.冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,第137-172页;Lightner J和Caspar T,(1998)InJ Martinez-Zapater,J Salinas编辑,Methods on Molecular Biology,82卷Humana Press,Totowa,NJ,第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中合并物中存在的杂双链体在色谱图上检测为额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域公知的(McCallum等(2002)Nat Biotechnol 18:455-457,由Stemple综述(2004)NatRev Genet 5(2):145-50)。
同源重组
同源重组允许向基因组中的规定选定位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规用于低等生物体如酵母或剑叶藓（physcomitrella）的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10):3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2):132-8)，并且存在无论靶生物种类的通常可应用的方法(Miller等,Nature Biotechnol.25,778-785,2007)。
产量相关性状
产量相关性状包括如下中的一或多种：产量、生物量、种子产量、早期活力、绿度指数、增加的生长速率、改善的农艺性状（例如，提高的水利用效率(WUE)、氮利用效率(NUE)等)。
产量
术语“产量”通常表示具有经济价值的可测量产出，其一般是与规定的作物、面积和时期相关的。各植物部分可以基于其数量、大小和/或重量对产量直接做出贡献，或者实际产量是年作物每平方米的产量，用总产量（既包括收获的产量也包括估定的产量）除以种植的平方米来确定。术语植物的“产量”可以与该植物的营养性生物质（根和/或枝条生物质）、与繁殖器官、和/或与繁殖体(例如种子)相关。
以玉米为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面：每平方米建植的植物数的增加、每株植物的穗(ear)数的增加、行数、行粒数、粒重、千粒重、穗长度/直径的增加、种子饱满率(为充实的种子数除以种子的总数并乘以100)的增加，等等。以稻为例，产量增加可以表现为如下一个或多个方面的增加：每平方米的植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每圆锥花序的小穗数、每圆锥花序的花朵（小花）数、种子饱满率(为充实的种子数除以种子的总数并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。在稻中，耐淹性也可以导致增加的产量。
早期活力
“早期活力”是指活跃健康充分均衡的生长（特别是在植物生长的早期阶段），其可以因植物健康(fitness)增强引起，例如，由于植物更好地适应其环境(即，优化能源资源的利用以及在枝条和根之间的分配)引起。具有早期活力的植物也显示出增加的幼苗存活和更佳的作物齐苗，这往往产生高均匀度的田地(作物以齐整的方式生长，即大多数植物基本上同时达到各发育阶段)，以及往往是更优更高的产量。因此，早期活力可以通过测量多种因素来确定，如千粒重、萌发率、出苗率、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝条生物量，等等。
增加的生长速率
增加的生长速率可以特异于植物的一个或多个部分(包括种子)，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为指，从成熟干种子生长至植物已经产生类似于起始材料的成熟干种子的阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如萌发速度、早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段，或者发生在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比原可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许再次播种同种植物物种的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着再次播种和收获稻类植物)。与此类似，如果生长速率充分地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种和收获玉米植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其它适宜的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一砧木收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每平方米年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获的次数增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还允许在更广阔的地域栽培转基因植物，这是因为种植作物的地域限制常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，就可以避免这类不利条件。可以通过自生长曲线获得多种参数，确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50%所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90%所需的时间)等等。
胁迫抗性
相对于对照植物，产量和/或生长速率的增加可以发生在植物处于非胁迫条件下或发生在植物暴露于各种胁迫的情况下。通常植物通过更加缓慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长且丧失重新开始生长的能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致受胁迫植物的生长，与非胁迫条件下的对照植物相比，下降不到40%、35%、30%或25%、更优选下降不到20%或15%。由于农业实践(灌溉、施肥、农药处理)的发展，栽培的作物植物往往并不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱发的受损的生长通常成为农业中不期望的性质。轻度胁迫是植物接触的日常的生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或冰冻温度而引起。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其是由于干旱)引起的渗透胁迫、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫。生物胁迫通常是由病原体，例如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫，引起的那些胁迫。
本发明的方法尤其可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下进行，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。如Wang等(Planta(2003)218:1-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子的变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱发生长和细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫和高盐度胁迫之间存在着的特别高程度的“交叉对话”。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传递通路和细胞应答，如应激蛋白的产生、抗氧化剂的上调、可混溶溶质的累积以及生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员知道给定位置的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件（在非胁迫条件下生长）的植物通常按照递增的优选次序产生这样的植物在给定的环境中的平均产量的至少97%、95%、92%、90%、87%、85%、83%、80%、77%或75%。可基于收获和/或季节，计算平均产量。本领域技术人员将知晓作物的平均产量产出。
养分缺乏可以因诸如氮、磷酸及其它含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼等养分的缺乏所致。
术语盐胁迫不局限于氯化钠(NaCl)，而可以是如下之任一种或多种：NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等等。
增加/提高/增强
术语“增加”、“提高”或“增强”可互换，且在本申请意义上表示与文中所定义的对照植物相比，产量和/或生长多出至少3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%，优选至少15%或20%，更优选25%、30%、35%或40%。
根
如本文中所用，术语根涵盖植物的所有“地面之下”或“地下”部分，其起着支持、从周围土壤中吸取矿物质和水分、和/或储存营养物质的作用。根包括球根、球茎、块茎、块根、根状茎和肉质根。增加的根产量可以表现为以下之一或多个方面：根生物量(总重)的增加，其可以基于个体和/或每株和/或每平方米；增加的收获指数，其表示为可收获部分(例如根)的产量除以总生物量的比率。
根产量的增加也可以表现为根大小和/或根体积上的增加。此外，增加的根产量也可以表现为根面积和/或根长和/或根宽和/或根周长上的增加。增加的产量也可以导致改变的构造，或可以因改变的构造而发生。
种子产量
增加的种子产量自身可表现为如下一项或多项：a)种子生物量(种子总重量)的增加，这可以是基于单粒种子和/或每植株和/或每平方米的增加；b)每植株花数的增加；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表达为饱满种子数与种子总数的比率)；e)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产量除以总生物量的比率；f)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且也可来自胚和/或胚乳大小的增加。
种子产量的增加也可表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加自身也可表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以导致改变的构造，或可以因改变的构造而发生。
绿度指数
如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿值相对于红值之比(在RGB模型中用于色度编码)。绿度指数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、在养分可利用度下降的生长条件下，在开花前的末次成像中测量植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物绿度指数。
生物量
如本文中所用，术语“生物量”意指植物的总重量。在生物量的定义范围内，可以区分植物的一个或多个部分的生物量，其可以包括以下之任一或多个：
-地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；
-地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等；
-地下部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；
-地下可收获部分，例如但不限于，块茎、球茎、根生物量等；
-部分地伸入土壤或与土壤接触的可收获部分，例如但不限于，甜菜根和其它的植物下胚轴区域、根茎、匍匐枝或匍匐茎。
-营养体生物量，例如根生物量、枝条生物量等；
-生殖器官；和
-繁殖体，例如种子。
标记辅助育种
这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变异；可选的，此类程序可以起始于一系列无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体。然后通过例如PCR进行等位基因变体的鉴定。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，该变体提供增加的产量。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括使经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。
在（遗传作图）中用作探针
利用编码目的蛋白质的核酸进行基因的遗传和物理作图仅需要长度至少15个核苷酸的核酸序列。此类核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可以用编码目的蛋白质的核酸探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆：实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1:174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。另外，可以使用所述核酸探测含有一组如下个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述该组个体为规定的遗传杂交的亲本和子代。记录DNA多态性的分离，并用于计算编码目的蛋白质的核酸在先前用此群体所获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。
有关在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和使用，描述于Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4:37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行的遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员公知的。
核酸探针也可以用来进行物理作图(即在物理图谱上安置序列；参见Hoheisel等In:Non-mammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academic press 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个kb到几百个kb；参见Laan等(1995)Genome Res.5:13-20)，但是灵敏性的提高可以允许在FISH作图中应用较短的探针。
用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸序列进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸的序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员公知的。在采用基于PCR的遗传作图的方法中，可能需要鉴定作图杂交的亲本之间在相应于本发明核酸序列的区域中的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
植物
本文所用术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根（包括块茎）、花以及组织和器官，其中上述每一种都含有目的基因/核酸。术语“植物”也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都含有目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自包括如下的列表：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍茎剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、簕竹属物种(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(如欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica rapassp.)[芸苔、油菜籽油菜、芜菁])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、Ceiba pentandra、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可拉属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草（Eragrostis tef）、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、地杨梅(Luzula sylvatica)、番茄属物种(Lycopersicon spp.)(如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、苹果属物种(Malus spp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihotspp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)(如稻(Oryzasativa),阔叶稻(Oryza latifolia))、黍糜(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番柿(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、鸭茅状磨擦禾（Tripsacumdactyloides）、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(如小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)、一粒小麦（Triticum monococcum）或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、旱金莲(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
关于本发明的序列，植物来源的核酸或多肽序列分别具有如下的特征：为在植物中表达而优化的密码子使用，和使用在植物中常见的氨基酸和调节位点。来源植物可以是任何植物，但优选在前面段落中描述的那些植物。
对照植物
选择适宜的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物一般与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子。无效合子(也称为无效对照植物)是因分离而失去转基因的个体。此外，对照植物一直生长在与本发明植物生长条件相同的生长条件下。典型地，对照植物在相同的生长条件下并因此在本发明植物附近并在同一时间生长。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且还指植物部分，包括种子和种子部分。在允许与根据本发明生产的植物进行比较的条件下评估对照植物的表型或性状，例如，对照植物和根据本发明的方法生产的植物在相似，优选相同的条件下生长。
发明详述
现已发现，在植物中调节编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸的表达，可以产生相对于对照植物具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。根据第一实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物产量的方法，包括调节邻氨基苯甲酸合成酶(AS)在植物中的活性。此外，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物产量和/或产量相关性状的方法，其中所述方法包括以重组构建体转化植物来增加邻氨基苯甲酸合成酶(AS)在植物中的活性或表达，以及任选地选择具有增加的产量和/或增强的产量相关性状的植物。
用于在植物中调节邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的表达和活性的优选方法是引入和表达编码该邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸分子。
下文中对“用于本发明方法的蛋白质”的任何提及，均旨在指如本文中定义的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)。测量邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的活性的测定试验描述于例如Tozawa等(2001,Plant Physiol.126(4):1493-1506):Trp测量，Bernasconi等(1994,Plant Physiol.106(1):353-8):大肠杆菌中蛋白质重组体和AS活性测量，或Niyogi和Fink(1992,Plant Cell.4(6):721-33):大肠杆菌和酵母互补。邻氨基苯甲酸合成酶(AS)催化分支酸转变为邻氨基苯甲酸，这是色氨酸路径的第一步(Romero等1995,Phytochemistry.39(2):263-76)。可选地，AS也能催化分支酸转变为4-氨基-4-脱氧分支酸，后者是叶酸生物合成中的前体(Basset等(2004)PNAS.101(6):1496-501)。
优选地，如本文中所定义的本发明的“邻氨基苯甲酸合成酶(AS)”(即“POI多肽”)指邻氨基苯甲酸合成酶(AS)α亚基，更优选地其来自杨树(Poplar)。优选地，其属于与Tozawa等(2001,Plant Physiol.126(4):1493-1506)和Morino等(2005,Plant Cell Physiol.46(3):514-521)中所描述的ASA1相同的亚家族，该亚家族被报道包含叶绿体信号肽(Niyogi和Fink,1992.Plant Cell.4(6):721-33;Romero等1995.Phytochemistry.39(2):263-76)。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽包含叶绿体信号肽。
下文中对“用于本发明方法的核酸”的任何提及，均旨在指能够编码该邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸。待引入植物中（并因此可以用于实施本发明方法）的核酸是编码现将进行描述的此类蛋白质的任何核酸，在下文中也称为“POI核酸”或“POI基因”。
优选地，如本文中定义的本发明的“邻氨基苯甲酸合成酶(AS)”(即“POI多肽”)指包含这样的氨基酸序列的任何多肽，所述氨基酸序列包含短结构域PF04715(邻氨基苯甲酸合成酶结构域I，位于其N末端中)或PF00425(分支酸结合结构域，位于其C末端中)的至少一个。
在优选的实施方案中，氨基酸序列包含PF04715(位于其N末端中的邻氨基苯甲酸合成酶结构域I)和PF00425(位于其C末端中的分支酸结合结构域)中的至少一个，更优选至少两者都包含。
此外，如本文中定义的本发明的“邻氨基苯甲酸合成酶(AS)”(即“POI多肽”)指：包含这样的氨基酸序列的任何多肽，所述氨基酸序列包含结构域例如PF04715(位于其N末端中的邻氨基苯甲酸合成酶结构域I)和/或PF00425(位于其C末端中的分支酸结合结构域)，和/或所述氨基酸序列包含SEQ ID NO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52中所示多肽序列之任一，及其同源物(如本文中所描述的)；或指由包含SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51中所示核酸分子的多核苷酸编码的多肽、及其同源物(如本文中所描述的)，和/或包含基序1至8、优选4至8、和更优选6至8之任一的至少一个。
优选地，邻氨基苯甲酸合成酶(AS)包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含短结构域例如PF04715(位于其N末端中的邻氨基苯甲酸合成酶结构域I)和/或PF00425(位于其C末端中的分支酸结合结构域)，和所述氨基酸序列与SEQ ID NO.:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52中所示多肽序列之任一、或与由包含SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51中所示核酸分子的多核苷酸编码的多肽具有35%或更高的同一性，以及更优选还包含基序1至8、优选4至8、和更优选6至8之任一的至少一个。
在一个实施方案中，邻氨基苯甲酸合成酶(AS)被表征为包含下列MEME基序之一或多个：
基序1(SEQ ID NO:56)：
EK[QE]CAE[HN][IVL]M[LI]VDL[GL]RND[VL]G[KR]V
基序2(SEQ ID NO:57)：
P[FL]E[VL]YRALR[IV]VNP[SA]PY[MA][AI]YLQ
基序3(SEQ ID NO:58)：
[VM][ST]GAPKV[RK]AME[LI][IL]DELE
更优选，邻氨基苯甲酸合成酶(AS)被表征为包含下列亚类MEME基序之一或多个：
基序4(SEQ ID NO:59)：
KEHILAGDIFQIVLSQRFERRTFADPFE[VI]YRALR[IV]VNPSPYM[AT]YLQARGC
基序5(SEQ ID NO:60)：
FCGGWVG[FY]FSYDTVRYVEK[KR]KLPFS[KN]APEDDRNLPD[VI]HLGLYDDV[IL]VFDH
基序6(SEQ ID NO:61)：
LMN[IV]ERYSHVMHISSTV[TS]GEL
基序7(SEQ ID NO:62)：
KEHI[LQ]AGDIFQIVLSQRFERRTFADPFE[VI]YRALR[IV]VNPSPYM[AT]YLQARGC
基序8(SEQ ID NO:63)：
FCGGWVG[FY]FSYDTVRY[TV]EK[KR]KLPFS[KRN]AP[KE]DDRNLPD[/I]HLGLYDDV[IL]VFDH
基序1至6使用MEME算法(Bailey和Elkan,第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings of the Second International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology),第28-36页,AAAI Press,Menlo Park,CalIFifoia,1994.)推导出来。在MEME基序中的每个位置上，显示在查询组序列中以高于0.2的频率存在的残基。基序7和8通过手工推导出来。方括号中的残基代表可选残基。
更优选地，用于本发明方法的多肽包含这8个基序的至少一个。在一个优选实施方案中，AS多肽包含选自基序7、基序8和基序6的一个或多个基序。优选地，AS多肽包含基序7和8、或基序8和6、或基序7和6、或基序7、8和6。
此外，本发明涉及POI多肽的同源物及其在本发明方法中的使用。POI多肽的同源物，按照递增的优选次序，与SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列、和/或与SEQ ID NO.:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52中显示的其直向同源物和旁系同源物表示的氨基酸序列，具有至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的全序列同一性，优选地条件是同源蛋白包含上文所列的基序或结构域之任一或多个。可以使用全局比对算法，例如程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选利用缺省参数和优选利用成熟蛋白质的序列（即，不考虑分泌信号或转运肽），确定全序列同一性。
在一个实施方案中，通过在SEQ ID NO:2的全长序列上进行多肽序列的比较，确定序列同一性水平。
在另一个实施方案中，通过在SEQ ID NO:1的序列的全长编码序列上进行核酸序列的比较，确定核酸序列的序列同一性水平。
与全序列同一性相比，当只考虑保守结构域或基序时，序列同一性通常更高。优选地，POI多肽中的基序按照递增的优选次序与基序1至8、优选4至8、和更优选6至8之任一或多个具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
术语“结构域”、“标签”和“基序”在本文中“定义”部分中进行了定义。
在一个实施方案中，用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品中的AS多肽是邻氨基苯甲酸合成酶，但是排除具有以下公开序列的邻氨基苯甲酸合成酶：
i.Uniprot数据库的数据库条目B9HSQ4(截止于2011年3月2日，2011_02发布,http://www.uniprot.org)、或截止于2011年3月2日的NCBI美国国家生物技术信息中心的数据库条目XP_002316223.1；或
ii.国际专利申请WO 03/092363的SEQ ID NOs:104或108；或
iii.美国专利申请US 2004/031072的SEQ ID NO:46407或189249；或
iv.国际专利申请WO 03/000906的SEQ ID NO:785或786；或
v.国际专利申请WO 03/008540的SEQ ID NO:8670或9055。
优选地，所述多肽序列，当用于构建系统发生树，例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的组而非与任何其它组聚类。
此外，一般将POI多肽(至少以其天然形式)描述为邻氨基苯甲酸合成酶(AS)。SEQ ID NO.:1编码毛果杨(Populus trichocarpa)的邻氨基苯甲酸合成酶(AS)。
当例如根据如实施例6和7中所列的本发明方法在植物中表达时，POI多肽在表达或在活性上的增加，导致植物相对于对照植物具有增加的产量，特别是种子产量(其通过种子总重和/或种子数量度)、和改善的产量相关性状(特别是枝条和/或根生物量)。
本发明以编码SEQ ID NO:2的多肽序列的SEQ ID NO:1所示核酸序列转化植物来进行举例说明。然而，本发明的实施并不局限于这些序列；本发明的方法可以有利地利用本文所定义的任何POI编码核酸或POI多肽来实施，例如表A所列出的，序列表中SEQ ID NO.:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52所示的多肽，以及它们的同源物、直向同源物或旁系同源物。
编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸的实例在本文实施例部分表A中给出。这些核酸可用于实施本发明的方法。实施例部分表A所给出的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的POI多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，其中术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文所定义。其它的直向同源物和旁系同源物可以通过进行如定义部分所述的所谓交互BLAST搜索，容易地鉴定；在查询序列为例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的情况下，二次BLAST(back-BLAST)将针对该原始序列的数据库(例如杨树数据库)进行。
本发明还提供了迄今未知的POI编码核酸分子和POI多肽，其可以用于赋予植物相对于对照植物增强的产量相关性状。
根据本发明的另一个实施方案，由此提供了分离的核酸分子，其选自：
(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51(之任一)所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51(之任一)所示的核酸的互补序列；
(iii)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52(之任一)所示的多肽的编码核酸，优选地由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52(之任一)所示的多肽序列得出，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51的任何核酸序列具有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状，的核酸；
(v)在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子杂交并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子；
(vi)编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸，所述AS按照递增的优选次序与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52和表A中任何其它氨基酸序列（之任一）所示的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和优选赋予相对于对照植物增加的产量，例如增加的种子总重和/或增加的种子总数，或增强产量相关性状，例如增加的枝条和/或根生物量。
根据本发明的另一个实施方案，提供了分离的多肽，其选自：
(i)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的氨基酸序列；
(ii)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52和表A中任何其它氨基酸序列（之任一）所示的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状，的氨基酸序列；
(iii)上文(i)或(ii)所给出的任何氨基酸序列的衍生物；或
(iv)本发明的核酸所编码的氨基酸序列。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及表达构建体，所述表达构建体包含本发明的核酸分子或赋予本发明的POI多肽表达。
核酸变体也可用于实施本发明的方法。这类变体的实例包括编码实施例部分表A中给出的任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，其中“同源物”和“衍生物”如本文所定义。同样可用于本发明方法的有，编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本发明方法的同源物和衍生物与其源自的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物活性和功能活性。可以用于实施本发明方法的其它变体为密码子使用经优化或miRNA靶位点被移去的变体。
可用于实施本发明方法的其它核酸变体包括编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸的部分，与编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)的核酸杂交的核酸，编码POI的核酸的剪接变体，编码POI多肽的核酸的等位基因变体，以及通过基因改组获得的编码POI多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪接变体、等位基因变体和基因改组如本文所述。
在本发明的一个实施方案中，本发明核酸序列的功能是，当本发明的核酸序列在活的植物细胞中转录和翻译时，赋予可以增加产量或产量相关性状的蛋白质信息。
编码POI多肽的核酸无需是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸序列的部分、或者编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分，并且所述部分与实施例部分表A给出的氨基酸序列，特别是包含SEQ ID No.:2的多肽，具有基本相同的生物活性。
可以例如，通过对核酸进行一个或多个缺失来制备核酸的“部分”。“部分”可以以分离的形式使用，或者可将其与其它编码(或非编码)序列融合，以便例如，产生组合了几种活性的蛋白质。当与其它编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比针对该蛋白质部分预测的大小要大。
可用于本发明方法的“部分”编码如本文所定义的POI多肽，并与实施例部分表A所给出的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。优选“部分”是实施例部分表A所给出的任一核酸的部分，或是编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的部分。优选“部分”为至少100、200、300、400、500、550、600、700、800或900个连续核苷酸长度，该连续核苷酸来自实施例部分表A所给出的任一核酸序列、或编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。优选“部分”是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51的核酸的部分。最优选“部分”是SEQ ID NO:1的核酸的部分。优选“部分”编码氨基酸序列的片段，当将其用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，其与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，和/或其包含基序1至8、优选4至8、和更优选6至8之任一或多个，和/或具有HRGP的生物学活性，和/或包含本发明的核酸分子，例如与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，“部分”编码氨基酸序列的片段，当将其用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，其与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，且其包含基序1或2之任一或多个，并具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。
可以用于本发明方法的另一核酸变体是这样的核酸，所述核酸能够在降低的严紧条件下，优选在严紧条件下与编码本文中定义的POI多肽的核酸、或者与本文中定义的“部分”杂交。
根据本发明，提供了在植物中增加产量和增强产量相关性状的方法，包括向植物中引入和表达能够与实施例部分表A所给出的任一核酸杂交的核酸，或包括向植物中引入和表达能够与编码实施例部分表A所给出的任何核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交的核酸。
用于本发明方法的杂交序列编码本文中定义的POI多肽，所述多肽与实施例部分表A所给出的氨基酸序列、特别是包含SEQ ID No.:2的多肽具有基本上相同的生物活性。优选，杂交序列能够与实施例部分表A所给出的任一核酸的互补序列杂交，或与这些序列之任一的部分杂交，其中“部分”如上文所定义，或者所述杂交序列能够与编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选，所述杂交序列能够与SEQ ID NO:1所示的核酸的互补序列或与其部分杂交。在一个实施方案中，杂交序列能够在中等或高严紧、优选以上定义的高严紧条件下，与SEQ ID NO:1所示的核酸的互补序列或其部分杂交。在另一个实施方案中，杂交序列能够在严紧条件下与SEQ ID NO:1所示的核酸的互补序列杂交。
优选，所述杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列，当全长用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，和/或包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8，之任一或多个，和/或具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，并包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，和具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，且与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。
可以用于本发明方法的另一核酸变体是编码上文中定义的POI多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸序列的剪接变体、或编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选剪接变体是如SEQ ID NO:1所示的核酸的剪接变体、或编码SEQID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选，由所述剪接变体编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，其与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，和/或包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，和/或具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，剪接变体编码氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列，当将其用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，并包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。
可用于本发明方法的另一核酸变体为编码前文所定义的POI多肽的核酸的等位基因变体，等位基因变体如本文所定义。
根据本发明，提供了增强植物产量相关性状的方法，包括在植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸的等位基因变体，或包括在植物中引入和表达编码实施例部分表A所给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因变体。
由可用于本发明方法的等位基因变体编码的多肽与SEQ ID NO:2的POI多肽及实施例部分表A中描述的任何氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:2的POI多肽，具有基本上相同的生物活性。等位基因变体天然存在，并且对这些天然等位基因的应用包含于本发明的方法中。优选，等位基因变体为SEQ ID NO:1的等位基因变体，或编码SEQ ID NO:2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位基因变体。优选，由等位基因变体编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，和/或包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，和/或具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，等位基因变体编码氨基酸序列，所述氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，并包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。
基因改组或定向进化也可用于产生编码上文所定义的POI多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文所定义。
根据本发明，提供了用于在植物中增加产量和增强产量相关性状的方法，包括向植物中引入和表达实施例部分表A所给出的任一核酸序列的变体，或包括向植物中引入和表达编码实施例部分表A所给出的任何氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的变体，其中所述变体核酸通过基因改组获得。
优选，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，和/或包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，和/或具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和/或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52具有至少50%的序列同一性，或是其直向同源物或旁系同源物。例如，变体核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列，当用于构建系统发生树例如图1中描述的系统发生树时，与包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的POI多肽的组而非与任何其它组聚类，并包含基序1-8，优选4-8，更优选6-8之任一或多个，和具有邻氨基苯甲酸合成酶(AS)生物学活性，和与SEQ ID NO:2具有至少50%的序列同一性。
此外，还可利用定点诱变获得核酸变体。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编辑)。
编码POI多肽的核酸可以源自任何天然或人工来源。该核酸可以通过有意的人为操作而在组成和/或基因组环境上不同于其天然形式。优选，编码POI多肽的核酸来自表A中所示的生物，例如来自植物。
与SEQ ID NO:2的序列相异一个或几个氨基酸的POI多肽可以用于本发明的方法、构建体和植物中增加植物的产量。
在另一个实施方案中，本发明延及重组染色体DNA，其包含可以用于本发明的核酸序列，其中所述核酸由于重组方法而存在于该染色体DNA中，即所述核酸在其天然环境中并不位于该染色体DNA中。所述重组染色体DNA可以是通过重组手段插入了所述核酸的天然来源的染色体，或其可以是微型染色体或非天然的染色体结构，例如，或者是人工染色体。染色体DNA的性质可以不同，只要其允许用于本发明的重组核酸稳定传递到后继世代，和允许所述核酸在活的植物细胞中表达而导致植物细胞或包含植物细胞的植物具有增加的产量或增加的产量相关性状。
在另一个实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。
本发明方法的实施产生具有提高的产量和增强的产量相关性状的植物。特别是，本发明方法的实施产生相对于照植物具有增加的产量，特别是增加的种子总重和/或种子总数和/或增加的枝条和/或根生物量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文“定义”部分有更详细的说明。
本文中提及增强的产量相关性状，旨在表示植物的早期活力和/或一个或多个部分的生物量（重量）的增加，所述部分可以包括地上（可收获的）部分和/或地下（可收获的）部分。特别是，该可收获部分是种子和/或根，并且本发明方法的实施导致相对于对照植物具有增加的种子饱满率、根和枝条生物量的植物。
本发明提供了用于与无效对照植物相比增加产量，特别是种子产量(通过总种子重量和/或种子数量测定)，和相对于对照植物提高产量相关性状（特别是枝条生物量）的方法，所述方法包括调节，优选增加POI多肽在植物中的表达或活性，例如，调节或增加编码本文所定义的POI多肽的核酸在植物中的表达。
由于根据本发明的转基因植物具有增加的产量，例如种子产量(例如总种子重量和/或种子总数)、和/或相关性状(例如根和/或枝条生物量)，故而，相对于对照植物在其生命周期的相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。
根据本发明优选的方面，实施本发明方法产生相对于对照植物具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节编码本文所定义的POI多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明方法，可以产生在干旱条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在干旱条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码POI多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明方法，可以产生在非胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码POI多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明方法，可以产生在营养缺乏条件，特别是在缺氮条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码POI多肽的核酸在植物中的表达。
实施本发明方法，可以产生在盐胁迫条件下生长时相对于在相当条件下生长的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明，提供了用于在盐胁迫条件下生长的植物中增加产量的方法，所述方法包括调节编码POI多肽的核酸在植物中的表达。
本发明还提供遗传构建体和载体，以利于编码POI多肽的核酸在植物中的引入和/或表达。可以将基因构建体插入适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体（可商购获得）中。本发明还提供了如本文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更特别地，本发明提供这样的构建体，其含有：
(a)编码如上文所定义的POI多肽的核酸；
(b)一个或多个能够驱动(a)中核酸序列表达的控制序列；和任选
(c)转录终止序列。
优选地，编码POI多肽的核酸如以上所定义。术语“控制序列”和“终止序列”如本文所定义。
此外，本发明提供转化了上述构建体的植物。特别是，本发明提供转化了上述构建体的植物，所述植物具有如本文所述增强的产量和/或增加的产量相关性状。
可以使用含有任何上述核酸的载体转化植物。技术人员充分知晓载体中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择和繁殖含目的序列的宿主细胞。在本发明的载体中，目的序列将有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。
在一个实施方案中，以包含上述任何核酸的表达盒转化本发明的植物。技术人员充分知晓表达盒中必须存在的遗传元件，以便成功进行转化、选择和繁殖含目的序列的宿主细胞。在本发明的表达盒中，目的序列将有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。在这样的表达盒中的启动子可以是对于上述核酸非天然的启动子，即在其天然环境中不调节所述核酸表达的启动子。
在另一个实施方案中，本发明的表达盒，当将它们引入到活的植物细胞中并导致包含在表达盒中的如以上所定义的核酸表达时，赋予所述活的植物细胞增加的产量或产量相关性状。
本发明的表达盒可以包含在宿主细胞、植物细胞、种子、农产品或植物中。
有利地，可以使用任何类型的启动子，无论是天然的或合成的，来驱动核酸序列的表达，但优选启动子是植物来源的。组成型启动子在本发明方法中特别有用。优选组成型启动子是中等强度的遍在组成型启动子。有关各种启动子类型的定义，参见本文中“定义”部分。也可用于本发明方法的是根特异性启动子。一般，“中等强度启动子”表示以低于强启动子的水平，尤其是以在所有情况下都低于在35S CaMV启动子控制下获得的水平的水平，驱动编码序列表达的启动子。
应当清楚，本发明的实施并不局限于SEQ ID NO:1所示的POI多肽编码核酸，而且本发明的实施也不局限于由组成型启动子驱动或由根特异性启动子驱动的POI多肽编码核酸的表达。
组成型启动子优选是中等强度的启动子，更优选选自植物来源的启动子，例如植物染色体来源的启动子，例如GOS2启动子，更优选来自稻的GOS2启动子。GOS2启动子有时被称为PRO129或PRO0129启动子。更优选组成型启动子为与SEQ ID NO:53基本上相似的核酸序列，最优选组成型启动子如SEQ ID NO:53所示。有关组成型启动子的其它实例，参见本文中“定义”部分。
任选的，可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选，构建体包含表达盒，所述表达盒包含GOS2启动子和编码POI多肽的核酸。此外，在引入植物的构建体中可以存在一个或多个编码选择标记的序列。
根据本发明的优选方面，调节的表达是编码POI多肽的核酸分子的增加的表达或活性，例如过量表达，所述核酸分子例如编码SEQ ID NO.:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51或其旁系同源物或直向同源物（例如表A中所显示的）的核酸分子。增加核酸或基因的表达或基因产物的方法在本领域有充分的文献记载，并且实例在“定义”部分提供。
如上文所述，调节编码POI多肽的核酸表达的一个优选方法是，在植物中引入和表达编码POI多肽的核酸；然而，实施所述方法的效果，即增加产量和改善产量相关性状，也可以利用其他众所周知的技术实现，包括但不限于：T-DNA激活标记、TILLING、同源重组。这些技术的说明在“定义”部分提供。
本发明还提供了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达编码如前文所定义的POI多肽的任何核酸。
更特别地，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物与无效对照植物相比较具有增强的产量相关性状，特别是增加的种子产量、种子饱满率、根和枝条生物量，所述方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入和表达POI多肽编码核酸或包含POI多肽编码核酸的遗传构建体；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
(i)中的核酸可以是能够编码如本文所定义的POI多肽的任何核酸。
可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入植物的组织、器官或任何其它部分)。根据本发明优选的方面，优选通过转化将核酸引入植物。术语“转化”在本文“定义”部分有更详细的说明。
在一个实施方案中，本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞、或植物，以及其所有的植物部分及繁殖体。本发明包括可由根据本发明的方法获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分含有编码如上文所定义的POI多肽的核酸转基因。本发明还延及由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与根据本发明方法所产生的亲本呈现相同的基因型和/或表型特征。
在另一个实施方案中，本发明还延及到包含存在于植物表达盒或植物表达构建体中的本发明核酸分子的转基因植物细胞和种子。
在另一个实施方案中，本发明的种子以重组的方式包含本发明的表达盒、本发明的(表达)构建体、上述核酸和/或由上述核酸编码的蛋白质。
本发明的另一个实施方案延及到包含存在于重组植物表达盒中的上述核酸的植物细胞。
在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是非繁殖细胞，例如，不能使用标准细胞培养技术从该细胞再生整个植物，所述标准的细胞培养技术意思是细胞培养方法，但不包括体外核、细胞器或染色体转移方法。尽管植物细胞通常具有全能性的特性，一些植物细胞不能被用于从所述细胞再生或繁殖完整的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是那样的细胞。
在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是这样的植物细胞，它们不能通过光合作用从诸如水、二氧化碳和矿物盐等无机物合成碳水化合物和蛋白质来维持其自身，即它们可以被认为是非植物品种。在另一个实施方案中，本发明的植物细胞是非植物品种和非繁殖材料。
本发明也包括包含编码上文所定义的POI多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是选自细菌细胞的任何细胞，例如大肠杆菌(E.coli)或农杆菌属(Agrobacterium)物种细胞，酵母细胞，真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞。在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞是植物细胞。对于在根据本发明方法中使用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体，宿主植物原则上有利地为能够合成用于本发明方法的多肽的所有植物。
在一个实施方案中，本发明的植物细胞过量表达本发明的核酸分子。
本发明还包括用于生产产品的方法，包括a)生长本发明的植物，和b)从或由本发明的植物或这些植物的部分(包括种子)生产所述产品。在另一个实施方案中，所述方法包括步骤a)生长本发明的植物，b)从植物采取如以上所定义的可收获部分，和c)从或由本发明的可收获部分生产所述产品。
这样的方法的实例可以是生长本发明的玉米植物，收获玉米棒并摘取籽粒。它们可以用作饲料或加工成淀粉和油作为农产品。
可以在植物生长的地点生产产品，或可以将植物或其部分从植物生长的地点运走以生产产品。典型地，生长植物，从植物上采集所需的可收获部分（如果可行的话以重复的方式），和从植物的可收获部分生产产品。在每次执行本发明的方法时生长植物的步骤可以只进行一次，而允许重复多次生产产品的步骤，例如反复采摘本发明植物的可收获部分，和如果需要的话，进一步加工这些部分，以获得产品。也可以重复生长本发明植物的步骤，储存植物或可收获部分，对积累的植物或植物部分一次性进行产品的生产。也可以在时间上重叠地，甚至在很大程度上同时地，或相继地，进行生长植物和生产产品的步骤。一般，在生产产品之前使植物生长一段时间。
本发明的方法有利地比已知的方法更有效，因为本发明的植物与用于可比方法中的对照植物相比较，具有增加的产量和/或对环境胁迫的胁迫耐受性。
在一个实施方案中，通过本发明的所述方法生产的产品是植物产品，例如但不限于食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、纤维、化妆品或药品。食品被视为用于营养或用于增补营养的组合物。特别地，动物饲料和动物饲料添加剂可以被视为食品。
在另一个实施方案中，本发明的该生产方法用来生产农产品，所述农产品例如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等等。
植物产品可以在很大程度上为一种或多种农产品。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸序列或多肽序列包含在农产品中。
在另一个实施方案中，本发明的核酸序列和蛋白质序列可被用作产品标记，例如用于通过本发明方法生产的农产品。这样的标记可以被用来鉴别通过有利方法产生的产品，该方法不仅导致更高的加工效率，而且由于用于加工的植物材料和可收获部分的品质提高而导致产品质量提高。可以通过多种本领域已知的各种方法检测这样的标记，所述方法例如但不限于用于检测核酸的基于PCR的方法、或基于抗体的用于检测蛋白质的方法。
本发明方法有利地适用于任何植物。尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或青贮豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物。作物植物的实例包括大豆、甜菜、糖用甜菜(sugarbeet)、向日葵、双低油菜(canola)、菊苣、胡萝卜、木薯、苜蓿、三叶草(trefoil)、油菜籽、亚麻籽（linseed）、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、裸麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)和燕麦。
在一个实施方案中，用于本发明方法的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜包括双低油菜、甘蔗、糖用甜菜和苜蓿。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的植物和用于本发明方法的植物是糖用甜菜植物，其具有增加的生物量和/或增加的甜菜糖含量。
本发明也延及植物的可收获部分，例如但不限于：种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎。枝条和球茎，所述可收获部分含有编码POI多肽的重组核酸。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分产生（优选直接地产生）的或制备的、优选直接产生的或直接地制备的产品，如干丸(pellets)或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明还包括在增强植物的任一上述产量相关性状中，编码如本文所述的POI多肽的核酸的用途以及这些POI多肽的用途。例如，可以在育种程序中使用编码本文所述的POI多肽的核酸、或所述POI多肽本身，其中鉴定可以与编码POI多肽的基因遗传连锁的DNA标记。可以使用所述核酸/基因或所述POI多肽本身来定义分子标记。接着可以在育种程序中使用此DNA或蛋白质标记，以在本发明方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。此外，编码POI多肽的核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。编码POI多肽的核酸还可以用作探针来对包含其的基因进行遗传和物理作图，以及用作与这些基因连锁的性状的标记。这样的信息可以在植物育种中使用，以培育具有所期望表型的株系。
在一个实施方案中，确定序列同一性百分比的任何比较
-就核酸的比较而言，在SEQ ID NO:1的完整编码区域上进行，或
-就多肽序列的比较而言，在SEQ ID NO:2的全长上进行。
例如，在该实施方案中，50%的序列同一性表示在SEQ ID NO:1的完整编码区上，所有碱基中的50%在SEQ ID NO:1的序列和相关序列之间是相同的。类似地，在该实施方案中，当从SEQ ID NO:2的起始甲硫氨酸开始到序列末端进行比较时，如果在测试多肽中发现SEQ ID NO:2所示序列的氨基酸残基的50%，则多肽序列与SEQ ID NO:2的多肽序列是50%相同的。
在一个实施方案中，用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品的核酸序列是编码POI的序列，但排除编码在以下任何文献中公开的多肽序列的核酸：
vi.Uniprot数据库的数据库条目B9HSQ4(截止于2011年3月2日，Release 2011_02,http://www.uniprot.org)、或截止于2011年3月2日的NCBI美国国家生物技术信息中心的数据库条目XP_002316223.1；或
vii.国际专利申请WO 03/092363的SEQ ID NOs:104或108；或
viii.美国专利申请US 2004/031072的SEQ ID NO:46407或189249；或
ix.国际专利申请WO 03/000906的SEQ ID NO:785或786；或
x.国际专利申请WO 03/008540的SEQ ID NO:8670或9055；
和/或排除选自以下所示核酸序列的核酸：
xi.编码Uniprot数据库的数据库条目B9HSQ4的多肽(截止于2011年3月2日，2011_02发布,http://www.uniprot.org)的核酸、或编码截止于2011年3月2日的NCBI美国国家生物技术信息中心的数据库条目XP_002316223.1的多肽的核酸；或
xii.国际专利申请WO 03/092363的SEQ ID NOs:104或108；或
xiii.美国专利申请US 2004/031072的SEQ ID NO:46407或189249；或
xix.国际专利申请WO 03/000906的SEQ ID NO:785或786；或
xv.国际专利申请WO 03/008540的SEQ ID NO:8670或9055。
在另一个实施方案中，用于本发明方法、构建体、植物、可收获部分和产品的核酸序列是这样的序列，其不是编码选自表A中所列蛋白质的蛋白质的多核苷酸，当进行最优比对时其与编码表A中所列蛋白质的序列具有至少60、70、75、80、85、90、93、95、98或99%的核苷酸同一性。
项目
1.用于相对于对照植物增强植物产量的方法，包括调节多肽在植物中的活性，其中所述多肽包含至少一个PF04715或PF00425结构域。
2.项1的方法，包括调节编码多肽的核酸分子在植物中的表达，其中所述多肽包含PF04715或PF00425结构域中至少一个，优选两者都包括。
3．根据项1或2的方法，其中所述多肽包含以下基序之一或多个：
基序1：EK[QE]CAE[HN][IVL]M[LI]VDL[GL]RN D[VL]G[KR]V
基序2：P[FL]E[VL]YRALR[IV]VNP[SA]PY[M A][AI]YLQ和/或
基序3：[VM][ST]GAPKV[RK]AME[LI][IL]DELE；
优选地，所述多肽包含以下基序之一或多个：
基序4：
EHILAGDIFQIVLSQRFERRTFADPFE[VI]YRALR[IV]VNPSPYM[AT]YLQARGC
基序5：
FCGGWVG[FY]FSYDTVRYVEK[KR]KLPFS[KN]APEDDRNLPD[VI]HLGLYDDV[IL]VF
DH；和/或
基序6：LMN[IV]ERYSHVMHISSTV[TS]GEL.
4．根据项2至3的方法，其中所述经调节的表达通过向植物中引入和表达编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)α亚基的核酸分子来实现。
5．根据项1至3之任一的方法，其中所述多肽由核酸分子编码，所述核酸分子包含选自如下的核酸分子：
(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51（之任一）所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51（之任一）所示的核酸的互补序列；
(iii)编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的多肽的核酸，优选地由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的多肽序列得到，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51的任何核酸序列具有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状，的核酸；
(v)在严格杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子杂交并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子；
(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽按照递增的优选次序与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
6．根据任何前述项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选增加的枝条和/或根生物量和/或种子总数和/或种子总重。
7．根据项1至6之任一的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。
8．根据项1至6之任一的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得所述增强的产量相关性状。
9．构建体，其包含：
(i)编码如项1至8之任一中定义的所述多肽的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
10．根据项9的构建体在制备相对于对照植物具有增加的产量，特别是枝条生物量的方法中的用途。
11．转化了根据项9的构建体或根据项1至8之任一的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物或其部分包含编码如项1至8之任一中定义的所述多肽的重组核酸。
12．用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括：
(i)向植物中引入和表达编码如项1至8之任一中所定义的所述多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
13．根据项11的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条和/或根生物量和/或种子。
14．从根据项11的植物和/或从根据项12的植物的可收获部分产生的产品。
15．编码如项1至8之任一中所定义的多肽的核酸在相对于对照植物增加产量，特别是枝条和/或根生物量和/或种子总数和/或种子总重中的用途。
附图说明
现参考以下附图描述本发明，其中：
图1.AS相关蛋白的系统发生关系：使用MUSCLE(MUSCLE:Edgar(2004),Nucleic Acids Research 32(5):1792-97)比对蛋白质。使用QuickTree1.1(Houwe等(2002).Bioinformatics 18(11):1546-7)计算邻接树。使用Dendroscope2.0.1(Hudson等(2007).Bioinformatics 8(1):460)绘制倾斜的进化树(slanted cladogram)。在e＝1e-40时，找到了所有编码POI多肽同源物的基因。该树使用每个簇的代表性成员生成。该树使用包含8个MEME基序中的至少一个的基因的列表产生。浅灰色阴影标记SEQ IDNO:2的蛋白质的位置。
图2表示多种AS多肽(从2至52的奇数SEQ ID NO:序列)的多重比对。星号表示在多种蛋白质序列中相同的氨基酸，冒号表示高度保守性氨基酸取代，点代表较低保守性氨基酸取代；在其它的位置上没有序列保守性。当使用保守氨基酸时，这些比对可以用于定义其他的基序或标签序列。
图3显示用于在稻GOS2启动子(pGOS2)控制之下增加AS编码核酸在稻(Oryza sativa)中表达的双元载体。
整个本申请中使用了以下缩写：A.dehalogenans:Anaeromyxobacterdehalogenans，Anaeromyxobacter:Anaeromyxobacter sp.(厌氧粘细菌属的种)，Aquilegia:Aquilegia sp(耧斗菜属的种)，A.thaliana:Arabidopsisthaliana(拟南芥)，A.gossypii:Ashybya gossypii(棉阿舒囊霉)，A.fumigatus:Aspergillus fumigatus(烟曲霉)，A.terreus:Aspergillus terreus(土曲霉)，A.anophagefferens:Aureococcus anophagefferens(褐潮藻)，A.caulinodans:Azorhizobium caulinodans(茎瘤固氮根瘤菌)，BAC：Bacteria(细菌)，B.vulgatus:Bacteroides vulgatus(普通拟杆菌)，B.napus:Brassica napus(欧洲油菜)，B.ambifaria:Burkholderia ambifaria，C.albicans:Candidaalbicans(假丝酵母)，C.glabrata:Candida glabrata(光滑假丝酵母)，CHL:Chlorophyta(绿藻门)，C.sinensis:Citrus sinensis(甜橙)，C；solstitialis:Citrussolstitualis，C.hutchinsonii:Cytophaga hutchinsonii(哈氏噬纤维菌)，D.discoideum:Dictyostelium discoideum(盘基网柄菌)，D.hansenii:Debaryomyces hansenii(汉逊德巴利酵母)，D.geothermalis:Deinococcusgeothermalis，D.desulfuricans:Desulfovibrio desulfuricans(脱硫脱硫弧菌)，D.melanogaster:Drosophila melanogaster(果蝇)，D.salina:Dunaliellasalina(杜氏盐藻)，E.coli:Escherichia coli(大肠杆菌)，E.esula:Euphorbiaesula(乳浆大戟)，G.zeae:Gibberella zeae(玉蜀黍赤霉)，G.biloba:Ginkgobiloba(银杏)，G.max:Glycine max(大豆)，G.hirsutum:Gossypiumhirsutum(陆地棉)，G.forsetii:Gramella forsetii，H.sapiens:Homo sapiens(智人)，H.vulgare:Hordeum vulgare(大麦)，K.lactis:Kluveromyces lactis(乳酸克鲁维酵母)，L.braziliensis:Leishimania brazilensis(巴西利什曼原虫)，M.truncatula:Medicago truncatula(蒺藜苜蓿)，M.xanthus:Myxococcusxanthus(黄色粘球菌)，N.crassa:Neurospora crassa(粗糙脉孢霉)，N.benthamiana:Nicotiana benthamiana(本塞姆氏烟草)，O.basilicum:Ocimum basilicum(罗勒)，O.sativa:Oryza sativa(稻)，O.lucimarinus:Ostreococcus lucimarinus，O.RCC809:Ostreococcus sp.RCC809，O.taurii:Ostreococcus taurii，P.distansonis:Parabacteroides distasonis(吉氏副拟杆菌)，P.carbinolicus:Pelobacter carbinolicus，P.falciparum:Plasmodiumfalciparum(恶性疟原虫)，P.glauca:Prosthechea glauca，P.patens:Physcomitrella patens(展叶剑叶藓)，P.stipitis:Pichia stiptis，P.tremuloides:poplus tremuloides(美洲山杨)，P.trichocarpa:Poplus trichocarpa(毛果杨)，P.persica:Prunus persica(桃)，P.trifoliata:Ptelea trifoliata(榆桔)，S.cerevisiae:Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)，S.ruber:Salinibacterruber，S.lepidophylla:Selaginella lepidophylla(鳞叶卷柏)，S.moellendorffii:Selaginella moellendorfii(江南卷柏)，S.lycopersicum:Solanumlycopersicum(番茄)，S.tuberosum:Solanum tuberosum(马铃薯)，S.cellulosum:Sorangium cellulosum(纤维堆囊菌)，S.bicolor:Sorghumbicolor(两色蜀黍)，STP:Streptophyta(链形植物)，S.aciditrophicus:Syntrophus aciditrophicu，T.aestivum:Triticum aestivum(小麦)，T.brucei:Trypanosoma brucei(布氏锥虫)，V.vinifera:Vitis vinifera(葡萄)，V.carteri:Volvox carteri，X.autotrophicus:Xanthobacter autotrophicus(自养黄色杆菌)，Y.lipolytica:Yarrowia lipolytica(解脂耶氏酵母)，Z.mays:Zea mays(玉蜀黍)，Z.marina:Zostera marina(大叶藻)。
实施例
现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。如下实施例并非旨在完全限定或以其他方式限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994),Current Protocols in Molecular Biology,CurrentProtocols第一卷和第二卷的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1：鉴定与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列
利用了数据库序列搜索工具，例如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所保持的序列中，鉴定了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组序列)。该程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间的局部相似的区域。例如，在TBLASTN算法中，利用了SEQID NO:1的核酸编码的多肽，其中使用默认设置，开启过滤器以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在一些情况下，可调整缺省参数来改变搜索的严格性。例如增加E值以显示不太严格的匹配。这样，可鉴定到短的几乎完全的匹配。
序列列表提供了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的核酸序列的列表；例如选自表A：
表A：POI核酸和多肽的实例
SEQ ID No 1和2        P.trichocarpa ASA1#1_Cl-1
SEQ ID No 3和4        A.lyrata_348673#1_Cl-1
SEQ ID No 5和6        A.lyrata_481885#1_Cl-1
SEQ ID No 7和8        A.lyrata_487374#1_Cl-1
SEQ ID No 9和10       A.sativa_TA1242_4498#1_Cl-1
SEQ ID No 11和12      A.thaliana_AT2G29690.1#1_Cl-1
SEQ ID No 13和14      A.thaliana_AT3G55870.1#1_Cl-1
SEQ ID No 15和16      A.thaliana_AT5G05730.1#1_Cl-1
SEQ ID No 17和18      B.napus_TC74667#1_Cl-1
SEQ ID No 19和20      C.roseus_TA369_4058#1_Cl-1
SEQ ID No 21和22      G.max_Glyma20g23680.1#1_Cl-1
SEQ ID No 23和24      M.truncatula_AC149807_25.4#1_Cl-1
SEQ ID No 25和26      M.truncatula_AC20234_415.3#1_Cl-1
SEQ ID No 27和28      M.truncatula_CT971491_13.4#1_Cl-1
SEQ ID No 29和30      N.tabacum_NP917364#1_Cl-1
SEQ ID No 31和32      O.glaberrima_Og012455.01#1_Cl-1
SEQ ID No 33和34      O.sativa_LOC_Os03g61120.1#1_Cl-1
SEQ ID No 35和36      P.tremula_TA9332_113636#1_Cl-1
SEQ ID No 37和38      P.virgatum_TC26838#1_Cl-1
SEQ ID No 39和40      P.virgatum_TC46796#1_Cl-1
SEQ ID No 41和42      S.bicolor_Sb01g002760.1#1_Cl-1
SEQ ID No 43和44      S.bicolor_Sb01g040180.1#1_Cl-1
SEQ ID No 45和46      V.vinifera_GSVIVT00024135001#1_Cl-1
SEQ ID No 47和48      V.vinifera_GSVIVT00029259001#1_Cl-1
SEQ ID No 49和50      Z.mays_ZM07MC29806_BFb0014L0229716#1C_l-1
SEQ ID No 51和52      Z.mays_ZM07MC31538_BFb0355F0231444#1_Cl-1
序列已经由研究机构如基因组研究机构(Institute for GenomicResearch,TIGR；始于TA)尝试性地进行了装配并向公众公开。可以通过关键词搜索，或是采用BLAST算法，运用目的核酸序列或多肽序列，利用真核基因直向同源物(Eukaryotic Gene Orthologs,EGO)数据库来鉴定这样的相关序列。已经针对特定的生物创建了特定的核酸序列数据库，例如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。此外，对私有数据库的使用也已允许鉴定新型核酸和多肽序列。
实施例2：POI多肽序列的比对
使用MUSCLE算法(Edgar(2004),Nucleic Acids Research 32(5):1792-97)进行多肽序列的比对。
可以使用邻接聚类算法QuickTree1.1(Houwe等(2002).Bioinformatics 18(11):1546-7)构建POI多肽的系统发生树(图1)。
多肽序列的比对可以利用Clustal W(1.83/2.0)渐近比对算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25:4876-4882;Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31:3497-3500)，使用标准设置（慢比对，相似性矩阵：Gonnet、空位开放罚分10，空位延伸罚分0.2)）来进行。进行了小的手工编辑来进一步优化比对。
实施例3：计算多肽序列之间的全局同一性百分比
全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比，利用Clustal W 2.0渐近比对算法(Thompson等(1997)Nucleic Acids Res 25:4876-4882;Chenna等(2003).Nucleic Acids Res 31:3497-3500)，使用默认设置，进行了确定。
用于本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比，可利用本领域可获得的方法之一MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMCBioinformatics.2003 4:29.MatGAT:an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences.CampanellaJJ,Bitincka L,Smalley J;软件由Ledion Bitincka托管)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。
实施例4：鉴定可以用于实施本发明方法的多肽序列中所含的结构域
使用MEME算法(Bailey和Elkan,第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings of the Second International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology),第28-36页,AAAI出版社,Menlo Park,California,1994.)鉴定了基序。在MEME基序中的每个位置上，显示在查询组序列中以高于0.2的频率存在的残基。方括号中的残基表示可选残基。
使用Pfam数据库鉴定了结构域。
蛋白质家族、结构域和位点整合资源(Integrated Resource of ProteinFamilies,Domains and Sites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索的、常用标签数据库的一个整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，这些数据库利用不同的方法学和有关充分表征的蛋白质的不同程度的生物信息来产生蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的、多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合。Pfam由位于英国的桑格研究所服务器（Sanger Instituteserver）托管(PFAM版本24，见http://pfam.sanger.ac.uk/)。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)托管。
进行了Interpro结构域搜索，检测到了SEQ ID NO:2的以下结构域(见表A2)：
表A2
Figure BDA00002415954700771
Anth_synt_I_N(PF04715)邻氨基苯甲酸合成酶组分I，N末端区域：邻氨基苯甲酸合成酶(EC:4.1.3.27)催化色氨酸生物合成的第一步。组分I利用氨和分支酸，催化邻氨基苯甲酸的形成。催化位点位于相邻区域，描述在分支酸结合酶家族中(PF00425)。该区域参与由色氨酸引起的反馈抑制[1]。该家族还包含对氨基苯甲酸合成酶组分I(EC 4.1.3.-)的区域。SEQ ID NO:2的序列包含该PFAM结构域(PF04715)，所述结构域起始于第68位氨基酸，结束于第229位氨基酸。
分支酸_结合(Chorismate_bind)(PF00425)。该家族包括分支酸结合酶邻氨基苯甲酸合成酶、异分支酸合成酶、氨基脱氧分支酸合成酶和对氨基苯甲酸合成酶的催化区域。该条目代表分支酸结合酶邻氨基苯甲酸合成酶、异分支酸合成酶、氨基脱氧分支酸合成酶和对氨基苯甲酸合成酶的催化区域。邻氨基苯甲酸合成酶催化以下反应：该酶是包含2I和2II组分的四聚体：该条目限于利用氨而不是谷氨酰胺催化形成邻氨基苯甲酸的组分I，而组分II提供谷氨酰胺转酰胺酶活性。SEQ ID NO:2的序列包含该PFAM结构域(PF00425)，所述结构域起始于第289位氨基酸，结束于第569位氨基酸。
实施例5：POI多肽序列的拓扑学预测
TargetP 1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。位置分配所基于的是如下任一N-末端前序列的预测性存在：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)。最终预测所基于的分值并非真正的概率，且加起来并不必为1。不过，根据TargetP，得分最高的定位是最可能的，且分值之间的关系(可靠性级别)可作为所述预测的可靠性的指标。可靠性级别(RC)范围从1到5，其中1表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学(TechnicalUniversity of Denmark)的服务器维护。
对于经预测包含N末端前序列的序列，还可预测潜在切割位点。
可以选择许多参数，例如生物组别(非植物或植物)、截断值设置(无、预定的截断值设置、或用户指定的截断值设置)和预测切割位点的计算（是或否）。
许多其他算法可用于实施此类分析，包括：
-在丹麦技术大学的服务器上托管的ChloroP 1.1；
-在澳大利亚布里斯班的昆士兰大学分子生物科学学院（Institute forMolecular Bioscience）的服务器上托管的Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor 1.2版;
-在Edmonton,Alberta,Canada的阿尔伯特大学（University ofAlberta）的服务器上托管的PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5;
-在丹麦技术大学的服务器上托管的TMHMM；
-PSORT(URL:psort.org)
-PLOC(Park和Kanehisa,Bioinformatics,19,1656-1663,2003)。
表B:SEQ ID N.2:的拓扑学
名称 Len cTP mTP SP 其它 Loc RC
SEQ ID NO:2 580 0.856 0.191 0.027 0.022 C 2
截断值(>0.90) 0.730 0.620 0.760 0.000 0.530
实施例6:POI编码核酸序列的克隆
使用定制的毛果杨(Populus trichocarpa)幼苗cDNA文库(在pDONR222.1中;Invitrogen,Paisley,UK)作为模板，通过PCR扩增了核酸序列。用于克隆的cDNA文库从毛果杨的不同组织(例如，叶片、根)定制。所使用的毛果杨苗株在比利时收集。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶，在50μl PCR mix中使用200ng模板进行PCR。使用的引物是：
prm16254(SEQ ID NO:54;有义):
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcaaaccctaatcttctct 3’
和prm16255(SEQ ID NO:55;反向,互补):
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatttgcatctgttgctaaaac 3’
其包括用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法纯化了扩增的PCR片段。接着进行了Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”，pPOI。作为
Figure BDA00002415954700801
技术一部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。
含有SEQ ID NO:1的进入克隆随后与用于稻转化的Destination载体一起用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含如下功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；和旨在与已克隆到进入克隆中的目的核酸序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子位于此Gateway盒的上游。
在LR重组步骤之后，根据本领域公知的方法，将所产生的表达载体GOS2::POI转化到农杆菌菌株LBA4044中。
实施例7：植物转化
稻转化
用含表达载体的农杆菌转化稻(Oryza sativa)植物。使粳稻栽培种日本晴(Nipponbare)的成熟干种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育1分钟，接着在0.2%HgCl2中孵育30分钟，接着用无菌蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使消毒的种子在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下盾片来源的胚发生愈伤组织，并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中传代培养另外2周来扩增或者增殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚发生愈伤组织块(以加强细胞分裂活性)。
含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适抗生素的AB培养基上，并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至光密度(OD600)约为1。接着将悬浮液转移至培养皿，并将愈伤组织浸于悬浮液中15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固化的共培养培养基中，并在黑暗中于25℃孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2,4-D的培养基上于28℃暗培养四周。在此期间，发育出了快速生长的抗性愈伤组织岛。将此材料转移至再生培养基并在光照下孵育之后，释放了胚发生潜力，在接下来的四至五周发育出了芽。将芽从愈伤组织切下，并在含生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。
一个构建体产生约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获T1种子。在移植后三至五个月收获种子。该方法以超过50%的比率产生了单基因座转化体(Aldemita和Hodges 1996,Chan等,1993,Hiei等,1994)。
实施例8:其他作物的转化
玉米转化
可以用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6):745-50所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型适于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优良来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后约11天(DAP)，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物收获穗。共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植物。切离的胚依次生长在含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基、和玉米再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
小麦转化
可以运用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6):745-50描述的方法，进行小麦的转化。栽培种Bobwhite(可从CIMMYT,Mexico(墨西哥)获得)常用来进行转化。可以共培养未成熟胚和含有表达载体的根癌农杆菌，并通过器官发生回收转基因植株。与农杆菌孵育后，胚依次体外生长在含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的愈伤组织诱导培养基，和再生培养基上。培养板在光照下于25℃孵育2-3周，或直到芽发育。绿芽可以从每个胚转移到生根培养基上并在25℃孵育2-3周，直到根发育。可以将生根的芽移植到温室的土壤中。从表现出对选择剂具有耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
大豆转化
可以根据Texas A&M专利US 5,164,310所述方法的改良方案转化大豆。若干商业大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(可以得自伊利诺斯种子公司(the Illinois Seed foundation))常用来进行转化。对大豆种子消毒以进行体外播种。可以从七日龄幼苗中切出下胚轴、胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。可以切离这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗涤外植体并转移到选择培养基中。可以切离再生的芽，置于芽伸长培养基中。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
油菜籽/双低油菜转化
可以利用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养并根据Babic等(1998,Plant Cell Rep 17:183-188)进行转化。商业栽培种Westar(加拿大农业(Agriculture Canada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。可以对双低油菜种子表面消毒，进行体外播种。从体外幼苗中切离附着有子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切割端浸入细菌悬浮液中来接种农杆菌(含有表达载体)。随后外植体在含有3mg/l BAP、3%蔗糖、0.7%植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23℃、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将子叶柄外植体转移到含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中7天，然后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，可以将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5,含有0.5mg/l BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MS0)中进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。可以从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
苜蓿转化
可以利用(McKersie等1999Plant Physiol 119:839–847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植株的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业(Agriculture Canada))或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4:111-112)所述的任何其它商业苜蓿品种。可选的，可以选择RA3品种(威斯康辛大学(University of Wisconsin))用于组织培养(Walker等,1978Am JBot 65:654-659)。子叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等,1999 Plant Physiol 119:839–847)或LBA4404的过夜培养物进行共培养。外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。可以将外植体在一半浓度的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，但该培养基不含乙酰丁香酮而含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。可以将生根的幼苗移植到花盆中并在温室中生长。可以从对选择剂表现出耐受性且含有单拷贝T-DNA插入片段的植物产生T1种子。
棉花转化
可以按照US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。可以于3%次氯酸钠溶液中20分钟，对棉花种子表面消毒，并且在具有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中进行洗涤。然后将种子转移至具有50μg/ml苯菌灵(benomyl)的SH培养基中进行萌发。可以从4至6日龄的幼苗中取出下胚轴，切成0.5厘米的小块，置于0.8%琼脂上。将农杆菌悬浮液（每ml大约108个细胞，从用目的基因和适当的选择标记转化的过夜培养物稀释的）用于接种下胚轴外植体。在室温和光照下3天后，可以将组织转移至具有Murashige和Skoog盐和B5维生素(Gamborg等,Exp.Cell Res.50:151-158(1968))、0.1mg/l 2,4-D、0.1mgl 6-糠氨基嘌呤(6-furfurylaminopurine)和750μg/ml MgCL2、以及50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素(以杀死残留细菌)的固体培养基(1.6gGelrite)。在2至3个月（每4至6周进行一次传代培养）后分离单细胞系并且将其在选择培养基上进一步培养以进行组织扩增(30℃,16小时光周期)。接着可以将转化的组织在非选择培养基上进一步培养2至3个月以产生体细胞胚。将至少4mm长的健康外貌的胚转移至具有SH培养基（于细小蛭石中）的试管中，所述培养基补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠氨基嘌呤和赤霉酸。将胚在30℃和16小时的光周期下进行培养，将2至3叶期的小植株转移入具有蛭石和营养物的花盆。可以使植物变硬，然后转移至温室以进一步栽培。
糖用甜菜转化
将糖用甜菜(Beta vulgaris L.)种子于70%乙醇中消毒1分钟，接着在20%次氯酸盐漂白剂例如
Figure BDA00002415954700841
常规漂白剂(可从Clorox商业获取,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA)中摇荡20分钟。以无菌水清洗种子，风干后铺种在萌发培养基上(Murashige和Skoog(MS)基础培养基(见Murashige,T.,和Skoog,.,1962.A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant,vol.15,473-497)，包含B5维生素(Gamborg等;Nutrient requirements of suspension cultures ofsoy-bean root cells.Exp.Cell Res.,vol.50,151-8.)，添加有10g/l蔗糖和0.8%琼脂)。使用下胚轴组织，基本上根据Hussey和Hepher(Hussey,G.,和Hepher,A.,1978.Clonal propagation of sugarbeet plants and theformation of polylpoids by tissue culture.Annals of Botany,42,477-9)，起始芽培养，并在添加有30g/l蔗糖和0,25mg/l苄氨基嘌呤以及0,75%琼脂,pH 5,8的MS基础培养基上，以23-25℃和16小时光周期，维持生长。
使用携带含有例如nptII选择性标记基因的双元质粒的根癌农杆菌菌株进行转化试验。转化前一天，包含抗生素的液体LB培养物在摇床上(28℃，150rpm)生长直到600nm处光密度(O.D.)达到约为1。将过夜生长的细菌培养液离心，重悬于包含乙酰丁香酮(Acetosyringone)的接种培养基(pH 5,5)(O.D.为约1)中。
将芽基组织切割成薄片(大约1.0cm x 1.0cm x 2.0mm)。将组织浸入到液体细菌接种培养基中30秒。通过滤纸吸取除去过剩的液体。在包含30g/l蔗糖的MS基础培养基上共培养24-72小时，接着在包括30g/l蔗糖和1mg/l BAP的MS基础培养基上进行非选择性培养周期，以诱导芽的发育，并以头孢噻肟用于消除农杆菌。3-10天后，将外植体转移到类似的包含例如卡那霉素或G418(50-100mg/l，取决于基因型)的选择性培养基上。
每2-3周将组织转移到新鲜培养基上以维持选择压力。芽的迅速发生(3-4天后)说明现存分生组织的再生而不是新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮继代培养后，将小芽转移到包含5mg/l NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基上。采取额外的步骤以降低产生嵌合的(部分转基因的)转化植物的可能性。使用来自再生芽的组织样品进行DNA分析。
用于糖用甜菜的其它转化方法在本领域已知，例如Linsey和Gallois的方法(Linsey,K.,和Gallois,P.,1990.Transformation of sugarbeet(Betavul-garis)by Agrobacterium tumefaciens.Journal of Experimental Botany;vol.41，No.226;529-36)或作为WO9623891A公布的国际申请中公布的方法
甘蔗转化
从田间生长6个月龄甘蔗植株分离长茎(见Arencibia A.等,1998.Anefficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformationmediated by Agrobacterium tumefaciens.Transgenic Research,vol.7,213-22;Enriquez-Obregon G.等,1998.Herbicide-resistant sugarcane(Saccharum officinarum L.)plants  by  Agrabac-terium-mediatedtransformation.Planta,vol.206,20-27)。通过浸入到20%次氯酸盐漂白剂例如
Figure BDA00002415954700861
常规漂白剂(可从Clo-rox商业获取,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA)中20分钟，对材料进行消毒。将约0.5cm的横切面以顶部向上的方向放置于培养基上。将植物材料，在包含B5维生素(Gamborg,O.等,1968.Nutrient requirements of suspension cultures of soybean rootcells.Exp.Cell Res.,vol.50,151-8)，添加有20g/l蔗糖、500mg/l酪蛋白水解物、0.8%琼脂和5mg/l 2,4-D的MS(Murashige,T.和Skoog,1962.Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissuecultures.Physiol.Plant,vol.15,473-497)基础培养基上，在暗中于23°C培养4周。4周后将培养物转移到新鲜的相同培养基上。
使用携带含有例如hpt选择性标记基因的双元质粒的根癌农杆菌菌株进行转化试验。转化前一天，使包含抗生素的液体LB培养物在摇床（25℃,150rpm）中生长直到600nm处光密度(O.D.)达到约为0.6。将过夜生长的细菌培养液离心，重悬于包含乙酰丁香酮(pH 5,5)的MS基础接种培养基中(O.D.为约0.4)。
基于致密结构和黄颜色的形态特征，分离甘蔗胚胎发生愈伤组织块(2-4mm)，在层流罩中干燥20分钟后浸入到液体细菌接种培养基中10-20分钟。通过滤纸吸除过剩的液体。在置于包含B5维生素和1mg/l 2,4-D的MS基础培养基顶部的滤纸上在黑暗中共培养3-5天。在共培养后，以无菌水清洗愈伤组织，接着在类似的培养基上进行非选择性培养周期，所述培养基包含500mg/l头孢噻肟用于消除农杆菌。3-10天后，将外植体转移到包含B5维生素、1mgl 2,4-D、和25mg/l潮霉素(取决于基因型)的MS基础选择培养基上再培养3周。所有的处理均在23°C于黑暗条件下进行。
将抗性愈伤组织在缺乏2,4-D、包含1mg/l BA和25mg潮霉素的培养基上，于16小时光周期下进一步培养，由此形成芽结构。分离芽，在选择性生根培养基(MS基础，包括20g蔗糖、20mg/l潮霉素和500mg/l头孢噻肟)上培养。
使用来自再生芽的组织样品进行DNA分析。
用于甘蔗的其它转化方法在本领域已知，例如来自国际申请公布WO2010/151634A和授权的欧洲专利EP1831378。
实施例9：表型评估方法
9.1评估设置
产生大约35个独立的T0稻转化体。原代转化体由组织培养室转移到温室进行生长并收获T1种子。保留6个其中T1代发生转基因的存在/缺乏的3:1分离的事件。对于每一个此类事件，通过监测可视标记的表达，选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗、以及大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28℃，夜间22℃，相对湿度70%。对在非胁迫条件下生长的植物定期浇水，以确保水和养分是非限制性的以及满足完成生长和发育的植物需要。
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
干旱筛选
在正常条件下在花盆土中培养了来自T2种子的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到“干”区，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC下降低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如针对在正常条件下生长所详述的那样，记录生长和产量参数。
氮利用效率筛选
可以在除营养液以外为正常的条件下在花盆土中栽培来自T2种子的稻植物。可以从植物移植到成熟，用特定的营养液对花盆进行灌溉，所述营养液含有减小的氮(N)含量，通常少7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。如对正常条件下生长所详细描述的那样，记录生长和产量参数。
盐胁迫筛选(SAUR多肽)
可以将植物生长在由椰壳纤维和argex(3:1)制成的基质上。可以在小植株移植到温室后的头两周期间，应用正常营养液。过了头两周之后，向营养液中添加25mM盐(NaCl)，直至收获植物。然后测量种子相关参数。
9.2统计学分析：F检验
利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行总体评估。对用本发明基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行了F检验。进行F检验以检查基因在所有转化事件上的效应，并验证基因的总体效应，亦称为“整体基因效应”。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5%概率水平。显著性F检验值指示存在基因效应，这意味着引起表型上差异的不仅仅是基因的存在或位置。
9.3测量的参数
生物量相关参数测量
从播种期到成熟期，植物数次通过数码成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数数码图像中区别于背景的地上植物部分的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。该地上面积是在植物达到其最大叶生物量的时间点测量的面积。早期活力是萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。根生物量增加表达为根总生物量(测量为在植物一生中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/枝条指数(测量为在根和枝条活跃生长期中根生物量和枝条生物量之间的比值)的增加。
植物高度的一个有力指标是对重力的量度，即测定叶生物量的重力中心的高度(以mm表示)。基于曲线拟合的渐近线，或者如果拟合不令人满意的话，则基于最大绝对值，这避免了受单片直立叶的影响。
通过计数区别于背景的地上植物部分的像素总数，测定了早期活力。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。下面描述的结果是针对萌发后3周的植物的。
种子相关参数测量
收获成熟的一级圆锥花序(primary panicles)、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37℃干燥三天。随后使圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置使饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数，确定饱满种子数。通过称重从植物收获的所有饱满谷壳来测量种子总产量。通过计数从植物收获的谷壳数来测量每株植物的种子总数。根据计数的饱满种子数及其总重量外推得出千粒重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量和地上面积(mm2)之间的比值再乘以因子106。每圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟一级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子(或小花)总数的比例(以%表示)。
实施例10：转基因植物表型评估结果
在非胁迫条件下对表达包含SEQ ID NO:1的最长开放阅读框的核酸的T1代转基因稻植物进行了评估，结果如下。关于转基因植株产生的细节，参见之前的实施例。
在非胁迫条件下对转基因稻植物的评估结果如下。观察到了地上生物量(AreaMax)、出苗活力(早期活力)、种子总产量、饱满种子数、饱满率、每圆锥花序的花朵数、收获指数的(至少-大于)5%增加，和千粒重的至少2.5-3%增加。
在组成型启动子GOS2控制下过量表达POI的转基因植物，与无效对照植物相比较，显示出了增加的产量。更特别的是，转基因植物显示出了增加的根生物量和枝条生物量，具有总体正效应。
在产量(YIELD)筛选下POI在稻中过量表达的效应是增加：枝条生物量，具有9.3%(p＝0.0000)的总体效应；根生物量，具有3.9%(p＝0.1908)的总体效应；种子总数，具有7.9%(p＝0.0160)的总体效应；种子总重，具有9.2%(p＝0.1908)的总体效应；株高，具有5.0%(p＝0.0002)的总体效应；和/或植物重心，具有5.3%(p＝0.0000)的总体效应。
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Claims (26)

1.用于相对于对照植物增强植物产量和/或产量相关性状的方法，包括调节多肽在植物中的活性，其中所述多肽包含至少一个PF04715或PF00425结构域。
2.权利要求1的方法，包括调节编码多肽的核酸分子在植物中的表达，其中所述多肽包含PF04715或PF00425结构域中至少一个，优选两者。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述多肽包含以下基序之一或多个：
基序1(SEQ ID NO：56)：EK[QE]CAE[HN][IVL]M[LI]VDL[GL]RND[VL]G[KR]V
基序2(SEQ ID NO：57)：P[FL]E[VL]YRALR[IV]VNP[SA]PY[MA][AI]YLQ和/或
基序3(SEQ ID NO：58)：[VM][ST]GAPKV[RK]AME[LI][IL]DELE；
优选地，所述多肽包含以下基序之一或多个：
基序4(SEQ ID NO：59)：
EHI LAG DI FQIVLSQRFERRTFADPFE[VI]YRALR[I V]VNPSPYM[AT]YLQARGC
基序5(SEQ ID NO：60)：
FCGGWVG[FY]FSYDTVRYVEK[KR]KLPFS[KN]APEDDRNLPD[VI]HLGLYDDV[IL]VFDH；和/或
基序6(SEQ ID NO：61)：LMN[IV]ERYSHVMHISSTV[TS]GEL；和/或
基序7(SEQ ID NO：62)：
KEHI[LQ]AGDIFQIVLSQRFERRTFADPFE[VI]YRALR[IV]VNPSPYM[AT]YLQARGC；和/或
基序8(SEQ ID NO：63)：
FCGGWVG[FY]FSYDTVRY[TV]EK[KR]KLPFS[KRN]AP[KE]DDRNLPD[VI]HLGLYDDV[IL]VFDH。
4.根据权利要求2至3的方法，其中所述经调节的表达通过向植物中引入和表达编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS)α亚基的核酸分子来实现。
5.根据权利要求1至3之任一的方法，其中所述多肽由核酸分子编码，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51（之任一）所示的核酸；
(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51（之任一）所示的核酸的互补序列；
(iii)编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的多肽的核酸，优选地由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的多肽序列得到，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状；
(iv)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或51的任何核酸序列具有至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和更优选地赋予相对于对照植物增强的产量相关性状，的核酸；
(v)在严紧杂交条件下与(i)至(iv)的核酸分子杂交并优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状的核酸分子；
(vi)编码所述多肽的核酸，所述多肽按照递增的优选次序与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、或52（之任一）所示的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，和优选赋予相对于对照植物增强的产量相关性状。
6.根据任何前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选增加的生物量和/或种子总数和/或种子总重。
7.根据权利要求1至6之任一的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。
8.根据权利要求1至6之任一的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得所述增强的产量相关性状。
9.根据权利要求1至8之任一的方法，其中所述编码多肽的核酸来自植物，优选来自双子叶植物，再优选来自双子叶乔木，更优选来自杨属(Populus)，最优选来自毛果杨(Populus trichocarpa)。
10.根据权利要求1至9之任一的方法，其中所述编码多肽的核酸编码表A中所列多肽之任一，或是这样的核酸的部分，或是能够与这样的核酸的互补序列杂交的核酸。
11.根据权利要求1至10之任一的方法，其中所述核酸序列编码表A中所给出的任何多肽的直向同源物或旁系同源物。
12.根据权利要求1至9之任一的方法，其中所述核酸编码SEQ IDNO:2所示的多肽。
13.根据权利要求1至12之任一的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与中等强度的组成型启动子有效连接，优选与植物启动子有效连接，更优选与GOS2启动子有效连接，最优选与来自稻的GOS2启动子有效连接。
14.通过根据权利要求1至13之任一的方法可获得的植物、其植物部分，包括种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含编码如权利要求1至5和9至12之任一中所定义的多肽的重组核酸。
15.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1至5和9至12之任一中所定义的所述多肽的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
16.根据权利要求15的构建体，其中所述控制序列之一是组成型启动子，优选中等强度组成型启动子，优选植物启动子，更优选GOS2启动子，最优选来自稻的GOS2启动子。
17.根据权利要求15或16的构建体在制备相对于对照植物具有增加的产量，特别是生物量的植物的方法中的用途。
18.转化了根据权利要求15或16的构建体或根据权利要求1至13之任一的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物或其部分包含编码如权利要求1至5和9至12之任一中定义的所述多肽的重组核酸。
19.根据权利要求14或18的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如甜菜、糖用甜菜或苜蓿；或单子叶植物例如甘蔗；或谷类植物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦（spelt）、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱(milo)和燕麦。
20.用于生产相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括：
(i)向植物中引入和表达编码如权利要求1至5和9至12之任一中定义的所述多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
21.根据权利要求18或19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条和/或根生物量和/或种子。
22.从根据权利要求18或19的植物和/或从根据权利要求21的植物的可收获部分产生的产品。
23.编码如权利要求1至5和9至12之任一中定义的多肽的核酸在相对于对照植物增加产量，特别是枝条和/或根生物量和/或种子总数和/或种子总重中的用途。
24.用于生产产品的方法，所述方法包括步骤：生长根据权利要求14、18或19的植物、和从或通过：
a.所述植物；或
b.所述植物的部分，包括种子
生产所述产品。
25.根据权利要求15或16的构建体，包含在植物细胞中。
26.任何前述权利要求，其中核酸编码多肽，但是所述多肽不是选自以下序列的多肽：
a)Uniprot数据库的数据库条目B9HSQ4(截止于2011年3月2日，2011_02发布)、或截止于2011年3月2日的NCBI美国国家生物技术信息中心的数据库条目XP_002316223.1；或
b)国际专利申请WO 03/092363的SEQ ID NOs:104或108；或
c)美国专利申请US 2004/031072的SEQ ID NO:46407或189249；或
d)国际专利申请WO 03/000906的SEQ ID NO:785或786；或
e)国际专利申请WO 03/008540的SEQ ID NO:8670或9055。
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