CN103361361B - 复苏植物安徽旋蒴苣苔耐脱水与复苏相关基因BdBCP1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及复苏植物安徽旋蒴苣苔耐脱水与复苏相关基因BdBCP1及其应用。本发明公开了来自复苏植物安徽旋蒴苣苔的一个耐脱水与复苏相关基因及其编码蛋白，其目的是提供一个安徽旋蒴苣苔的耐脱水与复苏相关基因与其在培育耐脱水与复苏性状增强的植物中的应用。该基因可具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该基因编码蛋白具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列。本发明的耐脱水与复苏相关基因将在培育耐旱性增强的植物(特别是水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、油菜等农作物)中发挥重要的作用。

Description

复苏植物安徽旋蒴苣苔耐脱水与复苏相关基因BdBCP1及其应用

技术领域

本发明涉及植物中与抗胁迫相关的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及安徽旋蒴苣苔(Boea densihispidula)中的一个复苏基因及其编码蛋白与其在培育复苏性状增强的植物中的应用。

背景技术

复苏性状是某些生物应对水分剧烈变化恶劣环境的一种特殊适应能力，在植物界广泛分布于苔藓和蕨类低等植物，一些高等植物也具有这种性状。复苏植物可以在损失体内95％以上的水分后，遇水而复苏，以此度过环境恶劣的时段。研究表明，安徽旋蒴苣苔具有优异的复苏性状，并且较适宜进行遗传操作。因此，安徽旋蒴苣苔不但是一种可供研究植物自然复苏机制的可能模式植物，更是一种分离优异复苏相关基因的资源植物。

发明内容

本发明的目的是提供一个安徽旋蒴苣苔的复苏基因及其编码蛋白。

因此，本发明一方面涉及安徽旋蒴苣苔的复苏基因BdBCP1，其核苷酸序列选自：

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明另一方面涉及复苏基因BdBCP1编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列80％以上的氨基酸相似的序列。

本发明还一方面涉及含复苏基因BdBCP1的表达载体。

本发明还一方面涉及含复苏基因BdBCP1的转基因细胞系。

本发明还一方面涉及含复苏基因BdBCP1的宿主菌。

本发明还一方面涉及复苏基因BdBCP1或其编码的蛋白的应用。在本发明的一个实施方案中，本发明涉及复苏基因BdBCP1或其编码的蛋白用于植物抗旱或复苏的应用。

本发明还一方面涉及一种培育耐旱植物的方法，其包括将复苏基因BdBCP1导入植物细胞，由此获得对干旱耐受力增强的转基因植物。在本发明的一个实施方案中，所述植物包括拟南芥、小麦、水稻、玉米、棉花、油菜或大豆。在本发明的一个实施方案中，在所述植物中过量表达复苏基因BdBCP1并进一步获得耐旱植物。所述方法中具体转化和选择方法可根据本领域公知的多种方式进行。在本发明的一个实施方案中，所述方法可参照实施例中描述的过程进行并根据不同植物进行适当修改。

本发明所提供的复苏基因，名称为BdBCP1，来源于苦苣苔科植物旋蒴苣苔(Boea densihispidula)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；

2)编码序列表中的SEQ ID No.2的氨基酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所谓高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No.1由1012个碱基组成，其编码序列为自5′端第41位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明耐旱基因所编码的蛋白(BdBCP1)，也属于本发明的保护范围。它是具有序列表中SEQ ID No.2氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID No.2由207个氨基酸组成。

含有本发明具有的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增BdBCP1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的复苏基因导入植物细胞，可获得对高旱耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他的可参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆储存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用BdBCP1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明BdBCP1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、棉花、油菜等双子叶植物。

通过对转化本发明所提供的复苏基因BdBCP1经和植物基因组基因的序列比对发现，该基因还是一功能尚未知晓的基因，与厚叶蛛毛苣苔基因组中编码一个BCP1的基因(AAO86692.1)有较高相似性(氨基酸水平上有65％的相似性)，通过对转化本基因后所得到的转基因拟南芥植物进行逆境胁迫试验，证明该基因在转入植物后可显著提高植株的耐旱性。本发明为人为控制植物中抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是水稻、玉米、小麦、油菜、大豆、棉花等农作物)中发挥重要的作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1、载体pCB2004的物理图谱

图2、载体pCB2004-BdBCP1(即pCB2004-816-3)的物理图谱

图3、复苏株816-3，功能验证转化体和野生型拟南芥中BdBCP1基因表达情况检测

图4、a)、b)为复苏株816-3，功能验证转化体和野生型拟南芥成体苗叶片离体失水后的复苏情况及数据统计

图5、生长在土壤中复苏株816-3，转pCB2004/816-3的功能验证转化体和野生型拟南芥植物，经干旱胁迫处理后的复苏情况，其中a)干旱前；b)干旱后；c)各盆中植物的位置示意图；d)、e)复苏情况；f)对照。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、旋蒴苣苔耐旱基因BdBCP1的获得

一、旋蒴苣苔cDNA文库的构建

提取旋蒴苣苔总RNA，反转录得到旋蒴苣苔全基因组的cDNA，采用高通量构建载体的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展。中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将旋蒴苣苔cDNA先重组克隆到pDONR207载体(Invitrogen公司)，得到Entry cDNA文库，然后再以重组克隆将整cDNA文库穿梭至含有35S启动子的植物过量表达双元载体pCB2004(物理图谱如图1所示)(Lei，Z.Y.，Zhao，P.，Cao，M.J.，Cui，R.，Chen，X.，Xiong，L.Z.，Zhang，Q.F.，Oliver，D.J.，and Xiang，C.B.(2007).High-throughput binary vectors for plantgene function analysis.J Integr Plant Biol 49，556-567.)中，得到旋蒴苣苔cDNA文库。上述重组反应完全按照Invitrogen提供的实验指南进行。

二、将旋蒴苣苔cDNA文库转化野生型拟南芥

将步骤一构建的旋蒴苣苔cDNA文库穿梭到双元载体pCB2004中，电转化至农杆菌C58，采用拟南芥花序浸花转化的方法(floral dipmethod)(Steven J，Clough and Andrew F.Bent：Floral dip：a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournal：Volume 16Issue 6Page 735-December 1998)大规模转化拟南芥。

三、拟南芥复苏转化体的筛选

1、拟南芥转化体库的创建

在土壤中大规模播种步骤二获得的转化有旋蒴苣苔cDNA文库的拟南芥转化体的种子，在种子发芽后约5天，表面喷洒浓度为0.2％的除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)进行筛选，以野生型拟南芥为对照。约1周后可以观察到转化体植株和野生型植株具有明显差别，野生型植株在0.2％除草剂glufosinate条件下不能存活，而转化体植物不受影响，可以正常生长。

2、高通量方法初筛复苏转化体植株

待上述阳性苗在土中生长25天后，剪取莲苔叶(每个单株取两片)，进行叶片失水-复苏筛选。剪下的叶片在22°，相对湿度20％的恒温箱中进行失水，待失水超过80％后，进行复水，在培养皿中加入水。24小时后观察叶片复水情况，筛选出能够复水的转化体，单株收种。

3、复苏转化体的复筛

对每一可能的耐旱转化体，选取其大约100粒种子用上述步骤2的方法进行复筛，进行观察并记录相应数据，检查复苏植株数量和非复苏植株数量之间比例，在存活植株叶片上涂抹2％除草剂glufosinate，1周后观察叶片存活情况。如果叶片全部存活，表明上述可能的复苏株系的复苏性状和抗除草剂基因连锁，符合筛选要求。最后，单株收种，将种子保存备用。

四、耐旱基因BdBCP1的获得

根据旋蒴苣苔cDNA在载体pCB2004中插入位点的上、下游序列设计引物扩增cDNA序列，引物序列如下：

Omega：5′TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA-3′

attB2：5′TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3′

提取步骤3筛选得到的耐旱转化体复苏株816-3的基因组DNA，并以此为模板，在引物Omega和attB2的引导下进行PCR扩增，50uLPCR扩增体系为：0.25uL ExTaq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，2uL基因组DNA，10×PCR缓冲液5uL，dNTPs 100uM，上下游引物各25uM，再用双蒸水将反应体系补充至50uL。用PCR技术扩增转入的旋蒴苣苔cDNA。PCR反应条件为：先95℃，1min，再66℃，1min，最后72℃，2min，共40个循环。反应结束后，对PCR产物进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中的SEQ ID No.1的核苷酸序列，由1012个碱基组成，其编码序列为自5′端第41位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。将该耐旱基因命名为BdBCP1。

实施例2、拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体中BdBCP1表达量检测。

用实施例1的方法构建BdBCP1的过量表达载体，使用Invitrogen公司的BP克隆酶和LR克隆酶，利用Gateway克隆法将BdBCP1克隆入含有35S启动子的过量表达双元载体pCB2004中，得到BdBCP1的过量表达载体，命名为pCB2004/BdBCP1。经测序鉴定正确后，将pCB2004/BdBCP1用电转化法转入农杆菌，再用花序转化方法(floral dipmethod)转化野生型拟南芥植株，得到转基因植株。抽提拟南芥野生型，复苏株816-3及转BdBCP1基因植株的RNA，反转录成cDNA后，以此cDNA为模板，进行Semi-Quantitative RT-PCR，检测结果显示，复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体中BdBCP1表达量明显比野生型中有大幅增加。结果如图3所示。

实施例3、拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体叶片离体失水实验

对拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体进行叶片离体失水实验，方法为：将拟南芥BdBCP1转化体，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体及野生型植株，在土中生长25天后，剪取莲苔叶(每个单株取两片)，进行叶片离体失水实验。剪下的叶片在22°，相对湿度20％的恒温箱中进行失水，待失水超过80％后，进行复水，在培养皿中加入水。24小时后观察叶片复水情况。与野生型植株相比，拟南芥复苏株及功能验证转化体叶片具有更明显的复苏性状，统计分析显示，在失水率达到80％-82％及82％-84％两个区间内，拟南芥复苏株及功能验证转化体中能够复苏的植株比例均明显高于野生型。结果如图4所示。

实施例3、拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体在土壤中的耐旱实验

将实施例2中获得的拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体和野生型拟南芥(WT)的种子播种于同盆土壤中，在相同条件下培养，生长10天左右(约10片莲苔叶并且未抽苔)，实施干旱胁迫，观察并记录其生长情况，待植株的生长情况如图5(干旱后)所示，复水，结果如图5(复水后)所示，野生型植株不能复苏，而拟南芥复苏株816-3，转BdBCP1基因的拟南芥功能验证转化体均具有更高的复苏比例。

Claims (8)

1.安徽旋蒴苣苔的复苏基因BdBCP1，其编码序列表中的SEQ ID No.2的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的复苏基因BdBCP1，其特征在于：所述基因的序列为序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列。

3.权利要求1所述复苏基因BdBCP1编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.含权利要求1或2所述复苏基因BdBCP1的表达载体。

5.含权利要求4所述表达载体的转基因细胞系。

6.含权利要求4所述表达载体的宿主菌。

7.权利要求1所述的复苏基因BdBCP1或其编码的蛋白用于提高植物的耐旱性的应用，所述植物选自水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草或拟南芥。

8.一种培育耐旱植物的方法，其包括将权利要求4所述的表达载体导入植物细胞并过量表达所述复苏基因BdBCP1，由此获得对干旱耐受力增强的转基因植物，所述植物选自水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆、牧草或拟南芥。