CN113151301A - HD-Zip转录因子GmHdz4基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及大豆HD‑Zip转录因子GmHdz4基因及其在调节侧根发育提高大豆耐旱性中的应用。本发明公开了一种HD‑Zip转录因子GmHdz4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其用途是：调控大豆侧根根系形态建成，提高大豆耐旱性。

Description

HD-Zip转录因子GmHdz4基因及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及大豆HD-Zip转录因子GmHdz4基因调节侧根发育提高大豆耐旱性中的应用。

背景技术

植物根系是与土壤直接密切接触的重要器官，不仅承载着吸收养分和水分的功能，而且当土壤缺水时最先感知土壤含水量的变化，并产生大量的根源信号，输送到地上部分，影响地上部分植株的生长和最终产量的形成(Huang et al.2014)。根系形态建成(Rootsystem architecture，RSA)主要是指根的形态和物理空间，RSA指标如植物的根长、根表面积、根数和根冠比等已经被用作鉴定植物抗旱能力的重要指标(胡标林等，2005)。RSA是一个重要的发育农艺性状，在缺水环境中对植物的适应性和生产力都起着十分重要的作用(Ye et al.2018)。根系形态结构在缺水条件下具有很强的可塑性，一方面植株为了吸收水分，根系变得强壮发达，形成更多的侧根；另一方面根系越发达，分布越广越深，植株的抗旱能力越强(Benjamin,2009)。双子叶植物通过发育较多的深层主根和侧根来吸收土壤中的水分避免干旱对植物的威胁(Gilbert et al.2011；Battisti and Sentelhas 2017)。研究表明耐干旱大豆品种PI 416937增加了侧根的发育和生长(Hudak and Patterson 1996；Pantalone et al.1996)；在大豆中也发现干旱敏感品种根系分布较浅且根与主茎的夹角小于40°，而避旱品种根系分布较深且根与主荚的夹角大于60°(Fenta et al.2014)。

同源结构域-亮氨酸拉链(Homeodomain-leucine zipper，HD-Zip)蛋白是近十年来发现的高等植物中特有的一类转录因子，植物HD-Zip转录因子可分为四个亚类(HD-ZipI～IV)，其中HD-Zip I已在拟南芥(Peterson et al.2013,Perotti et al.2017)、水稻(Zhang et al.2012)、小立碗藓(Sakakibara et al.2001)和芝麻(Wei et al.2019)等研究中表明对植物的生长、发育、形态建成、信号网络和环境胁迫中起着重要的调控作用(Gong SH et al.2019)。缺水和ABA处理强烈诱导拟南芥HD-Zip转录因子AtHB6和AtHB7的表达；在干旱胁迫下，AtHB6、AtHB7和AtHB12对ABA信号负反馈调节；AtHB7和AtHB12对PP2C蛋白磷酸酶具正向调节作用，并抑制ABA受体PYL5和PYL8的表达，受体突变体pyl8对侧根发育敏感(Himmelbach,2002；Romani,2016)。PEG模拟干旱处理诱导水稻HD-Zip转录因子Oshox22表达但抑制Oshox4表达，Oshox4在维管束中特异表达，过表达Oshox4延长水稻营养生长期但节间伸长下降，Oshox4具有反向调节GA信号和干旱胁迫的作用(Agalou etal.2008；Zhou et al.,2015)。干旱胁迫诱导苜蓿HD-Zip转录因子在根尖中强烈表达，并调节根系形态建成和侧根的发生(Ariel et al.2010)。芝麻中有45个HD-Zip转录因子均属于HD-ZipⅠ～Ⅳ家族，其中75％的基因与干旱和盐胁迫有关，且大部分是HD-ZipⅠ和Ⅱ家族(Wei et al.2019)。小麦过表达向日葵HD-Zip I转录因子HaHB4在干旱胁迫下通过增加小穗数、分蘖数和可育小花数提高了籽粒产量，且HaHB4基因的作用与干旱胁迫相关的传统候选基因RD19或DREB1a等无关(Fernanda et al.,2019)。转向日葵HD-Zip I转录因子HaHB4基因大豆在干旱胁迫下通过增加木质部面积、叶片水分利用率以及诱导热休克蛋白的表达提高了产量(Ribichich et al.2020)。桉树过表达HD-ZipⅡ家族EcHB1基因改变了叶肉体解剖结构，增加了光合作用速率，提高了桉树的耐旱性(Sasaki et al.2019)；大豆HD-ZipⅠ转录因子家族有36个成员，其中GmHB6、GmHB13和GmHB21在敏感品种(BR 16)和耐旱品种(EMBRAPA 48)中差异表达；特别是在耐旱品种中GmHB13受缺水诱导而在敏感品种中GmHB6被抑制(Belamkar et al.2014)；转HD-ZipⅠ转录因子MdHB-7基因苹果表现为增加了耐旱性(Zhao et al.2020)。

大豆HD-Zip转录因子家族在盐胁迫下的转录组分析发现，Glyma11g06940表达量仅有小幅上升，但对改善大豆耐盐性没有显著作用。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种HD-Zip转录因子GmHdz4基因及其在调控侧根发育建成和提高大豆耐旱性中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种HD-Zip转录因子GmHdz4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还同时提供了上述HD-Zip转录因子GmHdz4基因的用途：调控大豆侧根根系形态建成。

作为本发明的用途的改进：提高大豆耐旱性。

本发明对GmHdz4转录因子的cDNA序列进行了克隆，生物信息学分析表明GmHdz4属于大豆HD-ZipⅠ家族δ亚组，定位于细胞核中，该基因编码蛋白具备转录因子功能；该基因表达量受干旱诱导且在根系特异表达。采用发根农杆菌系统验证了该基因具有负调控根系侧根发育和耐干旱的能力，过表达GmHdz4抑制大豆发状根系根尖的正常发育侧根数减少，CRISPR/Cas9 GmHdz4可促进发状根根尖数量增多和侧根形成，模拟干旱试验表明，GmHdz4抑制大豆表现为耐旱性。

本发明在发明过程中发现了以下现象，而后从大豆中克隆了HD-Zip转录因子GmHdz4基因。

(1)GmHdz4基因在栽培大豆根系中的相对表达量约为叶片中的60倍，显著高于茎、叶、花和荚中，表明GmHdz4基因主要在根系中发挥功能。

(2)GmHdz4基因随干旱胁迫程度加深受到显著抑制，12h内GmHdz4的表达量呈阶梯状显著下降，12h后保持在干旱胁迫前相对表达量的0.2左右。

(3)根据野生大豆GsHdz4(KHN42008.1)蛋白序列，基因信息学分析表明栽培大豆基因组中有1个GsHdz4的同源序列Glyma11g06940，序列相似度高达98％。以Glyma11g06940基因CDs全长序列设计引物进行PCR扩增，最终获得GmHdz4基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1。

(4)GmHdz4与其它HD-ZipⅠ家族成员多序列比对结果表明GmHdz4具有该家族高度保守的同源异型域HD和亮氨酸拉链LZ两个功能结构域，符合HD-ZipⅠ蛋白的序列特征。拟南芥、水稻、野生大豆和栽培大豆4个物种的HD-ZipⅠ蛋白序列系统进化分析表明HD-ZipⅠ蛋白序列经Neighbor-Joining法计算后被聚类到α至Φ8个亚组中，其中，GmHdz4属于δ亚组，与野生大豆Gshdz4(KHN42008.1)属于直系同源。

本发明提供了GmHdz4基因在调控大豆侧根根系形态建成和提高大豆耐旱性中的应用。具体包括：

(1)构建HD-Zip转录因子GmHdz4基因植物过表达载体pTF102和CRISPR/Cas9基因编辑载体pBGK041。过表达载体pTF102共含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和草铵膦抗性基因(Bar)两个标记基因；pBGK041载体的Cas9蛋白经密码子优化，采用大豆U6启动子表达gRNA序列，并含有Bar基因能高效地用于双子叶植物特别是大豆的基因敲除。

(2)采用冻融法将过表达载体和基因编辑载体转入发根农根菌K599中，用于发根农杆菌的转化；

(3)以去除根发芽4天的大豆幼苗作为外植体进行发根农杆菌转化，以草丁膦用为筛选标记，以外植体分离、农杆菌侵染、农杆菌共培养、农杆菌发根培养，得到转基因和基因敲除根系但地上部是未转化的转基因和基因编辑幼苗嵌合体；

(4)将所述的转基因和基因编辑幼苗嵌合体采用GUS染色、目的基因PCR方法及基因编辑根系进行靶标位点前后序列测序鉴定；

(5)将所述为转基因和基因编辑GmHdz4幼苗嵌合体，先在霍格兰营养液中培养至二叶期，然后用营养液配置2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)(pH值为5.8)进行模拟干旱处理；证实基因编辑GmHdz4基因可以提高大豆的抗旱功能。

(1)中，构建重组表达载体时，采用的原始载体为pTF102；构建基因编辑表达载体时，原始载体为CRISPR/Cas9 pBGK041，编码基因GmHdz4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(2)中，所述的农杆菌为发根农杆菌K599；(3)所述的大豆受体材料为大豆品种天隆一号发芽4天的不含根系的幼苗。

(3)和(4)中，所述的鉴定和筛选基因过表达和基因编辑大豆幼苗嵌合体采用三种方法即GUS染色、目的基因PCR方法及基因编辑根系进行靶标位点前后序列测序鉴定。

本发明具有以下有益效果：

本发明从大豆中HD-Zip转录因子GmHdz4基因，并采用发根农杆菌介导法将GmHdz4基因导入大豆根系中；在2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱胁迫中，过表达GmHdz4基因明显抑制了大豆根系的正常生长发育，从而影响地上部分幼苗的生长，而基因编辑GmHdz4根系生长促进，从而促进地上部分幼苗的生长；转录因子GmHdz4，可能作为一负调控因子，主要通过抑制根系的伸长和侧根的形成，对大豆的耐旱机制起到负面作用。因此，基因编辑GmHdz4基因可用于培育耐旱植物新种质。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为大豆HD-ZipⅠ家族蛋白多序列联配；

Glyma11g06940与大豆HD-ZipⅠ其他已知的35个成员氨基酸序列进行比对结果表明个别基因在亮氨酸拉链保守结构域的后几个亮氨酸位点上存在苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸的替换，但该家族所有氨基酸序列的同源异型域HD均高度保守，亮氨酸拉链结构域LZ也相对保守；Glyma11g06940序列也只有最末位亮氨酸位点被丙氨酸所替换，其余均高度符合两保守结构域特征，因此而根据相关命名规则，将序列Glyma11g06940命名为GmHdz4。

图2多物种HD-ZipⅠ蛋白序列的系统进化分析；

拟南芥，水稻，野生大豆，栽培大豆4个物种的HD-ZipⅠ蛋白序列经Neighbor-Joining(NJ)法计算后被聚类到α至Φ8个亚组中；其中，GmHdz4属于δ亚组，与野生大豆Gshdz4(KHN42008.1)属于直系同源。

图3为GmHdz4组织特异性表达分析；

目的基因GmHdz4基因在大豆根系中的相对表达量约为叶片中的60倍，显著高于其它组织中的表达量；表明GmHdz4基因可能主要在根系中发挥功能。

图4为PEG模拟干旱胁迫下根系GmHdz4的表达变化；

干旱处理后12小时内GmHdz4的表达量呈阶梯状显著下降的趋势，12小时后GmHdz4的表达量仍小幅下降但无显著趋势，基本保持在处理前相对表达量0.2左右的较低水平

图5为pTF102过表达载体；

含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和草铵膦抗性基因(Bar)两个标记基因。

图6为pBGK041载体；

pBGK041载体的Cas9蛋白经密码子优化，采用大豆U6启动子表达gRNA序列，并含有Bar基因能高效地用于双子叶植物特别是大豆的基因敲除。

图7发根农杆菌介导的GmHdz4过表达(左框)和基因编辑(右框)发状根的GUS、PCR和测序鉴定；

图7中，

A为对照根系的GUS染色图；

B为GmHdz4过表达根系的GUS染色图；

C为GmHdz4过表达根系每一条根目的基因的PCR扩增条带；

D为基因编辑根系每一条根目的基因的PCR扩增条带；

E为基因编辑根系每一条根目的基因的测序结果。

由过表达发状根(左框)可知，GUS染色后，大部分能被染成蓝色，仅个别几条根的染色结果呈阴性。结合Bar基因PCR检测结果表明GmHdz4-oe平均单株阳性诱导率为85.7％；基因编辑(右框)发状根gmhdz4的Bar基因PCR结果：单株阳性诱导率约89.3％；靶位点序列测序结果显示，单株发状根两条染色体同时编辑率约为35.7％。

图8为2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱前后野生型、过表达GmHdz4-oe和Crisp/cas9 gmhdz4三个独立转基因株系嵌合体大豆地上部分的长势。

图8中，

A为干旱处理前对照株系生长情况；

B为干旱处理前基因编辑株系生长情况；

C为干旱处理前过表达株系生长情况；

D为干旱处理8天对照株系生长情况；

E为干旱处理8天基因编辑株系生长情况；

F为干旱处理8天过表达株系生长情况。

这些转基因株系是由发根农杆菌获得的，是转基因嵌合体，地下部分根系为转基因，地上部分为非转基因。由肉眼可见，干旱处理前野生型(图8A)和Crisp/cas9 gmhdz4(图8B)叶片嫩绿挺阔、株高正常，而过表达株系GmHdz4-oe(图8C)则叶片失绿泛黄、整株矮小，相对于野生型和基因编辑大豆明显生长迟缓；15％PEG8000模拟干旱处理8天后：野生型(图8D)和Crisp/cas9 gmhdz4(图8E)第一和第二片真叶出现不同程度的萎蔫但叶片仍保持绿色，而GmHdz4-oe(图8F)第二片真叶已萎蔫泛黄，大多数第一片真叶已干枯脱落且植株仍然比另两株系矮小。

图9为2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱处理对转基因大豆毛状根根系形态建成的影响；

图9中，A、B、C分别为PEG胁迫处理前非转基因大豆野生型、基因编辑gmhdz4和过表达GmHdz4大豆毛状根系形态，D、E、F则分别为PEG胁迫处理8天后这三种毛状根的根系形态。由肉眼可见毛状根根系形态结构发生了很大的变化，基因编辑gmhdz4(图9E)根系在2.5MPEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱下分枝根明显变多，且根的直径较粗。具体数值见图10。

图10为2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)处理前后野生型、基因编辑gmhdz4和过表达GmHdz4大豆毛状根系的形态指标；

敲除株系总根长在干旱处理后涨幅显著高于野生型，且根系平均直径下降29.2％，而野生型发状根无明显粗细的变化；处理后敲除毛状根根系根尖数约为其原有根尖的2.2倍，野生型根系根尖仅增长至1.8倍，过表达毛状根系各项形态指标均最低，根系的生长发育明显受到抑制。敲除该基因的株系根系生长受到促进，这可能与有利于大豆抗旱有关。

图11是GmHdz4 CDS序列(Glyma11g06940)，带下划线的为His标签。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、GmHdz4序列的获取、生物信息学分析及组织特异性表达分析：

根据野生大豆Gshdz4(KHN42008.1)蛋白序列在BLAST中的比对结果，栽培大豆基因组中有1个Gshdz4的同源序列Glyma11g06940，序列相似度高达98％。该序列包含648bpCDs(SEQ ID NO.1)，编码215个氨基酸。将Glyma11g06940与大豆HD-ZipⅠ其他已知的35个成员氨基酸序列进行比对。Clusatlx对大豆HD-ZipⅠ家族蛋白的多序列联配结果显示(图1)，虽然个别基因在亮氨酸拉链保守结构域的后几个亮氨酸位点上存在苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸的替换，但该家族所有氨基酸序列的同源异型域HD均高度保守，亮氨酸拉链结构域LZ也相对保守。Glyma11g06940序列也只有最末位亮氨酸位点被丙氨酸所替换，其余均高度符合两保守结构域特征，因此而根据相关命名规则，将序列Glyma11g06940命名为GmHdz4。

利用拟南芥、水稻、野生大豆和大豆HD-ZipⅠ蛋白的全长序列进行比对并通过软件MEGA5.0构建了NJ系统发生树，揭示了4物种HD-ZipⅠ蛋白之间的进化关系(图2)。HD-ZipⅠ蛋白被聚类到α、β1、ζ、γ、ε、β2、δ、Φ等8个亚组中，且其分布具有明显的物种偏好。β1、ζ、ε和Φ4个亚组中均不存在水稻HD-ZipⅠ蛋白，而其它4亚组则包含4物种的HD-ZipⅠ，且ζ亚组中只含有大豆和野生大豆序列，而Φ亚组则只含有拟南芥。推测HD-ZipⅠ亚组的分化起始应该在单双子叶植物分化之前，并在单双子叶植物分化后持续分化，同时这亚组的聚类关系也进一步阐明了各物种HD-ZipⅠ基因之间的旁系和同源关系。GmHdz4位于δ亚组，与Gshdz4(KHN42008.1)属于直系同源基因。

大豆根茎叶花荚等组织中GmHdz4相对表达量的荧光定量检测方法具体为：取适量大豆组织用Trizol法提取各组织中总RNA；Nanodrop微量测试仪测定RNA浓度后反转录合成cDNA并进行浓度均一化；使用诺维赞ChamQ SYBR qPCR预混酶液(Vazyme,中国南京)进行qRT-PCR反应，同时进行3个生物学重复和3个技术重复；最后按2^-ΔΔCt法计算GmHdz4在各组织中的相对表达量。

所得结果为：大豆根茎叶花荚等组织中GmHdz4相对表达量的荧光定量检测结果显示(图3)，以叶片中Gmhdz4的表达量为对照，根系中该基因的相对表达量是叶中约60倍，显著高于其他的组织中的表达量，表明Gmhdz4可能主要在大豆根系中发挥相应功能。

2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱处理方法具体为：挑选大粒饱满无病无裂纹的大豆种子，细沙中播种萌发，第一片单叶展开时移至1/2Hoagland营养液中培养；用Hoagland营养液配置2.5M PEG 8000，调整pH 5.8，分别在处理0h、3h、6h、12h、1d、2d和4d后将根系取样，提取叶片RNA进行GmHdz4定量表达分析。

所得结果为：2.5M PEG8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱处理对大豆根系GmHdz4表达量分析表明(图4)干旱处理后12小时内GmHdz4的表达量呈阶梯状显著下降的趋势，12小时后GmHdz4的表达量仍小幅下降但无显著趋势，基本保持在处理前相对表达量0.2左右的较低水平。

实施例2、基因的克隆、表达载体和编辑载体的构建和发根农杆菌介导转化和嵌合体幼苗的鉴定

采用PCR方法扩增GmHdz4 CDs序列，所用的GmHdz4引物为：F:GACCACCTTTCCAAGACCACA；R:AGCTCCATTGCCAGCCTATC，扩增条件为94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环，72℃延伸5分钟，扩增体系为：Taq Mix 10μl，正向引物0.8μl，反向引物0.8μl，模板cDNA 1μl，ddH₂O 7.4μl。

扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，特异性目的条带进行回收并测序，验证为GmHdz4 CDs序列(SEQ ID NO.1)的目的条带用于载体的构建。

以pTF102作为过表达载体的基础载体(图5)，该载体含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因(Bar)，表现为除草剂草丁膦的抗性作为标记基因，通过EcoRI位点将目的基因Gmhdz4及CaMV35s启动子和终止子连接到pTF102载体中(连接方法可参照常规的酶切重组法)，构成GmHdz4超表达载体。

以pBGK041载体为基因编辑基础载体(图6)，该载体的Cas9蛋白经密码子优化，采用大豆U6启动子表达gRNA序列，同时含有Bar基因能高效地用于大豆的基因敲除。

采用冻融法将载体质粒(GmHdz4超表达载体、pBGK041载体)转入发根农杆菌中用于大豆发根农杆菌的转化，GmHdz4超表达载体对应所得的称为pGmHdz4，pBGK041载体对应所得的称为pgmhdz4。

以发芽4天除去根的大豆幼苗作为外植体进行发根农杆菌转化，以草丁膦作为筛选标记，通过外植体分离、农杆菌侵染、农杆菌共培养、农杆菌发根培养，得到嵌合体株系。由含pGmHdz4农杆菌侵染转化产生的嵌合体株系仅在根系过表达GmHdz4基因(下文记为GmHdz4-oe)；由含pgmhdz4农杆菌侵染转化产生的嵌合体株系仅根系中GmHdz4基因被敲除(下文记为gmhdz4)；而用空载体农杆菌侵染转化所得嵌合体株系作为后续实验的对照株系(下文记为NT)。说明：该内容可依据常规的农杆菌介导的基因转化法进行。

将所述的转基因和基因编辑幼苗嵌合体采用GUS染色(图7A和图7B)、目的基因PCR方法(图7C、图7D)及基因编辑根系进行靶标位点前后序列测序鉴定(图7E)，验证明确为转基因和基因敲除根系的嵌合体幼苗用于抗旱性的鉴定。

实施例3、转基因和基因敲除根系嵌合体幼苗的根系形态和抗旱性鉴定

PEG模拟干旱参照常规的2.5M PEG8000(渗透式-0.54Mpa)进行模拟干旱处理。

选取独立的转基因(GmHdz4-oe)和基因敲除(gmhdz4)根系嵌合体幼苗各三个重复，对照(NT)为不含质粒的空载体非转基因嵌合体幼苗，在PEG模拟干旱前，发现二叶期三个株系发状根嵌合体大豆地上部分的长势就存在肉眼可见的差异(图8A，图8B和图8C)：对照株系和基因编辑株系gmhdz4干旱处理前叶片嫩绿挺阔、株高正常，且两株系看不出长势的差别，而过表达株系GmHdz4-oe则叶片失绿泛黄、整株矮小，相对于另外两株系明显生长迟缓。2.5M PEG8000模拟干旱处理8天后，三个株系均出现一定程度的萎蔫(图8D，图8E和图8F)，NT和gmhdz4第一和第二片真叶出现不同程度的萎蔫但叶片仍保持绿色，而GmHdz4-oe株系各生物学重复的第二片真叶均已萎蔫泛黄，大多数第一片真叶已经干枯脱落且植株矮小。

根系扫描发现转基因、基因敲除和对照干旱处理前后各根系形态存在鲜明的差别(图9)，且各根系参数也都发生了显著变化(图10)。基因编辑gmhdz4株系与NT株系相比，发状根总根长从不到500cm增涨到干旱8天后接近2000cm，涨幅显著高于NT株系；从根系平均直径来看基因敲除gmhdz4根系在干旱处理后显著变细而NT的根整体来看没有粗细的变化；转基因和基因敲除株系根尖数均有明显增多，干旱处理后gmhdz4的根尖数超过其原有根尖的2倍，涨幅显著大于NT株系；与根长、根系直径和根尖数协同变化的指标——根系表面积的变化趋势也与前三者相应，gmhdz4根系表面积的涨幅要更为显著。而过表达株系GmHdz4-oe除平均根系直径在干旱前后均大于另两株系外，其余根系形态指标都极显著低于对照和基因敲除根系。

GmHdz4基因在根系的过表达使植株正常的生长受到抑制。干旱处理前后过表达、敲除和对照植株干物质量的积累情况如表1所示。在进行干旱处理前GmHdz4过表达株系的根系干重为NT的18.6％，地上部分的干重也仅有NT的60.8％；敲除株系gmhdz4的根系干重在处理前约为NT的二分之一，而两者地上部分具有相近干重。经过8天干旱处理后过表达株系GmHdz4-oe的干重仍显著低于对照NT，平均干重仅为NT的60.7％；反而敲除该基因促进了干旱胁迫下植株的干物质积累，gmhdz4干旱8天后的干重在统计学意义上显著高于NT，其根系是干物质量贡献最大的组织。对比干旱前后，gmhdz4的根系干物质增长率要显著高于NT，GmHdz4-oe根系虽然干物质增长率也较高，但其实际干物质量还处于较低水平，还不到其他两株系的一半。另外根据根冠比来看，干旱处理8天后三株系根冠比由大到小依次为gmhdz4，NT，GmHdz4-oe，表明gmhdz4能较多地提高根系比重，更利于在干旱环境下吸收水分。

根系形态和干物质量的数据充分说明了干旱胁迫下GmHdz4基因对大豆生长的影响。该转录因子在根系中的过表达显著抑制了大豆根系的正常生长发育，这种抑制作用甚至影响到GmHdz4-oe株系的地上部分。而GmHdz4转录因子的敲除使得大豆在干旱胁迫下表现出更好生物量分配策略：其更长的根系更多的分支、与土壤更多的接触面积，更有利于提高植株耐旱能力，对大豆在干旱胁迫下的生长起到促进作用。

表1、干旱处理前后各株系干物质量及根冠比

根据表1得知：15％PEG6000模拟干旱处理前后，野生型与基因编辑gmhdz4地上部分干重均相似，过表达GmHdz4大豆株系地上部分干重仅约有前两者的二分之一。干旱处理后，敲除株系毛状根根系的干物质量总量最高，且积累速率约为野生型的3.4倍。根冠比更充分地说明在干旱胁迫下敲除株系gmhdz4生长情况优于野生型，而过表达GmHdz4则使植株生长受到明显抑制。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南浙江大学研究院

<120> HD-Zip转录因子GmHdz4基因及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaatcatc gaccaccttt ccaagaccac atgatgctca tgtctcagtt attccctgct 60

gatgcataca ctcaaattat ttctcaacaa ggagagacta ataagaagcc aagacgccgt 120

cgtaacaaga agaacaaagg aggagaaaac ggtgcctcgg aagccaacaa gaagaggaag 180

cttagtgagg tgcaagttaa tttacttgaa caaaactttg gaaatgaacg caaacttgag 240

tccgaaagaa aggataggct ggcaatggag cttggtttgg accctcgaca agttgctgtg 300

tggtttcaaa acagaagagc ccgttggaag aacaaaaagt tggaagaaga gtactccagc 360

cttaaaaaaa atcatgaagc caccttgctt gagaaatgtt gcctggagag tgaggtgttg 420

aagctcaaag agcaactttc tgaggcagag aaagagattc agaggctgct agagagtgcc 480

gagagagtcc caagcaacag ttctagttcg tcacagtcac aatcaatgga agcggtggac 540

ccaccattct ttggggaatt tggagttgat ggatatgagg atgatgtgtt ttacgtgcct 600

gagacccatt acatcaacgg catggaatgg attaatctgt atatgcatca ccaccaccac 660

cactaa 666

Claims (3)

1.HD-Zip转录因子GmHdz4基因，其特征是核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的HD-Zip转录因子GmHdz4基因的用途，其特征是：调控大豆侧根根系形态建成。

3.根据权利要求2所述的HD-Zip转录因子GmHdz4基因的用途，其特征是：提高大豆耐旱性。

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