MX2008011055A

MX2008011055A - Plantas resistentes a enfermedades.

Info

Publication number: MX2008011055A
Application number: MX2008011055A
Authority: MX
Inventors: Suzan Herma Elisabeth Johanna Gabriels; Jack Hubertus Vossen; Matthieu Henri Antoon Jozef Joosten; Peter Jozef Gerard Marie De Wit
Original assignee: Keygene Nv
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2008-12-09
Also published as: JP2009528053A; CA2638820A1; EP1991681A1; AU2006339460B2; CN101415828B; WO2007100238A1; IL193760A0; AU2006339460A1; BRPI0621375A2; JP5173847B2; CN101415828A; IL193760A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para producir plantas que tienen resistencia mejorada a enfermedades. Se proporcionan proteínas de NRC1 y secuencias de ácido nucleico que codifican estas, así como también plantas transgénicas que producen proteínas NRC1.

Description

PLANTAS RESISTENTES A ENFERMEDADES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a plantas transgénicas y células de plantas que comprende un gen que codifica una proteina NCR1 (NB-LRR Requerida para Muerte Celular asociada con HR 1) integrada en su genoma y métodos para elaborar tales plantas y células. Se proporcionan especialmente plantas Solanáceas y partes de planta (semillas, fruto, hojas, etc.) con resistencia intensificada a enfermedad. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican proteínas NCR1 de conformidad con la invención, vectores que las comprenden, así como las mismas proteínas NCR1 aisladas. Además, se proporcionan las células de planta y plantas que comprenden una o más mutaciones en un alelo NCR1 endógeno, por lo cual las mutaciones confieren resistencia intensificada a enfermedades a las plantas y células de planta .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La defensa activa de las plantas provoca en reconocimiento de un factor de avirulencia de un patógeno mediada por un gen de resistencia, siguiendo el modelo gen por gen (Dangl and Jones, 2001, Nature 411, 826-833). A la fecha, varios genes resistentes de planta (genes R) se han clonado y se basan en la estructura de las proteínas codificadas, los genes se dividen en varios grupos (Hammond-Kosach and Jones, 1997, Annu, Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48, 575-607). Muchos genes R codifican proteínas NB-LRR citoplasmáticas, que contienen un sitio de enlace al nucleótido (NB) y repeticiones ricas en leucina (LLR) . Este grupo consiste de genes que codifican proteínas CC-NB-LLR, que contiene un dominio superenrollado y genes que codifican proteínas que tienen un dominio similar a receptores Toll e interleucina (IL) de mamífero, las así llamadas proteínas TIR-NB-LLR (Hammond-Kosack and Jones, 1997, supra) . Usar tales genes de resistencia específica en programas de mejora genética para resistencia durable es problemático, ya que la patogénesis fácilmente burla el reconocimiento para mutaciones en sus factores de avirulencia, por lo tanto previene la inducción de defensa activa (Westerink et al., 2004, Mol. Microbiol, 54, 533-545). Similarmente entre proteínas resistentes (proteínas R) , se sugiere la existencia de trayectorias resistentes comunes (Shirasu and Schulze-Lefert , 2000, Plant Mol. Biol. 44, 371-385) . Por lo tanto, la identificación de genes adicionales requeridos para resistencia, no solamente proporciona información en cómo tales trayectorias de señalización funcionan, sino también puede ser capaz de identificar genes que juegan un papel más general en resistencia. Por ejemplo, el silenciamiento del gen inducido por virus (VIGS) en Nicotiana benthamiana se muestra de forma que SGT1 es involucrado en trayectorias de defensa múltiple, tales como N-, Rx- y HR mediadas por Pto y resistencia, y HR mediada por Cf-4- y Cf-9 (Peart et al., 2002, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 99, 10865-10869; Zhang et al., 2004, Plant J. 40, 213-224). SGT1 es un interactor de SKP1, el cual es un componente del complejo E3-ligasa SCF que es involucrado en ubiquitinación de proteínas, una modificación la cual es objetivo para la degradación ( Schwechheimer and Schwager, 2004, Plant Cell Reports 23, 353-364) . Se planea una hipótesis que el silenciamiento de un gen esencial de este sistema de degradación de proteína dificulta los proceso de ubiquitinación, por lo tanto inhibe la degradación de reguladores negativos, lo cual es requerido para activación de defensa (Azevedo et al., 2002, Science 295, 2073-2076) . En varias trayectorias de resistencia, se activan las MAPKs (proteína cinasa activada por mitógeno) (Zhang and Klessig, 2001, Trends Plant Sci. 6, 520-527; Pedley and Martin, 2005, Curr. Opin. Plant. Biol. 8, 541-547). Se activan en plantas de tabaco que contienen Cf-9 y cultivos celulares cargados con Avr9, Nt IPK (proteína cinasa inducida por herida) y NtSIPK (proteina cinasa inducida por ácido salicilico) (Romeirs et al., 1999, Plant Cell 11, 273-287) . VIGS de una NtCDPK (proteina cinasa dependiente de calcio) en N. benthamiana inhibe el HR dependiente de Cf-9/Avr9 y Cf-4/Avr4 (Romeis et al., 2001, EMBO J. 20, 5556-5567) y VIGS de LeACIKl (cinasa 1 inducida por Avr/Cf) en tomate, resulta en resistencia reducida en C. fulvum (Rowland et al., 2005, Plant Cell 17, 295-310). La activación de cinasas durante la defensa y la resistencia reducida después de la "desactivación" de sus genes codificantes que soportan su función en activación de defensa . Siguiendo un procedimiento predispuesto, 21 genes conocidos por estar involucrados en la señalización relacionada con la defensa se usaron para VIGS en tomate y se encontró que nueve de ellos están involucrados en la resistencia mediada por Pto. Entre estos están dos genes que codifican a APKKs (LeMeKl y LeMEK2), y dos genes que codifican a MAPKs (LeNTF6 y LeWIPK) (Ekengren et al., 2003, Plant J. 36, 905-917) . En otro estudio, más de 2400 ADNc de una biblioteca normalizada de ADNc de N. benthamiana se clonaron en un vector a base de Virus X de papa y se usaron para VIGS en N. benthamiana. Aproximadamente 3% de los ADNc se afectan por HR dependiente de Pto después del silenciamiento . Entre estos, se identificó un MAPKKKa como un regulador positivo de tanto resistencia como enfermedad (Del Pozo et al., 2004, EMBO J. 23, 3072-3082). Lu et al. (2003, EMBO J. 22, 5690-5699) realizó VIGS usando 4992 ADNc a partir de una biblioteca de ADNc de N. benthamiana normalizada clonada en un vector PVX . De los ADNs, 79 (1.6%) corresponden a genes requeridos para HR mediado por Pto, mientras el silenciamiento de solamente seis de ellos también deteriora la resistencia mediada por Pto contra Pseudomonas syringae . El VIGS usando un ADNc correspondiente a HSP90 abóle no solamente HR mediado por Pto, sino también resistencia mediada por Pto, Rx y N, que indica que se requiere HSP90 en trayectorias de resistencia a enfermedades múltiples. La misma serie de ADNc también se usa para VIGS en N. benthamiana , después de lo cual las plantas se inocularon con una cepa etiquetada con GFP de TMV. La resistencia contra TMV fue más significantemente suprimida después del silenciamiento usando un fragmento de ADNc derivado de un gen que codifica a CC-NB-LRR, referido como NRG1 (gen 1 de requerimiento N) (Peart et al., 2005, Curr. Biol. 15, 968-973). El NRG1 mostró ser específicamente requerido para la función del gen N, indicando que las proteínas de CC-NB-LLR no solamente actúan como proteínas de resistencia involucradas en el reconocimiento de factores de avirulencia, sino también, están involucrados en la trayectoria de señalización iniciada por la proteina N TIR-NB-LRR, la cual conduce eventualmente a resistencia (Peart et al., 2005, supra) . De este modo, aunque la proteina NRG1 de tabaco funciona corriente abajo de la cascada de señalización de defensa de la planta iniciada por una proteina de resistente, tiene la desventaja de que está específicamente involucrada en la resistencia mediada por N contra el virus del mosaico del tabaco (TMV) y no es un cofactor general de resistencia a enfermedad (resistencia mediada por Rx y Pto contra PVC y Pseudomonas syringae, no son afectados por el silenciamiento de NRG1), con ello, no puede ser adecuado para crear resistencia amplia contra patógeno en cultivos tales como tomate. Debido a la información incrementada acerca de las trayectorias de resistencia a enfermedad, existe todavía una necesidad en la identificación de genes y proteínas las cuales pueden ser usadas para crear plantas con resistencia a enfermedades de intervalo amplio, durables. Es un objeto de la invención, proporcionar tales ácidos nucleicos, proteínas y métodos para crear plantas, especialmente plantas que pertenecen a la familia Solanaceae, con resistencia intensificada a enfermedades.

DEFINICIONES GENERALES "HR" se refiere a la respuesta hipersensible, es decir, muerte de células de planta local, vista como ya sea lesiones microscópicas (como se describe por Rivas and Thomas, 2005, Ann Rev Phytopath 43:395-436) y/o lesiones macroscópicas. La muerte de células hipersensibles está usualmente asociada con otras respuestas de plantas, tales como producción de especies de oxigeno reactivo y la activación de genes relacionados con la defensa en células que circundan la lesión HR. "Patógenos de plantas", se refiere a los agentes bióticos los cuales son capaces de causar enfermedades con plantas, tales como hongos patogénicos de plantas, virus, oomicetes, organismos similares a micoplasma, nemátodos, mosquita blanca y áfidos y similares. En general, todas las cepas, razas o patovars de especies de patógenos las cuales son capaces de causar enfermedades en el tejido hospedero, están incluidas en la presente. "Patógenos biotróficos de plantas" o "biótrofo", se refiere a un patógeno que mantiene las células de planta hospederas vivas y depende de las células vivas para crecimiento y colonización de tejido. "Patógeno hemibiotrófico de planta" o "hemibiótrofo" , se refiere a un patógeno de planta el cual mantiene las células hospederas vivas durante al menos, parte de su ciclo de vida. "Patógeno necrotrófico de planta", se refiere a un patógeno de planta el cual activamente elimina células de planta después de la colonización del tejido, produciendo enzimas tóxicas, proteínas o metabolitos que eliminan las células hospederas. "HR dependiente del elicitor", se refiere a una respuesta hipersensitiva la cual se desarrolla sin un patógeno o un elicitor patógeno (por ejemplo, una proteína Avr fúngica) estando presente. Cuando se refiere a plantas que expresan una proteína NRC1 de conformidad con la invención (por ejemplo, una proteína NRC1 constitutivamente activa) , también se puede distinguir entre "HR constitutivo", por medio del cual se hace referencia al desarrollo de lesiones de HR en la ausencia de patógenos o proteínas elicitoras de patógenos, e "inducido por HR", por medio del cual se hace referencia al desarrollo de lesiones de HR en la presencia de un estímulo inductor (por ejemplo, después de la inducción del promotor el cual acciona la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína NRC1 o variante de la misma) . " Solanaceae" , se refiere en la presente al género de plantas, especies y variantes de las mismas, que pertenecen a la familia Solanaceae . Estas incluyen especies que pertenecen al género Solanum (que incluyen Solanum lycopersicum, el cual se usa por ser conocido como Lycopersicon esculentum) , Nicotiana , Capsicum, Petunia y otros géneros. "Resistencia a enfermedades", se refiere en la presente, a varios niveles de resistencia o tolerancia a enfermedad de una planta, que incluye resistencia moderada y alta resistencia o completa resistencia a uno o más patógenos. Se puede medir y opcionalmente cuantificar por comparación de síntomas causados por patógenos (tales como frecuencia y/o tamaño de lesiones HR, micelio fúngico, etc.), con relación a aquellos vistos en plantas de control susceptibles cuando se hacen crecer bajo presión de enfermedad idéntica. Tales bioensayos de enfermedad se pueden llevar a cabo usando métodos conocidos. La resistencia a enfermedad también puede ser indirectamente medida como rendimiento superior de plantas resistentes, comparado con plantas susceptibles cuando se hacen crecer bajo presión de enfermedad. "Resistencia intensificada a enfermedad", se refiere a cualquier incremento estadísticamente significante en resistencia a enfermedad de una planta o tejido de planta, comparado con un control adecuado. Tanto un incremento cualitativo (por ejemplo, de susceptible a resistente) como un incremento cuantitativo, están abarcados en la presente. También se abarca tanto una reducción de incidencia de enfermedad (porcentaje de plantas que llegan a ser infectadas) y/o de severidad de enfermedad. Preferiblemente, una planta que tiene resistencia intensificada a enfermedad con al menos un patógeno, es una planta que comprende al menos, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, o aún 100% niveles superiores de resistencia al patógeno que la planta de control, usando los bioensayos apropiados y/o ensayos de campo para valorar la resistencia a enfermedades. Resistencia a enfermedad de "amplio espectro", se refiere a resistencia intensificada contra al menos dos, tres, cuatro o más patógenos de diferentes especies de patógenos. Por ejemplo, una planta hospedera que tiene resistencia mejorada a varias especies de patógenos biotróficos y/o hemibiotróficos y/o necrotróficos , podrían ser consideradas por tener resistencia de amplio espectro. "Síntomas causados por patógeno", incluyen cualquiera de los síntomas de enfermedad, tales como crecimiento de micelio/biomasa dentro/sobre el tejido hospedero, crecimiento bacteriano/biomasa , tamaño y/o frecuencia de lesiones necróticas o cloróticas en el tejido de la planta, tamaño y/o frecuencia de chancros, etc. El término "secuencia de ácido nucleico", (o molécula de ácido nucleico) , se refiere a una molécula de ADN o ARN en una forma de hebra única o doble, particularmente un ADN que codifica una proteína o fragmento de proteína de conformidad con la invención. Una "secuencia de ácido nucleico aislada", se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual no es más larga en el ambiente natural a partir del cual se aisló, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico en una célula bacteriana o en el genoma plastidico o nuclear de la planta. Los términos "proteína" o "polipéptido" , son usados intercambiablemente y se refieren a moléculas que consisten de una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo específico de acción, tamaño, estructura 3 dimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" de una proteína, puede de este modo, todavía ser referido como a una "proteína". Una "proteína aislada", es usada para referirse a una proteína la cual no es más larga en su ambiente natural, por ejemplo, in vitro o en una célula de hospedero de planta o bacteriano recombinante . "Funcional", con relación a proteínas NRC1 (o variantes, tales como ortólogos o mutantes, y fragmentos) , se refiere a la capacidad para modificar el desarrollo (cuantitativo y/o cualitativo) de lesiones HR y/o el nivel de resistencia a enfermedad, modificando el nivel de expresión del gen que codifica a NRC1 (por ejemplo, por sobreexpresión o silenciamiento) en una planta. Por ejemplo, la funcionalidad de una proteína NRC1 putativa obtenida de especies X de planta, puede ser probada por varios métodos. Si la proteína es funcional, el silenciaraiento del gen NRCl que codifica la proteina en especies de plantas X, usando por ejemplo, vectores de silenciamiento de gen o VIGS, conducirá a una reducción o supresión de lesiones HR inducidas por elicitor o patógeno y/o a una reducción de resistencia a patógenos, como se muestra en los Ejemplos para tomate. También, la complementación con una proteina NRCl funcional, será capaz de restaurar las lesiones HR y/o resistencia a patógenos. Alternativamente, la (sobre) expresión temporal o estable en especies X del gen que codifica la proteina NRCl (opcionalmente junto con un inhibidor de silenciamiento del gen post-transcripcional ) , conducirá al desarrollo de las lesiones HR independientes del elicitor y/o resistencia intensificada a enfermedades, especialmente contra patógenos biotróficos y/o hemi-biotróficos . Véase también los ejemplos. El término "gen", significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita) , la cual es transcrita en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, operablemente ligada a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor) . Un gen puede de este modo, comprender varias secuencias operablemente ligadas, tales como un promotor, una secuencia líder al 5' que comprende por ejemplo, secuencias involucradas en la iniciación de la traducción, una región codificante (proteina (ADNc o ADN genómico) y una secuencia no traducida al 3' que comprende por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción. Un "gen quimérico" (o gen recombinante ) , se refiere a cualquier gen, el cual no se encuentra normalmente en la naturaleza en unas especies, en particular, un gen en el cual, una o más partes de la secuencia de ácido nucleico están presentes, que no están asociadas entre si en la naturaleza. Por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región transcrita o con otra región reguladora. El término "gen quimérico", se entiende por incluir los constructos de expresión en los cuales, una secuencia reguladora de la transcripción o promotora, está operablemente ligada a una o más secuencias codificantes o a una secuencia antisentido o invertida repetida (complemento inverso de la hebra sentido) (sentido y antisentido, por medio del cual, el transcripto de ARN forma ARN de doble hebra después de la transcripción) . Una "UTR 3'" o " secuencia no traducida al 3"', (también a menudo referida como una región no traducida al 3' o extremo 3'), se refiere a la secuencia de ácido nucleico encontrada corriente abajo de la secuencia codificante de un gen, la cual comprende por ejemplo, un sitio de terminación de la transcripción y (en la mayoría, pero no en todos los ARNm eucarióticos ) , una señal de poliadenilación (tal como por ejemplo, AAUAAA o variantes de las mismas) . Después de la terminación de la transcripción, el transcripto de ARNm puede ser desdoblado corriente abajo de la señal de poliadenilación y una cola poli (A) puede ser agregada, la cual está involucrada en el transporte del ARNm al citoplasma (en donde toma lugar la traducción) . La "Expresión de un gen", se refiere al proceso en donde una región de ADN, la cual está operablemente ligada a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, es transcrita en un ARN, el cual es biológicamente activo, es decir, el cual es capaz de ser traducido en una proteina o péptido biológicamente activo (o fragmento peptidico activo) , o el cual es activo el mismo (por ejemplo, en silenciamiento post-transcripcional del gen o ARNi) . Una proteina activa en ciertas modalidades, se refiere a una proteina siendo constitutivamente activa. La secuencia codificante está preferiblemente, en orientación sentido y codifica una proteina biológicamente activa, deseada o péptido, o un fragmento de péptido activo. En procedimientos de silenciamiento de gen, la secuencia de ADN está preferiblemente presente en la forma de un ADN antisentido o un ADN de repetición invertido, que comprende una secuencia corta de un gen objetivo en orientación antisentido o en sentido y antisentido. "Expresión ectópica", se refiere a la expresión en un tejido en el cual el gen no está normalmente expresado. Una "secuencia reguladora de la transcripción" está en la presente, definida como una secuencia de ácido nucleico que es capaz de regular la tasa de transcripción de una secuencia (codificante) operablemente ligada a la secuencia reguladora de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción como se define en la presente, de este modo comprenderá todos los elementos de secuencia necesarios para el inicio de la transcripción (elementos promotores), para mantener y regular la transcripción, que incluye por ejemplo, atenuadores o intensificadores . Aunque la mayoría de las secuencias reguladoras de la transcripción corriente arriba (5') de una secuencia codificante son referidas, las secuencias reguladoras encontradas corriente abajo (3') de una secuencia codificante, también están abarcadas por esta definición. Como se usa en la presente, el término "promotor", se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizados corriente arriba con respecto de la dirección de transcripción del sitio de iniciación de transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de enlace para polimerasa de ARN dependiente del ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquiera de otras secuencias de ADN, que incluyen, pero no se limitan a, sitios de enlace al factor de transcripción, sitios de enlace a la proteina activadora y represora, y cualquiera de otras secuencias de nucleótidos conocidas por uno de habilidad en la técnica, para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "constitutivo", es un promotor que es activo en la mayoría de tejidos bajo las principales condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible", es un promotor que es fisiológicamente (por ejemplo, por aplicación externa de ciertos compuestos) o regulado en cuanto al desarrollo. Un promotor "específico del tejido", es solamente activo en tipos específicos de tejidos o células. Un "promotor activo en plantas o células de plantas", se refiere a la capacidad general del promotor para accionar la transcripción dentro de una planta o célula de planta. No se hacen algunas implicaciones acerca de la actividad espaciotemporal del promotor. Como se usa en la presente, "operablemente ligado", se refiere a un enlace de elementos de polinucleótido en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operablemente ligado", cuando es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, o preferentemente una secuencia reguladora de transcripción, está operablemente ligada a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Operablemente ligado significa que las secuencias de ADN siendo ligadas son típicamente contiguas y, en donde sea necesario, unidas a dos regiones que codifican la proteína, contiguas y en estructura lectora así para producir una "proteína quimérica". Una "proteína quimérica" o "proteína híbrida", es una proteína compuesta de varios "dominios" de proteína (o porciones), los cuales no se encuentran como tales en la naturaleza, sino los cuales se unen para formar una proteína funcional, la cual exhibe la funcionalidad de los dominios unidos (por ejemplo, un dominio superenrollado (CC) , un dominio de enlace de nucleótido (NB-ARC) y una región de Repetición Rica en Leucina (LRR) , pueden ser combinados). Una proteína quimérica también puede ser una proteína de fusión de dos o más proteínas que se originan en la naturaleza. El término "dominio" como se usa en la presente, significa cualquiera de la(s) parte (s) o dominio (s) de la proteína con una estructura o función específica que puede ser transferida a otra proteína para proporcionar una nueva proteína híbrida con al menos, la característica funcional del dominio. Los dominios específicos también _ pueden ser usados para identificar otras proteínas NRCl, tales como ortólogos de NRCl de otras especies de plantas. Los términos "péptido objetivo", se refiere a secuencias de aminoácido las cuales dirigen una proteína, o fragmento de proteína, a organelos intracelulares tales como, plástidos, preferiblemente cloroplastos, mitocondrias, o al espacio extracelular o apoplasto (secreción de péptido señal). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido objetivo, puede ser fusionada (en estructura) , a la secuencia de ácido nucleico que codifica el extremo amino terminal (extremo N-terminal) de la proteína o fragmento de proteína, o puede ser usada para reemplazar un péptido objetivo nativo. Un "constructo de ácido nucleico" o "vector", se entiende en la presente, por significar una molécula de ácido nucleico elaborada por el hombre, que resulta del uso de tecnología de ADN recombinante y la cual se usa para suministrar ADN exógeno en una célula hospedera. El esqueleto del vector puede por ejemplo, ser un vector binario o superbinario (véase por ejemplo, documentos U5591616, US 2002138879 y O95/0672), un vector cointegrado o un vector de T-ADN, como se conoce en la técnica y como se describe en otra parte aquí, en el cual, un gen quimérico está integrado, si una secuencia reguladora de la transcripción adecuada está ya presente, solamente una secuencia de ácido nucleico deseada (por ejemplo, una secuencia codificante, una secuencia antisentido o de repetición invertida) , es integrada corriente abajo de la secuencia reguladora de la transcripción. Los vectores usualmente comprenden elementos genéticos adicionales para facilitar su uso en clonación molecular, tal como por ejemplo, marcadores seleccionables , sitios de clonación múltiples, y similares (véase abajo) . Una "célula hospedera" o una "célula hospedera recombinante" o "célula transformada", son términos que se refieren a una nueva célula individual (u organismo) , que se origina como un resultado de al menos una molécula de ácido nucleico, especialmente que comprende un gen quimérico que codifica una proteina deseada o una secuencia de ácido nucleico la cual después de la transcripción, proporciona un ARN antisentido o un ARN de repetición invertido (o ARN hairpina) , para silenciamiento de una familia de gen/gen objetivo, que ha sido introducido en dicha célula. La célula hospedera es preferiblemente una célula de planta o una célula bacteriana. La célula hospedera puede contener el constructo de ácido nucleico como una molécula de replicación extra-cromosomalmente (episomal), o más preferiblemente, comprende el gen quimérico integrado en el genoma de plástido o nuclear de la célula hospedera. A través del texto, el término "hospedero", puede también referirse a las especies de plantas ho-spederas en las cuales, un patógeno es capaz de invadir o infectar, pero esto será claro a partir del contexto. Las especies de plantas son clasificadas como especies "hospederas" o "no hospederas" con relación a un patógeno. Especies "no hospederas", son completamente inmunes a la infección del patógeno de todas las razas o cepas de un patógeno, aún bajo condiciones óptimas para el desarrollo de la enfermedad. Las especies "hospederas" también son referidas como el "intervalo hospedero" de un patógeno y son inmunes a ciertas razas (pero no a todas) de un patógeno. El término "marcador seleccionable" , es un término familiar para uno de habilidad ordinaria en la técnica y se usa en la presente, para describir cualquier entidad genética la cual, cuando se expresa, puede ser usada para seleccionar una célula o células que contienen el marcador seleccionable. Los producto de gen marcador seleccionable confieren por ejemplo, resistencia antibiótico, o más preferiblemente, resistencia a herbicida u otro rasgo seleccionable tal como un rasgo fenotipico (por ejemplo, un cambio en pigmentación) o requerimientos nutricionales . El término "reportero", es usado principalmente para referirse a marcadores visibles, tales como proteina fluorescente verde (GFP) , eGFP, luciferasa, GUS y similares. El término "ortólogo" de un gen o proteina, se refiere al gen o proteina homólogo encontrado en otras especies, el cual tiene la misma función como el gen o proteina, pero (usualmente) desviado en secuencia a partir del punto de vista de cuando las especies albergan los genes desviados (es decir, los genes desarrollados a partir de un ancestro común por especificación) . Ortólogos del gen de tomate nrcl, pueden de este modo, ser identificados en otras especies de plantas basados en tanto comparaciones de secuencia (por ejemplo, basadas en porcentajes de identidad de secuencia sobre la secuencia completa o sobre dominios específicos) y análisis funcionales. Los términos "homólogos" y "heterólogos" , se refieren a la relación entre una secuencia de aminoácido o ácido nucleico y su célula u organismo hospedero, especialmente en el contexto de organismos transgénicos . Una secuencia homologa es de este modo, naturalmente encontrada en las especies hospederas (por ejemplo, una planta de tomate transformada con un gen de tomate) , mientras una secuencia heteróloga no se encuentra naturalmente en la célula hospedera (por ejemplo, una planta de tomate transformada con una secuencia a partir de plantas de papa). Dependiendo del contexto, el término "homólogo" u "homólogos", puede ser alternativamente referido a secuencias las cuales son descendentes de una secuencia ancestral común (por ejemplo, pueden ser ortólogas) . "Condiciones de hibridización rigurosas", pueden ser usadas para identificar secuencias de nucleótidos, las cuales son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótido dado. Condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. En general, se seleccionan condiciones rigurosas por ser aproximadamente 5°C inferiores que el punto de fusión térmico (Tm) para las secuencias especificas a una intensidad iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo la intensidad iónica y pH definidos), en la cual, 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente apareada. Típicamente, la condiciones rigurosas serán elegidas en las cuales, la concentración de sal es aproximadamente 0.02 molar a pH 7 y la temperatura es al menos, de 60°C. Reduciendo la concentración de sal y/o incrementando la temperatura, se incrementa la rigurosidad. Las condiciones rigurosas para hibridizaciones de ARN-ADN (manchados North usando una sonda de por ejemplo, 100 nt), son por ejemplo, aquellas las cuales incluyen al menos, un lavado en 0.2XSSC a 63°C por 20 minutos, o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para hibridización de ADN-ADN (manchados Southern usando una sonda de por ejemplo, 100 nt) , son por ejemplo, aquellas las cuales incluyen al menos, un lavado (usualmente 2) en 0.2X SSC a una temperatura de al menos 50°C, usualmente aproximadamente 55°C, por 2 minutos, o condiciones equivalentes. Véase también, Sambrook et al., (1989) y Sambrook and Russell (2001) . "Identidad de secuencia" y "similitud de secuencia", pueden ser determinadas por alineación de dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineación local o global. Las secuencias entonces, pueden ser referidas como "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares", cuando ellas (cuando se alinean óptimamente mediante por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT usando parámetros por defecto) portan al menos, un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define abajo) . GAP usa el algoritmo de alineación global Needleman and Wunsch para alinear dos secuencias sobre la longitud completa, maximizando el número de apareamientos y minimizando el número de hendiduras. En general, los parámetros por defecto GAP, son usados, con una penalización de creación de hendidura = 50 ( nucleótidos ) /8 (proteínas) y penalidad de extensión de hendidura = 3 (nucleótidos ) /2 (proteínas). Para nucleótidos, la matriz de registro por defecto se usa en nwsgapdna y para proteínas la matriz de registro por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1991, PNAS 89, 915-919) . Las alineaciones de secuencia y registros para porcentaje de identidad de secuencia, pueden ser determinadas usando programas de computadora, tales como el GCG isconsin Package Versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, o Emboss in versión 2.10.0 (usando el programa "neddle") . Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad, puede ser determinado por búsqueda contra base de datos, usando algoritmos tales como FASTA, BLAST, et . En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprende" y sus conjugaciones, se usa en su sentido no limitante por significar que puntos después de la palabra están incluidos, pero puntos no específicamente mencionados no están excluidos. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "uno", no excluye la posibilidad que más de uno de los elementos está presente, a menos que el contexto claramente requiera que exista uno y solamente uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "uno", de este modo usualmente significa "al menos uno". Se entiende además, que cuando se refiere a "secuencias" en la presente, en general, son referidas las moléculas físicas actuales con una cierta secuencia de subunidades (por ejemplo, aminoácidos) . Como se usa en la presente, el término "planta" incluye células de planta, tejidos u órganos de plantas, protoplastos de planta, cultivos de tejidos de células de plantas, a partir de los cuales las plantas pueden ser regeneradas, callos de planta, grupos de células de plantas, y células de plantas que están intactas en las plantas, o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, frutas (por ejemplo, tomates cultivados) , flores, hojas, semillas, raices, puntas de raices y similares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han usado análisis de ADNc-AFLP, en combinación con VIGS (Silenciamiento de Gen Inducido por Virus), para identificar genes involucrados en HR dependiente de Cf-4/Avr4 y resistencia a enfermedad. Entre los genes de los cuales el VIGS resulta en una supresión del HR inducido por Avr4, se identificó un gen de tomate (referido en la presente como NRCl), que codifica un análogo de proteina de resistencia tipo CC-NB-LLR (en la presente referido como NRCl para proteina NB-LRR Requerida para Muerte Celular 1 Asociada con HR) . El silenciamiento de NRCl en tomate, compromete no solamente el desarrollo de un HR inducido por Avr4, sino también resistencia al patógeno de tomate Cladosporium fulvum. Esto indica que la proteina de resistencia Cf-4 de tomate (una proteina similar al receptor extracelular ) , requiere que una proteina NB-LRR citoplásmica sea funcional. Además, se encontró sorprendentemente que el NRCl está involucrado en resistencia a enfermedad múltiple y HR múltiple/trayectorias de señalización de muerte celular, tales como HR iniciado por Cf-9/Avr-9- , LeEix2/Eix- , Pto/AvrPto- y Rx/CP, (véase ejemplos). Pruebas adicionales están siendo conducidas para determinar si el NRCl está también involucrado en otros HR, tal como el HR mediado por Mi (que confiere resistencia a HR inducido por nemátodos, mosquita blanca y áfidos; véase documentos US 6613962 y EP0937155B1) . De este modo, el NRCl está involucrado en las trayectorias HR activadas por proteínas de resistencia a enfermedades tanto extra como intracelulares , las cuales pertenecen a diferentes clases: proteínas similares al receptor extracelular (RLPs, tales como Cf-4, Cf-9 y LeEix2) , proteínas cinasas Ser/Thr tales como Pto y una proteína CC-NB-LLR (Rx) , la cual confiere resistencia a respectivamente, hongos {Cladosporium fulvum y Trichoderma viridae) , una bacteria (Pseudomonas syringae pv tomato) o un virus ( PVX) . La proteína NRCl (y el gen NRCl que lo codifica) , puede ser usada para conferir o intensificar la resistencia a la planta contra una variedad de patógenos, especialmente patógenos de plantas biotróficas y hemibiotróficas , sino también a patógenos de planta necrotróficos tales como especies de Botrytis. Especialmente, la expresión de NRC1 (o variantes o fragmentos de los mismos, como se define en otra parte), conduce a resistencia intensificada, especialmente contra patógenos biotróficos y/o patógenos I hemibiotróficos, es decir, todos los patógenos l s cuales obtienen nutrientes a partir de células vivas. Sin limitar el campo de la invención, se piensa que la supresión ( silenciamiento de gen) o desactivación (por ejemplo por TILLING) de genes NRC1 endógenos, puede ser usada para conferir o intensificar la resistencia contra patógenos nectrotróficos , ya que la trayectoria que conduce a necrosis es afectada y los patógenos necrotróficos requieren esta trayectoria. De este modo, dependiendo de los patógenos contra los cuales la resistencia es intensificada, ya sea un incremento o una reducción en los niveles de expresión de NRC1 pueden ser usados para intensificar la resistencia. Opcionalmente , ambos procedimientos pueden ser usados en una planta, por ejemplo, bajo el control de diferentes promotores. Por ejemplo, el NRC1 puede ser expresado bajo el control de un promotor inducido por un patógeno (hemi ) -biotrófico, para conferir resistencia a patógenos de hoja biotróficos y/o hemibiotróficos , mientras al mismo tiempo, el gen NRC1 endógeno (o familia del gen) , puede ser silenciado en ciertos tejidos, o después de la inducción por un necrótrofo usando un promotor el cual es inducible por patógenos necrotróficos o heridas. Se encuentra además que, cuando una proteina NRCl constitutivamente activa (NRC1D481V) se produce temporalmente en tomate, el tejido de la planta muestra una muerte celular independiente del elicitor (HR) , que muestra que la expresión de una proteina NRCl funcional puede ser usada para conferir o intensificar la resistencia a enfermedad en plantas.

Proteínas y secuencias de ácido nucleico de conformidad con la invención La proteína NRCl obtenida de tomate muestra baja identidad de secuencia (menos de 25%) a NRG1 de tabaco. El NRCl también contiene un gran número de Repeticiones Ricas en Leucina (LLR) que el NRGl. La estructura de proteína de NRCl se muestra en la figura 1 y la SEC ID NO: 2. En una modalidad de la invención, se proporcionan secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácido de proteínas NRCl (que incluyen ortólogos), así como también métodos para aislar o identificar ortólogos de NRCl en otras especies de plantas, tales como otras Solanaceae, preferiblemente papa. Igualmente, se proporcionan en la presente, métodos para aislar o identificar otros alelos NRCl, tales como alelos de otras especies de tomate, variedades, lineas o accesos. En una modalidad, se proporcionan proteínas NRCl. "Proteínas NRCl" comprenden la proteína representada en la SEC ID NO: 2 (tipo nativo) y 4 (mutante constitutiva), así como también, fragmentos y variantes de los mismos. Variantes de NRCl incluyen por ejemplo, proteínas que tienen al menos, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99%, o más, identidad de secuencia de aminoácido (sobre la longitud completa) a la SEC ID NO: 2 y/o 4. La identidad de secuencia de aminoácido se determina por alineación en forma de pares usando el algoritmo Needleman y unsch y parámetros de omisión GAP como se define anteriormente. Las variantes de NRCl se pueden obtener de varias fuentes, tales como las bases de datos de la secuencia existente, a partir de otras especies de plantas (especialmente otras especies de Solanaceae, tales como papa) u otras variedades o pueden ser elaboradas por síntesis de novo, mutagénesis y similares. Por ejemplo, la SEC ID NO: 4, un mutante NRCl constitutivamente activo, el cual es una variante de la SEC ID NO: 2, y se elabora por mutagénesis dirigida usando traslape de PCR (véase Ejemplos. Las proteínas NRCl de conformidad con la invención, pueden, de este modo, ser aisladas de fuentes naturales, sintetizadas de novo por síntesis química (usando por ejemplo, un sintetizador peptídico tal como el suministrado por Applied Eiosystems), o producido por células hospederas recombinantes expresando las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína NRCl, fragmento o variante. Las variantes NRCl pueden comprender sustituciones de aminoácido conservativo dentro- de las categorías básicas (por ejemplo, Arg, His, Lys;, ecídicas (por ejemplo, Asp, Glu) , no polares (por ejemplo, Ala, Val, Trp, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp) o polar (por ejemplo, Gly, ' Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln) . Además, sustituciones no conservativas de aminoácido caen dentro del campo de la invención. - La funcionalidad de cualquier proteína NRCl, variante o fragmento, puede ser determinada usando varios métodos. Por ejemplo, la sobre expresión "temporal o- estable en células de planta, puede ser usada par?, probar' si la proteína tiene actividad en la planta. La funcionalidad es preferiblemente probada en las mismas especies de plantas a partir de las cuales se obtiene la proteína. De este modo, por ejemplo, la expresión temporal o estable- puede ser usada para determinar si un HR se desarrolla y/c si - la resistencia es intensificada, indicando funcionalidad ; Alterna ivamente, el · silenciamiento de los genes endógenos o familia de gen, mostrará si la proteina NRC1 es funcional. Por ejemplo, VIGS pueden ser usados en una variedad de Solanaceae, tales como papa, tomate y tabaco (véase, Brigneti et al., 2004, Plant Journal 39: 264; Faivre-Rampant et al. Plant Physiology 134: 1308-1316; Baulcombe 1999, Curr. Opinión. Plant Biol. 2: 109-113; Lu et al. 2003, E BO J. 22:5690-5699), en organismos modelos tales como Arabidopsis (urnage et al. 2002, Plant J. 30: 107-114), en monocotiledóneas tales como cebada (Holzberg et al. 2002, Plant J. 30: 315-327). Alternativamente, los vectores de silenciamiento que comprenden fragmentos sentido y antisentido de un gen NRC1, pueden ser usados para transformar células de planta (véase abajo), seguido de un ensayo para determinar si la capacidad para desarrollar lesiones de HR y/o resistencia a enfermedad se modifica . En una modalidad preferida, variantes de NRC1 incluyen proteínas NRC1, las cuales son constitutivamente activas en células de plantas, tales como la proteína NRC1 proporcionadas en la SEC ID NO: 4, la cual comprende una sustitución de aminoácido único en el dominio MHD (D481V) (véase, Figura 1). La actividad constitutiva puede ser probada determinando si la proteína es capaz de provocar un HR en tejido de planta, en la ausencia del elicitor. Por ejemplo, Agroinfiltración de un constructo 35S:NRC1, como se describe en los Ejemplos, puede ser usado para infiltrar tejido de hoja. Otras proteínas NRC1 constitutivamente activas pueden ser elaboradas, ya sea por mutagénesis aleatoria, seguida por pruebas de actividad (como se describe en Bendahame et al., 2002, pl96) , o por mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos únicos en el dominio MHD (cualquiera de los aminoácidos VHD o VHMD, pueden ser reemplazados con otros aminoácidos), el dominio NB-ARC, por ejemplo, en el dominio RNBS-D (aminoácidos FLYFGTFPRGY) , o uno de los dominio 13 LRR (véase Figura 1). Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas NRC1 constitutivamente activas, se pueden obtener a partir de plantas, por ejemplo, mutagenizando semillas y seleccionando estas para determinar la presencia de un fenotipo de lesión espontánea (por ejemplo, lesiones microscópicas), véase por ejemplo, Sharino et al. (2002, The Plant Cell 14:3149-3162), y demás posteriormente . En una modalidad, también se proporcionan proteínas NRC1 quiméricas. Tales proteínas comprenden al menos, un dominio CC, un dominio NB-ARC y preferiblemente, al menos 13 LRR. Un dominio CC-, NB-ARC y LRR, preferiblemente se refiere a porciones de aminoácido que comprenden al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% o más, identidad de secuencia de aminoácido a los aminoácidos 1-150, a aminoácidos 151-508, o a aminoácidos 509-846 de la SEC ID NO:2, respectivamente. Los dominios pueden de este modo, ser intercambiados (dominios de cambio) entre proteina NRC1 o entre proteínas NRC1 y otras proteínas CC-NB-LRR o TIR-NB-LRR, tan pronto como la funcionalidad de la proteína quimérica resultante sea esencialmente similar a aquella de NRC1, o preferiblemente a NRC1D481V. Más preferiblemente, la proteína quimérica retiene la capacidad para conferir o intensificar la resistencia a enfermedades cuando se produce por células de plantas recombinantes , para conferir o intensificar la resistencia a enfermedades cuando se produce por células de plantas recombinantes, como se describe abajo. "Fragmentos" de proteínas NRC1 y de variantes de proteínas NRC1 como se describe anteriormente, comprenden fragmentos de 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 850, 855 aminoácidos contiguos o más. Preferiblemente, tales fragmentos son funcionales en el tejido de la planta, es decir, son capaces de conferir o intensificar la resistencia al patógeno cuando se producen en células de planta. Los fragmentos también pueden ser usados para hacer proteínas quiméricas, como se describe anteriormente. En otra modalidad, se proporcionan las secuencias de ácido nucleico aislado que codifican cualquiera de las proteínas anteriores, variantes o fragmentos, tales como secuencias de ADNc, ADN genómico y ARN . Debido a la degeneración del código genético varias secuencias de ácido nucleico pueden codificar la misma secuencia de amino ácido. Cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas o variantes NRC1 están en la presente, referidas como "NRC1". Las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ácido nucleico que se originan naturalmente, artificiales o sintéticas. Ejemplos de proteínas NRC1 que codifican secuencias de ácido nucleico se proporcionan en la SEC ID NO:l y 3. Se entiende que las secuencias están representadas como secuencias de ADN, mientras el ARN referido con la secuencia de base actual de la molécula de ARN, es idéntico con la diferencia de que la timina (T) es reemplazada por uracilo (U) . También están incluidas variantes y fragmentos de secuencias de ácido nucleico NRC1, tales como secuencias de ácido nucleico que hibridizan a secuencias de ácido nucleico NRC1 bajo condiciones de hibridización rigurosas como se define. Las variantes de secuencias de ácido nucleico NRC1, también incluyen secuencias de ácido nucleico las cuales tienen una identidad de secuencia con la SEC ID NO: 3 (sobre la longitud total), de al menos 50% o más, preferiblemente al menos 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 989.8%, o más. En una modalidad preferida, variantes de NRC1 codifican proteínas NRC1 constitutivamente activas como se describe. Es claro que muchos métodos pueden ser usados para identificar, sintetizar o aislar variantes o fragmentos de secuencias de ácido nucleico NRC1, tales como hibridización de ácido nucleico, tecnología de PCR, análisis in silico y síntesis de ácido nucleico y similares. La secuencia de ácido nucleico, particularmente secuencia de ADN, que codifica las proteínas NRC1 de esta invención, puede ser insertada en vectores de expresión para producir altas cantidades de proteínas NRC1 (o por ejemplo, proteínas NRC1 quiméricas) como se describe abajo. Para expresión óptima en un hospedero, las secuencias de ADN de NRC1, pueden ser de codón optimizado adaptando el empleo de codón a aquella más preferida en genes de planta, particularmente a genes nativos a géneros o especies de plantas de interés (Bennetzen & Hall, 1982, J. Biol . Chem. 257, 3026-3031; Itakura et al., 1977 Science 198, 1056-1063.), usando tablas de empleo de codón disponibles (por ejemplo, hacia la expresión más adaptada en algodón, soya, maíz o arroz) . Las tablas de empleo de codón para varias especies de plantas son publicadas por ejemplo, por Ikemura (1993, In "Plant Molecular Biology Labfax", Croy, ed., Bios Scientific Publishers Ltd.) y Nakamura et al. (2000, Nucí. Acids Res. 28, 292.) y en la base de datos de secuencia de ADN principal (por ejemplo, EMBL at Heidelberg, Alemania).

Por consiguiente, las secuencias sintéticas de ADN pueden ser construidas de manera que se producen las mismas o sustancialmente las mismas proteínas. Varias técnicas para modificar el empleo de codón con aquellas que son preferidas por las células hospederas, se pueden encontrar en un paciente y en la literatura científica. El método exacto de modificación de empleo de codón no es crítico para esta invención. Modificaciones menores a una secuencia de ADN, tal como se describe anteriormente, pueden ser rutinariamente elaboradas, es decir, por mutagénesis mediada por PCR (Ho et al., 1989, Gene 77, 51-59., White et al, 1989, Trends in Genet . 5, 185-189). Modificaciones más profundas a una secuencia de ADN pueden hacerse rutinariamente por la síntesis de ADN de novo de una región codificante deseada usando técnica disponible. También, las secuencias de ácido nucleico NRC1 pueden ser modificadas de manera que el N-término de la proteína NRC1 tiene un contexto de inicio de traducción óptimo, agregando o suprimiendo uno o más aminoácidos al extremo N-terminal de la proteína. A menudo, se prefiere que las proteínas de la invención sean expresadas en células de plantas iniciando con un dipéptido Met-Asp o Met-Ala para inicio de traducción óptimo. Un codón Asp o Ala puede de este modo, ser insertado después del codón Met existente o segundo, Val, puede ser reemplazado por un codón para Asp (GAT o GAC) o Ala (GCT, GCC, GCA o GCG) . Las secuencias de ADN pueden también ser modificadas para remover sitios de empalme ilegítimos. "Fragmentos" de secuencias de ácido nucleico NRC1, incluyen fragmentos de al menos 10, 12, 15, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, o más nucleótidos consecutivos de la SEC ID NO:l o 3, o de variantes de la SEC ID NO:l o 3. Fragmentos cortos pueden ser usados por ejemplo, como cebadores de PCR o sondas de hibridización . En otra modalidad de la invención, se proporcionan cebadores y/o sondas de PCR y kits para detectar las secuencias de ADN o ARN de NRC1. Los pares cebadores de PCR específicos o degenerados para amplificar ADN de NRC1 de muestras, pueden ser sintetizados basados en la SEC ID NO:l o 3 (o variantes de las mismas), como se conoce en la técnica (véase, Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Alemania). Por ejemplo, cualquier estiramiento de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, o más nucleótidos contiguos de la SEC ID NO:l o 3 (o la hebra complemento), pueden ser usados como cebador o sonda. Del mismo modo, fragmentos de ADN de la SEC ID N0:1 o 3 (o variantes de las mismas), pueden ser usados como sondas de hibridización . Un kit de detección de NRC1 puede comprender ya sea, cebadores específicos de NRC1 y/o sondas específicas de NRC1 y un protocolo asociado para usar los cebadores o sondas para detectar ADN de NRC1 en una muestra. Tal kit de detección puede, por ejemplo, ser usado para determinar si una planta se ha transformado con un gen de NRC1 (o parte del mismo) de la invención. Debido a la degeneración del código genético, algunos codones de aminoácido pueden ser reemplazados por otros sin cambiar la secuencia de aminoácido de la proteína. En aún otra modalidad, se proporciona un método para identificar y usar ortólogos o alelos del gen NRC1 de tomate (SEC ID NO: 1 y 3) . El método comprende las etapas de: a) obtener o identificar una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos, 70% de identidad ácido nucleico con la SEC ID NO: 1 y/o 3 (o un porcentaje de identidad de secuencia superior, como se indica anteriormente) , b) modificar opcionalmente la secuencia nucleico para codificar una proteína NRC1 constitutivamente activa, y c) usar la secuencia de ácido nucleico de a) para generar vectores de expresión y/o silenciamiento, o usar la secuencia de ácido nucleico de b) para generar vectores de expresión, d) usar uno o más vectores de c) para transformar una planta o célula (s) de planta (s), preferiblemente de las especies de plantas a partir de las cuales se obtiene el ácido nucleico, e) analizar la capacidad de la planta transformada/tejido de planta, para desarrollar lesiones HR (es decir, fenotipo de lesión HR, el cual puede ser opcionalmente cuantificado) y/o la resistencia a enfermedad de los transformantes para determinar o verificar la función del gen en la planta y/o generar plantas transgénicas que tienen resistencia intensificada a enfermedad; f) seleccionar opcionalmente aquellos alelos u ortólogos para uso adicional, los cuales confieren resistencia intensificada a la enfermedad a la planta transgénica, pero los cuales, después de la expresión, confieren un fenotipo HR débil (es decir, causan o no un fenotipo de lesión HR reducida) . De este modo, alelos u ortólogos NRC1, los cuales después de la expresión en plantas resultan en pocas y/o lesiones HR más pequeñas que las vistas después de la expresión de la SEC ID N0:1 y 3, o después de la expresión del alelo NRC1 de tipo nativo obtenido a partir de las especies hospederas a ser transformadas, pueden ser identificados usando este método. Más preferiblemente, se identifican alelos u ortólogos NRC1, los cuales no causan lesiones HR, o al menos no lesiones HR macroscópicamente visibles, después de la expresión, pero las cuales todavía confieren resistencia intensificada a enfermedades. El fenotipo HR de diferentes alelos y/u ortólogos de NRC1, puede ser comparado haciendo vectores de expresión que usan los mismos promotores, transformando una planta hospedera con estas, y comparando el fenotipo de lesión HR entre estas plantas transgénicas . Cuando son comparados diferentes alelos en plantas transgénicas de Solanaceae (por ejemplo, bajo el control de un promotor constitutivo o inducible) , el fenotipo de lesión HR de transformantes que expresan la SEC ID NO:l o 3, es preferiblemente usado como referencia. Alternativamente, el alelo tipo nativo obtenido de las especies hospederas a ser transformadas, puede ser usado como referencia. Estos alelos los cuales proporcionan algunas y/o lesiones HR más pequeñas comparados con la SEC ID NO: 1 o 3, o algunas y/o lesiones HR más pequeñas que las causadas por la expresión del alelo tipo nativo obtenido de las especies transformadas, pueden entonces ser seleccionados para uso adicional. Por ejemplo, plantas transgénicas que expresan estos pueden ser elaboradas como se describe abajo. Especialmente, alelos de tomate y ortólogos de papa, se pueden obtener o identificar usando por ejemplo, cebadores o sondas especificas de NRC1, o análisis de bioinformática in silico. También, puede ser usado mapeo genético para mapear el locus NRC1 en el genoma de la planta (por ejemplo, tomate o papa), con ello, se pueden obtener secuencias enlazando el mapa genómico a bases de datos de secuenciamiento de genoma existente (por ejemplo, desarrollado en proyecto de secuenciamiento de tomate) . Tales alelos y/u ortólogos pueden ser especialmente adecuados para generar plantas con resistencia intensificada a enfermedades. Cuando los ortólogos de papa de NRC1 son identificados en el método anterior, estos ortólogos (o variantes de estos ortólogos), son preferiblemente usados para generar plantas que tienen resistencia intensificada a Phytophtora infestans.

Genes quiméricos, vectores de expresión y organismos recombinantes de conformidad con la invención En una modalidad de la invención, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas NRC1 (que incluyen variantes o fragmentos), como se describe anteriormente, son usadas para hacer genes quiméricos y vectores que comprenden estos para transferencia del gen quimérico en una célula hospedera y producción de la(s) proteína (s) NRCl en células hospederas, tales como células, tejidos, órganos u organismos derivados de célula (s) transformada ( s ) . Vectores para la producción de proteína NRCl (o fragmentos o variantes de proteínas) en células de plantas, son en la presente, referidos como es decir, "vectores de expresión". Células hospederas son preferiblemente células de plantas y, hospederos microbianos (bacterias, por ejemplo, Agrobacterium, levadura, hongos, etc.), también están contemplados . Cualquier planta puede ser un hospedero adecuado, tal como plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, pero más preferiblemente, la planta hospedera que pertenece a la familia Solanaceae . Por ejemplo, las plantas que pertenecen al género Solanum (que incluyen Lycopersicon) , Nicotiana, Capsicum, Petunia y otros géneros. Las siguientes especies hospederas pueden ser adecuadamente usadas: Tabaco ) especies de Nicotiana, por ejemplo, N. benthamiana , N. plumbaginifolia , N. tabacum, etc.), especies vegetales, tales como tomate (L. esculentum, syn. Solanum lycopersicum) tal como por ejemplo, tomate cherry, var. cerasiforme o tomate currant, var. pimpinellifolium) o tomate de árbol (S. betaceum, syn. Cyphomandra betaceae) , papa (Solanum tuberosum) , berenjena {Solanum melongena) , pepino (Solanum muricatum) , cocona {Solanum sessiliflorum) y naranjilla (Solanum quitoense) , chiles (Capsicum annuum, Capsicum frutescens , Capsicum baccatum) , especies ornamentales (por ejemplo, Petunia hybrida, Petunia axillaries , P. integrifolia ) . Alternativamente, la planta puede pertenecer a cualquier otra familia, tal como la Cucurbitaceae o Gramineae . Las plantas hospederas adecuadas incluyen por ejemplo, maíz/mazorca (especies de Zea) , trigo (especies de Triticum) , cebada (por ejemplo, Hordeum vulgare) , avena (por ejemplo, Avena sativa), sorgo {Sorghum bicolor) , cebada {Sécale cereale) , soya {Glycine spp, por ejemplo, G. max) , algodón (especies de Gossypium, por ejemplo, G. hirsutum, G. barbadense) , Brassica spp. (por ejemplo, B. napus, B. júncea, B. olerácea, B. rapa, etc.), girasol {Helianthus annus) , cártamo, ñame, yuca, alfalfa {Medicago sativa), arroz (especies de Oryza, por ejemplo, el grupo de cultivar de O. sativa indica o grupo de cultivar japónica), pastos forrajeros, mijo perlado {Pennisetum spp. por ejemplo, P. glaucum) , especies de árboles (Pinos, álamo, abeto, platanales, etc.), te, café, aceite de palma, coco, especies vegetales, tales como arveja, calabacín, guisantes (por ejemplo, especies de Phaseolus) , calabaza, alcachofa, espárrago, brócoli, ajo, puerro, lechuga, cebolla, rábano, nabo, coles de Bruselas, zanahoria, coliflor, achicoria, apio, espinaca, endibia, hinojo, betarraga, plantas que portan frutos frescos (uvas, duraznos, ciruelos, fresas, mango, manzana, ciruela, cereza, albaricoque, plátano, mora, arándano, cítricos, kiwi, higos, limón, lima, nectarinas, frambuesa, melón, naranja, uva, etc.), especies ornamentales (por ejemplo, especies de Rose, Petunia, Chrysanthemum , Lily, Gerbera) , hierbas (menta, perejil, albahaca, tomillo, etc.), árboles de madera (por ejemplo, especies Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus) , especies de fibras por ejemplo, lino (Linum usitatissimuni) y cáñamo (Cannabis sativa), u organismos modelo, tales como Arabidopsis thaliana. Hospederos preferidos son "plantas de cultivo", es decir, especies de plantas las cuales son cultivadas y reproducidas por humanos. Una planta de cultivo puede ser cultivada para propósitos de alimentación (por ejemplo, cultivos de campo) , o para propósitos ornamentales (por ejemplo, producción de flores para corto, pastos para césped, etc.) . Una planta de cultivo como se define en la presente, también incluye plantas a partir de las cuales productos no alimenticios son cultivados, tales como petróleo para combustible, polímeros plásticos, productos farmacéuticos, corcho y similares. La construcción de genes y vectores quiméricos para introducción preferiblemente estable, de secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína NRCl en el genoma de células hospederas, es conocido en general en la técnica. Para generar un gen quimérico, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína NRCl (o variante o fragmento) , son operablemente ligadas a una secuencia promotor, adecuada para expresión en las células hospederas, usando técnicas de biología molecular estándar. La secuencia promotora puede estar ya presente en un vector, de manera que la secuencia nucleica NRCl es simplemente insertada en el vector corriente abajo de la secuencia promotor. El vector es entonces usado para transformar las células hospederas y el gen quimérico es insertado en el genoma nuclear o en el genoma de plástido, mitocondrial o cloroplasto y expresado ahí usando un promotor adecuado (por ejemplo, Me Bride et al., 1995 Bio/Technology 13, 362; documento US 5,693,507). En una modalidad, un gen quimérico comprende un promotor adecuado para expresión en células de planta o células microbianas (por ejemplo, bacteria), operablemente ligado a este una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NRCl de conformidad con la invención, opcionalmente seguido por una secuencia de ácido nucleico no traducida al 3' . La secuencia de ácido nucleico NRCl, preferiblemente el gen quimérico NRCl que codifica una proteína NRCl funcional (o en ciertas modalidades, una proteína NRC1 constitutivamente activa), puede ser establemente insertada en una manera convencional en el genoma nuclear de una planta de célula única, y la célula de planta así transformada, puede ser usada en una manera convencional para producir una planta transformada que tiene un fenotipo alterado debido a la presencia de la proteína NRC1 en ciertas células en un cierto tiempo. En este sentido, un vector de T-ADN, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NRC1, en Agrobacterium turnefaciens, puede ser usado para transformar la célula de planta, y posteriormente, una planta transformada puede ser regenerada a partir de la célula transformada usando los procedimientos descritos, por ejemplo, en los documentos EP 0 116 718, EP 0 270 822, publicación de PCT WO 84/02913 y solicitud de Patente Europea Publicada EP 0 242 246 y en Gould et al. (1991, Plant Physiol. 95, 426-434). La construcción de un vector T-ADN para transformación de planta mediada por Agrobacterium, es bien conocida en la técnica. El vector de T-ADN puede ser ya sea, un vector binario como se describe en el documento EP 0 120 561 y EP 0 120 515 o un vector cointegrado, el cual puede integrarse en el plásmido Ti de Agrobacterium por recombinación homologa, como se describe en el documento EP 0 116 718. Los vectores T-ADN preferidos, cada uno contiene un promotor operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica a NRC1 (por ejemplo, que codifica una SEC ID N0:2 o SEC ID N0:4) entre las secuencias limite de T-ADN, o al menos, localizado a la izquierda de la secuencia limite derecha. Las secuencias limite se describen en Gielen et al. (1984, EMBO J 3,835-845). Por supuesto, otros tipos de vectores pueden ser usados para transformar la célula de planta, usando procedimientos tales como transferencia directa de gen (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0 223 247), transformación mediada por polen (como se describe por ejemplo, en los documentos EP 0 270 356 y WO85/01856) , transformación de protoplasto, como por ejemplo, descrito en el documento US 4, 684, 611, transformación mediada por el virus de ARN de planta (como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0 067 553 y US 4,407, 956), transformación mediada por el liposoma (como se describe, por ejemplo, en el documento US 4,536, 475), y otros métodos. Para transformación de tomate o tabaco, véase también An G. et al., 1986, Plant Physiol. 81: 301-305; Horsch R.B. et al, 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5, Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9; Koornneef M. et al., 1986, In: Nevins DJ. and R.A. Jones, eds . Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178) . Para transformación de papa, véase por ejemplo, Sherman and Bevan (1988, Plant Cell Rep. 7: 13-16). Del mismo modo, la selección y regeneración de plantas transformadas a partir de células transformadas, es bien conocido en la técnica. Obviamente, para diferentes especies y aún para diferentes variedades o cultivares de especies únicas, los protocolos están específicamente adaptados para la regeneración de transformantes a alta frecuencia . Además de la transformación del genoma nuclear, también la transformación del genoma de plástido, preferiblemente genoma de cloroplasto, se incluye en la invención. Una ventaja de la transformación del genoma de plástido es que el riesgo de distribución de los transgenes puede ser reducido. La transformación de genoma plástido se puede realizar como se conoce en la técnica, véase por ejemplo, Sidorov VA et al. 1999, Plant J.19: 209-216 o Lutz KA et al. 2004, Plant J. 37 ( 6) : 906-13. La planta transformada resultante puede ser usada en un esquema de reproducción de planta convencional para producir más plantas transformadas que contienen el transgen. Transformantes de copia única pueden ser seleccionados, usando por ejemplo, análisis de Manchado Southern o métodos a base de PCR o el ensayo de Tecnologya Invader® (Third ave Technologies, Inc.). Las células transformadas y plantas pueden ser fácilmente distinguidas de las no transformadas por la presencia del gen quimérico. Las secuencias del ADN de planta que flanquea el sitio de inserción del transgen también pueden ser secuenciadas , con ello, un método de detección de "evento especifico" puede ser desarrollado, para uso de rutina. Véase por ejemplo, documento WO 0141558, el cual describe kits de detección de evento principal (tales como kits de detección de PCR) , basados por ejemplo, en la secuencia integrada y la secuencia de flanqueo (genómica) . La secuencia de ácido nucleico NRC1, es insertada en un genoma de planta de manera que la secuencia codificante insertada está corriente abajo (es decir al 3' ) de, y bajo el control de, un promotor el cual puede dirigir la expresión en la célula de planta. Esto es preferiblemente realizado insertando el gen quimérico en el genoma de célula de planta, particularmente en el genoma nuclear o plástido (por ejemplo, cloroplasto) . Mientras, la producción constitutiva de la proteina NRC1 puede conducir a la inducción de muerte celular, (por ejemplo, lesiones microscópicas y/o lesiones macroscópicas) y/o puede reducir el rendimiento (por ejemplo, Rizhsky and Mittler, Plant Mol Biol, 2001 46: 313-23), es una modalidad preferida, usar un promotor cuya actividad es inducible. Ejemplos de promotores inducibles son promotores inducibles por heridas, tales como el promotor MPI descrito por Cordera et al. (1994, The Plant Journal 6, 141), el cual es inducido por heridas (tal como causadas por insecto o heridas físicas), o el promotor COMPTII (documento WO0056897) o el promotor PRl descrito en el documento US6031151. Alternativamente, el promotor puede ser inducible por un químico, tal como dexametasona como se describe por Aoyama and Chua (1997, Plant Journal 11: 605-612) y en el documento US6063985 o por tetraciclina (promotor TOPFREE o TOP 10, véase Gatz, 1997, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 89-108 y Love et al. 2000, Plant J. 21: 579-88). Otros promotores inducibles son por ejemplo, inducibles por un cambio en la temperatura, tal como el promotor de golpe de calor descrito en el documento US 5,447, 858, por condiciones anaeróbicas (por ejemplo, el promotor de maíz ADH1S) , por luz (documento US6455760), por patógenos (por ejemplo, el promotor gstl del documento EP759085 o el promotor vstl del documento EP309862) o por senescencia (SAG12 y SAG13, véase documento US5689042). Obviamente, existe un intervalo de otros promotores disponibles. En una modalidad preferiblemente, un promotor inducible por patógeno se usa, con ello, la proteína NRC1 (o variante o fragmento) , será solamente producido después del ataque de patógeno del tejido de la planta. Especialmente, promotores de genes los cuales son regulados ascendentemente rápidamente después del ataque del patógeno, son deseados. Los promotores inducibles de patógenos incluyen, por ejemplo, los promotores hsr203J, str246C y sgd24 de tabaco, promotor EAS4 descrito por Yin et al. (1997, Plant Physiology 115 ( 2 ) : 437-51 ) , el promotor tapl o tap2 (Mohán et al., 1993, Plant Mol Biol. 1993 22:475-90), el promotor gstl o variantes del mismo (Martini et al. 1993, Mol. Gen. Gen. 236, 179-186; Hennin C, 1997, Afstudeerwerk, Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische etenschappen, University of Gent, Bélgica) , los promotores WRKY (Eulgem et al., EMBO J. , 1999, 18 ( 17 ): 4689-99 y promotores quiméricos descritos en el documento WO0029592). Promotores inducibles por un patógeno de planta particular, pueden también ser identificados usando métodos conocidos, tales como cDNA-AFLP®. Preferiblemente, el promotor es inducible por un número de patógenos, es decir, es inducible por un amplio intervalo de patógenos de la planta hospedera. Para cada especie de planta particular, un promotor diferente puede ser más adecuado. Por ejemplo, cuando se usa tomate como un hospedero, el promotor es preferiblemente inducido después de al' menos uno, pero preferiblemente más de un patógeno de tomate. Especialmente, se prefiere un promotor el cual es inducible por al menos uno o más patógenos fúngicos de planta y/o patógenos bactericidas de planta (especialmente por uno o más patógenos biotróficos y/o hemi-biotróficos de planta) . Las descripciones detalladas de patógenos de plantas, los síntomas de enfermedad causados por ellos y sus ciclos de vida, se pueden encontrar para cada especie de planta. Por ejemplo, patógenos de tomate son descritos en "Compendium of Tomato Diseases" , Editors Jones, Jones, Stall and Zitter, ISBN 0-89054-120-5, APS Press (http : /www . shopapspress/org) . Patógenos de papa son descritos en "Compendium of Potato Disease", 2nd edición, Editors Stevenson, Franc and Weingartner, APS Press, ISBN 0-89054-275-9. Los patógenos de tomate incluyen por ejemplo, las siguientes especies fúngicas y bacterianas y virus (no limitantes): Botrytis cinérea (hongo/necrótrofo) ; Colletotrichum coccodes (hongo/necrótrofo) ; Alternaría alternata (hongo) ; Alternaría solaní (hongo/necrótrofo) ; Stemphylíum solaní; Phytophthora infestans (oomiceto/hemibiótrofo) ; Septoría tycopersící; Cladosporium fulvum, (hongo/hemibiótrofo) ; Phytophthora parasítica; Oídium lycopersicum (biótrofo) ; Fusarium oxysporum ; Sclerotium rolfsii; Pythium; Rhizoctonia (hongo/necrótrofo) ; Corynebacterium míchíganense (bacteria) ; Pseudomonas syringae pv tomato o pv syringae (bacteria/biótrofo ) ; Pseudomonas solanacearum; Pseudomonas corrúgate ; Clavibacter Xantho onas campestris (bacteria/biótrofo) ; Vertidllium (hongo) , virus del moteada de tomate (TS V) ; virus del mosaico del tabaco o tomates (Tob V, TomMV) . Patógenos de papa incluyen, por ejemplo, varios hongos, bacterias, nemátodos y virus, tales como: Phytophthora infestans (oomiceto/hemibiótrofo) , nemátodos (biótroficos ) ; Erwinia carotovora (bacteria) ; Colletotrichum coccodes (hongo) ; Rhizoctonia solani (hongo/necrótrofo) ; Verticillium dahliae (hongo) ; Streptomyces scabies; Alternaría solani (hongo/necrótrofo) ; Pythium; Spongospora subterranean; PVX y PVY; Virus de enrollamiento de hoja de papa (PLRV); etc. Véase también, http://www.apsnet.org/online/common/toc.asp para enfermedades de plantas de varias especies de plantas. De este modo, en una modalidad, el promotor es preferiblemente inducible por uno o más de los patógenos anteriores, más preferiblemente, al menos por uno o más de los patógenos biotróficos y/o hemibiotróficos . Alternativamente, un hospedero de planta puede comprender varios transgenes NRCl, cada uno bajo el control de un diferente promotor inducible de patógeno, para asegurar que la proteina NRCl es producida después del ataque por una variedad de patógenos. Por ejemplo, para transformación de tomate, un promotor puede ser inducible por Phytophthora y uno por Cladosporium. La palabra "inducible", no requiere necesariamente que el promotor sea completamente inactivo en la ausencia del estimulo inductor. Una actividad no especifica de bajo nivel puede estar presente, tan pronto como esto no resulte en rendimiento severo o penalidad de calidad de las plantas. Inducible de este modo, preferiblemente se refiere a un incremento en actividad del promotor, resultando en un incremento en la transcripción de la región codificante NRC1 corriente abajo después del contacto con el inductor. La combinación más preferida en la presente es el uso de un promotor inducible de patógeno, operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico NRC1, la cual codifica una proteina NRC1 constitutivamente activa, como se describe anteriormente. En este caso, después del ataque de patógeno, el NRC1 constitutivamente activo, será expresado, resultando en un HR local (restringido al sitio de ataque de patógeno) , previniendo el crecimiento adicional de cualquier patógeno ( hemi ) -biotrófico . En otra modalidad, pueden ser usados promotores constitutivos, tales como los promotores 35S constitutivos fuertes o los promotores 35S intensificados (los "promotores 35S") del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de aislados CM 1841 (Gardner et al, 1981, Nucleic Acids Research 9, 2871-2887), CabbB-S (Franck et al, 1980, Cell 21, 285-294) y CabbB-JI (Hull and Howell, 1987, Virology 86,482-493); el promotor 35S descrito por Odell et al. (1985, Nature 313, 810-812) o en el documento US5164316, promotores de la familia ubiquitina (por ejemplo, el promotor de ubiquitina de maíz de Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18,675-689, documento EP 0 342 926, véase también Cornejo et al 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581), el promotor gos2 (de Pater et al, 1992 Plant J. 2, 834-844), el promotor emú (Last et al, 1990, Theor. Appl. Genet. 81,581-588), promotores de actina Arabidopsis tales como el promotor descrito por An et al (1996, Plant J. 10, 107.), promotores de actina de arroz, tales como el promotor descrito por Zhang et al. (1991, The Plant Cell 3, 1155-1165) y el promotor descrito en el documento US 5, 641, 876 o el promotor de actina 2 de arroz, como se describe en el documento WO070067; promotores del virus del mosaico de vena de yuca (documento O 97/48819, Verdaguer et al 1998, Plant Mol. Biol. 37,1055-1067), la serie de promotores pPLEX del Virus de detención de trébol subterráneo (documento WO 96/06932, particularmente el promotor S7), un promotor de alcohol deshidrogenasa, por ejemplo, pAdhlS (números de acceso de GenBank X04049, X00581), y el promotor TR1 ' y el promotor TR2 ' (el "promotor "TR1 ' " y "promotor TR2 ' " , respectivamente), el cual acciona la expresión de los genes 1 ' y 2 ' , respectivamente, del T-DNA (Velten et al, 1984, EMBO J 3, 2723-2730) , el promotor del virus del mosaico de escrofularia descrito en el documento US6051753 y en el documento EP426641, promotores del gen histona, tales como el promotor Ph4a748 de Arabidopsis ( PMB 8:179-191), u otros. En una modalidad preferida, los promotores AA6 como se describe en el documento PCT/NL2005/050083 (presentado el 16 de Diciembre de 2005), son usados. Alternativamente, un promotor puede ser utilizado, el cual no es constitutivamente, sino preferiblemente, especificado para uno o más tejidos u órganos de la planta (tejido preferido/tejido especifico, que incluye el desarrollo de promotores regulados) , por ejemplo, preferido de la hoja, preferido de la epidermis, preferido de la raíz, tejido de flor, por ejemplo, preferido del tapetum o anteras, preferido de semilla, preferido de vainas, etc.), por medio del cual el gen NRC1 es expresado solamente en células del (los) tejido (s) u órgano (s) específicos y/o solamente durante una cierta etapa de desarrollo. Por ejemplo, los gene(s) NRC1, pueden ser selectivamente expresados en las hojas de una planta colocando la secuencia codificante bajo el control de un promotor inducible por luz, tal como el promotor del gen de subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bifosfato carboxilasa de la planta misma o de otra planta, tales como guisantes, como se describe en el documento US, 5,254,799 o Arabídopsís como se describe en el documento US5034322. En una modalidad, se usa el promotor del gen NRCl endógeno. Por ejemplo, el promotor del gen NRCl de tomate puede ser aislado y operablemente ligado a la región codificante que codifica la proteína NRCl de la SEC ID NO: 2 o 4. El promotor NRCl (la región reguladora de la transcripción corriente arriba de la SEC ID NO:l y 3), puede ser aislado de plantas de tomate usando métodos conocidos, tales como TAIL-PCR (Liu et al 1995, Genomics 25 (3) : 674-81; Liu et al 2005, Methods Mol Biol. 286:341-8), PCR enlazadora, o PCR Inversa (IPCR) . La secuencia codificante NRCl es preferiblemente insertada en el genoma de la planta, de manera que la secuencia codificante está corriente arriba (es decir, 5' ) de la región no traducida del extremo 3' adecuado ("extremo 3'" o "3'UTR). Los extremos al 3' adecuados incluyen aquellos del gen CaMV 35S ("3' 35S"), el gen de sintasa nopalina ("3' nos") (Depicker et al., 1982 J. Molec. Appl . Genetics 1, 561-573.), el gen de sintasa octopina ("3'ocs") (Gielen et al, 1984, EMBO J 3, 835-845) y el gen 7 de T-DNA ("3' de gen 7") (Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998), los cuales actúan como secuencias de ADN no traducidas al 3' en células de planta transformadas y otras. En una modalidad, la 3'UTR del gen NRC1 de tomate es usado, como se muestra en la SEC ID NO: 3, a partir de los nucleótidos27 8 a nucleótidos 3168, y como se muestra en la SEC ID NO: 5. La 3'UTR de NRC1 también es una modalidad en si misma en la presente, ya que puede también ser usada como 3'UTR en combinación con otras regiones codificantes. Igualmente, cualquier variante o fragmento de la SEC ID NO: 5 se proporciona. Una variante de la SEC ID NO: 5, incluye secuencias de ácido nucleico que comprenden al menos, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99% o más identidad de secuencia de ácido nucleico a la SEC ID NO: 5 (como se determina usando el algoritmo Neddleman and Wunsh y las penalidades GAP como se definen anteriormente) . Los fragmentos incluyen cualquier secuencia de nucleótido que comprende al menos, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400 o más nucleótidos consecutivos de la SEC ID NO: 5, o de una variante de la SEC ID NO: 5. La introducción del vector de T-ADN en Agrobacterium puede llevarse a cabo usando métodos conocidos, tales como electroporación o apareamiento triparental . Una secuencia de ácido nucleico que codifica a NRC1, puede opcionalmente , ser insertada en el genoma de la planta como una secuencia de gen híbrido, por medio de la cual, la secuencia NRC1 es flanqueada en estructura a un gen (documento US 5,254, 799; Vaeck et al., 1987, Nature 328, 33-37), que codifica un marcador registrable o selecciónatele , tal como por ejemplo, el gen neo (o nptll) (documento EP 0 242 236) que codifica la resistencia a canamicina, de manera que la planta expresa una proteina de fusión la cual es fácilmente detectable.

Toda o parte de una secuencia de ácido nucleico NRC1, que codifica una proteina NRC1 (o variante o fragmento) , también puede ser usada para transformar microorganismos, tales como bacteria (por ejemplo, Escherichia coli, Pseudomonas , Agrobacterium , Bacillus, etc.), hongos o algas, o insectos, para hacer virus recombinantes . La transformación de bacteria, con toda o parte de una secuencia de ácido nucleico NRC1 de esta invención, incorporada en un vehículo de clonación adecuado, se puede llevar a cabo en una manera convencional, preferiblemente usando técnicas de electroporación convencional, como se describe en Maillon et al. (1989, FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210.) y documento O 90/06999. Para expresión en células hospederas procarióticas , el empleo de codón de la secuencia de ácido nucleico puede ser por consiguiente, optimizado (como se o describe para planas anteriormente) . Las secuencias intrón deben ser removidas y otras adaptaciones para la expresión óptima pueden hacerse como se conoce. La secuencia de ADN de la secuencia de ácido nucleico NRC1 puede ser además, cambiada en una manera traduccionalmente neutral, para modificar las secuencias de posiblemente inhiben ADN presente en la parte del gen y/o introduciendo cambios al empleo del codón, por ejemplo, adaptando el empleo de codón a aquellas mayormente preferidas por plantas, preferiblemente, el género de planta relevante, como se describe anteriormente. De conformidad con una modalidad de esta invención, las proteínas NRC1 (o proteínas quiméricas) , son objetivo a organelos intracelulares tales como, plástidos, preferiblemente cloroplastos , mitocondrias , o son seleccionados de la célula, potencialmente optimizando la estabilidad de la proteína y/o expresión. De manera similar, la proteína puede ser dirigida a las vacuolas. Para este propósito, en una modalidad de esta invención, los genes quiméricos de la invención comprenden una región codificante que codifica un péptido objetivo o señal, ligado a la región codificante de la proteína NRC1 de la invención. Péptidos particularmente preferidos para estar incluidos en las proteínas de esta invención son los péptidos tránsito para cloroplastos u otros objetivos plástidos, especialmente regiones de péptidos de tránsito duplicados a partir de genes de plantas cuyo producto de gen es dirigido a los plástidos, el péptido de tránsito optimizado de Capellades et al. (US 5,635, 618), el péptido tránsito de ferredoxina-NADP+oxidoreductasa a partir de espinaca (Oelmuller et al., 1993, Mol. Gen. Genet . 237,261-272), el péptido tránsito descrito en Wong et al. (1992, Plant Molec. Biol . 20, 81-93) y los péptidos objetivo en la solicitud de patente PCT publicada O 00/26371. También preferidos son péptidos de secreción de señalización de una proteina ligada a tal péptido fuera de la célula, tal como la señal de secreción del inhibidor de proteinasa de papa II (Keil et al., 1986, Nucí. Acids Res. 14,5641- 5650), la señal de secreción del gen alfa-amilasa 3 de arroz (Sutliff et al., 1991, Plant Molec. Biol. 16,579-591) y la señal de secreción de la proteina de tabaco PR1 (Cornelissen et al., 1986, EMBO J. 5,37-40). Particularmente, los péptidos señal empleados de conformidad con la invención, incluyen péptidos de tránsito de cloroplasto (por ejemplo, Van Den Broeck et al., 1985, Nature 313, 358), o el péptido de tránsito de cloroplasto optimizado del documento US 5,510, 471 y US 5,635, 618 que causa el transporte de la proteina al cloroplasto, un péptido de señal secretora o un péptido que dirige la proteina a otros plástidos, mitocondria, el ER u otro organelo. Las secuencias señal para objetivo a organelos intracelulares o para secreción fuera de la célula de planta o la pared celular se encuentran en las proteínas naturalmente dirigidas o secretadas, preferiblemente aquellas descritas por Klosgen et al. (1989, Mol. Gen. Genet. 217, 155-161), Klosgen and Weil (1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304), Neuhaus & Rogers (1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144), Bih et al. (1999, J. Biol . Chem. 274, 22884-22894), Morris et al. (1999, Biochem. Biophys . Res. Commun. 255, 328-333), Hesse et al. (1989, EMBO J. 8, 2453-2461), Tavladoraki et al. (1998, FEBS Lett . 426,62-66.), Terashima et al. (1999, Appl . Microbiol. Biotechnol. 52,516-523), Park et al. (1997, J.Biol. Chem. 272, 6876-6881), Shcherban et al. (1995, Proc. Nati. Acad. Sci USA 92, 9245-9249) . Para permitir la secreción de proteínas NRC1 al exterior de la célula hospedera transformada, un péptido señal de secreción apropiado puede ser fusionado al extremo amino terminal (extremo N-terminal) de la proteína NCR1. Los péptidos de señal putativa pueden ser detectados usando análisis a base de computadora, usando programas tales como el programa de búsqueda de Péptido Señal (Signal IP VI .1 o 2.0) (VOn Heijne, Gunnar, 1986, y Nielsen et al., 1996). En una modalidad, varias secuencias de ácido nucleico que codifican NRC1 son co-expresadas en un hospedero único, opcionalmente bajo el control de diferentes promotores. Una planta hospedera co-expresante es fácilmente obtenida transformando una planta que ya expresa la proteina NRCl de esta invención, o cruzando plantas transformadas con diferentes proteínas NRCl de esta invención. Alternativamente, varias secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas NRCl pueden estar presentes en un vector de transformación único o ser co-transformadas al mismo tiempo usando vectores separados y seleccionando transformantes que comprenden ambos genes quiméricos. De manera similar, uno o más genes que codifican a NRCl pueden ser expresados en una planta única junto con otros genes quiméricos, por ejemplo, que codifican otras proteínas, las cuales intensifican la enfermedad o resistencia o las cuales están involucradas en la trayectoria de señalización de resistencia a enfermedades, u otras. Se entiende que las diferentes proteínas pueden ser expresadas en la misma planta, o cada una puede ser expresada en una planta única y después combinadas en la misma planta por cuza de las plantas únicas con otras. Por ejemplo, en producción de semilla híbrida, cada planta parental puede expresar una proteína única. Después de cruzar las plantas parentales para producir híbridos, ambas proteínas son combinadas en la planta híbrida. Preferiblemente, para propósitos de selección, pero también para opciones de control de malezas, las plantas transgénicas de la invención son también transformadas con un ADN que codifica una proteina que confiere resistencia a herbicidas, tal como un herbicida de amplio espectro, por ejemplo, herbicidas a base de glufosinato de amonio como ingrediente activo (por ejemplo, Liberty ® o BASTA; se confiere resistencia por el gen PAT o bar; véase documento EP 0 242 236 y EP 0 242 246) o glifosato (por ejemplo, RoundUp®; se confiere resistencia por genes EPSPS, véase por ejemplo, documento EP 0 508 909 y EP 0 507 698). Usando genes de resistencia a herbicida (u otros genes que confieren un fenotipo deseado) como marcador seleccionable además tiene la ventaja que la introducción de genes de resistencia a antibióticos puede ser evitada. Alternativamente, se pueden usar otros genes marcadores seleccionables , tal como genes resistentes a antibióticos. Como generalmente no es aceptado retener genes resistentes a antibióticos en las plantas hospederas transformadas se pueden remover nuevamente después de la selección de los transformantes. Existen diferentes tecnologías para eliminación de transgenes. Un método para lograr la eliminación es flanqueando el gen quimérico con sitios lox y, después se la selección, cruzar la planta transformada con una planta que expresa recombinada CRE (véase, por ejemplo, documento EP506763B1). Resultados de recombinación específicos del sitio en escisión del gen marcador. Otros sistemas de recombinación específico del sitio es el sistema FLP/FRT descrito en el documento EP686191 y US5527695. También se pueden usar sistemas de recombinación específicos al sitio tal como CRE/LOX y FLP/FRT para propósitos de apilar el gen. Además, se han descrito sistemas de escisión de un componente, véase por ejemplo, documento O9737012 o WO9500555) .

Células de planta/plantas/semillas transformadas y usos de la secuencia de ácido nucleico y proteínas de conformidad con la invención En la siguiente parte el uso de las secuencias NCR1 de conformidad con la invención para generar células de planta, plantas, semillas de planta transgénicas , etc., y se describe cualquier derivado/progenie del mismo, con un fenotipo intensificado resistente a enfermedades. Una planta transgénica con resistencia intensificada a enfermedad puede ser generada transformando una célula hospedera de planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una proteína NCR1 bajo el control de un promotor adecuado, como se describe anteriormente, y generando una planta transgénica de la célula . Promotores preferidos son promotores los cuales son inducibles por estímulos bióticos y/o abióticos externos. Se prefieren especialmente promotores los cuales son inducible de patógeno, como se describe anteriormente. Combinaciones de promotor-NC l preferidas son: a) un promotor inducible de patógeno - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl constitutivamente activa; b) un promotor inducible de patógeno - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl de tipo nativa ; c) el promotor de un gen NCRl de planta (preferiblemente de las mismas especies las cuales son transformadas) - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl constitutivamente activa; d) el promotor de un gen NCRl de planta (preferiblemente de las mismas especies las cuales son transformadas) - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl de tipo nativa; e) un promotor inducible de estrés biótico (por ejemplo, inducible por herida de insecto, inducible de patógeno, etc.) - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl constitutivamente activa; f) un promotor inducible de estrés biótico (por ejemplo, inducible de insecto, inducible de patógeno, etc.) - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína NCRl de tipo nativo. g) Un promotor constitutivo (por ejemplo, promotor 35S) - secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina NCRl de tipo nativo; h) un promotor constitutivo (por ejemplo, promotor 35S) - secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que comprende al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácido a la SEC ID NO: 2 sobre la longitud completa; i) un promotor inducible de patógeno - secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que comprende al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácido a la SEC ID NO: 2 sobre la longitud completa; h) el promotor de un gen NCRl de planta secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que comprende al menos 70% de identidad de secuencia de aminoácido a la SEC ID NO: 2 sobre la longitud completa . En una modalidad, la planta transgénica puede mostrar cualquiera de lesiones HR constitutivas o lesiones HR inducibles, y resistencia intensificada a enfermedad a uno o más patógenos. Sin embargo, también se puede prever en este documento que no se desarrollan lesiones HR o lesiones HR "débiles" (tal como lesiones más pequeñas, por ejemplo, micro-lesiones y/o una frecuencia baja de lesión), mientras la planta aún muestra resistencia intensificada de enfermedad. Son particularmente preferidos en este documento alelos u ortólogos NCRl los cuales, en expresión en plantas hospederas bajo control de los promotores idénticos, resulta en menos y/o pequeñas lesiones HR que la SEC ID NO: 1 ó 3, o que la expresión del alelo NCRl tipo nativo obtenido de las mismas especies hospederas, las cuales son transformadas, especialmente en procedimientos g) y h) anteriores. Tales alelos/ortólogos pueden ser referidos como alelos NCRl que confieren un "fenotipo HR débil" en un hospedero proporcionado. Tales alelos u ortólogos NCRl pueden ser identificados y/o aislados como se describe en este documento anteriormente. El fenotipo HR de alelos NCRl diferentes y/o ortólogos puede ser comparado por vectores de expresión elaborados usando estos (preferiblemente todos los ácidos nucleicos, los cuales comparados son operablemente enlazados a los promotores idénticos, por ejemplo 35S) , plantas transformantes o tejido de planta con esto, y comparando el fenotipo de lesión HR entre estas plantas. Para transformantes de Solanaceae, el fenotipo de lesión HR de transformantes que expresan la SEC ID NO: 1 ó 3 es preferiblemente usado como referencia y cualquier alelo resultante en lesiones HR escasa y/o pequeñas en expresión bajo control del mismo promotor es un alelo que confiere un fenotipo HR débil. El fenotipo de lesión HR puede ser comparado y opcionalmente cuantificado usando varios métodos, tal como microscopio (opcionalmente teñido de células muertas) , registro visual, conteo de lesiones para calcular en número por cm2, midiendo el diámetro de lesiones HR, etc. Preferiblemente, las plantas transgénicas de la invención comprenden resistencia intensificada a enfermedad contra uno o más patógenos, especialmente patógenos biotróficos y/o hemibiotróficos de las especies de planta transgénica. De esta forma, por ejemplo plantas de tomate o papa transgénicas comprenden resistencia intensificada a al menos uno, o más, de especies fúngicas, bacterianas, nemátodos y/o patógenos virales listados anteriormente, más preferiblemente al menos contra una o varias especies biotróficas y/o hemibiotróficas . "Resistencia a enfermedad" o "resistencia incrementada/intensificada a enfermedad" se usa en este documento para referirse a una capacidad intensificada de transformantes (comparados a transformantes de tipo nativo o control) para soportar el ataque de uno o más patógenos de planta, o en otras palabras, se refiere a una reducción significante en síntomas de enfermedad en transformantes comparados a controles no transformados (o vector vacío transformado) . Se puede determinar la resistencia a enfermedad o resistencia intensificada a enfermedad usando una variedad de métodos. A menudo síntomas de enfermedad se registran visualmente (ya sea en bioensayos o en el campo) valorando los síntomas de enfermedad a uno o más puntos de tiempo después de la inoculación o contacto con un patógeno. Métodos alternativos incluyen métodos por los cuales el patógeno es detectado y opcionalmente cuantificado . Una planta transgénica puede de esta forma mostrar resistencia intensificada a enfermedad sí la cantidad de patógeno detectada dentro/sobre el tejido es significativamente menor comparada a controles, o sí la extensión del patógeno es significativamente menor que en los controles. Finalmente, un incremento significante en rendimiento promedio de transformantes (por ejemplo, al menos 1%, 2%, 5%, 10% o más) comparado a los controles, cuando crece bajo presión equivalente de enfermedad (preferiblemente en el campo) proporciona una medición indirecta de resistencia intensificada a enfermedad. De esta forma, una pluralidad de plantas transformadas que expresa proteína NCR1 (o una proteína NCR1 constitutivamente activa) muestra resistencia intensificada a enfermedad, sí muestra una reducción significante a síntomas de enfermedad, comparados a los controles transformados de vector vacío o no transformados, se requiere análisis estadístico para determinar sí existe diferencia significante. Preferiblemente, uno o más síntomas de enfermedad están en promedio de al menos 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% o aún 100% menor en transformantes NCRl que en plantas control. Como el ensayo de enfermedad es diferente para cada combinación hospedero-patógeno, no se puede proporcionar protocolo específico, pero la persona experta conoce cómo determinar sí los transformantes muestran resistencia significantemente intensificada a enfermedad a uno o más patógenos. Los bioensayos como se conocen en la técnica para cada combinación planta-patógeno puede ser usado para comparar la resistencia de plantas transgénicas a controles adecuados . Como la proteína NCRl puede en algunas modalidades resultar en lesiones HR en la ausencia de patógeno (por ejemplo, sí el gen NCRl está bajo el control de un promotor constitutivo) : puede en ciertas modalidades ser importante para diferenciar entre síntomas causados por expresión NCRl y síntomas causados por infección y extensión del patógeno. Puede, por lo tanto, ser preferido usar métodos los cuales detectan al mismo patógeno (en lugar de necrosis en el tejido de la planta) y compara la cantidad de patógeno presente o la extensión del patógeno extendido. Por ejemplo, los bioensayos pueden ser usados en donde el patógeno puede ser detectado por teñido. En los ejemplos, se usa una raza de C. fulvum transgénica la cual expresa GUS. El micelio fúngico puede, por lo tanto, ser visualizado usando teñido X-gluc del tejido de planta inoculado. Una reducción significante de micelio fúngico en las plantas transgénicas comparado a los controles, indica una resistencia intensificada a los hongos. También una modalidad genera plantas transgénicas, las cuales expresan varias proteínas NCRl, preferiblemente bajo el control de diferentes promotores, tal como promotores inducibles de diferentes patógenos. El fenotipo resistente a la enfermedad puede ser de ajuste fino expresando una cantidad adecuada de proteína NCRl en un tiempo y ubicación adecuado. Tal ajuste fino puede ser realizado determinando el promotor más apropiado para una combinación hospedera-patógeno particular y también seleccionando "eventos" transgénicos los cuales muestran el nivel de expresión deseado. Un nivel demasiado bajo de proteína NCRl o inducción demasiado lenta de producción de proteína NCRl después del ataque del patógeno puede ser insuficiente para niveles de resistencia intensificada a enfermedad. Por otra parte, un nivel o expresión de proteína demasiado alto a la vez y ubicaciones desprovistas de ataque de patógeno, puede resultar en fenotipos agronómicamente indeseados, tal como lesiones en hojas o fruto en la ausencia de patógenos y rendimiento penalizados. Sin embargo, la persona experta puede fácilmente general plantas que tienen resistencia intensificada a enfermedad, pero las cuales al mismo tiempo son aceptables agronómicamente. Los alelos NCR1 óptimos pueden ser aislados o identificados como se describe, por ejemplo, los alelos proporcionan niveles altos de resistencia y únicamente un fenotipo HR débil. Transformantes que expresan niveles deseados de la proteina NCR1 se seleccionan por, por ejemplo, analizando número de copia (análisis de manchado Southern) , niveles de transcripto ARNm (por ejemplo, RT-RCP usando pares de cebadores NCR1 o cebadores de flanqueo) o analizando la presencia y nivel de la proteina NRC1 en varios tejidos (por ejemplo, SDS-PAGE; análisis ELISA, etc.). Por razones reguladoras, son preferiblemente seleccionados transformantes de copia preferiblemente única y las secuencias flanquean el sitio de inserción del gene quimérico es analizado, preferiblemente secuenciado para caracterizar el "evento". Eventos transgénicos que expresan NRCl alto o moderado se seleccionan para cruzamiento/retrocruzamiento/autofecundación hasta que se obtiene un evento élite altamente realizado con un transgen NRCl estable. Los transformantes que expresan uno o más genes NRCl de conformidad con la invención, pueden también comprender otros transgenes, tal como otros genes que confieren resistencia a enfermedad o que confieren tolerancia a otro estrés biótico y/o abiótico. Para obtener tales plantas con transgenes "apilados", otros transgenes pueden ya sea ser introducidos en los transformantes NRCl, o los transformantes NRCl pueden ser transformados subsecuentemente con uno o más de otros genes, o alternativamente se pueden usar varios genes quiméricos para transformar una linea o variedad de planta. Por ejemplo, varios genes quiméricos pueden estar presentes en un vector único, o pueden estar presentes en vectores diferentes los cuales son co-transformados . En una modalidad, se combinan los siguientes genes con uno o más genes NRCl de conformidad con la invención: genes de resistencia a enfermedad conocidos, especialmente genes que confieren resistencia intensificada a patógenos necrotóficos , genes de resistencia a virus, genes de resistencia a insectos, genes de resistencia a estrés abiótico (por ejemplo, tolerancia a sequía, tolerancia a sal, tolerancia a calor o frío, etc.), genes de resistencia a herbicida, y similares. Los transformantes apilados pueden de esta forma una tolerancia biótica y/o abiótica más amplia, para resistencia a patógeno, resistencia a insecto, resistencia nemátodos, salinidad, estrés por frío, estrés por calor, estrés por agua, etc. También, procedimientos de silenciamiento de NRCl se pueden combinar con procedimientos de expresión NRCl en una planta única. Por ejemplo, la sobreexpresión de NRCl en raices o tubérculos pueden conferir o intensificar resistencia a raíz o tubérculo para patógenos del suelo. Al mismo tiempo la regulación descendente de NRCl en partes aéreas puede conferir o intensificar resistencia para patógenos necrotróficos (o vice versa) . También es posible introducir o introgresar el gen NRCl en una linea de reproducción de planta la cual ya tiene un cierto nivel de resistencia a enfermedad. Para durabilidad de resistencia a enfermedad en el campo, puede ser deseable apilar varios mecanismos de resistencia a enfermedad en una planta, preferiblemente si las fuentes de resistencia tienen diferentes mecanismos moleculares subyacentes. Plantas completas, semillas, células, tejidos y progenie (tal como híbridos Fl, semillas/plantas F2, etc.) de cualquiera de las plantas transformadas descritas anteriormente se abarcan en este documento y puede ser identificada por la presencia del transgen en el ADN, por ejemplo por análisis RCP usando ADN genómico total como plantilla y usando pares de cebador de RCP específico a NRCl. También, se pueden desarrollar métodos de diagnóstico de RCP de "evento específico", en donde los cebadores RCP se basan en el ADN de la planta flanqueando el gen quimérico insertado, véase US6563026. Similarmente , se puede desarrollar el evento especifico de impresiones dactilares AFLP o impresiones dactilares RFLP las cuales identifican la planta transgénica o cualquier planta, semilla, tejido o célula derivada de la misma. Se entenderá que las plantas transgénicas de conformidad con la invención, preferiblemente no muestran fenotipos no deseados, tal como reducción de rendimiento, susceptibilidad intensificada a enfermedades (especialmente a necrotróficos ) o cambios arquitectónicos indeseados (enanismo, deformaciones) etc., y que, si tales fenotipos se siembran en los transformantes primarios, estos pueden ser removidos por reproducción normal y métodos de selección ( cruzamiento/retrocruzamiento/autofecundación, etc.). Cualquiera de las plantas transgénicas descritas en este documento pueden ser homocigoto o homocigoto para el transgen .

Procedimientos de silenciamiento del gen NRC1 y vectores de silenciamiento del gen En una modalidad adicional de la invención para proporcionar plantas con resistencia intensificada a enfermedad, especialmente contra patógenos necrotróficos , por lo cual la planta se transforma con un vector de silenciamiento del gen NRC1. Sin limitación del alcance de la invención, se espera que el silenciamiento de genes NRC1 endógeno o familias del gen resulta en la incapacidad de la planta transgénica para activar y/o aumentar una respuesta HR. Los patógenos necrotróficos requieren muerte celular para su crecimiento y desarrollo, tales plantas pueden comprender resistencia intensificada para uno o más patógenos necrotróficos . El "silenciamiento del gen" se refiere a la regulación descendente o inhibición completa de expresión del gen de uno o más genes objetivo (por ejemplo, genes NRC1 endógenos) . El uso de ARN inhibitorio para reducir o suprimir expresión del gen es bien establecido en la técnica y es sujeto de varias revisiones (por ejemplo, Baulcombe 1996, Stam et al. 1997, Depicker and Van Montagu, 1997). Existe un número de tecnologías disponibles para lograr el silenciamiento del gen en plantas, tal como genes quiméricos los cuales producen ARN antisentido de todo o parte del gen objetivo (véase, por ejemplo, documentos EP 0140308 Bl, EP 0240208 Bl y EP 0223399 Bl), o el cual produce ARN sentido (también referido como una co-supresión) , véase EP 0465572 Bl. El procedimiento más exitoso hasta ahora ha sido la producción de ARN tanto sentido como antisentido del gen objetivo ("repeticiones invertidas"), las cuales forman ARN en hebras dobles (dsARN) en la célula y silencia el gen objetivo. Se han descrito métodos y vectores para producción de dsARN y silenciamiento del gen en EP 1068311, EP 983370 Al, EP 1042462 Al, EP 1071762 Al y EP 1080208 Al. Un vector de conformidad con la invención puede, por lo tanto, comprender una región reguladora de transcripción la cual es activa en las células de planta operablemente enlazadas a un fragmento de ADN sentido y/o antisentido de un gen NRC1 de conformidad con la invención. Son suficientes estiramientos generalmente cortos (sentido y antisentido) de la secuencia del gen objetivo, tal como 17, 18, 19, 20, 21, 22 ó 23 nucleótidos de secuencias codificantes y no codificantes. También se pueden usar secuencias largas, tal como 50, 100, 200 ó 250 nucleótidos o más. Preferiblemente, los fragmentos sentido y antisentido cortos son separados por una secuencia espadadora, tal como un intrón, la cual forma un bucle (o hairpina) en formación de dsARN. Cualquier alargamiento corto de la SEC ID NO: 1 ó 3, o variantes del mismo, pueden ser usados para elaborar un vector de silenciamiento del gen NCR1 y una planta transgénica en las cual uno o más genes NRC1 son silenciados en todos o algunos tejidos u órganos (dependiendo de los promotores usados). Una forma conveniente de generar constructos de hairpina es el uso de vectores genéricos tal como pHANNIBAL y pHELLSGATE, vectores basados en la tecnología Gateway ® (Véase, Wesley et al. 2004, Methods Mol Biol. 265:117-30; Wesley et al. 2003, Methods Mol. Biol. 236-273-86 y Helliwell & Waterhouse 2003, Methods 30 ( ) : 289-95 ) , todos incorporados en este documento por referencia. Seleccionando partes de ácido nucleico conservado del gen NCR1, pueden ser silenciados elementos de la familia NRC1 en una planta hospedera o partes de la planta. Abarcadas en este documento también son plantas transgénicas que comprenden un elemento regulador de transcripción operablemente enlazado a un fragmento ADN sentido y/o antisentido de un gen NRC1 y exhibe resistencia intensificada para uno o más patógenos, especialmente patógenos necrotróficos . También, se proporcionan plantas que tienen resistencia intensificada para uno o más patógenos biotrófico y/o hemi-biotrófico y a uno o más patógenos necrotróficos . Tales plantas pueden ser reguladas seleccionando combinaciones promotor-gen NCR1 apropiadas. Por ejemplo, una proteina NRC1 funcional puede ser producida en un cierto tejido en un cierto tiempo (por ejemplo, en inducción o en partes de planta aérea), que proporciona resistencia a patógenos biotróficos y/o hemibiotróficos , mientras los genes NRC1 endógenos son silenciados en un tejido diferente y/o en un tiempo diferente (por ejemplo, en plántulas, en raices o tubérculos, etc.), con ello se proporciona resistencia para uno o más patógenos necrotróficos . Una planta única puede, por lo tanto, comprender tanto un transgen que expresa NRCl quimérico como un gen de silenciamiento a NRCl.

Alelos y plantas mutantes de conformidad con la invención Es también una modalidad de la invención usar métodos no transgénicos , por ejemplo, sistemas de mutagénesis tal como TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; McCallum et al., 200, Nat Biotech 18:455, y McCallum et al. 200, Plant Physiol. 123, 439-442, ambos incorporados por referencia en este documento) y selección para generar lineas de plantas las cuales producen niveles altos de una o más proteínas NRCl de conformidad con la invención y/o los cuales producen una proteína NRCl constitutivamente activa como se describe. Sin limitar el alcance de la invención, se cree que tales plantas pueden comprender mutaciones de punto/supresión en el promotor que son sitios de enlace para proteínas represoras que hacer al gen NRCl hospedero constitutivo o mayor en expresión. Mutantes NRCl constitutivamente activos pueden comprender mutaciones en la región codificante, tal como la región MHD. Preferiblemente, niveles de proteína NRCl en el mutante o partes del mutante son al menos 2, 5, 10, 15% o más, incrementados en el mutante comparado a plantas no mutantes. El TILLING usa mutagénesis química tradicional (por ejemplo, mutagénesis EMS) seguido por selección de alto rendimiento para mutaciones (por ejemplo, usando desdoblamiento Cel 1 de heteroduplexos ADN mutante de tipo nativo y detección usando un sistema el gel de silenciamiento) , véase por ejemplo, Henikoff et al. Plant Physiology Preview iMayo 21, 2004. De esta forma, se abarcan en este documento plantas no transgénicas , semillas y tejidos que comprenden una expresión intensificada del gen NCR1 en uno o más tejidos y que comprende uno o más de los fenotipos NRC1 de conformidad con la invención (resistencia intensificada a enfermedad y/o lesiones HR) y métodos para generar e identificar tales plantas. El método comprende en una modalidad, las etapas de sembrar la planta sometida a mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis EMS), combinación de plantas individuales o ADN, amplificación RCP de una región de interés, formación heteroduplex y detección de alto rendimiento, identificación de la planta mutante, secuenciamiento del producto RCP mutante. Se entenderá que otros métodos de mutagénesis y selección pueden igualmente ser usados para generar tales plantas mutantes. Las semillas pueden por ejemplo ser irradiadas o químicamente tratadas y las plantas seleccionadas para un fenotipo modificado, tal como resistencia intensificada a enfermedad y/o lesiones HR.

En otra modalidad de la invención, los materiales de planta son poblaciones naturales de las especies o especies relacionadas que comprenden polimorfismo o variaciones en secuencia de ADN en las secuencias codificantes y/o reguladoras ortólogas NRCl. Se pueden seleccionar mutaciones en el objetivo del gen NRCl usando un procedimiento ECOTILLING (Henokoff et al 2004, supra) . En este método, polimorfismos naturales en lineas reproducidas o especies relacionadas se seleccionan por la metodología TILLING descrita anteriormente, en la cual los individuos o agrupaciones de plantas se usan para amplificación RCP del objetivo NRCl, formación heteroduplex y análisis de alto rendimiento. Esto puede ser seguido por la selección de plantas individuales que tienen la mutación requerida que se puede usar subsecuentemente en programa de reproducción para incorporar el alelo ortólogo NRCl deseado para desarrollar el cultivo con rasgos deseados. Plantas mutantes pueden ser distinguidas a partir de no mutantes por métodos moleculares, tal como las presentes mutaciones en el ADN, niveles de proteína NRCl, niveles de ARN de NRCl, etc., y por las características fenotípicas modificadas. Los mutantes no transgénicos pueden ser homocigotos o heterocigotos para la mutación.

Secuencias referidas a SEC ID NO. 1: región codificante del gen NRCl de tomate SEC ID NO: 2: secuencia de aminoácido de la proteina NRCl de tomate SEC ID NO. 3: ADNc de longitud completa del gen NRCl de tomate (que incluye UTR 5' y 3') SEC ID NO. 4: secuencia de aminoácido de la proteina NRC1D481V de tomate SEC ID NO. 5: UTR 3' del gen NRCl de tomate Leyendas de la Figura Figura 1 - Secuencia pronosticada de la proteina NRCl Los primeros residuos de 150 aminoácidos representan dominio y residuos superenrrollados (CC) que son pronosticados para formar la estructura CC son subrayadas. Los residuos 151 a 508 comprenden el dominio de enlace al nucleótido (NB-ARC) , con las siguientes porciones (subrayado y etiquetado) : CinasalA (bucle P) , RNBS-A, Cinasa 2, RNBS-B, RNBS-C, GLPL, RNBS-D y MHD. Residuos 509 a 846 comprenden 13 repeticiones ricas en leucina imperfectas (LRRs) ; los residuos hidrofóbicos y prolina conservados se muestran en negro. Abajo, se indica la proteina somete a secuencia la porción consenso LRR: "1" indica un residuo alifático conservado, "c" indica un residuo cargado conservado y "P" indica un residuo de prolina conservado.

Figura 2A - NRC1 es requerida para HR Mediado por Cf-4 completo de Tomate para Cladosporium fulvum Se inocularon plantas de tomate que contienen Cf-4 y tomate CfO con los constructos TVR indicados y las plantas se analizaron tres semanas después del inicio de VIGS . Las hojas de plantas de tomate que contienen Cf-4 infectadas con TVR se inyectaron con proteina Avr4 y se examinaron para el desarrollo de un HR. El número de sitios iniciando un HR en plantas infectadas con TVR: 00 se muestra al 100%. Cada barra de error representa el error estándar de cuatro experimentos independientes.

Figura 2B - NRC1 es requerida para Resistencia Mediada por Cf-4 completo de Tomate a Cladosporium fulvum Se inocularon plantas Cf-4 o Cf-0 infectadas con TVR y no infectadas con TVR con C. fulvum-pGPD :: GUS y dos semanas después de la colonización por inoculación de las hojas se estudiaron con un ensayo X-gluc.

Figura 3 - Inoculación de N. betha iana con TRV:NCR1 afecta Cf/Ayr-LeEix2/tvEix-Pto/AyrPto y Rx/CP induce HR inoculó N. benthamiana con TVR: 00 (vector vacío), TRV:NRC1 y TRV: SGT1. Tres semanas después las hojas se infiltraron con Agrobacterium que expresa proteínas que inducen HR y se tomaron fotografías a los 4 días después de la infiltración. Primera, segunda y tercera columna: las hojas de N. benthamiana que expresan el gen de resistencia Cf-4 agroinfiltrado con Avr4 o una mezcla de Cf-9 y Avr9, o una mezcla de LeEix2 y tvEix (combinada en una relación 1:1), respectivamente. Columna cuatro: hojas de N. benthamiana transgénica que expresan en gel de resistencia Pto agroinfiltrado con AvrPto. Columna cinco: hojas de N. benthamiana transgénica que expresa el gen de resistencia Rx agroinfiltrado con el gen que expresa la proteína de recubrimiento de PVX (CP) . Los círculos oscuros indican un HR, los círculos brillantes indican un HR comprometido.

Figura 4 - NRCl Constitutivamente activo Induce un HR Independiente de Elicitor y Permite la Posición NRCl en una Trayectoria de Señalización de Muerte Celular N. benthamiana que expresa el gen de resistencia Cf-4, se agroinfiltró con los genes indicados. Para paneles A y C, tres semanas antes de la agroinfiltración, las plantas se inocularon con los constructos TRV indicados. Los círculos oscuros indican un HR, los círculos claros indican un HR comprometido. (A) Agroinfiltración de genes que codifican cinasas APKK y MAPK constitutivamente activas. Primera columna: la agroinfiltración con el gen que codifica el dominio de cinasa constitutivamente activa de LeMAPKKKa (MAPKKK-KD). Segunda columna: agroinfiltración con el gen que codifica una forma constitutivamente activa del LeMEK2 (MEK2DD) . Dos días posteriores a la infiltración de MAPKKK-KD o MEK2DD, la expresión se indujo atomizando hojas con estradiol. Las fotografías se tomaron cuatro días posteriores a la agroinfiltración . (B) Agroinfiltración de NRC1 tipo nativo (wt) y formas mutadas del gen, bajo el control del promotor 35S, ya sea mezclado en una relación 1:1 con Agrobacterium , dirigiendo la expresión del gen supresor de silenciamiento que codifica el gen pl9 (panel izquierdo) , o solo (panel derecho) . NRC1K191R (K191R) : mutante de bucle P inactivo de NRC1; NRC1D481V (D481V) : NRC1 constitutivamente activo (mutado en la porción MHD) ; NRC1^IR DÍBIV (K191R/D481V) : doble mutante de NRC1. Las fotografías se tomaron tres días posteriores a la agroinfiltración . (C) Agroinfiltración de Avr4 y el gen que codifica a NRC1D481V constitutivamente activo (D481V) . Las fotografías se tomaron tres días posteriores a la agroinfiltración.

Figura 5 - Modelo para NRC1 Mediada por Señalización de Muerte Celular Modelos se basan en experimentos de epistasis que combinan ensayos de muerte celular y VIGS en N. benthamiana . Cf-4-Avr4 media las señales de muerte celular en una manera dependiente de EDS1, NRC1, MEK2 y ST1/RAR1. Los siguientes ejemplos no limitantes, ilustran las diferentes modalidades de la invención. A menos que se declare de otro modo en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevaron a cabo de conformidad con los protocolos estándares como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; y en Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y métodos estándares para trabajo molecular de planta, se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, conjuntamente publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications , UK.

EJEMPLOS 1. MATERIALES Y MÉTODOS 1.1 VIGS en N. benthamiana , Agroinfiltración, HR y Ensayos de Enfermedad Plantas de N. benthamiana de cuatro semanas se agroinfiltraron con una mezcla 1:1 de constructos derivados de pTVOO (vector ARN2 TRV binario) y pBintra6 (vector ARN1 TRV binario) (Ratcliff et al., 2001 Plant J. 25, 237-245), o una mezcla 1:1 de constructos derivados de ARN2 pTRV y ARN1 pTRV (Liu et al., 2002, Plant J. 31, 777-786; Liu et al., 2002, Plant J. 30, 415-429). Se usaron los siguientes constructos de TRV: TRV:NRC1, TRV:Cf-4 y TRV:SGT1 (Peart et al., 2002, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 10865-10869), todos en el vector TRV descrito por Ratcliff et al. (2001, supra) y TRV:EDS1, TRV : EK2 , TRV : RAR1 y TRV : DR1 (Ekengren et al., 2003, Plant J. 36, 905-917), todos en el vector TRV descrito por Liu et al. (2002, Plant J. 30, 415-429). Para cada constructo de TRV, en cada experimento, se usaron cuatro plantas. AvrPto y CP se agroinfiltraron en N. benthamiana infectada con TRV que expresa el gen de resistencia Pto (N. benthamiana: Pto (linea 38-12 (Rommens et al., 1995, Plant Cell 7, 1537-1544)) (Pedley and Martin, 2003, Annu. Rev. Phytopathol . 41, 215-243) y Rx {N. benthamiana: Rx (linea Rx- 18) (Bendahmane et al., 1999, Plant Cell 11, 781-791), respectivamente. En los otros casos, se realizó agroinfiltración en N. benthamiana que expresa la resistencia del gen Cf-4 (N. benthamiana: Cf-4) . Tres semanas posteriores a la inoculación con TRV, la tercera, cuarta y quinta hoja arriba de las hojas inoculadas, se cambiaron con Agrobacterium tumefaciens que dirige la expresión de AvrPto (OD6oo=0.06) (Tang et al., 1996, Science 274, 2060-2063), CP (OD60o=0.12) (Bendahmane et al., 1999, supra) , Avr4 (OD600=0.03 ) , Cf-9 y Avr9 (mezclada en una relación 1:1, OD6oo=0.2) (Van der Hoorn et al., 2000 Mol. Plant-Microbe Interact . 13, 439-446), LeEix2 y tvEix (mezclada en una relación 1:1, OD60o=l) (Ron and Avni, 2004, Plant Cell 16, 1604-1615), el gen ß-glucuronidasa (GUS) (OD60o=2) (Van der Hoorn et al., 2000, Mol. Plant-Microbe Interact. 13, 439-446), NRC1 y pl9 (mezclado en una relación 1:1, OD6oo=l) (Voinnet et al., 2003, Plant J. 33, 949-956), el NRC1D 81V constitutivamente activo o el doble mutante inactivo URC1k191r/msiv (OD600=2 ), LeMAPKKKa*0, LeMAPKKKc 0- (Del- Pozo et al., 2004, EMBO J. 23, 3072-3082) (ambos a OD600=O.12) o LeMEK2 DD y LeMEK2 (Del Pozo et al., 2004, supra) (ambos a OD60o=0.25). Dos días posteriores a la infiltración de LeMAPKKKof0, LeMAPKKKoF0- , LeMEK2DD o LeMEK2 , las hojas se atomizaron con una solución 7.5 µp? de 17 -ß-estradiol en agua, que contiene silwet (4 µ1/100 mi) (Del Pozo et al., 2004, supra). Para inyecciones de proteina, proteina etiquetada con AvrA -HIS-FAG, se trató con enterocinasa EK-max de conformidad con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, Breda, NL) y 5 µ? de proteina Avr4 en agua, suplementada con 0.2% tween (v/v), se usó para las inyecciones. Tres a cinco días posteriores a la agroinfoiltración o inyección de proteina, las hojas se examinaron para determinar el desarrollo de un HR, o se sometieron a ensayo para determinar actividad de ß-glucouronidasa (GUS) . 1.2 VIGS en tomate, HR y ensayos de enfermedad Para VIGS en tomate, se usaron vectores TRV-ARN1 y pTRV-ARN2 descritos por Liu et al. (2002, Plant J. 30, 415-429) . Los fragmentos Cf-4 y NRC1, se escindieron de PTV00 por digestión con BamHl/Asp718 e insertaron en pTRV-ARN2 digerido con BamHl/Asp718 (pYL156) (Liu et al., 2002, Plant J. 31, 777-786). Para el constructo constructo TRV:222-UTR, se amplificó parte de la 3 ' -UTR de NRC1 usando los cebadores 222-3 ' UTR-F (5'- GTGGATCCGCAGGTTCAACCAGCCTGGT-3 ' ; sitio BamHl subrayado) y 222-3 'UTR-R ( 5 ' -GTGGTACCCAAGTGACTTGTTCTGCTGT-3 ' ; sitio Asp718 subrayado) y para el constructo TRV:222-LRR, parte de la región NRC1 que codifica al LRRs 222-LRR-F (5'-GTGGATCCGTTAAGAGGCTGCAATTTCT-S ' ; sitio BamHl subrayado) y 222-LRR-R ( 5 ' -GTGGTACCGATCTTCTCAAGTTTATCAC-3 ' ; sitio Asp718 subrayado) . Los fragmentos de PCR fueron digeridos por BamHl/Asp718 e insertados en el pTRV-ANR2 digerido por BamHl/Asp718. La construcción de TRV:Prf se ha descrito (Ekengren et al., 2003, Plant J. 36, 905-917) . Todos los plásmidos se transformaron a la cepa GV3101 de A. tumefaciens por electroporacion (Takken et al., 2000, Plant J. 24, 275- 283). Para establecer VIGS en tomate, cotiledones de plántulas de tomate de diez a doce días, se agroinfiltraron con una mezcla de los constructos derivados de pTRV-ARNl y pTRV-ARN2 (combinados en una relación 1:1), (Liu et al., 2002, supra) . Para cada constructo TRV, ya sea cuatro plantas de tomate que contienen Cf-4 (plantas CfO transformadas con Hcr9-4D {Cf-4)) (Thomas et al., 1997, Plant Cell 9, 2209-2224), resistentes a C. fulvum que expresa Avr4, o cuatro plantas de tomate que contienen Cf-4 (plantas CfO transformadas con Hcr9-9C (Cf-9) ) (Jones et al., 1994, Science 266, 789-793), resistentes a C. fulvum que expresan Avr9 , fueron usadas. Como control, plantas de tomate CfO (MM-Cf0) completamente susceptibles a C. fulvum, ya sea inoculadas con TRV: 00 o TRV: NRC1, fueron usadas. Para ensayos de enfermedad, tres semanas posteriores a la inoculación de TRV, plantas que contienen CfO y Cf-4, fueron inoculadas con C. fulvum (De it, 1977, Neth. J. Plant Path. 83, 109-122). Se usó pGPDv.GUS de raza C. fulvum (que expresa Avr4 y el gen de ß-glucouronidasa bajo el control del promotor GPD constitutivo) . La colonización de los foliólos se valoró dos semanas después por teñido X-gluc. En paralelo, foliólos de la segunda, tercera o cuarta hoja compuesta de las plantas, se usaron para análisis de RT-PCR para probar la "supresión" del gen de interés (véase abajo) . Para ensayos de HR, foliólos de la tercera hoja compuesta de plantas que contienen Cf-4 o Cf-9 infectadas con TRV, fueron inyectadas con Avr4 o Avr9, respectivamente. Ambos elicitores fueron inyectados en foliólos con una micro-j eringa (Ito Corporation, Fuji, Japón) . El Arv4 se inyectó a una concentración de 10 µ?, a diez sitios por foliólo y cuatro foliólos por planta. Para Avr9, fluido apoplástico diluido ocho veces, que contiene aproximadamente 10 µ? de Avr9, aislado de una interacción compatible entre la raza 5 de C. fulvum y plantas de CfO, se inyectó en ocho sitios por foliólo y cuatro foliólos por planta. Se ensayó la resistencia contra Pseudomonas syringae pv. ?ornato, en RG-PtoR de tomate ( Pto/Pto; Prf/Prf) , inoculado con TRV-.00, TRV:Prf o TRV: NRCl. El procedimiento de inoculación y la determinación de la colonización bacteriana de las hojas se realizó como se describe previamente (Ekengren et al., 2003, supra) . 1.3 Construcción de Vector Binario 35S:NRC1 y Mutagénesis El ADNc de NRCl de longitud completa se amplificó por PCR usando los cebadores 222-Inicio-F (5'-GGGATCCATGGTTGATGTAGGGGTTGA-31 ) y 222-Detención-R (5'-GTCACTGCAGACCTTTCTAAGAAGCTGTCTG-3 ' ) , con ello, introduciendo sitios de restricción Nocí y PstI, respectivamente (sitios de restricción subrayados). El fragmento de PCR fue diferido por NcoI/PstI e insertado en pRH80 diferido por NcoI/PstI (Van der Hoorn et al., 2000, Mol. Plant-Microbe Interact. 13, 439-446).

Subsecuentemente, el constructo fue diferido por Xbal/Kpnl y el fragmento resultante que contiene el promotor 35S, la estructura lectora abierta NRC1 y el terminador NOS (tNOS) , se clonó en el vector binario pMOG800 (Honee et al., 1998, Plant Physiol. 117, 809-820), para crear el plásmido (NRCl(vit). Para crear NRC1D48IV binario constitutivamente activo, se introdujo la mutación D481V por traslape de extensión de PCR (Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16, 7351-7367) usando el plásmido NRClvit como una plantilla y cebadores de flanqueo 222-Inicio-F y 222-Detención-R y cebadores de desapareamiento 222MHD-F (5'- CAAAACTTGTCGTGTTCATGTCATGTTGTATGAG-3 ' ) y 222MHD-R (5'-CCAGCAAAACTCATACAACATGACATGAACACGAC-3 ' ) (mutación subrayada) . El fragmento fue diferido con NcoI/PstI, insertado en pRH80 y el fragmento 35S-NRC1M81V-tUOS , se escindió y subsecuentemente se insertó en pMOG800 como se describe anteriormente. En una forma similar, se crearon el mutante de bucle P NRC1K191R, y el mutante doble inactivo N C1Ki9iR/D48iv_ Aquií la mutación K191R se introdujo usando cebadores de desapareamiento 222PBucle-F (5'-GGAATGCCTGGTCTTGGCAGAACTACACTAGC-3 ' ) y 222PBucle-R (5'- GCT AGTGTAGTTCTGCCAAGACCAGGCATTCC-3 ' ) (mutación subrayada), con el respectivamente, el plásmido NRC1 (wt) y NRC1D481V como una plantilla. Todos los constructos fueron secuenciados-verificados y transformados a la cepa A. turnefaciens GV3101. 1.2 Análisis de Manchado en Gel de ADN El ADN genómico de N. benthamiana , se aisló usando el protocolo de extracción de ADN QIA-Gen (Qiagen, Venlo, NL) , mientras para tomate, se usó el protocolo estándar descrito por (Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor, Y, U.S. A.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . El ADN se digirió con BamHI, HindIII, EcoRI, EcoRN o Xbal. El manchado de gel de N. benthamiana se hibridizó con el fragmento de 252 pb etiquetado con 32P (Prime-a-gene Labeling System, Promega, Madison, I), presente en el vector TRV: NRC1 y el manchado en gel de ADN de tomate, se hibridizó con una sonda etiquetada con 32P de 1293 bases, que corresponde a los nucleótidos 1876 a 3168 del ADN c de NRC1 de longitud completa. Los sitios para las enzimas de restricción usados no están presentes en las sondas. La baja rigurosidad se refiere a un lavado a 55°C en 2x SSC y 0.5% de SDS. Las condiciones de alta rigurosidad consisten de lavados a 65°C en 0.5X SSC y 0.5% de SDS. 1.5 RT-PCR para Mostrar Silenciamiento de NRC1 en Tomate Cuatro discos de hoja (de aproximadamente 100 mg de tejido en total), se colectaron de la segunda, tercera o cuarta hoja compuesta de plantas infectadas con TRV. El ARN total es extraído usando el protocolo de extracción NRAeasy QIA-Gen (Qiagen, Venlo, NL) y tratado con DNase libre de RNase (Bio-Rad, Veenendaal, NL) . El ADNc de primera hebra se sintetizó de 1 g de ARN total usando el kit de síntesis de ADNc Bio-Rad (Bio-Rad, Veenendaal, NL) y se realizó RT-PCR usando los siguientes ciclos :95°C por 15 segundos, 60°C por 45 segundos y 72°C por 60 segundos. Los cebadores que se usaron 222 F : 5 ' -TGAGGTAT ATTGCTTTCTCATCTGAC-3 ' y 222R:5'-AGCTATTTTCCCACGGATGCCCAG-3 ' ) , no cubren el fragmento él cual es insertado en TRV:NRC1. Cebadores de actina (ActinFnrl82 : 5 ' -TATGGAAACATTGTGCTCAGTGG-3 ' y ActinRnrl83: 5 ' -CCAGATTCGTCATACTCTGCC-3 ' ) se utilizaron para verificar la presencia de cantidades iguales de ADNc en las reacciones de PCR.

Ejemplo 2 - Resultados 2.1 NRCl de Tomate: una Protelna CC-NB-LRR Se realizó análisis ADNc-AFLP, seguido por VIGs de los fragmentos identificados de tomate en N benthamiana : Cf-4. 20 fragmentos de ADNC se identificaron de los cuales la VIGS afecta la HR inducida por Cf-4/Avr4. Para uno de estos, NRCl, el ADNc de longitud completa se aisló, como se representa en la SEC ID NO: 3. El cuadro de lectura abierta se muestra en la SEC ID NO: 1, la cual codifica la proteina NRCl representada en la SEC ID NO: 2. La estructura primaria predicha de la proteina NRCl (SEC ID NO: 2) típicamente se asemeja a aquella de las proteínas con resistencia a CC-NB-LRR (Figura 1) . La NRCl tiene un dominio de doble espiral (CC) amino terminal, un dominio NB-ARC (adaptador Enlazante de Nucleótido compartido por Apaf-1, proteínas R y CED4) (Van der Biezen and Jones, 1998, Curr. Biol. 8, R226-R227; Aravind et al, 1999, Trends Biochem. Sci. 24, 47-53) y 13 repeticiones ricas en leucina imperfectas (LRRs) . Como se indica en la figura 1, la comparación con dominios NB-ARC homólogos reveló la presencia de una porción de espiral P o CinasalA, cuatro porciones de RNBS (Sitio de Enlace de Nucleótido de Resistencia) y una porción GLPL y MHD (Meyers et al., 1999, Plant J. 20, 317-332; Meyers et al., 2003, Plant Cell 15, 809-834) .

El fragmento ADNc-AFLP de 252 bp presente en el vector TRV:NRC1 se utilizó para códigos de VIGS para aminoácidos 599-681, los cuales se ubican en cuatro a siete LRRs . El análisis de manchado con gel de ADN de baja severidad de ADN genómico de tomate digerido con BamHI-, HindIII-, EcoRI-, EcoRV- y Xbal, se hibridizó con fragmento de ADNc NRCl de 1293 bp (nucleótidos 1876 a 3168 de SEC ID NO: 3) que cubre la secuencia de NRCl presente en los constructos TRV:NRC1-, TRV: NRC1-LRR- y TRV:NRC1-UTR (véase posteriormente) como una sonda. Este manchado Southern reveló solamente una banda prominente después de un lavado de alta severidad, lo cual indica que NRCl es un gen de copia única en tomate. Un manchado de gel de ADN genómico digerido por BamHI, HindIII, EcoRI, EcoRV y Xbal de N. benthamiana se probó con el fragmento ADNc-AFLP de NRCl presente en el vector TRV y dos-tres bandas hibridizantes se encontraron (resultados no mostrados ) ( 0.5 x SSC, 0.5% SDS, 65°C). Esto sugiere que existen al menos dos o tres ortólogos de NRCl presentes en el genoma de N. benthamiana que se pueden silenciar en inoculación con TRV: NRCl. 2.2 Tomate de NRCl silenciada es Afectado en HR Mediada por Cf4 y Resistencia a Enfermedades Para investigar la función de NRCl en la señalización de HR y resistencia a C. fulvum, los inventores realizaron VIGS en tomate, puesto que esta planta es la única hospedera para este hongo. Plántulas de tomate de diez días de edad se agroinfiltraron con TRV:NRC1 y tres semanas pos-infiltración el ARN se aisló de hojas sueltas potencialmente silenciadas y se analizaron por RT-PCR. Los niveles de transcripto de NRCl variaron en diferentes plantas infectadas con TRV:NRC1, pero en la mayoría de los casos fueron menores en las plantas infectadas con TRV:00, indicando que la 'desactivación' de la expresión de NRCl ha ocurrido (datos no mostrados) . Para excluir la posibilidad que el fenotipo que se observo en tomate es causado por el silenciamiento de proteínas NB-LRR adicionales, también se realizó VIGS en tomate usando un fragmento de 360 bp de NRCl dirigido a ocho a doce LRRs (TRV : NRC1-LRR) , y un fragmento que consiste de 297 bp de la región 3 ' -no traducida (UTR) de NRCl (TRV:NRC1-UTR) . Con estos constructos se probó si NRCl se requiere para HR mediada por Cf4 en tomate por inyecciones de proteína Avr4 en plantas de tomate que contienen Cf-4 infectadas con TRV:222-LRR y TRV:222-UTR. El silenciamiento de NRCl (usando cada uno de los tres constructos) resulta en un fenotipo suave ya que las plantas de tomate parecen un poco menores que las plantas infectadas con TRV:00 o TRV:Cf (datos no mostrados). Como control se inyectó proteina Avr4 en plantas infectadas con TRV:00 y TRV:Cf-4. En plantas infectadas con TRV:Cf-4 el porcentaje de sitios inyectados con Avr4 respondedores fue 52% (figura 2), indicando una HR disminuida debido al silenciamiento de Cf-4. En plantas infectadas con TRV:222-LRR y TRV:222-UTR este porcentaje fue similar (56% y 48%, respectivamente) (Figura 2), confirmando la función de NRC1 en HR inducida por Cf-4/Avr4 , también en tomate. Se obtuvieron resultados similares en VIGS de Nrcl en tomate que contiene Cf-9 e inyecciones subsiguientes de fluido apoplástico que contiene Avr9 (no mostrado) . Para VIGS de Cf-9 en tomate que contiene Cf-9 se utilizó el constructo TRV:Cf-4, puesto que los códigos de fragmento Cf-4 de 404 bp para LRRs altamente conservadas 15 a 21, habilitando el silenciamiento tanto de Cf-4 como el gen de resistencia Cf-9 homólogo (Van der Hoorn et al., 2001, supra). Además, se investigó si NRC1 también se requiere para resistencia completa de tomate a C. fulvum. Las plantas CF0 y Cf-4 se inocularon con TRV:00, TRV:Cf-4 y TRV:NRC1 y después de tres semanas las plantas silenciadas se inocularon con una cepa de C. fulvum que expresa Avr4 y el gen ß-glucuronidasa (GUS) , permitiendo la visualización de crecimiento fúngico. Dos semanas post inoculación con C. fulvum las hojas se mancharon con X-gluc. En las hojas sueltas de plantas Cf-4 infectadas con TRV:00 no se detectó crecimiento de C. fulvum, mientras que en plantas Cf-4 infectadas con TRV:Cf-4 los parches de manchado azul indicaron resistencia comprometida mediada por Cf-4 (no mostrada) . También en las plantas infectadas con TRV:NRC1 pequeños parches de manchado azul indican pérdida de resistencia completa contra el hongo. El análisis microscópico reveló crecimiento intercelular de hifas fúngicas en plantas infectadas con TRV:Cf-4 y TRV:NRC1, pero no en plantas de control infectadas con TRV:00. Todas las plantas CfO exhibieron colonización extensa por C. fulvum, indicando que ni la infección de TRV misma, ni VIGS que usa TRV:NRC1 afecta la susceptibilidad de estas plantas al hongo. 2.3 VIGS de NRC1 Afecta la HR Inducida por Diferentes Combinaciones de Gen R/Gen Ayr de Igualación Además de una HR inducida por Cf-4/Avr4 disminuido en VIGS que usa NRC1, se encontró también que la HR inducida por el elicitor Infl del patógeno oomiceto Phytophthora infestans se disminuyó en VIGS que usa NRC1 en N. benthamiana. Para investigar adicionalmente la especificidad de NRC1 en defensa de la señalización, los inventores probaron su requerimiento para la HR inducida por combinaciones R/Avr adicional. Como controles se incluyeron TRV:00 (vector vacio) y TRV: SGT1, puesto que SGT1 se conoce que es requerido para la HR inducida por varias combinaciones R/Avr (Peart et al., 2002, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 10865-10869). La agro infiltración de una mezcla de Cf-9 y Avr9 (Van der Hoorn et al., 2000, supra) , o una mezcla de LeEix2 y tv£ix (Ron and Avni, 2004, Plant Cell 16, 1604-1615) en N. benthamiana infectada con TRV:NRC1 resultó en una HR disminuida, mientras que en las plantas infectadas con TRV: 00 la HR se desarrolló normalmente. En las plantas infectadas con TRV:SGT1 la HR fue abolida completamente, confirmando las observaciones de Peart et al. (2002, supra) (Figura 3) . También el AvrPto del patógeno bacteriano Pseudomonas syringae pv tomato y el gen que codifica la proteina de envoltura (CP) de virus de papa X (PVX) fueron agro-infiltrados en N. benthamiana infectada con TRV que expresa el gen de resistencia Pto (Pedley and Martin, 2003, Annu. Rev. Phytopathol. 41, 215-243) y Rx (Bendahmane et al, 1999, Plant Cell 11, 781-791), respectivamente. En ambos casos las plantas infectadas con TRV: 00 mostraron una HR, mientras que la HR fue abolida en plantas infectadas con TRV:SGT1. La infección con TRV:NRC1 resultó en una HR inducida por Pto/AvrPto asi como Rx/CP severamente suprimido, indicando que en N. benthamíana una proteina NRC1 es requerida para la señalización de HR activada por varias combinaciones de gen para gen R/Avr (Figura 3). Para excluir la posibilidad que la HR comprometida en N. benthamiana infectada con TRV:NRC1 resulte de una eficiencia de transformación disminuida por Agrobacterium, los inventores infiltraron N. benthamiana : Cf-4 infectada con TRV:00 y TRV:NRC1 con Agrobacterium que expresa el gen ß-glucuronidasa (GUS) (Van der Hoorn et al., 2000, supra) . Tres días post infiltración una intensidad similar del manchado azul en plantas infectadas con TRV:00 y TRV:NRC1 reveló que la eficiencia de transformación de las plantas por Agrobacterium no es afectadas (datos no mostrados). Además, las plantas infectadas con TRV:NRC1 también mostraron una HR reducida en inyección con proteina Avr4, mientras que en las plantas infectadas con TRV:00 una HR clara se desarrolla dentro de 2 días. 2.4 NRC1 Actúa Corriente Abajo de EDS1 y Corriente Arriba de la Cascada APK en una Trayectoria de Señalización de Muerte Celular Puesto que NRC1 es requerida no solamente para HR inducida por Cf-4/Avr4, sino también para HR inducida por varias combinaciones R/Avr adicionales, la NRC1 parece estar involucrada en una trayectoria de señalización de HR común. Una respuesta de hospedador típica que precede el inicio de la HR incluye la activación de cascadas MAPK (Romeis et al, 2001, EMBO J. 20, 5556-5567; Del Pozo et al., 2004, EMBO J. 23, 3072-3082; Pedley and Martin, 2005, Plant Biol . 8, 541-547) . Para investigar el requerimiento de NRC1 para la HR iniciada por MAPKs, se realizaron experimentos de epistasis en N. benthamiana . Las plantas fueron inoculadas con TRV:00, TRV:SGT1 y TRV:NRC1 y posteriormente se agroinfiltraron con genes que codifican el dominio cinasa de LeMAPKKKa {LeMAPKKKc 0) o constitutivamente activan LeMEK2 ( LeMEK2DD) (Yang et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 741-746; Del Pozo et al., 2004, EMBO J. 23, 3072-3082.). Dos días post-agroinfiltración la expresión de los genes fue inducida pulverizando las hojas infiltradas con estradiol. La expresión temporal de cada uno de los genes resulta en una HR en plantas infectadas con TRV:00, mientras que en plantas infectadas con TRV:SGT1 la HR se disminuyó (figura 4A) . En plantas infectadas con TRV:NRC1 la HR originada por ambas cinasas constitutivamente activas no se afectó (Figura 4A) . La agro infiltración de los controles negativos correspondientes, LeMAPKKKof0 y LeMEK2 tipo silvestre no resulta en una HR en cualquiera de las plantas infectadas con TRV (datos no mostrados) . Estos resultados indican que la SGT1 es funcional corriente abajo de estas MAPKs, mientras que las MAPKs actúan ya sea corriente abajo o independiente de NRCl. 2.5 Sobre-expresión Temporal de NRCl y construcción de una proteina NRCl constitutivamente activa Para investigar adicionalmente cuales genes son requeridos para señalización de HR por la proteina CC-NB-LRR el efecto de la sobre-expresión de NRCl se investigó. Por lo tanto, la secuencia codificante (SEC ID NO: 1) del ADNc se fusionó con el promotor 35S constitutivo y se insertó en un vector binario. La agroinfiltración de este constructo en N. benthamiana no resulta en una HR, mientras que la expresión de una mezcla de NRCl y el inhibidor de silenciamiento pl9 (Voinnet et al, 2003, Plant J. 33, 949-956) provocaron una HR independiente del elicitor (Figura 4B) . La agroinfiltración de un constructo que codifica un mutante de espiral P de NRCl (K191R) interrumpe la porción de espiral P, afectando la hidrólisis de ATP (Tameling et al., 2002, Plant Cell 14, 2929-2939), ya sea con o sin pl9, no resulta en una HR (Figura 4B) . Los datos descritos anteriormente indican que el silenciamiento de gen post-transcripcional (PTGS) del gen NRCl puede, por lo tanto, prevenir el desarrollo de una HR en el tejido que sobre-expresa NRCl. Además, la interrupción de la porción de espiral P resulta en una proteina NRCl no funcional. Puesto que las mutaciones en la porción MHD de las proteínas Rx con resistencia a NB-LRR (D460V) (Bendahmane et al., 2002; Tameling et al., 2002) e 1-2 (D495V) (Bendahmane et al., 2002, Plant J. 32, 195-204; Tameling et al., 2002, Plant Cell 14, 2929-2939; Van Bentem et al., 2005, Plant J. 43, 284-298) resultan en actividad constitutiva, los .inventores generaron un mutante similar de NRCl (NRC1D481V) . En efecto, la agroinfiltración de NRC1D481V resultó en una HR independiente de elicitor en hojas de N. benthamiana dentro de tres días post infiltración y nuevamente no se observó HR durante la agroinfiltración de NRC1Ki9iR/D48iv mutante doble (Figura 4B) . Además, no se indujo HR durante la expresión de NRC1D481V en plantas silenciadas con SGTI (véase posteriormente) . Estos resultados indican que la respuesta inducida en agroinfiltración de NRC1D481V es específicamente debida a la actividad constitutiva de la proteína NRCl y que las funciones de NRCl en una cascada de transducción de señal conducen a HR. 2.6 Experimentos de epistasis usando una protelna NCR1 constitutivamente activa Los experimentos de epistasis que emplean NRC1D481V se realizaron para investigar además cuales genes son requeridos para la señalización de HR por esta proteina, y por esto se determina su posición putativa en una trayectoria HR. Además de VIGS de genes conocidos para ser involucrados generalmente en la señalización de HR, tal como SGT1 y RAR1 (Requerido para resistencia de Mlal2) (Shirasu and Schulze-Lefert , 2003, Trends Plant Sci . 8, 252-258), N. benthamíana: Cf- 4 se silenció por NDR1 (resistencia a la enfermedad de subespecie no especifica) (Century et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 6597-6601), EDS1 (susceptibilidad a la enfermedad mejorada) (Aarts et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 10306-10311) y MEK2 (un MAPKK) (Ekengren et al., 2003, Plant J. 36, 905-917), y subsecuentemente agroinfiltrada con NRC1D481V o Avr4. Además, VIGS usando TRV:00, TRV:Cf-4 y TRV:NRC1 se incluyó como controles. Una HR inducida por NRC1D481V o Avr4 comprometida indica 'desactivación' de un gen requerido para la señalización de HR inducida por NRC1 o Cf-4/Avr4 respectivamente. Como se espera, HR inducida en la agroinfiltración de Avr4 se comprometió en plantas infectadas con TRV-Cf-4 y TRV:NRC1. La señalización mediada por Cf-4 también requiere EDS1, cuando las plantas silenciadas por este gen exhiben una HR inducida por Avr-4 menos severa. Además, los inventores encuentran una HR reducida en la agroinfiltración de Avr4 en plantas silenciadas para MEK2, RAR1 y SGT1 (Figura 4C; circuios claros) . La HR inducida por Avr4 no está comprometida en plantas infectadas con TRV: 00 y TRV : NDR1 (Figura 4C; circuios oscuros), indicando que NDR1 no es requerido para la señalización mediada por Cf-4. De manera similar, HR inducida por NRC1D481V no se comprometió en plantas infectadas con TRV: 00 y TRV : NDR1 , y tampoco en plantas infectadas con TRV:Cf-4. De manera interesante, en contraste a Avr4, NRC1D 81V todavía induce una HR en plantas infectadas con TRV:EDS1, indicando que NRC1 es funcional corriente abajo de EDS1 (Figura 4C; círculos oscuros) . La HR inducida por NRC1D 81V es comprometida en plantas silenciadas para MEK2, mostrando que la NRC1 requiere la cascada de cinasa MAP para su señalización y se puede posicionar corriente arriba de estas cinasas. La VIGS de RAR1 y SGT1 también compromete la HR inducida por D481V, similar a la HR inducida por Avr4 (figura 4C; círculos claros) . Por consiguiente, NRC1 es requerida para señalización de HR iniciada por Cf-4 y se puede posicionar corriente arriba de la cascada MAPK y corriente abajo de EDS1.

Véase figura 5 para un modelo de señalización celular mediada por NRCl.

Ejemplo 3 - Requerimiento de NRCl para resistencia mediada por Mi Para determinar si NRCl es requerida para resistencia mediada por Mi contra nemátodos, mosca blanca y áfidos, una forma constitutivamente activa de Mi (véase US 6613962 y EP0937155B1) es agroinfiltrada en plantas silenciadas con NRCl. Una HR disminuida en plantas silenciadas con NRCl indica que NRCl también es requerida para HR mediada por Mi y que la ( sobre ) expresión de NRCl se puede usar para generar plantas transgénicas que tienen resistencia mejorada contra nemátodos, mosca blanca y áfidos.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una planta transgénica que tiene resistencia intensificada a enfermedad comparada con una planta control no transgénica, caracterizado porque el método comprende las etapas de: (a) transformar una planta o célula de planta con una secuencia de nucleótido que codifica una proteina NRC1 operablemente enlazada a un promotor activo en células de planta, (b) regenerar una planta. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótido se integra en el genoma de la planta. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque además comprende la etapa (c) seleccionar la planta regenerada, o un derivado de la planta de esta por autofecundación o cruzamiento, para resistencia de uno o más patógenos de la planta e identificación de una planta que comprende resistencia intensificada a uno o más de los patógenos de la planta.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible por patógeno.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteina NCRl comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 ó SEC ID NO: 4, o una secuencia de aminoácido que comprende al menos 70% de identidad de aminoácido para la SEC ID NO: 2 sobre su longitud completa.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la planta pertenece a la familia Solanaceae .
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la planta es del género Solanum.
8. Una planta transgénica, célula de la planta, semilla o fruto, caracterizada porque se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
9. Una proteina aislada caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: , o una secuencia de aminoácido que comprende al menos, 70% de identidad de secuencia de aminoácido con la SEC ID NO: 2 sobre su longitud completa.
10. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque codifica la proteina de conformidad con la reivindicación 9.
11. Un gen quimérico caracterizado porque comprende un promotor activo en células de planta, operablemente ligado a una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, y opcionalmente, además operablemente ligado a una molécula de ácido nucleico no traducida al 3' .
12. Un vector, caracterizado porque comprende el gen quimérico de conformidad con la reivindicación 11.
13. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteina NRC1 para la generación de plantas resistentes a enfermedad, en donde dicha proteina NRC1 comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: , o una secuencia de aminoácido que comprende al menos, 70% de identidad de secuencia de aminoácido con la SEC ID NO: 2 sobre la longitud completa.