CN114292949B - 一种快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法，该方法包括抗蚜标记专用引物RhWRKY14，蔷薇长管蚜的接种，荧光定量RTFQ‑PCR试验，以及抗蚜材料的等级划分。该方法仅用1天时间和少量植物材料，即可准确高效地在我国各地鉴定出对蔷薇长管蚜具有抗虫性的月季种质资源，节约成本、省工省时。

Description

一种快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法

技术领域

本发明属木本花卉抗虫育种技术领域，具体涉及不同月季种质资源对蔷薇长管蚜的抗性鉴定和筛选。

背景技术

月季(Rosa hybrida)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa L.)植物，栽培广泛，是全球第一大切花。在我国，云南省是月季切花的主产区之一。

危害月季的蚜虫主要包括蔷薇长管蚜(Macrosiphum rosae)、月季长管蚜(Macrosiphum rosivorum)、桃蚜(Myzuspe rsicae)、月季冠蚜(Myzaphis rosarum)、棉蚜(Aphis gossypii)等，其中蔷薇长管蚜最为常见且危害严重，其常聚集于月季嫩梢部位刺吸汁液，进而使花卉长势衰弱，同时增加其他病虫害的感染率。随着切花月季生产规模的不断扩大，蚜虫对月季的危害日渐严重，目前，主要是采用施用农药对其进行防治，但这样不仅增加了生产商的生产成本，而且对环境造成了污染。因此，选育和种植抗蚜月季新品种是今后绿色生产的关键。

选育月季抗蚜新品种的前提，就是要应用准确高效的抗蚜鉴定和筛选方法，对大量的月季亲本材料和大量的月季杂交后代，进行抗蚜鉴定和筛选工作，以期缩短抗蚜育种的周期。迄今为止，国内外尚未有利用分子标记技术筛选抗蚜月季种质资源的研究报道。目前，国内外对于抗蚜植物的传统筛选鉴定方法主要是：将蚜虫接种到鉴别寄主植物上，经过一定产蚜周期，记录和统计寄主叶片上产蚜数量变化情况，以此鉴别出不同抗蚜等级的植物材料。

基于我们前期对月季蔷薇长管蚜对月季资源各个阶段的危害特点、月季抗蚜基因的克隆和测序、月季抗蚜基因分子标记开发等多方面开展了大量的科研工作，发现结合现代分子生物技术对抗蚜材料进行鉴定筛选，不仅能准确地鉴定和筛选出抗蚜材料，而且能缩短鉴定周期，同时还具有操作方便、省工省材等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速筛选抗蔷薇长管蚜的月季种质资源的方法，以便解决目前抗蚜植物的传统筛选鉴定方法存在的费事费力和鉴别不精准的缺陷。

本文本以下所使用的术语：

抗蚜：抗蔷薇长管蚜。

蚜虫：蔷薇长管蚜。

荧光定量RTFQ-PCR技术：实时荧光定量聚合酶链反应，英文Real-TimeFluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称：RTFQ-PCR。

UBC基因：泛素结合蛋白(UBiquitin Conjugating protein)基因。

RhWRKY14基因：月季七肽(WRKYGQK)保守转录因子基因(Rosa hybrida probableWRKY transcription factor 40Locus Chromosome 2，RhWRKY14)

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

1.一种利用荧光定量RTFQ-PCR技术快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的专用引物RhWRKY14，所述专用引物RhWRKY14由RhWRKY14上游引物和RhWRKY14下游引物组成，所述RhWRKY14上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，RhWRKY14下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种利用荧光定量RTFQ-PCR技术快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法，其特征在于，用权利要求1所述的专用引物RhWRKY14对对照月季种质资源材料叶片和接种蔷薇长管蚜成虫的月季种质资源材料培养1d后去除蔷薇长管蚜成虫后的叶片样本进行抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量的测定，按抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量划分的抗蔷薇长管蚜等级鉴定月季种质资源对蔷薇长管蚜的抗性级别。

进一步，所述抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量划分的抗蔷薇长管蚜等级为如下4个等级：

0级：免疫，相对表达量≧20；

1级：高抗，相对表达量≧15，且<20；

2级：中抗，相对表达量≧10，且<15；

3级：低抗，相对表达量≧5，且<10。

进一步，所述接种为：将待鉴定的月季种质资源材料的叶片用70％v/v乙醇处理1min，然后用无菌水清洗3～5次作为待接种的叶片；将蔷薇长管蚜成虫饥饿处理4h，而后用已灭菌的湿润毛笔将蔷薇长管蚜成虫接种到待接种的叶片上。

与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是：

1.通过前期大量的实验，利用本发明方法将所收集的873份月季种质资源进行了抗蚜筛选试验，其结果表明，用本发明方法筛选鉴定出的抗蚜种质资源与采用传统的方法鉴定结果，相比较后，结果完全一致，说明本发明方法可高效准确地在我国各地鉴定出抗蚜月季种质资源，而且节约成本、省工省时，尤其适用于对大量的月季资源杂交后代早期抗蚜鉴定和筛选，是一套适用于我国各地进行高效鉴定和筛选抗蚜月季种质资源的方法。

2.本发明方法的核心是利用我们前期研发的月季抗蚜标记基因专用引物RhWRKY14，结合荧光定量RTFQ-PCR技术，从而获得抗蚜标记基因在接种的不同资源叶片中的相对表达量这一数字，最终依据相对表达量这一数字的范围大小来划分各个月季种质资源的抗蚜等级。

3.鉴定时间短，从蚜虫接种叶片材料到完成抗蚜鉴定工作仅需要1d时间，而传统方法则需要3d以上。传统鉴定方法是接种后，每天需要人工对寄主材料上的蚜虫数量进行记录并统计，一方面费时费力，另一方面容易产生统计误差。

综上所述，本发明提供的这套适用于我国各地区进行抗蚜月季种质资源鉴定和筛选的方法及其专用引物，使在国内进行大量的月季杂交后代抗蚜准确快速的鉴定筛选工作成为可能；本发明方法各步骤的协同作用，使得抗蚜月季种质资源的鉴定筛选周期缩短至1天，鉴定材料用量少(仅用3～5片完全叶)，实用范围广、操作简便，占用空间小，鉴定准确、筛选快速。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是RhWRKY14上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是RhWRKY14下游引物的核苷酸序列.

序列表中SEQ ID NO：3所示的是内参通用引物UBC上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是内参通用引物UBC下游引物的核苷酸序列。

具体实施方式

以下实施例无特殊说明的为常规方法。实施例中所涉及的试剂、试剂盒、蔷薇长管蚜、45份月季种质资源等所有材料均可从商业渠道购买。

实施例1我国各地收集的45份月季种质资源对蔷薇长管蚜的抗蚜鉴定

(1)接种材料的准备：分别采集待鉴定的45份月季种质资源材料(见表1)上无病虫害的叶片，选取当年新抽的月季枝条从顶端开始数起，第3～4层的无病虫害的成熟完全叶片，用70％v/v乙醇和无菌水清洗，其清洗过程如下：将采集的叶片用70％v/v乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次，将清洗的叶片正面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L。

(2)接种试验：选取实验室培养的蔷薇长管蚜成虫，作为待接种蚜虫，并将待接蚜虫饥饿处理4h，所述饥饿处理是不进食和水；而后用已灭菌的湿润毛笔轻柔地将蚜虫接种到待接种的叶片上，每份材料接种3株，每个处理3次重复，每份材料的叶片接种蚜虫5头，同时，保留相应一份相同处理但不接种蚜虫的叶片作为对照。接种完成后，将培养皿在室内光强1800-3200lx、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，室内空气相对湿度80～90％、室温20-25℃的条件下培养1d；每个培养皿设置3～5个重复。蔷薇长管蚜的诊断可参考文献(姜立云,乔格侠,张广学,等.东北农林蚜虫志:昆虫纲、半翅目、蚜虫类[M].北京:科学出版社,2011:1-14)中的诊断方法，对蚜虫进行诊断。

(3)荧光定量RTFQ-PCR试验：委托上海捷瑞生物科技有限公司合成本发明提供的抗蔷薇长管蚜标记基因专用引物RhWRKY14和内参通用引物UBC以备用。抗蔷薇长管蚜标记基因是RhWRKY14(R.hybrida probable WRKY transcription factor 40 LocusChromosome 2)，在GenBank上有全基因序列，登录号XM_024326791.2。内参基因是UBC(ubiquitin conjugating protein)，在GenBank上有全基因序列，登录号JN399227。专用引物RhWRKY14由SEQ ID NO：1所示的RhWRKY14上游引物和SEQ ID NO：2所示的RhWRKY14下游引物组成。内参通用引物UBC由SEQ ID NO：3所示的内参通用引物UBC上游引物和SEQ IDNO：4所示的是内参通用引物UBC下游引物组成。

将上述对照叶片样本和接种培养1d后去除蔷薇长管蚜成虫后的叶片样本，按照北京TransGen Biotech公司生产的RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒的说明书进行试验操作，将所有对照叶片样本和所述的接种叶片样本的cDNA一一合成好后，按照北京TransGenBiotech公司生产的荧光定量RTFQ-PCR试剂盒说明书的步骤，对对照和接种的材料进行抗蚜标记基因相对表达量的测定。荧光定量RTFQ-PCR反应体系20μl，其中，ddH₂O 6μl，荧光定量混合试剂10μl，上游引物(0.25nM)1μl，下游引物(0.25nM)1μl，接种或对照材料cDNA 2μl。反应程序：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火15s，+Plate Read(荧光信号的采集)，共45个循环。内参基因的荧光定量RTFQ-PCR反应体系(同上)，反应程序(同上)，测定结果采用SAS V9.0软件进行ANOVA分析抗蚜标记基因相对表达量的测定数据，最终数据采用相对表达量平均值±标准误差方式进行记录。

(4)抗蚜等级的鉴定：依据所述抗蚜标记基因在不同待鉴定资源叶片中的相对表达量来划分抗蚜等级，分为4个等级：0级：免疫，相对表达量≧20；1级：高抗，相对表达量≧15，且<20；2级：中抗，相对表达量≧10，且<15；3级：低抗，相对表达量≧5，且<10；当相对表达量<5时，表明该种质资源为易感蚜虫，不属于抗蚜类资源。结果详见表1。

表1 45份月季种质资源对蔷薇长管蚜的抗蚜鉴定结果

注：“--”：表示该种质资源为易感蚜虫，不属于抗蚜类资源。

序列表

<110> 云南省农业科学院花卉研究所

<120> 一种快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagaaccca gagaaggagc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaacttttt ggccatat 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccagagatt gcccatatgt a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacagagtc ctagcagcac a 21

Claims (1)

1.一种利用荧光定量RTFQ-PCR技术快速筛选抗蔷薇长管蚜月季种质资源的方法，其特征在于，用专用引物RhWRKY14对对照月季种质资源材料叶片和接种蔷薇长管蚜成虫的月季种质资源材料培养1 d后去除蔷薇长管蚜成虫后的叶片样本进行抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量的测定，按抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量划分的抗蔷薇长管蚜等级鉴定月季种质资源对蔷薇长管蚜的抗性级别；

所述专用引物RhWRKY14由RhWRKY14上游引物和RhWRKY14下游引物组成，所述RhWRKY14上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，RhWRKY14下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；

所述抗蔷薇长管蚜标记基因相对表达量划分的抗蔷薇长管蚜等级为如下4个等级：

0级：免疫，相对表达量≧20；

1级：高抗，相对表达量≧15，且< 20；

2级：中抗，相对表达量≧10，且< 15；

3级：低抗，相对表达量≧5，且< 10；

所述接种为：将待鉴定的月季种质资源材料的叶片用70%v/v乙醇处理1min，然后用无菌水清洗3～5次作为待接种的叶片；将蔷薇长管蚜成虫饥饿处理4 h，而后用已灭菌的湿润毛笔将蔷薇长管蚜成虫接种到待接种的叶片上。