CN103387994A - ‘湖北海棠’MhWRKY40a 基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了‘湖北海棠’MhWRKY40a基因及其应用。‘湖北海棠’MhWRKY40a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。所述的MhWRKY40a基因在创制耐盐和抗低温新种质和/或植物品种改良中的应用。本发明首次从‘湖北海棠’克隆得到了一个新的MhWRKY40a基因，该基因序列与拟南芥、葡萄及大麦之间的同源性为50.89%。但MhWRKY40a基因蛋白三级结构与模式植物拟南芥上的同源基因明显不同，前者具5个β折叠而后者具4个β折叠。MhWRKY40a转基因烟草具有较强的耐盐和抵御低温胁迫的能力，并提高了抗性相关基因的表达，说明MhWRKY40a基因具有提高植物耐盐和抗寒的功能。

Description

‘湖北海棠’MhWRKY40a 基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及‘湖北海棠’MhWRKY40a基因及其应用。

背景技术

湖北海棠（Malus hupehensis Rehd.）为蔷薇科梨亚科苹果属多年生落叶小乔木，具有分布广、适应性强的特点，是我国常用的苹果砧木。主要分布于我国湖南、湖北、四川、云南、贵州、甘肃、陕西、河南、河北、山东、山西、安徽、江苏、浙江、江西、福建、广东。从分类分布的角度看，湖北海棠也是我国特有的苹果属植物资源。此外，湖北海棠在抗病、抗旱、抗涝、无融合生殖方面具有重要的研究价值。挖掘湖北海棠抗性基因资源对于形成我为具有自主知识产权的基因库具有重要的意义。

苹果属植物种类繁多，其中不乏一些优良的抗性育种资源，育种工作者在多花海棠（Malusfloribunda）找到了抗黑星病基因Vf，并成功培育抗黑星病和白粉病苹果品种普利玛Prima（Patocchi et al.1999;束怀瑞1999）。20世纪60年代，在八棱海棠（Malus robusta）和珠眉海棠（Malus zumi）发现了对苹果白粉病具有高度抗性的基因Pl1和Pl2（Knight and Alston1968;束怀瑞1999），但直到目前为此还没有Pl₁和Pl₂具体序列信息的报道。通过对近缘的种的抗性基因的挖掘，以常规的杂交育种手段培育抗性强的优良品种仍然是当前乃至今后相当长一段时间培育苹果新品种的安全有效的方法。美洲粟（Castanea dentata）杂交育种是果树上抗性育种资源成功应用的典范，美洲粟（Castanea dentata）曾经因粟疫病而濒于灭绝，而中国板粟（Castanea mollissima）抗粟疫菌（Cryphonectria parasitica），通过两者杂交育种培育的抗粟疫病品种挽救了美洲粟。目前，通过转基因方法获得的某些方面抗性（如抗虫、抗除草剂等）的农作物品种使得其生产成本大大地降低，其产品在价格方面也有了明显的竞争优势并占据了较大的市场份额，国外转基因大豆和玉米严重挤压国内相应行业的生存空间，甚至威胁到了我国的粮油安全问题。在果树上，转番木瓜环斑病毒(PRSV)外壳蛋白基因的抗病番木瓜品种已经进行商业化生产10余年时间，也是最早进入商品化应用的多年生转基因果树品种(Fermin et al.2011;Fitch et al.1992;Ling et al.1991;Tripathi et al.2007;Tripathi et al.2008)。我国具有丰富的抗性强的育种资源，加强对我国的抗性基因资源的开发应用是一项长远而有意义的工作。

发明内容

本发明的目的是提供一个新的‘湖北海棠’MhWRKY40a基因。

本发明的另一目的是提供该MhWRKY40a基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

‘湖北海棠’MhWRKY40a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

含有所述的MhWRKY40a基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的MhWRKY40a基因插入到表达载体pYH4215的BamHⅠ及SacⅠ切酶的切位点之间所得。

含有所述的MhWRKY40a基因的宿主细胞。

所述的宿主细胞优选农杆菌。

本发明所述的MhWRKY40a基因在创制耐盐耐及低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

所述的含有MhWRKY40a基因的重组表达载体在创制耐盐及耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

有益效果

本发明首次从‘湖北海棠’克隆得到了一个新的MhWRKY40a基因，通过DNAMAN软件将‘湖北海棠’MhWRKY40a氨基酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，序列比对分析表明其与拟南芥AtWRKY40、葡萄VvWRKY4及大麦WRKY基因1、2、3之间的同源性为50.89%，推导的氨基酸序列N端具有LZ和WRKYGQK的保守结构域，C端具Cx_4–5Cx_22–23HxH保守结构域。MhWRKY40a基因蛋白三级结构与拟南芥AtWRKY40的明显不同，前者具5个β折叠而后者具4个β折叠。说明本发明MhWRKY40a基因与现有基因有显著的不同。

转MhWRKY40a基因烟草提高了种子在盐胁迫下的发芽率、极显著改善了种苗根系的生长、增加了植株的生物量积累，基因表达分析显示，转MhWRKY40a基因提高了烟草SOS1、SOS2、SOS3基础表达量；冷胁迫中，转基因烟草冻害死亡率极显著低于野生型烟草，基因表达分析显示，转MhWRKY40a基因提高了烟草RCI2A和DREB2A在各个处理时间点的表达量。MhWRKY40a基因调控抗性相关基因来提高了植株的耐盐性和抗寒性。

附图说明

图1克隆载体PMT19‐T和表达载体pYH4215中MhWRKY40a基因酶切检测

其中，M为marker。

图2转MhWRKY40a基因烟草GUS检测

其中，WT为非转基因对照植株，即野生型（wild‐type）植株。

图3转MhWRKY40a基因烟草PCR检测（A）及目的基因RT‐PCR检测（B）

其中，WT为非转基因对照植株，H₂O为空白对照水，3、6、16……36分别表示6‐3、6‐6、6‐16……6‐36转基因株系，M为marker。

图4转基因烟草种子在不同含盐（NaCl）量的培养基上的发芽率，

A图为转基因烟草种子在含0mM NaCl的培养基上的发芽率，B图为转基因烟草种子在含100mM NaCl的培养基上的发芽率，C图为转基因烟草种子在含150mM NaCl的培养基上的发芽率，D图为转基因烟草种子在含200mM NaCl的培养基上的发芽率。

图5转基因烟草幼苗在不同含盐量的培养基上的生长情况

图6耐盐相关基因在的表达情况

图7烟草冻害处理（‐12℃）的表型（A）及存活率（B）

图8抗寒处理（4℃）相关基因RCI2A（A图）和DREB2A（B图）的表达情况

具体实施方式

实施例1基因克隆

采用CTAB法提取湖北海棠叶片RNA，再将RNA反转录成cDNA，采用RT‐PCR方法从叶片的cDNA模板中克隆目的基因。PCR反应体系为模板cDNA1μL（50ng·μL^‐1），10×PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL（25mmol·L^‐1），dNTP2.0μL（2.5mmol·L^‐1），上游引物F1（SEQ ID NO.2）、下游引物R1（SEQ ID NO.3）各1.0μL（100ng·μL^‐1），1.0U rTaq酶，用超纯水补足至25μL。PCR程序为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。取20μL的PCR产物，在1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段连接pMD19-TSimple（TaKaRa）载体后，转化到DH5α大肠杆菌，随机挑取5个以上单菌落进行测序，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。经测序后在BioXM2.2软件上进行分析，预测其编码区和编码的蛋白，并在NCBI进行Blast比对分析。序列比对分析表明其与拟南芥AtWRKY40、葡萄VvWRKY4及大麦WRKY基因1、2、3之间的同源性为50.89%，推导的氨基酸序列N端具有LZ和WRKYGQK的保守结构域，C端具Cx_4–5Cx_22–23HxH保守结构域。MhWRKY40a基因蛋白三级结构与拟南芥AtWRKY40的明显不同，前者具5个β折叠而后者具4个β折叠。将获得的新基因命名为MhWRKY40a。

实施例2载体构建

在酶切位点分析基上，在原基因克隆引物的5′端引入BamHⅠ及SacⅠ酶切位点，设计成带酶切位点的引物（下划线部分序列），即上游引物K‐MhWRKY40a F（SEQ ID NO.4）、下游引物K‐MhWRKY40a R（SEQ ID NO.5）。以实施例1中测序正确的返还质粒为模板，PCR扩增出带酶切位点的基因片段。反应体系如下：

PCR程序为94℃4min；94℃120s，65℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。全部PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段并连接PMD19‐T Simple上，连接产物转化DH5α大肠杆菌，随机挑取5个以上单菌落进行测序。回收片段连接体系如下：

载体准备（大片段）：取pYH4215载体（罗昌国南京农业大学博士学位论文湖北海棠WRKY转录因子基因克隆与功能分析2013，06）质粒转化DH5α大肠杆菌，经过含Km⁺抗生素（pYH4215为Km⁺抗性）的平板培养筛选单克隆进行放大培养，提取质粒酶切检测正确后使用。

pYH4215载体双酶切体系（准备2～5管）如下：

酶切在恒温水浴锅中进行，30℃反应3h。产物于0.8%的琼脂糖凝胶上检测，割胶回收大片段，短时间存放可置于4℃或冰冻或‐20℃保存，长时间存放置于‐70℃保存。

目的基因片段（小片段）准备：将经测序正确并引物酶切位点的MhWRKY40基因克隆菌液放大培养或直接提取质粒。因基因片段内含有一个BamH I酶切位点，在没有进行点突变的情况下采用不对称双酶切反应体，如下：

酶切在恒温水浴锅中进行，30℃反应1h。小片段回收、保存等方法同大片段。

将备好的大片段和小片段按下列体系4℃过夜连接反应：

连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆放大培养，并菌液PCR鉴定。阳性克隆菌液提取质粒，再进行PCR和酶切鉴定，酶切鉴定图见图1。经鉴定正确的质粒用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，鉴定阳性克隆，具体方法如下：

（1）取1～3μl质粒加入到冰上融化的农杆菌EHA105感受态细胞中，用移液枪轻打混匀，冰上静置30min后放入液氮中5min。

（2）37℃恒温水浴锅温浴120～180s后，立即冰上静置2～3min。

（3）加入800μL无抗生素的YEB液体培养基（无菌条件下，超净工作台进行），28℃，180rpm活化培养3h。

（4）6000rpm离心60s，弃除菌液保留沉淀，加入100μL含有50ug·mL^‐1Rif、50ug·mL^‐1Km的液体YEB，移液枪打匀，均匀涂到附加50ug·mL^‐1Rif、50ug·mL^‐1Km的YEB平板上（无菌条件下，超净工作台进行），28℃倒置暗培养2～3d。

（5）挑取单菌落，转入含有50ug·mL^‐1Rif、50ug·mL^‐1Km的YEB液体培养基中（无菌条件下，超净工作台进行），28℃、250rpm振荡培养～24h。

（6）菌液PCR鉴定阳性克隆，提取质粒酶切鉴定。

（7）鉴定正确的菌落用于转化烟草。

实施例3MhWRKY40a基因转化烟草及检测

转化过程要求无杂菌污染，超净工作台进行。接种转化的农杆菌EHA105单菌落在含50ug·mL^‐1Rif、50ug·mL^‐1Km的YEB液体培养基中28℃、250rpm振荡培养至OD600约0.5～1.0，分装于50mL的离心中，每管装40mL，5000rpm离心10min，弃除菌液，沉淀（菌体）用40mlMS液体培养基重新悬浮，28℃、250rpm振荡活化1h；将烟草叶片剪成1～2cm²的叶块（叶缘亦需剪除，使边缘均形成伤口），放入活化的农杆菌液中，浸泡3～5min，其间轻摇几次；取出材料，放在无菌滤纸上吸去多余菌液，接种于共培养培养基（MS+BA1.0mg·L^‐1+NAA0.2mg·L^‐1，pH5.8）中，25～28℃弱光或黑暗条件下共培养2～3d。

共培养结束后，将烟草叶片转入筛选培养基（MS+BA1.0mg·L^‐1+NAA0.2mg·L^‐1+hyg30mg·L^‐1+cb500mg·L^‐1，pH5.8）中，直接置于25℃下光照培养，每天光照16h，光照强度为40～50μmol·m^‐2·s^‐1，20d更换一次培养基（主要防止农杆菌过度繁殖），直至分化出直径2cm左右愈伤组织。将愈伤组织切成小块接种于多瓶筛选培养基中，诱导抗性芽生长。

剪下3～5cm长的抗性芽，转入生根培养基（1/2MS+IBA0.2mg·L^‐1+hyg30mg·L^‐1+cb200mg·L^‐1，pH5.8）中诱导生根，每瓶接1～3个左右抗性芽。抗生芽生根并长高至8～15cm时，对各个植株进行标识、记录，并进行GUS染色、PCR、RT‐PCR鉴定，阳性植株剪下带茎尖茎段再次接到生根培养基中进行壮苗培养。待植株生根良好、生长健壮后（根系长达瓶底边缘、茎粗壮、叶大而浓绿）打开瓶盖练苗3～5d,从瓶中取出转基因苗并尽量去除根系上的培养基后移栽至营养钵中，保持较高的湿度10～20d，成活后可在10～35℃的自然条件下培养。

转基因烟草GUS检测：从抗性植株和阴性对照的顶端幼叶上剪取约0.5cm²的叶块，放入装有30～50μL GUS染色液的250μL离心管中，37℃培养箱中进行GUS组织染色，6～10h后取出叶片，用80％的乙醇脱色，拍照记录，结果见图2，转基因株系叶块边缘被染成蓝色，野生型不能被染成蓝色。

转基因烟草PCR检测：提取GUS染色阳性烟草植株的DNA，用hyg引物（hyg F:GCATAACAGCGGTCATTG（SEQ ID NO.20）；hyg R:TACTTCTACACAGCCATCG（SEQ ID NO.21））进行PCR检测，结果见图3A，可见MhWRKY40a基因已经成功转化至烟草中。

转基因烟草RT‐PCR检测：提取PCR检测阳性烟草植株的RNA，采用DNase I去除RNA中痕量的DNA，然后将其反转录成cDNA，用上节的构建载体时的引物进行RT‐PCR检测，结果见图3B，可见MhWRKY40a基因已经成功转化至烟草中。

实施例4转MhWRKY40a基因烟草耐盐性和抗寒性分析

表1转基因烟草基因表达分析引物

种子消毒处理后分别播于NaCl浓度为0、100、150、200mol·L^‐1的无糖MS培养基中，在温度为25±2℃、光照1200lux（40～50μmol·m^-2·s^-1）、每天光照16h条件下培养。无NaCl的培养基种子发芽快、发芽率高，5～7d基本完成发芽，转基因烟草和野生型烟草发芽率95%左右；添加100μmol·L^‐1NaCl后，种子发芽延迟至9～11d，转基因烟草发芽率下降至92%～93%、野生型的为90%左右；7d后转基因烟草和野生型发芽率约有3%～5%的差距。当NaCl浓度增高至150和200μmol·L^‐1时，7d后的转基因烟草和野生型烟草发芽率差距比较明显，相差约15%～40%（图4）。

转基因烟草和野生型烟草在不含盐的培养基中生长都比较一致，随着盐浓度的增高，烟草种苗生长开始受到影响，并且转基因和野生型烟草生长差异开始表现出来，体现在根系长度、根系的数量、叶片数量和植株生物量4个方面，转基因明显较野生型烟草耐盐，在盐胁迫下较野生型烟草生长良好（图5）。

移栽成活的幼苗用200mol·L^‐1NaCL浇施处理60d，以水浇施处理为对照，采取叶样作为荧光定量PCR分析用。在长期的盐胁迫下，SOS1和SOS2都上调表达，但转基因烟草的SOS1和SOS2上调幅度不及野生型烟草高；而无盐胁迫条件下，转基因烟草的SOS1和SOS2的表达量较野生型的高。SOS3在盐处理中表达量没有较大变化，但在无盐胁迫的情况下，转基因烟草较野生型的高。盐处理与无盐处理之间以及转基因与野生型之间NHX表达变化不明显（图6）。

将正常生长的种植60d的盆栽烟草苗置于-5℃环境中12h，然后恢复正常的培养，调查冻害后的死亡率。‐5℃处理烟草植株12h再恢复到正常培养，植株冻害后存活率调查结果显示，野生型烟草存活率只有36%，而转基因的为72%～85%，转基因烟草极显著提高了植株的抗寒性（图7）。

将正常光照、温度条件下生长的盆栽植株置于4℃低温光照培养箱中，分别于处理后0、6、12、24h采取叶样作为荧光定量PCR分析用。进一步对野生型和转基因烟草抗寒相关基因RCI2A和DREB2A在4℃低温胁迫下的表达分析结果表明，RCI2A则在24h内呈持续上调表达的趋势；DREB2A在处后6～24h均上调表达至较高的表达水水平。而野生型和转基因烟草比较，RCI2A和DREB2A在转基因烟草表达量高，而在非转基因烟草中表达量低（图8）。

Claims (7)

1.‘湖北海棠’MhWRKY40a基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

2.含有权利要求1所述的MhWRKY40a基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将权利要求1所述的MhWRKY40a基因基因插入到表达载体pYH4215的BamHⅠ及SacⅠ切酶的切位点之间所得。

4.含有权利要求1所述的MhWRKY40a基因的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的含有MhWRKY40a基因的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为农杆菌。

6.权利要求1所述的MhWRKY40a基因在创制耐盐及低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

7.权利要求2所述的含有MhWRKY40a基因的重组表达载体在创制耐盐及低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

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