CN113584024B - 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用 - Google Patents

小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113584024B
CN113584024B CN202110797328.0A CN202110797328A CN113584024B CN 113584024 B CN113584024 B CN 113584024B CN 202110797328 A CN202110797328 A CN 202110797328A CN 113584024 B CN113584024 B CN 113584024B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir175
gene
sequence
iron
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110797328.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113584024A (zh
Inventor
渠慎春
陈京瑞
余心怡
曹丽芳
王三红
徐孙霞
侯应军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202110797328.0A priority Critical patent/CN113584024B/zh
Publication of CN113584024A publication Critical patent/CN113584024A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113584024B publication Critical patent/CN113584024B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及‘小金海棠’Mx‑miR175‑5p基因及其应用。‘小金海棠’Mx‑miR175‑5p，其前体序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次从‘小金海棠’鉴定到一个新的Mx‑miR175‑5p基因，RLM‑5’RACE验证其靶基因是BTB4蛋白；通过转基因技术，发现过表达Mx‑miR175‑5p能够提高苹果愈伤组织的铁III还原酶活性及铁吸收和转运相关基因的表达，说明其能够调节苹果对铁的吸收和转运能力，提升对缺铁胁迫的耐受性。因此，可利用其培育出具有高抗缺铁能力的转基因苹果。

Description

小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及‘小金海棠’Mx-miR175-5p基因及其应用。
背景技术
铁是植物生长发育必须的金属元素，在光合作用或呼吸作用等代谢过程中起着至关重要的作用。植物在碱性或钙质土壤生长，因铁的有效性和利用性低，往往出现缺铁黄化现象，并影响植物生长甚至死亡。
miRNA(microRNA)是一类来自真核生物、长度为18～24nt的内源性非编码小分子RNA，由具有发卡结构的单链RNA前体剪切形成。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，在转录后水平引起mRNA的降解或抑制其翻译，在植物基因表达调控中发挥重要功能。BTB/POZ蛋白(BTB/POZ and TAZ domain-containing protein)对植物生长和发育的整个过程都起着非常重要的作用，如植物向光性生长、抗逆性、蛋白泛素化、降解过程、细胞骨架构成、离子通道以及细胞循环调控。BTB-TAZ蛋白是BTB/POZ蛋白的一个亚家族，该亚家族蛋白仅存在于植物中。在拟南芥中，BTB-TAZ亚家族蛋白有5个成员，它们含有保守的三个结构域，拟南芥AtBTs蛋白主要定位于细胞质和细胞核中，或有时仅在细胞质中，能够与Cul3蛋白互作，形成CRL3泛素连接酶复合体，调控生长发育和逆境响应。在苹果中关于microRNA调控铁的吸收和稳态还未见报道，本发明提供了一个小金海棠‘Mx-miR175-5p’基因及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一个新的‘小金海棠Mx-miR175-5p’基因。
本发明的又一目的是提供小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列。
本发明的又一目的是提供小金海棠Mx-miR175-5p抑制靶基因表达以研究靶基因功能的应用。
本发明的又一目的是提供小金海棠Mx-miR175-5p抑制靶基因表达以提高苹果耐缺铁性，培育耐缺铁苹果品种的应用。
为解决上述技术问题，本发明的目的通过如下技术方案实现：
小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
Mx-miR175-5p前体序列的二级结构如图1所示。
上述小金海棠Mx-miR175-5p的成熟序列如序列表SEQ ID NO.3所示，Mx-miR175-5p的成熟序列是前体序列自5’端1bp-21bp的一段RNA序列。
编码上述小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列的DNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
过表达编码上述小金海棠Mx-miR175-5p的基因的表达载体。
作为本发明的一种优选，所述的表达载体，是将所述的编码上述小金海棠Mx-miR175-5p的基因插入pCAMBIA2300表达载体SalI和XbaI限制性酶切位点所得。
上述小金海棠Mx-miR175-5p基因功能及其应用，Mx-miR175-5p抑制靶基因BTB4(BTB-TAZ蛋白4)的表达，所述的BTB4基因序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
上述的小金海棠Mx-miR175-5p基因在培育抗缺铁转基因植物中的应用。
上述转基因植物为苹果。
在苹果中过表达SEQ ID NO.1所述miRNA，培育出具有抗缺铁能力的转基因苹果。
采用上述技术方案所产生的技术效果在于：本发明提供了一种小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用。利用MiRNA高通量测序获得一个新的基因，即Mx-miR175-5P，并在小金海棠中特异性存在，受缺铁胁迫的诱导。RLM-5’RACE检测结果表明，Mx-miR175-5p靶向BTB-TAZ蛋白4基因，可用于研究BTB-TAZ蛋白4的基因功能。荧光定量PCR检测结果表明，Mx-miR175-5p的表达受缺铁胁迫调控，说明其在苹果适应缺铁胁迫中起着重要作用。通过转基因技术，发现过表达Mx-miR175-5p能够提高苹果愈伤组织的铁Ⅲ还原酶、铁吸收及转运相关基因的表达，说明其能够调节苹果对铁的吸收和转运能力，提升对缺铁胁迫的耐受性。因此，可利用其培育出具有高抗缺铁能力的转基因苹果，对苹果抗逆遗传育种和苹果产业具有重要参考价值。
附图说明
图1是本发明小金海棠Mx-miR175-5p的前体的二级结构图。
图2是miRNA测序分析图
图A是差异表达miRNA的VENN图，图B为小金海棠缺铁下特异miRNA表达量聚类热图。
图3小金海棠Mx-miR175-5p前体DNA序列在蔷薇科基因组数据库中的染色体定位图。
图4Mx-miR175-5p成熟体切割靶基因BTB4基因的作用位点。图A是5’RLM-RACE PCR产物的凝胶电泳分析，图B是切割位点图(箭头所致处，在10～11位点裂解)。
图5Mx-miR175-5p前体和成熟体及靶基因BTB4在缺铁胁迫下的表达模式图。图A是MxBTB4和Mx-miR175-5p前体的半定量凝胶电泳分析图，图B是Mx-miR175-5p前体、MxMIR175、MxBTB4在缺铁胁迫下的表达模式图。
图6转基因‘王林’苹果愈伤表型鉴定图。其中WT：非转基因愈伤组织；空载为不含Mx-miR175-5p基因的pCAMBIA2300转基因愈伤；OE为过表达Mx-miR175-5p的转基因苹果愈伤。
图7是三种愈伤组织在正常加铁和缺铁调节下的铁还原酶定性和定量分析。其中上柱状图为铁还原酶活性定量图，下面图片为铁还原酶活性定性图，WT、空载，OE含义同图6。
图8是铁吸收和转运相关基因bHLH104、FIT、IRT1、FRO2的表达量，WT、空载，OE含义同图6。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对具体实施方式进行详细说明。本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为避免因不必要的细节而模糊了本发明，以下实施范例仅仅展示了与根据本发明的方案密切相关的结构和处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本发明所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得；所有定量试验均设置三次生物重复和三次技术重复试验，结果取平均值。
实例1：Mx-miR175-5p和靶基因的确认
小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列如下：
GGGGAGCAAAGACGACGAUUACAGCACCGGAUGGAGUCGGAACUAAGAACCUCCGGCUACCACUCUCCUGACAGAUCCGUGCUGCGCAACCGUUGCUGCAAUCGUCGUCUUGGCUGUCCAC(SEQ ID NO.1)
小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列二级结构如图1所示，二级结构式为：自5’端3bp-5bp和115-117bp形成环状，自5’端7-9bp和111-113bp形成环状，自5’端20-22bp和97-99bp形成环状，自5’端26-28bp和91-93bp形成环状；自5’端30-32bp、62-64bp、75-80和88-90形成环状，自5’端34-35bp和58-60bp形成环状，自5’端41-52bp形成环状，自5’端66-73bp形成环状，自5’端82-86bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构,。
编码上述小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列的DNA序列为：
GGGGAGCAAAGACGACGATTACAGCACCGGATGGAGTCGGAACTAAGAACCTCCGGCTACCACTCTCCTGACAGATCCGTGCTGCGCAACCGTTGCTGCAATCGTCGTCTTGGCTGTCCAC(SEQ ID NO.2)
上述小金海棠Mx-miR175-5p的成熟序列如下：
GGGGAGCAAAGACGACGAUUA(SEQ ID NO.3)，Mx-miR175-5p的成熟序列是前体序列自5’端1bp-21bp的一段RNA序列。
上述小金海棠Mx-miR175-5p的前体序列在植物生产中的应用，Mx-miR175-5p抑制靶基因BTB-TAZ蛋白4的表达，所述的BTB-TAZ蛋白4基因序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
实施例2：Mx-miR175-5p的制备
1、苹果材料的处理
选取长势一致的苹果砧木山定子(M.baccata)和小金海棠(M.xiaojinensis)生根苗，将其转移到半量Hoagland’s营养液中炼苗两周，然后用完全Hoagland’s营养液培养，每周更换一次，培养条件为光照16h，光量子通量密度umol·s-1，黑暗8h，温度22～25℃。在全营养液培养至其长出8～10片叶片后，以正常供铁(+Fe,EDTA-FeNa,50μM)为对照，进行缺铁(-Fe,EDTA-FeNa,0μM)胁迫处理，取两处理的白色新根和幼叶，经液氮速冻后放置-80℃冰箱备用。
2、样品总RNA的提取与检测
植物总RNA的提取使用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)试剂盒，略有修改。
(1)匀浆处理：将采集的50-100mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL裂解液SL，立即漩涡剧烈震荡混匀。
(2)将上述样品12000rpm(～13400×g)离心2min。
(3)将上清转移志过滤柱CS上，12000rpm(～13400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
(4)缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm(～13400×g)离心15sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(5)将吸附柱CR3中的加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm(～13400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(6)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，12000rpm(～13400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(7)重复步骤(6)
(8)12000rpm(～13400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O,室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心1min，得到RNA溶液。
(9)RNA样品的检测：琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2％；1×TEB电泳缓冲液；150V，15min)检测完整性；用紫外分光光度计分别在26nm、280nm波长下检测提取RNA吸光值，并计算产率，OD260/OD280比值测量RNA的纯度和浓度。
3、miRNA文库的构建及测序
提取的总RNA经检测合格后，经以下步骤构建miRNA文库及测序：
(1)RNA片段选择:将Total RNA使用PAGE电泳切胶纯化分离18-30nt的RNA。
(2)3’接头连接:使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到(1)中RNA的3’端。
(3)将带有UMI的RT引物加入体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。
(4)5’接头连接:5’接头连接至(3)中产物的5’端。
(5)一链cDNA合成:以带UMI的RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。
(6)PCR扩增:使用高敏聚合酶对同时连接有3’接头和5’接头的cDNA进行扩增，放大产量。
(7)文库片段选择:使用PAGE电泳分离110-130bp范围PCR产物。
(8)文库定量及pooling环化。
(9)对构建的文库进行质量检测。
(10)将质量检测合格的文库上机测序。
4、测序数据分析和miRNA筛选
测序所得49nt序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到可信的备用分析的目标序列，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。
小RNA测得rawdata数据中首先会对其进行杂质的过滤和数据的初步判断评估。对于这些定义为过滤掉的序列会通过一系列的处理得到干净的序列(clean tags)。然后统计小RNA(sRNA)的序列种类及序列数量，并对小RNA序列做长度分布统计。一般来说，小RNA的长度区间为18～30nt，而miRNA集中在21或22nt。测序得到的Clean Reads用Bowtie2d比对到苹果基因组序列(GCF_002114115.11，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002114115.1)，基于测序数据在基因组上的位置来预测已知miRNA和其他的非编码RNA。另外，Reads还与非编码RNA、Rfam数据库进行比对，对测序数据进行非编码RNA注释。在以上各注释信息中，有可能存在一个sRNA同时比对上两种不同的注释信息的情况。为了使每个unique sRNA有唯一的注释，按照:MiRbase>pirnabank>snoRNA>Rfam>other sRNA的优先级顺序将sRNA遍历注释。
随后对获得注释的miRNA进行差异表达分析、聚类分析、差异表达miRNA的靶基因预测KEGG注释分类及富集分析、GO注释分类及富集，我们筛选到一个新的miRNA,即miR175-5p，在小金海棠中特异表达，并在缺铁胁迫条件下表达量升高，而在山定子中未检测到，结果见图2。
通过用蔷薇科基因组数据库(Genome Database for Rosaceae，GDR，http://www.rosaceae.org)进行序列查找，Mx-miR175-5p前体序列定位于苹果4号染色体中，而在山定子的基因组数据库中并未定位到，再次证实了miR175-5p在小金海棠中特异存在，结果见图3。
实例3：Mx-miR175-5p的应用
1、miRNA靶基因预测
利用Mx-miR175-5p的成熟体序列和苹果基因组mRNA序列信息，通过psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis)进行靶基因预测。预测的靶基因为BTB-TAZ蛋白4基因。miRNA靶基因预测规则为：
(1)miRNA与靶基因间的错配不得超过4个(G、U配对认为0.5个错配)；
(2)在miRNA/复合体中，从miRNA的5’端起第2-12个位点不得有相邻位点都发生错配；
(3)在miRNA/复合体的第10～11个位点不得发生错配；
(4)在miRNA/复合体中，不得有超过2处发生相邻位点的错配；
(5)在miRNA/复合体的最低自由能(MEF)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MEF的75％。
2、采用RLM-5’RACE验证Mx-miR175-5p对靶基因的切割作用
为验证MxBTB4是否为Mx-miR175-5p的目标基因，使用使用
Figure SMS_1
RLM-RACEkit(Ambion)试剂盒进行5’RLM-RACE试验。
(1)5’RACE Adapter连接
用T4连接酶将5’RACE接头序列连接到总RNA上，反应体系为总RNA2μL,5’RACEAdapter 1μL,10X RNA Ligase Buffer 1μL,T4 RNA Ligase(2.5U/μL)2μL,Nuclease-freeWater 4μL。在冰上配置反应液，短暂离心后，在37℃条件下孵育1h，将反应液储存至-20℃或进行反转录。
(2)反转录
对获得已链接5’端接头的反应液进行反转录，反转录体系为：(1)中反应液2μL，dNTP Mix 4μL，Random Decamers 2μL，10×RT Buffer 2μL,RNase Inhibitor 1μL,M-MLVReverse Transcriptase 1μL,Nuclease-free Water up to 20μL。在冰上配置反应液，混匀后，在42℃条件下孵育1h，将反应液储存至-20℃或进行PCR反应。
(3)巢式PCR反应扩增
通过NCBI/Primmer-Blast设计巢式PCR引物，分析目标基因剪切位点。以上一步反转录的产物作为模板，利用靶基因特异外部引物和接头的外部引物进行Outer 5’RLM-RACEPCR，5’RACE-Outer F和5’RACE-Outer R分别为GCTGATGGCGATGAATGAACACTG和AAACATGACCCAAGAAAAAGTTAC。反应体系为反转录反应液1μL，5’RACE Outer F 1μL，5’RACEOuter R 1μL，dNTP Mix 12.5μL，ddH2O up to 25μL。将所有溶液直接加入管底后轻轻混匀，短暂离心，反应程序：预变性，94℃5min；扩增，94℃30s，60℃30s，72℃30s(35个循环)；延伸，72℃10min。将反应液储存至4℃或进行下一步PCR反应。
以Outer 5’RLM-RACE PCR的产物为底物，进行Inner 5’RLM-RACE PCR扩增，5’RACE-Inner F和5’RACE-Inner R分别为CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG和TCCCGATCAGTTGATATCCCTTT。反应体系为Outer反应液1μL，5’RACE Inner F 1μL，5’RACEInner R 1μL，dNTP Mix 12.5μL，ddH2O up to 25μL。将所有溶液直接加入管底后轻轻混匀，短暂离心，反应程序：预变性，94℃5min；扩增，94℃30s，60℃30s，72℃30s(35个循环)；延伸，72℃10min。将反应液储存至4℃保存。
(4)目的片段与克隆载体的连接
Inner 5’RLM-RACE PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收纯化目的片段，将回收的目的片段连至007Blunt Simple载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至通用安徽通用公司进行测序。测序结果如附图4(箭头所指位置为miRNA降解靶基因的裂解位置)。
结合附图3和附图4的结果说明，Mx-miR175-5p能将BTB4蛋白基因mRNA特异性降解，从而使其表达下调。
3、缺铁胁迫下Mx-miR175-5p的表达量分析
分别将不同缺铁处理的小金海棠根系RNA反转录合成cDNA，使用多糖多酚植物microRNA提取试剂盒(上海浦迪)进行小分子RNA的提取。分别以5.8srRNA、ELONGATIONFACTOR 1α(EF-1α)为内参基因，对pre-miR175-5p、miR175-5p、BTB4进行荧光定量PCR，通过NCBI/Primmer-Blast设计特异性引物。
Figure SMS_2
用SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒检测上述基因在不同缺铁胁迫下的表达模式，反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10μL，上游引物F 0.2μL，下游引物R0.2μL，Rox Dye II 0.4μL，cDNA 1μL，ddH20 up to 20μL；使用QuantStudioTM5 System荧光定量PCR仪，反应程序为：
Figure SMS_3
每个试验均进行三次生物学重复和三次技术重复。检测结果见图5，可以看出随着缺铁胁迫时间的增加，Mx-miR175-5p的前体表达量呈现先升高后下降的趋势，并在12h时达到最高水平；MxMIR175表达量也是呈现先升高后下降的趋势，在24h达到最高水平，与测序的结果一致；而MxBTB4则呈现先下降后升高的趋势，在24小时下降最低水平。以上结果说明，Mx-miR175-5p能够靶向裂解MxBTB4，从而导致其在缺铁胁迫后表达量逐渐下降。
实例4：转Mx-miR175-5p苹果愈伤的应用
为研究Mx-miR175-5P在实际生产中的作用,我们以小金海棠DNA为模板克隆了Mx-miR175-5p前体的基因序列，构建了35S：MxmiR175-5p过表达的载体，并用冻融法转化和培养农杆菌(EH105)。同时，采用农杆菌介导的遗传转化法转化“王林”苹果愈伤组织，获得了过表达的转基因愈伤组织，对缺铁胁迫表现出强力的抗性，为苹果的分子遗传育种有良好借鉴作用。具体方法参考如下：
4.1 Mx-miR175-5p前体的克隆
取“小金海棠”叶片，使用DNAquick Plant System(TIANGEN)试剂盒进行植物基因组DNA的提取，具体步骤见TIANGEN DNAquick Plant System试剂盒说明书。通过NCBI/Primmer-Blast设计特异性引物，以小金海棠基因组DNA为模板，pre-miR175-5p克隆引物如下：pre-miR175-5p F:TGATCAAATTCCGCTCTGGACA(SEQ ID NO.5)，pre-miR175-5p R:GTTGCTTGCTTGCTACCTTAAA(SEQ ID NO.6)。通过PCR克隆pre-miR175-5p，25μL高保真体系如下：5×primer STAR GXL Buffer 5μL，Primer STAR GXL polymerase 0.5μL，dNTPs 2μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，DNA模板1μL，ddH2O up to 25μL。上样液体混匀后，放入PCR仪，反应程序：
Figure SMS_4
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目的片段，将回收的目的片段连至pClone007 Blunt Simple Vector Kit载体，送至南京擎科生物科技公司进行测序。
4.2过表达载体构建
为研究Mx-miR175-5p在实际生产中的作用，我们通过构建了35S：MxmiR175-5p过表达载体。构建方法如下：选择特异性的限制性酶切位点SalI和XbaI，设计特异引物，从克隆载体上扩增带酶切位点的Mx-miR175-5p基因序列，将回收纯化的目的序列通过双酶切体系插入pCAMBIA2300表达载体。最后将构建好的35S-MxmiR175-5p载体进行双酶切和测序验证。设计构建pCAMBIA2300表达载体的特异引物如下：上游引物为5’GTCGACGTCGACTGATCAAATTCCGCTC 3’(SEQ ID NO.7)，下游引物为5’TCTAGATCTAGAGTTGCTTGCTTGCTACCT 3’(SEQ ID NO.8)。
4.3农杆菌转化
(1)取-80℃保存的100μL农杆菌感受态EHA105在手心中融化成冰水混合物，置于冰水浴中，将待转化重组载体35S-MxmiR175-5p和pCAMBIA2300空载，用手拨打混匀，然后依次在冰上静止10min、在液氮中冷却5min、37℃水浴5min、迅速置于冰上冷却5min，接着加入800μL无抗性的LB液体培养基，于28℃，摇床200r/min震荡培养2～3h；
(2)吸取100μL的上述菌液，分别均匀涂布于含卡那霉素的LB固体培养基(50mg/LKana+50mg/L Rif)，于28℃培养2d至长出单一菌落；
(3)分别从各自的培养基上挑取阳性单菌落，加入800μL的含卡那霉素抗性LB液体培养基(50mg/L Kana+50mg/L Rif)，于28℃，摇床200r/min震荡培养过夜至浑浊，以农杆菌菌液为模板，用对应的特异引物进行PCR扩增验证。
4.4农杆菌介导转化苹果愈伤组织
吸取100μL含有目的基因的菌液于50ml含50mg/L Kana+50mg/L Rif的LB液体培养基中，黑暗条件下黑暗条件下28℃、200rpm振荡培养16h，至OD600为0.6，取30ml菌液在高速冷冻离心机(28℃、5000r/min)中离心10min，然后倒掉上清；用30mlMS0液体培养基(加入100μmol/L AS)对离心后的菌体进行重悬浮，并在28℃培养1h左右。在超净工作台里，取出培养18d且长势良好，鲜嫩的‘王林’苹果愈伤组织，分成小块放入侵染液中，摇床20min，用滤纸滤干后放置到共培养的固体培养基(MS+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂糖，pH5.8)，黑暗培养1d。共培养1d后，用无菌水(加入250mg/L头孢噻肟)清洗愈伤组织3次，吸干残留水分后，平铺接种到筛选培养基上(MS+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+50mg/L卡那霉素+250mg/L头孢噻肟，pH 5.8)，暗培养30d，此过程中如果根癌农杆菌生长过多，及时更换培养基。
待长出抗性愈伤组织后，在超净工作台上取转基因愈伤及野生型愈伤，浸入10μLGUS染液中，放置37℃培养箱过夜后，待颜色变化后取出，并将GUS染色液倒出，同时加入75％乙醇进行脱色。对染色结果为蓝色的愈伤提取基因组DNA和总RNA,进行PCR和RT-qPCR检测。
4.5转基因愈伤耐缺铁性分析
将野生型(WT)和转基因愈伤组织分别置于正常加铁(+Fe,EDTA-FeNa，50uM)和缺铁(-Fe,EDTA-FeNa,0uM)培养基中5d，后进行表型、铁还原酶活性(FCR)。如附图所示6，在正常加铁的培养基中生长的WT、空载、OE表型无明显变化，在缺铁条件下，WT和空载的生长则受到了一定的抑制，而过表达愈伤OE受到的抑制程度则小于WT和空载。
铁还原酶活性(FCR)能够反应植物对三价铁还原能力的强弱，测量方法如下。①FCR定性试验：将愈伤组织在0.5mM的CaSO4浸洗5min，后将其置于含有0.5mM FeNa-EDTA、0.5mM Ferrozine、0.5mM CaSO4、0.7％琼脂糖中，黑暗培养1h，变色后用相机拍照；②FCR定量测量：将愈伤组织在0.5mM的CaSO4浸洗5min，然后转移到含有0.5mM FeNa-EDTA、0.5mMFerrozine、0.5mM CaSO4的溶液中，黑暗培养1h,然后用紫外分光光度计在562nm波长下进行吸光值测量，计算铁还原酶活性。结果如附图所示7，从FCR染色和含量统计图可以看出：在正常加铁条件下，OE愈伤组织的铁还原酶活性比WT和空载表现出都高；在缺铁条件下，三种愈伤组织的FCR活性都比其在正常加铁表现出升高，但OE愈伤组织的FCR活性显著高于WT和空载愈伤组织。同时，同时，对铁吸收和转运相关基因bHLH104、FIT、FRO2、IRT1的表达量进行了检测，发现缺铁处理均增加了这几个基因的表达，且OE愈伤组织的IRT1、FRO2的增加量比野生型和空载愈伤组织要高得多，说明过表达Mx-miR175-5p能够增强愈伤组织对铁离子的吸收和转运能力，提高对缺铁胁迫的耐受性。
以上结果可以表明，过表达Mx-miR175-5p在缺铁条件下的生物学功能，能够增强苹果愈伤组织对缺铁的耐性，提高对铁缺乏的抗性。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> ‘小金海棠’Mx-miR175-5p基因及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> RNA
<213> 苹果(Malus pumila Millapple)
<400> 1
ggggagcaaa gacgacgauu acagcaccgg auggagucgg aacuaagaac cuccggcuac 60
cacucuccug acagauccgu gcugcgcaac cguugcugca aucgucgucu uggcugucca 120
c 121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 苹果(Malus pumila Millapple)
<400> 2
ggggagcaaa gacgacgatt acagcaccgg atggagtcgg aactaagaac ctccggctac 60
cactctcctg acagatccgt gctgcgcaac cgttgctgca atcgtcgtct tggctgtcca 120
c 121
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 苹果(Malus pumila Millapple)
<400> 3
ggggagcaaa gacgacgauu a 21
<210> 4
<211> 1749
<212> DNA
<213> 苹果(Malus pumila Millapple)
<400> 4
gcgtacagca ggaccgaaat gcccccatcg aaacggtcac gttttgcctc tctctcacca 60
cctcccctca gccgtccatt tctgcataaa gggagttgaa tgctgcagaa atctcacgcg 120
tcgttcccga agcccctacc ctccctctca acacagaggg agagaaacgc agacatcgtc 180
tttggggaac tgattcttcc actgctctgc tccgctccca aaattccacc ttttcaaaag 240
gaacaggaac ttaggcacca atgtgtaagg tgaaaaacat ccgcgagaga ccagccccag 300
ttaacaagga tgtttcccca acggttcctc catggcctgg tccagtgaca aagggtcttc 360
ataaggggtc atcaaatggt ggatcaccac aaaaggggta cagctgtgtt tctacagcaa 420
caagagattt gtgggatcgt ctctttgatg aaggttataa agcagatgtt tctgttaata 480
ctgatgacgg tggaattatt tatgcccatg ctaacattct tggaatggct tctcctgtaa 540
tcaaaggcca gttgaagcaa tcaaaccggt ttcgtcgtca acgatcaatc tcaattcgtg 600
gagttccagt ggatgcagtt cgggttttta ttcgattctt gtattcttcc tgttacgaga 660
tgaaggaaat ggaggctttt gttgtgcact tgttggtgct tgctcatgta tatgtggttc 720
cccagttgaa gcaagagtgt gagaagaagc tggagcatgg tttgcttact atagataatg 780
tggttgacat ctttcaactg gcactactgt gtgatgcccc tcggcttagc ctcatttgtc 840
accgtatgat cctgaagaac tttaaaactg tttgtacaac tcgaggatgg aaaacaatga 900
agaagagtca cccgacacta gaaaaagaac tcgtggagtc gatgattgaa gaagatacta 960
ggcaaaagga gaggatcaaa aagataaatg agagaaaaat ttatatgctc ttatacgggg 1020
caatggaggc tcttgtgcat atatatgaag atggctgtcg aacaattgga ccatctgata 1080
aggactttaa agagaaccag gcaccttgta agtatgtagc ctgtaaggga ctggaattgc 1140
ttgttcgcca ttttgctggc tgcaagttga gagtcccagg cggttgcatc cattgcaaga 1200
gaatgtggca gctgctggag ttacactccc gcctttgttc tgattcccat aactgcaggg 1260
ttcctttgtg caggaatttt aaggagagaa taaagaagca gagcaagaaa gacgagatta 1320
ggtggaaaat gttagtgaag aagattttga caacaaagag aatcgcagga gcgccattcg 1380
tttcatctgc atttgtcagc actttgtggc agtgaagtcg tcgtctttgt tccccagcac 1440
cggaacacct gatttaaatt ttccaaattt gttgtgatat caatgaaacc agtgttccgt 1500
ttccaaattg gttctacaaa atatgtaaga taatgtttag ctcaagtata catgtgaagg 1560
cattgaactc ctcgttcatg tatttgaggc ccctcacgta caaataaaaa gggataccaa 1620
actgatcggg aaatttttga caaaaaaatt agtggggtca ttccttaata atacatttac 1680
acaacactcg tatttgattg gaaatgtgtg gtttaaattt gtaacttttt cttgggtcat 1740
gtttacttg 1749
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaaaccgc cggaca 16
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttgcttgct tgctacctta aa 22
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgacgtcg actgatcaaa ttccgctc 28
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctagatcta gagttgcttg cttgctacct 30

Claims (9)

1.小金海棠Mx-miR175-5p，其特征在于其前体序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的小金海棠Mx-miR175-5p，其特征在于其成熟体序列如SEQ IDNO.3所示。
3. 编码权利要求1所述的Mx-miR175-5p前体序列的基因，其特征在于DNA序列如SEQID NO.2所示。
4.过表达权利要求3所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于将权利要求3所述的基因插入pCAMBIA2300表达载体SalI和XbaI限制性酶切位点所得。
6.权利要求1所述的小金海棠Mx-miR175-5p、权利要求3所述的基因在调控靶基因BTB/ POZ蛋白4基因的表达中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的BTB/POZ蛋白4基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
8.权利要求3所述的基因在培育耐缺铁苹果品种中的应用。
9.权利要求4所述的表达载体在培育耐缺铁苹果品种中的应用。
CN202110797328.0A 2021-07-14 2021-07-14 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用 Active CN113584024B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110797328.0A CN113584024B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110797328.0A CN113584024B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113584024A CN113584024A (zh) 2021-11-02
CN113584024B true CN113584024B (zh) 2023-05-26

Family

ID=78247395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110797328.0A Active CN113584024B (zh) 2021-07-14 2021-07-14 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113584024B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304526A (zh) * 2011-09-28 2012-01-04 首都师范大学 小金海棠铁调控转运体基因在提高植物铁含量中的用途
CN103387994A (zh) * 2013-07-12 2013-11-13 南京农业大学 ‘湖北海棠’MhWRKY40a 基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304526A (zh) * 2011-09-28 2012-01-04 首都师范大学 小金海棠铁调控转运体基因在提高植物铁含量中的用途
CN103387994A (zh) * 2013-07-12 2013-11-13 南京农业大学 ‘湖北海棠’MhWRKY40a 基因及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Valerio Pompili等.Transcriptional regulation of MdmiR285N microRNA in apple (Malus x domestica) and the heterologous plant system Arabidopsis thaliana.horticulture research.2020,第07卷全文. *
于昌江 ; 孙瑞 ; 王忆 ; 张新忠 ; 韩振海 ; .小金海棠缺铁胁迫相关miR394a的克隆与表达分析.中国农学通报.2012,(第28期),全文. *
渠慎春 ; 王三红 ; 陈卫平 ; 徐长宝 ; 章镇 ; .转番茄铁载体基因(LeIRT2)八棱海棠株系的鉴定.中国农业科学.2007,(第09期),全文. *
渠慎春,张君毅,陶建敏,乔玉山,章镇.转番茄铁载体基因(LeIRT_2)八棱海棠对缺铁胁迫的响应.中国农业科学.2005,(第05期),全文. *
罗昌国 ; 渠慎春 ; 张计育 ; 王三红 ; 乔玉山 ; 张仕杰 ; 刘丹 ; 章镇 ; .湖北海棠MhWRKY40b在几种胁迫下的表达分析.园艺学报.2013,(第01期),全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113584024A (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Characterization and cloning of grape circular RNAs identified the cold resistance-related Vv-circATS1
Liang et al. Identification of nitrogen starvation-responsive microRNAs in Arabidopsis thaliana
Huang et al. A set of miRNAs from Brassica napus in response to sulphate deficiency and cadmium stress
Sunkar et al. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation
Yu et al. Transcriptome analyses of FY mutants reveal its role in mRNA alternative polyadenylation
Zhang et al. Cloning and characterization of miRNAs from maize seedling roots under low phosphorus stress
Hwang et al. Identification of miR172 family members and their putative targets responding to drought stress in Solanum tuberosum
CN110564738B (zh) 甜樱桃PaPME2基因在调控甜樱桃果实成熟或软化中的用途
Tsuzuki et al. Recovery of dicer-like 1-late flowering phenotype by miR172 expressed by the noncanonical DCL4-dependent biogenesis pathway
CN116218876A (zh) 一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用
Wen et al. A Malvaceae-specific miRNA targeting the newly duplicated GaZIP1L to regulate Zn 2+ ion transporter capacity in cotton ovules
Tan et al. RNA-seq and sRNA-seq analysis in lateral buds and leaves of juvenile and adult roses
CN113584024B (zh) 小金海棠Mx-miR175-5p基因及其应用
CN110904101B (zh) miR395基因及其调控位点与应用
CN111778258A (zh) Myb140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株
Tang et al. Integration of small RNA and transcriptome sequencing reveal the roles of miR395 and ATP sulfurylase in developing seeds of chinese Kale
Guo et al. MicroRNAs behave differently to drought stress in drought-tolerant and drought-sensitive grape genotypes
CN107236740B (zh) 梨PbrmiR397a及其应用
CN109207485A (zh) OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用
Wang et al. ARGONAUTE genes in Salvia miltiorrhiza: identification, characterization, and genetic transformation
Li et al. Genome-wide identification and characterization of long non-coding RNA in barley roots in response to Piriformospora indica colonization
CN114958906A (zh) 与烟草低钾胁迫相关的基因、启动子及其应用
Begheldo et al. The dynamic regulation of microRNAs circuits in plant adaptation to abiotic stresses: a survey on molecular, physiological and methodological aspects
Zhou et al. Physiological characteristics and miRNA sequencing of two root zones with contrasting ammonium assimilation patterns in Populus
CN108795942B (zh) 一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant