CN115125324B

CN115125324B - 一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌rna比例的引物及方法

Info

Publication number: CN115125324B
Application number: CN202210711093.3A
Authority: CN
Inventors: 李志刚; 纪晓贝; 赵震; 田野; 缪卫国
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN115125324A

Abstract

本发明公开了一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法。本发明使用两对新的引物(EqP21001、EqP21002)对橡胶树白粉菌不同侵染阶段的cDNA样本进行PCR扩增，并通过ImageJ软件对PCR所得凝胶电泳图进行灰度分析。结果显示，EqP21002引物最适用于评估橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段RNA相对含量，EqP21001次之。相较于转录组测序等方法，本发明通过半定量PCR分析建立了一种简便快捷的评估方法用来检测橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片过程中RNA的比例，为进一步探索橡胶树白粉菌与寄主的互作过程提供便利。

Description

一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法。

背景技术

橡胶树[Hevea brasiliensis(Willd.ex A.Juss.)Muell.Arg.]原产于巴西亚马逊河下游马拉岳以西地带，是大戟科、橡胶树属的一种植物，主要分布区在南北纬10°以内。现在，我国的橡胶树种植区主要在中国台湾、福建南部、广东、广西、海南以及云南等区域，其中海南地区是国家重点种植区域。

橡胶树白粉菌(Erysiphe quercicola)主要侵染叶片正面，同时也侵染叶片背面、嫩枝、嫩梢、花序，极少侵染老叶，是引起橡胶树白粉病的病原真菌，该病菌更易侵染处于古铜期和嫩绿期的叶片，造成叶片蜷缩并落叶，引起减产和生长减缓。橡胶树白粉病是我国橡胶种植区最严重的病害之一，被列为“两病一虫”(橡胶树白粉病、橡胶树炭疽病和叶螨)，是我国橡胶树早春时期防治的重点。

目前，国内外已经有很多关于橡胶树白粉菌生长发育的研究。刘静等人的研究表明，温度在23-28℃之间、pH范围为6-8以及持续的黑暗条件更利于橡胶树白粉菌分生孢子的萌发，而湿度对分生孢子的萌发没有明显的影响。万三连等将橡胶树白粉菌孢子侵染寄主分为5个关键发育阶段，橡胶树白粉菌接种后分生孢子开始萌发，4hpi达到分生孢子萌发高峰；8hpi时分生孢子产生芽管，芽管的顶端细胞逐渐膨大形成附着胞；附着胞产生垂直于寄主的侵入钉，15hpi后侵入钉侵入寄主表皮细胞，末端膨大形成吸器，并获取寄主体内营养；24hpi后寄主表面产生更多的次生菌丝；5dpi产生分生孢子梗。

橡胶树白粉菌是一种活体营养型的专性寄生真菌，只能寄生在活体橡胶树叶片上，目前没有离体培养的方法。由于橡胶树白粉菌的这一特性，在实验室中很难长期保存鲜活的橡胶树白粉菌菌种，这不利于我们对其形态学、生物学以及分子生物学方面的研究，也使我们很难确定该菌的分类地位。而在橡胶树白粉菌的致病机理方面，分子生物学角度的研究也因为白粉菌的寄生特性而遇到重重困难。近些年，基因表达的定量分析广泛应用于白粉菌的研究中，它对揭示白粉菌的致病机理有着重要意义。在研究基因表达水平时，用内参基因来做参照物，内参基因是一种能在细胞中稳定表达的基因，用它做参照物的作用是降低在上样量和上样过程中会出现的实验误差，确保实验结果的准确性。如果使用这种不稳定表达的内参基因，对靶基因表达量分析的结果可能会相差甚远。因此，选择合适的内参基因至关重要，而目前并没有关于橡胶树白粉菌内参基因的相关研究内容发表。

随着高通量技术的发展，新一代测序技术也逐渐被用于转录组分析，利用转录组测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq)技术，我们可以得到细胞或者组织内在某一状态时转录本的序列信息和表达信息，但同时这种方法也存在着步骤繁琐、耗时长和成本高昂等缺点。半定量反转录－聚合酶链反应(半定量PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的测定RNA相对含量的方法，这种方法首先要提取细胞或者组织内在某一状态时的RNA并反转录，通过对反转录样本半定量PCR来推测原细胞或组织的RNA的相对含量。ImageJ是一个基于java的图像处理软件，可以分析图片的灰度值，常被用于表达水平分析，如蛋白质印迹法(Western Blot)和Southern印迹杂交(Southern blot)等技术。半定量PCR结合ImageJ软件灰度分析的方法，可以利用相对灰度值评估样品中特异RNA的相对含量。相较于转录组测序或荧光定量技术，这种方法虽然无法得到转录本的序列信息和准确的表达信息，但是也有快速简捷，成本低廉的优点，在某些定量实验中，是一种更好的选择。目前未见利用半定量PCR结合ImageJ灰度分析的方法评估橡胶树白粉菌不同侵染阶段的RNA相对含量的报道，也未见相关基因及引物的发表。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提出一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法。

本发明主要涉及以下几个方面的内容：

一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物，所述引物为EqP21001或EqP21002；

所述EqP21001的上游引物序列为TGCTCTCGTCATAGCAACGG，下游引物序列为TCATCGCGTCCAGTCTTCAC；

所述EqP21002的上游引物序列为ACATGTAAGCAAAGCGCACC，下游引物序列为AGCGCCGTAATTTTGGCATC。

优选的，所述引物为EqP21002。

优选的，所述白粉菌为橡胶树白粉菌。

本发明还公开一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的方法，包括以下步骤：将白粉菌侵染叶片不同阶段的RNA反转录合成cDNA，使用引物EqP21001或EqP21002对白粉菌侵染叶片不同阶段的cDNA样本进行PCR扩增，获取凝胶电泳图，对图像进行处理得到凝胶电泳灰度图，进行灰度分析，得到各样本条带的相对灰度值；最后以真菌比例值数据为横坐标，以相对灰度值为纵坐标，作散点图，并建立回归直线。

另一方面，本发明还公开一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的基因，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

本发明还公开所述的基因在评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明使用两对新的引物(EqP21001、EqP21002)对橡胶树白粉菌不同侵染阶段的cDNA样本进行PCR扩增，并通过ImageJ软件对PCR所得凝胶电泳图进行灰度分析。结果显示，EqP21002引物最适用于评估橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段RNA相对含量，EqP21001次之。相较于转录组测序等方法，本发明通过半定量PCR分析建立了一种简便快捷的评估方法用来检测橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片过程中RNA的比例，为进一步探索橡胶树白粉菌与寄主的互作过程提供便利。

附图说明

图1：0hpi电泳灰度图；注：泳道1为2000bp Marker，泳道2-4为样本用Eq18S引物扩增的3个重复，泳道5-7为样本用EqP21001引物扩增的3个重复，泳道8-10为样本用EqP21002引物扩增的3个重复(下同)。

图2：4hpi电泳灰度图。

图3：8hpi电泳灰度图。

图4：15hpi电泳灰度图。

图5：24hpi电泳灰度图。

图6：5dpi电泳灰度图。

图7：橡胶树白粉菌不同侵染阶段相对灰度值与真菌比例的回归曲线图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例：

2材料和方法

2.1实验材料

表1实验材料表

2.2实验方法和内容

2.2.1橡胶树白粉菌的培养

刚萌发的橡胶树幼嫩叶子呈古铜色，而成熟期的叶子则转变为绿色。由于橡胶树中绿色叶子的角质水平明显超过了古铜期叶子，所以室内的橡胶树古铜时期为最佳白粉菌孢子接种时间。为了避免自然界其他病原菌污染对该实验的后续操作造成影响，预先通过将白粉菌菌株接种至热研7-33-97古铜期叶片的方式对供试菌株进行分离纯化，活体繁育待用。在分离纯化接种后的12～15d，收集在古铜期叶片上的白粉菌孢子，作为本次实验主要菌源。使用软毛刷将收集的新鲜白粉菌孢子均匀地轻扫到待接菌的热研7-33-97健康古铜期叶片上，将接菌样品置于无菌温室中培养，温度25℃，相对湿度75％，14h光照/10h黑暗，在生长发育的过程中进行浇水和施肥，以确保胶苗的健壮发育。发育至特征观察时段后，观察接种的情况，使用灭菌剪刀剪下接种叶用锡纸包裹，放在液氮内速冻并于-80℃以下贮存备用。

2.2.2橡胶树白粉菌RNA提取与cDNA合成

接菌样品在人工气候箱中培养至发育特征观察时段(0hpi,4hpi,8hpi,15hpi,24hpi,5dpi)后，将盛放接菌介质的保鲜盒取出。根据TRizol总RNA抽提试剂盒和OMEGAFungal总RNA Kit R6840-01试剂盒的使用说明书完成RNA提取，提取后的样本经完整性验证，于-80℃保存备用。

橡胶树白粉菌cDNA合成：将橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段的RNA用DEPC水调至同一水平浓度，反转录合成相应cDNA。为防止反转录实验过程中RNA降解，选用不含RNA酶的PCR管，加样操作在冰上进行。接下来的步骤按照天根反转录试剂盒上的操作步骤进行。获得的产物cDNA置于-80℃保存备用。

2.2.3引物设计

基于前期研究基础筛选出橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段恒定表达的基因，用Blast工具中的Pick Primer工具设计本实验所需EqP21001和EqP21002两条引物。

2.2.4半定量PCR

以各时段(0hpi,4hpi,8hpi,15hpi,24hpi,5dpi)橡胶树白粉菌的RNA反转录的cDNA为模板，对18S、EqP21001和EqP21002进行SqRT-PCR，每个引物三组处理。PCR反应体系为Primer F 0.5ul，Primer R 0.5ul，PCR Mix 6ul，ddH₂O 4.5ul，cDNA 0.5ul，总体积为12ul。PCR仪扩增程序：95℃变性5min，然后95℃30s，57℃30s，72℃1min循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物用Goldview染色，0hpi、4hpi、8hpi、15hpi、24hpi、5dpi六个时间点的Maker以及18S、EqP21001和EqP21002的各个处理点样量均为8ul，以1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon凝胶显像仪成像。

2.2.5数据处理

利用ImageJ软件对胶图条带进行灰度分析；利用Excel软件进行统计学分析。

以2000bp Maker条带的灰度为标准，对相应侵染阶段Eq18S、EqP21001和EqP21002三对引物各电泳条带进行灰度分析，得到各样本条带灰度分析数据。将Marker各个bp的灰度值取平均值，然后求出各个处理与上值的比值，再对每个引物的三组处理求平均值，最终得到各个时间点18S、Eq1和Eq2的相对灰度值(表2)。最后以本课题组库中已有的各个时间点的真菌比例值ratio数据(真菌比例指的是样品中橡胶树白粉菌RNA与总RNA的比例)为横坐标，以18S、EqP21001和EqP21002相对灰度值为纵坐标，做散点图，并建立回归直线(图7)。

3结果与分析

3.1 RNA提取质量检测与引物扩增特异性分析

用上述方法对橡胶树白粉菌不同侵染阶段的RNA进行提取，然后对提取的RNA进行电泳检测。RNA电泳条带完整清晰，说明RNA比较完整。经紫外分光光度计检测后，所有样本A_260/280比值在1.80～2.00之间，说明提取RNA质量较高。

以上述反转录所得到的橡胶树白粉菌不同侵染阶段cDNA为模板，用Eq18S、EqP21001和EqP21002三对引物进行PCR扩增，用1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。三对引物扩增条带单一，扩增特异性良好，没有引物二聚体，可以用于接下来的实验当中。

3.2 PCR扩增凝胶电泳灰度图

用1.5％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，用Tanon凝胶显像仪成像后，拍摄获取凝胶电泳图，经过ImageJ软件图片处理后得到如下橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片不同阶段电泳灰度图(图1～图5)。

3.3 ImageJ灰度分析

通过ImageJ软件对凝胶电泳灰度图进行灰度分析并进行数据统计，最终得到橡胶树白粉菌不同侵染阶段各引物扩增样本平均相对灰度值表(表2)和橡胶树白粉菌不同侵染阶段相对灰度值与真菌比例的回归曲线图(图7)。根据线性相关系数的平方R²大小和散点与回归直线的位置关系可以看出，利用EqP21002引物对样本PCR所得产物的相对灰度值的R²为0.9827最接近1，散点基本呈线性分布；EqP21001次之，R²为0.9324；而Eq18S引物所得R²最小，仅为0.4977，散点与直线有明显偏差。EqP21001和EqP21002引物所得数据有良好的线性关系，说明半定量PCR结合ImageJ软件的方法可以评估橡胶树白粉菌RNA含量。同时，比较三对引物，R²最接近1的引物最适合作为半定量PCR结合ImageJ软件的方法评估橡胶树白粉菌不同侵染阶段RNA含量的引物。

表2橡胶树白粉菌不同侵染阶段各引物扩增样本平均相对灰度值表

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctctcgtc atagcaacgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcatcgcgtc cagtcttcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acatgtaagc aaagcgcacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcgccgtaa ttttggcatc 20

<210> 5

<211> 1119

<212> DNA/RNA

<213> Erysiphe quercicola

<400> 5

atgcatagca agattgtaat tattggttct gggccagcag cacacactgc ggcagtatat 60

cttgcacgag cagaattaaa gcgtctcgat tccctgacgc catgtaatca caccgtacta 120

tacgagggtt ttcttgcaaa tggaatcgca gctggcggac agctcactac aactacggat 180

gttgaaaact atccaggttt tcctaatggg ccaagaattg atggtatttc agcaagctct 240

ttcgttaaat gcgctaatga gtaccaggaa gctatgcgta cacaatctga acgttttgga 300

acaaagataa ttacagaaac tgtttccaaa cttgatcttt ccaagcggcc ctttaaatac 360

tggactgaaa acaacgaaaa taacgaacca aacactgctg atgctctcgt catagcaacg 420

ggtgcgtcag ctcgacgtct aggacttaaa ggcgaggata agtattggca aaatggtgtt 480

tctgcatgtg cagtctgtga tggtgccgtg cccatctttc gcaataagcc attaatagtc 540

ataggtggcg gtgattcggc agctgaagaa gctatttttc tcaccaaata tggttctcac 600

gtaactgtgc tcgtaaggaa agatgcctta cgtgcttcta agacaatggc taaacgcctg 660

ttgtcaaacg aaaaaataac tgttaagttc aatcatgttg gtgttgagat caagggagac 720

gaacgaggct tgatgagtca catagtaatt aaaaacgtga agactggacg cgatgaggag 780

attgaggcaa agggattatt ctatgctatc ggacatgatc cagctacaac cttagtcaaa 840

ggtcagataa aagtagatga ggacggttat atcgttacaa agcctggtac tagctacaca 900

agcatcgaag gcgtatttgc agctggtgat gttcaggata aaaggtacag acaagctatc 960

acaagtgccg gttcattagg ttctggttgt atcgcagcac ttgaagcgga aaaattctta 1020

tccgagaacg aaaatattag agataacaat gaagaagtag agattcacaa tagcaaaacc 1080

cctagtacat ctgactacag ttcaaatcca cttctctga 1119

<210> 6

<211> 555

<212> DNA/RNA

<213> Erysiphe quercicola

<400> 6

atgaaagtct tctccaatga tgaaatattt gagtattcat gggaagaagt atctactgct 60

aactggatga aatactgccc atggaatgac aagtctactc acgttattgc agtggatact 120

ttatctcgaa gtgtagatgc cgaaacagga gtgcttcgca ctgagcggct tatcacatgt 180

aagcaaagcg caccgaaatg gctaagctct ttaatgggcg gcaaagaaac atcccatgta 240

ttcgagacgt catatgtgga ccctttgaaa aagaaagtta ccatgatatc ctctaatctc 300

actttctcta acattattaa tgtacgagaa acggtcacat atgagcctct atcctcaaca 360

agaacaaagt ttagccaaga tgccaaaatt acggcgctat gtggtggctg gcaaaaaata 420

aagaatgcag tggaagaagc tacagtagat cgattttcgg aaaatgctcg gaagggaaag 480

gaagggtttg aaaatgtatt gagaatgagt aggggagtct ttggtgatca aaaactacaa 540

caacaaaacc aatag 555

Claims

1.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的引物，其特征在于，所述白粉菌为橡胶树白粉菌，所述引物为EqP21001或EqP21002；

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物为EqP21002。

3.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的方法，其特征在于，包括以下步骤：将橡胶树白粉菌侵染叶片不同阶段的RNA反转录合成cDNA，使用权利要求1所述的引物EqP21001或EqP21002对橡胶树白粉菌侵染叶片不同阶段的cDNA样本进行PCR扩增，获取凝胶电泳图，对图像进行处理得到凝胶电泳灰度图，进行灰度分析，得到各样本条带的相对灰度值；最后以真菌比例值数据为横坐标，以相对灰度值为纵坐标，作散点图，并建立回归直线。

4.一种用于评估被白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例的基因，其特征在于，所述白粉菌为橡胶树白粉菌，所述基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

5.权利要求4所述的基因在评估被橡胶树白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例方面的应用。

6.权利要求1所述的引物在评估被橡胶树白粉菌侵染的叶片中病原菌RNA比例方面的应用。