CN109640632A - 用于控制真菌植物病原体的植物和方法 - Google Patents

用于控制真菌植物病原体的植物和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了降低真菌病原体的生长、增加植物对真菌病原体的抗性或它们的组合的植物。所述植物包含降低真菌病原体诸如油菜核盘菌或灰葡萄孢菌中存在的编码区的表达的多核苷酸。所述多核苷酸可存在于所述植物的表面上、由植物表达或它们的组合。还提供了制备所述植物的方法和使用所述植物的方法。

Description

用于控制真菌植物病原体的植物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月3日提交的美国临时申请序列号62/331,026的权益，该临时申请以引用的方式并入本文。
背景技术
双低油菜(Canola)是一种重要的油料种子作物，为许多国家的经济贡献了数十亿美元(www.canolacouncil.org)。双低油菜作物受到多种真菌病原体的威胁，但最具破坏性的是油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。这种真菌在全世界范围内、包括加拿大的所有双低油菜种植区域出现(Baharlouei等人，2011,African J Biotech 10:5785-5794；Litholdo等人,2010,Genetics Molec Res 10:868-877；Hu等人,2011,Can JMicrobiology 57:539-546)，并导致双低油菜植物出现茎腐病。这种真菌所造成的年度损失在数值上有很大差异，从5％到100％不等；2010年，90％的加拿大双低油菜作物表现出一定程度的核盘菌感染，种植者的损失估计为6亿美元(www.gov.mb.ca)。主要通过作物轮作和叶面杀真菌剂来减轻核盘菌造成的损害，但在潮湿的气候条件下，这些方法通常不足以控制疾病。
发明内容
公众越来越担心化学品对环境和人类健康造成的风险，这是寻找更安全的(真菌的或物种特异性的)替代品来控制死体营养型真菌病原体的令人信服的理由。
本文提供了植物。在一个实施方案中，一种植物包含降低编码区的表达的多核苷酸。所述编码区包含与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中，并且其中所述多核苷酸位于所述植物的表面上。在一个实施方案中，与对照植物相比，在所述植物上或所述植物中所述真菌病原体的生长降低。在一个实施方案中，与对照植物相比，所述植物对所述真菌病原体的抗性增加。在一个实施方案中，与不包含所述多核苷酸的对照植物相比，施用后所述真菌病原体对所述植物的叶子造成的损伤的大小降低至少3％。在一个实施方案中，所述植物病原体是油菜核盘菌或灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含双链RNA(dsRNA)，其中所述dsRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上相同的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含单链RNA(ssRNA)，其中所述ssRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸至少包含15个核苷酸。
在一个实施方案中，当将所述多核苷酸引入所述真菌病原体并与不包含所述多核苷酸的对照真菌病原体相比时，所述多核苷酸使所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。在一个实施方案中，与不包含所述多核苷酸的对照植物上存在的对照真菌病原体相比，所述多核苷酸使存在于所述植物上的所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。在一个实施方案中，所述表面是叶子、花朵、果实、种子、蔬菜或它们的组合。在一个实施方案中，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区选自SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或它们的同源物，并且所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上。在一个实施方案中，所述多核苷酸是第一多核苷酸，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区选自SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或它们的同源物，并且所述第二多核苷酸由所述植物表达。在一个实施方案中，所述植物是双低油菜、芥菜、亚麻、向日葵、玉米、燕麦、棉花、亚麻荠、海甘蓝、红花、稻、向日葵、大豆、花生、油菜籽、椰子、油棕、琉璃苣、马铃薯、豌豆、菜豆、兵豆、鹰嘴豆或豆类牧草。
还提供了一种用于制备植物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将组合物施加于所述植物的表面，其中所述组合物包含多核苷酸。在一个实施方案中，所述施加包括将所述植物喷洒到例如所述植物的叶子、花朵、果实、种子、蔬菜或它们的组合上。在一个实施方案中，以0.1纳克多核苷酸/平方毫米(ng/mm2)的剂量施加所述组合物。
本文还提供了一种转基因植物和一种转基因植物的细胞。所述转基因植物包含降低编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中。在一个实施方案中，与对照植物相比，在所述植物上或所述植物中所述真菌病原体的生长降低。在一个实施方案中，与对照植物相比，所述植物对所述真菌病原体的抗性增加。在一个实施方案中，与不包含所述多核苷酸的对照植物相比，施用后所述真菌病原体对所述植物的叶子造成的损伤的大小降低至少3％。在一个实施方案中，所述植物病原体是油菜核盘菌或灰葡萄孢菌。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含双链RNA(dsRNA)，其中所述dsRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含单链RNA(ssRNA)，其中所述ssRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸是至少15个核苷酸。
在一个实施方案中，当将所述多核苷酸引入所述真菌病原体中并与不包含所述多核苷酸的对照真菌病原体相比时，所述多核苷酸使所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。在一个实施方案中，与不包含所述多核苷酸的对照植物上存在的对照真菌病原体相比，所述多核苷酸使存在于所述植物上的所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。在一个实施方案中，所述植物包含编码所述多核苷酸的载体。在一个实施方案中，所述载体被整合到植物基因组DNA中。在一个实施方案中，所述多核苷酸是第一多核苷酸，并且所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上。在一个实施方案中，所述多核苷酸是第一多核苷酸，并且所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上，其中所述第二多核苷酸由所述植物表达。
本文还提供了一种用于制备转基因植物的方法。在一个实施方案中，所述包括转化用多核苷酸转化植物细胞以获得重组植物细胞，以及从所述重组植物细胞生成转基因植物，其中所述植物包含减少编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中。
术语“和/或”表示所列元素中的一者或全部或所列元素中的任何两者或更多者的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的叙述并不意味着其他实施例是无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变体在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制性含义。
应当理解，在本文中使用语言“包括”、“包含”或“含有”等来描述实施方案的任何地方，以“由......组成”和/或“由大体上由......组成”描述的其他类似实施方案也提供在内。
除非另有说明，否则“一个/种”、“该/所述”和“至少一个/种”可互换使用并且表示一个/种或多于一个/种。
同样在本文中，通过端点叙述的数值范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，可以以任何可行的顺序执行这些步骤。并且，视情况而定，可以同时执行两个或更多个步骤的任何组合。
上述对本发明的概述并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。下面的描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在整个申请的几个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所叙述的列表仅用作代表性组，并且不应被解释为排他性列表。
附图说明
图1示出了本文所述的核苷酸序列的实例。
具体实施方式
本文描述了多核苷酸诸如双链RNA(dsRNA)用于抑制植物寄生真菌生长的用途。当被真菌细胞吸收时，某些多核苷酸将干扰mRNA分子并选择性地降低一种或多种必需真菌基因的表达，从而降低真菌生长、感染或病原性。本文所述的多核苷酸被设计来靶向真菌基因而不影响宿主植物基因。多核苷酸可以按至少两种方式施加于植物：即1)通过转基因方法，由此植物表达多核苷酸以抑制植物中真菌的生长或感染；或者2)多核苷酸可局部施加于植物叶子，使得当真菌孢子粘附于植物并试图感染植物细胞时，它们遇到多核苷酸因此它们的生长被抑制或者真菌感染被降低。
病原性真菌感染许多商业作物，并可对作物产量造成破坏性影响。化学杀真菌剂通常施加于植物种子，并作为叶面喷雾施加于幼小植物的叶子上，以将真菌感染降到最低。这些化学杀真菌剂的活性是广谱的，并且可以对许多真菌、包括土壤中对维持养分循环重要的有益真菌产生不利影响。杀真菌剂的功效还取决于气候，因为在进行空中喷洒后降雨可洗掉杀真菌剂，使植物易受真菌孢子的侵害。
本文所述的技术提供了一类新的抗真菌剂，其被设计为对病原性真菌具有特异性并且不会对其他真菌、植物或动物产生不利影响。该技术在本质上是序列特异性的，能够降低个体基因的基因表达，因此它可以被设计为物种限制性的，靶向病原真菌内的基因序列而不影响其他基因序列。
本文提供了一种用于降低真菌植物病原体的生长的方法。如本文所用，“降低生长”是指降低真菌复制、进行代谢、感染植物(例如定殖植物，即可能在疾病之前发生的步骤)、产生致病性(例如引起疾病)或它们的组合的能力。“降低的生长”包括例如真菌植物病原体复制、进行代谢或它们的组合的能力的降低，并且类似于使用抑制真菌剂产生的结果。在一个实施方案中，“降低的生长”是指真菌植物病原体的死亡，并且类似于使用杀真菌剂产生的结果。
本文还提供了一种用于增加植物对真菌病原体的抗性的方法。如本文所用，“抗性”是指由植物病原体引起的疾病的征象减少。抗性可以是植物病原体生长降低的结果，或者是植物病原体引起疾病征象的能力降低的结果，尽管在植物上或植物中存在很大的水平。
除非另有说明，否则如本文所用的“真菌植物病原体”、“真菌病原体”、“真菌细胞”和“真菌”可互换使用，并且是指在植物中引起疾病的真菌。真菌病原体的实例包括核盘菌科的成员，诸如核盘菌属的成员。核盘菌属成员的实例包括北方核盘菌(S.borealis)、S.bulborum、同果核盘菌(S.homoeocarpa)、小核盘菌(S.minor)、S.ricini、油菜核盘菌(S.sclerotiorum)、S.spermophila、S.sulcata、三叶草核盘菌(S.trifoliorum)和S.veratri。在一个实施方案中，真菌病原体是油菜核盘菌。真菌病原体的其他实例包括Trichomaceae科的成员，诸如曲霉属(Aspergillus)的成员(例如烟曲霉(A.fumigatus)、费氏曲霉(A.fischerianus)(也称为费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、黄曲霉(A.flavus)、米曲霉(A.oryzae)、棒曲霉(A.clavatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、土曲霉(A.terreus)；葡萄孢菌属(Botrytis)的成员(例如灰葡萄孢菌(B.cinerea))；小不整球壳科(Plectosphaerellaceae)的成员，诸如轮枝孢菌属(Verticillium)的成员(例如V.alfalfa、V.tenerum、大丽花轮枝孢菌(V.dahlia))；丛赤壳科(Nectriaceae)的成员，诸如镰刀菌属(Fusarium)的成员(例如，F.gaminearum、真马特镰刀菌(F.eumartii)、马特镰刀菌(F.martii)、茄病镰刀菌(F.solani)、F.striatum、Nectria cancri、红球丛赤壳菌(Nectria haematococca))；小丛壳科(Glomerellaceae)的成员，诸如炭疽菌属(Colletotrichum)的成员(例如胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides))；以及小球腔菌属(Leptosphaeria)的成员(例如十字花科小球腔菌(L.maculans)、油菜黑胫病菌(L.biglobosa))。其他真菌病原体包括侧弯孢壳(Eutypa lata)、Glarea lozoyensis、粉色面包霉菌(Neurospora crassa)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulate)、杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、Coniosporiumapollinis、石果衣真菌(Endocarponpusillum)。
所述方法包括将多核苷酸引入真菌中。可以通过将真菌暴露于多核苷酸，或通过使对真菌病原体易感的植物表达多核苷酸，将多核苷酸直接引入真菌中。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是核糖核苷酸和/或脱氧核苷酸，并且包括双链和单链DNA和RNA。多核苷酸可包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列和非编码序列诸如调控序列。编码序列、非编码序列和调控序列定义如下。多核苷酸可以直接从天然来源获得，或者可以借助重组、酶促或化学技术来制备。多核苷酸的拓扑结构可以是线性的或环状的。多核苷酸可以是例如载体(诸如表达或克隆载体)的一部分或片段。可以分离本文公开的多核苷酸。“分离的”多核苷酸是已从其天然环境中除去的多核苷酸。通过重组、酶促或化学技术产生的多核苷酸按照定义被认为是分离的和纯化的，因为它们从未存在于天然环境中。
在一个实施方案中，多核苷酸可以是抑制编码区的表达的双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方案中，多核苷酸可以是编码dsRNA的DNA序列。在其他实施方案中，多核苷酸可以是反义RNA或核糖酶。应当理解，通过用尿苷核苷酸替换每个胸苷核苷酸，可以将作为DNA序列的本文公开的序列从DNA序列转化为RNA序列。
不希望受理论的限制，据信本文所述的dsRNA介导mRNA的RNA干扰(RNAi)。RNAi是由dsRNA启动的序列特异性转录后基因沉默的过程，所述dsRNA包括与沉默的mRNA的一部分的序列互补或基本上互补的反义链。沉默可以由特定mRNA的降解引起，mRNA降解通常在dsRNA的一条链与靶mRNA之间存在高互补性时发生。反义RNA是与细胞中特定mRNA中发现的序列互补或反义的单链RNA(ssRNA)分子。将反义RNA引入细胞中使得反义RNA与mRNA结合，并抑制mRNA的翻译。核糖酶(也称为RNA酶或催化RNA)是催化诸如mRNA分子的磷酸二酯骨架的切割的化学反应的RNA分子。可以将核糖酶设计为包含与靶mRNA反义的多核苷酸序列，从而靶向并切割靶mRNA。
如本文所用，术语“编码区”和“基因”可互换使用。“编码区”是编码未加工的preRNA(即包含外显子和内含子的RNA分子)，并且被加工以产生翻译成多肽的mRNA的核苷酸序列。编码区的边界通常由其5'末端的转录起始位点和3'末端的转录终止子确定。
已鉴定出当表达被减少时，使得真菌病原体的生长降低的编码区。在一个实施方案中，可被减少以使生长降低的编码区的实例编码可以Genbank登录号XM_001592197.1、XM_001592927.1、XM_001596225.1或XM_001591197.1获得的mRNA序列(参见实施例的表5-表7)。当被减少时预期使生长降低的编码区的mRNA序列的其他实例包括但不限于以Genbank登录号XM_001597459.1、XM_001588982.1、XM_001590428.1、XM_001550999.1、XM_001556707.1、XM_001553668.1、XM_001556287.1、XM_001559983.1可获得的mRNA序列(参见实施例的表3和表10)。当被减少时预期使生长降低的编码区的mRNA序列的其他实例包括但不限于以实施例2中列出的Genb ank登录号可获得的mRNA序列。
在一个实施方案中，靶向的mRNA可以用于将多核苷酸诸如dsRNA引入真菌病原体中的方法，所述真菌病原体是核盘菌科的成员，诸如油菜核盘菌。在其他实施方案中，多核苷酸诸如dsRNA可以用于其他真菌病原体，其中dsRNA针对由为同源物的编码区编码的mRNA。
编码区为同源物指编码区共享祖先，例如它们都来自在共同祖先中存在的编码区。技术人员通过使用常规方法可以容易地确定真菌病原体中非核盘菌科成员或非核盘菌属成员的编码区是否是编码本文公开的mRNA的编码区的同源物。在一个实施方案中，技术人员可以使用本文公开的编码区的核苷酸序列并设计简并PCR引物用于低严格性PCR。低严格性PCR是一种用于鉴定已知编码区的同源物的常规方法。在另一个实施方案中，技术人员可以使用容易获得的数据库在另一种真菌植物病原体中鉴定编码本文公开的mRNA的编码区的同源物。合适的数据库的实例包括但不限于GenBank(可通过万维网在ncbi.nlm.nih.gov/genbank获得)。(关于油菜核盘菌编码区的灰葡萄孢菌同源物的实例的实施例，参见表10)
在另一个实施方案中，技术人员可以通过编码本文公开的mRNA的编码区与另一编码区之间的序列同一性水平来鉴定本文公开的编码区的同源物。在一个实施方案中，当比较两个核苷酸序列时，将大于50％的同一性百分比视为可能同源性的证据。E值(期望值)表示搜索的数据库中预计将只是偶然性地与查询对齐的命中(序列)的数量，因此小于0.01的E值(即，随机出现序列的概率小于1％)，加上大于50％的同一性百分比被视为鉴定可能同源物的合适分数。用于测定两个序列之间的核苷酸序列同一性的方法在本领域是容易获得的且是常规的。在一个实施方案中，可以在NCBI的非冗余数据库利用缺省参数分别使用BLAST-N或BLAST-X算法鉴定真菌病原体中为编码本文公开的mRNA或蛋白质的编码区的同源物的编码区。如果候选编码区与本文公开的相应编码区具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列同一性，则候选编码区被认为是编码本文公开的mRNA的编码区的同源物。
本文公开的一种或多种mRNA的表达减少可导致真菌生长降低，例如真菌复制、进行代谢、感染植物、产生致病性或它们的组合的能力降低。
在一个实施方案中，本文所述方法中使用的多核苷酸包含有义链和反义链。有义链的长度为至少15个核苷酸；然而，通常更期望更长的长度。因此，有义链可以是，但不限于例如至少15个、至少25个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个或至少400个核苷酸。在哺乳动物细胞中，长度大于30个核苷酸的dsRNA可诱导干扰素介导的细胞免疫应答，从而导致细胞死亡。真菌细胞缺乏这种基于干扰素的应答，并且可以递送更长的dsRNA。有义链与dsRNA所靶向的mRNA(即靶mRNA)的一系列核苷酸(例如，至少15个核苷酸、至少25个核苷酸等)相同或基本上相同。技术人员将认识到与靶mRNA相同或基本上相同的有义链的核苷酸将不长于靶mRNA的长度。如本文所用，术语“相同”是指有义链的核苷酸序列具有与靶mRNA的一部分相同的核苷酸序列。如本文所用，术语“基本上相同”是指有义链的序列与靶mRNA的序列在某些数量的核苷酸上有所不同，但是互补反义链结合并使靶mRNA表达沉默的能力得到保持。例如，有义链的序列与靶mRNA的序列在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸上有所不同，而其余的核苷酸与靶mRNA的序列相同。在另一个实施方案中，有义链和靶mRNA的序列之间的核苷酸差异可以不大于核苷酸的1％、不大于核苷酸的5％、不大于核苷酸的10％、不大于核苷酸的15％或不大于核苷酸的20％，而其余的核苷酸与靶mRNA的序列相同。
dsRNA多核苷酸的另一条链，在本文中称为反义链，与有义链互补或基本上互补，并因此与靶mRNA的一系列核苷酸(例如，至少15个核苷酸、至少25个核苷酸等)互补或基本上互补。术语“互补”是指两个单链多核苷酸彼此进行碱基配对的能力，其中一个多核苷酸上的腺嘌呤将与第二个多核苷酸上的胸腺嘧啶或尿苷进行碱基配对，并且一个多核苷酸上的胞嘧啶将与第二个多核苷酸上的鸟嘌呤进行碱基配对。与另一多核苷酸诸如(诸如靶mRNA)“互补”的反义链意指与多核苷酸(诸如靶mRNA)的核苷酸序列互补的反义链的核苷酸。如本文所用，术语“基本上互补”意指反义链有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸与靶mRNA的核苷酸序列不互补，而其余的核苷酸与靶mRNA的序列互补。在另一个实施方案中，术语“基本上互补”意指反义链有不大于1％、不大于5％、不大于10％、不大于15％或不大于20％的核苷酸与靶mRNA的核苷酸序列不互补，而其余的核苷酸与靶mRNA的序列相同。
在一个实施方案中，反义链是单链RNA(ssRNA)，并且不与有义链结合。这种ssRNA可用作反义多核苷酸，用于减少反义多核苷酸所靶向的mRNA的翻译。
本文还提供了对应于本文公开的有义链和反义链的单链DNA多核苷酸。本文还提供了本文公开的双链多核苷酸，其包含单链多核苷酸的互补序列。
本文所述的dsRNA可以在一条或两条链上包含突出端。突出端是存在于双链RNA的一条链中的未配对的一个或多个核苷酸，即它们在双链多核苷酸的另一条链中没有对应的互补核苷酸。突出端可以位于有义链、反义链或有义链和反义链两者的3'末端。突出端的长度通常为1、2或3个核苷酸。在一个实施方案中，突出端位于3'端并且具有尿嘧啶-尿嘧啶序列(或如果是DNA，则具有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶序列)。不希望受限制，可以使用这种突出端来增加dsRNA的稳定性。在一个实施方案中，如果存在突出端，则在确定有义链是否与靶mRNA相同或基本上相同时不予考虑，并且在确定反义链是否与靶mRNA互补或基本上互补时不予考虑。
本文所述的dsRNA的有义链和反义链也可以例如通过由核苷酸组成的间隔子来共价连接。这种多核苷酸在本领域中通常称为发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)。有义链和反义链进行碱基配对后，间隔区通常形成环。构成环的核苷酸的数量可以变化，并且已报告了3至23个核苷酸之间的环(Sui等人,2002,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,99:5515-5520；Jacque等人,2002,Nature,418:435-438)。在一个实施方案中，shRNA包含有义链，随后是核苷酸环和类似的反义链。在一个实施方案中，反义链可以在核苷酸环结构之前，有义链可以在核苷酸环结构之后。
可以对本文所述的dsRNA进行修饰。此类修饰可用于增加多核苷酸在某些环境中的稳定性。修饰可包括核酸糖、碱基或骨架或它们的任何组合。修饰可以是合成的、天然存在的或非天然存在的。dsRNA可以包括对多核苷酸中存在的一个或多个核酸的修饰。骨架修饰的实例包括但不限于膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸盐、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸。核酸碱基修饰的实例包括但不限于肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、或丙炔修饰。核酸糖修饰的实例包括但不限于2'-糖修饰，例如2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖、2'-O-甲氧基乙基核苷酸、2'-O-三氟甲基核苷酸、2'-O-乙基-二氟甲氧基核苷酸、2'-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或2'-脱氧核苷酸。可以商业合成获得包括这些修饰的多核苷酸(例如，Dharmacon Inc.,Lafayette,CO)。
本文所述的多核苷酸具有生物活性。生物活性多核苷酸引起靶编码区的表达的转录后抑制，也称为沉默。不希望受理论限制，在将本文所述的多核苷酸引入真菌细胞中之后，多核苷酸将与靶mRNA杂交并发信号通知细胞核酸内切酶切割靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译。结果是由mRNA编码的多肽的表达受到抑制。靶mRNA的表达是否受到抑制可以通过例如测量细胞中靶mRNA的量的减少，测量由mRNA编码的多肽的量的减少，或通过测量与由mRNA编码的多肽的表达相关的表型的变化来确定。
可用于使本文公开的mRNA的表达沉默的多核苷酸的实例包括以下所示的那些。
表1：经合成以靶向油菜核盘菌中的特定基因的DsRNA分子
表2：经合成以靶向灰葡萄孢菌中的特定基因的DsRNA分子
技术人员将理解，可以使用各示例性dsRNA的一部分来使靶mRNA的表达沉默，并且也可使用更长的dsRNA。本领域技术人员还理解，能够使用其他dsRNA来使本文公开的靶mRNA的表达沉默。技术人员还将认识到，可以产生靶向表1和表2中列出的编码区和这些编码区的同源物的反义RNA分子。
可使用本领域中常规的且已知的方法设计可用于本文所述方法的多核苷酸。例如，抑制编码本文所述mRNA的编码区的表达的候选dsRNA多核苷酸或反义多核苷酸可以基于选定的一系列核苷酸，并且可以使用容易获得的算法进行鉴定。候选多核苷酸是正经过测试以确定其是否减少编码本文所述mRNA的编码区之一的表达的多核苷酸。候选多核苷酸可以与位于编码多肽的编码区、或位于mRNA的5'或3'非翻译区中的核苷酸相同。可以使用公众可用的算法(例如，BLAST)筛选候选多核苷酸，以将候选多核苷酸序列与真菌病原体和/或经处理可防止真菌病原体感染的植物中存在的编码序列进行比较。可能与由非靶编码区表达的mRNA形成双链体的那些候选多核苷酸通常不予进一步考虑。然后可以测试其余的候选多核苷酸以确定它们是否抑制编码区的表达。
通常，通过将候选多核苷酸引入表达适当mRNA和多肽的细胞中来单独测试候选多核苷酸。在一个实施方案中，候选多核苷酸可以在体外制备，然后引入表达靶mRNA的真菌细胞中。体外合成的方法包括例如用常规DNA/RNA合成仪进行化学合成。合成多核苷酸的商业供应商和用于这种合成的试剂是众所周知的。用于体外合成的方法还包括，例如在无细胞体系中使用环形或线性载体进行体外转录。在一个实施方案中，可以将候选多核苷酸作为dsRNA或作为反义ssRNA引入细胞中。在一个实施方案中，可以将候选多核苷酸作为编码候选多核苷酸的构建体引入细胞中。细胞可以是真菌病原体。此类构建体在本领域中是已知的，并且包括例如编码和表达候选多核苷酸的有义链和反义链的载体，以及包含侧翼连接可操作地连接的调控序列的编码候选多核苷酸的有义链和反义链的序列以驱动候选多核苷酸的表达的RNA表达载体。在另一个实施方案中，与调控序列可操作地连接的多核苷酸编码反义链，反义链转录产生可形成影响靶mRNA表达的二级结构的多核苷酸。
当评估候选多核苷酸是否起到抑制本文所述的靶mRNA的表达的作用时，可以测量含有候选多核苷酸的细胞中的靶mRNA的量并与对照细胞(例如，不含有候选多核苷酸的相同类型的细胞)进行比较。用于测量细胞中mRNA水平的方法在本领域中是已知的且是常规的。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)。本领域技术人员可以容易地确定用于扩增靶mRNA的引物和特定条件。其他方法包括例如RNA印迹和阵列分析。
用于评估候选多核苷酸是否起到抑制由靶mRNA编码的多肽的表达的其他方法包括监测多肽。例如，可使用测定来测量由mRNA编码的多肽的量的减少，或测量由mRNA编码的多肽的活性的降低。用于测量多肽量减少的方法包括测定含有候选多核苷酸的细胞中存在的多肽并与对照细胞进行比较。细胞是否表达多肽之一可以使用本领域常规且已知的方法确定，所述方法包括例如蛋白质免疫印迹、ELISA、免疫沉淀或免疫组织化学。
在一个实施方案中，与对照细胞(例如，不包含候选多核苷酸的真菌病原体)相比，候选多核苷酸能够将靶mRNA或由靶mRNA编码的多肽的表达减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
本文所述的多核苷酸诸如dsRNA可以由载体中存在的多核苷酸编码。载体是复制型多核苷酸，诸如质粒、噬菌体或粘粒，其上可以连接另一个多核苷酸以使所连接的多核苷酸发生复制。含有本文所述多核苷酸的载体的构建采用本领域已知的标准连接技术(参见，例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))。载体可用于进一步克隆(扩增多核苷酸)，即为克隆载体；或用于表达多核苷酸，即为表达载体。术语载体包括但不限于质粒载体。在一个实施方案中，诸如当dsRNA在植物细胞中表达时，载体可导致整合到细胞的基因组DNA中。通常，载体能够在细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)以及任选地在其他细胞中中复制。本文所述的多核苷酸可以作为两个单独的互补多核苷酸存在于载体中，每个互补多核苷酸可被表达以产生dsRNA的有义链和反义链；或者作为包含有义链、环区和反义链的单个多核苷酸存在于载体中，该单个多核苷酸可被表达以产生具有dsRNA的有义链和反义链的RNA多核苷酸。
载体的选择取决于所得构建体中的多种所需特性，诸如选择标记物、复制速率等。用于克隆或表达本文载体的合适宿主细胞是原核细胞或真核细胞。合适的原核生物包括细菌域的成员和古细菌域的成员。在一个实施方案中，合适的原核生物是大肠杆菌。真核细胞的实例是植物细胞。
表达载体任选地包含与本公开的多核苷酸可操作地连接的调控序列。通常，启动子导致RNA多核苷酸的产生。用于原核细胞的此类启动子的实例包括T7启动子、T3启动子或SP6启动子。用于真核细胞的此类启动子的实例包括引发RNA聚合酶诸如RNA聚合酶III复合物的结合以启动本公开的可操作连接的多核苷酸的转录的启动子。在一个实施方案中，此类启动子的实例包括组成型启动子，诸如来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、植物来源的肌动蛋白启动子和遍在蛋白启动子、叶定域的启动子诸如光合作用相关的核基因(PhANGS)启动子、叶绿素a/b-结合蛋白(Cab)启动子或Rubisco(RbcS)小亚基启动子。启动子可以是组成型或诱导型的。另一种调控序列是转录终止子。合适的转录终止子在本领域中是已知的。
将多核苷酸诸如dsRNA引入真菌病原体中。在一个实施方案中，dsRNA由转基因植物表达。如本文所用，术语“转基因植物”是指已被转化成含有至少一种多核苷酸以使dsRNA表达的植物。术语“转基因植物”包括完整植物、植物部分(茎、根、叶子、果实等)或器官、植物细胞、种子及其子代。转化的植物可以是直接转染子，这意味着诸如通过农杆菌(Agrobacterium)或其他方法将DNA构建体直接引入植物中，或者植物可以是转染植物的子代。第二代或后续世代植物可以通过有性繁殖即受精来生产。此外，植物可以是配子体(单倍体阶段)或孢子体(二倍体阶段)。
植物的实例包括但不限于草本植物、多肉植物，特别是花和蔬菜。具体实例包括但不限于油料种子作物，诸如双低油菜、芥菜、亚麻、向日葵、玉米、燕麦、棉花、亚麻荠、海甘蓝、红花、稻、向日葵、大豆、花生、油菜籽、椰子和油棕。其他植物包括琉璃苣、马铃薯、豌豆、菜豆、兵豆、鹰嘴豆或豆类牧草。
本文所述的转基因植物可以使用常规方法产生(参见，例如Waterhouse等人，美国专利申请2006/0272049)。转化和再生的方法是技术人员已知的。用本文所述的多核苷酸转化植物细胞从而产生重组宿主细胞可通过任何已知的用于将核酸序列插入原核或真核宿主细胞的方法来实现、所述方法包括农杆菌介导的转化方案、病毒感染、晶须、电穿孔、显微注射、聚乙二醇处理、热休克、脂质转染、粒子轰击和叶绿体转化。还提供了表达一种或多种本文所述的多核苷酸的转基因植物。
用于转化单子叶植物物种的技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转移到原生质体中，将粒子轰击到愈伤组织或组织结构中以及农杆菌介导的转化。
可以根据常规技术将已转化的细胞培养成植物。参见，例如McCormick等人(1986,Plant Cell Reports,5:81-84)。然后可以培养这些植物并评估dsRNA的表达。这些植物可以用相同的转化菌株或不同的菌株授粉，并鉴定出具有所需表型特征的所得杂交体。可以培养两代或更多代以确保一种或多种dsRNA的所需表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子以确保所需特征的稳定性得以实现。
在另一个实施方案中，通过将多核苷酸诸如dsRNA局部施加于具有或处于真菌植物病原体感染风险的植物，将多核苷酸诸如dsRNA引入真菌病原体中。将多核苷酸施加于植物可以通过喷洒、刷涂或任何其他方法来实现。该施加可以是针对整个植物或植物的一部分，诸如叶子、花朵、果实、种子或蔬菜。多核苷酸可以呈任何合适的组合物形式施加于植物。组合物可以是水性或非水性的。在一个实施方案中，组合物包含有助于多核苷酸的稳定性、多核苷酸进入真菌植物病原体的能力和/或保持与植物表面结合的能力的剂。这种剂可以与多核苷酸物理结合。组合物可包含有助于dsRNA分子的局部施加的其他剂，包括但不限于表面活性剂(例如，阴离子型、阳离子型、两性、非离子型)、生物表面活性剂、润湿剂、渗透剂、增稠剂、乳化剂、铺展剂、粘着剂、油、烷基聚葡糖苷、有机硅酸盐、无机盐或它们的组合。还提供了一种包含本文所述的多核苷酸的组合物。
本公开还提供了在表面上具有本文所述的多核苷酸的植物。多核苷酸可以存在于整个植物上或植物的一部分诸如植物的一片或多片叶子上。本文还提供了用包含本文所述的多核苷酸的组合物将多核苷酸施加于植物或植物的一部分的方法。
在一个实施方案中，多于一种多核苷酸可以在转基因植物中表达或施加于植物。例如，靶向mRNA的不同区域的多种多核苷酸可以在转基因植物中表达或施加于植物。在另一个实例中，靶向不同mRNA分子的多种多核苷酸可以在转基因植物中表达或施加于植物。不同多核苷酸的数量可以为至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个。预计可以在转基因植物中表达或施加于植物的不同多核苷酸的数量没有上限，但在一个实施方案中，该数量不大于15或不大于10。在一个实施方案中，一种或多种多核苷酸可以在转基因植物中表达，并且一种或多种多核苷酸可以施加于同一植物。
对植物的治疗可以是预防性的，或者可以在由真菌植物病原体引起的疾病发展之后开始。例如，在植物表现出疾病征象之前开始的预防性治疗在本文中称为对有感染“风险”的植物进行的治疗。可以在真菌植物病原体感染发生之前、期间或之后进行治疗。在疾病发展之前开始的治疗可以降低被真菌病原体感染的风险。在疾病发展之前开始的治疗包括将本文所述的多核苷酸施加于植物表面、使用表达本文所述的多核苷酸的转基因植物或它们的组合。在疾病发展之后开始的治疗可能降低疾病征象的严重程度，或完全消除征象。由真菌病原体引起的疾病的征象包括但不限于植物表面上的一处或多处损伤。施加于植物的剂量足以使感染的风险降低或疾病征象的严重程度降低(例如，损伤数量减少、损伤大小降低或它们的组合)。感染风险降低或疾病征象的严重程度降低可以是病原体生长减少、植物对病原体的抗性增加或它们的组合的结果。技术人员可以容易地确定这种剂量。
在一个实施方案中，可以通过损伤大小的降低来确定感染风险的降低或疾病征象严重程度的降低。可以使用标准方法测量植物的叶子或其他部分上的损伤大小。与对照植物(例如，未用组合物治疗的相同类型的植物或不表达多核苷酸的相同类型的植物)相比，损伤大小的降低可以为至少3％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一个实施方案中，植物上的损伤是不可检测的。
在一个实施方案中，施加于植物表面的组合物包含多核苷酸诸如dsRNA，剂量为0.1纳克/平方毫米(ng/mm2)至15ng/mm2。例如，dsRNA可以按至少0.1纳克/平方毫米(ng/mm2)、至少0.5ng/mm2、至少1ng/mm2、至少5ng/mm2或至少10ng/mm2的剂量施加。例如，dsRNA可以按不大于15ng/mm2、不大于10ng/mm2、不大于5ng/mm2、不大于1ng/mm2或不大于0.5ng/mm2的剂量施加。在一个实施方案中，多于一种多核苷酸可以由转基因植物表达或施加于植物。
通过以下实施例说明本公开。应理解，具体实施例、材料、量和程序将根据如本文所叙述的公开内容的范围和精神进行广义地解释。
实施例1
可提供一系列控制核盘菌的新选择的技术是RNA干扰(RNAi)。RNAi是一种在将双链RNA(dsRNA)引入细胞后降低基因表达或使基因表达沉默的序列特异性方法。一旦进入细胞内，dsRNA就会介导具有相同序列的任何RNA的破坏，从而使基因表达沉默。使用生物信息学工具，可以设计dsRNA以选择性地仅靶向生物体中的一个基因，并且还设计dsRNA以仅靶向一个物种或者一组相关物种。RNAi具有惊人的使基因表达沉默的能力，因此正考虑将其用于许多应用，包括多种作物保护技术[6]。我们之前已开发出表达物种特异性杀虫dsRNA的转基因植物，这些dsRNA靶向昆虫生长所必需的基因，从而杀死以植物为食的昆虫[7]。由于序列特异性，RNAi可以很容易地适应于选择性地靶向任何害虫或病原体，而不会对其他生物体产生不利影响。先前已证明RNAi可有效保护转基因烟草属植物免受病原真菌轮状镰刀霉菌(Fusarium verticillioides)的影响[8]。在本研究中，我们检查了RNAi技术抑制油菜核盘菌生长的效用，目的是开发出局部施加的dsRNA作为转基因介导的植物保护的替代。我们首先证明了外源提供的dsRNA可被真菌吸收，并且发生mRNA转录物的基因特异性敲低。其次，我们已确定了在双低油菜植物的早期感染阶段由油菜核盘菌表达的基因组库。通过使用中等通量筛选方法，我们已经鉴定出哪些真菌基因是最敏感的RNAi靶标，从而将植物中的感染降到最低。RNAi可以靶向特定基因或基因家族，因此，该技术实现了产生大量抗核盘菌dsRNA的能力，这将在出现抗性菌株时提供丰富的真菌控制dsRNA供应源。该技术还被发展来控制影响其他商业作物的其他真菌病原体。
我们开发基于RNAi的控制双低油菜中的核盘菌茎腐病的方法的方式包括三个主要组成部分：1)概念验证证明局部施加的dsRNA可诱导RNAi并抑制真菌生长生物测定中的油菜核盘菌生长；2)使用转录组学分析和中等通量RNAi功能筛选鉴定其他真菌靶基因；以及3)测试dsRNA的局部施加制剂以评定是否可以在不使用转基因技术的情况下保护植物免受核盘菌感染，所述转基因技术可以作为杀真菌剂的更安全的更具物种特异性的即用型替代品。
结果
1.对感染油菜核盘菌的油菜进行的转录组学分析已经鉴定出数千种推定的RNAi靶标。
为了鉴定感染过程中差异表达的基因，我们对快速感染油菜核盘菌感染的双低油菜叶组织进行测序。我们选择了两个具有不同易感性水平的栽培品种，即Westar(易感)和ZhongYou821(耐受)，以比较核盘菌内的反应。提取RNA样品，在Illumina HiSeq平台上进行高通量RNA测序。将由Illumina Hiseq 2500生成的100对配对末端序列读数通过FASTX工具包进行质量过滤，利用jar程序Trimmomatic使用sliding window和headcrop进行修整。使用TopHat2以高灵敏度模式将样品与油菜核盘菌参考基因组比对。使用原始计数作为DESeq2的输入用于列出差异表达的基因，并作为TopHat的输入以识别剪接点。
我们将在板上生长的真菌与在叶上生长的真菌的基因列表进行比较以鉴定出数千个差异表达的基因，这些基因代表了RNAi阻止和抑制真菌生长的优良靶标。还比较了两个栽培品种上的感染以鉴定出对双低油菜上的感染重要的基因。在感染过程之前期间和之后我们确定了10,003个基因的存在。然后，我们使用先前获得的基因本体论(GO)术语、BLAST和蛋白质FASTA文件来指定预测的生物学功能。
2.转录组学分析可提供有关基因表达水平的信息，以便能够更快地鉴定出在早期感染阶段表达的基因。
为了鉴定对感染过程重要的基因，我们发现在两个栽培品种中有1,858个基因响应于感染而上调。这些基因可能代表RNA干扰的理想靶标。这些基因显着上调，且认为最小假发现率为0.05。GO术语和BLAST查询指导了目标的选择。我们还针对公众可用数据库中列出的一些必需基因以扩展选择目标而无需转录组数据，并且开发出生物信息学管道。针对油菜核盘菌选择的靶标如表3所示。
为了合成针对所选靶标的dsRNA，从Genbank获得核盘菌基因序列，并设计引物以对长度范围在180与480bp之间的基因片段进行PCR扩增(如表4所示)。将每种产物连接到载体的两个T7RNA聚合酶启动子序列之间，然后使用载体对基因片段进行PCR扩增。然后将PCR产物用作模板，以使用T7RNA聚合酶通过体外转录制备dsRNA。
表3：用于RNA干扰的油菜核盘菌靶标
表4：用于克隆和合成所选的dsRNA的油菜核盘菌引物
3.油菜核盘菌真菌菌丝可以吸收外源dsRNA以随时间推移诱导RNA干扰
如上所述合成靶向核盘菌基因SS1G_05899的DsRNA。真菌是从马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上的菌核中生长出来的。从真菌菌落的活跃生长边缘取直径约1mm的塞子，并置于3mL马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中。真菌生长48小时，然后加入500ng dsRNA。在接种后0、24、28、72和96小时的时间点采集真菌；提取RNA；制备cDNA；并且使用qRT-PCR评定靶基因的mRNA转录物水平。孵育4天后观察到47％的最大敲低率(表5)。SS1G_05899dsRNA处理的管中的敲低趋势与GFP dsRNA处理的管中观察到的趋势相反。GFP对靶转录物的积聚没有任何负面影响，这是由于靶dsRNA的施加。RNAi效应的定时与在人细胞系和昆虫实验中观察到的定时一致。
表5：用500ng基因特异性dsRNA超时处理后的核盘菌基因表达％
1.基因表达是相对于β微管蛋白(SS1G_04652)基因转录物水平而言
2.基因表达是相对于0小时而言。
3.误差等于标准偏差
4.油菜核盘菌真菌菌丝可以吸收外源dsRNA以引发不同剂量下的RNA干扰
真菌是从PDA上的菌核中生长出来的。从真菌菌落的活跃生长边缘取直径约1mm的塞子，并置于3mL PDB中。向培养基中加入特定剂量(100ng、200ng、500ng和1000ng)的SS1G_07873dsRNA。并行地，测试500ng剂量水平下的SS1G_06487、SS1G_05899和SS1G_02495dsRNA。真菌生长3天，然后收集组织，提取RNA并合成cDNA。使用qRT-PCR评定靶基因的mRNA转录物水平。用水(0ng)比较积聚水平。在所有测试剂量下所有基因均显示出显着的敲低，最大敲低率为53％(表6和表7)。这表明分子在降低接受体核盘菌中的转录物积聚方面发挥作用。
表6：dsRNA处理后核盘菌中靶基因表达水平的变化。
A.基因表达是相对于：(1)β微管蛋白而言
B.误差对应于标准偏差
表7：用dsRNA处理后在核盘菌中观察到的基因转录物的敲低
A.基因表达是相对于：(1)β微管蛋白而言
B.基因表达是相对于0ng(水剂量)对照而言
C.误差对应于标准偏差
5.在双低油菜叶上局部施加dsRNA可以降低油菜核盘菌的生长。
为了模拟田间条件，用200ng dsRNA涂覆衰老双低油菜(油菜(B.napus))花瓣，然后将10μl真菌孢子(～5000个孢子)施加于每个花瓣。3天后，向叶子表面另外施加200ngdsRNA并将花瓣置于叶子之上。将植物在高湿度条件下孵育，这对于引起侵袭性感染是必需的。对叶子进行成像，并使用ImageJ软件测量损伤。所测试的基因大多数都显示出高达85.32％的显着损伤大小降低(表8)。结果表明，直接在叶子表面上局部施加dsRNA可保护植物免受油菜核盘菌增殖影响。
表8：使用双低油菜花瓣测定测得的双低油菜叶子的核盘菌感染的降低
基因 损伤大小降低百分比(％)
SS1G_06487 85.32±16.2
SS1G_01703 84.93±16.3
SS1G_05899 76.93±12.5
SS1G_02495 70.74±24.8
SS1G_11912 66.24±16.3
SS1G_07873 63.91±28.1
SS1G_09665 3.10±31.1
SS1G_08218 -8.94±29.3
A.损伤大小是相对于水对照(无dsRNA)而言
B.误差对应于标准偏差
6.表达DsRNA的拟南芥(A.thaliana)植物得到保护免受核盘菌感染
选择用于通过叶面施加保护植物的核盘菌基因靶标，以评估用于RNAi技术的转基因方法。再次使用用于合成dsRNA的引物(表4)来产生表达相同靶向区域的转基因植物。使用PCR对产物进行扩增，并将每种产物穿梭到载体中进行测序，然后重组到最终载体中，产生发夹RNA(hpRNA)。将载体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，这使得可以使用已确立的转化方案转化拟南芥植物。使用卡那霉素MS板选择转基因植物，并使植物生长3周。在此阶段，将悬浮在葡萄糖-磷酸盐缓冲液中的大约10μL的10000个孢子[9]分配到叶子的表面上。将植物置于湿度箱中并且使感染进行4天，然后使用照相术和ImageJ评定损伤。与野生型哥伦比亚拟南芥相比，所有表达hpRNA的植物都显示出高达74.5％的损伤大小降低(表9)。一般来讲，与叶面施加dsRNA分子相比，转基因植物显示出更高的保护水平。
表9：特异性靶向核盘菌基因的表达hpRNA的拟南芥植物的核盘菌损伤降低。
基因 损伤大小减少(％)
SS1G_01703 65.7±19
SS1G_09665 57.83±18
SS1G_08218 74.5±9
A.损伤大小是相对于野生型哥伦比亚拟南芥植物而言
B.误差对应于标准偏差
6.灰葡萄孢菌中的核盘菌同源物可有效降低生长
核盘菌靶标成功后，我们靶向灰葡萄孢菌中的一些油菜核盘菌基因的同源物以将我们的靶标扩展到核盘菌之外(表10)。使用BLASTP(可在万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins获得)鉴定同源物，然后可以找到Genbank登录号。与油菜核盘菌类似，设计引物以对长度范围在180与480bp之间的基因片段进行PCR扩增(如表11所示)。将每种产物连接到载体中位于两个T7RNA聚合酶启动子序列之间，然后使用载体对基因片段进行PCR扩增。然后将PCR产物用作模板，以使用T7RNA聚合酶通过体外转录制备dsRNA。
合成dsRNA后，取大约4周龄的双低油菜叶子并置于含有湿纸巾的大陪替氏平皿中。将500ng dsRNA铺在4cm2区域上。为了促进感染，在4cm2区域的中间进行小的穿刺，然后将大约1000个灰葡萄孢菌孢子放置在穿刺区域上。感染进行4天，然后拍摄损伤并使用ImageJ软件进行测量。损伤大小降低达73％(表12)，表明同源dsRNA可以被设计用于其他致病性物种，并且可以有效控制其他植物疾病。
表10：针对RNA干扰的灰葡萄孢菌局部同源物
表11：用于克隆的灰葡萄孢菌引物
表12：当被来自核盘菌的同源dsRNA靶向时，灰葡萄孢菌损伤的降低
葡萄孢菌基因 损伤降低％
BC1G_04775 73±30
BC1G_04955 53±26
BC1G_07805 42±33
BC1G_10306 46±29
BC1G_01592 54±20
A.损伤大小是相对于GFP对照而言
B.误差对应于标准偏差
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实施例2
如实施例1中所述的那样评估RNA干扰的其他靶标。当被靶向以降低表达时，发现以下编码区使油菜核盘菌的生长降低：XM_001591197.1(SS1G_07873，SEQ ID NO:42)、XM_001590273.1(SS1G_09088，SEQ ID NO:43)、XM_001596198.1(SS1G_02468，SEQ ID NO:44)、XM_001587661.1(SS1G_11704，SEQ ID NO:45)、XM_001596446.1(SS1G_02716，SEQ ID NO:46)、XM_001586961.1(SS1G_12040，SEQ ID NO:47)、XM_001589214.1(SS1G_09897，SEQ IDNO:48)、XM_001592927.1(SS1G_05899，SEQ ID NO:49)、XM_001592197.1(SS1G_06487，SEQID NO:50)、XM_001597459.1(SS1G_01703，SEQ ID NO:51)、XM_001596225.1(SS1G_02495，SEQ ID NO:52)、XM_001586833.1(SS1G_11912，SEQ ID NO:53)、XM_001589938.1(SS1G_08752，SEQ ID NO:54)、XM_001588858.1(SS1G_10456，SEQ ID NO:55)、XM_001588798.1(SS1G_10396，SEQ ID NO:56)、XM_001594135.1(SS1G_03992，SEQ ID NO:57)、XM_001586701.1(SS1G_11780，SEQ ID NO:58)、XM_001591282.1(SS1G_07958，SEQ ID NO:59)、XM_001594183.1(SS1G_04040，SEQ ID NO:60)、XM_001598634.1(SS1G_00773，SEQ ID NO:61)、XM_001598299.1(SS1G_00435，SEQ ID NO:62)、XM_001593489.1(SS1G_04966，SEQ IDNO:63)、XM_001588511.1(SS1G_10108，SEQ ID NO:64)、XM_001594947.1(SS1G_04805，SEQID NO:65)、XM_001594144.1(SS1G_04001，SEQ ID NO:66)、XM_001592623.1(SS1G_06914，SEQ ID NO:67)、XM_001591055.1(SS1G_07730，SEQ ID NO:68)、XM_001588997.1(SS1G_09680，SEQ ID NO:69)、XM_001594134.1(SS1G_03991，SEQ ID NO:70，XM_001588201.1(SS1G_10698，SEQ ID NO:71)、XM_001590641.1(SS1G_08431，SEQ ID NO:72)、XM_001585413.1(SS1G_13702，SEQ ID NO:73)、XM_001595070.1(SS1G_03208，SEQ ID NO:74)、XM_001587072.1(SS1G_12152，SEQ ID NO:75)、XM_001595209.1(SS1G_03348，SEQ ID NO:76)、XM_001585128.1(SS1G_13746，SEQ ID NO:77)、XM_001592539.1(SS1G_06830，SEQ IDNO:78)、XM_001586999.1(SS1G_12078，SEQ ID NO:79)、XM_001553779.1(SS1G_08022，SEQID NO:80)、XM_001595070.1(SS1G_03208，SEQ ID NO:81)、XM_001594134.1(SS1G_03991，SEQ ID NO:82)、XM_001593489.1(SS1G_04966，SEQ ID NO:83)、XM_001592539.1(SS1G_06830，SEQ ID NO:84)、XM_001588997.1(SS1G_09680，SEQ ID NO:85)、XM_001586942.1(SS1G_12021，SEQ ID NO:86)、XM_001586603.1(SS1G_12640，SEQ ID NO:87)、XM_001585850.1(SS1G_12992，SEQ ID NO:88)、XM_001585413.1(SS1G_13702，SEQ ID NO:89)或XM_001585128.1(SS1G_13746，SEQ ID NO:90)。
表13：使用双低油菜花瓣测定测得的双低油菜叶子的核盘菌感染的降低
A.损伤大小是相对于水对照(无dsRNA)而言
B.误差对应于标准偏差
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子版材料(包括例如在GenBank和RefSeq中提交的核苷酸序列，在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提交的氨基酸序列，以及对GenBank和RefSeq中注明的编码区的翻译)以引用的方式整体并入。出版物中引用的补充材料(诸如补充表、补充附图、补充材料和方法和/或补充实验数据)同样以引用的方式整体并入。如果本申请的公开内容与以引用的方式并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致，则以本申请的公开内容为准。上述详细描述和实例仅为了清楚地理解本发明。不应从中理解不必要的限制。本发明不限于所示和所述的确切细节，对于本领域技术人员而言显而易见的变型将包括在由权利要求所限定的本发明内。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示组分的量、分子量等的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，否则说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些值可以根据本发明寻求获得的所需特性而变化。最低程度上说，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围内，每个数值参数皆应至少根据报告的有效数位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含必然由其各自的测试测量中发现的标准偏差产生的范围。
除非另有说明，否则所有标题都是为了方便读者，且不应该用于限制标题后文本的含义。

Claims (34)

1.一种植物，其包含降低编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中，并且其中所述多核苷酸位于所述植物的表面上。
2.如权利要求1所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物上的所述真菌病原体的生长降低。
3.如权利要求1所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物对所述真菌病原体的抗性增加。
4.如权利要求1所述的植物，其中与不包含所述多核苷酸的对照植物相比，施用后所述真菌病原体对所述植物的叶子造成的损伤的大小降低至少3％。
5.如权利要求1所述的植物，其中所述植物病原体是油菜核盘菌或灰葡萄孢菌。
6.如权利要求1所述的植物，其中所述多核苷酸包含双链RNA(dsRNA)，其中所述dsRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上相同的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的植物，其中所述多核苷酸包含单链RNA(ssRNA)，其中所述ssRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上互补的核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的植物，其中所述多核苷酸包含至少15个核苷酸。
9.如权利要求1所述的植物，其中当将所述多核苷酸引入所述真菌病原体中并与不包含所述多核苷酸的对照真菌病原体相比时，所述多核苷酸使所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。
10.如权利要求1所述的植物，其中与不包含所述多核苷酸的对照植物上存在的对照真菌病原体相比，所述多核苷酸使存在于所述植物上的所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。
11.如权利要求1所述的植物，其中所述表面是叶子、花朵、果实、种子、蔬菜或它们的组合。
12.如权利要求1所述的植物，其中所述多核苷酸是第一多核苷酸，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区选自SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或它们的同源物，并且所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上。
13.如权利要求1所述的植物，其中所述多核苷酸是第一多核苷酸，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区选自SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或它们的同源物，并且所述第二多核苷酸由所述植物表达。
14.如权利要求1所述的植物，其中所述植物是双低油菜、芥菜、亚麻、向日葵、玉米、燕麦、棉花、亚麻荠、海甘蓝、红花、稻、向日葵、大豆、花生、油菜籽、椰子、油棕、琉璃苣、马铃薯、豌豆、菜豆、兵豆、鹰嘴豆或豆类牧草。
15.一种制备如权利要求1所述的植物的方法，所述方法包括将组合物施加于所述植物的表面，其中所述组合物包含多核苷酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述施加包括喷洒所述植物。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述施加包括将所述组合物施加于所述植物的叶子、花朵、果实、种子、蔬菜或它们的组合。
18.如权利要求15所述的方法，其中以0.1纳克多核苷酸/平方毫米(ng/mm2)的剂量施加所述组合物。
19.一种转基因植物，其包含降低编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中。
20.一种转基因植物的细胞，所述转基因植物包含降低编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中。
21.如权利要求19或20所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物上的所述真菌病原体的生长降低。
22.如权利要求19或20所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物对所述真菌病原体的抗性增加。
23.如权利要求19或20所述的植物，其中与不包含所述多核苷酸的对照植物相比，施用后所述真菌病原体对所述植物的叶子造成的损伤的大小降低至少3％。
24.如权利要求19或20所述的植物，其中所述植物病原体是油菜核盘菌或灰葡萄孢菌。
25.如权利要求19或20所述的植物，其中所述多核苷酸包含双链RNA(dsRNA)，其中所述dsRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上相同的核苷酸序列。
26.如权利要求19或20所述的植物，其中所述多核苷酸包含单链RNA(ssRNA)，其中所述ssRNA包含与所述编码区的一系列核苷酸基本上互补的核苷酸序列。
27.如权利要求19或20所述的植物，其中所述多核苷酸是至少15个核苷酸。
28.如权利要求19或20所述的植物，其中当将所述多核苷酸引入所述真菌病原体中并与不包含所述多核苷酸的对照真菌病原体相比时，所述多核苷酸使所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。
29.如权利要求19或20所述的植物，其中与不包含所述多核苷酸的对照植物上存在的对照真菌病原体相比，所述多核苷酸使存在于所述植物上的所述真菌病原体中的所述编码区的表达降低至少5％。
30.如权利要求19或20所述的植物，其中所述植物包含编码所述多核苷酸的载体。
31.如权利要求19或20所述的植物，其中所述载体被整合到植物基因组DNA中。
32.如权利要求19或20所述的植物，其中所述多核苷酸是第一多核苷酸，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665或与SS1G_06487、SS1G_01703、SS1G_05899、SS1G_02495、SS1G_11912、SS1G_07873或SS1G_09665的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上。
33.如权利要求19或20所述的植物，其中所述多核苷酸是第一多核苷酸，所述植物还包含降低编码区的表达的第二多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述第二多核苷酸位于所述植物的表面上，其中所述第二多核苷酸由所述植物表达。
34.一种用于制备如权利要求19或20所述的植物的方法，所述方法包括：
用多核苷酸转化植物的细胞以获得重组植物细胞；
从所述重组植物细胞生成转基因植物，其中所述植物包含降低编码区的表达的多核苷酸，所述编码区包含与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218或与SS1G_01703、SS1G_09665或SS1G_08218的同源物具有至少80％同一性的序列，其中所述编码区存在于真菌病原体中。
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