CN116515861B - 基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用，所述StLTPa基因的全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示。本发明揭示过表达StLTPa基因能够提高植物对真菌性病害的抗性。本发明验证了在马铃薯中过表达StLTPa基因能够显著提高马铃薯对晚疫病、灰霉病以及黑胫病的抗性。StLTPa基因编码的StLTPa蛋白在体外能够抑制致病疫霉菌、灰霉菌的孢子萌发以及黑胫病菌的生长。本发明为马铃薯抗病品种培育提供了新的技术思路，利用StLTPa基因改良马铃薯的抗病性状，能够培育出抗马铃薯晚疫病的转基因作物新品种。

Description

基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及StLTPa基因在植物抗病性中的应用，具体涉及基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用。
背景技术
马铃薯为茄科茄属，是重要的粮蔬兼用作物。马铃薯易感染真菌病、细菌病和病毒病等病害，其中真菌病包括：晚疫病、疮痂病以及早疫病等，由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病（Potato late blight）是一种严重威胁马铃薯健康生长和其产业发展的毁灭性病害，具有侵染次数频繁、发病范围广，且潜育期较短的特点。由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病以及由黑胫病菌（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense）引起的黑胫病对马铃薯的生长也有较大的威胁。
在植物和微生物互作过程中，为了能够适应环境变化，植物体内协同进化出多层次的防御机制，植物体内在感知外界刺激后，会诱导基础防卫反应，包括病程相关蛋白（Pathogenesis related proteins，PRs）的快速诱导、细胞壁加厚、胼胝质、蛋白酶抑制剂和抗菌素的累积以及活性氧的产生。PR蛋白家族具有广泛且重要的生物学功能，部分PR蛋白具有葡聚糖苷酶、过氧化物酶、核酸酶、草酸氧化酶、蛋白酶抑制剂等活性，在植物抵御外界不良环境中发挥着非常重要的作用。植物非特异性脂转运蛋白（non-specific lipid transfer protein，nsLTPs）属于PR14家族蛋白，是一类重要的生物活性物质，在调节植物生长发育、信号转导、响应逆境胁迫过程中具有重要的作用。此外，nsLTPs能够响应病原菌诱导表达，并对不同类型病原菌具有广谱抗性，且可以诱导植物免疫应答的发生。
目前对于马铃薯晚疫病的防治方法主要为化学药剂防治。目前生产上对于晚疫病的防控高度依赖化学农药，但伴随着病原菌抗药性的产生、植物与病原微生物协同进化、以及有效抗病资源有限、抗病品种培育难度较大等问题的出现，以及晚疫病菌毒性变异频繁，使得品种抗病性丧失问题突出，故从分子水平挖掘马铃薯的抗病基因，并解析它们的调控机制，进而培育广谱性抗病品种具有重要的意义。目前关于抗马铃薯晚疫病的种质资源非常有限，而且马铃薯存在种间杂交障碍，使得马铃薯抗病育种困难，马铃薯抗病品种会因为病菌的生理小种改变而丧失使用价值，造成抗病品种的使用年限受限。因此培育具有广谱性、持久抗病性的马铃薯品种有重要意义。
发明内容
为防治马铃薯晚疫病并减少化学药剂使用导致的各类问题，本发明提出基因StLTPa及其编码蛋白在马铃薯抗病性中的应用。通过挖掘在致病疫霉菌入侵马铃薯的防御反应中起正调控作用的抗病基因，并开展基因功能研究，成功克隆出一种编码脂质转运蛋白的基因StLTPa。本发明丰富了马铃薯抗病基因资源，为利用该抗病基因创制马铃薯抗病材料防控马铃薯晚疫病提供新路径。
为实现本发明的技术目的，一方面，本发明提供基因StLTPa在马铃薯抗病中的应用，基因StLTPa的全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，过表达StLTPa基因能够提高马铃薯对真菌性病害的抗性，StLTPa基因在马铃薯中受致病疫霉菌侵染后上调表达。
进一步，本发明从致病疫霉菌Pi14-3-GFP诱导的本氏烟草胞间液蛋白中鉴定及茄科数据库（https://solgenomics.net/）比对到三个马铃薯脂质转运蛋白，以被致病疫霉菌侵染马铃薯叶片的RNA反转录得到的cDNA作为模板对其进行克隆，并利用农杆菌介导的瞬时表达系统和离体叶片接种技术鉴定到一个抗性较强的抗病基因StLTPa，所述基因StLTPa编码的脂质转运蛋白其氨基酸序列由茄科数据库获得，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，本发明通过提取马铃薯叶片的RNA反转录后得到cDNA，经过茄科数据库获取编码脂质转运蛋白的StLTPa基因编码区（CDS）完整序列，PCR扩增后得到含有StLTPa基因全长编码框的DNA片段，经过双酶切反应以及大肠杆菌感受态细胞克隆后，提取质粒测序，得到编码马铃薯脂质转运蛋白的基因StLTPa的全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，本发明检测了StLTPa基因在致病疫霉菌侵染下的表达模式，得知所述基因StLTPa受致病疫霉菌侵染诱导表达。本发明提供了StLTPa基因过表达的转基因马铃薯的培育并且验证了在马铃薯中过表达StLTPa基因能够显著提高马铃薯对晚疫病、灰霉病以及黑胫病的抗性，利用StLTPa基因能够改良植物的抗病性状，培育出抗病转基因植物新品种。
进一步，本发明将重组质粒转化农杆菌，采用农杆菌介导法将StLTPa基因过表达载体导入到转化材料中，经过诱导愈伤组织、利用卡纳霉素抗性筛选愈伤组织、芽分化、生根等步骤最终获得马铃薯转基因植株，实现所述基因StLTPa在马铃薯植株体内的过表达。经PCR鉴定以及逆转录PCR（RT-PCR）可知，StLTPa基因被成功的转入到马铃薯材料中，并且产生了相对野生型更高的StLTPa转录表达量，提高马铃薯植株对外源病菌的防御能力。
进一步，本发明通过对过表达StLTPa基因的转基因马铃薯进行抗病性鉴定得知，过表达StLTPa基因能够提高马铃薯植株对引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌（Phytophthora infestans）、引起灰霉病的病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）和引起黑胫病的黑胫病菌（Pectobacterium carotovorum）的抗性。获得具有广谱抗病性的马铃薯种质材料。
另一方面，本发明请求保护抑菌蛋白在植物体抑菌方面的应用，抑菌蛋白由StLTPa基因编码，StLTPa基因全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，StLTPa基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，抑菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；抑菌蛋白在植物体中能够抑制致病疫霉菌、灰霉菌的孢子萌发以及黑胫病菌的生长发育。
进一步，本发明发现StLTPa为病程相关类抑菌蛋白，利用大肠杆菌原核表达系统获得了StLTPa蛋白，所述StLTPa纯化蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。经过验证得知脂质转运蛋白StLTPa可显著抑制致病疫霉菌和灰霉菌的孢子萌发，并且抑制黑胫病菌的生长。
进一步，本发明检测了脂质转运蛋白StLTPa在本氏烟草上对致病疫霉菌和灰霉菌的防效试验，得知脂质转运蛋白StLTPa接种与本氏烟草植株后，所述植株对于致病疫霉菌和灰霉菌侵染寄主的能力有显著防治的效果。
还有，本发明请求保护过表达StLTPa基因在马铃薯抗病种质资源材料的选育和创制中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：
本发明通过基因工程鉴定及导入抗病相关基因来提高植物抗性，与传统抗病育种技术相比，可以突破种间生殖障碍和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内可以实现目标性状的定向改良，为农作物提供更广谱，持久的保护。本发明通过基因功能研究，发现马铃薯脂质转运蛋白在致病疫霉菌入侵马铃薯的防御反应中起正调控作用，即StLTPa基因的过表达能够提高马铃薯抗晚疫病、灰霉病、黑胫病的能力。使其具有广谱抗病性。
本发明利用原核表达系统在体外获得StLTPa蛋白，同时发现所述基因StLTPa编码的脂质转运蛋白为病程相关类抑菌蛋白，当浓度为5uM时即可有效抑制致病疫霉菌以及灰霉菌的孢子萌发，能够显著抑制黑胫病菌的生长。本发明还发现了StLTPa在防治马铃薯晚疫病、灰霉病等植物病原真菌的新用途，表明StLTPa作为一种抗菌肽具有较好的广谱性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1为编码脂质转运蛋白的基因StLTPa的琼脂糖凝胶电泳图。StLTPa-1和StLTPa- 2分别为从马铃薯cDNA中扩增的目的基因片段；marker为DNA分子量标准MarkerIII，大小为200bp-5000bp。
图2为Desiree马铃薯接种致病疫霉菌Pi14-3-GFP后，StLTPa基因在不同时间点的表达模式图。hpi（hours post inoculation）代表接种后。
图3为StLTPa基因过表达的转基因马铃薯植株株系的PCR鉴定结果图。LTPa-5、LTPa-6以及LTPa-7分别为三个独立的StLTPa过表达马铃薯转基因株系的PCR扩增条带；Desiree为野生型植株对照；Positive为质粒阳性对照；marker为DNA分子量标准MarkerIII，大小为200bp-5000bp。
图4为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株株系的RT-PCR结果图。Desiree为野生型植株对照；StLTPa-5~7为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株株系。
图5为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株叶片接种致病疫霉菌14-3-GFP的表型鉴定结果图。A为表型拍摄图；B为病斑面积统计图；Desiree为野生型植株对照；StLTPa-5~7为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株株系。
图6为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株叶片接种灰霉菌B05.10的表型鉴定结果图。其中，A为表型拍摄图；B为病斑面积统计图；Desiree为野生型植株对照；StLTPa-5~7为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株株系。
图7为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株叶柄接种黑胫病菌strain212的表型鉴定结果图。其中，A为表型拍摄图；B为病斑面积统计图；MES为空白对照；Desiree为野生型植株对照；StLTPa-5~7为StLTPa基因在马铃薯中过表达的三个转基因植株株系。
图8为利用大肠杆菌原核表达系统在体外纯化融合GST标签的StLTPa蛋白以及对照GFP蛋白的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶电泳。
图9为StLTPa蛋白在体外抑制致病疫霉菌、灰霉菌孢子萌发以及黑胫病菌生长发育的验证图。A为StLTPa基因编码的脂质转运蛋白StLTPa和致病疫霉菌的孢子以及灰霉菌的孢子孵育表型图；B为致病疫霉菌孢子萌发率统计图；C为灰霉菌孢子萌发率统计图；D为脂质转运蛋白StLTPa对于黑胫病菌生长影响的吸光度折线统计图；GST-GFP为阴性对照。
图10为脂质转运蛋白StLTPa在体外对于致病疫霉菌和灰霉菌侵染植物的防治效果图。其中，A和C为表型拍摄图；B和D为病斑面积统计图。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例提供了编码脂质转运蛋白的编码基因StLTPa的分离与克隆方法，具体包括以下步骤：
1、脂质转运蛋白的编码基因StLTPa的鉴定
在本氏烟草上接种致病疫霉菌Pi14-3-GFP 0h和24h后，通过分离胞间液蛋白，利用三合一超高分辨组合液质联用仪（Ultra-High Resolution LC-MS）进行质谱分析，鉴定到6个显著诱导的脂质转运蛋白，通过在茄科数据库（https://solgenomics.net/）比对到3个马铃薯脂质转运蛋白，以被致病疫霉菌侵染马铃薯叶片的RNA反转录得到的cDNA作为模板对其进行克隆，并利用农杆菌介导的瞬时表达系统和离体叶片接种技术鉴定到一个抗性较强的抗病基因StLTPa。所述基因StLTPa编码的脂质转运蛋白其氨基酸序列由茄科数据库获得，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、基因StLTPa的核苷酸序列
使用RNA试剂盒（购于天根生化科技北京有限公司，货号DP419）提取马铃薯（品种为：Desiree）叶片的RNA；使用反转录试剂盒（购于Accurate Biotechnology，货号AG11728）获得cDNA。根据茄科数据库获取编码脂质转运蛋白的StLTPa基因编码区（CDS）完整序列，用Primer Premier5软件设计基因特异性引物。采用引物StLTPa-XhoIF1（5'-CCGCTCGAGATGGAAATGGTTAGTAAAATTGCA-3'）和StLTPa-HindIIIR1（5'-CCCAAGCTTCTGGACCTTGGAGCAGTCAG-3'）进行PCR扩增，扩增产物为含有StLTPa基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃补充延伸5min。4℃保存。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。如图1所示，基因StLTPa编码区序列大小符合预期。
利用胶回收试剂盒（购于天根生化科技北京有限公司，货号DP214-02）回收目的基因片段。将融合绿色荧光蛋白（GFP）标签的pART27载体使用XhoI和HindIII进行双酶切反应，与XhoI和HindIII双酶切的的StLTPa全长片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，检测阳性克隆并过夜摇菌，提取质粒命名为StLTPa-pART27-GFP，测序（杨凌奥科生物技术公司）得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时获得连接StLTPa全长基因的StLTPa-pART27-GFP植物表达载体。
实施例2
本实施例提供了基因StLTPa响应致病疫霉菌侵染的表达模式，具体包括以下步骤：
提取被致病疫霉菌侵染0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h的Desiree马铃薯叶片的RNA，并反转录成cDNA，将这些cDNA作为模板，以马铃薯Stactin作为内参基因，内参基因（qRT-Stactin-F：5'-AGCACCCTGTTCTGCTCACT-3'和qRT-Stactin-R：5'-GCACAGCCTGAATAGCAACA-3'），利用StLTPa基因特异性引物（qRT-Stactin-F：5'-TGGCTCCTTGCCTCCCTTATC-3'和qRT-Stactin-R：5'-TTACGCCACAAACGCTAGGGAT-3'）进行实时荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。得到基因StLTPa在不同时间点响应致病疫霉菌的表达模式（图2）。
由图2可知，StLTPa基因能被致病疫霉菌侵染所诱导，表明StLTPa基因是一个与马铃薯抗病防御反应相关的基因。
实施例3
本实施例提供了StLTPa基因过表达的转基因马铃薯的培育，具体包括以下步骤：
将测序正确的StLTPa-pART27-GFP重组质粒转化农杆菌（菌株编号为：GV3101）。以Desiree马铃薯茎段作为外植体材料，采用农杆菌介导法将StLTPa基因过表达载体导入到转化材料中，经过诱导愈伤组织、利用卡纳霉素抗性筛选愈伤组织、芽分化、生根等步骤最终获得马铃薯转基因植株。选取三个独立的StLTPa基因过表达的转基因马铃薯纯合植株。进行PCR鉴定（图3）以及RT-PCR（图4）。
由图3和图4可知，StLTPa基因被成功的转入到马铃薯材料中，并且产生了相对野生型更高的StLTPa转录表达量。
实施例4
本实施例提供了StLTPa基因过表达的转基因马铃薯的抗病性鉴定，具体包括以下步骤：
以野生型Desiree马铃薯植株为对照。在培养箱中，按照23℃、16h和16℃、8h的光照与黑暗周期模式进行培养，生长苗龄三周左右，取用生长点往下第4位到第6位完全展开的马铃薯叶片，利用离体叶片接种技术，将叶柄处用湿水脱脂棉轻轻包裹，放于铺有湿滤纸的塑料白盘中，在叶背部接种1000个左右的致病疫霉菌Pi14-3-GFP游动孢子，根据叶片的大小选择接种1~2个点，保鲜膜密封放于16℃培养箱观察3~4d，发病后量取病斑直径并拍照记录（图5），T检验显著性分析病斑面积（“**”为P＜0.01，表示差异极显著），生物学重复三次。
在StLTPa基因过表达的转基因植株叶片上接种腐生型病原真菌灰霉菌B05.10的孢子，以野生型Desiree马铃薯植株作为对照，采用离体叶片接种技术，在叶背面接种200个左右的孢子，放置于23℃、相对湿度（RH）90%的环境下观察2~3d，发病后量取病斑直径并拍照记录（图6），T检验显著性分析病斑面积（“**”为P＜0.01，表示差异极显著），生物学重复三次。
将黑胫病菌strain 212在胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA培养基）上划线，放置于28℃下暗培养36h，然后用MES溶液洗涤菌板上的黑胫病菌菌体，混合均匀后用分光光度计测定菌悬液的OD600，并利用MES溶液稀释至工作液浓度（OD600=0.1）备用。选取苗龄5周的马铃薯植株第4片到第6片完全展开叶的叶柄，将叶柄切割为同一高度，然后将叶柄插入到装有40mL OD600=0.1的MES稀释菌悬液的组培瓶中，空白对照组装有40mL不含菌液的MES溶液中，盖上组培盖，将组培瓶放到23℃、16h/8h（光/暗）的光照培养箱进行培养观察。48h发病后用游标卡尺测量发病高度。
由图5可知，StLTPa基因过表达转基因马铃薯叶片上的病斑面积显著小于野生型对照植株，表明StLTPa基因过表达能够增强马铃薯对于晚疫病的抗性。由图6可知，StLTPa基因过表达转基因马铃薯叶片上的病斑面积显著小于野生型对照植株，表明StLTPa基因过表达能够增强马铃薯对于灰霉病的抗性。由图7可知，StLTPa基因过表达转基因马铃薯叶柄上的病斑高度显著小于野生型对照植株，表明StLTPa基因过表达能够增强马铃薯对于黑胫病的抗性。
实施例5
本实施例提供了脂质转运蛋白StLTPa在体外的纯化获得，具体包括以下步骤：
利用SignalP5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP -5.0/）预测到脂质转运蛋白（StLTPa蛋白）有信号肽，故将去掉信号肽的基因StLTPa利用BamH1和SaL1R酶切位点连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1上，形成GST-StLTPa质粒，以GST-GFP质粒为对照，将这些原核表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达，超声裂解后，通过Glutathione Beads 4FF（购于天地人和生物科技有限公司，型号：SA010025）进行蛋白纯化，得到纯化蛋白StLTPa后经超滤更换缓冲液和浓缩蛋白，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术检测蛋白纯化情况（图8）。所述StLTPa纯化蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。由图8可知，所有目的蛋白都得到较好的纯化。
实施例6
本实施例提供了脂质转运蛋白StLTPa在体外抑菌效果的检测，具体包括以下步骤：
用灭菌牙签划取致病疫霉菌Pi14-3GFP的小菌块，将有菌丝的一面贴近黑麦蔗糖琼脂培养基（Rye sucrose agar，RSA）进行活化，于16℃培养9~12d，待菌丝长满整板时，加入4mL预冷的ddH2O置于4℃冰箱诱孢，1.5~2h后在显微镜下观察游动孢子的释放，用H2O稀释至孢子溶液中孢子浓度为500个/μL，在涡旋仪上振荡，使游动孢子休眠，然后加入GST-StLTPa纯化蛋白使其终浓度为5μM，于16℃处理5h后，利用光学显微镜进行观察和统计（图9A、图9B），以加入GST-GFP作为对照组。
将灰霉菌B05.10接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）上，于23℃、12h/12h(光/暗）培养5d。用无菌水将培养基上灰霉菌的孢子洗脱，然后用三层滤纸过滤，3000rpm离心5min后，用无菌水重新悬浮至孢子溶液中孢子浓度为1×103个/μL，然后加入GST-StLTPa纯化蛋白使其终浓度为5μM，于23℃处理5h后，利用光学显微镜进行观察和统计（图9A、图9C），以加入GST-GFP作为对照组。
将黑胫病菌strain 212接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB培养基）上，放置于28℃水平摇床，200rpm过夜培养，然后使用离心机，3000×g离心5min，收集菌体后，用MES溶液重悬菌体，然后用分光光度计测定菌悬液的OD600值，然后加入GST-StLTPa纯化蛋白，使其终浓度为5μM，以加入GST-GFP蛋白、缓冲液buffer以及TSB培养基作为对照，菌悬液的初始OD600为0.1，放置于28℃静置培养，每间隔1d利用酶标仪测量OD600值一次，统计折线图（图9D）。
由图9A、图9B和图9C可知，GST-GFP处理中大部分孢子均已萌发，而经过5μM GST-StLTPa纯化蛋白处理后，致病疫霉菌的孢子萌发率显著降低，灰霉菌的孢子基本不萌发，表明GST-StLTPa纯化蛋白能够明显抑制致病疫霉菌以及灰霉菌孢子的萌发。
由图9D可知，经过5μM GST-StLTPa纯化蛋白处理后，黑胫病菌的OD600明显降低，而经过GST-GFP蛋白处理、缓冲液buffer处理后的黑胫病菌生长情况与TSB培养基处理的黑胫病菌生长情况没有显著性差异，表明GST-StLTPa纯化蛋白能够显著抑制黑胫病菌的生长，GST-GFP蛋白处理和缓冲液buffer处理对黑胫病菌的生长无影响。
上述结果表明脂质转运蛋白StLTPa是一个广谱抑菌蛋白，在体外可抑制致病疫霉菌、灰霉菌以及黑胫病菌的生长繁殖。
实施例7
本实施例提供了脂质转运蛋白StLTPa在植物上对致病疫霉菌和灰霉菌的防效试验，具体包括以下步骤：
致病疫霉菌和灰霉菌的孢子溶液制备方法同实施例6，将致病疫霉菌的孢子和灰霉菌的孢子分别与GST-StLTPa纯化蛋白孵育后接种到寄主植物本氏烟草上，GST-GFP蛋白作为阴性对照，在2d后统计灰霉菌的侵染效果以及在5d后统计致病疫霉菌的侵染效果（图10），T检验显著性分析病斑面积（“**”为P＜0.01，表示差异极显著），生物学重复三次。
由图10可知，本氏烟草上致病疫霉菌的病斑面积GST-GFP处理远大于GST-StLTPa蛋白处理，本氏烟草上灰霉菌的病斑面积GST-GFP处理远大于GST-StLTPa蛋白处理，表明脂质转运蛋白StLTPa能够显著抑制致病疫霉菌和灰霉菌侵染植物，具有较好的防治效果。
综上所述，本发明从晚疫病菌侵染植物的分泌组蛋白中鉴定到一个显著诱导的StLTPa蛋白。采用实时荧光定量PCR技术，分析StLTPa基因在晚疫病菌侵染下的表达模式，得出StLTPa基因的表达受致病疫霉菌显著诱导。在马铃薯中过表达StLTPa基因，能够显著增强马铃薯对于致病疫霉菌、灰霉菌和黑胫病菌的抗性。本发明还发现StLTPa为病程相关类抑菌蛋白，利用大肠杆菌原核表达系统获得了StLTPa蛋白，验证了脂质转运蛋白StLTPa可显著抑制致病疫霉菌和灰霉菌的孢子萌发，并且抑制黑胫病菌的生长。检测了脂质转运蛋白StLTPa对于致病疫霉菌和灰霉菌侵染寄主的能力有显著防治的影响。可以利用该基因改良马铃薯的抗病性状，培育出优质的马铃薯抗病转基因植物新品种。
如上所述，较好的描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。上述实施例和说明书仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (7)

1.StLTPa基因在马铃薯抗病性中的应用，其特征在于，通过过表达所述StLTPa基因提高马铃薯对真菌性病害的抗性，所述StLTPa基因全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示；
所述真菌为致病疫霉菌Phytophthora infestans、灰霉菌Botrytis cinerea以及黑胫病菌Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌性病害为晚疫病、灰霉病和黑胫病中的任一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述StLTPa基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述StLTPa基因在马铃薯中受致病疫霉菌侵染后上调表达。
5.抑菌蛋白在植物体抑菌方面的应用，其特征在于，所述抑菌蛋白由权利要求1所述的StLTPa基因编码，所述StLTPa基因全长开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，所述StLTPa基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抑菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述植物体为马铃薯；
所述抑菌为抑制致病疫霉菌Phytophthora infestans、灰霉菌Botrytis cinerea以及黑胫病菌Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑菌蛋白在植物体中能够抑制致病疫霉菌、灰霉菌的孢子萌发以及黑胫病菌的生长发育。
7.一种马铃薯抗病种质资源材料的选育和创制方法，其特征在于，在马铃薯中过表达权利要求1所述的StLTPa基因。
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