CN114438258B - 一种用于茭白植物幼苗选育的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于茭白植物幼苗选育的方法。所述方法为：提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板；使用荧光定量PCR方法进行检测，检测使用的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的反向引物；MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示；根据T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量的比值预测茭白植物成熟期的表型，进行茭白植物幼苗的选育。通过分析茭白植物茎节或茎尖组织中T型与MT型菰黑粉菌的含量，可以有效预测其未来是否会形成灰茭或雄茭，从而优化茭白育苗过程，减少经济损失。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种用于茭白植物幼苗选育的方法。
背景技术
茭白作为一种水生蔬菜在中国已有2000多年历史，种植广泛，尤以江浙地区种植面积最大，是我国仅次于莲藕的第二大水生蔬菜。菰黑粉菌侵染是诱导植物茎部膨大形成可食用肉质茎的关键因素。茭白在田间生产中存在正常茭、灰茭和雄茭三种表型。人们日常所食用的是植物白色的肉质茎，即正常茭白；灰茭的肉质茎中菰黑粉菌形成大量的黑色冬孢子，会引起过敏性肺炎，不宜食用；雄茭中不含菰黑粉菌，茎部无法膨大形成可食用肉质茎，且可以抽穗开花。在田间种植过程中，灰茭和雄茭都需要及时清除，否则不仅不具有经济价值，还会影响正常茭的种植和品质。
前期研究表明，灰茭和正常茭的形成是由不同类型的菰黑粉菌侵染导致的。菰黑粉菌分为T型和MT型两类，T型菰黑粉菌侵染植物后，植物结灰茭；MT型菰黑粉菌侵染植物后，植物结正常茭(Yang,HC.Formation and Histopathology of Galls Induced byUstilago esculenta in Zizania latifolia.Phytopathology.1978,68(11).Zhang YF,Cao QC,Hu P,et al.Investigation on the differentiation of two Ustilagoesculenta strains-implications of a relationship with the host phenotypesappearing in the fields.BMC Microbiol,2017,17(1):228.)。张雅芬等人利用单倍体分离技术从植物中分离得到菰黑粉菌后进行观察，实验表明T型和MT型菰黑粉菌之间在碳源、氮源利用、生长速率等各个方面均存在较大差异；并且MT型菰黑粉菌存在一定的发育缺陷，MT型菰黑粉菌在人工接种的条件下无法顺利侵染植物组织(Zhang YF,Cao QC,Hu P,etal.Investigation on the differentiation of two Ustilago esculenta strains-implications of a relationship with the host phenotypes appearing in thefields.BMC Microbiol,2017,17(1):228.You W,Liu Q,Zou K,et al.Morphological andmolecular differences in two strains of Ustilago esculenta.Curr Microbiol,2011,62(1):44-54.)。
传统的茭白种植及育苗以经验为主。例如，部分种植户不对茭白苗进行筛选和处理，导致田间灰茭和雄茭的比例逐年升高，严重影响经济效益。目前，茭白种植过程中减少灰茭比例的方式主要包括两种：首先，每年收获时若发现灰茭和雄茭的茭白植物，则立即将该植物铲除，减少其向周围扩散的风险；其次，通过每年的育苗，选择后代灰茭比例较低的育苗方法进行育苗，目前的育苗方法包括茭墩育苗和薹管育苗等。
然而，无论是茭墩育苗还是薹管育苗，育苗过程都缺乏可靠的理论指导，不同种植地以及不同农户多根据经验进行选育，根据具体操作的不同，田间的灰茭比例也各不相同。其主要原因是育苗过程缺少相关依据，幼苗选育的效果好坏往往需要等到几个月后茭白结茭收获时才能知道。整个过程反馈时间过长，不利于茭白育苗时决策的制定，并且前一批育苗的好坏将会影响接下来的茭白植物育苗。因此亟需一种可以在茭白植物育苗早期即可预测正常茭、灰茭及雄茭形成的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于茭白植物幼苗选育的方法，在茭白植物育苗的早期预测植物是否会形成灰茭或雄茭，辅助茭白植物育苗。
本发明提供了一种用于茭白植物幼苗选育的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明提供了一种用于茭白植物幼苗选育的探针，所述探针包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的检测MT型菰黑粉菌使用的探针和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的检测T型菰黑粉菌使用的探针。
本发明提供了一种用于茭白植物幼苗选育的试剂盒，包括如权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。
本发明提供了一种茭白植物幼苗选育的方法，包括以下步骤：
(1)提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板；
(2)使用荧光定量PCR方法进行检测，检测使用的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；MT型菰黑粉菌检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，T型菰黑粉菌检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)根据MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌含量检测结果，选育T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量的；
(4)根据步骤(3)中预测的茭白植物成熟期的表型进行茭白植物幼苗的选育。
优选的，步骤(1)中待检测样品为植物茎节，待检测样品取自幼苗萌发后的第7-14天；步骤(3)和步骤(4)中，选育Log2(T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量)等于或小于-3.77，且Log2(T型菰黑粉菌含量)不低于1.51，Log2(MT型菰黑粉菌含量)不低于1.37的茭白植物为幼苗。
优选的，步骤(1)中待检测样品为植物茎尖，待检测样品取自幼苗萌发后的第7-14天；步骤(3)和步骤(4)中，选育Log2(T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量)等于或小于-0.78，且Log2(T型菰黑粉菌含量)不低于0.14，Log2(MT型菰黑粉菌含量)不低于0.25的茭白植物为幼苗。
优选的，步骤(4)中使用中上部的薹管进行育苗。
本发明的有益效果：
在田间育苗过程中，通过分析茭白植物茎节或茎尖组织中T型与MT型菰黑粉菌的含量与比例，可以在早期有效预测其未来是否会形成灰茭或雄茭。从而优化茭白育苗过程，减少灰茭和雄茭造成的经济损失。
附图说明
图1为菰黑粉菌系统发育树构建图；其中，图中圆形标志表示分离自正常茭白的菰黑粉菌；三角形标志表示分离自灰茭的菰黑粉菌。灰色方框中的菰黑粉菌接种至茭白植物后，无法正常侵染植物；灰色方框之外的菰黑粉菌接种至茭白植物后，菰黑粉菌可以顺利侵染植物并在膨大植物组织中累计黑色冬孢子，即形成灰茭。
图2为育苗14天后茭白植物茎尖组织中菰黑粉菌含量分布图；其中，A：MT型菰黑粉菌含量分布图；B：T型黑粉菌含量分布图；C：T型与MT菰黑粉菌含量比值分布图。
图3为育苗14天后茭白植物茎尖组织中T型与MT型菰黑粉菌含量关系图。
图4为育苗14天后茭白植物茎节组织中菰黑粉菌含量分布图；其中，A：MT型菰黑粉菌含量分布图；B：T型黑粉菌含量分布图；C：T型与MT菰黑粉菌含量比值分布图。
图5为育苗14天后茭白植物茎节组织中T型与MT型菰黑粉菌含量关系图；其中，图中方形的点表示最终植物结正常茭，圆形点表示最终植物结灰茭，三角形点表示最终植物不结茭。
图6为不同部位薹管育苗的T型与MT型菰黑粉菌含量关系图；其中，图中方形的点表示使用上部薹管育的茭白植物，三角形点表示中部薹管育的茭白植物，圆形点表示下部薹管育的茭白植物。
具体实施方式
实施例1
菰黑粉菌分离、鉴定及植物侵染。
(1)实验材料
不同茭白品种的正常茭及灰茭采集自浙江金华、余姚、嘉兴、丽水、台州以及江苏苏州等地。YEPS培养基(包含10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L蔗糖)购自北京索莱宝生物科技有限公司。氨苄霉素、卡那霉素购自上海生工生物技术有限公司。
(2)菰黑粉菌单倍体分离与鉴定
a.分别挑取正常茭白与灰茭肉质茎中的灰色孢子堆，无菌水稀释至1×104个/mL，均匀涂布于YEPS固体培养基上，28℃培养；
b.24h后无菌水冲洗培养平板，将混合液稀释至菌体浓度为1×103个/mL，转移至显微超净工作台；
c.取1μL稀释液观察,在显微操作系统下通过毛细吸管吸取单个单倍体至YEPS固体平板，28℃培养3-5天；
d.单个单倍体在YEPS平板上长出肉眼可见菌落后，分别挑取单倍体划线培养；
e.两两单倍体之间进行融合实验，观察是否有肉眼可见的白色气生菌丝。
可以形成白色气生菌丝的两个单倍体即为性亲和的单倍体。共计从20个品种的茭白中分离得到36对性亲和的单倍体菌株。
(3)菰黑粉菌侵染实验
将两个性亲和的单倍体菌株分别在YEPS液体培养基中培养至OD600为0.8～1.0之间。离心去除培养基后将单倍体用无菌水重悬，并将两个性亲和的单倍体按1:1比例混合，最终浓度为OD600＝2.0。然后使用1mL注射器将性亲和的混合菌液注射至茭白幼苗的茎部，处理后将植物于白昼25℃(12小时)，黑夜22℃(12小时)的人工气候室中培养。约90天后观察植物结茭情况(表1)。
表1
结果表明，多数分离自正常茭白的菰黑粉菌菌株无法成功侵染茭白植物，并且无法引起植物茎部膨大，即为MT型菌株；多数分离自灰茭的菰黑粉菌菌株可以侵染植物并引起植物组织膨大，膨大组织中充满黑色冬孢子，即为T型菌株。MT型菌株在人类活动下在植物体内长期保持无性生殖，因此重新侵染植物的能力较弱；T型菌株保留了重新侵染植物的能力，可以完成单倍体-双核菌丝-冬孢子的完整生活史，并在植物组织中形成大量黑色冬孢子。
然而，部分分离自正常茭的菰黑粉菌菌株也可以侵染植物，并在植物膨大组织中积累冬孢子；反之，部分分离自灰茭的菰黑粉菌菌株无法顺利侵染植物。据此推测，植物中可能同时存在T型和MT型菰黑粉菌菌株。
实施例2
菰黑粉菌重测序分析。
(1)实验材料
植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。不同茭白品种的正常茭及灰茭采集自浙江金华、余姚、嘉兴、丽水、台州以及江苏苏州等地。菰黑粉菌菌株样品由中国计量大学浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室分离、鉴定和保存。
(2)DNA提取、测序及序列分析
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
在浙江、江苏等地共收集茭白20种，分离得到菰黑粉菌菌株36个，通过高通量二代测序获得基因组重测序数据，然后将数据分别比对至T型和MT型菰黑粉菌基因组。使用samtools、gatk等软件对各个菌株的单核苷酸多态性位点进行分析。
(3)菰黑粉菌系统发育树构建
将分析得到的单核苷酸多态性位点提取后导入MEGA 7分析软件中，并使用Maximum likelihood算法进行系统发育分析，结果如图1所示。
分析结果表明，实验室收集得到的菰黑粉菌主要可分为两大类。其中一类组内的差异较小，并且均无法成功侵染茭白植物；另一类组内差异较大，且均可以成功侵染茭白植物，植物膨大组织中充满黑色冬孢子。菰黑粉菌属于哪一类与该菌株分离自灰茭还是正常茭存在一定的相关性，但并不是绝对的，这一结果进一步说明茭白植物中可能同时存在T型和MT型两种菰黑粉菌。
实施例3
茭白植物不同部位菰黑粉菌含量检测。
(1)实验材料
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。
(2)样本采集与DNA提取
选择正常茭和灰茭的茭墩进行育苗，开始育苗后每隔一定时间分别采集植物根部、茎节和茎尖的组织提取总DNA。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
(3)荧光定量PCR检测
根据T型和MT型菰黑粉菌的ITS序列(在rDNA基因中，5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列，序列如SEQ ID No.5所示)差异，分别设计特异性探针，用于定量植物中T型和MT型菰黑粉菌的含量。
取出荧光定量PCR所需的引物和探针等主要试剂，序列如表2所示，待恢复至室温(15-25℃)，涡旋混匀后短暂离心备用；按照表3配制荧光定量PCR体系，充分混匀。
表2
表3
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| PerfectStart II Probe qPCR SuperMix | 10μL | |
| 正向引物(10μM) | 4pmol | 0.2μM |
| 反向引物(10μM) | 4pmol | 0.2μM |
| TaqMan探针1(10μM) | 4pmol | 0.2μM |
| TaqMan探针2(10μM) | 4pmol | 0.2μM |
| DNA模板 | 1μL | |
| 无酶水(Nuclease-Free Water) | 至20μL |
将反应管放入荧光定量扩增仪检测孔内。按加样顺序设置样品以及空白对照名称和位置；同时选择FAM和VIC通道检测荧光信号；设置反应程序如表4所示。
表4
(4)植物组织中菰黑粉菌含量变化
根据定量检测结果分析茭白植物不同组织中T型与MT型菰黑粉菌的相对含量，相对含量的对数如表5所示。
表5不同组织中T型与MT型菰黑粉菌的相对含量的对数
以上结果表明，植物表型与植物中T型和MT型菰黑粉菌的含量存在密切联系，灰茭中T型菰黑粉菌含量均值显著高于MT型，正常茭中MT型菰黑粉菌含量均值显著高于T型。并且在植物育苗早期即可观察到这一现象，说明可以在植物生长早期通过比较两种菰黑粉菌的含量预测植物成熟期的表型。
根据以上结果，在植物根部中，T型和MT型菰黑粉菌的含量始终较低，因此不适合用于茭白植物表型预测；在茎尖和茎节组织中，育苗前21天，两者的菰黑粉菌含量相近，21天后随着植物逐渐成熟，菰黑粉菌在茎尖中的含量逐渐升高并显著高于其在茎节中的含量。考虑到应在尽可能早期预测茭白植物表型，所以着重考虑在育苗0-21天内通过植物茎节或茎尖中菰黑粉菌含量预测植物表型的可能。在这期间内，植物茎尖和茎节组织同样适用于茭白植物表型预测。
对比灰茭和正常茭白中菰黑粉菌的含量变化，MT型菰黑粉菌在育苗的0-21内含量变化不大；而T型菰黑粉菌在7-14天内含量显著升高，并且与第21天的含量差异不大。因此认为7-14天是检测和比较植物中T型及MT型菰黑粉菌含量，并预测植物表型的最佳时间。
实施例4
茭白植物茎尖菰黑粉菌含量与茭白表型的关系。
(1)实验材料
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。
(2)样本采集与DNA提取
育苗后14天采集植物茎尖组织。由于茭白膨大茎由茎尖发育而来，当植物茎尖被采集后便无法观察其最终结灰茭还是正常茭。因此，以每个茭墩为一个实验重复，每个茭墩共育40株苗，其中20株用于DNA提取及荧光定量检测，20株用于结茭表型观察。共选择10个茭墩用于本实验。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
(3)荧光定量PCR检测
荧光定量PCR检测与实施例3所述步骤相同。
(4)植物茎尖菰黑粉菌含量与结茭表型的关系
10墩共200个样品中T型、MT型菰黑粉菌相对含量，以及T型与MT型的比例的分布如图2所示。T型、MT型菰黑粉菌含量的相关性如图3所示。结果表明，不同茎尖中T型与MT型菰黑粉菌相对含量存在较大差异。如图2A、B所示，T型和MT型菰黑粉菌含量在灰茭与正常茭白之间并没有显著差异，因此单独将T型或MT型菰黑粉菌含量作为预测茭白结茭表型的依据并不合适。由图2C和图3可知，可以根据T型和MT型菰黑粉菌含量的比值可以将茭白分为两类。综合考虑后将T型与MT菰黑粉菌的比例作为预测茭白结茭表型的依据，图2中左侧个体的Log2(T/MT)的均值为-7.54，标准差为3.38，右侧个体的Log2(T/MT)的均值为6.74，标准差为0.63。据此推测当Log2(T/MT)等于或小于-0.78时，茭白结正常茭白的概率大于99.9％(Log2(T/MT)表示Log2(T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量))。
此外，还有部分样本中T型与MT菰黑粉菌含量相对其他植物较低，Log2(T型菰黑粉菌含量)小于0.14，Log2(MT型菰黑粉菌含量)小于0.25，推测其与雄茭形成密切相关。
10个茭墩中，T型与MT型菰黑粉菌含量的比值，及其与最终茭白表型的关系如表6所示。结果表明，植物茎尖组织中T型与MT型菰黑粉菌含量的比值与茭白最终的表型存在密切关系。
表6
实施例5
茭白植物茎节菰黑粉菌含量与茭白表型的关系。
(1)实验材料
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。
(2)样本采集与DNA提取
育苗后14天采集植物茎节的组织。采集植物茎节组织不影响茭白的育苗，因此可以对每个个体进行追踪观察。育苗14天后样本采集时对各个植物进行编号，并重新将植物种植在池中。从灰茭、正常茭、雄茭的茭墩中共抽取约200株植物用于本实验。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
(3)荧光定量PCR检测
荧光定量PCR检测与实施例3所述步骤相同。
(4)植物茎节菰黑粉菌含量与结茭表型的关系
约200个样品中T型、MT型菰黑粉菌相对含量，以及T型与MT型的比例的分布如图4所示。在植物茎节组织中，菰黑粉菌含量略少于茎尖组织。T型、MT型菰黑粉菌含量的相关性及结茭表型如图5所示，图中方形的点表示最终植物结正常茭，圆形点表示最终植物结灰茭，三角形点表示最终植物不结茭。由图5可知T型、MT型两者的比例与最终植物结正常茭或灰茭密切相关。结灰茭的植物中Log2(T/MT)的均值为8.53，标准差为2.02；结正常茭白的植物中Log2(T/MT)的均值为-6.43，标准差为1.33。据此推测当Log2(T/MT)等于或小于-3.77时，植物结正常茭白的概率大于99.9％；当Log2(T/MT)等于或大于4.49时，植物结灰茭的概率大于99.9％。不结茭的植物中，T型菰黑粉菌含量均值为0.61，标准差0.45；MT型菰黑粉菌含量均值0.63，标准差0.37。因此认为，当Log2(T型菰黑粉菌含量)低于1.51，Log2(MT型菰黑粉菌含量)低于1.37时，植物不结茭的概率大于95％。
实施例6
薹管育苗过程中不同部位薹管的检测。
(1)实验材料
上下游引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；无菌无核酸酶水，PerfectStart II Probe qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；植物基因组提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。
(2)样本采集与DNA提取
将茭白薹管育苗过程中的薹管分为上、中、下三个部分，育苗14天后，每个部分分别采集植物茎节组织用于DNA提取和菰黑粉菌含量鉴定，茎尖组织继续在土里栽培并观察最终结茭表型。
使用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，DP305)，根据说明书指示步骤进行操作，最终将DNA溶解在50μL无菌水中。
(3)荧光定量PCR检测
荧光定量PCR检测与实施例3所述步骤相同。
(4)植物茎节菰黑粉菌含量与结茭表型的关系
T型、MT型菰黑粉菌含量的相关性及结茭表型如图6所示，图中方形的点表示使用上部薹管育的茭白植物，三角形点表示中部薹管育的茭白植物，圆形点表示下部薹管育的茭白植物。结果表明，上部及中部薹管中，T型/MT型菰黑粉菌含量比值较低，偶有T型菰黑粉菌含量显著高于MT型的样本，最终植物成熟后，灰茭的发生概率也较低；下部薹管中，T型菰黑粉菌含量显著高于MT型的样本的出现概率更高，最终灰茭的发生概率也更高。以上结果表明，T型/MT型菰黑粉菌含量比值与植物结茭表型密切相关，薹管育苗过程中，使用中上部的薹管进行育苗可以更好地减少田间灰茭发生。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 一种用于茭白植物幼苗选育的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
agctacccaa tttcaacacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tttagacgac cgcattacca 20
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
cagctaaccg atg 13
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
acagccaacc gatgc 15
<210> 5
<211> 654
<212> DNA
<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)
<400> 5
gcacctgtct aaataaactt gagctaccca atttcaacac ggttgcatcg gttggctgtc 60
agacagcgcg gacagagatt tttttttttt ctctgctcgc tgctgggaag gcgttcgaca 120
caatacacaa acacttttga tgatctagga tttgaatgaa agttcatttt tatgatggaa 180
ccgactggta atgcggtcgt ctaaatctaa aaaacaactt ttggcaacgg atctcttggt 240
tctcccatcg atgaagaacg cagcgaattg cgataagtaa tgtgaattgc agaagtgaat 300
catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc cggcagatct aatctgggga gcatgcctgt 360
ttgagggccg cgaattgttt cgaacgacag ctttcttctt tgcaagagag ttggcggatc 420
ggtaatgagg gtttttgcca tttaccgtgg ctccctcgaa atgcattagc gcatccattc 480
aataggcaag acggacgaaa gcttgaattt cgccctctct ttcctgccgg gttttgataa 540
tatcagggct tcggaggcag agagatgggt tagagctgga cgcaacgttt tgctggttgg 600
agtgcttctg aaacccgccc atgcccttgc aaaagggaag ggattttatt tcaa 654
Claims (2)
1.一种用于茭白植物幼苗选育的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取含有菰黑粉菌的待检测样品的DNA作为扩增模板；
(2)使用荧光定量PCR方法进行检测，检测使用的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；MT型菰黑粉菌检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，T型菰黑粉菌检测使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)根据MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌含量检测结果，根据T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量的比值预测茭白植物成熟期的表型；
(4)根据步骤(3)中预测的茭白植物成熟期的表型进行茭白植物幼苗的选育；
当步骤(1)中待检测样品为植物茎节，待检测样品取自幼苗萌发后的第7-14天，
步骤(3)和步骤(4)中，选育Log2(T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量)等于或小于-3.77，且Log2(T型菰黑粉菌含量)不低于1.51，
Log2(MT型菰黑粉菌含量)不低于1.37的茭白植物为幼苗；
当步骤(1)中待检测样品为植物茎尖，待检测样品取自幼苗萌发后的第7-14天，
步骤(3)和步骤(4)中，选育Log2(T型菰黑粉菌含量/MT型菰黑粉菌含量)等于或小于-0.78，且Log2(T型菰黑粉菌含量)不低于0.14，Log2(MT型菰黑粉菌含量)不低于0.25的茭白植物为幼苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中使用中上部的薹管进行育苗。
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| 不同茭白品种中菰黑粉菌的鉴定及ISSR 多态性分析;康璐瑶等;菌物学报;第36卷(第9期);第1211页左栏第1段至右栏第2段、第1214页左栏第2段至第1218页右栏第1段 * |
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