CN110499386A - 一种快速检测番茄枯萎病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测番茄枯萎病的方法，包括如下步骤：先提取样本的DNA；再将提取的样本的DNA进行稀释；然后以尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物进行PCR扩增；根据荧光显示确定尖胞镰刀菌的生物量，并根据尖胞镰刀菌的生物量确定植株是否感染番茄枯萎病及其病期。本发明利用寻找到的新分子靶标IGS特殊序列，最终建立其准确和快速的分子检测技术。与病原菌分离培养、生物测定、血清学等技术相比，本发明的特异性强、灵敏度高、定量准确、速度较快、闭管操作无交叉污染等特点。

Description

一种快速检测番茄枯萎病的方法

技术领域

本发明涉及一种生化检测方法，特别涉及一种番茄枯萎病的检测方法。

背景技术

现有技术中，番茄枯萎病的致病菌为番茄尖镰孢菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici Snyder et Hansen）真菌造成，该真菌分生孢子有大小两型:小型分生孢子卵形至长椭圆形，无色单胞，大小5-14×2-4.5um。大型分生孢子镰刀形或长纺钎锤形，无色，有2-3个分隔，多数为3个分隔，大小19-45×3-5um。病菌在马铃薯蔗糖培养基上，菌落白色至紫红色，除形厉大、小型的分生孢子外，并有厚垣孢子产生。厚坦孢子在菌丝上顶生或间生，圆形至椭圆形，单胞，黄褐色，大小11.2-15.0×9.5-11.2um。

该病菌存在于土壤中，也可通过带菌种子进行远距离传病，病菌多在分苗、定植时从根系伤口、自然裂口、根毛侵入，到达维管束，在维管束内繁殖，堵塞导管，阻碍植株吸水吸肥，导致叶片萎蔫、枯死。

传统的番茄枯萎病鉴定方法，主要有如下几种：

1. 番茄枯萎病病原分离与鉴定

采用常规组织分离法，从番茄病株根部切下3mm×3mm×1mm的小块，经70%酒精和1%次氯酸钠消毒后，置于PDA（马铃薯葡萄糖）培养基上，在28℃培养箱内恒温培养5-7d，并在培养皿内观察病菌形态。

2. 菌种的致病力分析

用无菌ddH₂O冲洗在PDA培养基上培养7d后的病原菌的孢子，将孢子液浓度调成1×10⁶cfu/mL的无菌丝孢子悬浮液。通过浸根法、土壤接种法、灌根法和病原菌毒素滤液浸苗法进行病原菌回接试验。接种后观察并记录发病情况。植株发病后，再次从发病植株中分离病原菌，获得纯培养，并与原接种菌进行比较，确认再分离菌株与原接种菌株在形态上的一致性。

3. 病原菌的形态学特征观察

形态鉴定：依据Booth分类系统，参考《真菌鉴定手册》（魏景超，1979），在显微镜下观察并描述其菌丝、子座及孢子等形态特征，对镰刀菌菌株进行形态学鉴定。

4. 病原菌的ITS序列同源性分析

用CTAB法提取尖胞镰刀菌的DNA，利用真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS）通用引物ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’）和ITS4（3’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-5’）进行PCR扩增。将获得的ITS序列在NCBI核酸数据库采用GeneBank数据库进行同源性分析，并构建进化树。

现有技术的不足之处在于：目前缺少尖胞镰刀菌的特异性引物，导致检测的定性和定量都比较苦难，检测速度慢，检测的准确度不够高。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测番茄枯萎病的方法，使其可以快速准确检测出快速检测番茄植株是否感染尖胞镰刀菌及其病期。

本发明提供的一种快速检测番茄枯萎病的方法，包括如下步骤：

1）通过CTAB法提取样本的DNA；

2）将提取的样本的DNA进行稀释；稀释后的浓度大于等于1ng/μL；

3）以尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物IGS1049-上游引物（5’-TGCGATTTGGACGAGATATGTG-3’）和IGS1050-下游引物(5’-ATTTGCCTACCCTGTACCTACC-3’)进行PCR扩增；

4）根据荧光显示确定尖胞镰刀菌的生物量，并根据尖胞镰刀菌的生物量确定植株是否感染番茄枯萎病及其病期。

本发明利用寻找到的新分子靶标IGS特殊序列，最终建立其准确和快速的分子检测技术。这种分析方法用于不同属真菌不同种间和种内不同群体间的比较。利用尖胞镰刀菌不同致病小种的IGS区域基因特异性序列，根据此特性设计尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物 ，快速准确检测到发病番茄植株体内的尖胞镰刀菌。该特异性引物IGS1049和IGS1050快速检测植株体内的生物量，实时定量PCR表明，该方法能够快速、准确检测番茄枯萎病病原菌生物量。本发明可以在大田试验中，对发病植株体内的番茄转化型尖胞镰刀菌进行快速有效检测与定量。与病原菌分离培养、生物测定、血清学等技术相比，本发明的特异性强、灵敏度高、定量准确、速度较快、闭管操作无交叉污染等特点。

作为本发明的进一步改进在于，步骤1）中分别提取根部、茎基部、茎中部、茎上部及叶部的样本的DNA。

作为本发明的进一步改进在于，步骤2）中将模板浓度稀释为10 ng/μL。实验结果表明常规PCR对标准DNA样品的检测下限为1 ng/μL，可见尖胞镰刀菌番茄转化型特异性引物灵敏度极高，当模板浓度稀释为10 ng/μL时，扩增产物有125 bp大小的条带，显示清晰，便于判断和识别。

作为本发明的进一步改进在于，步骤3）中进行PCR扩增时，具体做法是：在PCR试管中分别加入1μL稀释后的样品DNA，再加入2×Taq PCR MasterMix 10μL、IGS1049-上游引物0.25μL、IGS1050-下游引物0.25μL、8.5μL无菌ddH₂O，进行PCR扩增，反应程序：94℃预变性3分钟，94℃30秒，56℃退火30秒，72℃60秒，30个循环扩增，72℃延伸10分钟，然后，降温至4℃保存。

步骤4）中通过根部、茎基部、茎中部及叶部尖胞镰刀菌的生物量确定番茄枯萎病的病期。由于番茄枯萎病病原菌在番茄植株体内由下而上不断蔓延，随着时间的推移，发病严重程度不断加重，植株的各个部位病原菌的数量逐渐增多。在发病植株中，病原菌在不同部位的生物量关系为重发病植株>轻发病植株>初发病植株>健康植株。

具体而言：

当各部位检测到病原菌的生物量为0-10 pg/μL，判断为健康植株；

当植株根部和茎基部检测到病原菌的生物量相对其他部位较高时，判断为发病初期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为100-1000 pg/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 pg/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 pg/μL；

当植株根部、茎基部中病原菌的生物量明显增多，且在茎中部和茎上部检测到不同量的病原菌时，判断为轻发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为1-10 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL；

当各组织中尖胞镰刀菌的生物量急剧上升，显著增多，并且在植株各个部位组织中病原菌生物量无显著差别时，判断为重发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为10-100 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量10-100 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL。

附图说明

图1为尖孢镰刀菌生物量q-PCR灵敏度检测图。

图2为q-PCR检测不同感病等级番茄组织中病原菌生物量富集图。

图2中，R：根部（Root），SB：茎基部（Stem-base），SM：茎中部（Mid-Stem），SU：茎上部（Stem-upper），L：叶部（Leaf），0-3 scale依次对应：阴性对照组（健康植株）、发病初期、轻发病期、重发病期。

具体实施方式

实施例1

番茄枯萎病快速鉴定方法的建立，按照如下方法进行：

1、病原菌接种与样品采集：

病原菌接种：采用蘸根法进行侵染。使用无无菌ddH₂O冲洗在PDA培养基上培养7天病原菌的分生孢子，将孢子液浓度调至1.0×10⁸ 个/mL，选取生长两周左右的健康番茄幼苗进行蘸根侵染（感病品种：Moneymaker），用自来水把番茄幼苗的根冲洗干净，然后浸泡在孢子悬浮液中30 min，将侵染后的番茄苗种在营养钵中。接种后的番茄幼苗放在28°C、湿度55%~65%的培养室中，光暗交替(各12 h)继续培养，持续观察结果并拍照。

将植株发病严重程度划分等级，分别为0，1，2，3级，分别对应阴性对照组（健康植株）、发病初期、轻发病期和重发病期，使用灭菌刀片切取植株根部、茎基部、茎中部、茎上部、叶片分别取样。

2、维管束褐变观察：

为了验证番茄植株不同发病期维管束受阻和褐变情况，横切受侵染植株的根部、茎基部制作成切片，使用棉兰和苯胺蓝对切片进行染色，并置于显微镜下观察维管束组织变褐程度，确定致病及病期。

3、尖胞镰刀菌特异性引物灵敏度检测

采用灭菌刀片切取植株根部、茎基部、茎中部、茎上部、叶片分别取样。通过CTAB法提取尖胞镰刀菌的DNA，将尖胞镰刀菌DNA进行梯度稀释，将模板浓度依次稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl，在真菌核糖体基因间隔区（IGS）合成尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物，IGS1049（5’-TGCGATTTGGACGAGATATGTG-3’）和IGS1050(5’-ATTTGCCTACCCTGTACCTACC-3’)进行PCR扩增。

如图1，荧光显示，常规PCR对标准DNA样品的检测下限为1ng/μl,可见尖胞镰刀菌番茄转化型特异性引物灵敏度极高。

实施例2

通过实施例1的步骤可见，通过特异性引物可以快速鉴别番茄植株是否感染番茄枯萎病。具体方法和步骤如下：

一种快速检测番茄枯萎病的方法，步骤如下：

1）通过CTAB法提取样本的DNA；分别提取根部、茎基部、茎中部、茎上部及叶部的样本的DNA；

2）将提取的样本的DNA进行稀释；稀释后的浓度大于等于1ng/μl；优选为10ng/μl；

3）以尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物IGS1049-上游引物（5’-TGCGATTTGGACGAGATATGTG-3’）和IGS1050-下游引物(5’-ATTTGCCTACCCTGTACCTACC-3’)进行PCR扩增；进行PCR扩增时，在PCR试管中分别加入1μL稀释后的样品DNA，再加入2×TaqPCR MasterMix（生产厂家：天根生化科技（北京）有限公司，货号：KT201 ） 10μL、IGS1049-上游引物0.25μL、IGS1050-下游引物0.25μL、8.5μL无菌ddH₂O，进行PCR扩增，反应程序：94℃预变性3分钟，94℃30秒，56℃退火30秒，72℃60秒，30个循环扩增，72℃延伸10分钟，然后，降温至4℃保存。

4）根据荧光显示确定尖胞镰刀菌的生物量，并根据尖胞镰刀菌的生物量确定植株是否感染番茄枯萎病及其病期；

如图2所示，当各部位检测到病原菌的生物量为0-10 pg/μL，判断为健康植株；

当植株根部和茎基部检测到病原菌的生物量相对其他部位较高时，判断为发病初期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为100-1000 pg/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量10-100 pg/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 pg/μL；

当植株根部、茎基部中病原菌的生物量明显增多，且在茎中部和茎上部检测到不同量的病原菌时，判断为轻发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为1-10 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL；

当各组织中尖胞镰刀菌的生物量急剧上升，显著增多，并且在植株各个部位组织中病原菌生物量无显著差别时，判断为重发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为10-100 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量10-100 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量10-100 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL。

上述数值范围作为量化指标，可以判断番茄枯萎病的发病期，在不同发病期，部分量化指标是相互衔接的，而另有部分量化指标不是无缝对接的，番茄枯萎病发病是从根部开始，在茎中富集从而堵塞维管束，而地上部分，某些指标在不同的发病期会有极显著的变化，例如叶部的病原菌富集只有在发病后期，也就是重发病期会有显著上升，所以，这个时期叶片种病原菌生物量比前一个时期会极显著升高，无法从数据上无缝对接。检测中，基本不会出现量化指标的范围外的数据，例如针对健康植株和初发病植株，初发病植株根部的尖胞镰刀菌的生物量为100-1000 pg/μL，健康植株根部的尖胞镰刀菌的生物量为0-10 pg/μL，基本不会出现尖胞镰刀菌的生物量为10-100 pg/μL这样的情况。众所周知，任何一种病程都有一个发展阶段，不可能出现极端跳跃性的变化，只是出现尖胞镰刀菌的生物量为10-100 pg/μL的这一阶段的时间很短，实践中难以捕捉，只会偶然出现，如经过再次取样检测，则检测的实际数值已经不在10-100 pg/μL的范围内，因此，在确定发病期时，可以忽略该偶然情况，如果出现量化指标范围外的数据，就再次取样检测，直到检测数据符合上述量化指标。

rDNA基因间隔区（Intergenic spacer, IGS）具有丰度高、变异较快、在种内不同菌株间高度保守，种间存在丰富变化等特点。本发明利用寻找到的新分子靶标IGS特殊序列，最终建立其准确和快速的分子检测技术。这种分析方法用于不同属真菌不同种间和种内不同群体间的比较。利用尖胞镰刀菌不同致病小种的IGS区域基因特异性序列，根据此特性设计尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物 ，快速准确检测到发病番茄植株体内的尖胞镰刀菌。该特异性引物IGS1049和IGS1050快速检测植株体内的生物量，实时定量PCR表明，该方法能够快速、准确检测番茄枯萎病病原菌生物量。同时，能够实现对发病植株不同部位病原菌进行定量，结果表明发病程度越高各部位的病原菌生物量越高。基于以上结果，可以在大田试验中对发病植株体内的番茄转化型尖胞镰刀菌进行快速有效检测与定量。与病原菌分离培养、生物测定、血清学等技术相比，qPCR这种技术特异性强、灵敏度高、定量准确、速度较快、闭管操作无交叉污染等特点。

本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种快速检测番茄枯萎病的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

tgcgatttgg acgagatatg tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

atttgcctac cctgtaccta cc 22

Claims (6)

1.一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）通过CTAB法提取样本的DNA；

2）将提取的样本的DNA进行稀释；稀释后的浓度大于等于1ng/μl；

3）以尖胞镰刀菌番茄专化型特异性引物IGS1049-上游引物（5’-TGCGATTTGGACGAGATATGTG-3’）和IGS1050-下游引物(5’-ATTTGCCTACCCTGTACCTACC-3’)进行PCR扩增；

4）根据荧光显示确定尖胞镰刀菌的生物量，并根据尖胞镰刀菌的生物量确定植株是否感染番茄枯萎病及其病期。

2.据权利要求1所述的一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于：所述步骤1）中分别提取根部、茎基部、茎中部、茎上部及叶部的样本的DNA。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于：所述步骤2）中将模板浓度稀释为10ng/μL。

4.根据权利要求3所述的一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于：步骤3）中进行PCR扩增时，在PCR试管中分别加入1μL稀释后的样品DNA，再加入2×Taq PCR MasterMix 10μL、IGS1049-上游引物0.25μL、IGS1050-下游引物0.25μL、8.5μL无菌ddH₂O，进行PCR扩增，反应程序：94℃预变性3分钟，94℃30秒，56℃退火30秒，72℃60秒，30个循环扩增，72℃延伸10分钟，然后，降温至4℃保存。

5.根据权利要求4所述的一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于：所述步骤4）中通过根部、茎基部、茎中部及叶部尖胞镰刀菌的生物量确定番茄枯萎病的病期。

6.根据权利要求5所述的一种快速检测番茄枯萎病的方法，其特征在于：当各部位检测到病原菌的生物量为0-10 pg/μL，判断为健康植株；

当植株根部和茎基部检测到病原菌的生物量相对其他部位较高时，判断为发病初期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为100-1000 pg/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 pg/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 pg/μL；

当植株根部、茎基部中病原菌的生物量明显增多，且在茎中部和茎上部检测到不同量的病原菌时，判断为轻发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为1-10 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL、茎上部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量100-1000 pg/μL；

当各组织中尖胞镰刀菌的生物量急剧上升，显著增多，并且在植株各个部位组织中病原菌生物量无显著差别时，判断为重发病期；量化指标为，根部的尖胞镰刀菌的生物量为10-100 ng/μL、茎基部的尖胞镰刀菌的生物量10-100 ng/μL、茎中部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL及叶部的尖胞镰刀菌的生物量1-10 ng/μL。