CN106755507B - 鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法，其中，分子标记包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，本发明创造了区分野生黑麦和栽培黑麦染色体的差异性分子荧光原位杂交技术，可以为继续开展栽培黑麦和野生黑麦基因导入小麦，开展小麦分子育种服务。

Description

鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法
技术领域
本发明属于生物分子检测与鉴别领域，具体地说，涉及一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法。
背景技术
黑麦属(Secale，2n＝14，染色体组R)作为小麦的三级基因源，蕴藏着丰富的遗传变异，具有许多优异的农艺性状，如抗逆性强、抗白粉病、锈病、腥黑穗病和大麦黄矮病及蚜虫等多种病害，根系发达、分蘖能力强、穗大、小穗多、籽粒中赖氨酸和蛋白质含量高等，是改良普通小麦产量、抗逆性和抗病性的重要基因资源。黑麦属(Secale)有普通栽培黑麦(S.cereale)、山地黑麦(S.montanum)、非洲黑麦(S.africanum)、瓦维洛夫黑麦(S.vavilovii)和森林黑麦(S.sylivestre)等5个种。而如何将黑麦属植物的优良基因导入到普通小麦中，是近些年科研人员研究的热点(Tang ZX,Ross K,Ren ZL,Yang ZJ,ZhangHY,Chikmawati T,Miftahudin,Gustafson JP(2011)Wealth of wild species:Role inplant genome elucidation and improvement-Secale.In:Wild Crop Relatives:Genomic and Breeding Resources Cereals.Edited by Kole C.Springer.pp.367-395.)。以远缘杂交结合染色体工程结合的方法，将黑麦属优异基因导入到小麦，其中以栽培黑麦1RS.1BL易位系的育成并在全世界小麦生产中的应用，最为成功(曹新有，陈雪燕，陈朝辉，王灿国，吉万全，刘建军.2014.黑麦属优异基因在小麦改良中的研究与应用。农业生物技术学报，22：1035-1045.)。但申请者发现，转移野生黑麦物种，包括非洲黑麦、森林黑麦等野生黑麦的优异基因转移研究相对缺乏，主要由于对野生黑麦染色质在小麦背景中的准确鉴定较难，且不易与栽培黑麦染色质的有效区分(Lei MP,Li GR,Zhou L,Li CH,Liu C,Yang ZJ.2013.Identification of wheat-Secale africanum chromosome 2Rafrintrogression lines with novel disease resistance and agronomiccharacteristics.Euphytica 194(2):197-20；An D,Zheng Q,Luo Q,Ma P,Zhang H,Li L,Han F,Xu H,Xu Y,Zhang X,Zhou Y.2015.Molecular cytogenetic identification of anew wheat-rye 6R chromosome disomic addition line with powdery mildewresistance.PLoS ONE 10(8):e0134534.)。因此，如何对不同的黑麦供体物种染色体的进行准确鉴定与追踪显得十分重要。目前，相关研究只能对栽培黑麦染色体进行鉴定，不能检测和区分野生黑麦，识别具体为那一条染色体(Schneider A,Rakszegi M,Molnár-Láng M,Szakács E.2016.Production and cytomolecular identification of new wheat-perennial rye(Secale cereanum)disomic addition lines with yellow rustresistance(6R)and increased arabinoxylan and protein content(1R,4R,6R).Theoretical and Applied Genetics 129(5)：1045-1059.)。因此，迫切需要开发新型的黑麦染色体鉴定新方法，大幅度提高小麦背景中野生和栽培黑麦的鉴定效率，为分子染色体工程育种服务。
建立新型基于合成寡核苷酸分子探针的非变性荧光原位杂交(ND-FSH)分子鉴定技术，作为追踪小麦背景中外源近缘物种遗传物质的最为有效的方法，但是，现有的分子探针对野生黑麦染色体上缺乏检测能力。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法，本发明创造了区分野生黑麦和栽培黑麦染色体的差异性分子荧光原位杂交技术，可以为继续开展栽培黑麦和野生黑麦基因导入小麦，开展小麦分子育种服务。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记，包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。
本发明还提供一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，包括以下步骤：
步骤1、制备黑麦染色体标本：
步骤2、制备分子探针、工作液和杂交液：
步骤3、原位杂交：
步骤4、比对。
进一步地，步骤1中的制备黑麦染色体标本具体为：
步骤1.1、将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养。待种子萌动后，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步，24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养；培养至种子根长至1-2cm时，剪根；
步骤1.2、将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中，离心管的盖子上戳一透气孔，一氧化二氮处理2小时；
步骤1.3、用体积浓度为90％的醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；
步骤1.4、用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时；
步骤1.5、用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，于2000转/分的转速下离心10秒，尽量将酒精倒干，加100％乙酸，每个根尖20μl，用移液枪反复吸打混匀；
步骤1.6、将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴7μl细胞悬液，盖上盒盖，5分钟后镜检，制备得到制备黑麦染色体标本。
进一步地，步骤2中的制备分子探针、工作液和杂交液具体为：
所述分子探针用由生物公司利用5’末端FAM荧光标记法合成寡核苷酸序列，具体为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，纯化后用1xTE、pH8.0的Tris-EDTA缓冲液溶解，利于探针长期保存；使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合；
工作液是通过4SSc和2xTE的1:1混合，最终浓度为2SSC 1xTE，pH7.0；-20℃保存备用；
杂交液为2SSC 1xTE，pH7.0的溶液。
进一步地，步骤3中的原位杂交具体为：
步骤3.1、将合成的探针各0.3ul加入8.0ul的2XSSC 1xTE、pH7.0的杂交液之中；每张玻片加杂交液后，轻轻盖上盖玻片，在37℃湿盒中，杂交3小时以上或过夜；
步骤3.2、将杂交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液工作液中，盖玻片会自动脱落；浸泡2分钟；取出玻片用洗耳球吹干；
步骤3.3、加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，即在荧光显微镜下观察照相。
进一步地，步骤4中的比对具体为：利用荧光显微镜，通过载玻片上野生和栽培黑麦的染色体标本，在480nm至500nm波长的荧光激发下，以蓝色荧光为背景，观察野生黑麦染色体端部，具有4-20个绿色的荧光信号的为野生黑麦，具有2个以下绿色的荧光信号的为栽培黑麦。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明根据麦类植物比较基因组特征，查找前人报道的黑麦基因组序列和小麦重复序列库进行比对，寻找在栽培黑麦和野生黑麦具有不同富集特征的核苷酸序列；对在<＝58bp的核苷酸序列进行合成，并进行5’末端的荧光标记，获得寡核苷酸探针；对小麦-野生黑麦远缘杂交和染色体工程创制的后代根尖染色体进行荧光原位杂交分析；明确小麦背景中导入的野生黑麦和栽培黑麦染色体的特征，验证分子探针对黑麦属物种染色体鉴定的特异性。基于野生黑麦基因组重复序列设计的寡核苷酸探针既能检测野生黑麦染色体，又能区分栽培和黑麦染色体的特征，大幅度提高了检测目标的准确性和检测效率。
2)采用本发明公开的分子探针序列pSa193和pSyCTT，可利用非变性荧光原位杂交(ND-FISH)的方法，有效区分普通小麦、野生黑麦栽培黑麦的染色体。
3)本发明提供的分子探针和原位杂交技术可用于黑麦属物种进化研究，以及在分子标记辅助选择育种过程中快速、有效地追踪黑麦属物种的全部染色体。能加快黑麦染色体上所携带的优良性状向受体小麦品种的转移与利用，加速育种进程，提高小麦高产、优质、高效新品种选育的效率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明黑麦染色体分子检测技术的工艺流程图；
图2是本发明小麦野生黑麦和栽培黑麦片段导入系检测的中期细胞(A)和近中期细胞(B)染色体荧光原位杂交图，其中，箭头所示野生黑麦染色体末端杂交信号，三角形所示为栽培黑麦染色体末端杂交信号；
图3是本发明小麦-野生黑麦(A)双二倍体和小麦-栽培黑麦(B)双二倍体的根尖染色体荧光原位杂交图，其中，曲线部分(类似虫子)为染色体，曲线的端部的亮光部分为杂交信号段，标尺为10μm；
图4是本发明不同野生黑麦(A，B)和栽培黑麦(C，D)材料的根尖染色体荧光原位杂交图，其中，箭头所示为杂交信号。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法
1)根据麦类植物比较基因组特征，查找前人报道的黑麦基因组序列和小麦重复序列库进行比对，寻找在栽培黑麦和野生黑麦具有不同富集特征的核苷酸序列；具体为：前人对高通量测序产生的黑麦基因组序列，利用生物信息学vmatch软件(http://www.vmatch.de)与小麦基因组重复序列进行比对，发现在转座子序列的组成分布上，小麦与黑麦基因组具有显著差异，仅在栽培黑麦重复序列分布上，发现2个长度分别为200bp(如SEQ ID NO.3所示)和250bp(如SEQ ID NO.4所示)的序列，富集在栽培黑麦染色体端部和近端部。我们用串联重复序列全基因组分析程序Tandem Repeat Finder，筛选获得了190bp(如SEQ ID NO.5所示)的序列，发现在野生黑麦和栽培黑麦染色体端部的分布位置和数量有显著差异，该序列串联分布在野生黑麦染色体上，其重复数是栽培黑麦的6倍以上，可以用于合成寡核苷酸探针的荧光原位杂交检测。
2)对在<＝58bp的核苷酸序列进行合成，并进行5’末端的荧光标记，获得寡核苷酸探针；
黑麦属染色体特异寡核苷酸探针序列：
探针pSa193(5’-3’):AGTTACAGCATGCCACACGGCGAAAACAAGGAGAATAAGGCATATAGCCGCTGGAT(SEQ ID NO.1)和pSyCTT:TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC(SEQ ID NO.2)。
5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。
3)对小麦-野生黑麦远缘杂交和染色体工程创制的后代根尖染色体进行荧光原位杂交分析；
4)明确小麦背景中导入的野生黑麦和栽培黑麦染色体的特征，验证分子探针对黑麦属物种染色体鉴定的特异性。
利用pSa193探针，分别对栽培黑麦和野生黑麦利用荧光原位杂交(图2)，可以准确区分野生与栽培黑麦的染色体，其中野生黑麦染色体末端杂交信号(图2箭头所示)强于栽培黑麦杂交信号(图2三角形所示)2倍以上，可以准确区分同时导入小麦的野生黑麦和栽培黑麦片段。
实施例2检测簇毛麦3V染色体的方法
(1)染色体标本制备
A.将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养。待种子萌动后(种子冒白尖即为萌动)，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步。24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养。培养至种子根长至1-2cm左右时，剪根。
B.将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中(盖子上戳一小洞)，一氧化二氮处理2小时左右。
C.90％(体积比)醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次(如不马上做可加入70％酒精放-20℃保存)。
D.用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时。
E.用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，低速(2000转/分)离心10秒左右，尽量将酒精倒干，加100％乙酸(每个根尖约20μl)，用移液枪反复吸打混匀。
F.将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴约7μl细胞悬液，盖上盒盖，5分钟后镜检。
(2)探针制备：
A.用由生物公司利用5’末端FAM荧光标记法合成寡核苷酸序列(其序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示)，纯化后用Tris-EDTA缓冲液(1xTE，pH8.0)溶解，利于探针长期保存。
B.工作液：2SSC 1xTE(pH7.0)是最终浓度，所以其配制可以是4SSc和2xTE的1:1混合。-20℃保存备用。它即用于稀释探针，又用做杂交液。
C.杂交液：用2SSC 1xTE(pH7.0)的溶液。
(3)原位杂交(ND-FISH)
A.将合成的探针各0.3ul加入8.0ul的2XSSC 1xTE(pH7.0)杂交液之中。每张玻片加杂交液后，轻轻盖上盖玻片，在37度湿盒中，杂交3小时以上或过夜。
B.将杂交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液中，盖玻片会自动脱落。浸泡2分钟。取出玻片用洗耳球吹干。
C.加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4',6-diamidino-2-phenylindole)染色，即可以在荧光显微镜下观察照相。
(4)荧光显微镜观察
利用荧光显微镜，通过载玻片上野生和栽培黑麦的染色体标本，在480nm至500nm波长的荧光激发下，观察到在野生黑麦染色体端部，具有10个绿色的高亮度的荧光信号(对应图中的亮点，荧光信号亮度与190b重复序列的拷贝数呈正相关)(图3A)，而在栽培黑麦染色体端部上，只有2个绿色的荧光信号的(对应图中的亮点)(图3B)，普通小麦没有绿色杂交信号，只显示背景的蓝色荧光。结果如图3所示，即通过计算有关信号的数量来鉴定野生与栽培的黑麦染色体组；即在栽培黑麦杂交信号在2个以下，野生黑麦的信号分布在4-20个。
实施例3构建各类黑麦属染色体核型、快速鉴定小麦-黑麦染色体(片段)
利用pSa193探针，分别对2个栽培黑麦和2个野生黑麦为材料，参照示例2的荧光原位杂交流程，获得了不同来源的栽培黑麦品种I(图4A)，栽培黑麦品种II(图4B)，野生黑麦材料I(图4C)，野生黑麦材料II(图4D)的染色体核型，从箭头所示的杂交信号和位置上，2个栽培黑麦没有信号，野生黑麦获得了4个和9个信号，因此能够准确区分不同的野生黑麦和栽培黑麦的染色体。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 电子科技大学
<120> 鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agttacagca tgccacacgg cgaaaacaag gagaataagg catatagccg ctggat 56
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcttcttct tcttcttctt cttcttc 27

Claims (6)

1.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针组合为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记的分子探针组合，其特征在于，所述分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。
3.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备黑麦染色体标本：
步骤2、制备分子探针、工作液和杂交液：
步骤3、原位杂交：
步骤4、比对；
所述步骤2中的制备分子探针、工作液和杂交液具体为：
所述分子探针用由生物公司利用5’末端FAM荧光标记法合成寡核苷酸序列，具体为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，纯化后用1xTE、pH8.0的Tris-EDTA缓冲液溶解，利于探针长期保存；使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合；所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示；
工作液是通过4SSc和2xTE的1:1混合，最终浓度为2SSC 1xTE，pH7.0；-20℃保存备用；
杂交液为2SSC 1xTE，pH7.0的溶液。
4.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤1中的制备黑麦染色体标本具体为：
步骤1.1、将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养；待种子萌动后，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步，24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养；培养至种子根长至1-2cm时，剪根；
步骤1.2、将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中，离心管的盖子上戳一透气孔，一氧化二氮处理2小时；
步骤1.3、用体积浓度为90％的醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；
步骤1.4、用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时；
步骤1.5、用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，于2000转/分的转速下离心10秒，尽量将酒精倒干，加100％乙酸，每个根尖20μl，用移液枪反复吸打混匀；
步骤1.6、将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴7μl细胞悬液，盖上盒盖，5分钟后镜检，制备得到制备黑麦染色体标本。
5.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤3中的原位杂交具体为：
步骤3.1、将合成的探针各0.3ul加入8.0ul的2XSSC 1xTE、pH7.0的杂交液之中；每张玻片加杂交液后，轻轻盖上盖玻片，在37℃湿盒中，杂交3小时以上或过夜；
步骤3.2、将杂交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液工作液中，盖玻片会自动脱落；浸泡2分钟；取出玻片用洗耳球吹干；
步骤3.3、加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，即在荧光显微镜下观察照相。
6.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤4中的比对具体为：利用荧光显微镜，通过载玻片上野生和栽培黑麦的染色体标本，在480nm至500nm波长的荧光激发下，以蓝色荧光为背景，观察野生黑麦染色体端部，具有4-20个绿色的荧光信号的为野生黑麦，具有2个以下绿色的荧光信号的为栽培黑麦。
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