CN101415828B - 抗病植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生具有增强的抗病性的植物的方法。提供了NRC1蛋白和编码这些蛋白的核酸序列，还提供了产生NRC1蛋白的转基因植物。

Description

抗病植物

技术领域

本发明涉及其基因组中整合有编码NRC1蛋白(I型HR相关的细胞死亡必需的NB-LRR(NB-LRR Required for HR-as sociated CellDeath1))的基因的转基因植物和植物细胞，以及制备这样的植物和细胞的方法。具体地说，提供了具有增强抗病性的茄科植物和植物部分(种子、果实、叶等)。除了本发明的分离的NRC1蛋白本身以外，还提供了编码该NRC1蛋白的分离的核酸分子、含有这些核酸分子的载体。此外，提供了在内源性NRC1等位基因中包含一个或多个突变的植物细胞和植物，由此所述一个或多个突变赋予所述植物和植物细胞增强的抗病性。

背景技术

在由抗性基因介导的对病原体无毒性因子的识别时所触发的植物主动防御遵循基因-对-基因模型(gene-for-gene model)(Dang1andJones，2001，Na ture411，826-833)。迄今为止，已经克隆了多个植物抗性基因(R基因)，并且基于这些基因编码的蛋白的结构将它们分成多个组(Hammond-Kosack and Jones，1997，Annu.Rev.Plant Phys iol.Plant Molec.Biol.48，575-607)。大多数的R基因编码细胞质NB-LRR蛋白，该蛋白包含一个核苷酸结合位点(NB)和富含亮氨酸的重复单元(LRR)。该组由编码以下两类蛋白的基因组成：含卷曲螺旋结构域的CC-NB-LRR蛋白，以及具有类似于哺乳动物Toll和白细胞介素(IL)受体的结构域的蛋白——即所谓的TIR-NB-LRR蛋白(Hammond-Kosack andJones，1997，见上文)。

为了获得持久的抗性而将这些特异性抗性基因用于育种程序中是有问题的，这是因为病原体可通过其无毒性因子的突变轻易地绕过识别，从而不会诱导主动防御(Westerink et al.，2004，Mol.Microbiol.54，533-545)。抗性蛋白(R蛋白)的相似性表明存在共同的抗性通路(Shirasu and Schulze-Lefert，2000，Plant Mol.Biol.44，371-385)。因此，对抗性所需的其他基因的鉴定不仅可提供关于这些信号通路如何发挥功能的信息，而且还有可能使得我们能够鉴定在抗性中发挥更普遍作用的基因。例如，本生烟草(Nicotiana benthamiana)中的病毒诱发的基因沉默(VIGS)表明，SGT1参与多个防御通路——例如N介导的、Rx介导的和Pto介导的HR和抗性，以及Cf-4介导的和Cf-9介导的HR(Peart et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，10865-10869；Zhang et al.，2004，Plant J.40，213-224)。SGT1是SKP1的相互作用子，后者是参与蛋白泛素化的SCF E3连接酶复合体的一个组件，蛋白泛素化是一种将蛋白靶向降解的修饰(Schwechheimerand Schwager，2004，Plant Cell Reports 23，353-364)。有这样的猜测，即将该蛋白降解系统的必需基因沉默会阻碍泛素化过程，从而抑制负调节蛋白的降解——这是防御激活所需要的(Azevedo et al.，2002，Science295，2073-2076)。

在多个抗性通路中，MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)被激活(Zhangand Klessig，2001，Trends Plant Sci.6，520-527；Pedley and Martin，2005，Curr.Opin.Plant Biol.8，541-547)。在以Avr9攻击且含Cf-9的烟草植株和细胞培养物中，NtWIPK(损伤诱导的蛋白激酶)和NtSIPK(水杨酸诱导的蛋白激酶)被激活(Romeis et al.，1999，Plant Cell11，273-287)。本生烟草中NtCDPK(钙依赖性蛋白激酶)的VIGS会抑制Cf-9/Avr9依赖的HR和Cf-4/Avr4依赖的HR(Romeis et al.，2001，EMBO J.20，5556-5567)，并且番茄中LeACIK1(Avr/Cf诱导的激酶1)的VIGS导致黄枝孢霉(C.fulvum)抗性的减小(Rowland et al.，2005，Plant Cell17，295-310)。在防御过程中激酶的激活以及它们的编码基因被“敲低(knock-down)”时抗性的减小证实了它们在防御激活中的作用。

依照有偏倚的方法(biased approach)，使用21个已知参与防御相关的信号传递的基因在番茄中进行VIGS，它们中的9个被发现参与Pto介导的抗性。其中有两个基因编码MAPKK(LeMEK1和LeMEK2)，并且有两个基因编码MAPK(LeNTF6和LeWIPK)(Ekengren et al.，2003，Plant J.36，905-917)。在另一项研究中，来自本生烟草的标准cDNA库的超过2400条cDNA被克隆进基于马铃薯X病毒的载体中，并且用于在本生烟草中进行VIGS。约3％的所述cDNA在被沉默时影响了Pto依赖的HR。其中，MAPKKKα被鉴定为抗性和疾病两者的正调节子(DelPozo et al.，2004，EMBO J.23，3072-3082)。

Lu等人(2003，EMBO J.22，5690-5699)使用来自本生烟草标准cDNA库并且克隆进PVX载体中的4992条cDNA进行了VIGS。在这些cDNA中，有79条(1.6％)与Pto介导的HR必需的基因相对应，而仅将其中的6条沉默也破坏了Pto介导的抗丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)抗性。使用与HSP90对应的cDNA的VIGS不但消除了Pto介导的HR，而且消除了Pto介导的、Rx介导的和N介导的抗性，这表明HSP90在多个抗病性通路中是必需的。同一组cDNA也用于在N转基因的本生烟草中进行VIGS，之后用TMV的GFP标记植株接种所述植物。用从编码CC-NB-LRR的基因——称为NRG1(N必需基因1(N requirement gene1))——衍生的cDNA片段沉默时最显著地抑制了抗TMV抗性(Peart etal.，2005，Curr.Biol.15，968-973)。已证明NRG1是N基因功能特别必需的，这表明CC-NB-LRR蛋白不但作为参与无毒性因子识别的抗性蛋白，而且参与由TIR-NB-LRR蛋白N启动的信号传递通路，所述通路最终导致抗性(Peart et al.，2005，见上文)。因此，虽然所述烟草NRG1蛋白在由抗性蛋白启动的植物防御信号传递级联的下游起作用，但是它有以下的缺点：它特异性地参与N介导的抗烟草花叶病毒(TMV)抗性，并且不是一般的抗病性辅因子(Rx介导的和Pto介导的抗PVX抗性和抗丁香假单胞菌抗性不受NRG1沉默的影响)，由此它可能不适合在作物例如番茄中产生广谱的病原体抗性。

虽然关于抗病性通路的信息在不断增加，但是仍然有鉴定这样的基因和蛋白的需求，即它们可以被用于产生具有持久的、广谱的抗病性的植物。本发明的一个目的是提供这样的核酸、蛋白和方法，用于产生具有增强抗病性的植物，特别是属于茄科的植物。

一般性定义

“HR”是指过敏反应，即局部的植物细胞死亡，表现为微观损伤(如Rivas and Thomas，2005，Ann Rev Phytopath43：395-436描述的)和/或宏观损伤。过敏性细胞死亡通常与其他的植物应答相关联——例如活性氧簇的产生和HR损伤周围细胞中防御相关基因的激活。

“植物病原体”是指能够引起植物疾病的生物物质(biotic agent)例如植物病原性真菌、细菌、病毒、卵菌、支原体样生物体、线虫、粉虱、蚜虫等。通常，本文包括能够引起宿主组织疾病的病原体种的所有菌株、小种(race)或致病变型。

“活体营养性植物病原体”或“活体营养”是指保持宿主植物细胞存活并且其生长和组织定殖依赖于活细胞的病原体。

“半活体营养性植物病原体”或“半活体营养”是指至少在其部分生命周期中保持宿主细胞存活的植物病原体。

“死体营养性植物病原体”是指通过产生杀死宿主细胞的有毒性的酶、蛋白或代谢物，在组织定殖时主动杀死植物细胞的植物病原体。

“不依赖诱导子的HR”是指在不存在病原体或病原体诱导子(例如真菌Avr蛋白)的情况下发生的过敏反应。

当提及表达本发明的NRC1蛋白(例如有组成型活性的NRC1蛋白)的植物时，还应区分“组成型HR”和“诱导型HR”，所述“组成型HR”指在不存在病原体或病原体诱导子蛋白时发生的HR损伤，所述“诱导型HR”是指在诱导性刺激物出现后(例如在对驱动编码NRC1蛋白或其变体的核酸序列表达的启动子进行诱导后)发生的HR损伤。

“茄科(Solanaceae)”在本文中是指属于茄科的植物的属、种及其变种。它们包括下列属的种：茄属(genus Solanum)(包括番茄(Solanum lycopersicum)，它以前被称为番茄(Lycopersiconesculentum))、烟草(Nicotiana)属、辣椒(Capsicum)属、碧冬茄(Petunia)属和其他属。

“抗病性”在本文中是指植物的各种水平的抗病性或耐病性，包括对一种或多种病原体的中抗性和高抗性或完全抗性。通过将病原体引起的症状(例如HR损伤、真菌菌丝体等的频率和/或大小)与在相同疾病压力下生长的敏感性对照植物中出现的症状比较，可以测定并任选地定量抗病性。这些疾病生物测定可以使用已知方法进行。也可以基于在疾病压力生长下时抗性植物比敏感植物高的产量间接地测定抗病性。

“增强的抗病性”是指与合适的对照相比植物或植物组织抗病性的任何统计学显著性的增加。本文涵盖定性的增加(例如从敏感变成抗性)和定量的增加。还涵盖发病率(正在被感染植物的百分数)的减小和/或疾病严重度的减轻。优选地，对至少一种病原体具有增强的抗病性的植物是与对照植物相比包含至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、50％、70％、80％、90％或者甚至100％的更高水平的对所述病原体抗性的植物，使用合适的生物测定和/或田间测定来评估抗病性。

“广谱的”抗病性是指对不同病原体种的至少两种、三种、四种或更多种病原体有增强的抗性。例如，对多个活体营养性病原体种和/或半活体营养性病原体种和/或死体营养性病原体种具有增强的抗性的宿主植物可以被认为具有广谱的抗性。

“病原体引起的症状”包括任何的疾病症状——例如在所述宿主组织上/中的菌丝体生长/生物量、细菌生长/生物量、在植物组织上坏死损伤或失绿损伤的大小和/或频度、溃疡的大小和/或频度等。

术语“核酸序列”(或核酸分子)是指单链或双链形式的DNA分子或RNA分子，特别是编码本发明的蛋白或蛋白片段的DNA。“分离的核酸序列”是指不再处于可从其中分离出它的天然环境中的核酸序列，例如在细菌宿主细胞中或者在植物细胞核基因组或质粒基因组中的核酸序列。

术语“蛋白”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，不涉及具体的作用模式、大小、3维结构或来源。因此蛋白的“片段”或“一部分”仍然可以被称为“蛋白”。“分离的蛋白”用来指脱离其天然环境的蛋白，例如在体外或者在重组的细菌或植物宿主细胞中的蛋白。

“功能的”与NRC1蛋白(或者变体(例如直系同源物或突变体)和片段)一块使用的时候是指通过改变植物中编码NRC1的基因的表达水平(例如通过过表达或沉默)，(定量地和/或定性地)改变HR损伤发生和/或抗病性水平的能力。例如，可以通过多种方法测试植物种X的推定NRC1蛋白的功能性。如果所述蛋白是有功能的，那么使用例如VIGS或基因沉默载体在植物种X中沉默编码所述蛋白的NRC1基因将减少或抑制病原体诱导的或诱导子诱导的HR损伤并且/或者减少病原体抗性(如番茄的实施例所示)。同样，功能性NRC1蛋白的补充将能够恢复HR损伤和/或病原体抗性。或者，编码NRC1蛋白(任选地连同转录后基因沉默抑制蛋白)的基因在物种X中短暂地或稳定地(过)表达将导致不依赖于诱导子的HR损伤的发生和/或抗病性(尤其是抗活体营养性病原体和/或半生体营养性病原体的抗病性)的增加。亦参见实施例。

术语“基因”意为包含在细胞中被转录成RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区域)的DNA序列，可操作地连接合适的转录调控区域(例如启动子)。因此基因可以包含几个可操作连接的序列，例如启动子、包含例如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。

“嵌合基因”(或重组基因)是指不是在一个物种中正常天然存在的任何基因，特别是其中存在的核酸序列的一个或多个部分在天然情况下彼此没有联系的基因。例如，启动子在天然情况下与部分或全部的转录区域没有联系，或者与另一调控区域没有联系。术语“嵌合基因”可以理解为包括表达构建体，其中启动子或转录调节序列可操作地连接至一条或多条编码序列或者至反义序列(所述正义链的反向互补序列)或反向重复序列(正义的和反义的，由此所述RNA转录物在转录时形成双链RNA)。

“3’UTR”或“3’非翻译序列”(经常也被称为3’非翻译区或3’端)是指在基因的编码序列下游存在的核酸序列，它包含例如转录终止位点和(在大部分但非全部的真核mRNA中)多腺苷酸化信号(例如AAUAAA或其变体等)。在转录终止后，可以切除所述mRNA转录物下游的多腺苷酸化信号并且加上多腺苷酸的尾，该尾参与所述mRNA到细胞质(进行翻译的位置)的转运。

“基因的表达”所指的过程是可操作地连接有合适的调节区域(特别是启动子)的DNA区域被转录成有生物活性的RNA，即它能够被翻译成具有生物活性的蛋白或肽(或活性肽片段)或者它自身具有活性(例如在转录后的基因沉默中或RNAi中)。在某些实施方案中的活性蛋白是指具有组成型活性的蛋白。编码序列优选地为正义方向并且编码所需的、有生物活性的蛋白或肽或者活性的肽片段。在基因沉默方法中，所述DNA序列优选地以反义DNA或反向重复DNA的形式存在，包含所述靶基因的反义方向的短序列或者正义和反义方向的短序列。“异位表达”是指在正常情况下不表达所述基因的组织中的表达。

“转录调控序列”在本文中被定义为能够调节与所述转录调控序列可操作地连接的(编码)序列的转录速率的核酸序列。因此本文定义的转录调控序列将包含启动转录(启动子元件)、维持和调节转录(包括例如弱化子或增强子)必需的所有序列元件。虽然提及的主要是编码序列的上游(5’)转录调节序列，但是在编码序列下游(3’)存在的调节序列也囊括在该定义中。

本文使用的术语“启动子”是指起到控制一个或多个基因转录作用的核酸片段，它位于所述基因转录起始位点的转录方向上的上游，并且结构特征为存在DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他的DNA序列——包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接起到调节该启动子转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理调控的启动子(例如通过外部给予某些化合物)或者受发育调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。“在植物或植物细胞中有活性的启动子”是指启动子驱动在植物或植物细胞中转录的一般性的能力。它不涉及所述启动子的时间空间的活性。

本文使用的术语“可操作地连接”是指多聚核苷酸元件之间在功能联系方面的连接。当一个核酸与另一个核酸序列具有功能联系时该核酸是“可操作地连接的”。例如，若启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则它们可操作地连接至该编码序列。可操作地连接的意思是被连接的DNA序列通常是邻接的，并且在需要把两个蛋白编码区域连接时是邻接的且在阅读框内的，从而产生“嵌合蛋白”。“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”是由多个蛋白“结构域”(或基序)构成的、其自身在自然界中并不存在的蛋白，但是所述蛋白“结构域”(或基序)被连接起来会形成功能蛋白，它表现出被连接的结构域(例如可以将卷曲螺旋结构域(CC)、核苷酸结合结构域(NB-ARC)和富含亮氨酸的重复(LRR)区结合起来)的功能性。嵌合蛋白还可以是两种或多种天然存在的蛋白的融合蛋白。本文使用的术语“结构域”意思是具有特定结构或功能的蛋白的任何一个或多个部分或结构域，该蛋白的所述部分或结构域可以被转移至另一种蛋白用于提供一种至少具有所述结构域的功能特征的新的杂合蛋白。特定的结构域还可以用于鉴定其他的NRC1蛋白，例如来自其他植物种的NRC1直系同源物。

术语“靶向肽”是指将蛋白或蛋白片段靶向至胞内细胞器例如质体(优选叶绿体、线粒体)，或者至细胞外间隙或质外体(分泌信号肽)的氨基酸序列。编码靶向肽的核酸序列可以与编码所述蛋白或蛋白片段的氨基末端(N-末端)的核酸序列融合(在阅读框内)，或者可以用于替代天然的有靶向作用的肽。

“核酸构建体”或“载体”在本文可理解为使用重组DNA技术产生并用于把外源DNA送递至宿主细胞内的人造核酸分子。载体骨架可以是例如双元或超双元载体(例如参见US5591616、US2002138879和WO95/06722)、共整合载体或T-DNA载体(这是本领域已知的并且如本文其他部分所述)，其中整合有嵌合基因，或者，若已存在合适的转录调节序列，则仅所需核酸序列(如编码序列、反义序列或反向重复序列)被整合于该转录调节序列的下游。载体通常包含有利于将其用于分子克隆的另外的遗传元件，例如可选择标记、多克隆位点等等(见下文)。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化的细胞”是指将至少一种核酸分子——特别是包含编码所需蛋白的嵌合基因或者包含在转录时可产生用于沉默靶基因/基因家族的反义RNA或反向重复RNA(或发夹RNA)的核酸序列——引入所述细胞而产生的新个体细胞(或生物体)。所述宿主细胞优选地是植物细胞或细菌细胞。所述宿主细胞可以包含作为染色体外(附加型)复制分子的核酸构建体，或者更优选地包含整合进入宿主细胞的核基因组或质体基因组中的嵌合基因。在本文的全文中，术语“宿主”还可以指病原体能够侵入或感染的宿主植物种，但是根据上下文这种情况将会是清楚的。对于一种病原体而言，可以将植物种分成“宿主”种或“非宿主”种。“非宿主”种对于病原体所有的小种或菌株的病原体感染都是完全免疫的——甚至在疾病发生的最佳条件下。所述“宿主”种也被称为病原体的“宿主范围”，并且对于病原体的某些(但非全部)小种是有免疫力的。

术语“可选择标记”是本领域普通技术人员熟悉的术语，并且在本文用于描述任何遗传实体，当其被表达的时候可以用于选择包含所述可选择标记的一种或多种细胞。可选择标记基因产物赋予例如抗生素抗性或者更优选除草剂抗性或另一种可选择的性状，例如表型特征(例如色素沉着的变化)或营养需求。术语“报告物(reporter)”主要用于指可见的标记物例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、萤光素酶、GUS等等。

术语基因或蛋白的“直系同源物”在本文中是指在其他物种中出现的同源基因或蛋白，它与所述基因或蛋白有相同的功能，但是(通常)从含有所述基因的物种分化的时间点开始出现序列的分化(即从共同祖先通过物种形成演化而来的基因)。因此可以同时基于序列比较(例如基于整条序列或特定区域的序列同一性百分比)和功能分析在其他植物种中识别番茄nrcl基因的直系同源物。

术语“同源的”和“异源的”是指核酸或氨基酸序列与其宿主细胞或生物体之间的关系，特别是在转基因生物体的情况下。因此同源序列可以在宿主物种中天然存在(例如用番茄基因转化的番茄植物)，而异源序列不会在宿主细胞中天然存在(如用马铃薯植物的序列转化的番茄植物)。根据上下文，所述术语“同源”或“同源的”均可以指来自共同祖先序列的序列(例如它们可以是直系同源物)。

“严格杂交条件”可以用于辨别这样核苷酸序列，该核苷酸序列与给定核苷酸序列基本相同。严格条件是序列依赖的并且在不同的环境中会有差异。通常，选择在确定的离子强度和pH下较具体序列的热熔点(T_m)低约5℃的严格条件。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列与完全匹配探针杂交的温度。选择典型的严格条件，其中在pH7下盐浓度为约0.02摩尔，温度不低于60℃。降低盐浓度和/或升高温度可提高严格度。RNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的RNA印迹法)的严格条件为例如那些包括于63℃在0.2X SSC中至少洗涤一次，持续20分钟的条件或者与之等价的条件。DNA-DNA杂交(使用例如100个核苷酸的探针的DNA印迹法)的严格条件为例如那些包括于至少50℃(通常约55℃)的温度下在0.2X SSC中洗涤至少一次(通常2次)，持续20分钟的条件或者与之等价的条件。亦参见Sambrook等人(1989)和Sambrook and Russell(2001)。

“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列确定。当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共有至少某一最小百分数的序列同一性(在下文中定义)时，那么它们可以被称为是“大体相同的”或“基本相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法对两个序列进行全长比对，使匹配的数目最大化并使空位的数目最小化。通常使用GAP的默认参数，其空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)，空位扩展罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对核苷酸而言，使用的默认打分矩阵是nwsgapdna，而对蛋白而言，默认打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。序列比对和序列同一性百分数得分可通过使用计算机程序例如GCG Wisconsin Package(版本10.3，从Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA获得)或版本2.10.0的EmbossWin(使用程序“needle”)确定。或者，可以通过使用FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库确定相似性或同一性的百分数。

在该文本及其权利要求书中，动词“包含”及其变化形式使用其非限制含义，意为包括该词之后接着的条目，但是并不排除没有明确指出的条目。另外，用不定冠词“a(一)”或“an(一种)”提及某一要素时，并不排除存在超过一种所述要素的可能性，除非文中清楚地要求有且仅有一种该要素。因此，不定冠词“a(一)”或“an(一种)”通常指“至少一种”。还需要理解，当在本文中提及“序列”时，通常是指具有某条亚单元(例如氨基酸)序列的真实的实体分子(physicalmolecule)。

本文使用的术语“植物”包括植物细胞、植物组织或器官、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞簇以及植物中完整的植物细胞或植物的部分(例如胚、花粉、胚珠、果实(例如收获的蕃茄)、花、叶、种子、根、根尖等)。

具体实施方式

本发明人已经使用cDNA-AFLP分析并结合VIGS(病毒诱发的基因沉默)，用以鉴定参与Cf-4/Avr4依赖的HR和抗病性的基因。在这些其中VIGS导致Avr4诱发的HR受抑制的基因中，鉴定了一个番茄基因(在本文中被称作NRC1)，它编码CC-NB-LRR型抗性蛋白类似物(在本文中被称作NRC1：I型HR相关的细胞死亡必需的NB-LRR蛋白)。番茄中NRC1的沉默不但消弱了Avr4诱导的HR的发生，而且减少了对番茄病原体黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的抗性。这说明，番茄Cf-4抗性蛋白(一种细胞外受体样蛋白)需要细胞质NB-LRR蛋白来发挥功能。

此外，本发明人吃惊地发现NRC1参与多个HR和多个抗病性/细胞死亡信号传递途径，例如Cf-9/Avr-9启动的HR、LeEix2/Eix启动的HR、Pto/AvrPto启动的HR和Rx/CP启动的HR(参见实施例)。还进行了其他测试以确定NRC1是否还参与其他的HR例如Mi介导的HR(赋予对线虫类、粉虱和蚜虫诱发的HR的抗性；参见US6613962和EP0937155B1)。因此，NRC1参与由细胞外和细胞内抗病性蛋白触发的HR途径，所述抗病性蛋白属于不同的类：细胞外受体样蛋白(RLP，例如Cf-4、Cf-9和LeEix2)、Ser/Thr蛋白激酶(例如Pto)以及CC-NB-LRR蛋白(Rx)，它们分别赋予对真菌(黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)和绿色木霉(Trichoderma viride))、细菌(丁香假单胞菌番茄致病变型(Pseudomonassyringae pv tomato))或病毒(PVX)的抗性。

NRC1蛋白(以及编码它的NRC1基因)可以用于赋予或增强植物对多种病原体(尤其是活体营养性病原体和半活体营养性植物病原体，而且还有死体营养性植物病原体例如葡萄孢(Botrytis)属)的抗性。具体地说，NRC1(或者其变体或片段，如本文其他部分所定义的)的表达导致针对病原体(尤其是活体营养性和半活体营养性病原体，即所有从活细胞获取养分的病原体)的抗性的增强。并非限制本发明的范围，人们认为内源性NRC1基因的敲低(基因沉默)或敲除(例如通过定向诱导基因组局部突变(TILLING))可以用于赋予或增强对死体营养性病原体的抗性，这是因为导致坏死的通路受到影响而且死体营养性病原体需要该通路。因此，根据需要对其增强抗性的所述一种或多种病原体，可以使用升高或降低NRC1表达水平以增强抗性。任选地，这两种方法均可用于同一植株中，例如处于不同的启动子控制之下。例如，NRC1可以在由(半)活体营养性病原体诱导的启动子控制下表达，以赋予对活体营养性和/或半活体营养性叶病原体的抗性，而在同时内源性NRC1基因(或基因家族)可在某些组织中或在由死体营养诱导时被沉默，所述诱导可使用可由死体营养性病原体或创伤诱导的启动子。

本发明人还发现，当有组成型活性的NRC1蛋白(NRC1^D481V)在番茄中短暂产生的时候，所述植物组织出现不依赖于诱导子的细胞死亡(HR)，这表明功能性NRC1蛋白的表达可以用于在植物中赋予或增强抗病性。

本发明的蛋白以及核酸序列

从番茄获得的NRC1蛋白与烟草的NRG1有很低的序列同一性(低于25％)。与NRG1相比，NRC1还包含更多的富含亮氨酸的重复单元(LRR)。NRC1的蛋白质结构在图1和SEQ ID NO：2中示出。

在本发明的一个实施方案中提供了NRC1蛋白的核酸序列和氨基酸序列(包括直系同源物)，也提供了用于分离或鉴别其他植物种(例如其他的茄科植物(Solanaceae)，优选马铃薯)中的NRC1直系同源物的方法。或者说，本文提供了用于分离或鉴定其他的NRC1等位基因(例如来自其他番茄种、变种、品系或种质的等位基因)的方法。

在一个实施方案中提供了NRC1蛋白。“NRC1蛋白”包括SEQ ID NO：2(野生型)和4(组成型突变体)中所示的蛋白，也包括它们的片段和变体。NRC1的变体包括例如与SEQ ID NO：2和/或4至少有30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99％或更高的氨基酸序列同一性(在全长上)的蛋白。氨基酸序列的同一性通过两两比对确定，使用的是上文定义的Needleman和Wunsch算法以及GAP默认参数。NRC1的变体可以来自于多种来源例如现有的序列数据库，可以来自于其他植物种(尤其是茄科的其他成员，例如马铃薯)或其他变种，或者它们可以通过从头合成、诱变等制备。例如，SEQ ID NO：4——一种具有组成型活性的NRC1突变体——是SEQ ID NO：2的变体，并且是通过使用重叠PCR的定向诱变制备的(参见实施例)。因此，本发明的NRC1蛋白可以从天然来源中分离，通过化学合成从头合成(使用例如由如Applied Biosystems提供的肽合成仪)，或者由重组宿主细胞通过表达编码NRC1蛋白、片段或变体的核酸序列产生。

NRC1变体可以包含相同类的保守氨基酸的置换，即碱性的(如Arg、His、Lys)、酸性的(如Asp、Glu)、非极性的(如Ala、Val、Trp、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp)或极性的(如Gly、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln)。另外，非保守氨基酸置换在本发明的范围内。

任何NRC1蛋白、变体或片段的功能性均可以使用多种方法确定。例如，植物细胞中的短暂或稳定的过表达可以用于测试所述蛋白是否在植物中(inplanta)有活性。优选在从其中获得所述蛋白的相同植物种中测试功能性。因此，例如短暂或稳定表达可以用于确定HR是否发生和/或抗性是否被增强，进而指示功能性。或者，内源基因或基因家族的沉默将显示NRC1蛋白是否是有功能的。例如，VIGS可以被用于多种茄科植物例如马铃薯、番茄和烟草中(参见Brigneti et al.，2004，PlantJournal39：264；Faivre-Rampant et al.Plant Physiology134：1308-1316；Baulcombe1999，Curr.Opinion.Plant Biol.2：109-113；Lu et al.2003，EMBO J.22：5690-5699)、模式生物例如拟南芥(Arabidopsis)中(Turnage et al.2002，Plant J.30：107-114)和单子叶植物例如大麦中(Holzberg et al.2002，Plant J.30：315-327)。或者，包含NRC1基因的正义和/或反义片段的沉默载体可以被用于转化植物细胞(见下文)，之后通过测试确定发生HR损伤的能力和/或抗病性是否有变化。

在一个优选的实施方案中，NRC1的变体包括在植物细胞中有组成型活性的NRC1蛋白——例如SEQ ID NO：4中提供的NRC1蛋白，它包括在MHD结构域中的单氨基酸置换(D481V)(参见图1)。可以通过在不存在诱导子的情况下确定所述蛋白是否能够诱导植物组织中的HR来测试所述组成型活性。例如，35S：NRC1构建体的农杆菌浸润(如实施例中的描述)可以用于浸润叶组织。通过随机诱变然后进行活性测试(如Bendahame et al.，2002，第196页中的描述)或者通过在MHD结构域中(氨基酸VHD或VHDM中的任一个可以用另一个氨基酸替换)、在NB-ARC结构域例如RNBS-D结构域中(氨基酸FLYFGTFPRGY)或在13个LRR结构域之一中进行单个氨基酸的定向诱变(见图1)，可以制备其他具有组成型活性的NRC1蛋白。或者，编码具有组成型活性的NRC1蛋白的核酸序列可以从植物中获得，例如通过对种子进行诱变处理并筛选存在自发性损伤表型(例如微观的损伤)的种子，参见例如Shar ino et al.(2002，The Plant Cel l14：3149-3162)和下文。

在一个实施方案中还提供了嵌合的NRC1蛋白。这样的蛋白至少包含一个CC结构域、一个NB-ARC结构域，并且优选地至少13个LRR。CC结构域、NB-ARC结构域和LRR结构域优选地是指包含分别与SEQ ID NO：2的第1-150位氨基酸、第151-508位氨基酸或第509-846位氨基酸有至少30、40、50、60、70、80、90、95、98、99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸基序。因此，可以在NRC1蛋白之间或者在NRC1蛋白和其他的CC-NB-LRR或TIR-NB-LRR蛋白间交换结构域(结构域交换)，只要产生的嵌合蛋白的功能性与NRC1的功能性或者优选地与NRC1^D481V的功能性基本上类似。最优选地，当重组植物细胞产生所述嵌合蛋白的时候(如下文所述)，该蛋白保持赋予抗病性或增强抗病性的能力。

NRC1蛋白的“片段”和NRC1蛋白的变体的“片段”(如上文所述)包含具有100、150、200、300、400、500、600、700、800、850、855个或更多个连续氨基酸的片段。优选地，这样的片段在植物组织中是有功能的，即当它们在植物细胞中产生的时候能够赋予或增强病原体抗性。片段还可以用于制备如上文所述的嵌合蛋白。

在另一个实施方案中提供了编码任一种上述蛋白、变体或片段的分离的核酸序列——例如cDNA、基因组DNA和RNA序列。由于遗传密码子的简并性，多种核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。任何编码NRC1蛋白或变体的核酸序列在本文中均被称作“NRC1”。所提供的核酸序列包括天然存在的核酸序列、人工核酸序列或合成核酸序列。编码NRC1蛋白的核酸序列的实例在SEQ ID NO：1和3中给出。需要理解的是，当序列以DNA序列的形式给出而在指代RNA时，该RNA分子的实际碱基序列是相同的，差异仅是由尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。

本发明还包括NRC1核酸序列的变体和片段，例如在所定义的严格杂交条件下与NRC1核酸序列杂交的核酸序列。NRC1核酸序列的变体还包括与SEQ ID NO：1或3(在全长上)有至少50％或更高，优选至少55％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.8％或更高的序列同一性的核酸序列。在一个优选的实施方案中，NRC1的变体编码所述具有组成型活性的NRC1蛋白。很明显，有多种方法可以用于鉴定、合成或分离NRC1核酸序列的变体或片段，所述方法例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析、核酸合成等。

编码本发明的NRC1蛋白的核酸序列，尤其DNA序列可以被插入到表达载体中以产生大量的NRC1蛋白(或者例如嵌合NRC1蛋白)，如下文所述。为了优化在宿主中的表达，可以通过以下的方式对所述NRC1 DNA序列进行密码子优化：使用现有的密码子选择表，通过将密码子选择调整成为植物基因(尤其是目的植物属或种的天然基因)中最优选的密码子选择(例如，更加适应于在棉花、大豆、玉米或稻中表达)(Bennetzen&Hall，1982，J.Biol.Chem.257，3026-3031；Itakura et al.，1977Science198，1056-1063.)。多种植物种的密码子选择表被例如Ikemura(1993，In″Plant Molecular Biology Labfax″，Croy，ed.，BiosScientific Publishers Ltd.)和Nakamura et al.(2000，Nucl.AcidsRes.28，292.)公开并且在主要的DNA序列数据库(例如位于德国海德堡的EMBL)中公开。因此，可以构建合成的DNA序列以便产生相同的或基本相同的蛋白。用于将密码子选择调整成宿主细胞优选的密码子选择的多种技术可以在专利文献和科学文献中获得。密码子选择调整的确切方法不是本发明关键之处。

对DNA序列的少量的修饰(例如上文描述的)可以利用常规方法进行，即通过PCR介导的诱变(Ho et al.，1989，Gene77，51-59.，Whiteet al.，1989，Trends in Genet.5，185-189)。可以使用现有技术通过从头DNA合成所需编码区对DNA序列常规地进行更深入的修饰。

再者，可以这样修饰NRC1核酸序列，即通过在NRC1蛋白的N末端添加或删除一个或多个氨基酸，从而使该蛋白的N末端具有最佳的翻译起始的前后序列。优选地，待在植物细胞中表达的本发明的蛋白一般由Met-Asp或Met-Ala二肽起始以获得最佳的翻译起始。因此Asp密码子或Ala密码子可以插入至已经存在的Met之后，或者第二个密码子——Val可以被Asp密码子(GAT或GAC)或Ala密码子(GCT、GCC、GCA或GCG)密码子替换。也可以修饰DNA序列以去除不正常的剪接位点。

NRC1核酸序列的“片段”包括SEQ ID NO：1或3或者SEQ ID NO：1或3的变体的至少10、12、15、16、18、20、30、40、50、100、200、500、1000、1500、2000或更长的连续核苷酸的片段。短片段可以用作例如PCR引物或杂交探针。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于探测NRC1DNA或RNA序列的PCR引物和/或探针以及试剂盒。可以根据SEQ ID NO：1或3(或者其变体)合成用于从样品中扩增NRC1DNA的简并PCR引物对或特异PCR引物对——这是本领域中的现有技术(参见Dieffenbach andDveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，and McPherson at al.(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany)。例如，SEQ ID NO：1或3(或者互补链)的任何具有9、10、11、12、13、14、15、16、18或更多个连续核苷酸的小片段可以被用作引物或探针。与之类似，SEQ ID NO：1或3(或者其变体)的DNA片段可以被用作杂交探针。NRC1探测试剂盒可以包含NRC1特异性引物和/或NRC1特异性探针，以及用于使用所述引物或探针探测样品中NRC1DNA的相关方案。该探测试剂盒可以例如用于确定植物是否已被本发明的NRC1基因(或其部分)转化。由于遗传密码子的简并性，某些氨基酸密码子可以被其他密码子替代而不改变蛋白的氨基酸序列。

在另一个实施方案中还提供了一种用于鉴定和应用所述番茄NRC1基因(SEQ ID NO：1和3)的直系同源物或等位基因的方法。所述方法包含下述步骤：

a)获得或鉴定与SEQ ID NO：1和/或3有至少70％核酸同一性(或者如上文所述的更高百分数的序列同一性)的核酸序列，

b)任选地修饰所述核酸序列以使之编码具有组成型活性的NRC1蛋白，以及

c)使用a)的核酸序列产生表达载体和/或沉默载体，或者使用b)的核酸序列产生表达载体，

d)使用一种或多种c)的载体转化植物或植物细胞，优选从其中获得所述核酸的植物种的植物或植物细胞，

e)分析所述转化植物/植物组织出现HR损伤(即HR损伤表型，任选对其定量)的能力和/或所述转化体的抗病性，以确定或验证所述基因在植物中的功能并且/或者产生具有增强的抗病性的转基因植物；

f)任选地对这样的等位基因或直系同源物进行筛选以便在后续中继续使用，所述等位基因或直系同源物会赋予所述转基因植物增强的抗病性而在表达时赋予弱的HR表型(即不引起或引起减弱的HR损伤表型)。

因此，使用该方法可鉴定NRC1等位基因或直系同源物，与SEQ ID NO：1或3的表达相比，或者与从所要转化的宿主物种中获得的野生型NRC1等位基因的表达相比，所述NRC1等位基因或直系同源物在植物中表达时会产生更少的和/或更小的HR损伤。最优选地，鉴定出在表达时不引起HR损伤或者至少不会导致宏观可见的HR损伤而仍赋予增强的抗病性的NRC1等位基因或直系同源物。

通过这样的方式可以比较不同的NRC1等位基因和/或直系同源物的HR表型，即使用相同启动子制备表达载体、用它们转化宿主植物并且比较这些转基因植物之间的HR损伤表型。当比较转基因茄科植物中不同的等位基因的时候(例如在组成型启动子或诱导型启动子控制下)，表达SEQ ID NO：1或3的转化体的HR损伤表型优选地被用作参照。或者，从所要转化的宿主物种中获得的野生型等位基因可以被用作参照。然后可以选择这样的等位基因在后续中继续使用，即那些与SEQ ID NO：1或3相比可以提供更少和/或更小的HR损伤的等位基因，或者那些与从所述被转化物种获得的野生型等位基因的表达所引起的相比可以提供更少和/或更小的HR损伤的等位基因。例如，可以制备表达它们的转基因植物——如下文的描述。

具体地说，可以使用例如NRC1特异的PCR引物或探针或者利用计算机生物信息学分析获得或者鉴定来自番茄的等位基因和来自马铃薯的直系同源物。遗传作图也可以被用于对所述植物(例如番茄或马铃薯)基因组中的NRC1基因座作图，由此可以通过将所述基因组图谱与现有的(例如番茄测序项目中开发的)基因组测序数据库关联获得序列。这些等位基因和/或直系同源物可能尤其适合于产生具有增强的抗病性的植物。

当用上述的方法鉴定NRC1的马铃薯直系同源物时，这些直系同源物(或这些直系同源物的变体)优选用于产生具有增强的致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性的植物。

本发明的嵌合基因、表达载体和重组生物体

在本发明的一个实施方案中，编码NRC1蛋白(包括变体或片段)的核酸序列(如上述)被用于制备嵌合基因，以及包含这些嵌合基因的载体，用于将所述嵌合基因转移至宿主细胞并且在宿主细胞(例如从转化的细胞得到的细胞、组织、器官或生物体)中产生NRC1蛋白。用于在植物细胞中产生NRC1蛋白(或蛋白片段或变体)的载体在本文中被称为“表达载体”。宿主细胞优选是植物细胞，而微生物宿主(细菌例如农杆菌、酵母、真菌等)也被考虑。

任何植物(例如单子叶植物或双子叶植物)都可以是适宜的宿主，但最优选地，所述宿主植物属于茄科。例如，所述植物属于茄属(包括番茄属(Lycopersicon))、烟草属、辣椒属、碧冬茄属和其他的属。以下的宿主种可适合于被使用：烟草(烟草种，例如本生烟草(N.benthamiana)、皱叶烟草(N.plumbaginifolia)、普通烟草(N.tabacum)等)、蔬菜种例如番茄(L.esculentum异名Solanumlycopersicum)(例如樱桃番茄变种cerasiforme或醋栗番茄变种pimpinellifolium)或树番茄(S.betaceum异名Cyphomandrabetaceae)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanummelongena)、凤果(pepino)(Solanummuricatum)、cocona(Solanum sessiliflorum)和果茄(Solanum quitoense)、辣椒类(一年生辣椒(Capsicum annuum)、灌木椒(Capsicum frutescens)、铃椒(Capsicum baccatum))、观赏物种(例如矮牵牛(Petunia hybrida)、腋花矮牵牛(Petuniaaxillaries)、膨大矮牵牛(P.integrifolia))。

或者，所述植物可以属于任何的其他科，例如属于葫芦科(Cucurbitaceae)或禾本科(Gramineae)。合适的宿主植物包括例如玉米/谷类(玉蜀黍属种(Zea species))、小麦(小麦属种(Triticumspecies))、大麦(例如大麦(Hordeum vulgare))、燕麦(例如燕麦(Avena sativa))、高粱(高粱(Sorghum bicolor))、黑麦(黑麦(Secalecereale))、大豆(野生大豆属种(Glycine spp)，如大豆(G.max))、棉花(棉属种(Gossypium species)，例如陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense))、芸苔属种(Brassica spp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、大头菜(B.juncea)、甘蓝(B.oleracea)、芜菁(B.rapa)等)、向日葵(Helianthus annus)、红花、山药、木薯、紫花苜蓿(Medicago sativa)、稻(稻属种(Oryza species)，例如籼稻栽培种(O.sativa indica cultivar-group)或粳稻日本晴栽培种(japoni cacultivar-group))、饲料草、珍珠栗(狼尾草属种(Pennisetum spp.)，例如珍珠栗(Pennisetum glaucum))、树种(松属(Pinus)、杨树、杉、芭蕉等)、茶树、咖啡树、油棕榈树、椰子树、蔬菜种(例如豌豆、小西葫芦、豆类(例如菜豆属种(Phaseolusspecies))、黄瓜、朝鲜蓟、芦笋、青花菜、大蒜、韭菜、莴苣、洋葱、萝卜、芜菁、抱子甘蓝、胡萝卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、苣荬菜、茴香、甜菜)、结肉质果植物(葡萄、桃树、李类(plums)、草莓、芒果树、苹果树、李树(plum)、樱桃树、杏树、香蕉树、黑莓、越橘、柑橘、猕猴桃树、无花果树、柠檬树、椴树(lime)、油桃树、树莓、西瓜、橙树、葡萄柚等)、观赏物种(例如蔷薇属种、矮牵牛属种、菊属种、百合属种、大丁草属种)、草本类(薄荷、荷兰芹、罗勒(basil)、百里香(thyme)等)、木质树(例如杨属种、柳属种、栎属种、桉属种)、纤维物种(例如亚麻(Linum usitatissimum)和大麻(Canna bis sativa))或者模式生物(例如拟南芥(Arabidopsis thaliana))。

优选的宿主是“作物植物”，即人类种植和培育的植物种。可以种植作物植物用于食用(例如田间作物)或者用于观赏(例如产生用于切枝的花、用于草坪的草等)。本文定义的作物植物还包括从其中收获非食用产物的植物，所述产物例如用于燃料的油、塑料聚合物、药物制品、软木等。

用于将编码NRC1蛋白的核酸序列(优选稳定地)导入宿主细胞基因组的嵌合基因和载体的构建方法是本领域普遍公知的。为了形成嵌合基因，使用标准的分子生物学技术将编码NRC1蛋白(或者变体或片段)的核酸序列可操作地连接至适宜于在宿主细胞中表达的启动子序列上。所述启动子序列可以已经存在于载体中，从而将NRC1核酸序列简单地插入至所述载体中所述启动子序列的下游。然后将所述载体用于转化所述宿主细胞，并且将所述嵌合基因插入到核基因组中或质体、线粒体或叶绿体的基因组中，并且使用合适的启动子在该处进行表达(例如Mc Brideet al.，1995Bio/Technology13，362；US5,693,507)。在一个实施方案中，嵌合基因包含适宜于在植物细胞或微生物细胞(例如细菌)中表达的启动子，该启动子可操作地连接至编码本发明的NRC1蛋白的核酸序列，其后端任选地连接一条3’非翻译核酸序列。

编码功能性NRC1蛋白(或者在某些实施方案中的具有组成型活性的NRC1蛋白)的NRC1核酸序列(优选NRC1嵌合基因)可以以常规的方式被稳定地插入至单个的植物细胞的核基因组中，并且经这样转化的植物细胞可以以常规的方式用于产生表型发生改变的转化植株，此表型改变是由于某些细胞在某些时间存在NRC1蛋白导致。在这一点上，在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中包含编码NRC1蛋白的核酸序列的T-DNA载体可以被用于转化所述植物细胞，并且之后使用例如在EP0116718、EP0270822、PCT公开文本WO84/02913和公布的欧洲专利申请EP0242246中记载的以及Gould等人(1991，Plant Physiol.95，426-434)描述的方法可以从所述转化的植物细胞再生成转化植株。用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建方法是本领域公知的。所述T-DNA载体可以是如EP0120561和EP0120515中记载的二元载体，或者是如EP0116718中记载的可以通过同源重组整合至所述农杆菌Ti质粒中的共整合载体。

每个优选的T-DNA载体均包含可操作地连接有编码NRC1(例如编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)的核酸序列的启动子，所述启动子位于T-DNA边界序列之间，或者至少位于所述右边界序列的左边。边界序列在Gielen et al.(1984，EMBO J 3,835-845)中有记载。当然，也可以通过例如以下的方法使用其他类型的载体转化植物细胞：直接基因转移(例如在EP0223247中记载的)、花粉介导的转化(例如在EP0270356和WO85/01856中记载的)、例如在US4,684,611中记载的原生质体转化、植物RNA病毒介导的转化(例如在EP0067553和US4,407,956中记载的)、脂质体介导的转化(例如在US4,536,475中记载的)以及其他方法。对于番茄或烟草转化，亦参见An G.etal.，1986，PlantPhysiol.81：301-305；Horsch R.B.etal.，1988，In：Plant MolecularBiology Manual A5，Dordrecht，Netherlands，Kluwer AcademicPublishers.第1-9页；Koornneef M.et al.，1986，In：Nevins D.J.and R.A.Jones eds，Tomato Biotechnology，New York，NY，USA，AlanR.Liss，Inc.第169-178页。对于马铃薯转化，参见例如Sherman andBevan(1988，Plant CellRep.7：13-16)。

类似地，对来自于转化细胞的转化植物的选择和再生是本领域公知的。很明显，对于不同物种和甚至单个物种的不同变种或栽培种，可以对方案具体调整以高频地再生转化体。

除核基因组的转化外，本发明还包括质体基因组(优选叶绿体基因组)的转化。质体基因组转化的一个优点是可以减少所述一种或多种转基因扩散的风险。质体基因组转化可以按本领域的公知方法进行，参见例如Sidorov VA et al.1999、Plant J.19：209-216或Lutz KA et al.2004，Plant J.37(6)：906-13。

可以将这样产生的转化植物用于常规的植物育种方案中以产生更多的包含所述转基因的转化植株。使用例如DNA印迹分析、基于PCR的方法或InvaderTechnology测定法(Third Wave Technologies，Inc.)可以筛选单拷贝转化体。通过所述嵌合基因的存在可以容易地将非转化的细胞和植株与转化的细胞和植株区分开。还可以对位于所述转基因的插入位点两侧的植物DNA序列进行测序，从而可以开发一种用于常规使用的“事件特异性”检测方法。参见例如WO0141558，它记载了基于例如整合序列和侧翼(基因组)序列的突出事件检测试剂盒(elit eeventdetection kit)(例如PCR检测试剂盒)。

将所述NRC1核酸序列插入至植物细胞基因组中，使得所述插入的编码序列位于能指导在植物中表达的启动子的下游(即3′)并且受到所述启动子的控制。这优选地通过将所述嵌合基因插入至所述植物细胞基因组，尤其是核基因组或质体(例如叶绿体)基因组中来实现。

因为NRC1蛋白的组成型产生可以诱导细胞的死亡(例如微观的损伤和/或宏观的损伤)并且/或者会降低产量(参见例如Rizhsky andMittler，Plant Mol Biol，200146：313-23)，所以在一个实施方案中优选使用活性为可诱导的启动子。诱导型启动子的实例是创伤诱导型启动子，例如Cordera等人(1994，ThePlant Journal6，141)描述的MPI启动子，它由创伤诱导(例如由昆虫或物理创伤造成)；或者COMPTII启动子(WO0056897)；或者US6031151中记载的PR1启动子。或者，所述启动子可以被化学药品诱导，所述化学药品例如Aoyama和Chua(1997，Plant Journal11：605-612)和US6063985中记载的地塞米松或例如四环素(TOPFREE或TOP10启动子，见Gatz，1997，AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol.48：89-108and Love et al.2000，Plant J.21：579-88)。其他的诱导型启动子可由例如温度变化诱导(例如记载于US5,447,858中的热休克启动子)、缺氧条件诱导(例如玉米ADH1S启动子)、光诱导(US6455760)、病原体诱导(例如EP759085的gstl启动子或EP309862的vstl启动子)或者衰老诱导(SAG12和SAG13，参见US5689042)。很明显还有大量的其他启动子。

在一个优选的实施方案中优选使用病原体诱导的启动子，从而所述NRC1蛋白(或者变体或片段)将仅会在病原体侵袭所述植物的组织后产生。尤其合乎需要的是受病原体侵袭后被迅速地上调的基因的启动子。病原体诱导的启动子包括例如烟草的hsr203J、str246C和sgd24启动子；Yin等人(1997，Plant Physiology115(2)：437-51)描述的EAS4启动子；tap1或tap2启动子(Mohan et al.，1993，Plant Mol Biol.199322：475-90)；gstl启动子或其变体(Mart ini et al.1993，Mol.Gen.Gen.236，179-186；Hennin C.，1997，Afstudeerwerk，FaculteitLandbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen，University of Gent，Belgium)；WRKY启动子(Eul gem et al.，EMBO J.，1999，18(17)：4689-99)；以及WO0029592中记载的嵌合启动子)。也可以使用已知方法例如cDNA-AFLP

鉴定由具体植物病原体诱导的启动子。

优选地，所述启动子可以被大量的病原体诱导，即它被所述宿主植物的广谱病原体诱导。对于每个具体的宿主植物种，可以有不同的最适的启动子。例如，当番茄被用作宿主时，所述启动子优选地被至少一种(但优选多于一种)番茄病原体诱导。具体地说，优选可以被一种或多种真菌植物病原体和/或细菌植物病原体(尤其是被一种或多种活体营养性植物病原体和/或半活体营养性植物病原体)诱导的启动子。

对于每个植物种，都可以获得关于植物病原体、它们引起的疾病症状以及它们的生命周期的详细描述。例如，番茄的病原体被记载于“Compendium of Tomato Diseases”，Editors Jones，Jones，Stall andZitter，ISBN 0-89054-120-5，APS Press(http:/www.shopapspress/org)。马铃薯的病原体被记载于“Compendium of Potato Disease”，第2版，Editors Stevenson、FrancandWeingartner，APS Press，ISBN 0-89054-275-9。

番茄的病原体包括例如以下的真菌种、细菌种和病毒(非限制性的)：灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)(真菌/死体营养)、球状炭疽病(Colletotrichum coccodes)(真菌/死体营养)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)(真菌)、茄病交链孢霉(Alternaria solani)(真菌/死体营养)、茄匐柄霉(Stemphylium solani)、致病疫霉(Phytophthora infestans)(卵菌纲(oomycte)/半活体营养)、番茄壳针孢菌(Septoria lycopersici)、黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)(真菌/半活体营养)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、番茄粉孢子(Oidium lycopersicum)(活体营养)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、整齐小菌核菌(Sclerotium rolfsii)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)(真菌/死体营养)、密执安棍状杆菌(Corynebacterium michiganense)(细菌)、丁香假单胞菌番茄致病变型或丁香致病变型(Pseudomonas syringae pv tomato or pv syringae)(细菌/活体营养)、青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)、波状假单胞菌(Pseudomonas corrugate)、棒形杆菌属(Clavibacter)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)(细菌/活体营养)、轮枝孢属(Verticillium)(真菌)、番茄斑萎病毒(TSWV)、烟草花叶病毒或番茄花叶病毒(TobMV，TomMV)。

马铃薯的病原体包括例如多种真菌、细菌、线虫类和病毒——例如：致病疫霉(Phytophthora infestans)(卵菌纲/半活体营养)、线虫类(活体营养性)、胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacaroto vora)(细菌)、球状炭疽病(Colletotrichum coccodes)(真菌)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)(真菌/死体营养)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)(真菌)、疥疮链霉菌(Streptomyces scabies)、茄病交链孢霉(Alternariasolani)(真菌/死体营养)、腐霉属、马铃薯粉痂菌(Spongosporasubterranean)、PVX和PVY、马铃薯卷叶病毒(PLRV)等。

多种植物种的植物疾病亦参见http://www.apsnet.org/online/common/toc.asp。因此，在一个实施方案中，所述启动子优选地被上述病原体中的一种或多种诱导，最优选地至少被以上活体营养性病原体和/或半活体营养性病原体中的一种或多种诱导。

或者，宿主植物可以包含多个NRC1转基因，每个均受一种不同的病原体诱导型启动子的控制，以保证在受到多种病原体侵袭后产生NRC1蛋白。例如，对于番茄的转化，一个启动子可以被疫霉属诱导并且一个被枝孢菌属诱导。

词语“诱导的”不一定要求所述启动子在不存在诱导物刺激的时候完全没有活性。可以存在低水平的非特异性活性，只要这不会对所述植物产量或质量产生严重的影响。因此，可诱导的优选地是指在与所述诱导物接触后所述启动子活性的增加，导致下游NRC1编码区的转录的增加。

本文中最优选的组合是使用病原体诱导型启动子，它可操作地连接至一个编码具有组成型活性的NRC1蛋白的NRC1核酸序列——如上文所述。在这种情况下当受病原体侵袭时，将表达所述具有组成型活性的NRC1从而导致局部的HR(局限在病原体侵袭的位点)，阻碍任何(半)活体营养性病原体的进一步生长。

在另一个实施方案中可以使用组成型的启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)分离株CM1841的强组成型35S启动子或增强型35S启动子(“35S启动子”)(Gardner et al.，1981，Nucleic Acids Research9，2871-2887)、CabbB-S(Franck et al.，1980，Cell21，285-294)和CabbB-JI(Hulland Howell，1987，Virology86，482-493)；Odell等人(1985，Nature313，810-812)描述的或记载于US5164316中的35S启动子；来自泛素家族的启动子(例如记载于Christensen et al.，1992，Plant Mol.Biol.18，675-689、EP0342926的玉米泛素启动子，亦参见Cornejo et al.1993，Plant Mol.Biol.23，567-581)、gos2启动子(de Pater et al.，1992Plant J.2，834-844)、emu启动子(Lastet al.，1990，Theor.Appl.Genet.81，581-588)、拟南芥肌动蛋白启动子例如An等人(1996，Plant J.10，107-121)描述的启动子、稻肌动蛋白启动子例如Zhang等人(1991，The Plant Cell 3，1155-1165)描述的启动子和US5,641,876中记载的启动子或者WO070067中记载的稻肌动蛋白2启动子；木薯叶脉花叶病毒的启动子(WO97/48819、Verdagueret al.1998，Plant Mol.Biol.37，1055-1067)、来自地三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO96/06932，尤其是S7启动子)、乙醇脱氢酶启动子例如pAdhlS(GenBank登录号X04049、X00581)、分别驱动1′基因和2′基因表达的T-DNA的TR1′启动子和TR2′启动子(分别为“TR1′启动子”和“TR2′启动子”)(Velten et al.，1984，EMBO J3，2723-2730)、US6051753和EP426641中记载的玄参花叶病毒启动子、组蛋白基因启动子例如来自拟南芥的Ph4a748启动子(PMB8：179-191)等。在一个优选的实施方案中使用了PCT/NL2005/050083(2005年12月16日提交)中记载的AA6启动子。

或者，可以利用不是组成型的而是植物的一个或多个组织或器官特异性的启动子(组织优选的/组织特异性的启动子，包括发育调控的启动子)，例如叶优选的、表皮优选的、根优选的、花组织例如绒毡层或花药优选的、种子优选的、荚优选的等)，由此所述NRC1基因仅在特定的一种或多种组织或器官的细胞中并且/或者仅在某一发育阶段表达。例如，通过将所述编码序列置于光诱导型启动子(例如植物本身的或其他植物(例如US5,254,799中公开的豌豆或US5034322中公开的拟南芥)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的启动子)控制下，可以在所述植物叶中选择性地表达所述NRC1基因。

在一个实施方案中使用了内源性NRC1基因的启动子。例如，可以将番茄NRC1基因的启动子分离并可操作地连接至编码SEQ ID NO：2或4的NRC1蛋白的编码区。使用已知的方法例如热不对称交错PCR(TAIL-PCR)(Liu et al.1995，Genomics25(3)：674-81；Liu et al.2005，Methods Mol Biol.286：341-8)、接头PCR(Linker-PCR)或反向PCR(Inverse PCR)(IPCR)，可以将所述NRC1启动子(SEQ ID NO：1和3的上游转录调控区)从番茄植株中分离。

优选地将NRC1编码序列插入至所述植物的基因组中，从而使所述编码序列位于合适的3′端非翻译区(“3′端”或3′UTR)的上游(即5′)。合适的3′端包括以下基因的3′端：CaMV35S基因(“3′35S”)、胭脂碱合酶基因(“3′nos”)(Depicker et al.，1982J.Molec.Appl.Genetics1，561-573.)、章鱼碱合酶基因(“3′ocs”)(Gielen et al.，1984，EMBOJ3，835-845)和T-DNA基因7(“3′基因7”)(Velten and Schell，1985，Nucleic Acids Research13，6981-6998)等，所述3′端可以作为转化的植物细胞中的3′-非翻译DNA序列。在一个实施方案中使用了番茄NRC1基因的3′UTR，如SEQ ID NO：3中的第2748-3168位核苷酸和SEQ ID NO：5中所示的。所述NRC13′UTR本身也是本发明的实施方案，这是因为它也可以与其他的编码区一起被用作3′UTR。同样，提供了SEQ ID NO：5的任何的变体或片段。SEQ ID NO：5的变体包括与SEQ ID NO：5有至少40、50、60、70、80、90、95、98、99％或更高的序列同一性的核酸序列(这是使用上文定义的Needleman和Wunsch算法以及GAP罚分确定的)。片段包括任何包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：5的变体的至少30、50、100、150、200、300、400或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。

可以使用现有技术已知的方法例如电穿孔或三亲融合将T-DNA载体导入农杆菌。

任选地将所述编码NRC1的核酸序列作为杂合基因序列插入至所述植物基因组中，由此将所述NRC1序列在阅读框内连接至(US5,254,799；Vaeck et al.，1987，Nature328，33-37)编码可选择标记或可记录标记的基因(例如编码卡那霉素抗性的neo(或nptII)基因(EP0242236))，使得所述植物表达容易被检测的融合蛋白。

编码NRC1蛋白(或者变体或片段)的NRC1核酸序列的全部或一部分还可以被用于转化微生物例如细菌(例如大肠杆菌、假单胞菌、农杆菌、芽胞杆菌等)、真菌、藻类或昆虫，或者被用于制备重组病毒。用结合进合适的克隆载体的本发明的NRC1核酸序列的全部或一部分转化细菌可以以常规的方式进行——优选使用Maillon等人(1989，FEMSMicrobiol.Letters60，205-210.)和WO90/06999中描述的常规的电穿孔技术。对于在原核宿主细胞中的表达，所述核酸序列的密码子选择可以做相应的优化(如上文对植物的描述)。如现有技术已知的，应该将内含子序列去除并且进行其他的修改以优化表达。

还可以以不改变翻译的方式，进一步改变NRC1核酸序列的DNA序列，以修饰所述基因部分中存在的可能的抑制DNA序列，并且/或者将变化引入密码子选择，例如将密码子选择调整为植物如上文所述的特别相关的植物属最优选的密码子选择。

根据本发明的一个实施方案，所述NRC1蛋白(或嵌合蛋白)定位于细胞内细胞器例如质体(优选叶绿体、线粒体)或者由所述细胞分泌，这可能会优化蛋白的稳定性和/或表达。类似地，所述蛋白可以定位于液泡。为了该目的，在本发明的一个实施方案中，本发明的嵌合基因包含连接至本发明的NRC1蛋白编码区的编码信号肽或靶向肽的编码区。本发明的蛋白所包含的特别优选的肽为用于叶绿体或其他质体定位的转运肽，尤其是其基因产物定位于所述质体的植物基因的两个(duplicated)转运肽区域、Capellades等人(US5,635,618)优化的转运肽、菠菜铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmuller et al.，1993，Mol.Gen.Genet.237,261-272)、Wong等人(1992，Plant Molec.Biol.20，81-93)描述的转运肽和已公开的PCT专利申请WO00/26371中公开的靶向肽。还优选对与其连接的蛋白的细胞外分泌起信号作用的肽——例如马铃薯蛋白酶抑制因子II的分泌信号(Keil et al.，1986，Nucl.AcidsRes.14，5641-5650)、稻α淀粉酶3基因的分泌信号(Sutliff et al.，1991，Plant Molec.Biol.16，579-591)和烟草PR1蛋白的分泌信号(Cornelissen et al.，1986，EMBO J.5，37-40)。本发明的特别有用的信号肽包括叶绿体转运肽(例如Van Den Broeck et al.，1985，Nature313，358)或者US5,510,471和US5,635,618中的将蛋白转运至叶绿体的优化的叶绿体转运肽、分泌信号肽或将蛋白靶向其他质体、线粒体、ER或另一个细胞器的肽。在天然的靶向蛋白或分泌蛋白中存在靶向至细胞内细胞器或者用于分泌至植物细胞胞外或靶向至细胞壁的信号序列，优选在下述文献中描述的那些信号序列：Kl

sgen等人(1989，Mol.Gen.Genet.217，155-161)、Kl

sgen和Weil(1991，Mol.Gen.Genet.225，297-304)、Neuhaus&Rogers(1998，Plant Mol.Biol.38，127-144)、Bih等人(1999，J.Biol.Chem.274，22884-22894)、Morris等人(1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333)、Hesse等人(1989，EMBO J.8，2453-2461)、Tavladoraki等人(1998，FEBSLett.426，62-66.)、Terashima等人(1999，Appl.Microbiol.Biotechnol.52，516-523)、Park等人(1997，J.Biol.Chem.272，6876-6881)和Shcherban等人(1995，Proc.Natl.Acad.SciUSA92，9245-9249)。

为了使NRC1蛋白分泌至所述被转化的宿主细胞外，可以将合适的分泌信号肽连接于所述NRC1蛋白的氨基末端(N-末端)。推定的信号肽的检测可以使用基于计算机的分析、使用例如信号肽搜索程序(SignalPeptide search)(SignalP，版本1.1或2.0)(Von Heijne，Gunnar，1986和Nielsen et al.，1996)的程序来完成。

在一个实施方案中，多条编码NRC1的核酸序列在单个的宿主中共表达，它们可选地受不同启动子的控制。通过转化已经表达本发明的NRC1蛋白的植株或者通过将本发明的由不同NRC1蛋白转化的植株进行杂交，可以容易地获得共表达的宿主植株。或者，多个编码NRC1蛋白的核酸序列可以存在于单个的转化载体中，或者可以使用不同的载体同时对其进行共转化然后选择包含两种嵌合基因的转化体。相似地，一个或多个编码NRC1的基因可以与其他(例如编码其他的增强抗病性的蛋白或者参与抗病性信号传递通路的蛋白等)的嵌合基因同时在单株植物中表达。

需要理解的是，不同的蛋白可以在同一株植物中表达，或者每种蛋白均在单株植物中表达，然后通过将所述单株植物与另一单株植物杂交把所述蛋白组合于同一株植物中。例如，在杂种种子的制备中，每个亲本植株可以表达单独一种蛋白。当将所述亲本植株杂交产生杂种时，就可以在所述杂种植物中组合两种蛋白。

优选地，为了选择的目的而且亦为了杂草防治选择，本发明的转基因植物还可以被编码可赋予除草剂抗性的蛋白的DNA转化，所述除草剂例如广谱除草剂——例如以草铵膦作为活性成分的除草剂(如Liberty

或BASTA；由PAT或bar基因赋予抗性；参见EP0242236和EP0242246)或者草甘膦(如RoundUp

；由EPSPS基因赋予抗性，参见例如EP0508909和EP0507698)。使用除草剂抗性基因(或者赋予所需表型的其他基因)作为选择性标记还有这样的优点，即可以避免引入抗生素抗性基因。

或者，可以使用其他的选择性标记基因例如抗生素抗性基因。因为将抗生素抗性基因保留在转化的宿主植物中通常不被接受，所以在筛选所述转化体后可以再次将这些基因去除。有不同的技术可用于去除转基因。一种实现去除的方法是通过：在所述嵌合基因的侧翼加入lox位点，在进行筛选后将所述转化的植株与表达CRE重组酶的植株杂交(参见例如EP506763B1)。位点特异的重组导致所述标记基因的切除。另一个位点特异性重组系统是EP686191和US5527695中记载的FLP/FRT系统。例如CRE/LOX和FLP/FRT的位点特异性重组系统也可以被用于基因叠加的目的。此外，现有技术已经记载了单组分切除系统(one-componentexcision system)，参见例如WO9737012或WO9500555。

转化的植物细胞/植物/种子以及本发明的核酸序列和蛋白的用途

在以下的部分中将描述本发明的NRC1序列在产生具有增强的抗病性表型的转基因植物细胞、植物、植物种子等以及它们的任何的衍生物/子代中的用途。

通过这样的途径可以产生具有增强的抗病性的转基因植物，即用受合适的启动子控制的编码至少一种NRC1蛋白的核酸序列转化植物宿主细胞——如上文所述，然后由所述细胞再生转基因植物。

优选的启动子是可由外部生物刺激物和/或非生物刺激物诱导的启动子。尤其优选病原体诱导型启动子——如上文所述。优选的启动子-NRC1组合为：

a)病原体诱导型启动子-编码具有组成型活性的NRC1蛋白的核酸序列；

b)病原体诱导型启动子-编码野生型NRC1蛋白的核酸序列；

c)植物NRC1基因的启动子(优选与所要转化的植物同种)-编码具有组成型活性的NRC1蛋白的核酸序列；

d)植物NRC1基因的启动子(优选与所要转化的植物同种)-编码野生型NRC1蛋白的核酸序列；

e)生物胁迫诱导型启动子(例如昆虫损伤诱导型、病原体诱导型等)

-编码具有组成型活性的NRC1蛋白的核酸序列；

f)生物胁迫诱导型启动子(例如昆虫损伤诱导型、病原体诱导型等)

-编码野生型NRC1蛋白的核酸序列；

g)组成型启动子(例如35S启动子)-编码野生型NRC1蛋白的核酸序列；

h)组成型启动子(例如35S启动子)-编码一种在全长上与SEQ IDNO：2有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。i)病原体诱导型启动子-编码一种在全长上与SEQ ID NO：2有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。

j)植物NRC1基因的启动子-编码一种在全长上与SEQ ID NO：2有至少70％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方案中，所述转基因植物可以表现出组成型HR损伤或者诱导型HR损伤，以及对一种或多种病原体的增强的抗病性。然而，本文也考虑到了不出现HR损伤或出现“弱”HR损伤(例如较小的损伤如微损伤和/或低的损伤频率)而所述植物仍然出现增强的抗病性。本文中(特别是上文的方法g)和h)中)尤其优选这样的NRC1的等位基因或直系同源物，即当在同样的启动子控制下在宿主植物中表达时产生的HR损伤比SEQ ID NO：1或3，或者比从被转化的相同宿主种中获得的野生型NRC1等位基因的表达所产生的HR损伤更少或更小。这些等位基因/直系同源物可以被称为在给定宿主中赋予“弱HR表型”的NRC1等位基因。如本文上文中所述，可以鉴定并且/或者分离这些NRC1等位基因或直系同源物。不同的NRC1等位基因和/或直系同源物的HR表型可以通过这样的方式进行比较，即用它们制备表达载体(优选地，将待对比的所有核酸可操作地连接至相同的启动子例如35S)，用这些表达载体转化植物或植物组织，然后比较这些植物之间的HR损伤的表型。对于茄科植物的转化体，表达SEQ ID NO：1或3的转化体的HR损伤表型优选被用作参照，并且在相同的启动子的控制下表达时任何产生更少和/或更小HR损伤的等位基因都是赋予弱HR表型的等位基因。可以使用多种方法(例如显微术(任选地对死细胞进行染色)；视觉评估、计数损伤以计算每cm²的数目；测定HR损伤的直径等)比较并且任选地定量所述HR损伤的表型。

优选地，本发明的转基因植物具有对一种或多种病原体(尤其是对所述转基因植物种的活体营养性病原体和/或半活体营养性病原体)的增强的抗病性。因此，例如转基因的番茄或马铃薯植物具有对上文中列出的至少一种或多种的真菌种、细菌种、线虫种和/或病毒病原体(最优选对至少一种或数种活体营养的和/或半活体营养的种)的增强的抗性。

本文使用的“抗病性”或“增加的/增强的抗病性”是指(与野生型或对照转化体相比)转化体抵抗一种或多种植物病原体侵袭的增强的能力，或者换而言之，它是指与非转化的(或空载体转化的)对照相比在转化体中的疾病症状的显著降低。使用多种方法可以确定抗病性或增强的抗病性。经常通过在接种或接触病原体后的一个或多个时间点评估所述疾病症状(在生物测试中或者在田地中)用肉眼对疾病症状进行打分。其他可用的方法包括检测并任选地进行定量所述病原体的方法。因此，如果转基因植物与对照相比在组织中/上检测到的病原体的量显著减少，或者所述病原体在所述转基因植物中的扩散比在对照中的扩散显著减慢，那么所述转基因植物有增强的抗病性。最后，当种植于相同的疾病压力下(优选在田地中)时，与对照相比转化体的平均产量的显著增加(例如至少1％、2％、5％、10％或更多)可提供增强的抗病性的间接量度。

因此，如果与未转化的或者空白载体转化的对照相比疾病症状有显著减少，那么表达NRC1蛋白(或具有组成型活性的NRC1蛋白)的大多数转化植物显示增强的抗病性。很明显需要进行统计学分析以确定是否存在显著性差异。优选地，在NRC1转化体中的一种或多种疾病症状平均比对照植物低至少2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％甚至100％。因为疾病测定法对于每种宿主-病原体组合是不同的，所以无法提供具体的方案，但是本领域技术人员知晓怎样确定转化体是否具有对一种或多种病原体的显著增强的抗病性。本领域已知的用每种植物-病原体组合的生物测定法可以被用于比较转基因植物与合适的对照的抗性。

由于NRC1蛋白在某些实施方案中可以在无病原体的情况下产生HR损伤(例如，如果NRC1基因受组成型启动子控制)：在某些实施方案中区分NRC1表达导致的症状与病原体感染和扩散引起的症状是重要的。因此，优选使用检测病原体本身(而不是植物组织上的坏死)的方法，以及比较存在的病原体的量或者病原体的扩散速度。例如可以使用其中通过染色检测所述病原体的生物测定法。在所述实例中，使用了表达GUS的转基因的黄枝孢霉小种。因此，使用X-gluc对所述接种的植物组织进行染色可以观察真菌的菌丝体。与对照相比，所述转基因植株的真菌菌丝体的显著减少表明了对所述真菌的增强的抗性。

另一个实施方案是产生表达多种NRC1蛋白的转基因植株，所述NRC1蛋白优选地受不同的启动子(例如不同的病原体诱导型启动子)的控制。

通过在合适的时间和合适的位点表达合适量的NRC1蛋白，可以对抗病性表型进行微调。通过确定最适当于特定的宿主-病原体组合的启动子并且还通过选择有所需表达水平的转基因“事件”，可以实现这样的微调。在病原体侵袭后过低水平的NRC1蛋白或NRC1蛋白诱导产生的太慢可能会不足以增强抗病性水平。在另一方面，太高的蛋白水平或者在没有病原体侵袭的时间和位点的表达可以导致不合乎需要的农艺表型，例如没有病原体时叶或果实的损伤以及产量的降低。然而，本领域技术人员能够容易地制备具有增强的抗病性的植物，而所述植物同时又是农艺上可接受的。按照上文所述可分离或鉴定最佳的NRC1等位基因——例如提供高抗性水平和弱HR表型的等位基因。

表达所需水平NRC1蛋白的转化体通过例如分析拷贝数目(DNA印迹分析)、mRNA转录水平(例如使用NRC1引物对或侧翼序列引物的RT-PCR)或者通过分析各个组织中NRC1蛋白的存在和水平(例如SDS-PAGE、ELISA测定等)来进行筛选。由于调控的原因，优选单拷贝的转化体，并且分析(优选测序)嵌合基因插入位点的侧翼序列以表征该“事件”。选择高度或中等NRC1表达的转基因事件用于进一步地杂交/回交/自交，直至获得具有稳定的NRC1转基因的高效的优势事件。

表达本发明的一种或多种NRC1基因的转化体还可以包含其他的转基因——例如赋予对其他生物胁迫和/或非生物胁迫的抗病性或耐受性的其他基因。为了获得这种具有“重叠的”转基因的植物，可以将其他转基因渗入至所述NRC1转化体中，或者可以在随后用一种或多种其他基因转化所述NRC1转化体；或者可以用多个嵌合基因转化植物系或变种。例如，多个嵌合基因可以存在于单载体中，或者可以存在于共转化的不同载体中。

在一个实施方案中，以下的基因与本发明的一个或多个NRC1基因组合：已知的抗病基因(尤其是赋予抗死体营养性病原体的增强的抗性的基因)、抗病毒基因、抗昆虫基因、抗非生物胁迫基因(例如耐干旱性、耐盐性、耐热或耐冷性等)、抗除草剂基因等。因此，所述重叠的转化体可以有更广谱的生物应激耐受性和/或非生物应激耐受性、病原体抗性、昆虫抗性、线虫类抗性、盐度、冷胁迫、热胁迫、水胁迫等。同时，可以在单植物中将NRC1沉默方法与NRC1表达方法联合使用。例如，NRC1在根或根茎中的过量表达可以赋予或者增强根或根茎对土壤病原体的抗性。同时，NRC1在地上部分中的下调可以赋予对死体营养性病原体的抗性(或反之亦然)。

还有可能将所述NRC1基因导入或渗入至已经具有一定水平抗病性的植物育种品系中。为了获得田地中的持续抗病性，可能需要在一种植物中叠加多种抗病机制，优选地由此所述抗性源具有不同的潜在分子机制。

本文包括上述任何转基因植物的全植株、种子、细胞、组织和子代(例如F1杂种、F2种子/植株等)，并且可以通过其DNA中存在所述转基因对它们进行鉴定——例如通过使用总基因组DNA为模板和使用NRC1特异的PCR引物对的PCR分析。也可以开发“事件特异的”PCR诊断方法，其中所述PCR引物是基于位于所述插入的嵌合基因侧翼的植物DNA，参见US6563026。类似地，可以开发事件特异的AFLP指纹或RFLP指纹，所述AFLP指纹或RFLP指纹可鉴定所述转基因植物或由其获得的任何的植物、种子、组织或细胞。

需要理解的是，本发明的转基因植物优选地没有不利的表型，例如产量减少、增强的对疾病(尤其对死体营养)的易感性或不合乎需要的形态变化(矮化、变形)等，并且如果在所述原代转化体中出现这些表型，则可以通过正常的育种和选择方法(杂交/回交/自交等)将其去除。本文描述的任何转基因植物对于所述转基因都可以是纯合的或半合的。

NRC1基因沉默方法和基因沉默载体

本发明的另一个实施方案还提供了具有增强的抗病性(尤其是针对抗死体营养性病原体)的植物，由此所述植物被NRC1基因沉默载体转化。这样的想法不是对本发明的范围的限制，即对内源性NRC1基因或基因家族的沉默会造成所述转基因植物失去触发和/或启动HR应答的能力。由于死体营养性病原体的生长和发育需要细胞的死亡，这样的植物可以具有对一种或多种死体营养性病原体的增强的抗性。

“基因沉默”是指一种或多种靶基因(例如内源的NRC1基因)的基因表达的下调或完全抑制。抑制性RNA在降低或消除基因表达中的用途已经在本领域中被确立，并且是多篇综述文献的研究主题(例如Baulcombe1996，Stam et al.1997，Depicker and Van Montagu，1997)。现有的多种技术可以在植物中实现基因沉默——例如产生全长或部分靶基因的反义RNA的嵌合基因(参见例如EP0140308B1、EP0240208B1和EP0223399B1)，或者产生正义RNA(也被称为共抑制)的嵌合基因(参见EP0465572B1)。

然而，迄今为止最成功的方法是同时产生所述靶基因(“反向重复序列”)的正义RNA和反义RNA，它在细胞中形成双链RNA(dsRNA)并且沉默所述靶基因。用于dsRNA产生和基因沉默的方法和载体已经记载于EP1068311、EP983370A1、EP1042462A1、EP1071762A1和EP1080208A1中。因此，本发明的载体可以包含在植物细胞中有活性的转录调控区，所述转录调控区可操作地连接至本发明的NRC1基因的正义和/或反义DNA片段。通常，所述靶基因序列的短(正义和反义)片段，例如编码或非编码序列的17、18、19、20、21、22或23个核苷酸就足矣。也可以使用较长的序列，例如50、100、200或250个核苷酸或者更多。优选地，所述短的正义和反义片段可以被间隔序列例如内含子隔开，该序列在形成dsRNA时产生一个环(即发夹)。SEQ ID NO：1或3或者它们变体的任何短片段可以被用于制备NRC1基因沉默载体和转基因植物，其中在所有或某些组织或器官(依赖于所使用的启动子)中一种或多种的NRC1基因被沉默。产生发夹构建体的方便的方法是使用通用载体例如pHANNIBAL和pHELLSGATE、基于

技术的载体(参见Wesley etal.2004，Methods Mol Biol.265：117-30；Wesley et al.2003，MethodsMol Biol.236：273-86and Helliwell & Waterhouse2003，Methods30(4)：289-95.)，所有这些文献通过引用的方式纳入本文。

通过选择NRC1基因的保守核酸部分，可以沉默宿主植物或植物部分中的NRC1家族成员。本文还涵盖这样的转基因植物，它包含一种可操作地连接至NRC1基因的正义和/或反义DNA片段的转录调控元件，并且对一种或多种病原体(尤其是死体营养性病原体)有增强的抗性。

同时提供了对一种或多种活体营养性病原体和/或半活体营养性病原体并且对一种或多种死体营养性病原体有增强的抗性的植物。这样的植物可以通过选择合适的启动子-NRC1基因组合产生。例如，可以在某一时间的某一组织中(例如在诱导时或者在植物地上部分中)产生功能性的NRC1蛋白，提供对活体营养性和/或半活体营养性病原体的抗性；而同时在不同组织中和/或在不同时间(例如在幼苗中，在根或块茎中等)一种或多种所述内源的NRC1基因被沉默，从而提供对一种或多种死体营养性病原体的抗性。因此，单独一种植物可以同时包含嵌合的表达NRC1的转基因和NRC1的沉默基因。

本发明的突变等位基因和植物

本发明的一个实施方案还有使用非转基因的方法例如TILLING(定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Lesions INGenomics)；McCallum et al.，2000，Nat Biotech18：455和McCallumetal.2000，Plant Physiol.123，439-442，这两篇文献都通过引用的方式纳入本文)等诱变系统和选择，来形成产生较高水平的本发明的一种或多种NRC1蛋白并且/或者产生具有组成型活性的所描述的NRC1蛋白的植物品系。不是对本发明的范围的限制，本发明人相信这些植物的启动子的抑制蛋白结合位点中可以包含点突变/缺失突变，所述点突变/缺失突变将使所述宿主NRC1基因组成型表达或者较高水平表达。具有组成型活性的NRC1突变将包含编码区(例如MHD区)中的突变。优选地，所述突变体或所述突变体的部分中的NRC1蛋白水平与非突变的植物相比增加至少约2、5、10、15％或更多。TILLING使用传统的化学诱变(例如EMS诱变)，随后对突变体进行高通量筛选(例如使用Cell酶切割突变体-野生型DNA异源双链并且使用测序凝胶系统检测)，参见例如Henikoff et al.Plant Physiology Preview May21，2004。因此，本发明涵盖在一种或多个组织中具有增强的NRC1基因表达并且具有一种或多种本发明的NRC1表型(增强的抗病性和/或HR损伤)的非转基因植物、种子和组织，以及用于产生和鉴定这样的植物的方法。

在一个实施方案中，所述方法包含下述步骤：将植物种子诱变处理(例如EMS诱变)、收集植物个体或DNA、PCR扩增目的区域、形成异源双链体并进行高通量检测、鉴定所述突变植物、将所述突变体PCR产物测序。应理解的是，同样可以使用其他的诱变和筛选方法以产生这样的突变植物。例如，可以对种子进行辐射或化学处理并且在植株中筛选变化的表型，例如增强的抗病性和/或HR损伤。

在本发明的另一个实施方案中，所述植物材料是所述物种或相关物种的自然群体(populations)，所述物种或相关物种在位于NRC1直系同源基因编码序列和/或调控序列的DNA序列中包含多态性或变异。使用ECOTILLING方法(Henikoff et al2004，见上文)可以筛选在所述NRC1基因靶标的突变。在该方法中，可以通过上述的TILLING方法筛选育种系或者相关物种中的天然多态性，其中植物的个体或群体(pools)被用于NRC1靶标的PCR扩增、异源双链体的形成和高通量分析。随后可以选择具有所需突变的植物个体，所述植物个体可以被用于随后的育种程序，以引入所需的NRC1-直系同源的等位基因以便用于开发具有所需性状的栽培种。

通过分子方法(例如DNA中存在的一个或多个突变、NRC1蛋白水平、NRC1RNA水平等)并且通过变化的表型特征可以将突变植物与非突变体区分开。

所述非转基因的突变体对于所述突变来说可以是纯合的或杂合的。

序列参照

SEQ ID NO1：番茄NRC1基因的编码区

SEQ ID NO2：番茄NRC1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO3：番茄NRC1基因的全长cDNA(包括5′和3′UTR)

SEQ ID NO4：番茄NRC1^D481V蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO5：番茄NRC1基因的3′UTR

附图说明

图1-预测的NRC1蛋白序列

前150个氨基酸残基表示卷曲螺旋(CC)结构域，并且预测形成所述CC结构的残基用下划线标示。第151-508位残基包含核苷酸结合(NB-ARC)结构域，它具有下列基序(由下划线并标出)：激酶1A(P环)、RNBS-A、激酶2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL、RNBS-D和MHD。第509-846位残基包含13个非完全的富含亮氨酸的重复单元(LRR)；保守的疏水残基和脯氨酸残基以粗体标示。在所述蛋白序列的下方，LRR共有基序被标出：‘1’表示保守的脂肪族残基，‘c’表示保守的带电荷残基，并且‘P’表示保守的脯氨酸残基。

图2A-NRC1是Cf-4介导的番茄对黄枝孢霉的完全HR所必需的

将Cf0番茄植株和包含Cf-4的番茄植株用指定的TRV构建体接种，在VIGS开始后3周分析所述植株。在TRV感染的含Cf-4的番茄植株的小叶中注入Avr4蛋白并检查HR的发生。将在TRV：00感染的植物上出现HR位点的数目设定为100％。每个误差条都代表4次独立实验的标准误差。

图2B-NRC1是Cf-4介导的番茄对黄枝孢霉的完全抗性必需的

将非TRV感染的和TRV感染的Cf-4或Cf-0植株用黄枝孢霉-pGPD：：GUS接种，并且在接种后2周用X-gluc测定法研究小叶的定殖。

图3-用TRV：NRC1接种本生烟草会影响Cf/Avr、LeEix2/tvEix、 Pto/AvrPto和Rx/CP诱导的HR

用TRV：00(空载体)、TRV：NRC1和TRV：SGT1接种本生烟草。在3周后，用表达诱导HR的蛋白的农杆菌浸润叶并在浸润后的4天拍照。第1列、第2列和第3列是分别以Avr4、以Cf-9和Avr9的混合物或者以LeEix2和tvEix混合物(以1:1的比例混合)进行农杆菌浸润的表达Cf-4抗性基因的本生烟草叶。第4列：由AvrPto进行农杆菌浸润的表达Pto抗性基因的转基因本生烟草叶。第5列：用表达PVX(CP)包被蛋白的基因进行农杆菌浸润的表达Rx抗性基因的转基因本生烟草叶。暗圈表示HR，亮圈表示弱化的HR。

图4-具有组成型活性的NRC1诱导不依赖于诱导子的HR并且使NRC1 定位于细胞死亡信号传递通路中

将表达Cf-4抗性基因的本生烟草用指定的基因进行农杆菌浸润。对于图A和图C，在进行农杆菌浸润前3周将所述植物用指定的TRV构建体接种。暗圈表示HR，亮圈表示弱化的HR。

(A)编码具有组成型活性的MAPKK和MAPK激酶的基因的农杆菌浸润。第1列：用编码LeMAPKKK(MAPKKK-KD)的具有组成型活性的激酶结构域的基因进行农杆菌浸润。第2列：用编码组成型活性形式的LeMEK2(MEK2DD)的基因进行农杆菌浸润。用MAPKKK-KD或MEK2DD浸润2天后，以雌二醇喷洒叶来诱导表达。在农杆菌浸润后4天拍照。

(B)受35S启动子调控的野生型NRC1(wt)和该基因的突变形式的农杆菌浸润，所述基因以1:1的比例与指导编码沉默抑制子p19的基因表达的农杆菌混合使用(左图)或者单独使用(右图)。NRC1^K191R(K191R)：NRC1的无活性P-环突变体；NRC1^D481V(D481V)：具有组成型活性的NRC1(在MHD基序中有突变)；NRC1^K191R/D481V(K191R/D481V)：NRC1的双突变体。在农杆菌浸润后3天拍照。

(C)Avr4和编码具有组成型活性的NRC1^D481V(D481V)的基因的农杆菌浸润。在农杆菌浸润后3天拍照。

图5-NRC1介导的细胞死亡信号传递模型

模型基于在本生烟草中将细胞死亡测定和VIGS结合的异位显性实验(epistasis experiment)。Cf-4/Avr4以EDS1、NRC1、MEK2和SGT1/RAR1依赖的方式介导细胞死亡信号。

如下的非限制实施例举例说明了本发明的不同的实施方案。除非在实施例中另外声明，否则所有重组DNA技术都是按照在Sambrook et al.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press中；Sambrook and Russell(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY中；以及在Ausubel et al.(1994)Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷中记载的标准方法完成。用于植物分子实验的标准材料和方法在Plant MolecularBiology Labfax(1993)byR.D.D.Croy，jointly published by BIOSScientific Publications Ltd(UK)and Blackwell ScientificPublications，UK中有记载。

实施例

1.材料和方法

1.1本生烟草中的VIGS、农杆菌浸润、HR和疾病测定

用pTV00-衍生的构建体(二元TRV RNA2载体)和pBintra6(二元TRV RNA1载体)的1:1混合物(Ratcliff et al.，2001Plant J.25，237-245)，或者用pTRV-RNA2衍生的构建体和pTRV-RNA1的1:1混合物(Liu et al.，2002，Plant J.31，777-786；Liu et al.，2002，PlantJ.30，415-429)对4周龄的本生烟草植株进行了农杆菌浸润。使用了下列TRV构建体：TRV：NRC1、TRV：Cf-4和TRV：SGT1(Peart et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，10865-10869)，它们都在Ratcliff等人(2001，见上文)描述的TRV载体中；以及TRV：EDS1、TRV：MEK2、TRV：RAR1和TRV：NDR1(Ekengren et al.，2003，Plant J.36，905-917)，它们都在Liu等人(2002，Plant J.30，415-429)描述的TRV载体中。对于每种TRV构建体，每次实验均使用4株植物。AvrPto和CP分别对表达抗性基因Pto(本生烟草：Pto(品系38-12)(Rommens et al.，1995，Plant Cell7，1537-1544))(Pedley and Martin，2003，Annu.Rev.Phytopathol.41，215-243)和Rx(本生烟草：Rx(品系Rx-18)(Bendahmane et al.，1999，Plant Cell11，781-791))的TRV感染的本生烟草进行农杆菌浸润。在所有其他情况下，用表达抗性基因Cf-4的本生烟草(本生烟草：Cf-4)进行农杆菌浸润。在TRV接种后3周，以这样的根瘤农杆菌攻击所述接种叶上面的第3、4和5片叶，即所述根瘤农杆菌指导下列基因的表达：AvrPto(OD₆₀₀＝0.06)(Tang et al.，1996，Science274，2060-2063)；CP(OD₆₀₀＝0.12)(Bendahmane et al.，1999，见上文)；Avr4(OD₆₀₀＝0.03)、Cf-9和Avr9(以1:1的比例混合，OD₆₀₀＝0.2)(Van der Hoorn et al.，2000Mol.Plant-Microbe Interact.13，439-446)；LeEix2和tvEix(以1:1的比例混合，OD₆₀₀＝1)(Ron and Avni，2004，Plant Cell16，1604-1615)；β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(OD₆₀₀＝2)(Van der Hoorn et al.，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13，439-446)；NRC1和p19(以1:1的比例混合，OD₆₀₀＝1)(Voinnet etal.，2003，Plant J.33，949-956)；具有组成型活性的NRC1D481V或无活性的NRC1^K191R/D481V双突变(OD₆₀₀＝2)；LeMAPKKKα^KD、LeMAPKKKα^KD-(Del Pozo et al.，2004，EMBO J.23，3072-3082)(两者都是OD₆₀₀＝0.12)；或者LeMEK2DD和LeMEK2(Del Pozo et al.，2004，见上文)(两者都是OD₆₀₀＝0.25)。LeMAPKKKα^KD、LeMAPKKKα^KD-、LeMEK2DD或LeMEK2浸润后2天，以含silwet(4μl/100ml)的7.5μM的17-β-雌二醇水溶液对叶进行喷洒(Del Pozo et al.，2004，见上文)。为了进行蛋白的注入，依照厂商的建议(Invitrogen，Breda，NL)使用肠激酶EK-max处理Avr4-HIS-FLAG标记的蛋白，并且将添加0.2％吐温(v/v)的5μM的Avr4蛋白水溶液用于注入。在农杆菌浸润或蛋白注入后3-5天，检查叶上HR的形成，或者测定β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的活性。

1.2番茄中的VIGS、HR和疾病测定

为了在番茄中进行VIGS，使用了Liu等人(2002，Plant J.30，415-429)描述的pTRV-RNA1和pTRV-RNA2载体。通过使用BamH1/Asp718的消化从pTV00上切下Cf-4和NRC1片段，并将其插入至BamH1/Asp718-消化的pTRV-RNA2(pYL156)(Liu et al.，2002，Plant J.31，777-786)。为了构建TRV：222-UTR，使用引物222-3’UTR-F(5’-GTGGATCCGCAGGTTCAACCAGCCTGGT-3’；BamH1位点用下划线标出)和222-3’UTR-R(5’-GTGGTACCCAAGTGACTTGTTCTGCTGT-3’；Asp718位点用下划线标出)扩增了NRC13’-UTR的一部分；并且为了构建TRV：222-LRR，使用引物222-LRR-F(5’-GTGGATCCGTTAAGAGGCTGCAATTTCT-3’；BamH1位点用下划线标出)和222-LRR-R(5’-GTGGTACCGATCTTCTCAAGTTTATCAC-3’；Asp718位点用下划线标出)扩增了编码LRR的NRC1区的一部分。所述PCR片段经BamH1/Asp718-消化并被插入至BamH1/Asp718消化的pTRV-RNA2中。TRV：Prf的构建在(Ekengren et al.，2003，Plant J.36，905-917)中有记载。使用电穿孔将所有质粒转化到根癌农杆菌株GV3101中(Takken et al.，2000，Plant J.24，275-283)。为了在番茄中建立VIGS，用pTRV-RNA1和pTRV-RNA2衍生的构建体的混合物(以1:1的比例组合)对番茄幼苗的10-12日龄的子叶进行农杆菌浸润(Liu et al.，2002，见上文)。对于每种TRV构建体，使用4株对表达Avr4的黄枝孢霉有抗性的且含Cf-4的番茄植株(以Hcr9-4D(Cf-4)转化的Cf0植物)(Thomas et al.，1997，Plant Cell9，2209-2224)，或者4株对表达Avr9的黄枝孢霉有抗性的且含Cf-9的番茄植株(以Hcr9-9C(Cf-9)转化的Cf0植物)(Jones et al.，1994，Science266，789-793)。使用了以TRV：00接种的或者以TRV：NRC1接种的对黄枝孢霉完全敏感的Cf0番茄植株(MM-Cf0)作为对照。为了进行疾病测定，TRV接种后3周将Cf0植株和含Cf-4的植株用黄枝孢霉接种(De Wit，1977，Neth.J.Plant Path.83，109-122)。使用了黄枝孢霉的小种5-pGPD：：GUS(在组成型GPD启动子控制下表达Avr4和β-葡糖醛酸糖苷酶基因)。两周后通过X-gluc染色评估小叶的定殖。同时，所述植株的第2、第3或第4复叶的小叶被用于RT-PCR分析，以测试目的基因的“敲低”(见下文)。为了进行HR测定，在TRV感染的含Cf-4或Cf-9的植株的第3复叶的小叶中分别注入Avr4或Avr9。使用微量注射器(Ito Corporation，Fuji，Japan)在小叶中注入两种诱导子。在每株植物的四片小叶且每片小叶的10个位点注射浓度为10μM的Avr4。对于Avr9，从黄枝孢霉的小种5和Cf0植物的匹配相互作用物中分离的含约10μM的Avr9的细胞质外体(apoplastic)液经8倍稀释，注射于每株植物的四片小叶且每片小叶的8个位点上。在接种TRV：00、TRV：Prf或TRV：NRC1的番茄RG-PtoR(Pto/Pto，Prf/Prf)中测定了对丁香假单胞菌番茄致病变型的抗性。接种的方法以及叶细菌定殖的确定按照上文的描述进行(Ekengrenet a l.，2003，见上文)。

1.3二元35S：NRC1载体的构建和诱变

使用引物

222-Start-F(5’-GGGATCCATGGTTGATGTAGGGGTTGA-3’)和

222-Stop-R(5’-GTCACTGCAGACCTTTCTAAGAAGCTGTCTG-3’)

PCR-扩增全长NRC1cDNA，从而分别引入NcoI和PstI限制位点(限制位点用下划线标出)。所述PCR片段经NcoI/PstI消化并被插入NcoI/PstI消化的pRH80中(Van der Hoorn et al.，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13，439-446)。随后，所述构建体经XbaI/KpnI消化，产生的含有35S启动子、NRC1开放阅读框和NOS终止子(tNOS)的片段被克隆至XbaI/KpnI消化的pMOG800二元载体中(Honée et al.，1998，Plant Physiol.117，809-820)，以形成质粒NRC1(wt)。为了形成具有组成型活性的二元NRC1^D481V，通过重叠延伸PCR(Higuchi etal.，1988，Nucleic Acids Res.16，7351-7367)导入D481V突变，所述PCR使用NRC1wt质粒作为模板并且使用侧翼引物222-Start-F、222-Stop-R以及错配引物

222MHD-F(5’-CAAAACTTGTCGTGTTCATGTCATGTTGTATGAG-3’)和222MHD-R(5’-CCAGCAAAACTCATACAACATGACATGAACACGAC-3’)(突变用下划线标出)。

所述片段经NcoI/PstI消化，被插入至pRH80中，并且将35S-NRC1^D481V-tNOS片段切下，然后将其插入pMOG800中——如上述。以类似的方式形成P-环突变体NRC1^K191R和无活性双突变体NRC1^K191R/D481V。这里，K191R突变的引入是使用错配引物222Ploop-F(5’-GGAATGCCTGGTCTTGGCAGAACTACACTAGC-3’)和222Ploop-R(5’-GCTAGTGTAGTTCTGCCAAGACCAGGCATTCC-3’)(突变用下划线标出)，并且分别以质粒NRC1(wt)和NRC1^D481V作为模板。所有的构建体均经序列确证并被转化至根癌农杆菌株GV3101中。

1.4DNA凝胶印迹分析

使用QIA-Gen DNA提取方案(Qiagen，Venlo，NL)分离本生烟草的基因组DNA，而对于番茄则使用(Sambrook and Russell，2001，Molecular cloning：A Laboratory Manual，第3版.(Cold SpringHarbor，NY，U.S.A.：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的标准方案。用BamHI、HindIII、EcoRI、EcoRV或XbaI消化所述DNA。用TRV：NRC1载体中252bp的³²P标记(Prime-a-gene Labeling System，Promega，Madison，WI)片段杂交本生烟草的凝胶印迹物，并且用对应于全长NRC1 cDNA的第1876-3168位核苷酸的1293个碱基的³²P-标记探针杂交番茄的DNA凝胶印迹物。所使用的限制性酶位点并不存在所述探针中。低严格度是指55℃下在2x SSC和0.5％SDS中洗涤。高严格条件包括65℃下在0.5x SSC和0.5％SDS中洗涤。

1.5RT-PCR显示番茄中NRC1的沉默

从TRV-感染植物的第2、第3或第4复叶收集4个叶盘(leaf disc)(总计大约100mg组织)。使用QIA-Gen RNAeasy提取方案(Qiagen，Venlo，NL)提取总RNA，并且用无RNA酶的DNA酶(Bio-Rad，Veenendaal，NL)进行处理。使用Bio-Rad cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Veenendaal，NL)用1μg总RNA合成cDNA的第一条链，并且使用以下的循环进行RT-PCR：95℃下15秒，60℃下45秒，以及72℃下60秒。所使用的引物

(222F：5’-TGAGGTATATTGCTTTCTCATCTGAC-3’和

222R：5’-AGCTATTTTCCCACGGATGCCCAG-3’)

不覆盖插入TRV：NRC1中的片段。肌动蛋白引物

(ActinFnr182：5’-TATGGAAACATTGTGCTCAGTGG-3’和

ActinRnr183：5’-CCAGATTCGTCATACTCTGCC-3’)

被用于检查在所述PCR反应物中是否存在等量的cDNA。

实施例2-结果

2.1番茄NRC1；CC-NB-LRR蛋白

进行了cDNA-AFLP分析，随后对本生烟草：Cf-4中的经鉴定的番茄片段进行VIGS。20条cDNA片段被鉴定，这些片段的VIGS影响Cf-4/Avr4诱导的HR。对于其中的一条——NRC1，分离了它的全长cDNA，如SEQ IDNO：3所示。NRC1的开放阅读框在SEQ ID NO：1中示出，其编码SEQ IDNO：2所示的NRC1蛋白。

所述NRC1蛋白(SEQ ID NO：2)的预测的一级结构一般类似于CC-NB-LRR抗性蛋白的一级结构(图1)。NRC1有一个氨基端卷曲螺旋(CC)结构域、一个NB-ARC(Apaf-1、R蛋白和CED4共有的核苷酸结合接头)结构域(Van der Biezen and Jones，1998，Curr.Biol.8，R226-R227；Aravind et al.，1999，Trends Biochem.Sci.24，47-53)和13个不完全的富含亮氨酸的重复单元(LRR)。如图1中所示，与同源的NB-ARC结构域的比较表明存在一个激酶1A或P-环基序、4个RNBS(抗性核苷酸结合部位)基序以及一个GLPL和MHD基序(Meyers et al.，1999，Plant J.20，317-332；Meyers et al.，2003，Plant Cell15，809-834)。

在用于VIGS的TRV：NRC1载体中存在的252bp的cDNA-AFLP片段编码氨基酸599-681，它们位于第4-7个LRR中。

将BamHI、HindIII、EcoRI、EcoRV和XbaI消化的番茄基因组DNA用作为探针的1293bp NRC1 cDNA片段(SEQ ID NO：3的第1876-3168位核苷酸)来杂交，从而进行低严格度DNA凝胶印迹分析，所述NRC1 cDNA片段涵盖了存在于TRV：NRC1、TRV：NRC1-LRR和TRV：NRC1-UTR构建体(见下文)中的NRC1序列。该DNA印迹显示，在高严格度洗涤后仅剩下一条主带，这说明NRC1在番茄中是单拷贝基因。

用TRV载体中的番茄NRC1 cDNA-AFLP片段探测经BamHI、HindIII、EcoRI、EcoRV和XbaI消化的本生烟草基因组DNA的凝胶印迹物，出现了2-3条杂交带(结果未显示)(0.5x SSC，0.5％SDS，65℃)。该结果说明了在本生烟草的基因组中至少存在有2-3种在用TRV：NRC1接种时可被沉默的NRC1直系同源物。

2.2NRC1沉默的番茄在Cf-4介导的HR和抗病性方面受到影响

为了研究NRC1在HR信号传递和黄枝孢霉抗性中的作用，本发明人在番茄中进行了VIGS，这是因为番茄是这种真菌唯一的宿主。用TRV：NRC1对10日龄的番茄幼苗进行农杆菌浸润，在浸润后3周从潜在被沉默的小叶中分离RNA并使用RT-PCR进行分析。所述NRC1转录物水平在不同的TRV：NRC1感染植物中有变化，但在多数情况下它们均低于TRV：00感染的植物中的水平，这表明发生了NRC1表达的“敲低”(数据未显示)。

为了排除这样的可能性，即本发明人在番茄中观察到的表型是由其他NB-LRR蛋白的沉默引起的，本发明人还使用靶向第8-12个LRR的360bp的NRC1片段(TRV：NRC1-LRR)以及由297bp组成的NRC1的3′-非翻译区(UTR)的片段(TRV：NRC1-UTR)在番茄中进行了VIGS。通过将Avr4蛋白注入至TRV：222-LRR和TRV：222-UTR感染的、含Cf-4的番茄植株中，本发明人使用这些构建体测试了NRC1对于番茄中Cf-4介导的HR是否是必需的。(使用所述3种构建体中的每种)对NRC1的沉默导致了轻度的表型变化，其表现是所述番茄植株比TRV：00或TRV：Cf-4感染的植株稍小(数据未显示)。将Avr4蛋白注入至TRV：00和TRV：Cf-4感染的植株中作为对照。在TRV：Cf-4感染植株中，Avr4注入位点的应答百分数是52％(图2)，这表明由于Cf-4的沉默而导致了HR的减少。在TRV：222-LRR和TRV：222-UTR感染的植株中，该百分数类似(分别是56％和48％)(图2)，在番茄中也确证了NRC1在Cf-4/Avr4诱导的HR中的作用。当在含Cf-9的番茄中对Nrcl进行VIGS以及随后注入包含Avr9的细胞质外体液时也获得了类似的结果(未显示)。为了在含Cf-9的番茄中对Cf-9进行VIGS，本发明人使用了TRV：Cf-4构建体，这是因为404bp的Cf-4编码高度保守的第15-21个LRR，能够同时沉默Cf-4以及同源的Cf-9抗性基因(Van der Hoorn et al.，2001，见上文)。

再者，还研究了NRC1是否也是番茄对黄枝孢霉的完全抗性所必需的。将Cf0和Cf-4植株用TRV：00、TRV：Cf-4和TRV：NRC1接种，3周后将沉默的植株用表达Avr4和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的黄枝孢霉菌株接种，由此将真菌的生长可视化。在黄枝孢霉接种后2周，用X-gluc对叶进行染色。在以TRV：00感染的Cf-4植株的小叶上没有检测到黄枝孢霉的生长，而在TRV：Cf-4感染的Cf-4植株中蓝染色的斑表明弱化的Cf-4介导的抗性(未显示)。在TRV：NRC1感染植株中蓝染色的小斑还表明了对该真菌完全失去抗性。显微镜分析显示，在TRV：Cf-4和TRV：NRC1感染植株中有细胞内生长的真菌菌丝，而在TRV：00感染的对照植株中没有。所有的Cf0植株均表现出大量的黄枝孢霉定殖，这说明既不是TRV感染本身也不是使用TRV：NRC1的VIGS影响了这些植物对该真菌的敏感性。

2.3NRC1的VIGS可影响由不同的匹配R基因/Avr基因组合诱导的 HR

在使用NRC1进行VIGS时除了减少了Cf-4/Avr4诱导的HR之外，发明人发现在本生烟草中使用NRC1进行VIGS时还减少了由卵菌(oomycete)病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)的Inf1诱导子诱导的HR。为了进一步研究NRC1在防御信号传递中的特异性，本发明人测试了由另外的R/Avr组合诱导的HR对它的需求。以TRV：00(空载体)和TRV：SGT1作为对照，这是因为现有技术已知SGT1对于由多种R/Avr组合诱导的HR来说是必需的(Peart et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，10865-10869)。

Cf-9和Avr9的混合物(Van der Hoorn et al.，2000，见上文)或者LeEix2和tvEix的混合物(Ron and Avni，2004，Plant Cell16，1604-1615)对TRV：NRC1感染的本生烟草的农杆菌浸润导致HR的减少，而在TRV：00感染的植株中HR正常发生。在TRV：SGT1感染的植株中HR被完全地消除，这证实了Peart等人(2002，见上文)的发现(图3)。同时，将细菌病原体丁香假单胞菌番茄致病变型的AvrPto和编码马铃薯X病毒(PVX)包被蛋白(CP)的基因分别对表达抗性基因Pto(Pedley andMartin，2003，Annu.Rev.Phytopathol.41，215-243)和Rx(Bendahmane et al.，1999，Plant Cell11，781-791)的TRV感染的本生烟草进行农杆菌浸润。在两种情况下，以TRV：00感染的植株均出现HR，而TRV：SGT1感染的植株中HR被消除。TRV：NRC1感染除了深度抑制Rx/CP诱导的HR外，还深度抑制Pto/A vrPto诱导的HR，这表明在本生烟草中由多种R/Avr基因-对-基因组合激活的HR信号传递需要NRC1蛋白(图3)。

为了排除这样的可能性，即在TRV：NRC1感染的本生烟草中弱化的HR是农杆菌的转化率的降低的结果，本发明人用表达β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的农杆菌(Van der Hoorn et al.，见上文)浸润TRV：00和TRV：NRC1感染的本生烟草：Cf-4。进行浸润3天后，TRV：00和TRV：NRC1感染的植株中的相似强度的蓝染色表明了农杆菌对所述植株的转化率没有受到影响(数据未显示)。另外，用Avr4蛋白注入时所述TRV：NRC1感染的植株也显示出HR的减少，而在TRV：00感染的植株中2天内出现了明显的HR。

2.4NRC1作用于细胞死亡信号传递途径中EDS1的下游和MAPK级联 的上游

因为不但Cf-4/Avr4诱导的HR，而且多个其他R/Avr组合诱导的HR都需要NRC1，所以NRC1似乎会参与共同的HR信号传递途径。出现在HR起始前的典型宿主反应包括MAPK级联的激活(Romeis et al.，2001，EMBO J.20，5556-5567；Del Pozo et al.，2004，EMBO J.23，3072-3082；Pedley and Martin，2005，Plant Biol.8，541-547)。

为了研究由MAPK启动的HR对NRC1的需求，在本生烟草中进行了异位显性实验。将植株用TRV：00、TRV：SGT1和TRV：NRC1接种，然后用编码LeMAPKKKα的激酶结构域(LeMAPKKKα^KD)或具有组成型活性的LeMEK2(LeMEK2DD)的基因进行农杆菌浸润(Yang et a l.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，741-746；Del Pozo et al.，2004，EMBO J.23，3072-3082.)。进行农杆菌浸润2天后，通过用雌二醇喷洒经浸润的叶诱导所述基因的表达。在TRV：00感染的植株中每个基因的短暂表达均形成了HR，而在TRV：SGT1感染的植株中HR减少(图4A)。在TRV：NRC1感染的植株中，两种具有组成型活性的激酶引起的HR都不受影响(图4A)。相应的阴性对照——LeMAPKKKα^KD和野生型LeMEK2的农杆菌浸润在任何TRV感染的植株中都没有导致HR(数据未显示)。这些结果表明，SGT1在这些MAPK的下游区起作用，而MAPK作用于NRC1的下游区或者独立于NRC1发挥作用。

2.5NRC1的短暂过表达以及具有组成型活性的NRC1蛋白的构建

为了进一步研究哪些基因是CC-NB-LRR蛋白介导的HR信号传递所必需的，研究了NRC1过表达的作用。因此，将所述cDNA的编码序列(SEQID NO：1)与组成型35S启动子融合并插入至二元载体中。该构建体对本生烟草的农杆菌浸润没有导致HR，而NRC1和p19沉默抑制子(Voinnetet al.，2003，Plant J.33，949-956)的混合物的表达确实引起了不依赖于诱导子的HR(图4B)。编码NRC1的P-环突变体(K191R)的构建体的农杆菌浸润破坏了P-环基序，从而影响ATP的水解(Tameling et al.，2002，Plant Cel l14，2929-2939)，不管有没有p19都没有形成HR(图4B)。

因此，上述的数据表明所述NRC1基因的转录后基因沉默(PTGS)可以阻止在NRC1过表达组织中发生HR。同时，P-环基序的破坏会形成无功能的NRC1蛋白。

因为在NB-LRR抗性蛋白Rx(D460V)(Bendahmane et al.，2002；Tameling et al.，2002)和I-2(D495V)(Bendahmane et al.，2002，Plant J.32，195-204；Tameling et al.，2002，Plant Cell14，2929-2939；Van Bentem et al.，2005，Plant J.43，284-298)的MHD基序中的突变会产生组成型活性，所以本发明人制备了类似的NRC1的突变体(NRC1^D481V)。事实上，在NRC1^D481V的农杆菌浸润后3天内，本生烟草的叶上形成了不依赖于诱导子的HR，而双突变体NRC1^K191R/D481V的农杆菌浸润还是没有出现HR(图4B)。再者，NRC1^D481V在SGT1-沉默的植株中表达时没有诱导出HR(见下文)。这些结果表明，NRC1^D481V的农杆菌浸润时诱导的应答尤其是由该NRC1蛋白的组成型活性造成的，并且NRC1在会导致HR的信号传导级联中发挥功能。

2.6使用具有组成型活性的NCR1蛋白的异位显性实验

进行了使用NRC1^D481V的异位显性实验以进一步研究该蛋白介导的HR信号传递还需要哪些基因，并由此确定其在HR通路中的推定位置。除了对已知通常参与HR信号传递的基因例如SGT1和RAR1(Mla12抗性必需的(Required for Mla12　resistance))(Shirasu andSchulze-Lefert，2003，Trends Plant Sci.8，252-258)进行VIGS之外，将本生烟草：Cf-4的NDR1(非小种特异的抗病性)(Century et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，6597-6601)、EDS1(增强的疾病易感性)(Aarts et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，10306-10311)和MEK2(MAPKK)(Ekengren et al.，2003，Plant J.36，905-917)沉默，随后用NRC1^D481V或Avr4进行农杆菌浸润。再者，使用TRV：00、TRV：Cf-4和TRV：NRC1的VIGS被作为对照。弱化的NRC1^D481V或Avr4诱导的HR表明基因的“敲低”分别是NRC1或Cf-4/Avr4诱导HR信号传递所必需的。

如预期的一致，Avr4的农杆菌浸润时诱导的HR在TRV：Cf-4和TRV：NRC1感染的植株中被弱化。Cf-4介导的信号传递还需要EDS1，这是因为该基因被沉默的植株出现了较轻程度的Avr4诱导的HR。另外，本发明人发现在MEK2、RAR1和SGT1被沉默的植株中Avr4的农杆菌浸润时出现了HR的减少(图4C；亮圈)。所述Avr4诱导的HR在TRV：00和TRV：NDR1感染的植株中没有被弱化(图4C；暗圈)，这表明NDR1不是Cf-4介导的信号传递必需的。类似地，NRC1^D481V诱导的HR在TRV：00和TRV：NDR1感染的植株以及在TRV：Cf-4感染的植株中都没有被弱化。值得注意的是，与Avr4相反，NRC1^D481V仍会在TRV：EDS1-感染的植株中诱导HR，这表明NRC1在EDS1的下游区起作用(图4C；暗圈)。NRC1^D481V诱导的HR在MEK2被沉默的植株中被弱化，这表明NRC1需要MAP激酶级联用于其信号传递，并且可以位于这些激酶的上游。RAR1和SGT1的VIGS还弱化了D481V诱导的HR，这类似于由Avr4诱导的HR(图4C；亮圈)。因此，NRC1是由Cf-4启动的HR信号传递必需的，并且可以位于所述MAPK级联的上游和EDS1的下游。

NRC1介导的细胞信号传递的模型参见图5。

实施例3-Mi介导的抗性需要NRC1

为了确定NRC1对于Mi介导的针对线虫类、粉虱和蚜虫的抗性是否是必需的，将组成型活性形式的Mi(参见US6613962和EP0937155B1)农杆菌浸润至NRC1被沉默的植株中。NRC1被沉默的植株中HR的减少表明了NRC1也是Mi介导的HR必需的，并且NRC1的(过)表达可以被用于产生具有增强的针对线虫类、粉虱和蚜虫的抗性的转基因植物。

Claims (9)

1.一种产生转基因植物的方法，所述植物是茄科(Solanaceae)成员，与非转基因的对照植物相比具有增强的过敏反应，所述方法包含步骤：

(a)用可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子的编码NRC1蛋白的核苷酸序列转化植物或植物细胞，所述NRC1蛋白由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，所述核苷酸序列被整合进所述植物的基因组中；

(b)再生植物。

2.根据权利要求1的方法，还包含步骤：

(c)就针对一种或多种植物病原体的过敏反应对所述再生植物进行筛选，并且鉴定对一种或多种所述植物病原体具有增强的过敏反应的植物。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述启动子是病原体诱导型启动子。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述植物是茄属(Solanum)植物。

5.一种分离的蛋白，所述蛋白由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

6.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求5的蛋白。

7.一个嵌合基因，所述嵌合基因包含一个在植物细胞中有活性的启动子，所述启动子可操作地连接至根据权利要求6的核酸分子，并且任选地还可操作地连接至一个3’非翻译的核酸分子。

8.一种包含根据权利要求7的嵌合基因的载体。

9.编码NRC1蛋白的核酸分子用于产生具有增强的过敏反应的茄科植物的用途，其中所述NRC1蛋白由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

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