CN101292037A

CN101292037A - 自激活抗性蛋白

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Publication number: CN101292037A
Application number: CNA2006800195520A
Authority: CN
Inventors: D·J·斯塔尔
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: EP1891220A2; ATE462795T1; RU2007147689A; EP1891220B1; WO2006128444A2; CA2610271C; US20090300795A1; CN101292037B; CA2610271A1; WO2006128444A3; ES2343271T3; AU2006254528A1; RU2375453C2; JP2008541739A; PL1891220T3; DE102005026045A1; DK1891220T3; JP5054677B2; US8080706B2; AU2006254528B2

Abstract

本发明涉及在植物中编码对病原体产生抗性的自激活抗性蛋白的核酸，其特征在于核酸具有NBS－LRR抗性基因的有限部分，从NBS－LRR抗性基因编码区的5’端向下延伸到NBS－LRR抗性基因NBS结构域的起始处，该NBS－LRR抗性基因不是TIR－NBS－LRR抗性基因。

Description

自激活抗性蛋白

本发明涉及编码可在植物中产生针对病原体的抗性的自激活抗性蛋白的核酸，该核酸在产生转基因植物的用途以及转基因植物。

由于植物中抵御或延迟及抑制主要的潜在病原体散播的天然防御机制不充分，因此由真菌、病毒、线虫和细菌引起的植物病害在世界范围造成极大损失，可影响收获产品的质量并需要更多更大量使用化学杀虫剂。这些防御机制包括超敏反应、感染部位宿主组织的可控死亡、通过木质化和愈合组织的形成而增强植物细胞壁、形成植物抗毒素及产生PR(致病相关的)蛋白。植物抗性基因(R基因)是激活诱导型防御机制的关键分子。根据Flohr的基因对基因假说，R基因的蛋白与微生物无毒基因(Avr基因)的对应蛋白相互作用，从而启动诱导型防御反应。

根据其编码的R蛋白的结构可将主要的R基因分为5类(Martin etal，2003)。1类仅包括编码丝氨酸/苏氨酸激酶的番茄Pto基因。而主要的植物R基因属于NBS-LRR基因超家族，它编码“核苷酸结合位点”(NBS)和“富含亮氨酸的重复”(LRR)。在其N末端具有诸如例如“亮氨酸拉链”这样的“卷曲螺旋”结构(CC)的NBS-LRR基因可归为2类CC-NBS-LRR基因。CC-NBS-LRR型R基因在所有被子植物中均有发现。3类包括TIR-NBS-LRR型R基因，它在N末端具有取代C结构域的、与动物TIR区(“toll-interleukin-1受体”)同源的序列。虽然在拟南芥中，TIR-NBS-LRR基因构成了约75％R基因，但未在草和甜菜中发现(Tian et al.，2004)。

第四类R基因包括番茄的Cf基因。CF蛋白没有NBS结构域，但具有跨膜结构域(TM)和胞外LRR。第五类包括水稻的Xa21蛋白，它由胞外LRR结构域、跨膜结构域和胞内激酶结构域构成。

尽管R基因由R基因启动子进行弱表达，但1、2和3类R基因的强组成型表达甚至在没有相应的无毒基因产物时仍可激活植物的病原体防御系统，由此导致R蛋白的自激活(Tang et al.，1999；Oldroyd andStaskawicz，1998；Bendahmane et al.，2002)。

但通常R基因在转基因植物中的组成型过表达与诸如植株的微坏死(Tang et al.，1999)或矮小(Frost et al.，2004)这样的农事上不良特征相关。

2类和3类R蛋白的自激活的另一个可能原因是在全长CC-NBS-LRR，或TIR-NBS-LRR蛋白中特定的、保守的氨基酸元件发生了突变。在NBS或马铃薯Rx基因的LRR结构域(Bendahmane et al.，2002)及亚麻L6基因的NBS结构域(Howles et al.，2005)中序列的突变可产生突变株，在不存在相应无毒基因的情况下，该突变株在瞬时表达后可启动细胞死亡。

用Rx基因的缺失实验表明包含CC结构域和部分NBS结构域的缺失产物可在其瞬时过表达后启动细胞死亡，其发生比使用全长R基因的情况更快。这些缺失产物除了CC结构域外，还需要NBS结构域中的P环、激酶2以及完整的激酶3a。相反，与全长R基因相比较，NBS的进一步缩短可导致更慢的HR引发或启动(Bendahmane et al.2002)。

亚麻L10基因，它也是一种3类R基因，其自激活可通过形成缩短的、含有TIR结构域以及包括P环在内的限制性NBS结构域的34个氨基酸的TIR-NBS-LRR蛋白来实现(Frost et al.，2004)。

虽然已知有多种R基因的自激活方法，但目前仍未报道过其中R蛋白自激活在导致真菌抗性增强的同时可降低农事上不良特征的转基因植物。在亚麻中，尝试在天然L6抗性基因启动子或真菌诱导型启动子控制下分别稳定转化两个L6基因的自激活全长变异体，产生的是正常生长的真菌敏感型植株，或者是矮小的真菌抗性植株(Howels et al.，2005)。

因此，本发明的目的是改变植物抗病原体的防御能力，从而使植物的防御反应确实在病原体攻击时可被激活，但不会对植物的农事特征产生负面影响。

根据本发明，可通过核酸来实现上述目的，该核酸包括NBS-LRR抗性基因的有限部分，它从NBS-LRR抗性基因编码区的5’端向下延伸到NBS-LRR抗性基因NBS结构域的起始处，其中NBS-LRR抗性基因不是TIR-NBS-LRR抗性基因。这种核酸可从植物中分离或人工合成。

NBS-LRR抗性基因的有限部分起始于翻译起始密码子(ATG密码子)，并延伸到其基本特征是含有P环(激酶-1a元件)的NBS结构域。对于发明中NBS-LRR抗性基因部分的功能而言，P环不应包括在内。同样，也不应存在NBS-LRR抗性基因中NBS-LRR-结构域的其它部分。但可保留包括P环在内的NBS结构域中的个别核苷酸，只要它们不干扰HR的引发即可。

术语“自激活抗性蛋白”是指在不存在相应的无毒基因产物时可激活植物病原体防御机制的蛋白。因此，本发明的优势在于不需要抗性蛋白和无毒蛋白间的相互作用即可形成对病原体的抗性，从而在实质上更直接地、最终更可靠地进行植物的防御反应。

例如，自激活可通过抗性基因的瞬时过表达而产生。过表达是指在没有相应的微生物无毒基因产物时，天然R基因启动子的表达强度在一定程度上超过R蛋白调控的信号传导的级联反应。因此，病原体的防御机制被激活，表现出部分或完全的病害抗性。

但抗性蛋白的自激活也可通过将甜菜的全长R基因BvKWS3_165、BvKWS3_135、Bv13033和Bv12069以及马铃薯的StR3a基因缩短到仅编码含有可能的CC结构域的蛋白的NBS和LRR结构域的自由N末端的5’区来实现。NBS结构域自由N末端在这种情况下是指NBS-LRR抗性基因编码区的5’端仅向3’端延伸到以下程度：在其有效或可操作的结构中不包括NBS-LRR抗性基因的P环。最简单的情况是将P环完全删除。但P环的个别核苷酸可保留在缩短的抗性基因中，只要它们不降低或阻碍HR的引发即可。对缩短到N末端的NBS-LRR抗性基因而言，也删除了根据数据库Prosite(Bairoch et al.，1996)和Pfam(Sonnhammeret al.，1997)，并在Bendahmane at al.(2002)中提供描述的激酶2、激酶3、GLPC和MHD元件。

与全长R基因相比较而言，缩短的R基因165_#176、135_#147、13033_#159和Bv12069及StR3a-#1-155的用途是在植物组织中更快地引发细胞死亡。联合使用病原体诱导型启动子，可诱导改善的诱导型病原体防御机制。该也可用于那些不被表达135_#147和BvKWS3_135-D480V基因的MHD或VHD结构域中的已知突变所自激活的R蛋白。

与全长R基因相比较而言，由于缩短的R基因可更早地引发细胞死亡，因此缩短的R基因比R基因135_#147只需要更少的表达即可足以达到植物防御机制中的临界蛋白浓度。

P环或激酶1a元件与激酶2和激酶3元件均为ATP或GPT水解蛋白(Traut，1994)，并位于NBS-LRR-基因的NBS结构域中。P环是NBS结构域N末端区的特征(Bendahmane et al.，2002)。R基因Prf、Rx、Rpm1、BvKWS3_135、BvKWS3_133和BvKWS3_165的P环的共有序列是：(I/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V)。

令人惊讶的是，用编码序列元件DAE的氨基酸序列的核酸可获得非常好的自激活。特别是编码序列元件AVLXDAE的核酸。例如，序列元件DAE和AVLXDAE位于SEQ ID NOS：13和15中。

优选的核酸序列选自以下组：

a)如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

b)如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

c)如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d)如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；及

e)如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列或与如SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

NBS-LRR抗性基因的有限部分(limited part)在优选的核苷酸基因序列中的延伸程度如下所示：

SEQ ID NO：1的124-654

SEQ ID NO：2的155-598

SEQ ID NO：3的94-573

SEQ ID NO：4的194-694

此处所用术语“杂交“是指在如Sambrook et al.(1989)中所述的传统条件下，优选地在严谨条件下的杂交。例如，严谨杂交条件是：在4×SSC中，于65℃杂交，然后在0.1×SSC中，于65℃多次洗涤约1小时。例如，较弱的严谨杂交条件是：在4×SSC中，于37℃杂交，然后在1×SSC中，室温下多次洗涤。“严谨的杂交条件”也指：在0.25 M磷酸钠，pH7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中，于68℃杂交16小时，然后在2×SSC和0.1％SDS中，于68℃洗涤两次。

优选的编码自激活抗性蛋白的抗性基因来源于甜菜或马铃薯。

在另一个优选的方案中，发明的核酸编码具有SEQ ID NOS：13到15中共有序列的氨基酸序列。在共有序列中，功能上等价的氨基酸可相互替代，例如Asp可替换为Glu，Leu可替换为Ile、Ala或Val，Arg可替换为Lys，Phe可替换为Trp。

如SEQ ID NOS：13和14所述的两个共有序列代表两个功能区，其间隔距离是不固定的。两个区优选的间隔可参见如SEQ ID NO：15所述的共有序列和如图10所示的共有序列。

发明的核酸优选地与病原体诱导型启动子连接。病原体诱导型启动子在病原体，例如有害真菌、细菌、病毒或线虫感染宿主组织的反应中被激活。病原体诱导型启动子在试图或成功感染的植物组织中的活性比未感染的植物组织更强。

本领域技术人员已知病原体诱导型启动子。病原体诱导型启动子的实施例包括几丁质酶启动子(Samac and Shah 1991)、葡聚糖酶启动子(Henning et al.，1993)和prp-1启动子(Martini et al.，1993)。

例如，通过R基因的病原体诱导型过表达，可避免组成型表达造成的诸如植株的矮小或畸形这样的负面结果。

已表明合成的启动子本身即是特别合适的启动子。这些通过分子生物学技术产生的启动子在设计上是自然界没有发现的。一种这样的合成启动子是最低限启动子(minimalistic promoter)，它除了基本启动子(minimal promoter)外仅含有一个或多个选择的确定的顺式元件。这些顺式元件是诸如转录因子这样的DNA结合蛋白的结合位点，它们是从天然启动子分离获得的，来源于已分离的顺式元件或通过随机重组技术产生并通过合适的或适当的过程筛选。与天然启动子相比较，由于合成启动子没有复杂的结构，所以仅被几个外源或内源因素所激活，因此可进行更特异的调控。

最小启动子或“核心”启动子是含基本转录因子复合物结合位点、并能精确起始RNA聚合酶II的转录的核酸序列。最小启动子的特征序列元件是TATA盒、起始子元件(Inr)、“TFBII识别元件”(BRE)和“下游核心启动子元件”(DPE)。这些元件可单独存在或在最小启动子中联合存在。最小启动子或其序列元件可从遗传的植物或病毒基因中获得。

在本发明框架中，已开发了新合成的启动子，它与实质上并不编码自激活抗性蛋白的已知抗性基因连接，可用于产生病原体抗性植物。这些启动子的类型有nxS-mxD最小启动子、nxW2-mxD最小启动子和nxGst1-mxD最小启动子，这样合成的启动子包括一个或多个以下顺式元件组合：

a)nxS-mxD-盒

b) nxW2-mxD-盒

c)nxGst1-mxD-盒(其中n和m是指1到10的自然数)

在Rushton et al.，2002中描述了包括其功能必需的核心序列的核酸序列为SEQ ID NO：6的S盒(CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT)，核酸序列为SEQ ID NO：7的W2盒(TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT)，核酸序列为SEQ ID NO：8的D盒(TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC)及核酸序列为SEQ ID NO：9的Gst盒(TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC)。

启动子可根据元件的选择性(nxS-mxD、nxW2-mxD或nxGst1-mxD)而与其自身的基础活性、病原体诱导性、激活动力学及启动子强度有所差异，例如如具有以下顺式元件组合的启动子所示：

核酸序列为SEQ ID NO：10的2xS-2xD，

核酸序列为SEQ ID NO：11的2xW2-2xD，及

核酸序列为SEQ ID NO：12的2xGst1-2xD。

合成启动子的特征可根据基因表达的需要，通过改变顺式元件的数目(n，m＝1...1 0)来改变。通过对启动子2xS-2xD与变异体2xS-4xD、4xS-2xD和4xS-4xD的比较表明，与二聚体构建的启动子相比较，可使用四聚体来增强平均启动子强度。另外，在所有的测定间隔点上，病原体诱导性从二聚体-二聚体启动子(2xS-2xD)、四聚体-二聚体及二聚体-四聚体启动子(4xS-2xD、4xS-2xD)，到四聚体-四聚体启动子(4xS-4xD)依次增强。与启动子强度和病原体诱导性的增强相平行，含四聚体的启动子的基础活性在所述实施例的情况下也增强了。该实施例表明重要的启动子特征也可通过顺式元件的数目来调控，并且可产生并鉴定最适启动子变异体用于不同技术中的翻译或转变。

但也可用顺式元件组合来获得合适的结果，这些组合表示核酸序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的衍生物，并具有与顺式元件组合SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12可比较的特征。

例如，启动子2xS-2xD最小启动子和2xW2-2xD最小启动子与四个全长R基因BvKWS3_133、BvKWS3_123、BvKWS3_135和BvKWS3_165连接，并转化到甜菜中。用具有对甜菜而言最重要的有害真菌、可造成叶斑点病的甜菜褐斑病菌的转基因植物进行的真菌抗性实验，获得了每种可改善真菌抗性、但转基因植物在其生长或其它农事特征方面与非转基因植物没有差别的构建体。这些结果表明基本上可以用病原体诱导型启动子来实现细胞死亡引发的R基因的过表达，并由此具有改善的病害抗性，而且不对植株发育产生负面影响。选取具有最佳数目的顺式元件重复的最适启动子，使用它可进一步提高病害抗性。

本发明进一步涉及用新核酸构建体转化的转基因植物，特别是甜菜植株、该植株的一部分以及种子或遗传材料，及新核酸构建体在产生转基因植物方面的用途。

本发明将在下面通过附图和实施例进行更详尽的描述。

本发明使用甜菜通过实施例方式来进行描述，可容易将其应用到其它分离到抗性基因的农事植物中。

附图

图1所示的是二元载体pER-35Sluci的图谱，它可用于甜菜叶中根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱导的R基因的瞬时表达。载体携带来自北美萤火虫(Photinus pyra/is)的、被内含子打断的、不能在根癌土壤杆菌中表达的荧光素酶基因。

图2所示的是通过根癌土壤杆菌，R基因BvKWS3_133的瞬时表达可在甜菜叶中引发细胞死亡。而瞬时表达构建体pER-35Sluci可在甜菜叶中产生强的报告基因活性，表达构建体pER133-35Sluci可引发细胞死亡，因此无法检测到报告基因活性。

图3所示的是用于瞬时生物弹射击法转化甜菜叶的载体pCaMV-2。全长的和缩短的R基因位于所述载体的双35S启动子控制下。

图4所示的是通过生物弹射击法转化的R基因BvKWS3_123、BvKWS3_133和BvKWS3_165瞬时表达后在甜菜叶中引发细胞死亡。基因BvKWS3_123、BvKWS3_133和BvKWS3_165在双35S启动子(d35S)控制下，并与报告基因构建体p70S-luc共转化。在转化20小时后测定报告基因活性。与对照(空载体pCaMV-2和p70S-luc)相比较，由于引发了超敏反应，因此报告基因活性是降低的。所示的是用每个构建体各自9个实验的3次独立实验重复的平均值。误差为标准偏差。

图5所示的是与表达全长R基因BvKWS3_165相比较，表达R基因BvKWS3_165的5’末端区可引发增强的细胞死亡。在d35S启动子控制下的N末端区和全长R基因(p70S-165_#175和p70S-BvKWS3_165)与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜叶中。所示的是每个构建体各自9-12个实验的3次独立实验重复的平均值。

图6所示的是与表达全长R基因BvKWS3_135相比较，表达R基因BvKWS3_135的5’末端区135_#147可引发增强的细胞死亡。在d35S启动子控制下的全长R基因和N末端区135_#147(p70S-BvKWS3_135和p70S-135_#147)与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜叶中。所示的是每个构建体各自9-12个实验的2次独立实验重复的平均值。

图7所示的是与表达全长R基因Bv13033相比较，表达R基因Bv13033的5’末端区13033_#159可引发增强的细胞死亡。在d35S启动子控制下的全长R基因和N末端区13033_#159(p70S-13033和p70S-13033_#159)与构建体p70S-luc通过生物弹射击法共转化到甜菜叶中。所示的是每个构建体各自9-12个实验的2次独立实验重复的平均值。

图8所示的是R基因Bv12069的表达启动细胞死亡。

图9所示的是与NBS结构域VHD元件突变相比较，通过缩短cDNA克隆135_#1475’区的蛋白BvKWS3_135的自激活。

图10a)-c)所示的是缩短的自激活蛋白Bv12069、Bv13033_#159、BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175和StR3a-#1-155彼此之间的氨基酸序列比较，及来自马铃薯(RX-160)和StR1(355-540)的非自激活缩短的抗性蛋白的序列比较，以及与来自拟南芥(AtAB028617)、豆(PvulgarisJ71)、水稻(OsativaAP003073)、大豆(GmaxKR4)和番茄(番茄-I2)的NBS-LRR类的完整R蛋白的序列比较。高亮标出了共有序列。

图11所示的是氨基酸147-175的缺失可显著降低165_#175蛋白的自激活活性。

图12所示的是合成启动子2xS-2xD在甜菜褐斑病菌感染后在转基因甜菜中的激活。

图13所示的是合成启动子2xW2-2xD在甜菜褐斑病菌感染后在转基因甜菜中的激活。

图14所示的是启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD在甜菜褐斑病菌(Cercospora beticola)感染后在转基因甜菜中的报告基因活性的比较。

图15和16所示的是具有合成启动子2xS-2xD的全长R基因123、133、135、165的组合。

图17和18所示的是具有合成启动子2xW2-2xD的全长R基因123、133、135、165的组合。

图19所示的是与非转基因对照3DC4156相比较，转基因甜菜系PR68-6对有害真菌--甜菜褐斑病菌的抗性增加。

图20所示的是与非转基因对照3DC4156相比较，转基因甜菜系PR70-32对有害真菌--甜菜褐斑病菌的抗性增加。

图21和22所示的是具有合成启动子2xS-2xD和2xW2-2xD的R基因N末端区165_#176和12069的组合。

实施例

对BvKWS3 133基因的过表达在甜菜叶中引发快速抗性反应的验证。

通过根癌农杆菌的BvKWS3_133基因全长cDNA克隆的瞬时过表达可在甜菜叶中引发快速细胞死亡，但不形成可见的坏死。将cDNA克隆BvkWS3_133与d35S启动子连接，并插入到二元载体pER-34Sluci(图1)中。得到的载体命名为pER133-34Sluci。将pER-34Sluci和pER133-34Sluci转化到农杆菌C58C1(An 1987)中。在50ml含100mg/ml壮观霉素和20μM乙酰丁香酮的LB培养基将阳性农杆菌培养4-5小时使其瞬时表达。然后，离心细菌，将沉淀悬浮在含10mM MgCl₂、10mMMES、100μM乙酰丁香酮的溶液中，调整细菌浓度为OD₆₀₀＝0.1。将细菌悬浮液放置2-3小时，然后用2.5ml皮下注射器通过10周龄甜菜叶的内侧将其注射到老甜菜的叶中。在25℃温箱中温育，温育后1、2和3天测定转化的叶中北美萤火虫荧光素酶报告基因的活性。另外，用荧光素酶检测系统(Promega，Mannheim，Germany)在Sirius Luminometer(Berthold Detection System GmbH，Pforzheim，Germany)上根据说明书测定荧光素酶的活。为了获得适于测量的酶，在每次测量间隔对两个叶片进行标注。对每个构建体在每个测量日收集8个测量点。将叶样品在加入海沙和10倍体积(v/w)Passive Lysis Buffer(PBL)的研钵中进行匀浆。提取液体上清，并分别用10μl未加工的提取液进行Photinus荧光素酶活性的测定。用对照构建体pER-35Sluci转化的甜菜叶在第1天的活性较小，在第2和3天的荧光素酶活性为124,000、或116,000 RLU/mg叶组织。用构建体pER-34Sluci转化的甜菜叶的活性在3个测量点均大于接种MgCl₂的叶(图2)。因此，cDNA克隆BvKWS3_133的瞬时表达可在接种的甜菜叶中启动快速细胞死亡。

R基因BvKW3 123、BvKWS3 133和BvKWS3 165的组成型表达可在甜菜叶中启动细胞死亡。

R基因BvKWS3_133和具有如SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的R基因BvKWS3_165及R基因BvKWS3_123与载体pCaMV-2的双35S启动子连接(图3)。得到的载体命名为p70S-BvkWS3_133、p70S-bvKWS3_165和p70S-BvKWS3-123。为了验证R基因的功能性，根据Schmidt et al.(2004)所述，通过生物弹射击法将报告基因载体p70S-luc与构建体p70S-BvkWS3_133、p70S-bvKWS3_165和p70S-BvKWS3-123在甜菜中瞬时表达。使用空载体pCaMV-2联合报告基因载体P70S-luc作为阳性对照。与Schmidt，et al.(2004)相反，摒弃了归一化载体的使用。用荧光素酶检测系统(Promega，Mannheim，Germany)在转化20小时后测定荧光素酶活性。转化实验重复3次，其中每次实验的每个构建体包括9个实验重复。3次实验的平均值表明，与设为100％的阳性对照(空载体)的荧光素酶活性相比较，p70S-BvKWS3-133的报告基因活性仅为37.7％，p70S-BvKWS3_165仅为66％，p70S-BvKWS3-123仅为68.7％(图4)。因此d35S启动子控制的R基因BVKWS3_133、BVKWS3_165和BVKWS3_123的强表达可启动细胞死亡，或在抑制共表达同时转化的报告基因载体的一部分转化细胞中启动超敏反。因此表明这3个R基因的强表达可导致细胞死亡，或在没有相应的无毒基因产物的情况下产生HR。

基因BVKWS3 165的5’区可比全长cDNA克隆BvKWS3 165启动更快的细胞死亡。

从构建体p70S-BvKWS3_165中其核苷酸序列如SEQ ID No.5所述的全长cDNA克隆BvKWS3_165开始，用Pfu聚合酶(Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及S318(CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTACC)扩增基因5′区，同时在编码区引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，它编码BvKWS3_165 1-175的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列仅含BvKWS3_165的N末端区，不含NBS和LRR结构域(图10)。用限制性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到载体pCaMV-2中。得到的载体命名为p70S-BvKWS3_#175。通过瞬时生物弹射击转化来定量检测构建体P70S-BvKWS3_165和p70S-165_#175在甜菜叶中启动细胞死亡的能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因载体p70S-luc共转化。空载体pCaMV-2与报告基因载体p-70S-luc共同使用作为阳性对照。与空载体(pcAMV-2)的转化相比较，p70S-BvKWS3_165的转化可产生65％可测的报告基因活性，而p70S-165-#175的转化仅产生38％可测的报告基因活性(图5)。该结果表明165_#175 N末端175个氨基酸的排他表达可在转化的甜菜叶中启动比使用1066个氨基酸长的全长蛋白BvKWS3_165更强烈的细胞死亡。165_#175的表达比BvKWS3_165的表达可使更多的转化叶细胞死亡。该差异的原因是R蛋白通过缩短(缩减)N末端产生了新的、更强烈的自激活方式。

基因BvKWS3 135 5’区比全长cDNA克隆BvKWS3 135启动更快的细胞死亡

从构建体p70S-BvKWS3_135中全长cDNA克隆BvKWS3_135开始，用Pfu聚合酶(Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及S330(CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC)扩增基因5′区，同时在编码区引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，它编码BvKWS3_1351-147的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列仅含BvKWS3_135的N末端区，不含NBS和LRR结构域，或来自这些结构域的元件。用限制性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到载体pCaMV-2中。得到的载体命名为p70S-135_#147。通过瞬时生物弹射击转化来定量检测构建体p70S-BvKWS3_135和p70S-135_#147在甜菜叶中启动细胞死亡的能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因载体p70S-luc共转化。空载体pCaMV-2与报告基因载体p-70S-luc共同使用作为阳性对照。与空载体(pCaMV-2)的转化相比较，p70S-BvKWs3_135的转化可产生74.5％可测的报告基因活性，而p70S-135_#147的转化仅产生58％可测的报告基因活性(图6)。该结果表明全长克隆BvKWS3_135的表达可在转化的组织中启动细胞死亡。但135_#147 N末端147个氨基酸的排他表达可在转化的甜菜叶中启动比使用844个氨基酸长的蛋白BvKWS3_135更强烈的细胞死亡。135_#147的表达比BvKWS3_135的表达可使更多的转化叶细胞死亡。该差异的原因是R蛋白通过缩减或缩短N末端产生自了新的、更强烈的激活方式。

基因Bv13033 5’区比全长cDNA克隆Bv13033启动更快的细胞死亡

从构建体p70S-Bv13033中全长cDNA克隆Bv13033开始，用Pfu聚合酶(Stratagene)和引物S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及S333(CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT)扩增基因5′区，同时在编码区引入终止密码子。扩增区对应于如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列，它编码Bv13033 1-159的氨基酸序列(图10)。氨基酸序列仅含Bv13033的N末端区，不含NBS和LRR结构域，或来自这些结构域的元件。用限制性酶SacII和BamHI切割PCR产物，并克隆到载体pCaMV-2中。得到的载体命名为p70S-13033_#159。通过瞬时生物弹射击转化来定量检测构建体p70S-13033和p70S-13033_#159在甜菜叶中启动细胞死亡的能力。为了该目的，将每个载体分别与报告基因载体p70S-luc共转化。空载体pCaMV-2作为阳性对照。与空载体(pCaMV-2)的转化相比较，p70S-13033的转化可产生95％可测的报告基因活性，而p70S-165_#175的转化仅产生68％可测的报告基因活性(图7)。该结果表明全长克隆Bv13033的表达仅可在转化的组织中启动较弱的细胞死亡。另一方面，13033_#159 N末端159个氨基酸的排他表达可在转化的甜菜叶中引发强烈的细胞死亡。该差异的原因是R蛋白通过缩短N末端产生了新的更强烈的自激活方式。

通过Bv12069 5’区在甜菜叶中启动细胞死亡

具有如SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的R基因Bv12069编码R蛋白166个氨基酸长的N末端。蛋白Bv12069不含NBS和LRR结构域，但与自激活R蛋白165_#175、135_#147、13033_#159的175、147和159个氨基酸长的N末端基因表现出不同的同源性(图10)。cDNA克隆与载体pCaMV-2的双35S启动子连接(图3)，形成载体p70S-12069。为了检测基因Bv12069的功能性，将构建体p70S-12069与报告基因载体p70S-luc通过生物弹射击转化，在甜菜叶中瞬时表达。3次独立实验中测定的用p70S-12069和p70S-luc转化的叶中的报告基因活性是阳性对照的活性的51％(空载体pCaMV-2和p70S-luc)(图8)。因此166个氨基酸长的蛋白Bv12069的表达可在甜菜细胞中启动细胞死亡。

缩短基因BvKWS3 135但不突变MHD结构域可产生自激活R蛋白

将通过把NBS-LRR类型的R蛋白缩减为无NBS和LRR的N末端的自激活的发明机制，与MHD元件突变的自激活方法进行比较。马铃薯Rx基因和亚麻L5基因的MHD元件的突变可导致所用基因的自激活(Bendahamane et al.，2002；Howes et al.，2005)。cDNA克隆BvKWS3_135对于MHD元件等价于VHD元件，后者是常见的除MHD元件之外也是R基因的元件(Howles et al.，2005)。如Bendahmane et al.(2002)所述，将相应的突变引入到全长克隆BvKWS3_135。为了该目的，将基因BvKWS33_135的VHD元件中的氨基酸天冬氨酸用氨基酸缬氨酸来替代。得到的基因命名为BVKW3_135_D480V。通过根癌土壤杆菌起始的瞬时过表达来检测甜菜叶中基因135_#147、BvKWS3_135_D408V和未修饰的基因BvKWS3_135的有效性。为此将cDNA克隆BvKWS3_135与d35S启动子连在一起并插入到二元载体pER-34Sluci中。得到的载体命名为pER135-34Sluci。同样地，对缩短的具有如SEQID No.2所述的核苷酸序列的cDNA克隆135_#147以及突变的cDNA克隆BvKWS3_135_D408V进行加工。得到的载体命名为pER135_#147-35Sluci和pER135_D480V-35Sluci。将载体转化到土壤杆菌菌株或所述的C58C1细胞系中，并与对照pER-35Sluci同时注射到甜菜叶中。接种后的1、2和3天在转化叶片中测定北美萤火虫荧光素酶报告基因的活性。用对照构建体pER-35Sluci转化的甜菜叶在第1天的活性较小，在第2和3天的荧光素酶活性为299,000和433,000 RLU/mg叶组织。用构建体pER135-35Sluci转化的甜菜叶的荧光素酶活性在第2天和第3天为190,000和245,000 RLU/mg叶组织，因此与阳性对照pER-35Sluci相比较，表现出可测定的细胞死亡。构建体pER_135_D480V-35Sluci的报告基因活性在第2天和第3天测定为188,000和206,000 RLU/mg(图9)。因此，在基因BvKWS3_135中引入MHD突变不产生或产生很少可测定的自激活。根据本过程缩短的R基因135_#147在第2天和第3天的报告基因活性为90,000和63,000 RLU/mg(图9)，因此比构建体pER135-35Sluci和pER_135_D480V-35Sluci引发更强的细胞死亡和自激活。

在BvKWS3 165、BvKWS3 135、Bv13033和Bv12069及StR3a R蛋白的N末端中通用氨基酸元件的鉴定

将175、147、159和166个氨基酸长的R蛋白BvKWS3_165、BvKWS3_135、Bv13033和Bv12069的N末端与155个氨基酸长的马铃薯R3a基因(Huang et el.，2005)的N末端进行同源性比较，以鉴定通用序列元件。通过比较在自激活R蛋白的N末端鉴定出多个共有序列。在图10a)中高亮标出通用序列元件的共有序列。

一个共有序列对应于如SEQ ID NO：13：AVLXDAEXKQXXXXXLXXWLXD LKDXVYDXDD ILDE所述的氨基酸序列。另一个共有序列对应于如SEQ ID NO：14：IXEIXXKLDD L所述的氨基酸序列。

此处字母X表示任何氨基酸。

这两个所述形式的共有序列仅包含在这种其表达会导致自激活的CC-NBS-LRR R蛋白的N末端中。因此，RX基因的160个氨基酸长的CC结构域不能引发细胞死亡或超敏反应(Bendahmane et al.，2002)。与全长R基因BvKWS3_133_e08相比较，甜菜R基因BvKWS3_133_e08177个氨基酸长的N末端和马铃薯R1基因540个氨基酸长的N末端(Ballvora et al.，2002)的瞬时表达没有引发扩增，对R1基因而言，没有细胞死亡(数据未显示)。自激活蛋白BvKWS3_165_#176、BvKWS3_135_#147、Bv13033_#159、Bv12069和StR3a-#1-155 N末端与Rx-、StR1-和BvKWS3_133_#177蛋白CC结构域氨基酸序列的氨基酸比较表明，在非激活N末端不含上述共有序列(图10b)。特别是序列元件DAE对鉴定其N末端是自激活的R蛋白是非常重要的。在共有序列中的序列元件DAE的协助下，可在多个植物物种中找到合适的自激活R基因，如图10c所示，例如拟南芥(AtAB028617)、豆(PvulgarisJ71)、水稻(osativaAp003073)、大豆(GmaxKR4)和番茄(Tomato-I2)。

氨基酸序列147-175对R蛋白165#175的自激活是重要的

为了鉴定165_#175蛋白中对NBS-LRR蛋白N末端自激活重要的氨基酸部分，将cDNA克隆165_#175的编码区缩短。cDNA克隆165_#93和165_#146编码165_#175蛋白的1-93或1-146氨基酸。构建体p70S_165_#93、p70S_165_#146和p70S_165_#175的瞬时生物弹射击实验表明只有165_#175蛋白可启动强烈的细胞死亡，而165_#93和165_#146不能(图11)。因此，146-175序列区域对NBS-LRR蛋白自激活是必需的。在该区域含有所有被检测蛋白中都保守的序列元件(图10a)。

合成的病原体诱导型启动子2xS-2xD和2xW2-2xD通过真菌侵染而产生的快速激活

对完整或部分抗性基因的病原体诱导的过表达而言，特别合适的是nxS-mxD、nxW2-mxD和nxGst1-mxD类的合成启动子，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，m＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。例如，将如SEQ ID NO.10所述的2xS-2xD类启动子、如SEQ ID NO.11所述的2xW2-2xD类启动子及如SEQ ID NO.12所述的2xGst1-2xD类启动子与来自北美萤火虫的荧光素酶基因连接，转化到甜菜中，然后分析对真菌侵染的反应。

对植物转化而言，可使用二元载体2xS-2xD-luc-kan、2xW2-2xD-luc-kan和2xGst1-2xD-luc-kan。将二元载体通过直接DNA转化过程用定居质粒pGV2260转化到根癌土壤杆菌C58C1中(An，1987)。用抗生素卡那霉素(50mg/l)筛选重组根癌土壤杆菌克隆。

根据Lindsey et al.(1991)用抗生素卡那霉素进行甜菜的转化。通过PCR检测植物的转基因性。使用引物GTGGAGAGGCTATTCGGTA和CCACCATGATATTCGGCAAG可从nptII基因扩增533个碱基对长的DNA片段。用10ng基因组DNA进行PCR，引物浓度为0.2μM，退火温度为55℃，在Mutli-Cycler PTC-200(MJ Reasearch，Watertown，USA)进行扩增。

为了分析启动子的病原体诱导性，将转基因甜菜在体外条件下用甜菜叶斑点诱导者甜菜褐斑病菌进行感染。分别将4个转基因系的植株浸泡在甜菜褐斑病菌菌丝体片段的悬浮液(400,000片段/ml)中，另外4个植株浸泡在稀释的营养液中作为对照。然后将感染植株和对照植株在培养箱中25℃光照温育16小时。在接种后1、2、3、4和6-7天除去感染的和未感染的叶材料，用荧光素酶检测系统(Promega，Mannheim，Germany)如述测定荧光素酶报告基因的活性。

2xS-2xD和2xW2-2xD启动子在感染早期均具有快速强烈的病原体诱导性，但在基础活性和启动子强度上有所不同(图12-13)。与未感染植株相比较，2xS-2xD启动子可在转基因系PR39/11、PR39/48和PR39/49中被快速诱导，在接种后第1天已达到11-59倍，在第2天达到21-384倍(图12)。而第1天以真菌菌丝在表皮的生长为特征，在第2天，真菌菌丝通过气孔穿入叶片，进入叶组织。在第7天感染的后期，可通过可见坏死的发展测定启动子被诱导了113-792倍。未感染植株以报告基因活性测定的2xS-2xD启动子的基础活性很低，仅为非转基因植株的荧光素酶活性的1-10倍。

2xW2-2xD启动子的激活有时比2xS-2xD启动子慢。在感染第1天，2xW2-2xD启动子仅具有2-11倍病原体诱导活性，在感染第2天为5-56倍。在第7天产生坏死，达到最大的318-672倍病原体诱导性(13)。与非转基因植物相比较具有10-50倍报告基因活性的2xW2-2-D启动子的基础活性比2xS-2xD启动子高。2xW2-2xD启动子显著超过了2xS-2xD启动子约10倍以上的启动子强度。

通过改变顺式元件数目来优化启动子特性

根据基因表达的需要，可通过改变顺式元件的数目来调控和优化具有n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及m＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的nxS-mxD、nxW2-mxD和nxGst1-mxD类型合成启动子的特性。以nxS-mxD型启动子为例进行说明。除了二元载体2xS-2xD-luc-kan外，构建二元载体4xS-2xD-luc-kan、2xS-4xD-luc-kan和4xS-4xD-luc-kan，并转化到甜菜中。用甜菜褐斑病菌如上所述感染植物，并在真菌接种后每日测定报告基因的活性。测定来自13个独立的2xS-2xD-luc系、14个独立的4xS-2xD-luc系、15个独立的2xS-4xD-luc系及15个独立的4xS-4xD-luc系的实验结果，并比较其启动子强度、病原体诱导性和基础活性的测定值。

将2xS-2xD启动子与变异体2xS-4xD、4xS-2xD和4xS-4xD进行比较，结果表明，与二聚体启动子构建体相比较，使用四聚体可增加平均启动子的强度(图14)。另外，在所有测量的时间间隔，二聚体-二聚体启动子(2xS-2xD)的病原体诱导性随着四聚体-二聚体和二聚体-四聚体启动子(4xS-2xD、4xS-2xD)升高至四聚体-四聚体启动子(4xS-4xD)(表1)。

启动子(独立转化子的数目)	第1天	第2天	第3天	第4天
启动子(独立转化子的数目)	第1天	第2天	第3天	第4天	2xS-2xD(13系)	1.9	3.6	27	59
4xS-2xD(14系)	3.1	4.8	52	135	2xS-2xD(13系)	1.9	3.6	27	59
4xS-2xD(14系)	3.1	4.8	52	135	2xS-4xD(15系)	1.4	9.2	54	87
4xS-4xD(15系)	2.9	9.8	90	93	2xS-4xD(15系)	1.4	9.2	54	87

表1：启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD在感染甜菜褐斑病菌后的转基因甜菜中的病原体诱导性。

所示的是每个启动子构建体在接种1-4天13-15个独立转化子(系)的病原体诱导性的平均值。

随着启动子强度和病原体诱导性的增加，可导致含四聚体的启动子的基础活性也增加(表2)。

启动子(独立转化子的数目)	第1天	第2天	第3天	第4天
启动子(独立转化子的数目)	第1天	第2天	第3天	第4天	2xS-2xD(13系)	4.7	5.5	5.2	2.6
4xS-2xD(14系)	14.2	21	7.8	11	2xS-2xD(13系)	4.7	5.5	5.2	2.6
4xS-2xD(14系)	14.2	21	7.8	11	2xS-4xD(15系)	24.6	13.3	7	22.3
4xS-4xD(15系)	35.5	20.3	6.3	20	2xS-4xD(15系)	24.6	13.3	7	22.3

表2：启动子2xS-2xD、4xS-2xD、2xS-4xD和4xS-4xD在转基因甜菜叶中的基础活性。

所示的是每个启动子构建体13-15个独立转化子(系)的基础活性的平均值，是在4天感染实验中作为未感染对照来测定的。基础活性提供了与非转基因植物的非特异背景活性相比较而言的转基因植物的报告基因活性的行为或关系。

该实施例表明，对诸如启动子强度、诱导性和基础活性等概念重要的启动子特征可通过顺式元件的数目来调控，因此可构建合适的启动子病原体用于各种技术转换。在实验性实施例中，与病原体的诱导性相关的病原体诱导性启动子的顺式元件的最佳数目大于如Rushton et al.，2002所述的二聚体溶液。

通过病原体诱导的抗性基因的转化来产生真菌抗性

为了增加甜菜的真菌抗性，将启动子2xS-2xD或2xW₂-2xD分别与四个R基因BvKWS3_123、BvKWS3_133、BvKWS3_135和BvKWS3_165连接，并转化到甜菜中。然后用SacI切割13,959或13,969kb长的二元载体2xS-2xD-luc-kan和2xW2-2xD-luc-kan，并用T4-DNA聚合酶处理来填充切割位点。然后将载体用XhoI重新切割，电泳分离，使12,284或12,294kb长的载体与1,675kb长的荧光素酶基因分开并分离。

从载体p70S-BvKWS3_123、p70S-BvKWS3_133、p70S-BvKWS3_135和p70S-BvKWS3_165中分离ZR抗性基因。为此，首先用NotI使载体线性化，切割位点用Klenow处理而填充。然后用XhoI切割载体，并分离R基因。得到的载体命名为2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xD-BvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_135和2xS-2xD-BvKWS3_165，或2xW₂-2xD-BvKWS3_123、2xW₂-2xD-BvKWS3_133、2xW₂-2xD-BvKWS3_135和2xW₂-2xD-BvKWS3_165(图15-18)。用二元载体如上所述产生转基因甜菜。

通过对植物病原体真菌--甜菜褐斑病菌的抗性实验来鉴定抗真菌的甜菜。

在真菌抗性实验中可观察到增强的真菌抗性，该实验如下进行描述，作为甜菜对甜菜褐斑病菌的抗性检测的示例。

对用叶斑点诱导物甜菜褐斑病菌所感染甜菜而言，除了转基因植株外，也使用基因型为3DC4156的甜菜在温室中进行转化。在接种蔬菜汁前2周，用侵染性甜菜褐斑病菌分离株Ahlburg涂布平板(40％Albani蔬菜汁)，并在25℃温育。在接种前，将长有真菌的琼脂用刮铲(objectcarrier)和水刮下来。通过细胞计数器测定菌丝体片段的浓度。用水稀释调整接种密度为20,000片段/ml。将10-12周龄的植株反向浸泡在5L含接种物的玻璃烧杯中进行感染。对每个待测的系，将30个植株进行接种，并将植株在温室中随机排列。

接种后将植株在28℃，95％湿度的温室中温育4天。第4天后，将湿度降低为60-70％。接种2、3和4周后，用Kleinwanzlebener Saatzucht(KWS)等级方案(1970)(1＝健康叶，9＝100％损坏的叶)目测叶落。与对照相比较，用构建体2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xD-BvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_165、2xW₂-2xD-BvKWS3_123、2xW₂-2xD-BvKWS3_133、2xW₂-2xD-BvKWS3_135或2xW₂-2xD-BvKWS3_165转化的转基因系具有增强的真菌抗性(表3)。

对照(非转基因)T3¹ AUDPC²	转基因系 T3¹ AUDPC²谱系名称	构建体
对照(非转基因)T3¹ AUDPC²	转基因系 T3¹ AUDPC²谱系名称	构建体	6.0 220	PR68-6 4.6 169	2xS-2xD-BvKWS3-133
6.8 193	PR74-73 6.1 157	2xS-2xD-BvKWS3-123	6.0 220	PR68-6 4.6 169	2xS-2xD-BvKWS3-133
6.8 193	PR74-73 6.1 157	2xS-2xD-BvKWS3-123	4.1 167	PR75-8 2.8 132	2xS-2xD-BvKWS3-165
6.0 220	PR69-15 5.3 177	2xW₂-2xD-BvKWS3-133	4.1 167	PR75-8 2.8 132	2xS-2xD-BvKWS3-165
6.0 220	PR69-15 5.3 177	2xW₂-2xD-BvKWS3-133	7.0 226	PR70-32 5.5 182	2xW₂-2xD-BvKWS3-123
6.8 193	PR77-42 5.6 155	2xW₂-2xD-BvKWS3-135	7.0 226	PR70-32 5.5 182	2xW₂-2xD-BvKWS3-123
6.8 193	PR77-42 5.6 155	2xW₂-2xD-BvKWS3-135	6.8 229	PR71-41 5.6 182	2xW₂-2xD-BvKWS3-165

表3：对植物病原体真菌--甜菜褐斑病菌抗性增强的转基因甜菜。

¹抗性实验中第3个和最后一个等级的值(1＝健康，9＝100％损坏的叶表面)。

²在3个等级时间段(T1-T3)测定的AUDPC(疾病进程曲线下的面积)值。AUDPC将多个等级时间点的侵染强度的进程包括在单个值中。

转化子PR68-6和PR70-32的3个等级时间段的侵染时间进程分析表明，在实验持续时间内，对照和转基因系的侵染进程的差异增加(图19和20)。这些结果表明在病原体特异启动子的协助下，甜菜的不同R基因的诱导型表达可导致对真菌抗性增加。

通过转化在病原体应答启动子控制下的R基因N末端区来产生真菌抗性植株。

为了产生真菌抗性植株，使用R基因N末端区，将缩减或缩短的R基因13033_#159、135_#147、165_#175和Bv12069与启动子2xS-2xD和2xW2-2xD连接，并转化到甜菜中。

为此，用SacI切割13,959或13,969kb长的二元载体2xS-2xD-luc-kan和2xW2-2xD-luc-kan，并用T4 DNA聚合酶填充切割位点。然后，用XhoI进一步切割载体，凝胶电泳分离，使12,284或12,294kb长的载体与1,675长的荧光素酶基因分开。

从载体p70S-12069、p70S-13033_#159、p70S-135_#147和p70S-165_#175中分离缩短的R基因。首先将载体用XbaI线性化，DNA末端用Klenow处理填充，用XhoI进一步切割载体。然后将分离的R基因片段克隆到制备的二元载体中。得到的载体命名为2xS-2xD-12069、2xS-2xD-13033_#159、2xS-2xD-135_#147、2xS-2xD-165_#175或2xW2-2xD-12069、2xW2-2xD-13033_#159、2xW2-2xD-135_#147、2xW2-2xD-165_#175(图21-22)。将二元载体如上所述转化到甜菜中，并通过甜菜褐斑病菌抗性实验鉴定真菌抗性植株。

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序列表

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Street：Grimsehlstrasse 31

City：Einbeck

State：

Country：Germany

PostalCode：D-37555

PhoneNumber：004 9-5561-311-0

FaxNumber：004 9-5561-311-322

EmailAddress：info@kws.de

<110>OrganizationName：KWS SAAT AG

Application Project

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<120>Title：自激活抗性蛋白

<130>AppFileReference：KWS SAAT AG

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<141>CurrentFilingDate：_____-___-___

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc tccaccgcgg gattctaata cgactcacta tagggcaagc agtggtatca 60

acgcagagta cgcggrgatt catactctac ttccatactt tgtaaaaaca aaaaaagata 120

aaaatggtga taggcggaga gatttttcta tcagcgtttc ttcaagtgct ctttgaaaag 180

cttgcatcag gagggataag tctattccta aaaagagaaa aaggaatagg acctaaagtt 240

attcaaagat ggaacaaaaa attgagatta atagaggcgg ttttaagtga cgccgagcaa 300

aagcagtttc acaacaatgc cgtcaaattg tggcttcgag atcttcaaga gttcgcgtac 360

gatttagagg acatcttaga cgaatttgat acagatgctc gacttaagga gttcaatgat 420

cagcctcagc cacagccaca ggaacatcaa cccaaatctt cttgttctcc tttcaataag 480

gtacaaagct gtctttcttg tggtttccca actttaaata agaaaactac aaagtattca 540

actagcattg aagagatgag cactcgcttg gaagatcttc tggaccaagt aaggtctttg 600

gctctctcaa cgcagataca ctcaagggta gagcaacatg aagaacggag gtgaggatcc 660

<212>类型：DNA

<211>长度：660

序列名：序列 1

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc tccaccgcgg gattctaata cgactcacta tagggcaagc agtggtatca 60

acgcagagta cgcggggaat ttgaagtcat catcaacctc ttatcatcat ccaactccaa 120

gattctctca tcactgacag ttctggagta gaatatggtg gacgcagtgg tcactgtgtt 180

tttggaaaaa cttttcaatg tccttgttca ggagggtggt gttttacttg gtttcaaaga 240

tcggtttaag aagctacaaa atgatctcaa atacatgcaa agcttcttta aagacgccga 300

gaggctcaaa aggaaagatg agtctctaaa atgcactctg gccgacatgc gtgagctggt 360

atatgaagct gaagacatac ttgcagattg ccagcttttg tcaaatagtt ctggaaaact 420

tcttgaagac tattctccta caaaggttcc agccaaatat caaatgggga aaagaattgg 480

tgaaatcaat gaaaagatca atagcattaa aaataacatc tcagcttttc ttgggcctct 540

tcaacctgtc catggtaatg tagaagaaga gggaccaccc agatggagtt ctccctgagg 600

atcc 604

<212>类型：DNA

<211>长度：604

序列名：序列 2

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

gaattcgagc tccaccgcgg acgcgtgggc agcagccaaa cacacacttt ctctcctgat 60

catcaatcat cattatcatc tccaaaacca aaaatggaat tcataagcac aacagtctct 120

atcgctgaaa aactgaatac tgcactgcag ttatgggagt tcaaagacaa gctctttagt 180

aacttcagct acgaaaccga acttgaggat ctccaacgca ccgtcagttc cataactgcg 240

gcgctacatg tagcagagac caagctggag ctctccgatg aactacaacg tcaaatcgag 300

gagctcaagg ataccatctt tgaagcggat gatctactgg atgagcttgt cactctttct 360

caccagcagc gggttgtaga tgccgatggt agtctcctag ataaagtaag acacttcttc 420

tctagttcca acccaatctg tgtttcttac tggatgtctc gggggagtaa ggatatcaag 480

aagaaattag atgatattgc taacaataat cagtttagct tagagcttga tcatgagcct 540

atcaggaaca gaaggcctga gacttgttct tgaggatcct 580

<212>类型：DNA

<211>长度：580

序列名：序列 3

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

agtttgtaca aaaaagcagg ctggtaccgg tccggaattc ccgggatatc gtcgacccac 60

gcgtccgctt caacaaccca tctcttcaat aattgtgaaa aaccacaaat catgattaag 120

taatttctgc accacttttg catcctcagc cccttctaaa tccttccccc tgaagtgatc 180

aataatcatt agaatgtctg aagcactact gtgggctgtc acaaaaacaa cacttgcaca 240

cattgctact tttgctggtg atcttacctg cagttatgct acacaaggca ttttagcagc 300

tcaaggtgtc cgaaacgacc tcaaaaagat cgagaacaag ctgattgcta ttcgcgctgt 360

tctgcaagat gcagaaagta agcaatatga tagcgaggct gtcaagattt ggctgaaaga 420

tgtcaaaaat gttgtgtatg atatagatga cctcttggat gaagttcaca ctgatctgtt 480

acgaaagaga atcaacaaaa gccatctgct tcgacaaatc aggtactatc tttcatcctc 540

gaatccaatt ctgagtaatt tttattggag tgataagatt agagaccttg ttcaaagatt 600

tgatgacatt gctgctaata gacgagatct tggattggat ggtcatgatc caattgaagt 660

atacaacatt gagaggaatc ctttagatgc ataatcatat gtgaagaaat cagaaattat 720

tggtagagat gaagctaggt ccgaaataat tagacgctta actagtagta ctagtgttgg 780

agatgctagt aggttggttg tgcttccgat agttgggttt ggcgggattg ggaaaacagc 840

attggcaaag cttgttttta atgatgagtg ggttgctagt aactttgata ttaagttgtg 900

ggcatgtgtc tctgaaaaat ttgatctgca gaagactaca gaagaaattt tgaattctgt 960

aagtaatgaa accactgcaa acctcaacat gagacagttg catgaaaaac tccgtgagat 1020

attggatgat cggaagcatt tccttgtgct ggacaatgtg tggatcgagg acatcaaagt 1080

gcactccaca ggaagcattt ccttgtactg gcatttagag agggtgaaga aacaagatac 1140

ccaaagcttg ctacaatcgg gaaaagcatt gttgaaaatt gtggcggggt tcctctggtt 1200

gttaaggttc ttgcaagcct gttacacagt gaaaggaacg agaaagaatg gaggcgaatt 1260

tctgaaacaa acaacataat gatatcaaac aagctttgag agtgagctac aataaactcc 1320

catctcaatt aaaagcatgt ttttcctatt gttcattatt tgtgaaggat agcaagctta 1380

atcctccgat tttgtcatgc ctgtggagtg cacttggaat cttgcaacga ggtaacgaca 1440

atgaagagtt ataatccatt ggatacaagt attgtgaaga cctatagtca agatgtcttc 1500

ttcaggatgc atttcttgtg ttcaccgaaa ttataagtga atgtagaatg cacgacttat 1560

tccatgattt agcaactgac cttgttggtg aagagatagc tgttgtgacc agtaatcatc 1620

ttaatgtttc agatatgtgc aggcatttag tatggggata tgaaggaggt gaaggtttat 1680

cagataagaa tttcccaaaa gagctactta gagcaaagaa ggctcgaact ttcagatttg 1740

gctatgcaat gggctatatt agcaagtcat ttattgaaag tattatacac aacttcaggt 1800

gcttacgtgt gttggatttg cattagagta gcttcgagga gttgtcgatg tcaattggga 1860

agttagaaca tctaagatat cttgacctgt cctacaaccc aatcatcaaa tttcttccaa 1920

gtacactatg caagttgttg aatctacaat cgttgtatgt tccaaaaaaa aaaaaaaagg 1980

gcggccgctc tagagtatcc ctcgaggggc ccaagcttac gcgtacccag ctttcttgta 2040

caaagtg 2047

<212>类型：DNA

<211>长度：2047

序列名：序列 4

序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

gattcatact ctacttccat actttgtaaa aacaaaaaaa gataaaaatg gtgataggcg 60

gagagatttt tctatcagcg tttcttcaag tgctctttga aaagcttgca tcaggaggga 120

taagtctatt cctaaaaaga gaaaaaggaa taggacctaa agttattcaa agatggaaca 180

aaaaattgag attaatagag gcggttttaa gtgacgccga gcaaaagcag tttcacaaca 240

atgccgtcaa attgtggctt cgagatcttc aagagttcgc gtacgattta gaggacatct 300

tagacgaatt tgatacagat gctcgactta aggagttcaa tgatcagcct cagccacagc 360

cacaggaaca tcaacccaaa tcttcttgtt ctcctttcaa taaggtacaa agctgtcttt 420

cttgtggttt cccaacttta aataagaaaa ctacaaagta ttcaactagc attgaagaga 480

tgagcactcg cttggaagat cttctggacc aagtaaggtc tttggctctc tcaacgcaga 540

tacactcaag ggtagagcaa catgaagaac ggagggaaac atcatctatg atacgggagc 600

cagttgtata tgggagggac gatgagaaaa atcagataat ccaaagatta ttaaagacag 660

atgagccatt ttgtgaaaat tacaatgtaa ttcctattgt tggaacagga ggcattggga 720

agacgaccct cgctcaggct gtatacaatg atgagcaggt gaaggctcac tttgatgtaa 780

aagcatgggt gtgcatctcc gatgagtttg atgtcaaaca agtgacaaca agcattatca 840

cttcagccac tcgtgataca tgtaatttcg gtgttctaga tgaggcacaa gataaattaa 900

agaacttgct tgtagacaaa agattcttga tcgttcttga tgatatatgg agtgatgaat 960

atgatccttg ggaccaactt caaacccctt tttcatcagc gaagaaggga agtagagttc 1020

taatcacgac cagaatggag acggtggcaa agaacatggt taaaagacca gatcaaagcc 1080

ccatcatcaa gttaaaggtt ttatctgatg atgattgttg gcttctcttt caaaagcatg 1140

cagtcgtaga tgaagacctc attgtgatgc agaaggactt ggttgggttg ttcaaaggat 1200

tgcctttggc tgcaaaagct ctaggaggtc tcctaaggag agagcgtaag agtaattggg 1260

caaggatatt aaagagcaat atttggagtg aagaaggtgg tgttctgcca gtcttgaggc 1320

ttagttatca tcatctccca caaaacctca aacgtgcctt tgcttattgt tctatattcc 1380

cgaaagatta taaattcacg gagatgaatg ttatattaat gtggatagca gaaggcttgc 1440

tgccagagca cgacaaggag tgcaaggaag acattggtcg tgactatttt cttgatctag 1500

tatcaagatc attgtttgaa ccaaacagtc caatgtatat ggatggatct ttcattatgc 1560

atgacctaat ccatgaccta gctcaatggg ctgctggtga agtttgttgc acattgaata 1620

tccaaaaact ttcttctaga acacgttatt ggtctttctc tgaagaaata ctgatagatc 1680

aaacatggac ttcaaagaaa cttgtccagg tacgatcatt tgcttctttt ggtgcattag 1740

atgttcgaat tcctatgcaa ctactagatt ccattttccg tcagtttcaa tacttacgct 1800

tgttgcgtat gcataaggcg ggaataattg agttaccaaa tagtatgggt aatctgaaac 1860

acttgagact tcttgacctc tcatggaata caaaactaac tagattgcca aagtccacta 1920

gcaagctttg caacctccag acgctgctgt taagaggatg taagtctctt gtggagatag 1980

tccctctaat cgaacttcaa caccttgatg ttagtagtag gtatgctgct tcaccgttgg 2040

ggattggaaa attaacaaac ttgcagacat tgaagggatt tactttgaga agatactcta 2100

agacaagtat aagtgaattg aagaacttga aatgcctccg tggctcactg gacatccatg 2160

gcctagagaa tgtgtttagt agtgaagaag cacaagcagc aaggttgcac gaaaagacag 2220

gccttgataa gttggaaatg tattggggag ataatgccca tgatgttgat gacaacatta 2280

aaaaagatgt agttgatcga ttacagcctc cggaatccat caaagaatta acgttgaatg 2340

ggtacgacgg cttaacattc cctgcttggt tgggaaatcc ctcttacact aatatggttt 2400

tcatagaatt aagggagtgt aggagatgtg aattcttacc agcactaggg cagctgccct 2460

cattaaagaa catcataata gaagggatgg atgatattaa gactgtaggc cctgaatttt 2520

acggcaatga tgatggttgt tcaaacctgt ttcctgcatt gaaaagtcta cgattctatg 2580

gaatgggggg ttgggaggag tggttggccc catcagttga caatagcaat gcatttccct 2640

gccttgaata tattagcata tatgaatgtc cattgttgcg ggctaactta ccttcccatc 2700

tcccatccct aaaagacttg tccattggca aatgcaaaga gttgagattg tcacttccaa 2760

gctgcccttt gctccaaaaa ttgactatta taacatatga gacgccattt agtattgctg 2820

attgtttgcc ctcaactctt gagaccctgg aaatcttgca ctccgaaata gagcagccaa 2880

ttcaagagtg gaaacttgac ctccttactt ctcttaaatc tcttgatctc caaaacatag 2940

gcagagccgc agatacaata gagcatattc cccaaccaga ttttcatctt ccctcttcct 3000

tgtcttcctt atatatctcg gatttcaaga atttgaaatc cttgtcatgc tctacccttc 3060

ccaacctcac tgaaattaaa atctggaatt gtaagaagct ggaatcattg ggtgtcgatt 3120

tcccaccatc gaagcttcag gaagcgtatt ttagtgattg ccctttgatt tatcaacgat 3180

gcaaaccgga tccccatgga cttattgttt ttaattatat tgataaatac aaatattcgt 3240

acatttgaag attccagttt tcattccctg aagattgagt tggaggtgga gttttggggt 3300

ttttttcaga ttttgttttt gttttttttc attttcttta gtttatttgt atgaaactag 3360

aatatattca aggaattgtg ataaaaaaaa aaaaaaaagg gcggccgctc tagagtatcc 3420

ctcgaggggc ccaagcttac gcgacccagc tttcttacaa agg 3463

<212>类型：DNA

<211>长度：3463

序列名：序列 5

序列描述：

序列

--------

<213>生物名称：

<400>前序列串：

cagccaccaa agaggaccca gaat 24

<212>类型：DNA

<211>长度：24

序列名：序列 6

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

ttattcagcc atcaaagttg accaataat 29

<212>类型：DNA

<211>长度：29

序列名：序列 7

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

tacaattcaa acattgttca aacaaggaac c 31

<212>类型：DNA

<211>长度：31

序列名：序列8

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

ttctagccac cagatttgac caaac 25

<212>类型：DNA

<211>长度：25

序列名：序列9

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

<400>前序列串：

actagtcagc caccaaagag gacccagaat tctagtcagc caccaaagag gacccagaat 60

tctagttaca attcaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaatt caaacattgt 120

tcaaacaagg aacctctaga g 141

<212>类型：DNA

<211>长度：141

序列名：序列 10

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

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actagtttat tcagccatca aagttgacca ataattctag tttattcagc catcaaagtt 60

gaccaataat tctagttaca attcaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaatt 120

caaacattgt tcaaacaagg aacctctaga 150

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序列描述：

序列

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<213>生物名称：

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actagtttct agccaccaga tttgaccaaa ctctagtttc tagccaccag atttgaccaa 60

actctagtta caattcaaac attgttcaaa caaggaacct ctagttacaa ttcaaacatt 120

gttcaaacaa ggaacctcta ga 142

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序列名：序列 12

序列描述：

序列

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AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDI LDE 36

<212>类型：PRT

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序列名：序列13

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序列

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<213>生物名称：

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IXEIXXKLDD I 11

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序列名：序列 14

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

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AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDILDEXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX 60

XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXIX EIXXKLDDI 99

<212>类型：PRT

<211>长度：99

序列名：序列 15

序列描述：

序列

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<213>生物名称：

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atggagattg gcttagcagt tggtggtgca tttctctctt cagctttgaa tgttctcttt 60

gataggcttg ctcctcacgg tgatctgctc aacatgtttc agaagcataa ggatcatgtt 120

aagctcttaa agaagctgga ggacattttg ctcggtcttc agattgtgct aagtgatgca 180

gagaataaac aagcatcaaa tcgacatgtg agccagtggt tcaataagct tcagaatgct 240

gtggacggtg ctgagaactt gatagaacaa gtcaattatg aagctttgag gcttaaggtg 300

gaaggccagc atcaaaatct tgcagaaaca agcaaccagc aagtaagtga ccttaacctg 360

tgcttcagtg atgatttctt tcttaacata aaggataagt tggaagaaac cattgaaaca 420

ttggaggtgt tggaaaagca aattggtcgc cttgtaatca ctagctag 468

<212>类型：DNA

<211>长度：468

序列名：序列16

序列描述.

Claims

1.编码在植物中产生针对病原体的抗性的自激活抗性蛋白的核酸，其特征在于该核酸含有NBS-LRR抗性基因的有限部分，从NBS-LRR抗性基因编码区的5’端向下延伸到NBS-LRR抗性基因NBS结构域的起始处，其中所述的NBS-LRR抗性基因不是TIR-NBS-LRR抗性基因。

2.如权利要求1所述的核酸，其编码具有序列元件DAE的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的核酸，其编码具有序列元件AVLXDAE的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的核酸，其具有选自下述的核苷酸序列：

5.如权利要求1所述的核酸，其特征在于NBS-LRR抗性基因是来自甜菜的抗性基因。

6.如权利要求1所述的核酸，编码具有选自下述的序列的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO：13

b)SEQ ID NO：14

c)SEQ ID NO：15

7.可在植物中产生针对病原体的抗性的核酸，其具有

a)病原体诱导型启动子，以及

b)位于启动子控制下的、如权利要求1-6中任一项所述的核酸。

8.如权利要求7所述的核酸构建体，其特征在于所述的病原体诱导型启动子是合成的启动子。

9.如权利要求8所述的核酸构建体，其特征在于所述的合成的启动子包括一个或多个以下的顺式元件组合：

a)nxS-mxD-box

b)nxW2-mxD-box

c)nxGst1-mxD-box

其中，n和m是指从1到10的自然数。

10.如权利要求9所述的核酸构建体，其特征在于所述的顺式元件组合包括：

a)SEQ ID NO：10的核苷酸序列，或

b)SEQ ID NO：11的核苷酸序列，或

c)SEQ ID NO：12的核苷酸序列，或

d)与如a)到c)所述的核酸序列具有类似特性的其衍生物。

11.具有前述权利要求任一项所述的核酸或核酸构建体的转基因植物。

12.如权利要求11所述的转基因植物的一部分。

13.如权利要求11所述的转基因植物的种子或遗传材料。

14.如权利要求1-10任一项所述的核酸或核酸构建体在产生转基因植物方面的用途。