JP2008541739A - 自己活性化した耐性タンパク質 - Google Patents
自己活性化した耐性タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008541739A JP2008541739A JP2008513923A JP2008513923A JP2008541739A JP 2008541739 A JP2008541739 A JP 2008541739A JP 2008513923 A JP2008513923 A JP 2008513923A JP 2008513923 A JP2008513923 A JP 2008513923A JP 2008541739 A JP2008541739 A JP 2008541739A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- seq
- gene
- nucleic acid
- nbs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Secondary Cells (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
Abstract
Description
a)SEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
b)SEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
c)SEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
d)SEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
e)SEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
このNBS−LRR耐性遺伝子の限定された部分は、有利なヌクレオチド配列では、次のように及ぶ;
SEQ ID NO:1、124−654位
SEQ ID NO:2、155−598位
SEQ ID NO:3、94−573位
SEQ ID NO:4、194−694位。
a)n×S−m×D−ボックス(Box)
b)nxW2−mxD−ボックス
c)nxGst1−mxD−ボックス
(その際、n及びmは自然数1〜10を意味する)。
ヌクレオチド配列SEQ ID NO:10を有する2×S−2×D、
ヌクレオチド配列SEQ ID NO:11を有する2×W2−2×D、及び
ヌクレオチド配列SEQ ID NO:12を有する2×Gst1−2×D。合成プロモーターの特性は更に、シス要素(n、m=1〜10)の数の変更により、遺伝子発現の要求に応じて変更される。プロモーター−2×S−2×Dと、変形2×S−4×D、4×S−2×D及び4×S−4×Dの比較は、平均的なプロモーター強度が、テトラマーの使用により、ダイマーから構成されたプロモーターと比較して高められることを示す。更に、ダイマー−ダイマープロモーター(2×S−2×D)の病原体誘導性は、テトラマー−ダイマー、及び、ダイマー−テトラマープロモーター(4×S−2×D、4×S−2×D)を越えて、テトラマー−テトラマープロモーター(4×S−4×D)にまで全ての測定点で上昇する。プロモーター強度及び病原体誘導性の上昇と並行して、記載された例の場合には、テトラマー含有プロモーターの基礎活性の向上も生じる。この例は、重要なプロモーター特性が、シス要素の数により制御され、かつ、そのつどの技術的な反応のために最適なプロモーター変形が作成かつ同定されることができることを示す。
図1は、バイナリーベクターpER-35Sluciの地図を示し、このベクターを、R遺伝子の、アグロバクテリウム チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介一過的発現のためにサトウダイコン葉中で使用した。このベクターは、フォチナス・フィラリス (Photinus pyralis)からの、イントロンにより中断されたルシフェラーゼ遺伝子を有し、これはA.チュメファシエンス中では発現されることができない。
遺伝子BvKWS3_133の過剰発現によるサトウダイコン葉中での迅速な耐性反応の作動の検出
アグロバクテリウム・チュメファシエンスによるサトウダイコン葉中での遺伝子BvKWS3_133の完全長cDNAクローンの一過的過剰発現は、可視可能なネクローシス形成無しに迅速な細胞死を作動する。cDNAクローンBvKWS3_133を、d35Sプロモーターと組み合わせ、そしてバイナリーベクターpER-35Sluci(図1)中に挿入した。この生じるベクターは、名称pER133-35Sluciを有する。このベクターpER-35Sluci及びpER133-35Sluciをアグロバクテリウム株C58C1中にトランスフォーメーションした(An 1987)。ポジティブアグロバクテリウムを、一過的発現のためにスペクチノマイシン100mg/ml及びアセトシリンゴン20μMを有するLB培地50ml中で4〜5時間生育した。引き続き前記細菌を遠心分離し、この沈殿物を10mM MgCl2、10mM MES、100μM アセトシリンゴンの溶液中に取り込ませ、そして細菌密度OD600=0.1に調整した。この細菌懸濁物を2〜3時間放置し、次いで2.5mlシリンジを用いて、10週齢のサトウダイコンの葉の裏側を介して葉中に注射した。25℃でのインキュベーション後に、栽培棚中で、接種1、2及び3日間後に、フォチナス・フィラリス ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を、前記のトランスフォーメーションした葉中で測定した。このために、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega, Mannheim, ドイツ国)を用いて、Sirius Luminometer中(Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, ドイツ国)で、製造指示に従って測定した。測定に適した酵素抽出物の獲得のために、測定点につきそのつど2つの葉円形部分(Blattrondelle)を打ち抜いた。コンストラクトにつき8つの測定点を、測定日1日につき得た。この葉の試料を、海砂(Seesand)の添加下で、10倍の容積(v/w)のパッシブ溶解バッファー(Passive Lysis Buffer)(PLB)を用いて、乳鉢中で均質化した。この液状の上清を、1.5mlのエッペンドルフ容器中に移し、5分間4℃及び20000gで遠心分離した。この透明な上清を取り出し、そのつど10μlの粗抽出物を、フォチナス ルシフェラーゼ活性測定のために使用した。コントロールコンストラクトpER-35Sluciでトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉は、1日目に少なく、かつ2日目及び3日目に、ルシフェラーゼ活性124.000又は116.000RLU/mg葉組織を示した。コンストラクトpER133-35Sluciでトランスフォーメーションしたダイコン葉は、全ての3つの測定点で活性を示さず、これは、MgCl2で接種された葉の活性と比較して高かった(図2)。従ってcDNAクローンBvKWS3_133の一過的発現は、極めて迅速な細胞死を接種されたダイコン葉中で作動させる。
R遺伝子BvKWS3_133並びにR遺伝子BvKWS3_165(SEQ ID NO:5によるヌクレオチド配列を有する)及びR遺伝子 BvKWS3_123を、ベクターpCaMV-2(図3)の二重の35Sプロモーターと組み合わせた。この生じるベクターは、名称p70S-BvKWS3 _133、p70S-BvKWS3_165及びp70S-BvKWS3_123を有する。R遺伝子の機能性を試験すべく、コンストラクトp70S-BvKWS3_133、p70S-BvKWS3_165及びp70S-BvKWS3_123をレポーター遺伝子ベクターp70S-lucを用いてサトウダイコン葉中に、Schmidt et al., 2004に応じて、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより一過的に発現させた。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。標準化したベクターの使用は、Schmidt et al.(2004)からは逸脱して、断念した。このルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイ系(Promega, Mannheim, ドイツ国)を用いてトランスフォーメーション20時間後に測定した。このトランスフォーメーション実験を3回繰り返し、そのつどの実験は1コンストラクトにつき9回の試験繰り返しを含んだ。3回の実験からの平均値の形成は、ポジティブコントロール(空ベクター)の100%に設定したルシフェラーゼ活性に比較して、p70S-BvKWS3_133で37.7%のみ、p70S-BvKWS3_165で66%のみ、そしてp70S-BvKWS3_123で68.7%のみのレポーター遺伝子活性を有した(図4)。R遺伝子BvKWS3_133、BvKWS3_165及びBvKWS3_123の強力な発現は、d35Sプロモーターにより細胞死又は過敏感反応を、トランスフォーメーションした細胞の部分中で作動し、これは同時形質転換したレポーター遺伝子ベクターの共発現を妨げた。これにより、3個のR遺伝子の強力な発現が、細胞死又はHRを、相応する非病原体遺伝子産物の非存在下で生じることを示した。
SEQ ID NO:5に応じたヌクレオチド配列を有する完全長cDNAクローンBvKWS3_165から出発して、コンストラクトp70SBvKWS3_165中で、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の5′領域を、プライマーS316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及びS318(CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTACC)の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、SEQ ID NO:1に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、BvKWS3_165のアミノ酸配列1〜175をコードする(図10)。このアミノ酸配列は、BvKWS3_165のN末端領域のみを含み、そしてNBSを含まずLRRドメインも含まない(図10)。このPCR産物を、制限酵素SacII及びBamHIを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S165_#175を有する。コンストラクトp70S-BvKWS3_165及びp70S-165_#175の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる適性は、一過的な、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験された。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。空ベクター(pCaMV-2)のトランスフォーメーションとの比較において、p70S-BvKWS3_165によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の65%、そしてp70S-165_#175によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の38%のみを生じた(図5)。この結果は、175アミノ酸の大きさの165_#175のN末端の唯一の発現が、1066アミノ酸の大きさの完全長タンパク質BvKWS3_165の使用と比較して、細胞死のより強力な作動をトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中で生じることを示す。165_#175の発現により、BvKWS3_165の発現の場合におけるよりもより多くのトランスフォーメーションした葉細胞が壊死する。この相違のための原因は、N末端での短縮化による、Rタンパク質の自己活性化の新規の、より強力な形態である。
完全長cDNA BvKWS3_135から出発して、コンストラクトp70SBvKWS3_135中で、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の5′領域を、プライマーS316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及びS330(CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC)の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、SEQ ID NO:2に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、BvKWS3_135のアミノ酸配列1〜147をコードする(図10)。このアミノ酸配列は、BvKWS3_135のN末端領域のみを含み、そしてNBSを含まずLRRドメイン又はこれらのドメインからのモチーフも含まない。このPCR産物を、制限酵素SacII及びBamHIを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S-135_#147を有する。コンストラクトp70S-BvKWS3_135及びp70S-135_#147の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる能力を、一過的な遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験した。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。空ベクター(pCaMV-2)のトランスフォーメーションとの比較において、p70SBvKWS3__135によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の74.5%、そしてp70S-135__#147によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の58.5%のみを生じた(図6)。この結果は、完全長クローンBvKWS3_135の発現が、形質転換した組織中での細胞死の作動を生じることを示す。確かに、147アミノ酸の大きさの135_#175のN末端の唯一の発現が、844アミノ酸の大きさのタンパク質BvKWS3_135の使用と比較して、より強力な細胞死をトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中で引き起こす。135_#147の発現により、BvKWS3_135の発現の場合におけるよりもより多くのトランスフォーメーションした葉細胞が壊死する。この相違のための原因は、N末端での短縮化による、Rタンパク質の自己活性化の新規の、より強力な形態である。
完全長cDNA Bv13033から出発して、コンストラクトp70S-13033中で、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の5′領域を、プライマーS316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG)及びS333(CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT)の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、SEQ ID NO:3に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、Bv13033のアミノ酸配列1〜159をコードする(図10)。このアミノ酸配列は、Bv13033のN末端領域のみを含み、そしてNBSを含まずLRRドメイン又はこれらのドメインからのモチーフも含まない。このPCR産物を、制限酵素SacII及びBamHIを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S-13033_#159を有する。コンストラクトp70S-13033及びp70S-13033_#159の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる適性は、一過的な遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験された。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を使用した。空ベクター(pCaMV-2)のトランスフォーメーションとの比較において、p70S-13033によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の95%、そしてp70S-165_#175によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の68%を生じた(図7)。この結果は、完全長クローンBv13033の発現が、形質転換した組織中での弱い細胞死の作動を生じることを示す。159アミノ酸の大きさの、13033_#159のN末端の唯一の発現によりこれに対して、トランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中での強力な細胞死を引き起こす。この相違のための原因は、N末端での短縮による、Rタンパク質の自己活性化の新規の、強力な形態である。
SEQ ID NO:4に応じたヌクレオチド配列を有するR遺伝子Bv12069は、166アミノ酸の大きさの、Rタンパク質のN末端をコードする。このタンパク質Bv12069は、NBSを含有せずLRRドメインも含有せず、しかしながら、自己活性化したRタンパク質165_#175、135_#147 13033_#159の175、147及び159アミノ酸の大きさのN末端に対する顕著なホモロジーを示す(図10)。このcDNAクローンを、ベクターpCaMV-2(図3)の二重の35Sプロモーターを用いてベクターp70S-12069へと組み合わせた。遺伝子Bv12069の機能性を試験するために、コンストラクトp70S-12069を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて、サトウダイコン中で、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより一過的に発現させた。p70S-12069及びp70S-lucでトランスフォーメーションした葉のレポーター活性は、3回の独立した試験において、ポジティブコントロール(空ベクターpCaMV-2及びp70S-luc)中で測定することができた活性の51%のみであった(図8)。この166アミノ酸の大きさのタンパク質Bv12069の発現は、従って、サトウダイコン葉中での細胞死を引き起こした。
NBS−LRRタイプのRタンパク質のNBS及びLRR不含N末端での短縮化による自己活性化の本発明による機構を、MHDモチーフの突然変異作成による自己活性化の方法と比較した。ジャガイモのRx遺伝子及びアマからのL6遺伝子のこのMHDモチーフの突然変異作成は、挙げられた遺伝子の自己活性化を生じた(Bendahmane et al., 2002; Howles et al., 2005)。cDNAクローンBvKWS3_135は、MHDモチーフに相当するVHDモチーフをコードし、これはしばしば、MHDモチーフの他に同様にR遺伝子中で見出される(Howles et al., 2005)。この相応する突然変異は、例えばBendahmane et al. (2002)により記載されたように、完全長クローンBvKWS3_135中に挿入されている。このためには、遺伝子のVHDモチーフ中の、アミノ酸アスパラギン酸を、アミノ酸バリンにより交換した。この相応する遺伝子は、名称BvKWS3_135_D480Vを有する。遺伝子135_#147、BvKWS3_135_D480V及び非変性遺伝子BvKWS3_135の有効性を、サトウダイコン葉中でのアグロバクテリウム・チュメファシエンスにより媒介された一過的な過剰発現により試験した。このために、cDNAクローンBvKWS3_135を、d35Sプロモーターと組み合わせ、バイナリーベクターpER35Sluci中に挿入した。この生じるベクターは、名称pER135-35Sluciを有する。相応して、SEQ ID NO:2に応じたヌクレオチド配列を有する短縮したcDNAクローン135_#147を用いて、並びに、突然変異したcDNAクローンBvKWS3_135_D480Vを用いて実施した。この生じるベクターは、名称pER135_#147-35Sluci及びpER135_D480V-35Sluciを有する。このベクターを、記載したように、アグロバクテリウム株C58C1中にトランスフォーメーションし、かつ、ポジティブコントロールpER-35Sluciと一緒にサトウダイコン葉中に注射した。フォチナス・ピラリス ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を、トランスフォーメーションした葉中で接種1、2及び3日間後に測定した。コントロールコンストラクトpER-35Sluciを用いてトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉は、1日目に少ない、そして2及び3日目に、299.000及び433.000RLU/mg葉組織のルシフェラーゼ活性を示した。コンストラクトpER135-35Sluciでトランスフォーメーションしたダイコン葉は、2及び3日目に、ルシフェラーゼ活性190.000及び245.000RLU/mg葉組織を示し、従ってポジティブコントロールpER-35Sluciと比較して測定可能な細胞死を示した。コンストラクトpER_135_D480V-35Sluciのレポーター遺伝子活性は、2及び3日目に、188.000及び206.000RLU/mgを示した(図9)。これにより、遺伝子BvKWS3_135中のMHD突然変異の挿入は、より少ないか又はほとんど測定可能でない自己活性化を生じた。この方法に相応して短縮されたR遺伝子135_#147はこれに対して、2及び3日目に、レポーター遺伝子活性90000及び63000RLU/mgを示し(図9)、従って、コンストラクトpER135-35Sluci及びpER_135_D480V-35Sluciに比較して顕著により強力な細胞死作動及び自己活性化を示した。
Rタンパク質BvKWS3_165、BvKWS3_135及びBv13033及び Bv12069の175、147、159及び166のアミノ酸の大きさの、Rタンパク質のN末端と、ジャガイモからの155のアミノ酸の大きさの、R3a遺伝子のN末端(Huang et al., 2005)の間のホモロジー比較を、共通の配列モチーフを同定するために実施した。この比較は、自己活性化したRタンパク質のN末端中での複数のコンセンサス配列の同定を生じた。この共通の配列モチーフは、コンセンサス配列として図10a中で強調されている。
NBS−LRRタンパク質のN末端の自己活性化のために重要であるタンパク質165_#175中のアミノ酸断片を同定すべく、cDNAクローン165_#175のコード領域を短縮化した。cDNAクローン165_#93及び165_#146は、タンパク質165_#175のアミノ酸1〜93又は1〜146をコードする。コンストラクトp70S_165_#93、p70S_165_#146及びp70S_165_#175の一過的な遺伝子銃による試験は、タンパク質165_#93及び165_#146でなくタンパク質165_#175のみが、強力な細胞死を作動させることを示した(図11)。従って、配列領域146〜175は、NBS−LRRタンパク質の自己活性化のために本質的である。この領域には、全ての試験したタンパク質間で保存された配列モチーフが存在する(図10a)。
病原体誘導された、完全長の又は部分的な耐性遺伝子の過剰発現のためには、特に合成のプロモーター、nxS−mxD、nxW2−mxD及びnxGst1−mxDのタイプ(その際n=1、2、3、4、5、6、7,8、9、10及びm=1、2、3、4、5、6、7,8、9、10)が適する。例示的に、SEQ ID NO:10による2xS-2xD、SEQ ID NO:11による2xW2-2xD並びにSEQ ID NO:12による2xGst1-2xDのタイプのプロモーターを、フォチヌス・ピラリスからのルシフェラーゼ遺伝子と組み合わせ、サトウダイコン中にトランスフォーメーションし、かつ、菌類の攻撃に対する反応において分析した。
タイプ、nxS−mxD、nxW2−mxD及びnxGst1−mxD(その際n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及びm=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)の合成プロモーターの特性は、シス要素の数の変更により、遺伝子発現の要求に応じて変更かつ最適化される。これは、例示的にプロモータータイプnxSmxDについて示される。バイナリーベクター2xS−2xD−luc-kanの他に、バイナリーベクター4xS−2xD−luc-kan、2xS−4xD−luc-kan及び4xS−4xD−luc-kanを作成し、サトウダイコン中にトランスフォーメーションした。この形質転換植物を、記載したように、C. beticolaで感染させ、そしてこのレポーター遺伝子活性を、菌類接種後に毎日測定した。13個の独立した系列2xS-2xD-lucの測定結果、14個の独立した系列4xS-2xD-luc、15個の独立した系列2xS-4xD-luc並びに15個の独立した系列4xS-4xD-lucを平均化し、このプロモーター強度、病原体誘導及び基礎活性の平均値を比較した。
サトウダイコンの菌類耐性の上昇のために、プロモーター2xS−2xD又は2xW2−2xDをそのつど、4個のR遺伝子 BvKWS3_123、BvKWS3_133、BvKWS3_135及びBvKWS3_165のうちの1個と組み合わせ、そしてサトウダイコン中にトランスフォーメーションした。このためには、13959又は13969kbの大きさのバイナリーベクター2xS-2xD-luc-kan及び2xW2-2xD-luc-kanを、SacIで切断し、そしてこの切断部位を、T4-DNAポリメラーゼ処理により満たした。引き続き、ベクターをXhoIで後切断し、電気泳動して分離し、12284又は12294kbの大きさのベクターを、1675kbの大きさのルシフェラーゼ遺伝子から分離及び単離した。
植物の向上した菌類耐性を、菌類耐性試験、例えば以下に例示的に、サトウダイコンの褐斑病(Cercospora beticola)に対する耐性試験のために記載する菌類耐性試験で観察した。
1 耐性試験の第3の及び最後の評価値(1=健康、9=100%崩壊した葉表面)。
2 3つの評価期日(T1〜T3)にわたり算出したAUDPC (Area under disease progress curve)値。AUDPC値は、複数の評価時間点の被害強度の進行を1つの値に包括する。
菌類耐性植物を、R遺伝子のN末端の断片の使用下で作成するために、短縮化したR遺伝子13033_#159、135_#147、165_#175及びBv12069を、プロモーター2xS−2xD及び2xW2−2xDを組み合わせ、そしてサトウダイコン中にトランスフォーメーションした。
Claims (14)
- 植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸であって、この核酸が、NBS−LRR耐性遺伝子のコード領域の5′末端から下流にNBS−LRR耐性遺伝子のNBSドメインの開始点までにわたるNBS−LRR耐性遺伝子の限定された部分を有し、その際、NBS−LRR耐性遺伝子はTIR−NBS−LRR耐性遺伝子でないことを特徴とする、植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸。
- 配列モチーフDAEを有するアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の核酸。
- 配列モチーフAVLXDAEを有するアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の核酸。
- 以下の群:
a)SEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:1によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
b)SEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:2によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
c)SEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:3によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
d)SEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:4によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列;
e)SEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列と、又はSEQ ID NO:16によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列
からのヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の核酸。 - NBS−LRR耐性遺伝子が、サトウダイコンからの耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項1記載の核酸。
- 次の群:
a)SEQ ID NO:13、
b)SEQ ID NO:14、
c)SEQ ID NO:15
から選択された配列を有するアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の核酸。 - a)病原体誘導可能なプロモーター並びに
b)前記プロモーターの制御下にある、請求項1から6までのいずれか1項記載の核酸
を有する植物での病原体に対する耐性の産生のための核酸コンストラクト。 - 病原体誘導可能なプロモーターが合成プロモーターであることを特徴とする、請求項7記載の核酸コンストラクト。
- 合成プロモーターが、以下のシス要素組み合わせ:
a)nxS−mxD−ボックス
b)nxW2−mxD−ボックス
c)nxGst1−mxD−ボックス
(その際n及びmは、1〜10の自然数を意味する)
を1個又は複数個含有することを特徴とする、請求項8記載の核酸コンストラクト。 - シス要素組み合わせ
a)SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列、又は
b)SEQ ID NO:11のヌクレオチド配列、又は
c)SEQ ID NO:12のヌクレオチド配列、又は
d)比較可能な特性を有する、a)〜c)によるヌクレオチド配列の誘導体
を含有することを特徴とする、請求項9記載の核酸コンストラクト。 - 請求項1から6までのいずれか1項記載の核酸又は請求項7から10までのいずれか1項記載の核酸コンストラクトを有する形質転換植物。
- 請求項11記載の形質転換植物の部分。
- 請求項11記載の形質転換植物の種子又は種物。
- 請求項1から6までのいずれか1項記載の核酸又は請求項7から10までのいずれか1項記載の核酸コンストラクトの、形質転換植物の製造のための使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102005026045A DE102005026045A1 (de) | 2005-06-03 | 2005-06-03 | Nukleinsäure, die für ein autoaktiviertes Resistenzprotein zur Erzeugung einer Resistenz gegenüber Pathogenen bei Pflanzen codiert |
DE102005026045.4 | 2005-06-03 | ||
PCT/DE2006/000950 WO2006128444A2 (de) | 2005-06-03 | 2006-06-02 | Autoaktiviertes resistenzprotein |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008541739A true JP2008541739A (ja) | 2008-11-27 |
JP5054677B2 JP5054677B2 (ja) | 2012-10-24 |
Family
ID=37482011
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008513923A Expired - Fee Related JP5054677B2 (ja) | 2005-06-03 | 2006-06-02 | 自己活性化した耐性タンパク質 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8080706B2 (ja) |
EP (1) | EP1891220B1 (ja) |
JP (1) | JP5054677B2 (ja) |
CN (1) | CN101292037B (ja) |
AT (1) | ATE462795T1 (ja) |
AU (1) | AU2006254528B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0613089A2 (ja) |
CA (1) | CA2610271C (ja) |
DE (2) | DE102005026045A1 (ja) |
DK (1) | DK1891220T3 (ja) |
ES (1) | ES2343271T3 (ja) |
PL (1) | PL1891220T3 (ja) |
RU (1) | RU2375453C2 (ja) |
UA (1) | UA91542C2 (ja) |
WO (1) | WO2006128444A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200710943B (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102006029129A1 (de) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Kws Saat Ag | Pathogen induzierbarer synthetischer Promotor |
US20130152228A1 (en) * | 2010-08-20 | 2013-06-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of Increasing Resistance Against Fungal Infection in Transgenic Plants by HCP-2-Gene |
CN109234292A (zh) * | 2011-06-23 | 2019-01-18 | 孟加拉朱特研究所 | 编码在黄麻中赋予疾病抗性的酶的核酸分子 |
DE102012003848A1 (de) | 2012-02-29 | 2013-08-29 | Kws Saat Ag | Pathogenresistente transgene Pflanze |
DE102013010026A1 (de) | 2013-06-17 | 2014-12-18 | Kws Saat Ag | Resistenzgen gegen Rizomania |
EP3282016A1 (de) | 2016-08-10 | 2018-02-14 | Kws Saat Se | Resistenzgen gegen wurzelbärtigkeit |
EP3567111A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-13 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera |
EP3584253A1 (en) | 2018-06-18 | 2019-12-25 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Balanced resistance and avirulence gene expression |
CN113646326A (zh) | 2019-02-18 | 2021-11-12 | 科沃施种子欧洲股份两合公司 | 用于抗植物病害的基因 |
EP3696188A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-19 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Gene for resistance to plant disease |
US20220389443A1 (en) * | 2019-11-12 | 2022-12-08 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera |
EP3957168A1 (en) | 2020-08-17 | 2022-02-23 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Plant resistance gene and means for its identification |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9924483D0 (en) * | 1999-10-15 | 1999-12-15 | Plant Bioscience Ltd | Modified resistance genes |
EP1288301A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-03-05 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Berlin | Plant-derived resistance gene |
CN100342018C (zh) * | 2002-03-22 | 2007-10-10 | 独立行政法人农业·生物系特定产业技术研究机构 | 功能性植物、为培育该功能性植物而使用的启动子及其应用方法 |
-
2005
- 2005-06-03 DE DE102005026045A patent/DE102005026045A1/de not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-06-02 CA CA2610271A patent/CA2610271C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-02 DE DE502006006581T patent/DE502006006581D1/de active Active
- 2006-06-02 PL PL06753229T patent/PL1891220T3/pl unknown
- 2006-06-02 JP JP2008513923A patent/JP5054677B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-02 RU RU2007147689/13A patent/RU2375453C2/ru active
- 2006-06-02 ES ES06753229T patent/ES2343271T3/es active Active
- 2006-06-02 WO PCT/DE2006/000950 patent/WO2006128444A2/de active Application Filing
- 2006-06-02 CN CN2006800195520A patent/CN101292037B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-02 US US11/916,086 patent/US8080706B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-02 BR BRPI0613089-5A patent/BRPI0613089A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-06-02 UA UAA200712869A patent/UA91542C2/ru unknown
- 2006-06-02 EP EP06753229A patent/EP1891220B1/de not_active Not-in-force
- 2006-06-02 AU AU2006254528A patent/AU2006254528B2/en not_active Ceased
- 2006-06-02 AT AT06753229T patent/ATE462795T1/de active
- 2006-06-02 DK DK06753229.1T patent/DK1891220T3/da active
-
2007
- 2007-12-18 ZA ZA200710943A patent/ZA200710943B/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1891220A2 (de) | 2008-02-27 |
ATE462795T1 (de) | 2010-04-15 |
RU2007147689A (ru) | 2009-07-20 |
EP1891220B1 (de) | 2010-03-31 |
WO2006128444A2 (de) | 2006-12-07 |
CA2610271C (en) | 2013-01-29 |
US20090300795A1 (en) | 2009-12-03 |
CN101292037B (zh) | 2013-07-10 |
CA2610271A1 (en) | 2006-12-07 |
WO2006128444A3 (de) | 2007-03-15 |
ES2343271T3 (es) | 2010-07-27 |
AU2006254528A1 (en) | 2006-12-07 |
RU2375453C2 (ru) | 2009-12-10 |
PL1891220T3 (pl) | 2010-10-29 |
DE102005026045A1 (de) | 2007-06-14 |
DK1891220T3 (da) | 2010-07-19 |
JP5054677B2 (ja) | 2012-10-24 |
US8080706B2 (en) | 2011-12-20 |
AU2006254528B2 (en) | 2011-03-03 |
UA91542C2 (ru) | 2010-08-10 |
DE502006006581D1 (de) | 2010-05-12 |
BRPI0613089A2 (pt) | 2010-12-21 |
CN101292037A (zh) | 2008-10-22 |
ZA200710943B (en) | 2009-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5054677B2 (ja) | 自己活性化した耐性タンパク質 | |
JP3281512B2 (ja) | ウイルス耐性の植物の生産方法 | |
JP3310307B2 (ja) | ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子 | |
JPH07500970A (ja) | 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法 | |
CN108251432B (zh) | 三七类病程相关蛋白基因PnPRlike及应用 | |
MX2014009113A (es) | Composiciones citricas resistentes a patogeno, organismos, sistemas y metodos. | |
MX2014010307A (es) | Plantas transgenicas resistentes a los agentes patogenos. | |
Chen et al. | Overexpression of glucanase gene and defensin gene in transgenic tomato enhances resistance to Ralstonia solanacearum | |
US6653533B1 (en) | Nucleic acids encoding proteins with pathogen resistance activity and plants transformed therewith | |
CA2741285A1 (en) | Mutated eif4e sequences from potato which are useful in imparting virus resistance | |
CA2184741A1 (en) | Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants | |
Ahmed et al. | An efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation method of lettuce (Lactuca sativa L.) with an aphidicidal gene, Pta (Pinellia ternata Agglutinin) | |
Zakharchenko et al. | Enhanced resistance to phytopathogenic bacteria in transgenic tobacco plants with synthetic gene of antimicrobial peptide cecropin P1 | |
CN109295068B (zh) | 一种三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用 | |
HU218356B (hu) | Eljárás többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgén növények előállítására | |
WO2013062069A1 (ja) | ジェミニウイルス複製阻害剤 | |
CN114606260B (zh) | 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法 | |
US20230225331A1 (en) | Plant Endophytic Bacteria And Methods To Control Plant Pathogens And Pests | |
Saker et al. | In vitro production of transgenic tomatoes expressing defensin gene using newly developed regeneration and transformation system | |
US20220042030A1 (en) | A method to improve the agronomic characteristics of plants | |
AU769546B2 (en) | Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes | |
Siti Nur Akmar | Over-expression of two putative disease resistant genes NBS-type rgc and wrky against Fusarium oxysporum f. sp. cubense in plants/Siti Nur Akmar Mazlin | |
Mazlin | Over-Expression of Two Putative Disease Resistant Genes NBS-Type RGC and WRKY Against Fusarium Oxysporum F. Sp. Cubense in Plants | |
Chettri et al. | Development of posttranscriptional gene silencing constructs for Groundnut Bud Necrosis Virus nucleocapsid protein gene | |
WO2010099320A1 (en) | Plant resistance to banana bunchy top virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20101228 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20101227 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110524 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120420 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120427 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120628 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120727 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150803 Year of fee payment: 3 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |