HU218356B

HU218356B - Eljárás többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgén növények előállítására

Info

Publication number: HU218356B
Application number: HU9402670A
Authority: HU
Inventors: Merikke Kelve; Mart Saarma; Teemu Teeri; Erkki Truve
Original assignee: Kemira Bio Holding B.V.
Priority date: 1992-03-18
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 2000-08-28
Also published as: PL171446B1; RU94045821A; AU2661392A; DE69231711T2; ES2155062T3; JPH07504820A; FI944315A; BR9207103A; HU9402670D0; GR3035873T3; NO943439L; DE69231711D1; NO943439D0; ATE199397T1; HUT70265A; UA29438C2; FI944315A0; RU2125606C1; CA2132096A1; AU669130B2

Abstract

A találmány tárgyát többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikusnövények előállítása képezi felhasználva a 2,5A oligoadenilát útvonalegy részét, különös tekintettel arra, hogy a nevezett transzgenikusnövények génsebészetileg kialakított – legalább egy, 2,5Aszintetázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló – DNS--szekvenciát tartalmaznak. Ezenkívül a találmány tárgyát képezi anevezett génsebészetileg kialakított DNS- szekvencia felhasználása. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás olyan, többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növények előállítására, amelyek génsebészetileg kialakított - legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló - DNS-szekvenciát tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi továbbá a génsebészetileg kialakított DNSszekvencia felhasználása.

Vírusrezisztens növények létrehozására már leírtak néhány módszert a szakmában. Számos növényi vírussal szemben génsebészetileg kialakított rezisztenciáról tudósítanak a megfelelő vírus burokfehérjéjének transzgenikus növényekben történő kifejezése révén [Beachy et al., Annu. Rév. Phytopathol. 28, 451-474 (1990)].

Néhány növényi vírussal szemben jelentős vírusrezisztenciát mutattak ki specifikus virális antiszenszRNS transzgenikus növényekben történő kifejezésével [Cuozzo et al., Bio/Technology 6, 549-557 (1988); Hemenway et al., EMBO J. 7, 1273-1280 (1988)]. A virális antiszensz-RNS működése vagy a specifikus virális DNS- és RNS-szekvenciákkal való hibridizációban és ezáltal további, a vírus szaporodásához fontos reakciók gátlásában, vagy a virális RNS-nek - az említett virális RNS-sel való hibridizációját követően bekövetkező - specifikus hasítását eredményező ribozimaktivitásban nyilvánul meg. A fent említett, vírusrezisztens transzgenikus növények létrehozására szolgáló módszerek fő hátránya az, hogy az illető transzgenikus növények csak egy vírussal vagy a vírusok egy specifikus csoportjával szemben ellenállóak.

A 2,5A oligoadenilát útvonal a vírussal szembeni ellenállásért felelős rendszernek egy része, amelyet az emlőssejtekben interferonok idéznek elő [Lengyel, Annu. Rév. Biochem. 51, 251-282 (1982)]. A 2,5A útvonalnak legalább néhány komponensét felfedezték nem emlős szervezetekben, madarakban, hüllőkben és kétéltűekben, rovarokban, élesztőkben sőt még baktériumokban is [Stark et al., Natúré 278, 471-473 (1979); Cayley et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 108, 1243-1250 (1982); Laurence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2322-2326 (1984)].

Növényekben részlegesen megtisztítottak egy vírusellenes faktort (AVF=anti viral factor), amelynek a termelődését vírusfertőzés stimulálja és amelynek a génje a humán β-interferonnal homológnak tűnik [Sela et al., in: Plánt Resistance to Viruses: Ciba Symposium, No. 133, 109-119. (1987)]. A dohány-mozaikvírussal (TMV=tobacco mosaic vírus) fertőzött dohányprotoplasztok humán interferonnal történő kezelése a TMV replikációjának gátlásához vezetett [Sela, Methods on Enzymology, 744-752 (1986)]. Továbbá kimutatták, hogy dohánynövényekben a 2,5A gátolni tudja a TMV replikációját [Devash et al., J. Bioi. Chem. 259, 3482-3486 (1984)]. A humán 2,5A szintetázzal homológ DNS-szekvenciákat találtak a dohány genomiális DNS-ében is [Sela (1987) lásd fent].

A 2,5A függő RN-ázról azonban, amely emlősökben része a 2,5A oligoadenilát útvonalnak, növények esetében eddig még nem tudósított a szakirodalom. Ebből arra következtettek, hogy a 2,5A nem gátolja a vírusfertőzést 2,5A függő endonukleázon keresztül növényekben [Devash et al., Biochemistry 24, 593-599 (1985)].

Továbbá beszámoltak arról, hogy a transzgenikus növényekben termelt interferon nem gátolja meg a vírusszaporodást [De Zoeten et al., Virology 172, 213-222 (1989)].

Összefoglalva, az előzmények nem engedik meg annak a következtetésnek a levonását, hogy a 2,5 A oligoadenilát útvonal alapként felhasználható lenne többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növények előállítására.

Ezért tehát a jelen találmány gyakorlati feladata az, hogy többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növényt szolgáltasson a 2,5A oligoadenilát útvonal felhasználásával.

A fenti technikai feladat megoldását a szabadalmi igénypontokban jellemzett megvalósításokkal értük el.

A jelen találmány tárgyát olyan többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növény előállítása képezi, amely legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló, génsebészetileg kialakított DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett polipeptid kifejeződése révén képes egy, a virális RNS degradációját okozó endonukleáz aktiválására.

A „többszörös vírusrezisztencia” kifejezés olyan transzgenikus növényekre vonatkozik, amelyek a víruscsoportok több fajtájával - például potex-, karla- és tobamovírusokkal - szemben jelentős rezisztenciát mutatnak.

A „génsebészetileg kialakított DNS-szekvencia” kifejezés olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amelyet génsebészeti módszerekkel - például rekombináns DNS-technikákkal - manipuláltunk.

A „2,5 szintetázaktivitással rendelkező polipeptid” kifejezés minden olyan polipeptidre vonatkozik, amely képes enzimesen szintetizálni három vagy több adenozinmaradékkal - például 2,5A₃-mal, amely 2’,5’-foszfo-diészter-kötésekkel kapcsolt és az 5’-végén defoszforilezett adeniláttrimer - rendelkező 5’-defoszforilezett vagy foszforilezett 2,5-oligonukleotidokat.

A „virális RNS degradációját okozó endonukleáz” kifejezés egy olyan heterológ vagy homológ endonukleázra vonatkozik, amely képes a virális RNS-t enzimes hasítással elbontani. Nevezett endonukleázt a 2,5A aktiválja, amelyet egy 2,5A szintetázaktivitással rendelkező polipeptid szintetizál.

A jelen találmány egy előnyös megvalósításában a nevezett DNS-szekvencia vagy a nevezett DNS-szekvenciának legalább egy része homológ vagy heterológ a nevezett transzgenikus növénnyel.

A jelen találmány egy további megvalósításában a nevezett DNS-szekvencia egy kiméra DNS-szekvencia.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósításában a nevezett DNS-szekvencia ráadásként kódol legalább egy szelektálható markert és/vagy legalább egy további polipeptidet, például az említett endonukleázt.

A jelen találmány egy előnyös megvalósításában a nevezett polipeptidet kódoló DNS-szekvencia egy emlősgénből, növényi génből vagy mikroorganizmusgénből származik, vagy egy szintetikus gén.

HU 218 356 Β

A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósításában a nevezett polipeptidet kódoló DNS-szekvencia patkány 2,5A szintetázgén (1. ábra).

A jelen találmánynak egy előnyös megvalósításában a nevezett endonukleáz növényi RN-áz L.

Az említett polipeptid kifejeződése egy indukálható- vagy konstitutív promoter kontrollja alatt áll, amely növényekben működőképes, és hozzájárul a nevezett polipeptid indukált és/vagy megnövekedett kifejeződéséhez. Ilyen promoterekre példák a karfiol-mozaikvírus 35S-promotere, rizsaktinpromoter, különböző fajokból származó rbc S promoter, Agrobacter TR2’ promoter, fazeolingén promoter vagy a NOS promoter. A jelen találmány egy előnyös megvalósításában a 2,5A-t szintetizáló polipeptid kifejeződése a karfiolmozaikvírus 35S-promoterének kontrollja alatt áll.

A transzgenikus növény egyszikű vagy kétszikű növény. A jelen találmány egy előnyös megvalósításában a transzgenikus növény dohány, rizs, búza, árpa, kukorica, paradicsom, uborka, szója, batáta, szőlő, repce, cukorrépa, gyapot, tea, napraforgó, szamóca, rózsa, krizantém, édes paprika vagy burgonya.

A jelen találmány további tárgyát képezi a többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növényből származó szaporítóanyag előállítása.

A „szaporítóanyag” kifejezés ép növényre vagy differenciált vagy nem differenciált növényi szövetre vonatkozik, mint például a gyökér, szár, levél, szövet, protoplaszt, szuszpenziókultúra és magok.

A jelen találmány további tárgyát képezi egy eljárás többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növény előállítására, amely magában foglalja a legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló, génsebészetileg kialakított DNS-szekvencia bevitelét a megfelelő növény genetikai anyagába.

A „genetikai anyag” kifejezés a növényi sejt sejtmaggenomjára, sejtszervgenomjára vagy egy extrakromoszomális formára vonatkozik.

A „bevitel” kifejezés egy olyan módszerre vonatkozik, amely képes a nevezett génsebészetileg kialakított DNS-szekvenciát a növényi sejt nevezett genetikai anyagába bejuttatni. Az említett módszerre előnyös példák a következők: Agrobacterium közvetítette transzfer, növényi vírus közvetítette transzfer, mikroinjektálás, bombázás mikrolövedékkel, elektroporáció, PEG közvetítette transzformáció és növényi protoplasztok transzformációja vírusalapú stabil vektorokkal.

A jelen találmány egy előnyös megvalósításában a nevezett DNS-szekvencia egy vektorban található egy promoter kontrollja alatt, amely lehetővé teszi kifejeződését a nevezett transzgenikus növényben.

A jelen találmány egy különösen megvalósításában a nevezett vektor pHTT2-5A+, amelyet a budapesti egyezmény követelményeinek megfelelően a Német Mikroorganizmus Gyűjteményben (DSM=Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen) DSM 6815 gyűjteményi szám alatt letétbe helyeztünk.

A jelen találmánynak egy további előnyös megvalósításában az említett bevitelt transzfekcióval, az Agrobacterium rendszer felhasználásával végeztük el.

A jelen találmány további tárgyát képezi egy génsebészetileg kialakított - legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló - DNS-szekvencia felhasználása többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgén növény előállítására.

Az ábrák rövid magyarázata:

1. ábra: A pHTT2-5A+ plazmid összeállítása. A patkány 2,5A szintetázgén cDNS-ét tartalmazó EcoRI fragmentumot kivágtuk a pSK2-5A+ plazmidból, a ragadós végeket feltöltöttük, és a kapott fragmentumot BamHI linkerek alkalmazásával a pHTT202 vektor BamHI helyére ligáltuk. Ez a pHTT2-5A+ vektort eredményezi, amely a patkány 2,5A szintetázgént a CaMV 35S promoter kontrollja alatt tartalmazza.

2. ábra: A 2,5A szintetázgénnel transzformált transzgenikus dohánynövény teljes RNS-ének Northern blot-analízise. Sávonként a teljes RNS 10 pg-ját vizsgáltuk [³²P]-vel jelölt 2,5A szintetáz cDNS-sel. Az 1-5. sávok a transzgenikus dohány vonalai és a 6. sáv a patkány 2,5A szintetázgén.

3. ábra: A 2,5A trimerek (A) és tetramerek (B) μΜ-ja különbözőképpen foszforilált formáinak hatása a TMV RNS in vitro transzlációjára búzacsíra-kivonatban. A TMV RNS 0,8 pg-jának transzlációját végeztük in vitro, az 5 μΐ-nyi mintákból kapott [³² S]-vel jelölt fehérjéket üveggyapot szűrőkön kicsaptuk, és ezután mértük a beépült radioaktivitást: • - 2,5A nélkül, O-pppA_n, - ppA_n, □ -pA_n, δ - Ah, ▲ - RNS nélkül.

4. ábra: Különböző 2, 5A trimerek hatása a TMV

RNS degradációjának arányára búzacsírakivonatban. A TMV RNS-t izoláltuk az 1 μΜ 2,5A trimert tartalmazó búzacsíra-kivonat mintákból, Northern blot-analízisnek vetettük alá, és hibridizáltuk [³²p]-vel jelölt TMV cDNS-sel. Az RNS mennyiségét lézerdenzitométer autoradiográfjaiból becsültük meg: - 2,5A nélkül, O - pppA₃, ·- A₃.

5. ábra: 2,5A hozzákötése növényi sejtkivonatfehérjékhez. [³²P]-vel jelölt 2,5A-t kötöttünk kovalens keresztkötéssel a sejtkivonat fehérjéihez NaIO₄-oxidációs eljárással, és szeparáltuk 12%-os SDS-PAAG elektroforézissel. Az 1. sáv nyúlretikulocita-lizátum, az alábbi irodalom szerint elkészítve [Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], a 2. sáv egér Lsejt-kivonat jelöletlen 2,5A-val, a 3. sáv egér L-sejt-kivonat, a 4. nyúlretikulocitalizátum Amersham szerint, az 5. burgonyalevél-kivonat és a 6. sáv burgonyalevélkivonat jelöletlen 2,5 A-val.

6. ábra: A 2,5A trimer „core” hatása a fehérjeszintézisre dohányprotoplasztokban. A [¹⁴C]-gyel

HU 218 356 Β jelölt fehérjehidrolizátumot a dohányprotoplaszt-kultúrához adtuk, és mértük a sejtek teljes radioaktivitását: · - 2,5A nélkül, Ο - 1 μΜ A₃.

7. ábra: PVX szaporodása 2,5A szintetázgént tartalmazó transzgenikus dohánynövényekben. Ép növényeket fertőztünk 10 pg/ml PVXszel, és a levélmintákat TRFIA-val, 21XD2 antitestek és 21XD2 európiumkonjugátumok felhasználásával analizáltuk. A vírus-koncentrációt Eu fluoreszcenciával, másodpercenkénti számlálással határoztuk meg: · - SRI kontroll, Ο - 4N1, □ -4N5, + -4N11, * -4N12.

8. ábra: PVS szaporodása 2,5A szintetázgént tartalmazó transzgenikus dohánynövényekben. Ép növényeket fertőztünk 10 pg/ml PVSsel, és a levélmintákat ELISA-val, S4A4 antitestek és S4A4 torma-peroxidáz-konjugátumok felhasználásával analizáltuk. A víruskoncentrációt színreakcióval, 450 nm-en optikaidenzitás-méréssel határoztuk meg: O - SRI kontroll, □ - a 2,5A szintetázgént „szensz” irányban tartalmazó transzgenikus növények, - ELISA háttér.

9. ábra: PVX szaporodása 2,5A szintetázgént tartalmazó transzgenikus növények levéllemezeiben. A leveleket 10 pg/ml PVX-szel fertőztük, 8 mm átmérőjű lemezeket vágtunk ki belőlük, és steril vízben tartottuk. A lemezeket ugyanúgy analizáltuk, mint a PVX-szel fertőzött ép növényeket (lásd 7. ábra): O SRI kontroll, - 4N10, + - 4N12.

10. ábra: Vírus-koncentráció (PVX) szabadföldön termesztett, 2,5A szintetázgént tartalmazó transzgenikus burgonyában. Az ép növényeket PVX-szel fertőzött dohánynövényekből gyűjtött növényi nedvekkel fertőztük. A levélmintákat ELISA-val, PVX kimutatására szolgáló immundiagnosztikai kit (Boehringer Mannheim) felhasználásával analizáltuk. A víruskoncentrációt színreakcióval, 405 nm-en mért optikaidenzitás-méréssel határoztuk meg. Contr.=kontrollklón; R101, R102, R104, R106, RÍ 07 és R2=transzgenikus kiónok.

A következő példák a találmány szemléltetésére szolgálnak.

Az alkalmazott molekuláris biológiai módszerek további magyarázata megtalálható Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” c. könyvében (lásd fentebb).

1. példa

A) A pHTT2-5A⁺ plazmidot tartalmazó 2,5A gén összeállítása

Patkány 2,5A szintetáz cDNS-t izoláltunk a patkányhippocampus cDNS-könyvtárból a kgtlO vektorba, Amersham előírása szerint próbaként egér 2,5A szintetáz cDNS-t alkalmazva. A cDNS-t szubklónoztuk a pBluescript SK+ (Stratagén) expressziós vektor EcoRI helyére. A kapott plazmidot pSK2-5A-nak neveztük el.

A dohánynövények transzformációjához patkány 2,5A szintetáz cDNS-t szubklónoztunk a pHTT202 növényi expressziós vektorba. A pSK2-5A plazmidból EcoRI-gyel kivágtuk a cDNS-t, a ragadós végeket feltöltöttük, és a cDNS-t szintetikus BamHI linkerek felhasználásával a BamHI-gyel linearizált pHTT202 vektorba klónoztuk (1. ábra). A kapott pHTT2-5A⁺ plazmidot használtuk fel Agrobacterium sejtek transzformálására.

B) Agrobacterium transzformálása pHTT2-5A⁺ plazmiddal

A pHTT202 plazmid nagymértékben a pBR322 plazmid szekvenciáján alapul. pBR322-alapú klónozóvektorok normális esetben nem mobilizálódnak a gazdasejtből egy másik baktériumba, de tartalmazzák a „mobilizáció bázisát”, a bőm helyet. Amennyiben „helper” (segítő) fünkciójú, mob gének által kódolt helper plazmidok állnak rendelkezésre, a pBR322-alapú klónozóvektorok is mobilizálódnak. Erre a célra a Van Haute és munkatársai által leírt rendszeren [EMBO J. 2, 411-417 (1983)] alapuló kétszülős párosítást alkalmazzuk.

pHTT2-5A⁺ plazmidot (amp^R, spc/str^R) tartalmazó E. colit párosítottunk L-lemezen GJ23 jelű E. coli helper törzzsel, amely tartalmazza az Ia-típusú R64drdll (tet^R, str^R) plazmidot a nélkülözhetetlen tra funkciókhoz, és egy második pGJ28 (kan^R, neo^R) helper plazmidot, amely mob fünkciókat nyújt transban a pBR-alapú mob bom+ plazmidok transzmissziójának kiegészítésére.

A helper plazmiddal rendelkező sejteket ampicillint, tetraciklint és kanamicint tartalmazó L-lemezeken szelektáltuk. Ezeket a sejteket L-táptalajon együtt tenyésztettük olyan pGV2260 (riff, cb^R) Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacterium tumefaciens C58C1 törzzsel, amelynél a növényi sejtben tumorképzésért felelős géneket pBR322 szekvenciákkal cseréltük ki. A konjugált Agrobacterium sejteket rifampicint, szpektinomicint és sztreptomicint tartalmazó lemezeken válogattuk ki. Mivel a pBR322-alapú vektorok nem tudnak Agrobacteriumban replikálódni, csak olyan Agrobacterumok tudnak növekedni a szelektív lemezeken, amelyekben a pGV2260, pBR322-szekvenciája és a pHTT202 közötti rekombináció egy egységes molekula képződéséhez vezetett. Annak megerősítésére, hogy a rekombináns plazmidok T-DNS-e tartalmazza a 2,5A szintetázgént, a kapott Agrobacteriumok teljes DNS-ét izoláltuk [Dhaese et al., Nucl. Acids Rés. 7, 1837-1849 (1979)] és Southern blottal analizáltuk.

2. példa

Dohánynövények transzformációja 2,5A szintetázgénnel

Transzgenikus Nicotiana tabacum SRI növényeket kaptunk Agrobacterium közvetítette transzferrel [Zambryski; Annu. Rév. Génét. 22, 1-30 (1988)]. A módszer azon az elven alapul, hogy az Agrobacterium stabilan átviszi egy növényi genomba Ti-plazmidjának egy szegmensét a sérült növényi sejttel való

HU 218 356 Β érintkezés révén. A „T-DNS”-nek nevezett szegmenst tartósított határszekvenciái határozzák meg. A határszekvenciák közötti genetikai információ kicserélhető a T-DNS transzfer hatékonyságának befolyásolása nélkül.

Dohánynövények transzformációját a 2,5A szintetázgénnel Horsch és munkatársai szerint [Science 227, 1229-1231 (1985)] végeztük. MS/2 táptalajon [Murashige and Skoog, Phys. Plánt. 18, 473-497 (1962)] termesztett N. tabacum SRI növények leveleit steril körülmények között, 24 °C-on, 16 órás fotoperiódusokra megfordítva K3-400 mM szacharózos táptalajba helyeztük [Nagy and Maliga, Z. Pflanzenphysiol. 78, 453-455 (1976)], és 0,5-1 cm²-es darabokra vágtuk úgy, hogy minden élt levágtunk. Az egyesített T-DNS-t tartalmazó, M9 minimáltáptalajon tenyésztett Agrobacteriumot [Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (1989) lásd fentebb] a K3-400 mM szacharózos táptalajhoz adtuk, és az edényeket három napig ugyanolyan körülmények között tartottuk, mint a növények esetében. A levélkorongokat mostuk, és megfordítva átvittük szilárd LS táptalajra [Linsmaier and Skoog, Phys. Plánt 100-127 (1965)], amely az Agrobacteriumok elölésére Claforant, hajtások előidézésére a levélkorongokból (benzil-amino)-purint (BAP) és a transzformált sejtek szelektálására kanamicint tartalmazott, ugyanis a pHTT2-5A⁺ plazmidnak a pGV2260 T-DNS-ébe beépített szegmense szintén tartalmazta a nos-npt2 gént, amely a transzformált sejteknek kanamicinrezisztenciát ad. Miután a hajtások megjelentek, levágtuk, és meggyökereztettük azokat egy hasonló, BAP nélküli táptalajban. A teljesen meggyökerezett növényeket MS/2 táptalajon tartottuk a fentiekben leírt körülmények között.

Annak igazolására, hogy a növények igazi transzformáltak, a levélszövet teljes DNS- és RNS-készletét izoláltuk az alábbi irodalmakban közöltek szerint [Dellaporta et al., Plánt Mól. Bioi. Rep. 1,19—21 (1983) és Verwoerd et al., Nucl. Acids Rés. 17, 2362 (1989)] külön-külön. Southern és Northern blot-analízist végeztünk Amersham előírásai szerint [³²P]-vel jelölt 2,5A szintetáz cDNS-t használva mintaként (2. ábra).

3. példa

2,5A-fuggő RN-áz-aktivitás azonosítása

Különböző 2,5 oligoadenilát formák hatásának vizsgálatai dohány-mozaikvírus (TMV) in vitro transzlációjánál búzacsíra-kivonatban (WGE=wheat germ extráét) azt mutatták, hogy a 2,5A nem foszforilált tri- és tetramerjei hatékonyan tudják gátolni a TMV RNS transzlációját WGE-ben (3. ábra). A TMV RNS degradációjának mértékét analizáltuk in vitro transzláció folyamán 2,5A jelenlétében és anélkül, mintákat véve a transzlációs keverékből és izolálva az RNS-t Toots és munkatársainak leírása szerint [Mól. Bioi. (USSR) 22, 1473-1481 (1988)]. Agaróz/formamid gélen történt elektroforézis és Northern blot-analízis után a [32p]-vel jelölt szűrők autoradiográfjainak lézer-denzitométerrel történő letapogatásával megbecsültük a minták RNS-koncentrációját. 2,5A trimer „core” hozzáadása a TMV RNS gyors degradációjához vezetett, jóllehet a TMV RNS degradációs foka jóval alacsonyabb volt a kontrollkísérletekben trifoszforilezett 2,5A-val vagy anélkül (4. ábra). Végeredményben a 2,5A „core” gátló hatását in vitro transzlációra növényisejt-mentes kivonatban az RNS-szubsztrát gyors degradációja okozza.

A 2,5A-kötő fehérjék azonosítására növényi kivonatokban a 2,5A-t [³²P]pCp-hez ligáltuk [Knight et al., Methods in Enzymology 79, 216-227 (1981)]. A [³²P]-vel jelölt 2,5A-t kovalens keresztkötéssel kapcsoltuk a burgonya sejtkivonatának fehérjéihez NaIO₄oxidációs módszerrel [Wreschner et al., Eur. J. Biochem. 124, 261-268 (1982)]. A kötés specificitását egy kompetíciós vizsgálattal ellenőriztük, ahol a jelöletlen 2,5A-t feleslegben adtuk a reakciókeverékekhez. A reakciókeverékeket 12%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) választottuk el.

Egy 70 kD nagyságú fehérjét azonosítottunk a burgonyalevél kivonatában, amely specifikusan kötődött a megjelölt 2,5A-hoz (5. ábra). A kötés specificitását a kompetíciós vizsgálattal mutattuk ki, ahol a jelöletlen 2,5A teljesen kiszorította a [³²P] 2, 5A-t a burgonyakivonatban (5. ábra).

Mivel a WGE-ben történő in vitro transzláció 2,5A által kiváltott gátlását a TMV RNS gyors degradációja idézte elő, a növényi kivonatból származó 70kD 2,5Akötő fehérje egy 2,5A által aktivált növényi endoribonukleáz.

A 2,5A hatását a fehérjeszintézisre N. tabacum SRI protoplasztokban is megvizsgáltuk. A protoplasztokat Honkanen és munkatársai szerint [Honkanen et al., „Biotechnology in tropical crop improvement: Proceedings of the intemational biotechnology workshop” (1988)] steril körülmények között termesztett és K3-400 mM szacharózos táptalajban fenntartott növények leveleinek mezofilljéből nyertük. [¹⁴C]gyel jelölt aminosavhidrolizátum hozzáadása után mintákat vettünk a protoplasztkeverékből a de novo szintetizálódott fehérjék koncentrációjának meghatározása céljából. A fehérjéket kicsaptuk triklór-ecetsavval és a beépült radioaktivitást mértük. A 2,5A hatékonyan gátolta a fehérjeszintézist dohányprotoplasztokban (6. ábra), amely újra jelzi a 2,5A működését, mint fehérjeszintézis-inhibitor növényi rendszerekben in vivő.

Miután azonosítottuk a 2,5A-fuggő RN-áz-aktivitást burgonyában és dohányban, levonhatjuk a következtetést, hogy a növényekben létezik egy metabolikus út - részben hasonló az IFN kiváltotta metabolikus úthoz emlősökben -, amely vírusrezisztenciát okoz.

4. példa

X és S burgonya-vírusok és dohány-mozaikvírus szaporodása 2,5A transzgenikus növényekben Különböző vírusok szaporodásának vizsgálatára

2,5A szintetázt kifejező transzgén növényekben, különféle fertőzési kísérleteket végeztünk. MS/2 táptalajon termesztett növényeket két héttel a fertőzést megelő5

HU 218 356 Β zően talajra vittünk át. A fertőzés előtt 2-3 alsó levelet karborundummal kezeltünk, 10 μ g/ml vírust manuálisan oltottunk a levelek felületére, és a karborundumot 30 perc elteltével steril vízzel lemostuk. A növényeket 16 órás fotoperiódus időn tartottuk egy hónapig. Mintákat gyűjtöttünk oly módon, hogy minden ötödik napon levettük a kis felső levelek egyikét, és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk.

A levélmintákat 1 ml immunoassay puffer/g levél anyag hozzáadásával mozsárban homogenizáltuk. Az X burgonyavírus (PVX) kimutatására 21XD2 monoklonális antitesteket és TRFIA (time-resolved fluoroimmunoassay) technikát alkalmaztunk az alábbi szerzők szerint [Sober et al., J. Gén. Virol. 69, 1799-1807 (1988) és Sinijarv et al., J. Gén. Virol. 69, 991-998 (1988)] külön-külön. A PVS koncentrációt DAS-ELISA-módszerrel, S4A4 monoklonális antitestek felhasználásával mértük [Sinijarv et al. (1988) (lásd fent)].

Egy hónappal a 10 pg/ml PVX-szel történő fertőzés után minden transzgenikus növény tartalmazott kimutatható mennyiségű PVX-et, de a vírusoncentráció jóval alacsonyabb volt, mint a kontrollnövényekben (7. ábra). Továbbá ezekben a növényekben a kimutatható PVX-szaporodás 1-2 héttel később kezdődött, mint a kontrollnövényekben.

Egy hónappal a 10 pg/ml PVS-sel történő fertőzés után minden transzgenikus dohányvonal teljes rezisztenciát mutatott a PVS-fertőzéssel szemben, és alig tartalmazott kimutatható mennyiségű PVS-t (8. ábra).

Levélkorongokat is fertőztünk PVX-szel, majd ráadásul TMV-vel. A transzgén dohány leveleit ugyanúgy fertőztük, ahogyan azt fentebb leírtuk. 8 mm átmérőjű korongokat lyukasztottunk ki a levelekből, és megfordítva steril vízben tartottuk 24 °C-on, 16 órás fotoperiódus mellett 5 napra. A korongokat lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és homogenizáltuk. A fertőzés 10 pg/ml PVX-szel az ép növényekhez hasonló eredményeket adott. Néhány transzgenikus dohányvonal levélkorongjai kevesebb vírust tartalmaztak, és a burgonyavírus kimutatható szaporodása jóval korábban kezdődött, mint az ép növényekben. A TMV koncentrációja a levélkorongokban öt nappal a fertőzést követően a vírusszaporodás egyértelmű gátlását mutatta a kontrollnövényekhez viszonyítva.

5. példa:

2,5 oligoadenilátok kimutatása transzgén növényekben

A 2,5A koncentrációjának kimutatására 2,5A szintetázt kifejező transzgenikus dohány SRI növényekben, vírussal fertőzött és nem fertőzött növények levélkivonatait készítettük el. A levél-kivonatokból származó jelöletlen 2,5A és a 2,5A[³²P]pCp kompetíciós vizsgálatát végeztük el. Egér L-sejt-kivonatot használtunk 2,5A-kötő endoribonukleáz L (RN-áz L) forrásként. Ajelölt 2,5A, az L-sejt-kivonat és a levélkivonat keverékét 90 percig jégen inkubáltuk. A fehérjéket nitrocellulóz szűrőn kicsaptuk a keverékből, és a szűrők és szűrletek radioaktivitását számláltuk. A növényi kivonat nélküli keverék szolgált pozitív kontrollként, és azt a keveréket, amelyben 10-⁷ M jelöletlen 2,5A trimer teljesen kiszorította a jelölt 2,5A-t, használtuk negatív kontrollként.

Az eredmények azt mutatják, hogy a 2,5A szintetázt kifejező, nem fertőzött transzgenikus növények kevés kimutatható 2,5 A mennyiséget tartalmaznak (ha tartalmaznak egyáltalán), hasonlóan az ilyen kontrollnövényekhez és a 2,5A szintetázgént antiszensz orientációban hordozó transzgén növényekhez (1. táblázat). Ennek az az oka, hogy a 2,5A szintetáz inaktív enzimként fejeződik ki, amelyet a dsRNS tud aktiválni. Ha 2,5A szintetázt kifejező transzgenikus növényeket PVX-szel fertőztünk, a 2,5A kimutathatóvá vált, és intracelluláris koncentrációja még a kontroll keveréknél is magasabb volt. A 2,5A-nak ilyen növekedését nem mutattuk ki SRI kontrollnövényekben. A 2,5A növekedése transzgenikus növényekben a PVX-, PVS- és TMV-szaporodásának gátlását eredményezi.

1. táblázat

Kompetitív radio-assay 2,5 oligoadenilátok koncentrációjának meghatározására 2,5A szintetázt kifejező transzgén növényekben PVX-szel történő fertőzés előtt és után

Növények	A szűrlet normalizált %-a (100%-nak vettük a pozitív kontrollt növényi anyag nélkül)
Kontroll SRI	29,2
Transzgén 2,5A, antiszensz szerkezet	65,5
Transzgén 2,5A, szensz szerkezet	47,2
Kontroll Sri χ PVX	54,6
Transzgén 2,5A+ xPVX	191,7
Növényi kivonat nélkül	100,0

Következtetésként, a PVX RNS dupla szálú replikálódó intermedieijei képesek aktiválni az inaktív 2,5A szintetázt, amely az intracelluláris 2,5A szintézist eredményezi.

6. példa

PVX-fertőzés kimutatása transzgenikus burgonya növényekben

Szabadföldi vizsgálat

2,5A szintetázgént tartalmazó ép burgonyanövényeket fertőztünk PVX-szel fertőzött dohánynövényekből gyűjtött nedvekkel, és szabad földön termesztettük azokat.

Levélmintákat analizáltunk öt héttel a fertőzés után ELISA-val, egy PVX kimutatására szolgáló immundiagnosztikai kit (Boehringer Mannheim) felhasználásával. A víruskoncentrációt színreakcióval, 405 nm-en mért optikaidenzitás-méréssel határoztuk meg (10. ábra).

A 2,5A szintetázgént tartalmazó növények PVXkoncentrációja drasztikusan csökkent a kontrollnövényekhez viszonyítva.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgenikus növény előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező, egy virális RNS degradációját okozó endonukleáz aktiválására képes polipeptidet kódoló, génsebészetileg kialakított DNS-szekvenciát viszünk be egy megfelelő növény genetikai anyagába.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy génsebészetileg átalakított heterológ DNSszekvenciát viszünk be.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy kiméra DNS-szekvenciát viszünk be.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy emlősgénből, növényi génből vagy mikroorganizmusgénből származó, vagy szintetikus génként kialakított DNS-szekvenciát viszünk be.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy patkány 2,5A szintetázt kódoló génből származó DNS-szekvenciát viszünk be.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát egy olyan vektorral visszük be, amely vektor a DNS-szekvenciát egy, a szekvenciának a transzgenikus növényben való kifejeződését biztosító promoter kontrollja alatt tartalmazza.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát egy, a DNS-szekvenciát egy induktív vagy konstitutív promoter kontrollja alatt tartalmazó vektorral visszük be.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát a pHTT2-5A⁺ (DSM 6815) vektorral visszük be.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát az Agrobacterium-vendszei alkalmazásával végzett transzfekcióval visszük be.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát dohányba, rizsbe, búzába, árpába, kukoricába, paradicsomba, uborkába, szójába, batátába, szőlőbe, repcébe, cukorrépába, gyapotba, teába, napraforgóba, szamócába, krizantémba, édes paprikába vagy burgonyába visszük be.
11. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazása legalább egy, 2,5A szintetázaktivitással rendelkező, egy virális RNS degradációját okozó endonukleáz aktiválására képes polipeptidet kódoló, génsebészetileg kialakított DNS-szekvenciát tartalmazó transzgenikus szaporítóanyag előállítására.