PL171446B1 - Sposób wytwarzania rosliny transgenicznej PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania rosliny transgenicznej wykazujacej odpornosc na wiele wirusów, zawierajaca wytworzona technika inzynierii genetycznej sekwencje DNA, kodujaca polipeptyd posiadajacy zdolnosc aktywowania endonukleazy, znamienny tym, ze do materialu genetycznego odpowiedniej rosliny wprowadza sie sekwencje DNA kodujaca co najmniej jeden polipeptyd wykazujacy aktywnosc syntetazy 2,5A, który to polipeptyd posiada zdolnosc aktywowania endonukleazy wywolujacej roz- pad wirusowego RNA. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej wykazującej odporność na wiele wirusów, zawierającej wytworzoną techniką inżynierii genetycznej sekwencję DNA, kodującą polipeptyd posiadający zdolność aktywowania endonukleazy.

Znanych jest wiele sposobów konstruowania roślin wykazujących odporność na wirusy. Opisany jest sposób wprowadzania cechy odporności na wiele wirusów roślinnych technikami inżynierii genetycznej na drodze ekspresji białka powłoczki odpowiedniego wirusa w transgenicznych roślinach (Beachy i wsp., Ann. Rev. Phytopathol. 28, 451-474, 1990).

Znaczącą odporność na szereg wirusów roślinnych uzyskano również w wyniku ekspresji w transgenicznych roślinach specyficznego wirusowego RNA antysensownego (Cuozzo i wsp., Bio/Technology 6, 549-557, 1988 oraz Hemenway i wsp., EMBO J., 7, 1273-1280, 1988). Wirusowy anty sensowny RNA wykazuje swe funkcje albo przez hydrydyzację ze specyficznymi wirusowymi sekwencjami RNA lub DNA, blokując w ten sposób dalsze reakcje ważne dla namnażania się wirusa bądź na drodze wpływu na aktywność rybozymu, co powoduje specyficzne rozszczepienie wirusowego RNA w wyniku hybrydyzacji z tym wirusowym RNA.

Główną niedogodnością powyższych sposobów konstruowania odpornych na wirusy transgenicznych roślin jest to, że takie transgeniczne rośliny są odporne na tylko jednego wirusa albo na określoną grupę wirusów.

Szlak 2,5A-oligoadenylanu jest indukowaną przez interferony częścią układu odpowiedzi antywirusowej w komórkach ssaków (Lengyel, Ann Rev. Biochem. 51, 251-282, 1982). W organizmach innych niż ssaki, między innymi w organizmach ptaków, gadów i płazów, owadów, drożdży a nawet bakterii wykryto przynajmniej niektóre części składowe szlaku 2,5A-oligoadenylanu (Stark i wsp., Nature 278. 471-473, 1979; Cayley i wsp , Biochem. Biophys. Res. Comm. 108. 1243-1250, 1982 i Laurence i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 2322-2326, 1984).

Roślinny czynnik antywirusowy (AVF), którego wytwarzanie jest stymulowane przez infekcję wirusową został częściowo oczyszczony a gen dla tego czynnika okazał się homologiczny z ludzkim β-interferonem (Sela i wsp., w broszurze' Plant resistance to viruses: Ciba Symposium, nr 133 (1987), 109-119). Sela wykazał, że działanie ludzkim interferonem na protoplasty tytoniu zakażone wirusem mozaiki tytoniowej (TMV) prowadzi do zahamowania replikacji wirusa TMV (Methods in Enzymology, 1 19. 744-752, 1986). Devash i wsp. wykazali ponadto, że 2,5A-oligoadenylan może hamować replikację wirusa TMV w roślinach tytoniu (Devash i wsp., J. Biol. Chem 259. 3482-2486, 1984) Sela (1987, jak wyżej) wykrył również sekwencje DNA homologiczne z sekwencjami dla ludzkiej syntetazy 2.5A w genomowym DNA tytoniu.

Jednakże nie ukazały się dotychczas doniesienia o występowaniu w roślinach RNA-zy zależnej od 2,5A-oligoadenylanu, biorącej udział w szlaku 2,5a oligoadenylanu u ssaków Doprowadziło to do wniosku, że 2,5A nie hamuje infekcji wirusowych w roślinach na drodze, w której bierze udział zależna od 2,5A endonukleaza (Devash i wsp , Biochemistry 24, 593-599, 1985).

Ukazało się poza tym doniesienie, że interferon wytwarzany w organizmach transgenicznych roślin nie hamuje namnażania się wirusa (De Zoeten i wsp. Virology, 172. 213-222, 1989).

Reasumując, dotychczasowa wiedza nie pozwala na wyciągnięcie wniosku, ze szlak 2,5A-oligoadenylanu może być użyty jako podstawa do konstruowania transgenicznych roślin wykazujących odporność na wiele wirusów.

Tak więc, wynalazek rozwiązuje problem techniczny, jakim jest wytworzenie transgenicznych roślin wykazujących odporność na wiele wirusów z wykorzystaniem szlaku 2,5A-oligoadenylanu Rozwiązanie tego problemu stało się możliwe dzięki wprowadzeniu rozwiązań podanych w zastrzeżeniach.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej wykazującej odporność na wiele wirusów, zawierającej wytworzoną techniką inżynierii genetycznej sekwencję DNA kodującą co najmniej jeden polipeptyd posiadający aktywność syntetazy 2,5A, który to polipeptyd powstający w wyniku ekspresji powyższej sekwencji, posiada zdolność aktywowania endonukleazy powodującej rozpad wirusowego RNA, przez wprowadzenie tej sekwencji DNA do materiału genetycznego odpowiedniej rośliny.

Termin odporność na wiele wirusów odnosi się do transgenicznych roślin, które wykazują znaczącą odporność na wiele różnych grup wirusów, takich jak potex-, carla- i tobamowirusy.

Termin: wytworzona techniką inżynierii genetycznej sekwencja DNA określa sekwencję DNA, która była poddana manipulacjom metodami inżynierii genetycznej, takimi jak techniki rekombinacji DNA.

Termin: polipeptyd posiadający aktywność syntetazy 2,5A oznacza polipeptyd, który ma właściwości enzymatycznego syntetyzowania 5'-defosforylowanych lub fosforylowanych 2,5-oligonukleotydów z trzema lub większą ilością reszt adenozyny, takich jak oligonukleotyd 2,5A3 będący trimerem adenylanu połączonym wiązaniami 2',5'-fosfodiestrowymi, defosforylowanym na końcu 5'.

Termin: endonukleaza powodująca rozpad wirusowego RNA odnosi się do endonukleazy heterologicznej lub homologicznej, posiadającej zdolność degradacji wiruso4 wego RNA na drodze rozszczepienia enzymatycznego. Ta endonukleaza jest aktywowana przez 2,5A, który z kolei jest syntetyzowany przez polipeptyd posiadający aktywność syntetaz·»» 2 5 A o li go a d e n y rl a mi oj ni.wa.Zyj j iunu.

W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, powyższa sekwencja DNA jest heterologiczna wobec transgenicznej rośliny. W innym korzystnym rozwiązaniu sekwencja DNA może być sekwencją chimerową.

Sekwencja DNA kodująca wspomniany polipeptyd pochodzi z genu ssaków, genu roślinnego albo genu z mikroorganizmu lub tez jest genem syntetycznym. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, jako sekwencję DNa kodującą wspomniany polipeptyd stosuje się gen syntetazy 2,5A szczura (fig. 1).

Sekwencję DNA korzystnie wprowadza się zawartą w wektorze pod kontrolą promotora umożliwiającego jego ekspresję w transgenicznej roślinie. Najbardziej korzystnie pod kontrolą promotora indukowanego lub konstytucyjnego.

Przykładami takich promotorów są: promotor 35S wirusa mozaiki kalafiorowej, promotor aktyny ryżu, promotor rbc S z różnych gatunków, promotor TR 2 z Agrobacter, promotor genu faseoliny lub promotor NOS lub przykładowo pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki tytoniowej. Korzystnie sekwencję DNA wprowadza się, gdy zawartajest w wektorze PHTT2-5 A (DSM nr 6815). Transgeniczną rośliną, do której wprowadza się sekwencję DNA jest w korzystnym wykonaniu wynalazku tytoń, ryz, pszenica, jęczmień, kukurydza, pomidory, ogórki, soja, bataty, winogrona, rzepa, burak cukrowy, bawełna, herbata, słonecznik, truskawka, róża, chryzantemy, słodka papryka lub ziemniaki.

Z uzyskanych sposobem według wynalazku transgenicznych roślin można uzyskać materiał do rozmnażania pochodzący z rośliny transgenicznej wykazującej odporność na wiele wirusów.

Termin: materiał do rozmnażania określa całe rośliny albo zróżnicowane lub niezróżnicowane tkanki roślinne, takie jak korzenie, łodygi, liście, kallus, protoplasty, zawiesiny hodowli lub nasiona.

Termin: materiał genetyczny oznacza genom jądra komórki roślinnej, genom organelli komórki roślinnej lub formę pozachromosomalną.

Termin: wprowadzenie odnosi się do sposobu, za pomocą którego jest możliwe wprowadzenie wytworzonej techniką inżynierii genetycznej sekwencji DNA do materiału genetycznego komórki roślinnej. Korzystnymi przykładami takiego, sposobu są: przeniesienie za pomocą Agrobacterium, przeniesienie za pomocą wirusa roślinnego, mikrowstrzyknięcie, bombardowanie mikropociskami, elektroporacja, transformacja za pomocą polietylenoglikolu oraz transformacja protoplastów roślinnych trwałymi wektorami opartymi na wirusach. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku wspomnianą sekwencję DNA zawiera się w wektorze pod kontrolą promotora umożliwiającego jej ekspresję w transgenicznej roślinie. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu wynalazku jako wektor stosuje się pHTT2-5A+, który został zdeponowany zgodnie z Układem Budapeszteńskim w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 6815.

W dalszym korzystnym rozwiązaniu wynalazku, tę procedurę wprowadzenia prowadzi się na drodze transfekcji w układzie Agrobacterium.

Figura 1 przedstawia konstruowanie plazmidu pHTT2-5A+. Z plazmidu pSK2-5A+ wycina się fragment EcoRI zawierający cDNA genu syntetazy 2,5A szczura, wypełnia się lepkie końce i uzyskany fragment poddaje się ligacji z miejscem BamHI wektora pHTT202 stosując łączniki BamHI. Uzyskuje się wektor pHTT2-5A+ zawierający gen syntetazy 2,5A-oligoadenylanu szczura pod kontrolą promotora CaMV 35S.

Figura 2 przedstawia analizę Northęrn'a całkowitego RNA z transgenicznych roślin tytoniu transformowanych genem syntetazy 2.5A. Próbki po.10 μg całkowitego RNA na pasmo analizowano wobec sond znakowanego gPj-cDNA syntetazy 2.5A. Pasma 1 do 5 są pasmami dla transgenicznych roślin tytoniu a pasmo 6 jest pasmem cDNA syntetazy 2.5A szczura.

Figura 3 przedstawia wpływ trimerów (A) i tetramerów (B) 2.5A-oligoadenylanu w formach o różnym stopniu fosforylacji, zastosowanych w stężeniu 1 μM, na translację RNA wirusa TMV in vitro w ekstrakcie kiełków pszenicznych. Prowadzono translację ilości 0.8 pg RNA wirusa in vitro, znakowane [³⁵S]-białka otrzymane z próbek po 5 μΐ strącano na filtrach z włókna szklanego i następnie wykonywano pomiary wbudowanej radioaktywności. - © - bez ____3____ __- A /Jl-C__.C----\ iunuoiundii - , !- pAn nniOuofosnoian),

z.5A-uligoadcnyidnu,O - pppA_n (trójfosforan),

Δ-AnA- bez RNA.

Figura 4 przedstawia wpływ różnych trimerów 2.5A-fllgfadenylanu na szybkość degradacji RNA wirusa TMV w ekstrakcie kiełków pszenicznych. RNA wirusa TMV izolowano z próbek ekstraktu kiełków pszenicy zawierających po 1 μΜ trimerów 2.5A-oligoadenylanu i następnie wykonywano przeniesienie punktowe typu Northern i hybrydyzowano ze znakowanym [³²P]-cDNA wirusa TMV. ilość RNA oznaczano przy użyciu autoradiografów z użyciem densytometru laserowego: □- bez 2.5A-oligfadenyłanu,0 - trójfosforan 2.5A-ollgfadenylanu (pppA 3),®- 2.5A-oligfadenylan (A3).

Figura 5 przedstawia wiązanie 2.5A-oligoadenylanu z białkami ekstraktu z komórek roślinnych. Znaczony [3²P]-2.5A-fllgoadenylan sieciowano kowalencyjnie z białkami ekstraktów komórkowych metodą utleniania za pomocą NaJOą i rozdzielano metodą elektroforezy na 12% SDS-PAGE. Pasmo 1 pochodzi z lizatu retikulocytów królika (przygotowanych według przepisu podanego w podręczniku Sambrook’a i wsp.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), pasmo 2 należy do ekstraktu komórek L myszy z nieznakowanym 2.5A-oligoadenylanem, pasmo 3 oznacza sam ekstrakt komórek L myszy, pasmo 4 należy do lizatu retikulocytów królika (Amersham), pasmo 5 pochodzi z ekstraktu liści ziemniaka a pasmo 6 należy do ekstraktu liści ziemniaka z nieznakowanym 2.5A-fligoadenylanem.

Figura 6 obrazuje wpływ rdzenia trimeru 2.5A-oligoadenylanu na syntezę białka w protoplastach tytoniu. Znakowany [ '^-hydrolizat białkowy dodaje się do hodowli protoplastów tytoniu 1 oznacza się całkowitą radioaktywność komórek. Znak·- oznacza próbę bez 2.5A-oligoadenylanu, znakO- oznacza próbę z dodatkiem 1 μM A3.

Figura 7 przedstawia namnażanie się wirusa PVX w transgo-nic/nych roślinach tytoniu zawierających gen syntetazy 2,5A. Całe rośliny zakażono stężeniem 10 μg/ml PVX i próbki liści analizowano techniką TRFIA stosując przeciwciała 21XD2 i koniugat 21XD2 z europem. Stężenie wirusa oznaczano przez pomiar ilości Oluflescencji Eu na sekundę.

znak® o oz.nacza oGumęę SRł, znakO o oznazza 4Ni, znak D- oznacza 4N5, znak + - oznaiza 4N11, znak * - oznacza 4N12.

Figura 8 przedstawia namnażanie się wirusa PVS w trazsgezlcnnych roślinach tytoniu zawierających gen syntetazy 2,5A. Całe rośliny zakażano stężeniem 10 μg/ml PVS i próbki liści analizowano techniką ELISA stosując przeciwciała S4A4 i koniugat S4A4 z peroksydazą chrzanu. Stężenie wirusa fnzacnano przez pomiar gęstości optycznej reakcji barwnej przy 450 nm, znako- oznacza kontrolę SR1, znakk- oznacza rośliny transgenicnne z genem syntetazy 2,5A w orientacji sensownej, znak - - oznncnα tło w próbie ELISA.

Figura 9 przedstawia namnażanie się wirusa PVX w krążkach liści trαzsgenlcnzych roślin tytoniu zawierających gen syntetazy 2,5A. Liście zakażano stężeniem 10 μg/ml PVX, wycinano krążki o średnicy 8 mm i utrzymywano w sterylnej wodzie. Krążki te analizowano tak jak całe rośliny zakażone wirusem PVX (fig. 7). Zn aa®- oznacza kontrolę SR1, znakO- oznacza 4N10, znak a - oznacza 4N12.

Figura 10 przedstawia stężenie wirusa (PVX) w hodowanych na polu transgezlcnzych roślinach ziemniaka zawierających gen syntetazy 2,5A. Całe rośliny zakażano sokiem zebranym z zakażonych wirusem PVX roślin tytoniu. Następnie próbki liści analizowano techniką ELISA w zestawie immuzodiagnfstycnnym do onzacnαzlα wirusa PVX firmy Boehringer Mannheim Stężenie wirusa fzzacnnzo przez pomiar gęstości optycznej w reakcji barwnej przy 405 nm. Skrót Contr, oznacza klony kontrolne, EW1, R102, R104, R106, R107; R2 fnzaczα klony trazsgeziczze.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami. Szczegółowe opisy zastosowanych metod z zakresu biologii molekularnej znajdują się w podręczniku Sambrook^ i wsp.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, jak wyżej.

Przykład 1

A. Konstruowanie plazmidu pHTT2-5A± zawierającego gen syntetazy 2,5A.

A O e^nziu· o ^λΙπια cia <7 Konbn ηΤ^ΧΤ Δ hm nlzamna C7r7nra iu wAlrtrwzp

VLAl Oy INWMJ ¹ i o^oui « au«ujv uun^u ^xzx χ ηψνλΜ^/«-* νχχ n »’ rxw^x e-i^

Żgt10 według protokołu Amershama stosując cDNA mysiej syntetazy 2,5A jako sondę. cDNA klonuje się do miejsca EcoRI w wektorze ekspresyjnym pBluescript SK+ (Stratagene). Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pSK2-5A.

Do celów transformacji w roślinach tytoniu klonuje się cDNA syntetazy 2,5A szczura do roślinnego wektora ekspresyjnego pHTT202. cDNA wycina się z pSK2-5A enzymem EcoRI, wypełnia się lepkie końce i klonuje się ten cDNA do doprowadzonego do postaci liniowej enzymem BamHI plazmidu pHTT202 stosując syntetyczne łączniki BamHI (fig. 1). Otrzymany plazmid pHTT2-5A⁺ stosuje się do transformacji komórek ngrobacterium.

B. Transformowanie Agrobacterium plazmidem pHTT2-5AE

Plazmid pHTT202 jest w dużej części oparty na sekwencji plazmidu pBR322. Wektory klonujące oparte na pBR322 w zasadzie nie wędrują z komórki gospodarza do innej bakterii ale zawierają one podstawę do mobilizacji, miejsce bom. Jeśli wprowadzi się funkcje pomocnicze (helperowe) kodowane przez geny mob z plazmidów helperowych, wówczas oparte na pBR322 wektory klonujące również ulegają mobilizacji. Do tego celu stosuje się kojarzenie dwurodzicielskie oparte na układzie opisanym przez Van Haute’go i wsp. (EMBO J. 2, 411-417, 1983).

Bakterie E. coli zawierające plazmid pHTT2-5A+ (ampR spc/str^R) kojarzy się na płytkach z pożywką L z pomocniczym szczepem E. coli, GJ23, który jest nośnikiem plazmidu typu la, R64drd11 (tet^R,,str^R) posiadającego potrzebne funkcje tra oraz drugiego plazmidu pomocniczego, pGJ28 (kanR, neo^!<) posiadającego funkcje mob in trans uzupełniające transmisję opartych na pBR plazmidów mob bom.

Komórki z plazmidami pomocniczymi selekcjonuje się na płytkach z pożywką L zawierającą ampicylinę, tetracyklinę i kanamycynę. Komórki te hoduje się na pożywce wspólnie z ngrobacterium tumefaciens, szczepem C58C1 zawierającym Ti-plazmid pGV2260 (rifR, cbR), w którym geny odpowiedzialne za onkogenezę w komórce roślinnej zostały zastąpione sekwencjami pBR322. Skomugowane komórki ngrobacterium selekcjonuje się na płytkach zawierających rifampicynę, spektynomycynę i streptomycynę. Ponieważ wektory oparte napBR322 nie mogą podlegać replikacji w ngrobacterium, na płytkach z pożywką selekcyjną mogą rosnąć tylko te komórki ngrobacterium, w których rekombinacja między sekwencją pBR322 w plazmidach pGV2260 i pHTT202 doprowadziła do powstania połączonej, jednolitej cząsteczki. Dla potwierdzenia, że T-DNA rekombinantowych plazmidów zawiera gen syntetazy 2,5A, wyizolowano i analizowano metodą przeniesienia Southerna całkowity DNA powstałych komórek ngrobacterium (Dhaese i wsp., Nuci. Acids Res. 7, 1837-1849, 1979).

Przykład 2

Transformacja roślin tytoniu genem syntetazy 2,5A

Transgeniczne rośliny Nicotiana tabacum SR1 otrzymuje się przez przeniesienie techniką z użyciem ngrobacteriumCZambtyski, Ann. Rev. Genet., 22,1-30,1988). Metoda ta jest oparta na obserwacji, że ngrobacterium w trwały sposób przenosi segment swego plazmidu Ti do genomu roślinnego podczas kontaktu z uszkodzonymi komórkami rośliny. Segment ten, znany pod nazwą T-DNA określają jego konserwatywne sekwencje graniczne. Informację genetyczną zawartą pomiędzy sekwencjami granicznymi można wymienić bez wpływu na wydajność przeniesienia T-DNA.

Transformację roślin tytoniu genem syntetazy 2,5A prowadzi się sposobem opisanym przez Horsch’a i wsp. (Science. 227. 1229-1231, 1985). Liście z roślin Nicotiana tabacum SR1 hodowanych na podłożu MS/2 (Murashige i Skoog, Phys. Plant. 18, 473-497, 1962) w warunkach sterylnych w temperaturze 24°C przy 16 - godzinnym naświetlaniu dziennie umieszcza się wierzchem do dołu w pożywce sacharozowej K3-400 mM (Nagy i Maliga, Z. Pflanzenphysiol. 76. 453-455, 1976) i tnie się na kawałki o powierzchni 0.5 do 1 cm² tak, aby wszystkie krańce były cięte. Do płytek z pożywką sacharozową K3-400 mM dodaje się ngrobacterium ze zintegrowanym T-DNA hodowane na pożywce minimalnej M9 (Sambrook i wsp , Molecular cloning, A Laboratory Manual, 1989, jak wyżej) i płytki utrzymuje się przez 3 dni w tych samych warunkach co rośliny. Następnie, krążki liści przemywa się i przenosi, układając je wierzchem do dołu, do stałego podłoża LS (Linsmaier i Skoog, Phys. Plant. 100-127, 1965) z dodatkiem Claforanu w celu zabicia Agrobacterium, benzyloaminopuryny (BAP) dla pobudzenia wyrastania odrośli z krążków liści i kanamycyny pozwalającej na selekcję komórek transformowanych, ponieważ segment plazmidu pHTT2-5A+ zintegrowany w T-DNA plazmidu pGV2260 zawiera również gen nos-npt2 nadający transformowanym komórkom oporność na kanamycynę. Po wyrośnięciu odrośli, odcina się je i hoduje do stanu ukorzenienia na podobnej pożywce bez BAP. Całkowicie ukorzenione rośliny utrzymuje się na podłożu MS/2 w opisanych powyżej warunkach.

W celu potwierdzenia, że wyhodowane rośliny są prawdziwymi transformantami, z tkanki liści izoluje się całkowity DNA i RNA, stosując odpowiednio metody opisane przez Dellaporta' ę i wsp. (Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21, 1983) i Verwoerd’a (Nuci. Acids Res. 17, 2362, 1989). Próby hybrydyzacji Southem’a i Northern' a wykonuje się według protokołu Amersham stosując [³²P]-znakowany cDNA syntetazy 2,5A jako sondę (fig. 2).

Przykład 3 identyfikacja aktywności RNA-zy zależnej od 2.5A-oligoadenylanu.

Badania nad wpływem różnych form oligoadenylanu 2.5 na translację virusa mozaiki tytoniowej (TMV) in vitro w ekstrakcie kiełków pszenicy (WGE) wykazują, ze formy niefosforylowane, trój- i tetramery 2.5A-oligoadenylanu mogą skutecznie hamować translację RNA wirusa TMV w tych ekstraktach (fig. 3). Szybkości degradacji RNA wirusa TMV podczas translacji in vitro w obecności i w nieobecności 2.5A-oligoadenylanu analizowano pobierając próbki z mieszaniny translacyjnej i izolując RNA w sposób opisany przez Toots’a i wsp. (Mol. Biol. (ZSSR)22, 1473-1481, 1988). Po elektroforezie w żelu agarozowo-formamidowym i analizie typu Northern oznaczano stężenie RNA w próbkach przez odczyt autoradiografów z filtrów znaczonych p²P] stosując densytometr laserowy. Dodanie rdzenia” trimeru 2.5A-oligoadenylanu prowadziło do szybkiego rozkładu RNA wirusa TMV, podczas gdy szybkość rozkładu tego RNA w doświadczeniach kontrolnych, prowadzonych z dodatkiem lub bez dodatku trójfosforylowanego 2.5A-oligoadenylanu była znacznie nizsza (fig. 4). Reasumując, wpływ hamujący rdzenia 2.5A-oligoadenylanu na translację in vitro w ekstrakcie roślinnym bezkomórkowym wynika z szybkiego rozpadu substratu RNA.

W celu zidentyfikowania białek wiążących 2.5A-oligoadenylan w ekstraktach roślinnych, poddaje się ten 2.5A ligacji z [3²P]pCp w sposób opisany przez Knight’a i wsp. (Methods in Enzymology 79, 216-227, 1981). Znakowany [3²P]-2.5A sieciuje się z białkami ekstraktów komórek ziemniaka metodą utleniania NaJOą wedługWreschner’ai wsp. (Eur. J. Biochem. 124, 261-268, 1982). Swoistość wiązania określa się w próbie wypierania, gdzie nieznakowany 2.5A-oligoadenylan dodaje się w nadmiarze do mieszanin reakcyjnych. Mieszaniny te poddaje się następnie elektroforezie na 12% żelu SDS-poliakryloamidowym (SDS-PAGE).

W ekstraktach liści ziemniaka zidentyfikowano białko o wielkości 70 kD, które swoiście wiązało się ze znakowanym 2.5A-oligoadenylanem (fig. 5). Swoistość wiązania wskazano w próbie wypierania, gdzie nieznakowany 2.5 A całkowicie wypierał znakowany [3p]-2.5A-oligoadenylan z ekstraktów ziemniaka (fig. 5).

Ponieważ indukowane przez 2.5A-oligoadenyian hamowanie translacji in vitro w ekstraktach kiełków pszenicy było wynikiem szybkiego rozkładu RNA wirusa TMV, tym białkiem z ekstraktu roślinnego o wielkości 70 kD wiązącym 2.5A jest aktywowana przez 2.5A roślinna endorybonukleaza.

Badano również wpływ 2.5A-ohgoadenylanu na syntezę białka w protoplastach N. tabacum SR1. Protoplasty przygotowywano według procedury podanej przez Honkanen’a i wsp. w Biotechnology in tropical crop improvement: proceedings of the international biotechnology workshop (1988) z mezofili liści z roślin hodowanych w sterylnych warunkach i utrzymywanych na pożywce sacharozowej K3-400 mM. Po dodaniu znaczonego [^l4C]-hydrolizatu aminokwasowego, z mieszaniny protoplastów pobiera się próbki w celu oznaczenia stężenia nowo syntetyzowanych białek. Białka strąca się kwasem trójchlorooctowym i mierzy się wbudowaną radioaktywność. 2.5A-oligoadenylan skutecznie hamuje syntezę białka w protoplastach tytoniu (fig. 6), co również wskazuje na rolę 2.5A-oligoadenylanu jako inhibitora syntezy białka w» r· o ś lin n y c h in υιαίΓνα w UMauavn ivoiuinjvu m yivim.

W oparciu o identyfikację aktywności RNA-zy zależnej od 2.5A w ziemniakach i tytoniu można wysnuć wniosek, że w organizmach roślinnych występuje szlak metaboliczny częściowo przypominający indukowany interferonem szlak metaboliczny u ssaków, który nadaje roślinom odporność na wirusy.

Przykład4

Namnażanie wirusów ziemniaka X i S i wirusa mozaiki tytoniowej w transgenicznych roślinach 2.5A.

W celu zbadania namnażania się różnych wirusów w roślinach transgenicznych, w których zachodzi ekspresja syntetazy 2,5A, przeprowadzono szereg laboratoryjnych prób zakażania. Na dwa tygodnie przed infekcją rośliny rosnące na podłożu MS/2 przenoszono do gleby. Do celów zakażenia, 2 do 3 mniejszych liści traktowano węglikiem krzemu, następnie powierzchnie liści ręcznie zakażano ilością 10 gg/ml wirusa i po 30 minutach spłukiwano węglik krzemu sterylną wodą. Rośliny utrzymywano w warunkach 16 - godzinnego naświetlania w czasie jednego miesiąca. Próbki pobierano przez zebranie jednego z małych górnych liści w odstępach co pięć dni i zamrożenie w ciekłym azocie.

Próbki liści homogenizowano w moździerzu dodając 1 ml buforu do prób immunologicznych na gram liści. Do wykrywania wirusa ziemniaczanego X (PVX) zastosowano przeciwciała monoklonalne 21XD2 w technice immunofluorescencyjnej (time resolved fluoroimmunoassay; TRIFIA) opisanych odpowiednio przez Sober’a i wsp. (J. Gen. Virol. 69, 1799-1807, 1988) i Smijarv’a i wsp. (J. Gen. Virol. 69. 991-998, 1988). Stężenie wirusa PVS oznaczano metodą DAS-ELISA stosując przeciwciała monoklonalne S4A4 (Sinijarv i wsp., jak wyżej, 1988). Po miesiącu od zakażenia wirusem PVX (10 pg/ml) wszystkie transgeniczne rośliny zawierały wykrywalne poziomy PVX ale stężenie wirusa było znacznie niższe niż u roślin kontrolnych (fig. 7). Ponadto, w roślinach transgenicznych wykrywalne namnażanie się wirusa PVX rozpoczynało się o 1 - 2 tygodni później niż u roślin kontrolnych.

Po miesiącu od zakażenia wirusem PVS (10 gg/ml), wszystkie transgeniczne linie tytoniu wykazywały całkowitą odporność na zakażenie PVS i zawierały prawie niewykrywalne poziomy PVS (fig. 8).

Przeprowadzono również zakażenia krążków liści wirusem PVX i dodatkowo wirusem TMV. Liście transgenicznych roślin tytoniu zakażano w sposób opisany powyżej. Z liści wycinano krążki o średnicy 8 mm, umieszczano je wierzchem do dołu w sterylnej wodzie i utrzymywano w temperaturze 24°C w warunkach 16 - godzinnego naświetlania w czasie do 5 dni. Krążki te zamrażano w ciekłym azocie i homogenizowano. Zakażenie ilością 10 μg/ml wirusa PVX dało podobne wyniki jak u całych roślin. Krążki liści pochodzące od niektórych linii transgenicznych tytoniu zawierały mniej wirusa a wykrywalne namnażanie się wirusów ziemniaka rozpoczynało się znacznie wcześniej niż u całych roślin. Stężenie wirusa TMV w krążkach liści po 5 dniach od zakażenia wykazało wyraźne hamowanie namnażania się wirusa w porównaniu z roślinami kontrolnymi.

Przykład 5

Wykrywanie oligoadenylanów 2.5 w roślinach transgenicznych.

W celu oznaczenia stężenia 2.5 A-oligoadenylanu w transgenicznych roślinach tytoniu SR 1 wytwarzających syntetazę 2.5A, przygotowano ekstrakty liści z roślin zakażonych i niezakazonych wirusem. Przeprowadzono próbę wypierania nieznakowanego 2.5A z ekstraktów roślinnych za pomocą 2.5A[³²P]pCp. Jako źródło endorybonukleazy L (RNA-zy L) wiążącej 2.5A użyto ekstrakt mysich komórek L. Mieszaninę ekstraktu komórek L ze znakowanym 2.5A-oligoadenylanem i ekstraktu roślinnego inkubowano przez 90 minut na lodzie. Białka z mieszaniny strącano na filtrach nitrocelulozowych i zliczano radioaktywność filtrów i przesączu. Jako kontrolę pozytywną użyto tę samą mieszaninę bez ekstraktu roślinnego a jako kontrolę negatywną użyto mieszaninę, w której stężeniem 10⁷ M nieznakowanego trimeru 2.5A całkowicie zastąpiono znakowany oligoadenylan 2.5A.

171 446

Wyniki wskazują na to, że niezakażone rośliny transgeniczne wytwarzające syntetazę 2.5 A zawierają niskie, trudno wykrywalne ilości 2.5A-oligoadenylanu, podobnie jak rośliny kontrolne i rośliny transgeniczne zawierające gen 2 5A syntetazy w orientacji antysensownej (tabela 1). Dzieje się rak dlatego, że syntetaza 2,5 A jest wytwarzana w postaci nieaktywnego enzymu, który może być aktywowany przez dsRNA. Wówczas, gdy rośliny transgeniczne, w których zachodzi ekspresja syntetazy 2,5A zakażano wirusem OVX, poziom 2.5A-oligoadenylanu stawał się wykrywalny a jego stężenia wewnątrzkomórkowe były nawet wyższe niż w mieszaninach kontrolnych. Takiego wzrostu w poziomie 2.5A nie obserwowano w roślinach kontrolnych SR1 Wzrost poziomu 2.5A-oligoadenylanu w transgenicznych roślinach prowadzi do hamowania namnażania się wirusów PVX, PVS i TMV.

Tabela

Radiologiczna próba wiązania kompetycyjnego zastosowana do oznaczania stężenia 2 5-oligoadenylanów w transgenicznych roślinach wytwarzających syntetazę 2,5A, przed i po zakazeniu wirusem PVX

Rośliny	Procentowa zawartość w przesączu znormalizowana (kontrola pozytywna bez materiału roślinnego przyjęta jako 100 %)
Kontrolne SR1	29.2
Transgemczna, antysensowna konstrukcja 2.5A	65.5
Transgemczna sensowna konstrukcja 2.5A	47 2
Kontrola SR 1 xPVX	54.6
Transgemczna 2 5A x PVX	191.7
Bez ekstraktu roślinnego	100 0

Reasumując, dwuniciowe replikujące się półprodukty RNA wirusa OVX są zdolne do aktywacji nieaktywnej formy syntetazy 2,5A, w wyniku czego zachodzi synteza wewnątrzcząsteczkowego ohgoadenylanu 2.5A.

Przykład 6

Wykrywanie zakażenia wirusem PVX w transgenicznych roślinach ziemniaka: próba połowa.

Całe rośliny ziemniaka zawierające gen syntetazy 2,5A zakaża się sokiem zebranym z zakażonych wirusem PVX roślin tytoniu i uprawia się je na polu. Po 5 tygodniach od infekcji analizuje się próbki liści metodą ELISA w zestawie immunodiagnostycznym do oznaczania wirusa PVX firmy Boehringer Mannheim. Stężenie wirusa oznacza się przez pomiar gęstości optycznej reakcji barwnej przy 405 nm (fig. 10). Stężenie wirusa PVX w roślinach zawierających gen syntetazy 2,5A ulega drastycznemu zmniejszeniu w porównaniu do roślin kontrolnych.

2 3 4 5 6

FIG. 2 ( H)-Leu, cpm

FIG. 4

171 446

2 3 4 5 6

kD 67 kD 43 kD 30 kD

FIG o 5

FIG. β

171 446

1600000

Eu, cps

171 446

Próba EL±3A absorbancja

171 446

>1

C

Ό

O tP

N υ

o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
•cr	ej	o	co	co	<3·	ej

Eu, cps

171 446

Zakażenie wirusem PVX: próba połowa Stężenie wirusa po 5 tygodniach

Stężenie wirusa w ng/z świeżej jnasy

Fig. 10

171 446

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej wykazującej odporność na wiele wirusów, zawierającą wytworzoną techniką inżynierii genetycznej sekwencję DNA, kodującą polipeptyd posiadający zdolność aktywowania endonukleazy, znamienny tym, że do materiału genetycznego odpowiedniej rośliny wprowadza się sekwencję DNA kodującą co najmniej jeden polipeptyd wykazujący aktywność syntetazy 2,5A, który to polipeptyd posiada zdolność aktywowania endonukleazy wywołującej rozpad wirusowego RNA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję DNA, która jest heterologiczną sekwencją DNA.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję DNA, która jest chimerową sekwencją DNA.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze wprowadza się sekwencję kodującą wspomniany polipeptyd, która to sekwencja pochodzi z genu ssaków, genu roślinnego lub genu mikroorganizmu albo jest genem syntetycznym.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję kodującą wspomniany polipeptyd, która to sekwencja jest genem syntetazy 2,5 A szczura.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję kodującą polipeptyd, którego ekspresja odbywa się pod kontrolą promotora indukowanego lub konstytucyjnego.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję DNA do materiału genetycznego rośliny wybranej spośród takich roślin jak tytoń, ryż, pszenica, jęczmień, kukurydza, pomidory, ogórek, soja, bataty, winogrona, rzepa, burak cukrowy, bawełna, herbata, słonecznik, truskawka, róża, chryzantema, słodka papryka lub ziemniaki
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję DNA zawartą w wektorze, pod kontrolą promotora umożliwiającego jej ekspresję w tej transgenicznej roślinie.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję DNA zawartą w wektorze pHTT2-5A+ (DSM nr 6815).
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadzenia tej sekwencji DNA dokonuje się na drodze transfekcji z zastosowaniem układu Agrobacterium.