CZ285629B6 - Způsob kontroly hmyzu - Google Patents

Způsob kontroly hmyzu Download PDF

Info

Publication number
CZ285629B6
CZ285629B6 CZ952194A CZ219495A CZ285629B6 CZ 285629 B6 CZ285629 B6 CZ 285629B6 CZ 952194 A CZ952194 A CZ 952194A CZ 219495 A CZ219495 A CZ 219495A CZ 285629 B6 CZ285629 B6 CZ 285629B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
patatin
plant
gene
chain
Prior art date
Application number
CZ952194A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ219495A3 (en
Inventor
Sherri Marie Brown
John Thomas Greenplate
Barbara Guenther Isaac
Michael Girard Jennings
Elaine Beatrice Levine
John Patrick Purcell
Original Assignee
Monsanto Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Company filed Critical Monsanto Company
Publication of CZ219495A3 publication Critical patent/CZ219495A3/cs
Publication of CZ285629B6 publication Critical patent/CZ285629B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/1245—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance
    • A01H1/127—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/38—Solanaceae [Potato family], e.g. nightshade, tomato, tobacco or chilli pepper
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Palatiny kontrolují hmyz, primárně deformacemi larev a tak zabráněním dospělosti a reprodukci. Geny kodující jeden či více těchto proteinů lze klonovat do vektorů pro transformaci mikroorganismů osídlujících rostliny nebo rostlin. To dává způsob kontroly zamoření hmyzem. ŕ

Description

Způsob regulace zamoření rostlin hmyzem
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu regulace zamoření rostlin hmyzem zabezpečením proteinu, který lze aplikovat přímo na rostlinu, nebo na ní vyrábět pomocí mikroorganismů, nebo genetickou modifikací rostliny, aby produkovala protein, a také mikroorganismů a rostlin užitečných při tomto způsobu.
Dosavadní stav techniky
Použití přírodních produktů, včetně proteinů je dobře známým způsobem regulace mnoha hmyzích škůdců. Například endotoxiny Bacillus thuringiensis (BT) se používají k regulaci jak lepidopteranových, tak coleopteranových hmyzích škůdců. Geny produkující tyto endotoxiny byly zavedeny a exprimovány různými rostlinami, včetně bavlníku, tabáku a rajčat. Existuje však řada komerčně důležitých hmyzích škůdců, které nejsou citlivé k endotoxinům BT. Příklady takových důležitých škůdců jsou Anthonomus grandis (AG) a Diabrotica spp (D). Mimoto je pro kontrolu hmyzu důležité, dá se říci životně důležité, mít různé genové produkty, aby se zvládla rezistence.
V rostlinách se nalézá mnoho jiných známých insekticidních proteinů. Tyto zahrnují lektiny, inhibitory amylázy a inhibitory proteázy, které mohou ovlivnit růst a vývoj hmyzu, jestliže jsou vstřebány ve vysokých dávkách (Boulter aj., 1989, Broadway a Duffey, 1986, Czapla a Lang, 1990, Gatehouse aj., 1986, Heusing aj., 1991, Ishimoto a K. Kitamura, 1989, Murdock aj., 1990, Schukle a Murdock, 1983) avšak neuvádějí akutní mortalitu působenou proteiny BT.
O roli patatinu, který by mohl hrát roli při ochraně rostlin proti mikrobiálnímu napadení, se v publikaci Embo J. 6 (1987) pouze spekulovalo. Dosud však nebyla pro patatin ustavena žádná specifická funkce (viz Plant Sci. 87 (1992): 45-54). Proto se má zato, že žádný z namítaných dokumentů nečiní insekticidní aktivitu zřejmou.
V evropské přihlášce EP 455 316 je popsána trasgenní rostlina brambory, nesoucí patatin kódující cDNA řízenou promotorem CaMV 35S.
Předmětem tohoto vynálezu je zajištění proteinů schopných regulovat AG, D a jiné hmyzí škůdce a geny užitečné při produkci takových proteinů. Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění genetických konstruktů a způsobů zavedení takového genetického materiálu do mikroorganismů a rostlinných buněk. Jiným předmětem tohoto vynálezu je zajištění transformovaných mikroorganismů a rostlin obsahujících takový genetický materiál.
Podstata vynálezu
Bylo objeveno, že patatiny, hlavní zásobní protein bramborových klíčků, bude regulovat různý hmyz, včetně Diabrotica virgifera (DV), Diabrotica undecipunctata (DU) a Anthonomus grandis (AG). Patatiny jsou smrtící pro některé larvy a zdeformují růst přežilých tak, že se zabrání dospělosti, nebo značně oddálí, což vede k nulové reprodukci. Tyto proteiny, o nichž je známo, že mají esterázovou (lipid acylhydrolázovou) aktivitu, lze aplikovat přímo na rostliny nebo zavést jinými způsoby, jako je aplikace mikroorganismů osidlujících rostliny, které byly transformovány, aby produkovaly enzymy nebo samotnými rostlinami po podobné transformaci.
- 1 CZ 285629 B6
Patatiny jsou skupinou proteinů nalezených v bramborách (Gaillaird, 1971, Racusen, 1984, Andrews aj., 1988) a jiných rostlinách, zejména v rostlinách solanaceovitých (Ganal aj., 1991, Vancanneyt aj., 1989). V bramborách se patatiny nalézají hlavně v klíčcích, ale také v mnohem menších hladinách v jiných rostlinných orgánech (Hofgen a Willmitzer, 1990). Byly studovány esterázové substrátové specificity několika patatinových isoenzymů (Hofgen a Willmitzer, 1990, Racusen, 1986).
Geny kódující patatiny byly dříve izolovány Mignery a j., 1984, Migneiy a j., 1988, Stiekema aj., 1988 a jinými. Rosahl aj., 1987 je zavedli do rostlin tabáku a pozorovali expresi patatinu. To dokazuje, že geny patatinu mohou být rostlinami heterogenně exprimovány.
Geny pro patatin se mohou podobně izolovat a vsunout do vhodných transformačních vektorových kazet, které se pak (1) použijí k transformaci mikroorganismů osidlujících rostliny, které po aplikaci na rostliny exprimují geny produkující patatin, a tím zabezpečují regulaci hmyzu, nebo (2) jsou zahrnuty do genomu rostliny, která se pak sama chrání proti útoku hmyzu expresí genu a produkuje patatin. Mimoto lze rostlinu také transformovat nebo pěstovat, aby se současně exprimoval jeden či více BT genů, které kódují proteiny pro regulaci hmyzu. Tím by se získaly rostliny, které jsou buď (1) chráněné proti většímu počtu škůdců a nebo (2) mají dvě možnosti účinku proti některým škůdcům, což je důležitý nástroj pro zvládnutí rezistence. Příklady rostlin transformovaných, aby exprimovaly BT geny se popisují v evropské patentové publikaci číslo 0 385 962, která odpovídá US sériovému číslu 476,661, podanému 12. února 1990 (Fischhoff aj.), která je zahrnuta do popisu tímto odkazem. Mimoto lze rostliny transformovat nebo pěstovat, aby se současně exprimovaly geny inhibitorů proteinázy, například ty, co kódují bramborový inhibitor papainu (Rodis a Hoff, 1983) nebo sojový inhibitor trypsinu (přehled viz uRyana, 1990), které jako inhibitory proteinázy umocňují aktivitu jiných insekticidních proteinů.
Pro dosahování výše uvedeného je v souladu s vynálezem zabezpečen způsob regulace zamoření rostlin hmyzem zahrnující zajištění účinného množství insekticidního patatinu pro požití hmyzem. Tento způsob lze provádět zabezpečením mikroorganismů osidlujících rostliny, které byly transformovány, aby exprimovaly gen pro patatin a které jsou zavedeny na rostlinu, exprimují takový gen a poskytují insekticidně účinné množství patatinu. Tento způsob lze také zajistit expresí genu pro patatin, který je zabudován v uvedené rostlině předcházející genetickou transformací rodičovské buňky rostliny. Takovouto rostlinou je například kukuřice, bavlník, rajče a brambor.
Tak, jak je zde používán, výraz „regulace zamoření hmyzem“ znamená snížení počtu hmyzu, které snižují blahodárný výnos, ať již smrtí, zpomalením růstu (deformací) nebo sníženou účinností reprodukce.
Tak, jak se zde používá, výraz „insekticidní“ znamená schopný snížení počtu hmyzu, které snižují blahodárný výnos, ať již smrtí, zpomalením růstu (deformací) nebo sníženou účinností reprodukce.
Tak, jak se zde používá, výraz „strukturní kódující sekvence“ znamená sekvenci DNA, která kóduje polypeptid, který může produkovat buňka po transkripci DNA na mRNA, následovanou translací na žádaný polypeptid.
Tak, jak se zde používá, výraz „patatin“ znamená rostlinný protein mající 75% či větší homologii s proteinem kódovaným SEQ ID NO: 31, ukázanou níže, nebo výhodněji alespoň 80% homologii, nebo ještě výhodněji alespoň 85 % homologii. Tento výraz také zahrnuje proteiny produkované ze syntetických sekvencí DNA, které byly navrženy pro zlepšenou expresi v jednoděložných rostlinách.
-2CZ 285629 B6
Patatiny jsou skupinou esteráz nalezených v bramborách (Gaillaird, 1971, Racusen, 1984, Andrews aj., 1988) a jiných rostlinách, zejména v rostlinách solanaceovitých (Ganal aj., 1991, Vancanneyt aj., 1989). V bramborách se patatiny nalézají hlavně v klíčcích, ale také v mnohem menších hladinách v jiných rostlinných orgánech (Hofgen a Willmitzer, 1990, Racusen, 1986). Ukázalo se, že tyto enzymy mají omezené požadavky na substrát. Použití všech patatinů odvozených z rostlin a jejich ekvivalentů je zde podrobně popsáno a je v rozsahu vynálezu. To platí ať už pro požití odvozených od přirozených sekvencí DNA nebo syntetických sekvencí DNA za účelem regulace zamoření hmyzem.
Surové preparáty patatinů jsou komerčně dostupné. Například Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nabízí bramborové proteinové preparáty označené Sigmou jako kyselá fosfatáza (P-1146 a P-3752) nebo apyráza (A-9149). Bramborové klíčky lze rovněž získat a lze připravit proteinové extrakty způsoby popsanými v literatuře (Racusen a Foote, 1980, Park aj., 1983).
Příklady
Testy biologické účinnosti
Testy umělé diety
Testy aktivity proti larvám Leptinotarsa decemlineata (LD) a Ostrinia nubilalis (ON) se provádějí převrstvením zkušebního vzorku na agarovou dietu podobnou popsané Marrone aj., 1985. Zkušební vzorky se připravily solubilizací proteinu v 4 až 5 ml lOmM HEPES, pH7,5, následovanou dialýzou ve stejném ústoji pomocí uspořádání potrubí oddělujícího 3500 molekulovou hmotnost. Čerstvě vylíhlé larvy se krmí upravenou dietou při 26 °C a mortalita a deformace růstu se vyhodnocují po 5 či 6 dnech. Výsledky testů P-3752 (Sigma) jsou ukázány v tabulce 1. Tyto surové preparáty patatinů ukázaly široké spektrum insekticidní aktivity.
Tabulka 1
Dávka DU % mortality a deformace3
AG LD ON
0,0 IX 0 11 0 0
0,03X 0* 20* 0 13
Ο,ΙΟΧ 19** 20** 6 0*
0,30X 6**_*$* 46*** 13* 6*
Ι,ΟΟΧ 6*** 7j*** 13** 6**
a * = lehká deformace (přibližně 30 až 40 % snížení velikosti) ** = střední deformace (přibližně 50 až 80 % snížení velikosti) *** = těžká deformace (přes 90 % snížení velikosti)
Provedla se přesná kvantitativní měření hmotnosti DU (tabulka 2) po 5 dnech expozice a ON (tabulka 3) po 5 dnech expozice a jsou uvedena níže. Vývoj larev krmených dietou obsahující P-3752 ukázal 92 % snížení hmotnosti ve srovnání s kontrolami a larvy ON ukázaly 62 % snížení hmotnosti ve srovnání s kontrolami.
-3CZ 285629 B6
Tabulka 2
Ošetření Střední hmotnost (SEM) % snížení % mortality
Tris 4 mg (0,60)a hladina kontroly
P-3752 0,30 mg (0,03)a 92 6
a Střední hmotnost přežití je významně odlišná na 95 % (jeden faktor ANOVA) 5 (SEM) = směrodatná odchylka
Tabulka 3
Ošetření Střední hmotnost (SEM) % snížení % mortality
Tris 5,39 mg (0,49)a hladina kontroly
P-3752 2,05 mg(0,27)a 62 7
a Střední hmotnost přežití je významně odlišná na 95 % (jeden faktor ANOVA) (SEM) = směrodatná odchylka
Proteinový charakter insekticidní složky P-3752, která je aktivní proti Diabrotica virgifera (DV) 15 a Anthonomus grandis (AG) se stanovila tepelnou labilitou, srážením síranem amonným, frakcionací molekulové hmotnosti a pokusy proteázové citlivosti.
Aby se potvrdilo, že účinky P-3752 jsou působeny přímým vlivem požitého patatinu a nikoliv nepřímým vlivem působeným odporem k požití, prováděla se studie výběru diety ON a DU. 20 Výsledky této studie výběru diety ukázaly, že obě diety upravené Tris i P-3752 byly požity bez žádné převažující preference. Neprojevil se žádný odpor k dietě upravené P-3752 ve srovnání s dietou upravenou Tris.
Dlouhodobý pokus (25 dnů) proti DU použily larvy druhé fáze a mnoho přenosů přežilého 25 hmyzu na čerstvě upravenou dietu. Na konci studie se všechny kontrolní larvy zakuklily.
Naopak, 50 % ošetřených larev bylo mrtvých a dalších 50 % zvýšilo tělesnou hmotnost jen o 16% počáteční hmotnosti (2,48 mg proti 2,14 mg). To ukazuje, že vývoj larev se zastaví a nejenom zpomalí. To má důležité důsledky ze stanoviska regulace hmyzu, protože se larvy nevyvinou do dospělosti. Tedy počet hmyzu v další generaci se sníží.
Larvy Diabrotica virgifera (DV) lze použít v laboratorních pokusech pouze v druhé fázi larev. Byl navržen souběžný test P-3752 proti DV v druhé fázi larev. Ošetření P-3752 vedlo jen k 13 % a 11 % zvýšení tělesné hmotnosti druhé fáze larev DU a DV. Kontrolní DU zvýšily hmotnost o 474 % a DV vyrostly o 200 % během Ί dnů. To napovídá, že aktivita palatinu proti DV je 35 zhruba ekvivalentní aktivitě proti DU.
P-3752 byl slabě aktivní proti Heliothis virescens (HV), Spondea exigua (SE), Helicoverpa zea (HZ), Ectinophora gossypiella (EG) a Manduca sexta (MS) s poměry deformace 1 až 1,5 při stejné koncentraci, při které se dosahuje poměr deformace 3 u DU. P-3752 dal poměr deformace 40 2,5 pro Agrotis ipsilon. (Poměry deformace jsou definovány shora v tabulce 1). Byl neaktivní proti Mysus persicae při zkoušených koncentracích.
Pokusy s tkáněmi rostlin (1) Brambor: jeden gram surového P-3752 se rozpustil v 4 ml 25 mM Tris pH 7,5 ústoje a pak se dialyzoval a zfiltroval 0,2 mikrometrovou membránou. Přidal se Triton (R) X-100, aby vznikl 0,1% roztok. Bramborové listy se ponořily do preparátu enzymu a daly na zvlhčený filtrační
-4CZ 285629 B6 papír v Petriho miskách. Larvy LD se přidaly a misky se inkubovaly při 27 °C 3 dny. Ošetření brambor P-3752 vedlo k deformaci a sníženému krmení larev LD. Jako závěr pokusu zůstalo významně méně tkáně listů na kontrolních listech ve srovnání s listy upravenými P-3752.
(2) Kukuřice a bavlník: Kalus černé mexické sladké kukuřice (ČMS) nebo kalus bavlníku se sejmuly z agaru na miskách a přenesly se do 50 ml odstředivkových trubic. Kalus se zvířil a odstřeďoval v IEC klinické odstředivce 5 minut při nastavení 8. Supematant se dekantoval. K 50 ml trubici obsahující 15 ml pelet kalusu se přidalo 30 ml kapalného 2% agaru. Po pečlivém promíchání se dieta pipetovala do pokusné arény pro hmyzí biopokus. Roztok diety se převrstvil dialyzovaným P-3752 (20 % objemu) a test se provedl, jak je popsáno výše.
Vyříznuté kořeny a výhonky kukuřice se vakuově infiltrovaly (Inflt) surovým P-3752 nebo 25 mM Tris pH 7,5 ústojem. Kontrolním vzorkem byla tkáň ponořená do Tris ústoje. Přibližně 10-15 kousků tkáně kořenů nebo 3 kousky tkáně výhonků se daly do jamek 24 jamkové desky pro tkáňové kultury a čtyřikrát se to opakovalo. Do každé jamky se daly čtyři čerstvě vylíhlé larvy DU. Pokus se inkuboval při 26 °C 4 dny, kdy se provedly pozorování mortality a průměrné hmotnosti larev. Výsledky těchto pokusů jsou ukázány v tabulce 4.
Tabulka 4
Tkáň Hmyz % mortality %snížení hmotnosti
Inflt kořeny kukuřice DU 90 44
Inflt výhonky kukuřice DU 51 52
Upravený kalus ČMS DU 24 51
Upravený kalus ČMS DV 0 23
Upravený kalus ČMS ON 0 33
Upravený kalus bavlníku AG 60 bez dat
Insekticidní aktivita proti všem čtyřem druhům hmyzu (DU, AG, LD a ON) se tedy zachová i když je P-3752 pozřen spolu s rostlinnou tkání. Tyto dietní studie demonstrují, že patatiny jsou insekticidně aktivní, když se zkouší v dietách, jejichž živiny jsou pouze v tkáních rostlin (kořeny, výhonky, kalus nebo listy).
Studie způsobu akce
Následující studie ukazují, že patatin, insekticidně aktivní složka P-3752, má přímý vliv na samotný hmyz a že tato aktivita demonstrovaná v pokusech popsaných shora, nemůže být připsána účinku(ům) aktivní složky na hmyzí dietu před pozřením.
Studie účinků diety
Jeden gram P-3752 se rozpustil v 10 ml 25 mM Tris pH 7,6 ústoje a pak se dialyzoval v MWCO 12-14000 potrubí proti stejnému ústoji. Po 0,2 mikrometrové filtraci se 50 ml podíly přidaly do dietních misek na dvě desky čtyři dny před přidáním hmyzu. Obě desky se inkubovaly při 27 °C 4 dny. Po inkubaci se jedna deska zahřála po 1 hodinu na 80 °C, aby se inaktivovaly enzymy. 50 1 podíly se přidaly na třetí desku. Pro biopokus s DU se tedy použily desky inkubované, inkubované + teplo a neinkubované.
Aktivita proti DU byla následující:
neinkubovaná P-3752 6*** inkubovaná P-3752 0**
-5CZ 285629 B6 inkubovaná, zahřátá P-3752 0.
Zatímco došlo k ztrátě části aktivity během inkubace diety, úplná ztráta aktivity byla důsledkem zahřívání. Tento údaj je konzistentní s přímým účinkem po pozření. Když se posuzuje ve vztahu s pokusy s tkáněmi rostlin a variabilitou vůči různému hmyzu, ukazuje se, že aktivita proteinu na DU a jiný hmyz není přes dietní účinek.
Identifikace proteinů
Insekticidně aktivní složka P-3752 se vyčistila, částečně sekvenovala a charakterizovala. Aktivní činidlo(a) se identifikovalo jako patatin, skupina lipidacylhydroláz z brambor.
K čistění bioaktivní složky proti DU z P-3752 se použily čtyři odlišné postupy.
Čistění DU aktivit iontoměničovou chromatografií na anexu
Insekticidně aktivní složka proti DU z P-3752 se čistila iontoměničovou chromatografií na anexu (IEC) Q-Sepharose (Pharmacia) následovanou iontoměničovou chromatografií a anexu M0N0Q (HR 5/5, Pharmacia). Hladiny proteinů v aktivních frakcích proti DU naznačily, že pozorované ** deformace byly dosaženy při koncentraci proteinu 31 ppm v dietě. SDS-PAGE naznačila, že v aktivních frakcích jsou přítomné tři hlavní proteinové pásy (Mr 42 000, asi 26 000 a asi 16 000).
Pětistupňová purifikace DU aktivity
K purifikaci aktivní složky proti DU z P-3752 se použilo pět postupných purifikačních kroků. Byly to: membránové třídění podle velikosti, srážení síranem amonným, Q-Sepharose IEC, SSepharose IEC, a P-200 SEC. SDS-PAGE nejčistších frakcí aktivních proti DU ukázala proteinové pásy při Mr 42 000, asi 26 000 a asi 16 000.
Čistění bioaktivity isoelektrickou fokusací
DU bioaktivní proteiny z brambor se přečistily dvěma postupnými běhy na RF3 proteinovém frakcionátoru (Rainin) podle instrukcí výrobce. SDS-PAGE profil aktivních frakcí proti DU byl velmi podobný profilu pozorovanému u aktivních frakcí z pětistupňové purifikace a iontoměničové chromatografíe na anexu. IEF gel ukázal, že proteiny se frakcionují od pH 4,6 do 5,1, což odpovídá publikovanému pí rozpětí pro patatin (Racusen a Foote, 1980).
Postupná isoelektrická fokusace na RF3 v úzkém rozpětí pH (pH 4 až 5) se použila při pokusu rozlišit isoenzymy patatinu. Jak se očekávalo, vrchol bioaktivity se pozoroval u proteinů s pí 4,6 až 5,1. Tyto frakce mají zřetelný vzor isozymů a rozdílné úrovně bioaktivity. Bioaktivita ve frakcích se pohybovala od mortality 0 s * až ♦* deformacemi při dávkách 80 až 512 ppm. Některé bioaktivní frakce mají jen 2 hlavní isoenzymy, což demonstruje, že komplexní vzor isoenzymů není pro bioaktivitu nutný.
Purifikace pomocí nativní PAGE
P-3752 se podrobil elektroforéze za nativních podmínek a izoloval se esterázově aktivní triplet pásů (jako substrát se použil alfa-naftylacetát). Gelově čištěný esterázově pozitivní materiál byl aktivní proti DU a dával 1,5* deformace. SDS-PAGE tohoto materiálu ukázala hlavní pásy při Mr 42 000, asi 26 000 a asi 16 000, profil pozorovaný dříve u jiných purifikaci. To je další potvrzení, že patatin je insekticidní složkou z brambor.
-6CZ 285629 B6
Sekvence aminokyselin
V chromatografíckých frakcích aktivních proti DU získaných iontoměničovou chromatografií na anexu a pětistupňovou purifikací se získala NH2 koncová sekvence aminokyselin u všech proteinových pásů (Mr 42 000, asi 26 000 a asi 16 000). Celkem se generovaly data o sekvencích všech pásů aktivních frakcí. Většina pásů ukázala homologii přes 85 % u sekvence 15 aminokyselin buď na NH2 konci (SEQ ED NO: 1) nebo vnitřní sekvence (SEQ ID NO: 7) isoenzymu patatinu (Stiekema aj., 1988). Jeden z 17 kD pásů ukázal 75% homologii s počátečními osmi aminokyselinami publikované sekvence na NH2 konci patatinu. Jiný 17 kD pásů ukázal homologii přes 85 % s počátečními osmi aminokyselinami publikované vnitřní sekvence. Tyto pásy představují proteolyzované produkty patatinu. Přítomnost isoenzymů je jasně naznačena variabilitou aminokyselin v polohách 1 a 3 jak na NH2 konci, tak uvnitř sekvence.
Sekvence aminokyselin N konce
Publikovaná sekvence
Pás 1 (42 kD)
Pás 2 (28 kD)
Pás 3 (26 kD)
Pás 4 (24 kD)
Pás 5a (17 kD)
KLEEMVTVLSIDGGG XLGEMVTVLSIDGGG TLGEMVTVLSIDGGG TLGEMVTVLSIDGGG KLXEMVTVLSIDGGG (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5)
XXEEMVTV (SEQ ID NO: 6)
Vnitřní sekvence aminokyselin poloha aminokyseliny 224
Publikovaná sekvence
Pás 5b (17 kD)
Pás 6 (16 kD)
Pás 7 (15 kD)
SLDYKQMLLLSLGTG (SEQ ID NO: 7) SLDYKOML (SEQ ID NO: 8) SLXYKOMLLLSLGTG (SEQ ID NO: 9) SLNYKQMLLLSLGTG (SEQ ID NO: 10)
Esterázová aktivita
Aby se vyzkoušela esterázová aktivita aktivních frakcí proti DU, proběhla řada pokusů.
Substrát alfa-nafitylacetát
SDS-PAGE (10 až 20%) se použila při stanovení, zda aktivní frakce proti DU (z pětistupňové purifíkace) vykazovaly esterázovou aktivitu (Racusen, 1984). Na dvě poloviny gelu se umístily zahřáté a nezahřáté aktivní frakce proti DU. Pozoroval se jediný esterázově aktivní pás u nezahřátého vzorku při Mr 55 000. Zahřátý vzorek ukázal původní Mr 42 000 pás a současně absenci 55 000 pásu. Tento výsledek odpovídal údaji v literatuře o elektroforetické pohyblivosti esterázové aktivity patatinu (Racusen, 1984). Mr 55 000 pás se nepozoroval u zahřátého vzorku, což ukazuje, že tepelné zpracování v SDS eliminuje esterázovou aktivitu. Při nepřítomnosti Mr 55 000 pásu v zahřátém vzorku se pozoroval původně pozorovaný Mr 42 000 pás při barvení Coomassie.
Studie specificity p-nitrofenyl substrátu
Série p-nitrofenyl esterů (C-2, C-4, C-6, C-8, C-10, C-12, C-14 a C-16 estery) se zkoušela pro stanovení substrátové specificity. p-NP C-8 a C-10 estery byly konzistentně nej lepší substráty pro esterázovou aktivitu většiny zkoušených patatinů ve srovnání s jinými estery.
-7CZ 285629 B6
Lipid esterové substráty
Čištěná aktivní frakce proti DU (z pětistupňové purifikace) se zkoušela na schopnost hydrolyzovat řadu lipidů. Každý lipid se rozpustil a inkuboval s podílem čištěné aktivní frakce proti DU. 5 Vzorky se analyzovaly TLC s použitím trojrozpouštědlového vývojového systému (Pemes aj., 1980). Čtyři lipidy ukázaly při TCL označené modifikace. Byly to oleoyl lysolecithin, dioleoyl L-alfafosfatidylcholin,l-monolinoleoyl- rac-glycerol a diolein (Sigma). Identifikovala se nová TCL skvrna při Rf 0,37 v organickém extraktu z reakční směsi této lipid aktivní frakce ve srovnání se standardy linoleové a olejové mastné kyseliny. Tedy aktivní materiál proti DU 10 vykazuje esterázovou aktivitu na tyto čtyři lipidové estery. Vyňaly se střední vnitřnosti třetího stadia DV larev krmených kořeny kukuřice. Lipidy ze středních vnitřností se extrahovaly, rozpustily a inkubovaly při pH středních vnitřností (pH 6,55) s čištěnou aktivní frakcí proti DU. Vzorky se analyzovaly TLC s použitím shora uvedené metody. Purifikovaná aktivní frakce proti DU vykazovala esterázovou aktivitu na fosfolipidy středních vnitřností DV při pH středních 15 vnitřností. To osvětluje možný způsob akce pro insekticidní aktivitu patatinu.
Alternativní zdroje patatinu
Protože se počáteční pokusy prováděly s P-3752, komerčně dostupným enzymovým preparátem 20 (Sigma) z minnesotských bramborových klíčků Russet var. Kranz, bylo žádoucí demonstrovat, že insekticidně aktivní patatiny lze získat z čerstvých tkání bramborových klíčků. Extrakty klíčků se připravily, jak se popisuje v literatuře (Racusen a Foote, 1980, Park aj., 1983). Analyzovaly se tři komerčně dostupné odrůdy S. tuberosum (Russet, Desiree a La Chipper) a sedm divokých druhů (S. kurtzianum, S. berthaultii, S. tarijense, S. acaule, S. demissum, S. cardiophyllum a 25 S. raphanofolium, všechny dostupné z Inter-Regional Potato Introduction Station, USDA, ARS,
Sturgeon Bay, WI). Všechny extrakty byly pozitivní na patatin při SDS-PAGE a Western skvrnových testech, všechny byly pozitivní na esterázu při C-10 esterázovém testu a všechny byly insekticidně aktivní proti DU, měly například poměr deformací 2 až 3, viz tabulka 5. To demonstruje, že insekticidně aktivní patatiny lze izolovat z klíčků více odrůd a že mnoho členů 30 v této celé třídě proteinů by měly mít insekticidní vlastnosti.
Tabulka 5
Odrůda protein mg/ml delta O.D./min*ml DUa
IX 0,lX
S. kurtzianum 25,0 2700 2,5 1
S. berthaultii 23,1 29 3 1
S. tarijense 27,2 1008 2,5 1
S. acaule 26,6 82500 2 1
S. demissum 35,3 375000 3 1,5
S. cardiophyllum 14,6 89 2,5 1,5
S. raphanofolium 33,7 3725 3 2
a aktivita proti DU je vyjádřena v termínech deformací larev, 1 = lehká deformace (30 až 40 % snížení velikosti) 2 = střední deformace (50 až 80 % snížení velikosti) 3 = těžká deformace (přes 90 % snížení velikosti).
Extrakty z S. berthaultii, S. kurtzianum a S. tarijense biologicky testovaly proti dvěma dalším cílovým hmyzům, LD a ON. Data o biotestech jsou shrnuty níže v tabulce 6. Pozorovala se malá aktivita u těchto extraktů proti LD, avšak ON larvy byly středně až těžce deformovány při dávce IX. Avšak ON larvy se zdají být trochu méně citlivé k těmto bramborovým extraktům než DU larvy, ukazuje úplná absence aktivity při 0,1 X proti ON.
-8CZ 285629 B6
Tabulka 6
Odrůda LD ON
IX 0,lX IX 0,lX
S. berthaultii 0 0 3 0
S. kurtzianum 1 0 2,5 0
S. tarijense 0 0 3 0
a deformace larev
Genomová DNA z devíti různých rostlin se testovala Southem analýzou na proteiny homologické s patatinem. Southem skvrny, zkoušené s alfa-32P- značeným vzorkem SEQ ID NO: 11, ukázaly, že v mnoha jiných druzích rostlin jsou homologické sekvence. Silné signály se získaly u kukuřice, rajčat, cukrové řepy, rýže a brambor. Při tomto pokusu nebylo možno rozdělit jednotlivé pásy, avšak rozměr skvrn a jejich intenzita byly podobné ve všech těchto druzích. Slabší signály se také získaly u cuket, sóji a kanoly a objevily se jako malý počet diskrétních pásů v DNA z každého druhu. Okurky a Arabidopsis nevykazují detegovatelnou hybridizaci se vzorkem patatinu za podmínek použitých v tomto pokusu, možná pro menší množství nanesené DNA, jak byla vidět v ethidium bromidové skvrně gelu.
Odborníci mohou DNA sekvence těchto homologických proteinů snadno získat a vložit do rostlin nebo jiných organismů známými prostředky. Insekticidní vlastnosti takových proteinů lze nejlépe testovat po odlišné expresi, například z baculoviru nebo E. coli. Tedy proteiny, které lze použít při způsobech podle vynálezu, lze získat s normálním množstvím experimentů s použitím známých metod a potom použít k získání rostlin s ochranou proti zamoření hmyzem.
Genetická identifikace
Geny pro patatiny byly klonovány mnoha vědci. Sekvence popsaná Mignery aj., 1984, byla označena GM203. Má neúplnou signální sekvenci. Mignery aj., 1988, identifikovali genomový klon, označený PS20, zahrnující GM203 a obsahující úplnou signální sekvenci. SEQ ID NO: 11 se konstruovala se signální sekvencí PS20 a cDNA kódující částí GM203, dále označenou jako PatA+. Ta také obsahuje Ncol restrikční místo a EcoRI restrikční místo bezprostředně následující po kodonu terminace translace.
Solanum tuberosum odrůda Russet Burbank
Z klíčků bramborové odrůdy Russet Burbank se izolovalo dvacet cDNA, které se sekvenovaly. Vyvozené sekvence aminokyselin ukazují, že tyto cDNA kódují jedenáct různých isoenzymů patatinu. Tyto proteiny jsou od asi 82 do 100 % identické ve srovnání s PatA+, SEQ ID NO: 11 s odlišnostmi vyskytujícími se v četných polohách v délce cDNA. Tyto sekvence pro jedenáct různých isoenzymů patatinu jsou označeny, jak je ukázáno v tabulce 7. cDNA vznikly PCR postupy s použitím primerů SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27, odpovídajících 5 nukleotidům, které kódují prvých několik kodonů signální sekvence a 3 konci kódující sekvence pro další klonovací manipulace. Symbol „+“ ukazuje, že je zahrnuta nativní signální kódující sekvence. Některé cDNA neobsahují úplnou nativní signální kódující sekvenci a pouze dospělá proteinová kódující sekvence se získala podobným PCR postupem s použitím primerů SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 27. Ty jsou označeny dolním indexem „m“.
-9CZ 285629 B6
Tabulka 7
Identifikační číslo sekvence
PatA+ SEQ ID NO: 11
PatAm SEQ ID NO: 14
PatB+ SEQEDNO: 16
PatC+ SEQ ID NO: 17
PatDm SEQ ID NO: 18
PatE+ SEQ ID NO: 19
PatEn, SEQ ID NO: 20
PatFm SEQ ID NO: 21
PatG+ SEQ ID NO: 22
PatHm SEQ ID NO: 15
Patlm SEQ ID NO: 23
PatL+ SEQ ID NO: 24
PatM+ SEQ ID NO: 25
Solanum berthaultii
Patatin z diploidních brambor S. berthaultii se izoloval reverzní transkripcí mDNA klíčků následovanou PCR s použitím primerů SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27, jak je popsáno výše. Provedly se mnohonásobné nezávislé PCR reakce, aby se zabránilo izolaci duplikovaných klonů v důsledku procesu amplifikace. Celkem se částečně sekvenovalo 14 cDNA patatinu. Všech čtrnáct cDNA (označených Pat 1 až Pat 14) se zdají mít jedinou nukleotidovou sekvenci, což ukazuje, že alespoň čtrnáct různých mRNA patatinu je v klíčcích S. berthaultii exprimováno. Sekvence pro Pat3+ je SEQ ID NO: 28. Sekvence pro PatlO+ je SEQ ID NO: 29. Vyvozené sekvence aminokyselin ukazují, že 14 cDNA kóduje alespoň jedenáct různých proteinů. Obecně byly cDNA sekvence z klíčků S. berthaultii velmi podobné. Pouze 12 poloh z celkových 267 zbytků (3 %) ukázalo variabilitu sekvence. Zbytky aminokyselin přítomné v každé z těchto poloh jsou ukázané v tabulce 8. V pěti těchto polohách byl pouze jediný variantní klon s jedinečným zbytkem. Tyto změny by mohly odrážet skutečné rozdíly mezi mRNA nebo by mohly vyplývat z chyb učiněných během PCR procesu. Ve všech ostatních sedmi polohách byla větší variabilita, alespoň dvě cDNA měly alternativní aminokyselinu. Každá z devíti různých skupin sekvencí aminokyselin měla jedinečný vzor zbytků na těchto sedmi polohách. V některých případech byly změny konzervativní, jako je změna Thr na Ser v poloze 164. V jiných případech byly rozdíly dramatičtější, jako je zavedení prolinu do polohy 148.
-10CZ 285629 B6
Tabulka 8 cDNA
Poloha rozdílu aminokyselin
89 96 10? 113 120 123 148 164 187 200
PAT3+ GLN LEU GLN TYR GUJ VAL ALA ALA 1HR ASP ASP
ΡΑΓ4+ GEN SER ASP HIS G.U VAL ALA PRO SER ASP VAL
PAT5+ GLN SER ASP HIS GLU VAL ALA PRO 1HR ASP ASP
PAT7+ GLN LEU GEN TYR GUJ VAL ALA ALA THR ASN ASP
PAT8+ LYS SER GLY TYR LYS VAL AIA PRD TOR ASP ASP
PAT9+ LYS SER ASP TYR LYS VAL ALA PRO TOR ASP ASP
PAT10+ GEN SER ASP HIS GLU VAL THR PRO TOR ASP ASP
PATLU GLN SER ASP HIS CTJU ALA ALA ALA TOR ASP ASP
PATL2+ GLN SER GLY HIS GLU VAL AIA ALA TOR ASP ASP
PATA+ HIS — SER — TYR GLU VAL ALA AIA TOR GLU ASP
Solanum cardiophyllum
Deset cDNA klonů se vytvořilo při PCR s použitím mRNA izolované z klíčků Solanum cardiophyllum, jak je popsáno výše. Nukleotidové sekvence se získaly alespoň z 75 % délky každého klonu. Úplná délková sekvence klonu označeného Patl7+je SEQ ID NO: 30. SEQ ID NO: 31 je dospělá konstruovaná forma, Patl7m. Klony S. cardiophyllum byly téměř identické s jedinými náhodnými změnami nukleotidové sekvence, které by mohly být skutečné rozdíly nebo chyby PCR. Avšak v polohách 54 a 519 se pozorovalo, že řada klonů má identické změny, což napovídá, že nejsou důsledkem procesu amplifíkace. Vzory nukleotidů v těchto polohách ukazují, že jsou přítomny alespoň čtyři různé mRNA. mRNA ze dvou skupin se izolovaly několikrát a mRNA z dalších skupin se izolovaly pouze jednou v této množině cDNA klonů.
Vyvozené sekvence aminokyselin klonů S. cardiophyllum byly extrémně podobné. Bylo v nich 8 jedinečný skupin sekvencí aminokyselin, každá se lišila od jiných sekvencí pouze jediným zbytkem. cDNA klony, kódující sekvenci aminokyselin identickou se sekvencí Pat 17+, se získaly dvakrát a dalších sedm cDNA (Pat 18+, 19+, 20+, 21+, 22+, 23+ a 24+) obsahovaly jediný jedinečný zbytek.
Genetická transformace
Jak se diskutovalo shora, lze izolovat geny patatinu z různých rostlinných zdrojů. Jeden či více těchto genů lze použít k transformaci buněk bakterií nebo rostlin, aby se staly schopné produkovat patatin a provádět způsoby podle tohoto vynálezu. Příklady, jak to lze udělat s různými sekvencemi patatinu, jsou uvedeny níže.
Inženýrství cDNA pro patatin
Aby se zahrnul gen pro patatin do vektorů vhodných pro expresi patatinu v hostitelských buňkách, bylo nutné zavést vhodná restrikční místa blízko konce genu. Cílem této mutageneze bylo vytvořit kazety, které obsahují sekvenci kódující protein s minimálními nekódujícími pobočnými sekvencemi, a zahrnout užitečná restrikční místa, aby se tyto kazety mobilizovaly.
-11CZ 285629 B6
Navrhly se kazety, které by umožnily mobilizaci nedotčené kódující sekvence včetně signálního peptidů nebo jen dospělé kódující sekvence. Pro PatAm se navrhly dva primery mutageneze, aby vytvořily tyto kazety. Mutageneze SEQ ID NO: 12 nahradila dvě aminokyseliny (methioninalanin) za lysin na N konci dospělého proteinu a zavedla Ncol místo a SEQ ID NO: 13 přidala druhý kodon terminace na EcoRI místě.
Vzniklá modifikovaná sekvence se identifikovala jako PatAm SEQ ID NO: 14. Pro všechny jiné cDNA se zavedly podobné modifikace a zavedení omezovačích míst se provedlo pomocí PCR a buď primerů SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 27 nebo primerů SEQ ID NO: 32 a SEQ ID NO: 27, jak je popsáno výše.
Exprese patatinu v E. coli
DNA kódující sekvence pro PatAm (SEQ ID NO: 14) se vložila do pMON5766, vektoru exprese E. coli odvozeného od pBR327 (Soberon aj., 1980) s promotorem recA a vedoucím G10 (Olins aj., 1989). Výsledný vektor, pMON19714, se mobilizoval v E. coli kmen JM101, který pak produkoval PatAm, jak potvrdila Western skvrnová analýza a esterázová aktivita pomocí p-nitrofenyl esteru C-10.
DNA kódující sekvence pro Patl7m jakož i pro PatAm se každá vložila do pMON6235 s promotorem AreBAD (indukovatelným, když buňky rostou v arabinóze) a vedoucím G10 a genem rezistence k ampicilinu. Výsledné vektory, pMON25213 obsahující Patl7m a pMON25216 obsahující PatAm se zavedly do E. coli kmen JM101.
V transformovaných E. coli se patatin exprimoval, avšak je rozdělen do refraktilních těles (RB). Nedotčené buňky a solubilizované RB se použily v testech s DU. Výsledky jsou ukázány v tabulce 9.
Tabulka 9
Vzorek (pMON) Rep Nedotčené buňky aktivita proti DU1 Solubilizované RB aktivita proti DU1
19714 Am 1 2,5 netestováno
2 1,5 1,0
25216 Am 1 1,0 0
2 0 1,0
2521317m 1 3,0 3,02
2 1,5 0,5
1 aktivita proti DU je vyjádřena v termínech deformací larev, 1 = lehká deformace (30 až 40 % snížení velikosti) 2 = střední deformace (50 až 80 % snížení velikosti) 3 = těžká deformace (přes 90 % snížení velikosti).
2 mortalita u tohoto vzorku byla 81 %.
Exprese patatinu v bakteriích osidlujících rostliny
Pro regulaci hmyzu může být žádoucí exprimovat jeden či více patatinů v bakteriích osidlujících rostliny a pak aplikovat tyto bakterie na rostlinu. Když se hmyz živí na rostlině, požírá toxickou dávku patatinu produkovanou kolonizátory rostliny. Kolonizátory rostliny mohou být buď ti, kteří osídlují povrch rostliny, jako jsou druhy Pseudomonas nebo Agrobacterium, nebo endofyty, kteří osídlují rostlinné cévy, například druhy Clavibacteru. U kolonizátorů povrchu lze gen pro
-12CZ 285629 B6 patatin umístit do široké řady hostitelských vektorů schopných replikovat tyto gram-negativní hostitele. Příklady takových vektorů jsou pKT231 z IncQ inkompatibilní skupiny (Bagdasarian aj., 1981) nebo pVKlOO z Incp skupiny (Knauf, 1982). U endofytů lze gen pro patatin zavést do chromozomu homologickou rekombinací nebo vázáním genu na vhodný transpozon schopný chromozomové inzerce v těchto endofytních bakteriích.
Exprese patatinu v Baculoviru
Geny patatinu se klonovaly do donorového vektoru baculoviru pMON14327, popsaného v souběžné US patentové přihlášce pořadové číslo 07/941,363, podané 4. září 1992, která je zahrnuta do popisu tímto odkazem, jako NcoI/EcoRI fragmenty. Donorový vektor pMON14327 obsahuje gen rezistence k ampicilinu, levou a pravou větev Tn7 transposonu a mezi těmito větvemi gen rezistence k gentamicinu, silný baculovirový promotor polyhedrinu a polylinker. Baculovirový kyvadlový vektor nebo bacmid se skládá z mini-attTn7 místa v rámci s lacZ genem a genem rezistence k kanamicinu rekombinovaného o AcNPV virového genomu. Pomocí pomocného plazmidu pMON7124 rezistentního k tetracyklinu se produkoval rekombinantní AcNPV virus transpozicí genů patatinu nebo GUS genů a značkových genů do virového genomu (Luckow aj., 1993). Následující geny se vložily do pMON14327: geny uvedené v tabulce 7 spolu s Pat3+, Pat 10+ a Pat 17+.
Podle postupů US patentové přihlášky pořadové číslo 07/ 941, 363 a Luckow aj. se produkovalo z výše uvedených genů množství patatinu. Přítomnost patatinu potvrdila Western skvrnová analýza a esterázová aktivita pomocí p-nitrofenyl esteru C-10. S výjimkou se PatAm se každý isoenzym množil alespoň dvakrát pro s DU. Zatím co PatE+ a PatEm fermentace konzistentně ukazovaly málo nebo žádný patatin, všechny ostatní isoenzymy se zdály být exprimovány v množství přijatelném pro biotesty. Avšak podstata potranslačního zpracování patatinových proteinů v baculoviru na rozdíl od brambor se nestanovila. Bioaktivita isoenzymů exprimovaných baculovirem proti DU se pozorovala u Patl7+, PatB+, PatDm, Patlm, PatL+ a Pat3+.
Stanovily se účinky mnoha isoenzymů (produkovaných baculovirem) na růst a vývoj hmyzu. Podíly jedenácti isoenzymů Russet se spojily do jednoho vzorku pro biotesty proti DU, ON, AI aHV. Spojilo se deset až patnáct mg každého isoenzymů purifikovaného na Q-Sepharose s výjimkou PatDm, kterého bylo jen 1,7 mg. Tato směs vedla k 100% mortalitě v testech s HV a 93% snížení hmotnosti u ON. Pak se každý isoenzym testoval odděleně proti HV a ON. Ve srovnání s blokem kontrolních larev, larvy HV a ON krmené dietou upravenou isoenzymy PatC+, PatL+ a Patlm ukázaly významné deformace (přes 75 %) a nebo mortalitu. PatB+ a PatDm také deformovaly HV na 69 a 78 %.
Konstrukce rostlinného genu
Exprese rostlinného genu existujícího v dvouřetězové DNA zahrnuje transkripci mediátorové RNA (mRNA) z jednoho řetězce DNA enzymem RNA polymerázou a následující úpravu primárního mRNA transkriptu v jádře. Tato úprava zahrnuje 3 netranslatovanou oblast, která aduje polyadenylátové nukleotidy na 3 konec RNA řetězce. Transkripce DNA do mRNA se reguluje oblastí DNA obyčejně označovanou jako „promotor“. Tato promotorová oblast obsahuje sekvenci bází, která signalizuje RNA polymeráze, aby se připojila k DNA a iniciovala transkripci mRNA pomocí jednoho z řetězců DNA jako templátu, za vzniku odpovídajícího řetězce RNA.
V literatuře byla popsaná řada promotorů, které jsou aktivní v rostlinných buňkách. Takové promotory se získaly z rostlin nebo rostlinných virů a zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, promotory nopalinsyntházy (NOS) a oktopinsyntházy (OCS) (které jsou neseny tumor způsobujícími plazmidy Agrobacterium tumefaciens, promotory 19S a 35S mozaikového viru květáku (CaMV), světlem buzený promotor z malé části ribulosy 1,5-bis-fosfát karboxylázy
(ssRUBISCO, velmi hojný rostlinný polypeptid) a promotor 35S mozaikového Figwort viru (FMV). Všechny tyto promotory se také použily k vytvoření různých typů DNA konstruktů, které se exprimovaly v rostlinách (viz například WO 84/02913). Mohlo by být žádoucí omezení exprese na jisté části rostlin, které jsou citlivé na útok hmyzu. Například promotor specifický pro kořeny lze použít k omezení exprese na kořeny nebo kořeny zvýrazňující promotor lze použít k úrovní aktivních proteinů v kořenech. Tomu se dává přednost u hmyzu požírajícího kořeny.
Jisté rostlinné promotory jsou též účinné u jednoděložných rostlin. Například aktinový rýžový promotor popsaný ve WO 91/09948 je účinný pro expresi v kukuřici. Kukuřičný promotor ubiquitin, popsaný EP 0 342 926 lze také použít u jednoděložných rostlin.
Promotory použité v DNA konstruktech (například chimémí geny rostlin) podle vynálezu lze modifikovat, pokud je to žádáno, aby se ovlivnily jejich kontrolní charakteristiky. Například promotor CaMV35S lze spojit s částí genu ssRUBISCO, která potlačuje expresi ssRUBISCO při nepřítomnosti světla za vzniku promotoru, který je aktivní v listech, ale ne v kořenech. Vzniklý chimémí promotor lze použít, jak je zde popsáno.
Pro účely tohoto popisu fráze „CaMV35S“ promotor tedy zahrnuje variace CaMV35S promotoru, například promotory získané vázáním s operátorovými oblastmi, náhodnou a kontrolovanou mutagenezí, atd.. Promotory lze měnit, aby obsahovaly mnohonásobné „zvýrazňovací sekvence“, aby podporovaly zvýšenou expresi genu. Příklady takových zvýrazňovacích sekvencí byly uvedeny Kay aj., (1987).
Vybraný promotor by měl být schopný působit dostatečnou expresi sekvence kódující enzym, aby vedly k produkci účinného množství patatinu. Výhodným promotorem je CaMV 35S promotor (zvýrazněný CaMV35S).
DNA produkovaný DNA konstrukt podle vynálezu může také obsahovat 5 netranslatovanou vedoucí oblast. Tuto sekvenci lze odvodit od promotoru vybraného, aby exprimoval gen a může se specificky modifikovat, aby se zvýšila translace mRNA. 5 netranslatované oblasti se také mohou získat z virových RNA, z vhodných eukaiyotních genů, nebo ze syntetických sekvencí genu. Vynález není omezen na konstrukty, kde nepřeložená oblast je odvozena z 5 netranslatované oblasti, která provází sekvenci promotoru.
Jak je poznamenáno výše, 3 netranslatovaná oblast chimémích rostlinných genů podle vynálezu obsahuje polyadenylační signál, jehož funkcí v rostlinách je působit adicí adenylových nukleotidů na 3 konec RNA. Příklady výhodných 3 oblastí jsou (1) 3 přepsané, netranslatované oblasti obsahující polyadenylační signál genů tumor způsobících plazmidů (Ti) Agrobacterium, jako je gen nopalinsyntházy (NOS), a (2) rostlinné geny, jako jsou geny zásobních proteinů sóji a fazolový ssRUBISCO E9 gen (Fischhoff aj.).
Lokalizace
Vektory obsahující kazety patatinu popsané výše exprimují aktivní protein v cytoplasmě nebo vakuolách rostlinné buňky. Může být žádoucí zavést většinu nebo všechen patatin do vyměšovacích cest rostliny. Aby se toho dosáhlo, může být výhodné použít signální sekvenci vytvořenou z bakteriálního nebo rostlinného genu, avšak předpokládá se, že bude výhodný rostlinný gen. Příklady takových signálních sekvencí jsou sekvence z genu endoproteinázy B (Koehler a Ho) a tabákový gen PRlb (Comelissen aj.) pMON10824, popsaný v EP publikaci 0 385 962, je rostlinný transformační vektor navržený pro expresi aktivního proteinu B. t. kurstaki (BTK) z lepidopteran. V pMON10824 kódující sekvence je spojena s PRlb signální sekvencí plus 10 aminokyselin z dospělé PRlb signální sekvence. Aby vznikl vektor, ve kterém je PRlb signál spojen s genem pro patatin, pMON10824 se štěpí Bgin a Ncol a izoluje se malý fragment BglUNcol, který obsahuje PRlb signál. V spojovací reakci malý fragment BgHI-NcoI pMON10824 se
-14CZ 285629 B6 míchá s 1,0 kb NcoI-EcoRI fragmentem z pMON19714 a BamHI-EcoRI štěpeného z pMON19470 (Brown aj.). Touto reakcí se konstruuje plazmid, ve kterém je sekvence kódující patatin spojena s sekrečním signálem z PRlb genu a řízena CaMV35S promotorem a intronem pro expresi u jednoděložných rostlin.
Pro expresi genu dvouděložných rostlin lze provést podobnou reakci. Fragment Notl-Notl dvouděložného vektoru pro expresi lze zavést do dvouděložného transformačního vektoru, jak je popsáno níže a mobilizovat do odzbrojeného hostitele Agrobacterium a použít k transformaci dvouděložných. Tedy lze vytvořit rostliny, které produkují patatin, který se vylučuje do mezibuněčného prostoru.
Fragment Notl-Notl jednoděložného plazmidů lze vložit do transformačního vektoru kukuřice (jako je pMON 18181 popsaný shora), aby vznikla rostlina kukuřice, která vylučuje patatin.
Může být výhodné zaměřit lokalizaci patatinů na jiný buněčný útvar, chloroplast. Proteiny lze zavést do chloroplastu pomocí vložení tranzitního peptidu chloroplastu (CTP) na jejich N konce. Jeden CTP, který pracoval při lokalizaci cizích proteinů do chloroplastu je odvozený z malé podjednotky RUBISCO genu z Arabidopsis, označeného atslA. Variace tohoto tranzitního peptidu, která kóduje transitní peptid, 23 aminokyselin dospělé RUBISCO sekvence plus reiteraci štěpného místa tranzitního peptidu se konstruovala pro úspěšnou lokalizaci BTK proteinu do chloroplastu. pMON19643 (popsán Brown aj.) obsahuje atslA tranzitní peptid Arabidopsis spojený s GOX genem a může se použít jako základ pro konstrukci vektoru pro lokalizaci patatinů do chloroplastu. Provede se úplné štěpení EcoRI a částečné štěpení Ncol zpMON19643 a izoluje se velký fragment (4,0 kb). V spojovací reakci NcoI-EcoRI fragment z pMON19714 se míchá s velkým fragmentem z pMON19643. Tato reakce konstruuje plazmid, ve kterém je sekvence kódující patatin spojena s Arabidopsis tranzitním peptidem s 23 aminokyselinami dospělé RUBISCO a řízena CaMV35S promotorem. Alternativně lze konstruovat podobný plazmid, kde se nahradí promotor FMV35S promotorem. Takové plazmidy se mobilizují do odzbrojeného hostitele Agrobacterium a použijí k transformaci dvouděložných. Alternativně se fragment Notl-Notl klonuje do transformačního vektoru kukuřice, jak je popsáno výše. Tedy lze vytvořit rostliny, které produkují patatin, co se lokalizuje do chloroplastu.
Transformace a exprese v rostlině
Chimémí rostlinný gen obsahující strukturní kódující sekvenci podle vynálezu lze vložit do genomu rostliny jakýmkoliv vhodným způsobem. Vhodné transformační vektory zahrnují ty, které jsou odvozeny z Ti plazmidů Agrobacterium tumefaciens jakož i ty, které popsali například Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) a EP publikace 0 120 516 (Schilperoort aj.). Navíc lze u rostlinných transformačních vektorů odvozených z Ti nebo zavádějících do kořenů (Ri) plazmidů Agrobacterium použít alternativní způsoby pro vložení DNA konstruktů podle vynálezu do rostlinných buněk. Takové způsoby mohou zahrnovat například použití liposomů, elektroporace, chemikálii, které zvyšují přijímání DNA, volné dodání DNA bombardováním mikroprojektily a transformaci viry nebo pylem.
Dočasná exprese patatinů v buňkách tabáku
Zvlášť užitečný plazmidový kazetový vektor pro transformaci dvouděložných rostlin je pMON11794. Kazeta exprese pMON 11794 se skládá z CaMV35S promotoru, 5 netranslatovaného vůdce Hsp70 z petúnie, a 3 konce zahrnující polyadenylátové signály z genu NOS. pMON11794 obsahuje NcoI-EcoRI místa pro vložení kódující sekvence a Notl-Notl místa lemující kazetu pro expresi genu.
PatA+ (SEQ ID NO: 11), PatB+ (SEQ ID NO: 16), PatC+ (SEQ ID NO: 17) a PatG+ (SEQ ID NO: 22) se všechny vložily do pMON11794, aby se produkovaly pMON19745, pMON19742,
-15CZ 285629 B6 pMON 19743 a pMON19744. Každý z těchto vektorů se elektroporoval do protoplastů tabáku. Exprese patatinu transformovanými buňkami tabáku potvrdila Western skvrnová analýza.
Stálá transformace dvouděložných
Stálou transformaci dvouděložných rostlin genem patatinu oznámili Rosahl aj.. Tabák se transformoval genem patatinu za kontroly promotorem specifického pro listy a stvol. Patatin se exprimoval.
NcoI-EcoRI fragment z pMON19745 se vložil do pMON17227, Ti plazmidového vektoru popsaného v Barry aj., WO 92/04449, což je zahrnuto do popisu tímto odkazem, aby se produkoval pMON22566. Tento vektor obsahuje gen glyfosátové rezistence popsaný Barrym pro selekci transformovaných rostlin. Podobně se použily SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 22 pro výrobu vektorů pMON22563, pMON22564 a pMON22565.
Tyto vektory se vložily do odzbrojeného Agrobacterium ABI a použily k transformaci rostlin rajčat v tkáňové kultuře. Po selekci na glyfosátovou rezistenci a regeneraci rostliny, se získaly celé rostliny exprimující gen patatinu. Exprese genu patatinu potvrdila Western skvrnová analýza a předběžné výsledky ukazují expresi na úrovni asi 0,1 až 0,5 % celkového proteinu. Biotesty s larvami hmyzu probíhají.
Dočasná exprese patatinu v buňkách kukuřice kb NcoI-EcoRI fragment z pMON19729, popsaný výše, se vložil do pMON19433, který je popsán ve WO 93/19189 a souběžné US patentové přihlášce pořadové číslo 07/855,857, podané 19. března 1992 (Brown aj.), která je zahrnuta do popisu tímto odkazem. Vzniklý plazmid, pMON19731 se rozštěpil Notl a vzniklý fragment se vložil do pMON10081, jak také popisují Brown aj., což dalo pMON19740. Tento plazmid se elektroporoval do protoplastů listů kukuřice, jak popisuje Sheen, 1991. Exprese patatinu transformovanými protoplasty kukuřice potvrdila Western skvrnová analýza.
Aby se dosáhlo cytoplazmické exprese patatinu, NcoI-EcoRI fragment z pMON 19714 se vložil do pMON 19433, což dalo pMON19730. Notl fragment z pMON19730 vložil do pMON10081 vzniklý plazmid se elektroporoval do protoplastů listů kukuřice, které produkovaly patatin, jak potvrdila Western skvrnová analýza.
Patl7, s cílovými signály i bez nich, lze také exprimovat v protoplastech kukuřice. Konstruoval se pMON19761 vložením 1,1 kb NcoI-EcoRI fragmentu (SEQ ID NO: 30) kódujícího protein Patl7+ (dospělý protein Patl7 a jeho vlastní signální sekvence pro zaměření na vakuoly) do pMON19648. pMON19761 obsahuje CaMV E35S promotor, intron Hsp 70, gen Patl7+ a NOS terminátor exprese v buňkách kukuřice.
Aby se získal vektor cytoplazmické exprese, Patl7+ v pMON19761 se nahradil NcoI-EcoRI fragmentem kódujícím protein Patl7m (SEQ ID NO: 31) z pMON25213, což dalo pMON25223.
pMON25224 vznikl vložením dvou fragmentů, 0,3 kb Xbal-Ncol fragmentu obsahujícího tranzitní peptid chloroplastu (CTP) z Arabidopsis thaliana Ia genu (Timko aj.) z pMON19643 (Brown aj.) a 1 kb NcoI-EcoRI fragment Patl7m z pMON25213, vložených do pMON19761 (Xbal-Ncol). Tedy pMON 25224 obsahuje CaMVE35S promotor, intron Hsp 70, CPT/ Patl7m kódující sekvenci a NOS terminátor.
Pro expresi v mezibuněčných cílových prostorách se 5 konec endoproteinázy B cDNA (Koehler a Ho) kódující mezibuněčný signální peptid vylučovaného proteinu připojil ke genu pro Patl7m zpMON25213. BglU-EcoRI fragment obsahující chimémí gen vynikl technikou štěpení
-16CZ 285629 B6 překryvového rozšíření (Horton aj.) a vložil se do pMON19761 (BamHI-EcoRI), což dalo pMON25225. Všechny tyto konstrukty se elektroporovaly do protoplastů listů kukuřice a expresi Patl7m potvrdila Western skvrnová analýza.
Stálá transformace kukuřice genem patatinu
Transformační vektor kukuřice pMON18181 se konstruoval z pMON19653 a pMON19643 (Brown aj.). Tento konstrukt obsahuje kazetu CaMV E35S promotoru, intron Hsp 70, značkovací signální znak glyphosátu a NOS terminátor, kazetu CaMV E35S promotoru, intron Hsp 70, GOX značkovací signální znak glyphosátu a NOS terminátor a jediné Notl místo pro vložení kazety pro expresi genu obsahujícího gen patatinu. SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 30 se obě vložily jako Notl-Notl fragmenty do pMON18181, což dalo pMON19746 a pMON19764.
Tyto vektory se vložily bombardováním embryonálních buněk v tkáňové kultuře s pomocí biolistického částicového děla popsaného v Brown aj.. Transformované buňky se selektovaly na glyfosátovou rezistenci a regenerovaly se celé rostliny. Odolnost rostlin se potvrdí expresí genu na úrovni asi 0,1 až 0,5 % celkového proteinu Western skvrnovou analýzou, testem esterázové aktivity a nebo testy odolnost i proti hmyzu.
Syntetické geny pro lepší expresi v jednoděložných
Ukázalo se, že modifikace kódujících sekvencí zlepšuje expresi jiných insekticidních proteinových genů, jako jsou sekvence pro delta endotoxin Bacillus thuringiensis (Fischhoff a Perlak, WO 93/07278, Ciba-Geigy). Navrhla se tedy modifikovaná kódující sekvence, aby zlepšila expresi patatinu v rostlinách, zejména v kukuřici. Modifikovaná Pat+ sekvence je ukázaná jako SEQ ID NO: 33. DNA fragment obsahující SEQ ID NO: 33 se bude syntetizovat a vloží se do kazetového vektoru pro expresi v kukuřici, jako je pMON19470 (Brown aj.). Kazeta exprese v kukuřici se pak vloží do pMON18181 nebo jiného transformačního vektoru rostliny kukuřice obsahujícího volitelný značkovací gen pro transformaci kukuřice a získají se celé rostliny vyjadřující Patl7+.
Z předešlého bude zřejmé, že vynález bude dobře přizpůsoben k dosažení všech cílů předmětů shora vytyčených spolu s výhodami, které jsou nasnadě a které jsou vynálezu vlastní. Rozumí se, že jisté rysy a podkombinace jsou užitečné a lze je použít bez odkazu na jiné rysy a podkombinace. To se vynálezem zamýšlí a je v rozsahu vynálezu. Protože jsou možné mnohá provedení vynálezu, aniž by se vystoupilo z jeho rozsahu, rozumí se, že všechno se má interpretovat v ilustrativním a nikoliv omezujícím smyslu.
Všechny publikace a patenty zmíněné v tomto popisu se sem zahrnují odkazem, jako kdyby každá jednotlivá publikace či patent byla specificky a jednotlivě jmenována a zahrnuta odkazem.
Andrews aj., Biochem. J., 252: 199-206,1988.
Bagdasarian aj., Gene, 16: 237-41, 1981.
Barry aj., WO 92/04449.
Bevan M. aj., Nátuře, 304: 184, 1983.
D. Boulter, A. M. R Gatehouse, V. Hilder, Biotech. Adv., 7: 489,1989.
Broadway a Duffey, J. Insect. Physiol., 23: 827,1986.
Brown aj., WO 93/19189 a souběžná US patentová přihláška pořadové číslo 07/855,857, podaná 19. března 1992.
-17CZ 285629 B6
Comelissen B. J. C. aj., EMBO Joumal, 5: 37-40,1986. Czapla and Lang, J. Econ. Entomol., 83: 2480,1990.
Fischhoff D. A., Perlak F. J., Evropská patentová přihláška číslo 0 385 962, 1990.
Fischhoff D. A., Bio/Technol. 5: 807,1987.
Gaillaird T., Biochem. J., 121: 379-390, 1971.
Ganal aj., Mol. Gen. Genetics, 225: 501-509,1991.
Gatehouse aj., J. Sci. Agric. 37: 727,1986.
Herrera-Estrella L. aj., Nátuře, 303: 209, 1983.
Heusing aj., Plant Physiol. 96: 993, 1991.
Hofgen R., Willmitzer L., Plant Science, 66: 221-230, 1990.
Horton aj., Gene, 77: 61-68,1989.
Ishimoto a K. Kitamura, Appl. Ent. Zool., 24: 281, 1989.
Kay R. aj., Science, 236: 1299-1302, 1987.
Klee H. J. aj., BiofTechnol. 3: 637-642,1985.
Knauf V. C., Nester E., Plasmid, 8: 43-54, 1982.
Koehler S., Ho T.-H. D., Plant Cell, 2: 769-783,1990.
Luckow V. A. aj., J. Virol., 67: 4566-4579, 1993.
Marrone P. G. aj., J. Econ. Entomol., 78: 290-3, 1985.
Mignery aj., Nucleic Acids Research, 12: 7987-8000, 1984.
Mignery aj., Gene, 62: 27-44,1988.
Murdock aj., Phytochemistry 29: 85,1990.
Olins P. aj., J. Biol. Chem., 264: 16973-16976, 1989.
Park W. D. aj., Plant Physiol. 71: 156-160, 1983.
Pemes J. F. aj., J. Chromatography, 181: 254-258, 1980.
Racusen D., Can. J. Bot. 62:1640-1644,1984.
Racusen D., Can. J. Bot. 64: 2104-2106,1986.
Racusen a Foote, J. Food Biochem., 4: 43-52, 1980.
Rodis P., Hoff J. E„ Plant Physiol. 96: 993,1983.
Rosahl aj., EMBO Joumal, 6(5): 1155-1 159, 1987.
Ryan, Ann. Rev. Phytopath, 28 : 425-449,1990.
Schilperoort aj., Evropská patentová přihláška číslo 0120 516.
Sheen Jen, Plant Cell, 3: 225-245,1991.
Schukle a Murdock, Environ. Ent. 12: 787,1983.
Soberon aj., Gene, 9: 287-305,1980.
Stiekema aj., Plant Mol. Biol., 11: 255-269,1988.
Timko aj., The Impact of Chemistry on Technology, ACS Books, 1988, 279-295.
-18CZ 285629 B6
Vancanneyt aj., Plant Cell, 1: 533-540, 1989.
Seznam řetězců
Informace o řetězci SEQ ID NO: 1
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 1
10 15
Lys-Leu-Glu-Glu-Met-V al-Thr-V al-Leu-Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 2
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 2
10 15
Xaa-Leu-Gly-Glu-Met-V al-Thr-V al-Leu-Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 3
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 3
10 15
Thr-Leu-Gly-Glu-Met-V al-Thr-V al-Leu-Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 4
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 4
5 10 15
Thr-Leu-Gly-Glu-Met-Val-Thr-Val-Leu-Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly
-19CZ 285629 B6
Informace o řetězci SEQ ID NO: 5
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 5
10 15
Lys-Leu-Xaa-Glu-Met-V al-Thr-V al-Leu-Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 6
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 8 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 6
5
Xaa-Xaa-Glu-Glu-Met-V al-Thr-V al
Informace o řetězci SEQ ID NO: 7
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 7
10 15
Ser-Leu-Asp-Tyr-Lys-Gln-Met-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Gly-Thr-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 8
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 8 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 8
5
Lys-Leu-Asp-Tyr-Lys-Gln-Met-Leu
-20CZ 285629 B6
Informace o řetězci SEQ ID NO: 8
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 8
10 15
Ser-Leu-Xaa-Tyr-Lys-Gln-Met-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Gly-Thr-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 9
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ: aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 9
10 15
Ser-Leu-Xaa-Tyr-Lys-Gln-Met-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Gly-Thr-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 10
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 15 aminokyselin
B) Typ; aminokyselina
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 10
10 15
Ser-Leu-Asn-Tyr-Lys-Gln-Met-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Gly-Thr-Gly
Informace o řetězci SEQ ID NO: 11
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1171 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 11
-21CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120
AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180
ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300
AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT ΤΓΤΤΑΑΤΤΑΤ AGTGGTTCAA 360
TTATTGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540 600
TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATTACTTTA
TTACTCATAC TAGTAATGGT GATATATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GGTCTTGCTA 660
CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720
CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCACA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840
CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900
ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960
AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020
AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAACATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG 1080
AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TGATAGAATT C 1171
Informace o řetězci SEQ ID NO: 12
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 37 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (syntetická) (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 12
CATGTGCTCT AGAAGATCTC CACCATGGCG TTGGAAG 37
-22CZ 285629 B6
Informace o řetězci SEQ ID NO: 13
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 26 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (syntetická) (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 13
GCTTCTTTT GTGTTC GGTC
Informace o řetězci SEQ CD NO: 14
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1105 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 14
-23CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TCATTCCAGC TATCATTCTC GAATTTCTTG AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA TTGTACCCTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATCTTCTGC GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTCCCA CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA ATACTAGTAA TGGTGATATA TATGAGTTCA GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ACATTTCTAC TGTTTTTCAA GCTCGTCATT ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG TAGTACAAGT TGGTGAAACA TTATTGAAGA ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT ACAAAGCTTC TTATTGATAG AATTC
TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA 60 AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120 TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180 ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGATA 240 ATATTTTTAA TTATAGTGGT TCAATTATTG 300 AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360 TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420 AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480 TATATTTTCC TCCACATTAC TTTATTACTC 540 ATCTTGTTGA TGGTGGTGTT GCTACTGTTC 600 CAACGAGACT TGCACAAGAG GATCCAGCAT 660 AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720 CACAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCTAC 780 ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840 CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900 ATGATGCGTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960 AACCAGTTTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020 TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080
1105
Informace o řetězci SEQ ID NO: 15
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1105 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 15
-24CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA 60
TCATTCCAGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120
AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180
TGACTGCTAT GATAACZACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGATA 240
TTGTACCCTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC ATATTTTTAA TTATAGTGGT TCAATTATTG 300
GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATCTTCTGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360
GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTGCCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420
CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA AGTCICCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480
ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA TATATTTTCC TCCACATTAC TTTATTACTC 540
ATACTAGTAA TCGTGATATA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGGTGTT GCTACTGTTG 600
GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG CAACGAGACT TGGACAAGAG GATCCAGCAT 660
TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720
CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CACAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCATC 780
GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840
ACATTTCTAC TGTrrrrCAA GCTGGTCATT cacaaaacaa ttacctcagg gttcaagaaa 900
atgcaitaac aggcacaact actgaaatgg atgatgcgtc tgaggctaat atggaattat 960
TAGTACAAGT TGGTGAAAAA TTATTGAAGG AACCAGTTTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020
CTGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGAAAGAAA CTCCGAGCAA 1080
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106
Informace o řetězci SEQ ID NO: 16
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 16
-25CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT GTTTTAGTTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATGTGC TACGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA120
AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA180
ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA300
AAGATATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTCT AGTGGTTCAA360
TTTTTGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATT TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG420
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA480
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA540
TGAATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCA CATTACTTTG600
TTACTCATAC TAGTAATGGA GATAAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA660
CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTCGAAC GAAACTTGCA CAAGTGGATC720
CAAAATTTGC TTCAATTAAG TCATTGAATT ACAACGAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC840
CTCTACGATG GATATTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG900
ATTATTACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC960
AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG1020
AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAAATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG1080
AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC1140
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 17
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1175 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 17
-26CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATTGTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATTTGC TTCCTTCGAA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA120
AGGGAATCAT TCCGGGTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG AAAATGGACA180
ATAATGCAGA TGCAAJGACTT GCAGATTACT TTGATCTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG240
GTTTATTGAC TTCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA300
ATGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTCT AGGTACTGGC360
CAATTTTTTG GCCAAAATAT GATCGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA QAAMCCTTG420
GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACTG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA480
CAAATAAGCC AGTAATATTC ACCAACTCAA ATTTAGCAAA GTCTCCAGAA TTGGATGCTA540
AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT600
TTACTACTAA TACTATTAAT GGAGATAAAT ATGAGTTCAA TCTTGTTGAT GGTGCTGTTG660
CTACTGTTGC TGATCCGGCG TTATTATCCA TTAGCGTTGC AACGAGACTT GCAGAAAAGG720
ATCCAGCATT TGCTTCAATT AGGTCATTGA ATTACAAAAA AATGTTGTTG CTCTCATTAG780
GCACTGGCAC TACTTCAGAG TTTGATAAAA CATATACAGC AGAAGAGACA GCTAAATGCG840
GTGCTATACA ATGGATGTTG GTTATACAGC GAATGACTGA TGCAGCAAGT TCTTACATGA900
CTGATTATTA CCTTTCTACT GTTTTTCAAG CTCAAAATTC ACAAAAGAAT TACCTCAGGG960
TTCAAGAAAA TGCGTTAACA GGCACAACTA CTGAAATGGA TGATGCTTCT GAGGCTAATA1020
TGGAATCAIT AGTACAAGTT GGTGAAAATT TATTGAAGAA ACCAGTTCCC AAAGACAATC1080
CTGAAACCTA TGAGGAAGCT CTAAAGAGGT TTGCAAAATT GCTTTCTGAT AGGAAGAAAC1140
TTCGAGCAAA CAAAGCTTCT TATTAATGAG AATTC1175
Informace o řetězci SEQ ID NO: 18
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1106 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 18
-27CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA 60
TCATTCCGGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATA 120
AAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180
TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGATA 240
TTCTACCTTT TTACTTOGAA CATGGCCCTC ATATTTTTAA TTCTAGTGGT TCAATTTTTG 300
GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATTTTCTGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360
GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTGCCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420
CAGTAATATT CACTAACTCA AATTTAGCAA AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480
ACATATGTTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA CATATTTTCC TCCACATTAC TTTGTTACTC 540
ATACTAGTAA TGGAGATAAA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG 600
GTGATCCGGC GTTATTATCC CT7AGCGTTG CAACGAAACT TGCACAAGTG GATCCAAAAT 660
TTGCTTCAAT TAAGTCATTG AATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720
CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAGAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCTAC 780
GATGGATATT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840
ACCTTTCTAC TGTTTTTCAA GCTCGTCATT CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900
ATGCATTAAC AGGCATAACT AC7GAAATGG ATGATGCGTC TGAjGGCTAAT ATGGAATTAT 960
TAGTACAAGT TGGTGAAAAA TTATTGAAGA aaccagtttc CAAAGACAGT CCTGAAACCT 1020
ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106
Informace o řetězci SEQ ID NO: 19
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 19
-28CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATTTGC TACATTCGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA120
AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA180
ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA GGTACAGGAG240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCTTTT GCTGCTGCTA300
AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGAACAOG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA360
TTTTAGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG420
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA460
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA540
TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAAIATA TTTTCCTCCA GATCACTTTG600
TTACTCATAC TAGTAATGGT GCTAGATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA660
CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC720
CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC840
CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG900
ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC960
AAGAAAATGC ATTAAATGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG1020
AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAACATTAT TGAAGAAACC AGTCTCCAAA GACAGTCCTG1080
AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGATTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC1140
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 20
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1106 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární to (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 20
-29CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA AT7AAGGGAA60
TCATTCCGGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAGTG GACAATAATG120
CAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAGGTACA GGAGGTTTAT180
TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC TTTTGCTGCT GCTAAAGATA240
TTATACCTTT TTACTTCGAA CACGGCCCTC ΑΤΑΤΤΤΤΤΑΆ TTATAGTGGT TCAATTTTAG300
GCCCAATGTA TGATGGAAAA TATCTTCTGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC360
GTGTGCATCA AGCTTTGACA GAAGTTGCCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC420
CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA AGTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG480
ACATATGCTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA TATATTTTCC TCCACATCAC TTTGTTACTC540
ATACTAGTAA TGGTGCTAGA TATGAGTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG600
GTGATCCGGC GTTATTATCC CTTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAGAG GATCCAGCAT660
TTTCTTCAAT TAAGTCATTG GATTACAAGC AAATGTTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGČA720
CTAATTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAGAAGAGGC AGCTAAATGG GGTCCTCTAC780
GATGGATGTT AGCTATACAG CAAATGACTA ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT840
ACATTTCTAC TGTTTTTCAA GCTCGTCATT CACAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA900
ATGCATTAAA TGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCGTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT960
TAGTACAAGT TGGTGAAACA TTATTGAAGA AACCAGTCTC CAAAGACAGT CCTGAAACCT1020
ATGAGGAAGC TCTAAAGAGA TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA1080
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC1106
Informace o řetězci SEQ ID NO: 21
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1109 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ LD NO: 21
-30CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGGCTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAAGGGAA 60
TCATTCCGGG TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGAAAATG GACAATAATG 120
CAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGAGGTTTAT 180
TGACTGCTAT GATAACTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAATGAAA 240
TTGTACCTTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC ATATTTTTAA TTCTAGGTAC TGGCCAATTT 300
TTTGGCCAAA ATATGATGGA AAATATCTTA TGCAAGTTCT TCAAGAAAAA CTTGGAGAAA 360
CTCGTGTGCA TCAAGCTTTG ACAGAAGTTG CCATCTCAAG CTTTGACATC AAAACAAATA 420
AGCCAGTAAT ATTCACTAAG TCAAATTTGG CAAAGTCTCC AGAATTGGAT GCTAAGACGT 480
ATGACATATG TTATTCGACA GCAGCAGCTC CAACATATTT TCCTCCACAT TACTTTGCTA 540
CTAATACTAT TAATGGAGAT AAATATGAjGT TCAATCTTGT TGATGGTGCT GTTGCTACTG 600
TTGCTGATCC ggcgttatta tccgttagcg ttgcaacgag acgtgcacaa OAGGATCCAG 660
caxttgcttc ΛΚτηασκΛ ttgaattaca aaaaaatgtt gtigctctca ttaggcactg 720
GCACTACTTC AGAGTTTGAT AAAACACATA CAGCAGAAGA GACAGCTAAA TGGGGTGCTC 780
TACAATGGAT GTTGGTTATA CAGCAAATGA CTGAGGCAGC AAGTTCTTAC ATOACTGATT 840
ATTACCTTTC TACTGTTTTT CAAGATCTTC ATTCACAAAA CAATTACCTC AGGGTTCAAG 900
AAAATGCATT AACAGGCACA ACTACTAAAG CGGATGATGC TTCTGAGGCT AATATGGAAT 960
TATTAGCACA AGTTGGTGAA AATTTATTGA AGAAACCAGT TTCCAAAGAC AATCCTGAAA 1020
CCTATGAGGA AGCTCTAAAG AGGTTTGCAA AATTGCTTTC TGATAGGAAG AAACTTCGAG 1080
CAAACAAAGC TTCTTATTAA TGAGAATTC 1109
Informace o řetězci SEQ ID NO: 22
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 22
-31CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TATTTTTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT60
CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTTA CTGTTCTAAG TATTGATGGA GGTGGAATTA120
AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA180
ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA300
AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA360
TTTTAGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC TTCTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG420
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA400
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA540
TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATCACTTTG600
TTACTCATAC TAGTAATGGT GCTAGATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA660
CTGTTGGTOA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC720
CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC840
CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG900
ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC960
AAGAAAATGC ATTAAATGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG1020
AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAACATTAT TGAAGAAACC AGTTTCCAAA GACAGTCCTG1080
AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGATTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC1140
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TG1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 23
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1104 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 23
-32CZ 285629 B6
CCATGGTTGG AAGAAATGGT GACTCTTCTA AGTATTGATG GAGGTGGAAT TAAGGGAATC60
ATTCCAGCTA TCATTCTCGA ATTTCTTGAA GGACAACTTC AGGAAGTGGA CAATAATAAA120
GATGCAAGAC TTGCAGATTA CTTTGATGTA ATTGGAGGAA CAAGTACAGG AGGTTTATTG180
ACTGCTATGA TAACTACTCC AAATGAAAAC AATCGACCCT TTCCIGCTGC CAAACATATT240
GTACCCTTTT ACTTCGAACA TGGCCCTCAT ΑΤΤΓΤΤΑΑΤΓ ATAGTGGTTC AATTTTAGGC300
CCAATGTATG ATGGAAAATA TCTTCTGCAA GTTCTTCAAG AAAAACTTGG AGAAACTCGT360
GTGCATCAAG CTTTGACGGA AGTTGCCATC TCAAGCTTTG ACATCAAAAC AAATAAGCCA420
GTAATATTCA CTAAGTCAAA TTTAGCAAAG TCTCCAGAAT TGGATGCTAA GATGTATGAC480
ATATGCTATT CCACAGCAGC AGCTCCAATA TATTTTCCTC CACATCACTT TGTTACTCAT540
ACTAGTAATG GTGCTAGATA TGAGTTCAAT CTTGTTGATG GTGCTGTTGC TACTGTTGGT600
GATCCGGCGT TATTATCCCT TAGCGTTGCA ACGAGACTTG CACAAGAGGA TCCAGCATTT660
TCTTCAATTA AGTCATTGGA TTACAAGCAA ATGTTGTTGC TCTCATTAGG CACTGGCACT720
AATTCAGAGT TTGATAAAAC ATATACAGCA GAAGAGGCAG CTAAATGGGG TCCTCTACGA780
TGGATGTTAG CTATACAGCA AATGACTAAT GCAGCAAGTT TTTACATGAC TGATTATTAC840
ATTTCTACTG TTTTTCAAGC TCGTCATTCA CAAAACAATT ACCTCAGGGT TCAAGAAAAT900
GCATTAAATG GCACAACTAC TGAAATGGAT GATGCGTCTG AGGCTAATAT GGAATTATTA960
GTACAAGTTG GTGAAACATT ATTGAAGAAA CCAGTTTCCA GAGACAGTCC TGAAACCTAT1020
GAGGAAGCTC TAAAGAGATT TGCAAAATTG CTCTCTGATA GGAAGAAACT CCGAGCAAAC1080
AAAGCTTCTT ATTAATGAGA ATTC1104
Informace o řetězci SEQ ID NO: 24
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 24
-33CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT ΤΑΤΤΤΓΤΤΑΤ GATATTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATGTGC TAAGTTGGAA GAAATGGTTA CTGTTCTAAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120
AGGGAATCAT TCCAGCTATC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGO ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180
ATAATAAAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TCGAGGAACA AGTACAGGAG 240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCCA 300
AAGATATTGT ACCCTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCATAT TTTTAATTAT AGTGGTTCAA 360
TTTTAGGCCC AATGTATGAT GGAAAATATC T7CTGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420
AAACTCGTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTGCCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480
ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAAGTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540
TGTATGACAT ATGCTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAATATA TTTTCCTCCA CATCACTTTG 600
TTACTCATAC TAGTAATGGT GCTAGATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660
CTGTTGGTGA TCCGGCGTTA TTATCCCTTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720
CAGCATTTTC TTCAATTAAG TCATTGGATT ACAAGCAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTC 840
CTCTACGATG GATGTTAGCT ATACAGCAAA TGACTAATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900
ATTATTACAT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC GTCATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960
AAGAAAATGC ATTAAATCGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCGTCTGAG GCTAATATGG 1020
AATTATTAGT ACAAGTTGGT GCAACATTAT TGAAGAAACC AGTCTCCAAA GACAGTCCTC 1080
AAACCTATQA GGAAGCTCTA AAGAGATTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140
GAGCAAACAA ACCTTCTTAT TAATGACAAT TC 1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 25
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1175 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 25
-34CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT ΤΑΑΤΓΓΤΤΑΤ GATGTTAGCA ACTACTAGTT60
CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTCA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA120
AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA180
ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTCATGTAAT TGGAGGAACA GCTACAGGAG240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCTTTT GCTGCTGCTA300
AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTAAGAT TTTTGAACCT AGTGGTTTTC360
ACCTTTTTGA GCCAAAATAT GATGGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTTC420
GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACAG GAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA480
CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA GTTTAGCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA540
AGATGIATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT600
TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACCTCAA TCTTGTTGAT CGCGATGTTG660
CTGCTGGTGA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCCTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC720
CAGCATTTGC TTCAATTAAG TCATTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA780
CTGGCACTAA TTCAGAGTTT GCTAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA840
TTCTACAATG GGTATTCTCA CCTTTATGGG AAATGAGAAG TGCAGCAAGT TCTTACATGA900
ATGATTATTA CCTTTCTACT GTTTTTCAAG CTCTTGATTC ACAAAACAAT TACCTCAGGG960
TTCAAOAAAA TGCATTAACA GGCACACCTA CTACATTTGA TGATCCTTCT CTGGCTAATA1020
TGATATTATT AGTACAAGTT GGTCAAAACT TATTCAAGAA ATCAGTTTCC GAACACAATC1080
ATGAAACCTA TGAGGTAGCT CTAAAGAGGT TTGCAAAATT GCTCTCTGAT AGGAAGAAAC1140
TCCGAGCAAA CAAAGCTTCT TATTAATGAG AATTC1175
Informace o řetězci SEQ ID NO: 26
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 33 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (syntetická) (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 26
GTTAGATCTC ACCATGGCAA CTACTAAATC TTT 33
-35CZ 285629 B6
Informace o řetězci SEQ ID NO: 27
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 33 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (syntetická) (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 27
CCAGAATTCT CATTAATAAG AAGCTTTGTT TGC 33
Informace o řetězci SEQ ID NO: 28
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 28
-36CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT 60 CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTGA CTCTTCTTAG TATTCATGGA GGTGGAATTA 120 AGGGAATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA 180 ATAATACAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGACGAACA GGTACAGGAG 240 GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TOGACCCTTT GCTGCTGCTA 300 AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTCAGAT TTTTGAACCT AGTGGTCTTC 360 AAATTTTTGG CCCAAAATAT GATGGAAAAT ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTTG 420 GAGAAACTCG TGTGCATCAA GCTTTGACAG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480 CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA ATTTAGCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA 540 AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600 TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACTTCAA TCTTGTTGAT GGTGATGTTG 660 CTGCTGGTCA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720 CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCGTTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780 CTGGCACTAC TTCAGAGTTT TATAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA 840 TTCTACAATG GCTGTTACCT TTACAGGAAA TGAGAAGTGC AGCAAGTTCT TACATGAATG 900 ATTATTACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC TTGATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960 AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAGCTACTA AATTTGATGA TGCTTCTGTG GCTAATATGA 1020 TATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAATC AGTTTCTGAA GACAATCATG 1080 AAACCTATGA GGTAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCCGATAGG AAGAAACTCC 1140 GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC 1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 29
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 29
-37CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTACAATTT TAATTTTTAT GATGTTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATTTGC TACATTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120
AGGGMTCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTCAAGG ACAACTTCAG GAAGTGGACA ιβο
ATAATACAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA GGTACAGGAG 240
GTTTATTGAC TGCTATGATA ACTACTCCAA ATGAAAACAA TCGACCCTTT GCTGCTGCTA 300
AAGATATTAT ACCTTTTTAC TTCGATCATG GCCCTCAGAT TTTTGAACCT AGTGGTTCAA 360
TTTTTGATGG CCCAAAATAT GATGGAAAAC ATCTTATGCA AGTTCTTCAA GAAAAACTAG 420
GAGAAACTCG TGTGCATCAA ACTTTGACAG AAGTTGCCAT CTCAAGCTTT GACATCAAAA 480
CAAATAAGCC AGTAATATTC ACTAAGTCAA ATTTACCAAA AACTCCAGAA TTGGATGCTA 540
AGATGTATGA CATATGTTAT TCCACAGCAG CAGCTCCAAC ATATTTTCCT CCACATTACT 600
TTGCTACTAA TACTAGTAAT GGAGATCAAT ATGACTTCAA TCTTGTTGAT CGTGATGTTG 660
CTGCTGGTGA TCCGTCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAGAGGATC 720
CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCGTTGAATT ACAAACAAAT GTTGTTGCTC TCATTAGGCA 780
CTGGCACTAC TTCAGAGTTT TATAAAAACT ATACAGCAGA AGAGGCAGCT AAATGGGGTA 840
TTCTACAATG GCTGTTACCT TTACAGGAAA TGAGAAGTGC AGCAAGTTCT TACATGAATG 900
ATTAMACCT TTCTACTGTT TTTCAAGCTC TTGATTCACA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960
AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAGCTACTA AATTTGATGA TGCTTCTGTG GCTAATATGA 1020
TATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAATC AGTTTCTGAA GACAATCATG 1080
AAACCTATGA GGTAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCCGATAGG AAGAAACTCC 1140
GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC 1172
Informace o řetězci SEQ ID NO: 30
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1172 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 30
-38CZ 285629 B6
CCATGGCAAC TACTAAATCT TTTTTAATTT TAATATTTAT GATATTAGCA ACTACTAGTT 60
CAACATTTGC TCAGTTGGGA GAAATGGTGA CTGTTCTTAG TATTGATGGA GGTGGAATTA 120 GAGGGATCAT TCCGGCTACC ATTCTCGAAT TTCTTGAAGG ACAACTTCAG GAAATGGACA 180 ATAATGCAGA TGCAAGACTT GCAGATTACT TTGATGTAAT TGGAGGAACA AGTACAGGAG 240 GTTTATTGAC TGCTATGATA AGTACTCCAA ATGAAAAOAA TCGACCCTTT GCTCCTGCCA 300 AAGAAATTGT ACCTTTTTAC TTCGAACATG GCCCTCAGAT TTTTAATCCT AGTGGTCAAA 360 TTTTAGGCCC AAAATATGAT GGAAAATATC TTATGCAAGT TCTTCAAGAA AAACTTGGAG 420 AAACTCOTGT GCATCAAGCT TTGACAGAAG TTCTCATCTC AAGCTTTGAC ATCAAAACAA 480 ATAAGCCAGT AATATTCACT AAGTCAAATT TAGCAAACTC TCCAGAATTG GATGCTAAGA 540 TGTATGACAT AAGTTATTCC ACAGCAGCAG CTCCAACATA TTTTCCTCCG CATTACTTTG 600 TTACTAATAC TAGTAATGGA GATGAATATG AGTTCAATCT TGTTGATGGT GCTGTTGCTA 660 CTGTTGCTGA TCCGGCGTTA TTATCCATTA GCGTTGCAAC GAGACTTGCA CAAAAGCATC 720 CAGCATTTGC TTCAATTAGG TCATTGAATT ACAAAAAAAT GCTOTTGCTC TCATTAGGCA 780 CTGGCACTAC TTCAGAGTTT GATAAAACAT ATACAGCAAA AGAGGCAGCT ACCTGGACTG 840 CTGTACATTG GATGTTAGTT ATACAGAAAA TGACTGATGC AGCAAGTTCT TACATGACTG 900 ATTATTACCT TTCTACTGCT TTTCAAGCTC TTGATTCAAA AAACAATTAC CTCAGGGTTC 960 AAGAAAATGC ATTAACAGGC ACAACTACTG AAATGGATGA TGCTTCTGAG GCTAATATGC 1020 AATTATTAGT ACAAGTTGGT GAAAACTTAT TGAAGAAACC AGTTTCCGAA GACAATCCTG 1080 AAACCTATGA GGAAGCTCTA AAGAGGTTTG CAAAATTGCT CTCTGATAGG AAGAAACTCC 1140 GAGCAAACAA AGCTTCTTAT TAATGAGAAT TC 1172
Informace o řetězci SEQ ED NO: 31
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1106 párů bází B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 31
-39CZ 285629 B6
CCATGGCGTT GGAAGAAATG GTGACTGTTC TTAGTATTGA TGGAGGTGGA ATTAGAGGGA 60
TCATTCCGGC TACCATTCTC GAATTTCTTG AAGGACAACT TCAGGAAATG GACAATAATG 120
CAGATGCAAG ACTTGCAGAT TACTTTGATG TAATTGGAGG AACAAGTACA GGMSGTTTAT 180
TGACTGCTAT GATAAGTACT CCAAATGAAA ACAATCGACC CTTTGCTGCT GCCAAAGAAA 240
TTGTACCTTT TTACTTCGAA CATGGCCCTC AGATTTTTAA TCCTAGTCGT CAAATTTTAG 300
GCCCAAAATA TGATGGAAAA TATCTTATGC AAGTTCTTCA AGAAAAACTT GGAGAAACTC 360
GTGTGCATCA GGCTTTGACA GAAGTTGTCA TCTCAAGCTT TGACATCAAA ACAAATAAGC 420
CAGTAATATT CACTAAGTCA AATTTAGCAA ACTCTCCAGA ATTGGATGCT AAGATGTATG 480
ACATAAGTTA TTCCACAGCA GCAGCTCCAA CATATTTTCC TCCGCATTAC TTTGTTACTA 540
ATACTAGTAA TGGAGATGAA TATGACTTCA ATCTTGTTGA TGGTGCTGTT GCTACTGTTG 600
CTGATCCGGC GTTATTATCC ATTAGCGTTG CAACGAGACT TGCACAAAAG GATCCAGCAT 660
TTGCTTCAAT TAGGTCATTG AATTACAAAA AAATGCTGTT GCTCTCATTA GGCACTGGCA 720
CTACTTCAGA GTTTGATAAA ACATATACAG CAAAAGAGGC AGCTACCTGG ACTGCTGTAC 780
ATTGCATGTT AGTTATACAG AAAATGACTG ATGCAGCAAG TTCTTACATG ACTGATTATT 840
ACCTTTCTAC TCCTTTTCAA GCTCTTGATT CAAAAAACAA TTACCTCAGG GTTCAAGAAA 900
ATGCATTAAC AGGCACAACT ACTGAAATGG ATGATGCTTC TGAGGCTAAT ATGGAATTAT 960
TAGTACAAGT TGGTGAAAAC TTATTGAAGA AACCAGTTTC CGAAGACAAT CCTGAAACCT 1020
ATGAGGAAGC TCTAAAGAGG TTTGCAAAAT TGCTCTCTGA TAGGAAGAAA CTCCGAGCAA 1080
ACAAAGCTTC TTATTAATGA GAATTC 1106
Informace o řetězci SEQ ID NO: 32
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 45 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (syntetická) (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 32
CCATCTAGAA GATCTCCACC ATGGCGTTGG GAGAAATGGT GACTG 45
Informace o řetězci SEQ ID NO: 33
Charakteristika řetězce:
i) A) Délka: 1164 párů bází
B) Typ: nukleová kyselina
-40CZ 285629 B6 (C) Vinutost: jednoduchá
D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis řetězce: SEQ ID NO: 33
ATGGCCACCA CCMGAGCTT CCTCATCCTG ATCTTCATGA TCCTGGCCAC CACCAGCAGC60
ACCTTCGCCC AGCTCGGCGA GATGGTGACC GTGCTCTCCA TCGACGGCGG TGGCATCAGG120
GGCATCATCC CGGCCACCAT CCTGGAGTTC CTQGAGGGCC AACTCCAGGA GATGGACAAC180
AACGCCGACG CCCGCCTGGC CCACTACTTC GACGTGATCG GTGGCACCAC CACCGGCGGT240
CTCCTGACCG CCATGATCTC CACTCCGAAC GAGAACAACC GCCCCTTCGC CGCTGCGAAG300
GAGATCGTCC CGTTCTACTT CGAACACGGC CCTCAGATTT TCAACCCCTC GGGTCAAATC360
CTGGGCCCCA AGTACGACGG CAAGTACCTT ATGCAAGTGC TTCAGGAGAA GCTGGGCGAG420
ACTAGCGTGC ACCAGGCGCT GACCGAGGTC GTCATCTCCA GCTTCGACAT CAAGACCAAC480
AAGCCAGTCA TCTTCACCAA GTCCAACCTG GCCAACAGCC CGGAGCTGGA CGCTAAGATG540
TACGACATCT CCTACTCCAC TGCTGCCGCT CCCACGTACT TCCCTCCGCA CTACTTCGTC600
ACCAACACCA GCAACGGCGA CGAGTACGAG TTCAACCTTG TTGACGGTGC GGTGGCTACG660
GTGGCGGACC CGGCGCTCCT GTCCATCAGC GTCGCCACGC GCCTGGCCCA GAAGGATCCA720
GCCTTCGCTA GCATTAGGAG CCTCAACTAC AAGAAGATGC TGCTGCTCAG CCTGGGCACT780
GGCACGACCT CCGAGTTCGA CAAGACCTAC ACTGCCAAGG AGGCCGCTAC CTGGACCGCC840
GTCCATTGGA TGCTGGTCAT CCAGAAGATG ACGGACGCCG CTTCCAGCTA CATGACCGAC900
TACTACCTCT CCACTGCGTT CCAGGCGCTT GACTCCAAGA ACAACTACCT CCGTGTTCAG960
GAGAATGCCC TCACTGGCAC CACGACCGAG ATGGACGATG CCTCCGAGGC CAACATGGAG1020
CTGCTCGTCC AGGTGGGTGA GAACCTCCTG AAGAAGCCCG TCTCCGAAGA CAATCCCGAG1080
ACCTATGAGG AAGCGCTCAA GCGCTTTGCC AAGCTGCTCT CTGATAGGAA GAAACTCCGC 1140
GCTAACAAGG CCAGCTACTA ATGA1164

Claims (4)

1. Způsob regulace zamoření rostlin hmyzem požírajícím rostliny, vyznačující se tím, že zahrnuje zajištění účinného množství insekticidního patatinu pro požití hmyzem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený patatin se zajistí mikroorganismy osídlující rostliny, které produkují patatin po aplikaci na rostlinu.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený patatin se zajistí expresí genu pro patatin, který je zabudován v uvedené rostlině předcházející genetickou transformací rodičovské buňky rostliny.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedenou rostlinou je bavlník, kukuřice, rajče nebo brambor.
CZ952194A 1993-03-12 1994-03-02 Způsob kontroly hmyzu CZ285629B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3114693A 1993-03-12 1993-03-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ219495A3 CZ219495A3 (en) 1996-05-15
CZ285629B6 true CZ285629B6 (cs) 1999-10-13

Family

ID=21857879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ952194A CZ285629B6 (cs) 1993-03-12 1994-03-02 Způsob kontroly hmyzu

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0688363A1 (cs)
JP (1) JPH08507692A (cs)
KR (1) KR960701210A (cs)
CN (1) CN1119027A (cs)
AU (1) AU677389B2 (cs)
BR (1) BR9406586A (cs)
CA (1) CA2155430A1 (cs)
CZ (1) CZ285629B6 (cs)
HU (1) HUT72479A (cs)
NZ (1) NZ263327A (cs)
PL (1) PL176936B1 (cs)
UA (1) UA27966C2 (cs)
WO (1) WO1994021805A2 (cs)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824864A (en) * 1995-05-25 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize gene and protein for insect control
ES2196340T3 (es) * 1996-06-18 2003-12-16 Unilever Nv Procedimiento de esterificacion enzimatica.
US6080913A (en) * 1996-09-25 2000-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Binary methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds
US6057491A (en) * 1997-05-29 2000-05-02 Borad Of Regents For University Of Oklahoma Protein having insecticidal activities and method of use
WO2001036468A2 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel proteins having insecticidal activities and method of use
EP1254167A2 (en) 2000-01-06 2002-11-06 Monsanto Technology LLC Preparation of deallergenized patatin proteins and patatin permutein proteins
FR2807756A1 (fr) * 2000-04-13 2001-10-19 Rhobio Polypeptides pla2 de plantes impliques dans la reaction de defense des plantes, polynucleotides codant ces polypeptides et plantes transformees les contenant

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU638438B2 (en) * 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
DE4013144A1 (de) * 1990-04-20 1991-10-24 Inst Genbiologische Forschung Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide

Also Published As

Publication number Publication date
AU6403494A (en) 1994-10-11
KR960701210A (ko) 1996-02-24
HUT72479A (en) 1996-04-29
CN1119027A (zh) 1996-03-20
WO1994021805A3 (en) 1994-12-22
NZ263327A (en) 1997-01-29
JPH08507692A (ja) 1996-08-20
CA2155430A1 (en) 1994-09-29
WO1994021805A2 (en) 1994-09-29
BR9406586A (pt) 1996-01-02
AU677389B2 (en) 1997-04-24
CZ219495A3 (en) 1996-05-15
HU9502646D0 (en) 1995-11-28
PL176936B1 (pl) 1999-08-31
UA27966C2 (uk) 2000-10-16
PL310599A1 (en) 1995-12-27
EP0688363A1 (en) 1995-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NZ335358A (en) CryIC protein fragment from Bacillus thuringiensis for insecticidal activity against Lepidopteran insects
AU2014307915B2 (en) Methods for enhancing drought tolerance in plants
CN111433363B (zh) 非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法
MX2014009113A (es) Composiciones citricas resistentes a patogeno, organismos, sistemas y metodos.
CZ421199A3 (cs) Proteiny s insekticidní účinností a jejich použití
AU718274B2 (en) Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same
AU685920B2 (en) Antimicrobial proteins from aralia and impatiens
US20150203866A1 (en) Methods and compositions for plant pest control
US5629469A (en) Thiol protease inhibitor
CZ285629B6 (cs) Způsob kontroly hmyzu
US6927322B2 (en) Cabbage proteinase inhibitor gene confers resistance against plant pests
Pourhosseini et al. Agrobacterium-mediated transformation of chitinase gene in Rosa damascene cv. Ghamsar
HU218356B (hu) Eljárás többszörös vírusrezisztenciát mutató transzgén növények előállítására
KR101108971B1 (ko) 무름병 내성이 증진된 배추의 형질전환체 및 그 제조방법
US20230225331A1 (en) Plant Endophytic Bacteria And Methods To Control Plant Pathogens And Pests
US6297427B1 (en) Insect resistant use of sweet potato sporamin gene and method for controlling pests using the gene
AU775719B2 (en) Synthetic bacillus thuringiensis gene encoding cryica (cryic) toxin
CN116606358A (zh) GmTLP8蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用
CA2358161A1 (en) Organisms containing insecticidal proteins
SE512197C2 (sv) Lektiner för att åstadkomma resistens mot insekter i Brassica
MXPA99010882A (en) Proteins having insecticidal activities and method of use
MXPA99005746A (en) Methods for conferring insect resistance to a monocot using a peroxidase coding sequence

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030302