SE512197C2 - Lektiner för att åstadkomma resistens mot insekter i Brassica - Google Patents

Description

...man x i| .sin i ...Him aim: : um 512 197 2 insekter. En stor fördel med denna teknik är att genens ursprung inte är begränsat till den art som grödan till- hör, inte ens till högre växter. Faktum är att de mest utnyttjade generna för denna tillämpning hittills är gener från en insekts-patogen bakterie, Bacillus thuringiensis. Emellertid har också gener från högre växter använts. Gener som kodar för proteinasinhibitorer, a-amylasinhibitorer och lektiner tillhör denna kategori.

Växtlektiner definieras som "alla växtproteiner som besitter åtminstone en icke-katalytisk domän som binder reversibelt till en specifik mono- eller oligosackarid” (Peumans & van Damme 1995). Från den vetenskapliga litteraturen (t.ex. Peumans & van Damme 1995) såväl som från patentdokument (t.ex. EP-A2-0 351 924 (Shell Inter- nationale Research Maatschappij B.V.); EP-A2-O 427 529 (Pioneer Hi-Bred International, Inc); WO-Al-9202139 (Agricultural Genetics Company Limited); WO-Al-9304177 (Agricultural Genetics Co Ltd); CA-Al-2 122 785 (DowElanco) är det känt att lektiner fungerar som växt- skyddande kemiska föreningar.

Sålunda är det känt från EP-A2-O 351 924 att lek- tiner har en bekämpningseffekt mot skadegörare, speciellt mot insekter. En transgen växt beskrivs, vilken innehål- ler en lektingen till vilken har kopplats en promotor som reglerar genen. Lektinet är främmande för växten som den föreligger i naturen. Företrädesvis är växten en art i familjen Solanaceae.

I EP-A2-O 427 529 beskrivs ett förfarande för att skydda en växt mot angrepp av insekter valda bland majs- mott, ”corn root worm" och ”cut worm", vilket innefattar att man i växtens genom sätter in en sekvens som kodar för åtminstone ett utvalt växtlektin som är skadligt för larverna. Emellertid visade sig Con A-, ärt-, potatis- och jordnötslektiner inte ha någon signifikant effekt.

Växten är företrädesvis en monokotyledon vald bland majs, vete, ris och sorghum. 512197 3 I WO-Al-9202139 beskrivs en transgen växt innehal- lande och med förmåga att uttrycka en gen som kodar för ett lektin som är specifikt mannos-bindande, i synnerhet ett lektin från Amaryllidaceae eller Alliaceae. Det enda exemplet pà en växt transformerad med en lektin-gen är en växt av Nicotiana-släktet transformerad med lektingenen fràn Galanthus nivalis.

WO-Al-9304177 avser skydd av växter medelst protei- ner med toxisk effekt på enbart insekter tillhörande Homoptera. Galanthus nivalis- och vetegroddslektiner nämns som exempel pà sådana proteiner.

I CA-A1-2 122 785 beskrivs en transgen majsplanta som är resistent mot angrepp av en insekt vald bland ”Western corn rootworm”, eller ”Northern corn rootworm”.

Denna transgena majsplanta uttrycker en insektsbekämpande mängd av PNA-lektin, amaranthin-lektin eller Con A.

Emellertid är känsligheten mot ett specifikt lektin olika för olika insektsarter (jfr t.ex. Czapla & Lang 1990; Rabhé et al. 1995) och lektiner tillhörande samma klass, baserat pà sockeraffinitet, kan skilja sig àt väsentligt i toxicitet gentemot en viss insekt. Sålunda, med föreliggande kunskap, är det inte möjligt att förut- säga vilket lektin som kommer att vara negativt för en viss skadeinsekt.

Detta är också tydliggjort av försöksresultaten i de olika patentbeskrivningar som nämnts ovan, och i synner- het beskrivningen till EP-A2-0 427 529 visar att fack- mannen pá omrâdet inte kan dra några som helst slutsatser om att ett isolerat lektin kommer att vara effektivt. Av cirka 45 testade lektiner hade ll en negativ effekt mot unga larver av majsmott och ”Southern corn rootworm”. Ett av två lektiner från vardera Griffonia simplicifolia och Wïstaria floribunda hade insekticid effekt, medan ett inte uppvisade någon insekticid effekt i de genomförda försöken.

Hos känsliga insekter bromsar lektiner tillväxten och sänker överlevnaden om de appliceras i tillräckligt 512 197 4 höga doser. Det finns olika idéer om hur lektiner påver- kar insekters vällevnad. Matspjälkningen kan försämras av lektiner som blockerar kanalerna i det peritrofa membra- net, av lektiner som binder till glykokonjugat i cellerna i tarmepitelet eller av lektiner som binder till mat- spjälkningsenzymer som innehåller sockermolekyler (jfr t.ex. Eisemann et al. 1994; Harper et al. 1995).

Skadegörelse av insekter är en begränsande faktor vid odling av Brassica-oljeväxter. De viktigaste skade- insekterna varierar med geografiskt odlingsomràde och huruvida grödan är en höst- eller vàrtyp. I länder såsom Sverige och Danmark är rapsbaggar av släktet Meligethes, speciellt av arten Meligethes aeneus, de viktigaste ska- deinsekterna och vàrraps och vàrrybs kan knappast odlas utan pesticidbehandling (Nilsson 1987). Även vid odling av hösttyper görs som regel en sprutning med insekticid mot rapsbaggar.

Sökandet efter genotyper som kan tjäna som källor till resistensgener i ett förädlingsprogram för resistens mot M. aeneus har inte varit framgångsrikt (Åhman 1993).

Vidare, eftersom man har höga krav pà frökvalitet och avkastning hos raps, skulle traditionell förädling med användning av resistensgener från agronomiskt primitiva växter kräva ett omfattande àterkorsningsprogram.

Förhållandena är likartade för resistensförädling mot ett annat viktigt skadeinsektskomplex i Brassica- oljeväxter, nämligen jordlopporna, Phyllotreta spp. Dessa skalbaggar förorsakar allvarliga problem i vårsådd raps och rybs i norra Europa och också i Kanada genom att de livnär sig på småplantor, vilket kan förorsaka plantdöd.

Sålunda skulle Brassica-odling kunna tjäna på transgent införande av växtgener som medför resistens mot dessa skadeinsekter. Andra viktiga skadeinsekter i Brassica- odling är kàlflugor av släktet Delia, såsom Delia radicum och Delia floralis. 512 A197 SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Det har nu visat sig möjligt att göra Brassica resi- stent mot skadeinsekter som angriper Brassica genom att transformera dem med DNA-sekvenser som kodar för speci- fika lektiner som hämmar nämnda skadeinsekter.

Sålunda, i en av sina aspekter, åstadkommer före- liggande uppfinning en transgen Brassica-växt resistent mot Brassica-angripande skadeinsekter, innefattande i sitt genom åtminstone en DNA-sekvens som kodar för ett lektin som inhiberar nämnda skadeinsekter tillsammans med en lämplig promotor, som är aktiv i vävnaderna hos Bras- sica-växter angripna av skadeinsekter.

I en ytterligare aspekt av uppfinningen àstadkomms en expressionskassett omfattande DNA, vilket kodar för ett eller flera lektiner som är funktionellt bundna till växtreglerande sekvenser, vilket resulterar i uttryck av DNA:t i cellerna hos Brassica-arter.

I en annan aspekt avser uppfinningen förökat växt- material, härrörande i en eller flera generationer, via kloning, sjàlvbefruktning och/eller hybridisering, från ovan visade transgena Brassica-planta.

I en annan av sina aspekter, erbjuder uppfinningen ett förfarande för att göra en Brassica-växt resistent mot skadeinsekter på Brassica, vilket förfarande omfattar transformation av Brassica-växten sä att den uttrycker ett lektin som hämmar nämnda skadeinsekter. I en särskilt föredragen utföringsform avser uppfinningen skadeinsekter tillhörande släktena Meligethes, Phyllotreta och Delia.

Lektiner lämpliga för användning vid transforma- tionen enligt uppfinningen är följande lektiner, vilka representerar tre olika specificitetsgrupper när det gäller sackarid-bindning: ”jack bean” (Canavalia ensi- formis)-lektin (Concanavalin A eller Con A), ett nytt modifierat Con A-lektin, erhållet genom lägesriktad muta- tion av Con A-genen, ärt (Pisum sativum)-lektin, vilka alla tre tillhör den glukos/mannos-specifika gruppen, samt vete (Triticum vulgaris)-groddslektin tillhörande : HH 512 197 6 N-acetylglukosamingruppen, potatis (Solanum tuberosum)- lektin som också tillhör N-acetylglukosamingruppen, och jordnöts (Arachis hypogaea)-lektin tillhörande N-acetyl- galaktosamin/galaktos-gruppen (Liener et al. 1986). Inget av dessa nämnda lektiner är specifikt mannosbindande (jfr. WO-A-9202139 och motsvarande US-A-S,545,820).

Företrädesvis är lektinet ”jackbean”-lektin (Conca- navalin A), modifierat Concanavalin A-lektin och/eller ärtlektin.

För både Con A-lektin och ärtlektin finns likartade varianter som kan isoleras från besläktade växtarter.

Dessa varianter är lektiner som besitter en biologisk aktivitet som är väsentligen lika den biologiska akti- viteten hos Con A eller ärtlektin. Det är också möjligt att konstruera varianter av Con A, modifierat Con A eller ärtlektin med olika tekniker som används inom molekylär- biologin. För ändamålen med föreliggande uppfinning är en variant ett protein, i vilket de aktiva delarna av amino- syrasekvenserna är identiska eller ekvivalenta till åt- minstone 80%, företrädesvis åtminstone 90%. Grupper av ekvivalenta aminosyror definieras nedan där en aminosyra i en grupp kan substitueras av en annan aminosyra i den gruppen: (1) glycin och alanin; (2) alanin, valin, leucin och isoleucin; (3) serin och treonin; (4) fenylalanin, tyrosin och tryptofan; (5) lysin, arginin och histidin; (6) asparaginsyra och glutaminsyra; och (7) asparagin och glutamin.

Promotorn väljs så att det insatta DNA:t resulterar i produktion av lektinet i en lämplig del eller delar av växten, växtdelar som är utsatta för skada av den speci- fika skadeinsekten som skall kontrolleras. Sålunda för att inhibera tillväxt och/eller överlevnad av Meligethes spp. bör promotorn vara aktiv i ståndare och/eller andra blom/knoppdelar. För att inhibera ätande av Phyllotreta spp. bör promotorn vara aktiv i hjärtblad och för att inhibera Delia spp. bör promotorn vara aktiv i rötter. 512 197 7 Uppfinningen kommer nu att beskrivas mera i detalj med hänvisning till följande icke-begränsande exempel.

Erhàllande av testkemikalier Con A, ärtlektin, vetegroddslektin, potatislektin och jordnötslektin användes i uppfödnings- försök. Föl- jande lektiner inköptes frän Sigma Chemical Co.; ”jack bean” C2010, vetegrodd L9640, jordnöt L088l och ärt L5380.

Potatislektin renades fram i enlighet med Matsumoto et al. (1983) med vissa modifieringar. Cirka 0,5 kg tvät- tade potatisknölar homogeniserades i 0,5 1 kall (4°C) 3 M ättiksyra, filtrerades genom ostduk och centrifugerades vid 9000 rpm under 30 min. vid 4°C i en Sorvall GSA-ro- tor. För att fälla ut proteinerna, tillsattes ammonium- sulfat till 60% mättnad. Denna lösning hölls vid 4°C över natten under konstant omrörning. Nästa dag, efter centri- fugering såsom beskrivits ovan, löstes proteinpelleten i ml vatten och dialyserades mot destillerat vatten över natten vid 4°C. Proteinlösningen centrifugerades i en Sorvall SA-600-rotor vid 5000 rpm under 20 min. vid 4°C.

Lektinet extraherades fràn denna proteinblandning medelst affinitetskromatografi pà en chitotrios-agarospelare jäm- viktad med vatten och eluerad med 0,2 M NH3. Proteinren- heten säkrades med SDS-polyakrylamidgelelektrofores, vil- ken visade ett enda band vid 65 kD. Vidare sammanföll proteininnehällande fraktioner fràn pelaren med aktivi- teten att agglutinera humana erytrocyter.

EXEMPEL 1 a Hpofödninqsförsök med M1 aeneus-larver I larvuppfödningsförsök med M; aeneus jämfördes ovannämnda fem lektiner. Larverna matades med Brassica napus oleifera (sort Katarina)-stàndare doppade i 1 eller % (vikt/vol) lösningar av respektive lektin. Ständarna togs alltid fràn knoppar som just hade börjat slà ut. För att ytterligare standardisera dieten, doppades grupper om 9 ständare i 10 pl av lösningarna. De exakta lektinkon- centrationerna i pollenkornen, larvernas föda, bestämdes H" li' ww- lO 512197 8 ej. Lösningsmedlet var 0,1% Tween 20 i ultrafiltrerat py- rogenfritt vatten (MilliporeR). Detta lösningsmedel an- vändes som kontrollbehandling.

Försöket påbörjades med larver som var mindre än ett dygn gamla. Ägg samlades fràn knoppar pà plantor i växt- husburar beskrivna nedan. Under mikroskop överfördes grupper om upp till 10 ägg till ett fuktigt bomullssub- strat i plastlocksförseglade, ventilerade brunnar pà mik- rotiterplattor. En gäng om dagen undersöktes plattorna med avseende pä nya larver, vilka överfördes en och en till uppfödningsplattor, olika för varje behandling.

Varje dag flyttades de larver som levde till en intill- liggande bomullsklädd brunn försedd med en färsk, impreg- nerad stàndare. Plattorna med ägg och larver hölls i en Conviron E15 CMP 3244 växtkammare (temperatur l5°C, RH 80% och 18 h ljus). Efter 7 dygn registrerades överlev- nadsgraden och levandevikten hos larverna.

Resultat Samtliga lektiner minskade signifikant (testat med chiz) ML aeneus-larvernas överlevnadsgrad vid koncentra- tionen 10% lektin i de lösningar som användes för behand- ling av stàndare (Tabell 1, Fig. 1, 2). Ingen av larverna som matades med Con A- eller ärtlektin-impregnerade stän- dare överlevde dag 4. Vid 1%-nivån för lektin i lös- ningarna var överlevnadsgraden för larverna signifikant lägre när lektinet var vetegroddslektin, Con A och ärt- lektin, men inte potatis. (Jordnötslektin testades inte i denna koncentration.) Som nämnts ovan överlevde inte ”10% Con A- och ärtlektinlarverna” till dagen för vägning.

Larver som matades med stàndare impregnerade med 1% ärtlektin, 1% och 10% vetegrodds-lektin och 10% jordnöts- lektin vägde signifikant mindre än kontrolllarverna (tes- tat med ANOVA följt av Scheffé's test vid 5% signifikans- nivå). 512 197 Tabell 1 M. aeneus larvöverlevnad och medelvikt efter 7 dygns uppfödning pà stàndare impregnerade med lösningar av växtlektiner jämfört med kontrollarver matade med stàn- dare impregnerade med lösningsmedel (0,1% Tween 20 i vatten). ** = p Behandling 1% % n % över- Vikt n % över- Vikt levnad (pg) levnad (pg) Kontroll 41 61 812 41b 78 753 Potatis 42 57 783 41 27*** 635 Kontroll 41b 78 753 Jordnöt 41 37*** 539*** Kontroll 41* 76 633 41b 78 753 vote 41 32*** 4o9*** 41 12*** 317*** Kontroll 41a 76 633 41b 78 753 con A 40 42** 540 41 o*** - Kontroll 47 68 695 40 27 639 Årt 47 11*** 146*** 38 o*** - a'b Kontrollen var densamma för samtliga indikerade lek- tiner.

I försöket där 10% ärtlektin visade sig vara lika effektivt som Con A vad avser dödandet av larver (Fig. 2) förelàg också en behandling där larver gavs ett val mel- lan en Con A-behandlad stàndare och en lösningsmedelsbe- handlad stàndare. Larvernas position och födopreferenser registrerades innan nya stàndare tillfördes. Det förelåg inte något bevis för att larverna kunde skilja mellan de två behandlingarna (Tabell 2), det vill säga risken är ímuv-:ÉIE v. . i 5122197 liten för att larverna skall orsaka skada på andra växt- delar om en ståndarspecifik promotor styr lektingenen.

Tabell 2 Preferenser hos Meligethes larver (n = 41) som gavs möj- lighet att välja mellan ståndare impregnerade med Con A eller lösningsmedel enbart. Inga signifikanta skillnader förelåg vid Cruz-test.

Antal gånger Antal gånger Antal gånger Antal gånger funna funna på Con A kontroll På Con A- kontrollståndare åts mer än åts mer än ståndare kontroll Con A 23 21 26 31 Försök med honor av M1 aeneus I detta försök testades potatislektin och Con A-lek- tin för att studera huruvida reaktionerna hos vuxna öve- rensstämmer med larvreaktionerna, där potatislektin är mindre potent som larvinhibitor än Con A. Vuxna ML aeneus samlades in från påskliljor och andra vàrblommor och hölls i nätburar i växthus under åtminstone en vecka in- nan försöken påbörjades. Burarna var försedda med blom- mande raps för att främja skalbaggarnas sexuella mognad och parning. En del av de insamlade baggarna lagrades i kylskåp i ventilerade 1,5 l plastburkar, delvis fyllda med fuktig sand vid en temperatur av 4-8°C. Dessa lagrade baggar användes senare under försöken och behandlades då som beskrivits ovan. För att skilja honor från hanar, hölls baggarna i bur en och en med en blomställning av vårraps. Burarna bestod av perforerade 18 x 25 cm plast- påsar (Cryovac) fästade över en plastburk (diameter 1,5 cm; höjd 6 cm) med gummiband.

Blomställningarna stacks ner genom ett hål i locket på den vattenfyllda burken. Efter 2-3 dygn undersöktes knopparna med avseende på äggläggningshål och ägg under mikroskop. Honor som hade lagt ägg användes i försöken. lO 5412 197 ll Honorna använder huvudsakligen 2-3 mm långa knoppar för äggläggning. Äggen införs i knoppen genom ett hål som görs av honan med mundelarna. Födan utgörs av knoppar som är mindre och större än dessa, samt av pollen från stàn- dare. Mindre knoppar förtärs ofta helt och hållet så att endast skaften blir kvar. Lektinets effekt på ätande och äggläggningsfrekvens testades i samma typ av plastpåse- burar som de för utsortering av honor som beskrivits ovan. För att tvinga honorna att äta endast behandlade växtdelar och för att använda så lite lektin som möjligt, erhöll honorna två stàndare under ett dygn alternerande med en blomställning nästa dygn och så vidare under en period av 14 dygn. Ståndarna, som placerades på fuktig bomull överst på locket, behandlades på samma sätt som stàndare som gavs till larverna. På blomställningen av- lägsnades blommor och knoppar större än 3 mm. De små knopparna (< 2 mm) i toppen av blomställningen màlades antingen med lektin eller kontrolllösning. Knoppar för äggläggning (2-3 mm) behandlades inte. Antalet stàndare och knoppar som hade ätits, antalet ägg som lagts och antalet knoppar där äggläggning skett registrerades lik- som vikterna hos honorna vid försökets början och slut.

Slutvikterna registrerades efter det att honorna hade dödats i frys (-18°C).

Resultat Samtliga honor överlevde den 14 dygn långa försöks- perioden. Honbeteendet var mycket varierande. Vissa lade inte några ägg alls och data analyserades både med och utan dessa honor. I tre jämförelser förelåg signifikanta skillnader mellan kontroll- och Con A-behandlingar: an- talet ätna knoppar (samtliga honor), antal lagda ägg och antalet knoppar använda för äggläggning (äggläggande ho- nor) var signifikant lägre på Con A-behandlade blomställ- ningar (Tabell 3; analyserat med t-test). Ingen av va- riablerna skilde signifikant vid jämförelse mellan kon- troll och potatislektin-exponerade honor. 512 197 12 Tabell 3 Ågglàggning och ätande hos honor som utsatts för behand- lade födoknoppar och stàndare. Medelsumman per hona över 14 dygn. Kontrollbehandling = lösningsmedel (0,l% Tween i vatten); potatislektin, Con A = 10% lektin i lös- ningsmedel 0 = p<0,05 n Antal Antal Antal Antal Honvikts- ägg knoppar knoppar stàndare förändr- med ägg som som ingar ätits âtits (pg) Alla honor Kontroll 6 10,0 5,2 12,7 1,0 96 Potatis 7 4,9 2,7 10,1 1,7 -34 Åggl. honor Kontroll 4 15,0 7,7 16,7 1,2 -117 Potatis 3 11,3 6,3 9,0 1,7 -110 .Alla hmm; Kontroll 9 15,6 7,2 14,6 2,6 74 Con A 8 4,4 2,6 7,5* 2,4 136 Ågs.l_-_ honor Kontroll 7 20,0 9,3 16,0 2,7 57 Con A 6 5,8* 3,5* 7,8 2,2 166 512 197 13 EXEMPEL lb Utfodringsförsök med vuxna Phyllotreta spp.

Vuxna Phyllotreta spp. lockades till hjärtblad av raps (sort Katarina) som växte pà brickor placerade utomhus pà marken. Fràn dessa samlades skalbaggar med en exhaustor. De levande baggarna sorterades med avseende pà art och överfördes slumpvis till en av de tvâ behand- lingarna, dvs kontroll eller Con A. I försöket hölls de vuxna djuren ett och ett i plastpetri-skàlar med en dia- meter av 9 cm pà fuktigt filtrerpapper i klimatkammare under samma förhållanden som M1 aeneus. Petriskàlarna med Phyllotreta placerades pà fuktig sand pà plastbrickor (41 x 62 x 11 cm) med de två behandlingarna slumpvis placera- de. Var tredje dag erhöll baggarna ett färskt hjärtblad fràn vàrraps (sort Katarina) målat pá båda sidor med an- tingen 10% Con A eller kontrollösningen av vatten med 0,1% Tween 20 som detergent. Ãtskadorna pä de fyra hjärt- bladen som exponerats för skalbaggarna under l2-dygnspe- rioden registrerades liksom deras slutvikt och överlev- nadsgrad.

Resultat Hos samtliga tre Phyllotreta spp. resulterade Con A- behandlingen i signifikant mindre skador pà bladen (Ta- bell 4: t-test) Hos P. undulata, den dominerade Phyllo- treta-arten i svensk vàrraps, var också medelvikten hos Con A-matade baggar signifikant lägre än hos kontroller- na. Överlevnadsgraden skilde sig inte àt mellan de tvà behandlingarna. min M maa; n, ~M.._....~.:..n.,,,, ...tu WH' :- fiivu 1"' lO 512' 197 14 Tabell 4 Ãtande och kroppsvikt hos Phyllotreta spp. som erhållit hjärtblad behandlade med Con A-(10%) eller kontrollösning (0,1% Tween i vatten). Medelsummorna av bladyta konsu- merad per bagge och skalbaggsvikt efter 12 dygns behand- ling.

H = p Behandling n Bladyta (mm) Slutvikt (pg) P. undulata: Kontroll 22 35,0 1014 Con A 9,0*** 868** P. vitata: Kontroll 15 26,0 766 Con A l8 l4,2*** 732 P. nigripes: Kontroll 18 24,3 986 Con A 18 l6,2** 940 SLUTSATSER Slutsatserna fràn dessa försök med larver och vuxna M1 aeneus, P. undulata, P. nigripes och P. vitata är pri- märt att Con A och ärtlektin är lektiner potentiellt an- vändbara som resistensfaktorer i transgen Brassica. Följ- aktligen isolerades dessa fràn Canavalia ensiformis och Pisum sativum.

Exempel 2 Genisolering. mutation. kloning och transformation med Con A-gen Genisolering Canavalia ensiformis-plantor odlades från frö (Sigma Chemical Co.), och fràn frön under utveckling (200 mg) renades mRNA fram med användning av Quick Prep micro mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige).

Första strängs cDNA framställdes fràn detta mRNA med om- vänd transkription med användning av oligo dT och blanda- S12 197 de hexamerer. Detta förökades ytterligare med PCR med följande primrar som utformades i enlighet med en publi- cerad sekvens enligt Carrington et al. 1985, med inklu- dering av ett EcoRI- respektive ett PstI-klyvningssite, '-TCA GAA TTC GTA GCA AGC AGC-3' och 5'-GAC CTG CAG TGG ATT ACA CAG C -3'. Ett DNA-fragment motsvarande nukleo- tiderna l-9§6 i den publicerade sekvensen erhölls med PCR med användning av dessa primers. PCR-reaktionen genomför- des med Pwo DNA polymeras (Boehringer Mannheim GmbH, Tyskland). Det fórökade fragmentet insattes i EcoRI och PstI i pBluescript SK-(Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Fragmentet subklonades och sekvenserades (Fig. 3). Den isolerade sekvensen skilde sig fràn den publicerade i 7 positioner. Plasmiden med Con A-genen i pBluescript be- tecknas pConA. Con Azs aminosyrasekvens visas i Pig. 4.

Mutation Con A-proteinet processas posttranskriptionellt pà ett mycket unikt sätt. Glykosylering uppträder vid ami- nosyra 152 (asparagin), men för att lektinet skall bli aktivt mäste denna glykosylering avlägsnas igen. Dä det är osäkert om enzymerna som svarar för denna deglykosy- lering finns i raps, producerades en muterad version av Con A-genen. Mutationen infördes medelst PCR i den full- ständiga pConA med användning av Tth DNA-polymeras (Clonetech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA, USA) för PCR-reaktionen. Ett PCR-primerpar användes där den bakre primern skiftade en AAT-triplett till TCT och samtidigt skapades ett BglII-site: 5'- TAG TGG TTC CAC TGG AAG G-3' och 5'- GGA AGA ECT GAT AAC ATT TGC -3'. protein i vilket asparagin 152 skiftas mot en serin och Detta ger ett sålunda bryts glykosyleringssignalen. BglII-sitet använ- des för klyvning och sammanfogning av den muterade pConA, vilken sedan benämndes pConAmut. Den muterade Con A-genen sekvenserades och den införda mutationen bekräftades (Fig. 5). Förutom den förväntade mutationen infördes yt- terligare en basförändring med PCR-reaktionen men denna förändrar inte aminosyrasekvensen (Fig. 6). 512 197 16 Nukleotidsekvensen hos den sålunda muterade Con A bestämdes vara 'ATGGCCATCTCAAAGAAATCCTCCCTGTTCCTTCCTATATTTACGTTCATCACCATGT TCCTAATGGTAGTGAACAAGGTGAGTTCATCAACACATGAGACAAATGCACTCCATTT CATGTTCAACCAATTTAGçAAAGATCAGAAGGATTTGATCCTTCAAGGTGACGCCACG ACAGGAACAGATGGTAACTTGGAACTCACAAGGGTGTCAAGTAATGGGAGTCCACAGG GAAGCAGTGTGGGCCGGGCTTTGTTCTATGCCCCAGTCCACATTTGGGAAAGTTCTGC TGTGGTGGCAAGCTTTGAAGCTACCTTTACATTTCTCATAAAATCACCCGACTCTCAC CCAGCTGATGGAATTGCCTTCTTCATTTCAAATATTGACAGTTCCATCCCTAGTGGTT CCACTGGAAGGCTCCTTGGACTCTTCCCTGATGCAAATGTTATCAGATCTTCCACTAC TATTGATTTCAACGCTGCTTACAATGCCGATACTATTGTTGCTGTTGAATTGGATACC TATCCCAATACTGATATTGGAGATCCAAGTTATCCACACATCGGTATCGATATTAAAT CTGTTCGCTCCAAGAAGACCGCAAAGTGGAACATGCAAAATGGAAAGGTAGGCACTGC ACACATCATCTATAACTCTGTTGATAAGAGACTAAGTGCTGTTGTTTCTTATCCTAAC GCTGACTCTGCCACTGTCTCTTACGACGTTGACCTCGACAATGTCCTTCCTGAATGGG TTAGAGTTGGCCTTTCTGCTTCAACCGGACTTTACAAAGAAACCAATAÖCATTCTCTC ATGGTCTTTTACTTCTAAGTTGAAGAGCAATGAGATCCCGGACATTGCTACCGTGGTT vilken kodar för en aminosyrasekvens MetAlaIleSerLysLysSerSerLeuPheLeuProIlePheThrPheIleThrMet PheLeuMetVa1Va1AsnLysValSerSerSerThrHisGluThrAsnAlaLeuHis PheMetPheAsnGlnPheSerLysAspGlnLysAspLeuIleLeuGlnGlyAspA1a ThrThrGlyTHrAspGlyAsnLeuGluLeuThrArgValSerSerAsnGlySerPro GlnGlySerSerValG1yArgAlafleuPheTyrAlaProValHisIleTrpGluSer SerAlaValValAlaSerPheGluAlaThrPheThrPheLeuIleLysSerProAsp SerHisProAlaAspGlyI1eA1aPhePheIleSerAsnIleAspSerSerIlePro SerGlySerThrG1yArgLeuLeuGlyLeuPheProAspAlaAsnValIleArg§g; seftrhrrhrïlezasppheAsnAl aAl awyrAsnAl aAspwhrzlevalAlavalclu LeuAspThrTyrProAsnThrAspIleGlyAspProSerTyrProHisI1eG1yIle AsplleLysSerValArgSerLysßysThrAlaLysTrpAsnMetGlnAsnGlyLys ValGlyThrAlaHisIleI1eTyrAsnSerVa1AspLysArgLefiSerAlaVaïVal SerTyrProAsnAlaAspSerAlaThrVa1SerTyrAspValAspLeuAspAsnVa1 LeuProG1uTrpValArgValGlyLeuSerAlaSerThrG1yLeuTyrLysGluThr AsnThrI1eLeuSerTrpSerPheThrSerLysLeuLysSerAsnGluIleProAsp IleA1aThrValVal, 512 197 17 där mutationen i nukleotidsekvensen har indikerats med feta bokstäver och mutationen i motsvarande aminosyra- sekvens har markerats med en understruken Ser (serin).

Konstruktion av transformationsvektorer (jfr. Fig. 7) pConA och pConAmut klövs med KpnI och NcoI. BnSD- promotorn frán Brassica napus togs ut från pBSBnSD2.1-GUS (vänligen erhållen från Dr D J Murphy, John Innes Centre, Norwich, UK) med samma enzymer och ligerades framför Con A/ConAmut-genen. Den kombinerade BnSD-promotorn - Con A/ConAmut-genen klipptes ut med XbaI och ligerades till XbaI-sitet i pPTV-pA. pPTV-pA är ett derivat av den bi- nära vektorn pGPTV-kan (Becker et al. 1992) i vilken GUS- genen har ersatts av polylinkern fràn pUCl9. Plasmiderna med korrekt genorientering, som resulterade fràn dessa ligeringar, benämndes pIns:3 innehållande Con A-genen och pIns:4 innehållande ConAmut-genen.

Transformation av Aqrobacterium Agrobacterium tumefaciens, stam LBA4404, transforme- rades med pIns:3 och pIns:4 genom direkt transformation av kompetenta celler. Närvaron av den binära vektorn ve- rifierades med plasmid-DNA-preparation och dess restrik- tionsenzyms-klyvningsmönster efter agaros-gel-elektro- fores.

Transformation av växtmaterial Fyra dygn gamla fröplantor av vàrraps, sort Westar, användes som källa för transformation av växtvävnad. I transformationsmetoden som användes (Moloney 1989, med mindre modifieringar) doppades bladskaften på hjärtbladen i en lösning med Agrobacterium tumefaciens och därefter överfördes de till en samodlingsplatta. Efter 2-3 dygns samodling dödades bakterierna genom överföring av växt- vävnaden till ett odlingssubstrat med 500 mg/1 carbeni- cillum och 25 mg/l kanamycin för selektion av transforme- rade celler. Efter 4 till 10 veckor utvecklades gröna skott från de snittade ändarna pà hjärtbladen. Dessa gröna skott överfördes till ett skottodlingssubstrat och M www mwfiwfi 512 197 18 testades med avseende pà framgångsrik transformation med en PCR-baserad metod. - PCR~test Total-DNA bereddes från 5 mmßïbladskivor. Ett PCR- test genomfördes med användning av primrarna '-CAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3' och '-AGCAAGGTGAGATGACAGGAAGATC-3', som förökar ett fragment med ca 300 baser i NPTII-genen av pPTV-pA. Närvaron av fragmentet analyserades med agarosgel-elektrofores.

Isolering av ärtlektin-gen Total-DNA från blad av ärta, sort Lincoln, extrahe- rades med DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland). Från detta DNA isolerades ärtlektin-genen med PCR med användning av primrarna 5'- CAT GAA TTC AAC CGA ACA ACC TCG AAG-3' och 5'-GGG TCG ACA ACA AGG TGT CTC TGC CC-3'. Primrarna valdes utifrân en publicerad sekvens (Hoedemaeker et al. 1994) med ett EcoRI- respektive Sall- site inkorporerade. Pwo DNA polymeras användes till PCR- -reaktionen. Det isolerade PCR-fragmentet ligerades i EcoRI och SalI i pBluescript SK-. Fragmentet subklonades och sekvenserades (Fig. 8). Sekvensen av den isolerade genen var identisk med den publicerade. Lektinet identi- fieras av aminosyrasekvensen visad i fig. 9.

EXEMPEL 3 M. aeneus-larver matade med genetiskt modifierad raps Följande försök med transformerade växter var identiska med försöken dà larver matades med stàndare doppade i proteinlösningar med undantag för att ingen behandling av stàndarna var nödvändig i detta fall.

Larvvikterna pà en av tre transformanter var signifikant lägre än på kontrollen, testad med ANOVA följt av Scheffê's test. 512 197 19 Tabell/5 - Medelvikter av rapsbaggelarver efter 7 dygns uppfödning på stándare fràn rapssort Westar jämfört med efter upp- födning pà Westar transformerad med Con A (R9)- eller ConAmut (R10)-genen. Medelvärden som följs av samma bok- stav år inte signifikant skilda àt i Scheffé's test. n = initialt antal larver per behandling. n Kontroll Växt nr Växt nr Växt nr Westar R9-845 RlO-868 RlO-877 36 O,756b O,789b O,62la O,760b 512 197 Referenser - Åhman, I. 1993. A search for resistance to insects in spring oilseed rape. OPBC/WPRS Bulletin 16(5):36-46.

- Becker, D., Kemper, E., Schell, J. & Masterson, R. 1992. New plant binary vectors with selecable markers located proximal to the left T_DNA border. Plant Mol.

Biol. 20:ll95-1197.

- Carrington, D.M., Auffret, A. & Hanke, D.E. 1985.

Polypeptide ligation occurs during post-translational modification of Concanavalin A. Nature 313:64-67.

- Czapla, T.H. & Lang, B.A. 1990. Effect of plant lectins on the larval development of European corn borer (Lepi- doptera: Pyralidae) and Southern corn rootworm (Coleop- tera: Chrysomelidae). J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485.

- Eismann, C.H., Donaldsson, R.A., Pearson, R.D., Cadogan, L.C., Vuocolo, T. & Tellam, R.L. 1994. Larvi- cidal activity of lectins on Lucilia cuprina: mechanism of action. Entomol. Exp. appl. 72: 1-10.

- Harper, S.M., Crenshaw, R.W., Mullins, M.A. & Privalle, L.S. 1995. Lectin binding to insect brush border membra- nes. J. Econ. Entomol. 88: 1197-1202 - Hoedemaeker, F.J., Richardson, M., Diaz, C.L., de Pater, B.S. & Kijne, J.W. 1994. Pea (Pisum sativum L.) seed isolectins 1 and 2 and pea root lectin result from carboxypeptidase-like processing of a single gene pro- duct. Plant Mol. Biol. 24(1): 75-81.

- Liener, I.E., Sharon, N. & Goldstein, I.J. 1986. The lectins: properties, functions and applications in bio- logy and medicine. Academic Press, Orlando, Florida, 600 PP- - Matsumoto, I., Jimbo, A., Mizuno, Y. & Seno, N. 1983.

Purification and Characterization of potato lectin. J.

Biol. Chem. 258: 2886-2891.

- Moloney, M.M., Walker, J.M. & Sharma, K.K. 1989. High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Rep. 8: 238-242. 512 197 21 (forts) 1987. by pollen beetles (Meligethes spp.) Swedish J. Agric.

Res. 17: 105-lll.

- Peumans, W.J. & Van Damme, E.J.M. 1995.

Plant Physiol. lO9:347-352.

Febvay, G., Referenser, - Nilsson, C. Yield losses in summer rape caused Lectins as defence proteins.

- Rabhë, Y., W.J. & Gatehouse, A.M.R. 1995. Toxicity of lectins and pro- Sauvion, N., Peumans, cessing of ingested proteins in the pea aphid Acyrt- hosiphon pisum. Entomol. Exp. appl. 76:l43-155. iiiiil 512 197 22 Figurhänvisningar Fig. 1. Överlevnadsgrader hos Meligethes-larver matade med stàndare doppade i 10%-iga lösningar av växtlektiner jämfört med lösningsmedlet.

Fig. 2a. Överlevnadsgrader hos Meligethes-larver matade med stàndare doppade i 10%-ig lösning av ärtlektin jämfört med Con A- och lösningsmedelsbehandlade stàndare.

Dessutom förelåg en behandling där larver hade ett val mellan en Con A-behandlad och en lösningsmedelsbehandlad stàndare.

Fig. 2b. Överlevnadsgrader för Meligethes-larver matade med stándare doppade i 1%-ig lösning av ärtlektin jämfört med Con A- och lösningsmedelsbehandlade stàndare.

Fig. 3. Sekvensen för isolerad Con A-gen. Start- och stoppkodoner är understrukna.

Fig. 4. Aminosyrasekvensen för Con A-lektin.

Fig. 5. Sekvensen för muterad Con A-gen. Start- och stoppkodoner är understrukna och den införda mutationen markerad med fetstil.

Pig. 6. Aminosyrasekvensen för modifierat Con A- -lektin.

Fig. 7. Konstruktion av pIns:3 och pIns:4. Con A = Con A-gen, ConAmut = ConAmut-gen, BnSD-P = BnSD-promotor, nos-P = nopalinsyntaspromotor, NPT II = neomycinfosfo- transferas II för kanamycinresistens, pA = polyA-sekvens, RB = höger gräns, LB = vänster gräns och Kan = bakteríell kanamycinresistens.

Fig. 8. Sekvensen för isolerad ärtlektingen. Start- och stoppkodoner är understrukna.

Pig. 9. Aminosyrasekvensen för årtlektin.

SEKVENSLISTA: '12 SEQ. 1597 Ål ID. NO.l Nukleinsyrasekvens för Con A-lektin LÅNGD= 873 TYP: nukleinsyra TOPOLOGI: ¿1gGccATcT cAccATGTTc CAAATGCACT TTGATCCTTC CACAAGGGTG CTTTGTTCTA AGCTTTGAAG AGCTGATGGA GTGGTTCCAC AGAAATTCCA TGTTGCTGTT GTTATCCACA GCAAAGTGGA TAACTCTGTT AcTcTGccAc TGGGTTAGAG TAccATTcTc CGGACATTGC linjàr CAAAGAAATC CTAATGGTAG CCATTTCATG AAGGTGACGC TCAAGTAATG TGCCCCAGTC CTACCTTTAC ATTGCCTTCT TGGAAGGCTC CTACTATTGA GAATTGGATA CATCGGTATC ACATGCAAAA GATAAGAGAC TGTCTCTTAC TTGGCCTTTC TCATGGTCTT TACCGTGGTT cTcccTGTTc TGAACAAGGT TTCAACCAAT CACAACAGGA GGAGTCCACA CACATTTGGG ATTTQTCATA TCATTTCAAA CTTGGACTCT TTTCAACGCT ccrATcccAA GATATTAAAT TGGAAAGGTA TAAGTGCTGT GACGTTGACC TGCTTCAACC TTACTTCTAA Išè CTTCCTATAT GAGTTCATCA TTAGCAAAGA ACAGATGGTA GGGAAGCAGT AAAGTTcTGc AAATcAcccG TATTGACAGT TCCCTGATGC GCTTACAATG TACTGATATT cTGTTcGcTc GGcAcTccAc TGTTTCTTAT TCGACAATGT GGACTTTACA GTTGAAGAGC TTACGTTCAT ACACATGAGA TCAGAAGGAT ACTTGGAACT GTGGGCCGGG TGTGGTGGCA ACTCTCACCC TCCATCCCTA AAATGTTATC CCGATACTAT GGAGATCCAA CAAGAAGACC ACATCATCTA CCTAACGCTG CCTTCCTGAA AAGAAACCAA AATGQGATCC "did nl! ii i» w Ill! SEKVENSLISTA: 512 197 SEQ.

Ur ID. No. 2 Nukleinsyra för muterad Con A-lektingen LÅNGD= 873 TYP: nukleinsyra TOPOLOGI: g1§GccATcT cAccATGTTc cAAATGcAcT TTGATCCTTC CACAAGGGTG CTTTGTTCTA AGCTTTGAAG AGCTGATGGA GTGGTTccAc AGAEQTTCCA TGTTGCTGTT GTTATCCACA GCAAAGTGGA TAACTCTGTT AcTcTeccAc TGGGTTAGAG TAccATTcTc CGGACATTGC linjär CAAAGAAATC CTAATGGTAG CCATTTCATG AAGGTGACGC TCAAGTAATG TGCCCCAGTC CTACCTTTAC ATTGCCTTCT TGGAAGGCTC CTACTATTGA GAATTGGATA CATCGGTATC ACATGCAAAA GATAAGAGAC TGTCTCTTAC TTGGCCTTTC TCATGGTCTT TACCGTGGTT CTCCCTGTTC TGAACAAGGT TTCAACCAAT CACGACAGGA GGAGTCCACA CACATTTGGG ATTTCTCATA TCATTTCAAA CTTGGACTCT TTTCAACGCT ccTATcccAA GATATTAAAT TGGAAAGGTA TAAGTGCTGT GACGTTGACC TGCTTCAACC TTACTTCTAA Išê CTTCCTATAT GAGTTCATCA TTAGCAAAGA ACAGATGGTA GGGAAGCAGT AAAGTTCTGC AAATCACCCG TATTGACAGT TCCCTGATGC GCTTACAATG TACTGATATT CTGTTCGCTC GGCACTGCAC TGTTTCTTAT TCGACAATGT GGACTTTACA GTTGAAGAGC TTACGTTCAT ACACATGAGA TCAGAAGGAT ACTTGGAACT GTGGGCCGGG TGTGGTGGCA AcTcTcAccc TccATcccTA AAATGTTATC CCGATACTAT GGAGATCCAA CAAGAAGACC ACATCATCTA CCTAACGCTG CCTTCCTGAA AAGAQACCAA AATGAGATCC SEKVENSLISTA: SEQ. 12 197 ÄÉ> In. 3 Nukleinsyrasekvens för isolerad ärtlektingen - LÅNGD= 828 TYP: nukleinsyra TOPOLOGI: gggscrrcrc CATTCTCTTA cTTccTTcTT CAAGGAGATG AAAGAAcAcT ATAGAGAAAC ATAAATGCAC CGCACCTGTA TcAATAccGc GACACTTTCT TGGAATCGAT TGCAGAATGG AATGTGTTAA TGTAACTAGT CTGAGTGGGT GCACATGAAG GTICTAAG linjär TTcAAAcccA AcAAcAATcc áATcAccAAG GcTATAccAc GTTGGCAGAG AGGCAACGTT CCAACAGTTA GATACTAAGC AGAGTATGAT ATAATGCTGC GTGAACAGTA TGAAGAGGCT CTGTTAGTTT TATACTCTTA AAGGATTGGT TTCTTTCATG CAAGCTGCAG AATGATCTCG TTTTCTTCAA TTcAGccccG AAAAGAGAAG cccTcTATTc GCTAATTTTG cAAcGTTGcc CGCAGACCGG AAAAccAcTc ATGGGATCCA TCAAATCCGT AATGTTGTGA GAccTATccT GCGACGTTGT TTCTCAGCTA GTCTTTTCAT ATGcAgg§ TTCTATGCGA GGTGAACTCA ACCAACAAAA CTGACACTGA CTCACCTATC TAACTTCCTT GACGGGTTTA CGGTGGATAT AAACTGTTGC AGCAACAGAG AAACACTAAG TAGCTTTTAA AATTCACTTG GTCTTTGAAG CCACAGGAGC TCTGAGTTGA TATTTCTATC ACTGAAACCA ccTAATcTTc CCAAGGCAGT CATATCTGGG CACTTTTGTC CGTTCTTCAT CTCGGAGTTT TGTGGAGTTT ATAGACATAT TCGTGGAAGT TGCTGCTACT AGGAAGAGAA GATGTTGTTC AGAATATGCA GTGQAACTTC 512 197 Zv SEKVENSLISTA: SEQ. ID. No. 4 Aminosyrasekvens för Con A LÄNGD= 290 TYP: aminosyra TOPOLOGI: linjär MOLEKYL: protein Met Ala Ile Ser Lys Lys Ser Ser 1 5 Thr Phe Ile Thr Met Phe Leu Met I 20 Ser Ser Thr His Glu Thr Asn Ala - 35 Gln Phe Ser Lys Asp Gln Lys Asp 45 50 Ala Thr Thr Gly Thr Asp Gly Asn 60 Ser Ser Asn Gly Ser Pro Gln Gly 75 Leu Phe Tyr Ala Pro Val His Ile 85 90 Val Ala Ser Phe Glu Ala Thr Phe 100 105 Pro Asp Ser His Pro Ala Asp Gly 115 120 Asn Ile Asp Ser Ser Ile Pro Ser 130 Leu Gly Leu Phe Pro Asp Ala Asn 145 Phe Asn Ala Ala Tyr 160 Thr 155 Ile Asp Ala Val Glu Leu Asp Thr Tyr Pro 170 175 14811 Val Leu Leu Leu 65 Ser Trp Thr Ile Gly 135 Val Asn Asn Phe Val His Ile Glu Ser 80 Glu Phe Ala Ser Ile 150 Ala Thr Leu Asn Phe LSU.

Leu Val Ser 95 Leu Phe Thr Arg Asp 165 Asp Pro Lys Met Gln Thr Gly Ser Ile 110 Phe Gly Ile Val Phe Gly 55 Ars Arg Ala Thr Ile 180 Ile Gly Phe Ser Asn Asp Val 70 Ala Val Ser Ser Leu 140 Thr Val Asp SEQ .

Pro Ser Ser 225 Ser Arg Asn Asn ID.

Ser Lys Thr Ala Tyr 240 Val Thr Glu No. 185 Lys Ala Val Asp Gly 255 Ile Ile PIO Thr 200 His Val Val Leu Leu 270 Pro 512197 (forts) His Ala Ile 215 Ser Asp Ser Ser Asp 285 Ile Lys Ile Tyr 230 Leu Ala Trp Ile Gly TIP Tyr Pro Asp 245 Ser Ser Ala Å? Ile 190 Asn Asn Asn Asn Thr 260 Phe Thr Asp Met 205 Ser Ala Val Ile Gln Val 220 Asp Leu Leu Ser Val 290 Lys Asn Asp Ser 235 Pro Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Glu 250 Lys Leu Val 195 Lys Arg Thr Trp Glu 265 Lys Arg Val 210 Leu Val Val Thr Ser 280 null i i v' r :ifia n :H 5012 197 Lfš SEKVENSLISTA: SEQ. ID. No. 5 Aminosyrasekvens för modifierat LÅNGD= 290 TYP: aminosyra ToPoLoGI= linjär MOLEKYL: protein Met 1 Thr Ser Gln Ala Ser Leu 85 Val PIO ASU Leu Thr 155 Ala Ala Phe Ile Ser Thr Phe Ser 45 Thr Thr Ser Asn Phe Tyr Ala 100 Ser Asp Ser 115 Ile Asp Gly Leu Ile Asp Val Glu 170 Thr His Lys Gly 60 Gly Ala Phe His Ser 130 Phe Phe Leu Ile Ser Lys Met Glu Asp Thr Ser 75 PIO Glu Pro Ser Pro 145 Asn Asp Lys Phe Thr Gln Asp PIO Val 90 Ala Ala Ile Asp Ala 160 Thr Ser Leu Asn Lys Gly Gln His Thr 105 Asp Pro Ala Ala Tyr 175 Ser Met Ala Asp 50 Asn Gly Ile Phe Gly 120 Ser Asn Tyr PIO "jack bean”-lektin Leu Val Leu Leu Leu 65 Ser Trp Thr Ile Gly 135 Val Asn Asn Phe Val His Ile Glu Ser 80 Glu Phe Ala Ser Ile 150 Ala Thr Leu Asn Phe Leu Leu Val Ser 95 Leu Phe Thr Arg Asp 165 Asp Pro Lys Met 40 Gln Thr Gly Ser Ile 110 Phe U) H |m Thr Ile 180 Ile Val Phe Gly 55 Arg Arg Ala Lys Ile 125 Arg Ser Ile Phe Ser Asn Asp Val 70 Ala Val Ser Ser Leu 140 Thr Val Asp SEQ.

Pro Ser SSI' 225 Ser Arg Asn Asn ID.

Ser No.

Tyr - 185 Lys Thr Ala Tyr 240 Val Thr Glu Lys Ala Val Asp Gly 255 Ile Ile 512 197 (forts.) Pro His Thr 200 Ala Ile 215 His Val Ser Val Asp Leu Ser Leu Ser 270 Pro Asp 285 Ile Lys Ile Tyr 230 LSU Ala TIP Ile Gly Trp Tyr Pro Asp 245 Ser Ser Ala ZP! Ile 190 Asn Asn Asn Asn Thr 260 Phe Thr Asp Met 205 Ser Ala Val Gly Thr 275 Val Ile Lys Gln Asn Val Asp 220 Asp Ser 235 Leu Pro Leu Tyr Ser Lys Val 290 Ser Gly Lys Ala Glu 250 Lys Leu Val 195 Lys AIS Thr Trp Glu 265 Arg Val 210 Leu Val Val Thr Ser 280 niii i |í u :Ii 512197 §C> sEKvENsLIsTA= SEQ. ID- NO- 6 Aminsosyrasekvens för ärtlektin LÅNGD= 275 TYP: aminsosyra TOPOLOGI: linjär MOLEKYL: protein Met Ala Ser Leu Gln Thr Glfi Met 1 5 Phe Ile 20 Ser Thr Glu Thr Thr Ser Phe . 35 Pro Asp Gln Gln Asn Leu Ile Phe 45 50 Glu Lys Leu Thr Leu Thr Leu Ser Leu Leu Thr Thr Asn Thr Lys 60 Val Gly Arg Ala Leu Tyr Ser Ser 75 Arg Glu Thr Gly Asn Val Ala Asn 85 90 Phe Val 100 Thr Ile Asn Ala Pro Asn Ser 105 Pro Val 120 Phe Phe Phe Ile Ala 115 Gly Gly Gly Tyr Leu Gly Val 130 Thr Thr Gln Thr Val 145 Phe Lys Ala Val Pro Ser Asn 160 Asn Ala Ala Trp Asp 155 Ser Ile Lys 175 Ile Asp Val Asn Ser 170 Ile Ile Leu Gln Lys 65 Pro Phe Tyr Asp Asn 135 Glu Arg Val Ser Leu Ile Gly Ala Ile 80 Val Asn Thr Ser Phe 150 Asp Asn Phe Phe Thr Asp Val His Thr 95 Val Lys Ala Asp 165 Thr Tyr Phe Lys 40 Gly Lys Ile Ser Ala 110 Pro Glu Thr His Lys 180 Ala Lys Phe Tyr 55 ÅSD.

Trp Phe Asp Gln 125 Tyr Phe Ile Ser Ile Val Ser Thr Thr 70 Asp Thr Gly Thr Asp 140 Tyr l5 SEQ.

Lys Asn Asn Asp 225 Ile Glu Ser ID. NO.

Leu Gln - 185 Ala Ser Val Gly 240 Val Ser Ala Leu Val Phe Leu 255 Ser 6 Asn Thr 200 Glu Ser Ser Ser Lys 270 512 197 (forts.) Gly Glu Glu Asn Glu 215 LEU Ala TIP Gln Val Glu Lys 230 Thr Ser Ala Leu Asn Asp Thr 245 Phe Ala S! Ala 190 Thr Val Val Gly His 260 Asp Asn Val 205 Thr Val Ala Ser Ala 275 Val Ser Ser 220 Pro Glu Glu Val Leu Tyr Glu 235 Tyr Leu Ile Thr Thr TIP Ala 250 Ser Ala 195 Tyr Leu Val Ala Gly 265 Phe Pro 210 Ser His Thr

Claims (21)

i. I! 10 15 20 25 30 35 512 12% PATENTKRAV

1. Transgen Brassica-växt som är resistent mot Bras- sica-angripande skadeinsekter valda ur den grupp som be- står av släktena Meligethes, Phyllotreta och Delia, vil- ken transgena Brassica-växt i sitt genom omfattar åtmin- stone en DNA-sekvens som kodar för ett främmande lektin som hämmar nämnda skadeinsekter, vilket främmande lektin är valt från den grupp som består av ”jack bean”-lektin (Concanavalin A), modifierat ”jack bean”-lektin (modifie- rat Concanavalin A), ärtlektin, vetegroddslektin, pota- tislektin och jordnötslektin, eller insekticida varianter eller kombinationer därav, tillsammans med en promotor som är aktiv i nämnda Brassica-växt.

2. Transgen Brassica-växt enligt krav 1, vari lek- tinet är ett "jack bean”-lektin (modifierat Concanavalin A) eller en insekticid variant därav.

3. Transgen Brassica-växt enligt krav 1, vari lek- tinet är ett modifierat "jack bean”-lektin eller en insekticid variant därav.

4. Transgen Brassica-växt enligt krav l, vari lek- tinet är ärtlektin eller en insekticid variant därav.

5. Transgen Brassica-växt enligt krav ett eller flera av kraven 1-4, vari ”jack bean”-lektin, det modi- fierade ”jack bean”-lektinet och/eller ärtlektin före- ligger i kombination med ett eller flera av vetegrodds- lektin, potatislektin och jordnötslektin, eller en insek- ticid variant av något av dessa.

6. Förökat växtmaterial från den transgena Brassica- växten som definieras i något av kraven 1-5, härlett genom kloning, självbefruktning och/eller hybridisering i en eller flera generationer.

7. Expressionskassett omfattande en DNA-klon, som kodar för åtminstone ett lektin som hämmar Brassica-an- gripande skadeinsekter valda ur den grupp som består av släktena Meligethes, Phyllotreta och Delia, vilket lektin är valt ur gruppen ”jack bean”-lektin, modifierat ”jack lO 15 20 25 30 35 5712 '197 ESS bean”-lektin, ärtlektin, vetegroddslektin, potatislektin eller insekticida varianter eller funktionellt bundna till reglerande och jordnötslektin, kombinationer därav, sekvenser hos växter som uttrycker åtminstone ett av nämnda lektiner i knoppar, pollen, hjärtblad och/eller rötter av Brassica, vilka medför uttryck av DNA-klonen i celler hos Brassica-arter.

8. Expressionskassett enligt krav 7, vari lektinet är Concanavalin A eller en insekticid variant därav.

9. Expressionskassett enligt krav 7, vari lektinet år modifierat Concanavalin A eller en insekticid variant därav.

10. Expressionskassett enligt krav 7, vari lektinet är ett ärt(Pisum sativum)-lektin eller en insekticid variant därav.

11. ll. Expressionskassett enligt krav 7, vari ”jack bean”-lektin, det modifierade ”jack bean”-lektinet och/eller ärtlektin eller en insekticid variant därav är kombinerat med ett eller flera av vetegroddslektin, potatislektin och jordnötslektin eller en insekticid variant av något av dessa.

12. Transgena växtceller innehållande som främmande DNA minst en kopia av DNA-sekvensen i en expressions- kassett enligt ett eller flera av kraven 7-11.

13. Lektin med insekticid verkan mot skadeinsekter, valda ur gruppen bestående av släktena Meligethes, Phyllotreta och Delia, i plantor av Brassica-arter och omfattande aminosyrasekvensen som visas i SEQ ID NO: 5 eller en insekticid variant därav.

14. Förfarande för skydd av en Brassica-växt mot angrepp av skadeinsekter valda ur den grupp som består av släktena Meligethes, Phyllotreta och Delia, omfattande införande i genomet hos Brassica-växten av åtminstone en DNA-sekvens som kodar för åtminstone ett främmande lektin som är inhiberande för nämnda skadeinsekter, vilket lek- tin är valt ur den grupp som består av ”jack bean”-lektin (Concanavalin A), modifierat ”jack bean”-lektin (modi- 10 15 20 25 30 35 512 197 34 fierat Concanavalin A), ärtlektin, vetegroddslektin, potatislektin och jordnötslektin eller insekticida varianter eller kombinationer av något av dessa, till- sammans med en promotor som är aktiv i Brassica-växten.

15. Förfarande enligt krav 14, vari lektinet är Concanavalin A eller en insekticid variant därav.

16. Förfarande enligt krav 14, vari lektinet är mo- difierat Concanavalin A eller en insekticid variant där- av.

17. Förfarande enligt krav 14, vari lektinet är ärt (Pisum sativum)-lektin eller en insekticid variant därav.

18. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 14-17, varvid ytterligare minst en DNA-sekvens införes, vilken kodar för ett eller flera lektiner valda ur den grupp som består av vetegroddslektin, potatislektin och jordnötslektin eller insekticida varianter av något av dessa.

19. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 14-18, omfattande stegen a) val av en Brassica-art, b) odling av celler eller vävnad från nämnda växtart, c)införande i cellerna i växtcell- eller vävnadsodlingen av åtminstone en kopia av expressionskassetten defi- nierad i något av kraven 7-11 omfattande en sekvens som kodar för lektinet, varianten eller kombinationen av lektiner, och d) regenerering av resistenta hela plantor från cell- eller vävnadsodlingen.

20. Förfarande enligt något av kraven 14, 16, 18 och 19, varvid DNA-sekvensen omfattar nukleotidsekvensen som visas i SEQ ID Nr: 2 och som kodar för modifierat "jack bean"-lektin (modifierat Concanavalin A).

21. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 14-20, vilket omfattar det ytterligare steget att föröka växtmaterialet genom kloning, självbefruktning och/eller hybridisering i en eller flera generationer på ett sådant 512 197 ší sätt att åtminstone en kopia av sekvensen given i expres- sionskassetten föreligger i cellerna hos avkomman.