JP2001503972A

JP2001503972A - 線虫抵抗性遺伝子

Info

Publication number: JP2001503972A
Application number: JP51429898A
Authority: JP
Inventors: クライネ，ミカエル; チャイ，タクァン; ユング，クリスチャン
Original assignee: ユング，クリスチャン; マルカー，カー．，アー．; ディークマン，ヨハネス; プランタアンゲヴァンテプフランツェンゲネティックウントビオテクノロジーゲーエムベーハー; ダニスコバイオテクノロジー; ディーエルオー―セントラムフォープランテンフェレデリングス―エンリプロダクティエオンダーゾーク（シピーアールオー―ディーエルオー）
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2001-03-27
Also published as: WO1998012335A1; CZ88199A3; EP0927262A1; US6294712B1; PL332311A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科、および／またはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）科の植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する核酸に関する。該核酸は、特に、すなわち、ベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）のｃ遺伝子の配列に少なくとも６０％相同な翻訳領域を含む。本発明は、また、該核酸のｃＤＮＡクローンとゲノムクローンの配列を含む。さらに、植物に定住する線虫に対する抵抗性に関する核酸を含む、例えば、酵母の人工染色体「ＹＡＣ」などのベクターを含む。本発明は、また、植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導するために核酸またはベクターを使用することに関し、また、核酸、またはベクターを含む遺伝子導入植物に関する。さらに、本発明は、核酸によってコードされているタンパク質、核酸、ならびに／またはベクターを含むテスト用キット、および、植物の線虫抵抗性を作出するための方法に関する。最後に、本発明は、また、核酸のプロモーター、その使用、およびＰＣＲ用プライマーに関する。

Description

【発明の詳細な説明】線虫抵抗性遺伝子本発明は、好ましくは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、および／またはアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科、および／またはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）科、特に好ましくは、属Ｂｅｔａ、および／またはブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、および／またはソラナム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する核酸に関する。本発明は、さらに、この核酸のｃＤＮＡクローン、およびゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列に関する。さらに、本発明は、植物の中の定住性線虫に対する抵抗性を付与するための核酸を含む、例えば、酵母の人工染色体ＹＡＣのようなベクターに関する。最後に、本発明は、植物の中の定住性線虫に対する抵抗性を誘導するための核酸、またはベクターの使用、および、また、この核酸、またはベクターを含む遺伝子導入植物に関する。さらに、本発明は、核酸、核酸を含むテスト用キット、および／またはベクターによってコードされるタンパク質、および、遺伝子導入植物を作出するための処理法、また、植物における線虫抵抗性を作出するための処理法に関する。最後に、本発明は、抵抗性遺伝子のプロモーターに関する。植物は、さまざまな病原体や寄生体によって攻撃を受けることがよく知られている。作物植物が、寄生体の攻撃に対して、野生型の近縁種よりも、大抵感受性であることもよく知られている。しばしば見られるのは、筋皮嚢に囲まれた、液体で満たされたシュードサイローマ（ｐｓｅｕｄｏｃｙｌｏｍａ）包皮をもつ線虫の仲間の植物寄生生物である。線虫は、世界中で、年間約１億５千万ドイツマルクの収穫物の損失をもたらしている、重要な寄生生物である。特に、損害がひどいのは、一定の摂食構造を誘導した後、寄生された植物の根の中に永久的に棲みつく、メロイドギネ（Ｍｅｌｉｄｏｇｙｎｅ）属、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属、およびグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属の線虫である。線虫のヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）は、例えば、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科、およびアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）科など、さまざまな科の植物の多くの種を含む広範な宿主範囲をもつ。線虫の生活環は、４つの幼虫段階（Ｊ１−Ｊ４）に細分される。シンシチウムの発達を誘導する中心体に移動するＪ２幼虫段階に、根に感染する。これらの広範な摂食構造は、木部柔組織の細胞の間の細胞壁の部分分解から生じる。線虫は、３つの時期の後、成虫期になって、その生活環を終了する。雌の線虫は、さらに、シンシチウムから餌を食べながら大きくなり、最後には、根冠を破壊する。雄の段階では、第３段階が終了してからは、もう餌を食べず、成虫になると、性フェロモンによって誘引される雌段階に移行する。成熟した雌段階では、体中が卵で一杯になる。それらが死ぬと、嚢子（シスト、ｃｙｓｔ）が形成されるが、この中で、感染性のある幼虫（Ｊ２）は、土の中で、１０年まで生き残ることができる。線虫抵抗性遺伝子は、宿主と寄主の間の不親和反応を開始させると考えられているが、これは、すでに細胞レベルで説明されている。この、またはこれらの遺伝子をもつ植物の根は、実は、Ｊ２幼虫期によって攻撃されるが、ほとんどの線虫は、できかかったシンシチウムが崩壊するために、後期Ｊ２段階で死ぬ。稀には、雌の段階で成長することができるが、それらは透明な外観を示し、成長を停止する。その結果、線虫は、生活環を完結させることができなくなる。環境政治学的な理由のために、殺線虫剤の使用が、限られた範囲でしか可能でないため、この抵抗性遺伝子を作物植物に備えさせることも、特に望ましい。特に、属Ｂｅｔａの根菜（例えば、サトウダイコン、飼料ビート、飼料用甜菜、ビートの根）は、根シスト線虫のヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）に対して、非常に感受性が強い。これらの遺伝子に対応する抵抗性遺伝子を欠いているために、植物、特に、作物植物の中で、ヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、およびその他の植物病原性線虫（例えば、グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ））に対する抵抗性を作出するための努力が長い間払われてきた。抵抗性の唯一の資源は、野生種のベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）と、その近縁種Ｂ．ウェビアナ（Ｂ．ｗｅｂｂｉａｎａ）とＢ．パテラリス（Ｂ．ｐａｔｅｌｌａｒｉｓ）である。さまざまな線虫種に対する抵抗性遺伝子が、さまざまな有用植物種（例えば、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルラディッシュ）の育種において用いられている。野生種のベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）に由来する抵抗性遺伝子も、交配育種によって、サトウダイコンに移行させてきた。このことから、抵抗性のサトウダイコンを選抜することができるだろうが、しかし、不適切な品質と生産性特性という特徴をもつという不利益があった。ベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）との交配育種から得られた抵抗性サトウダイコンの系統は、プロクムベンテス（Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｔｅｓ）亜属の野生ビートから、さまざまな転座を起している。それらの生産性が低く、品質が劣っているのは、たぶん、抵抗性遺伝子だけでなく、野生種に由来する、生産性を低下させる別の遺伝子もこららのサトウダイコンの系統に存在するという事実によるものであろう。また、抵抗性特性の後代への伝達は不完全である。交配による育種によっては、別の性質、ときには不利益な性質が同時に移行してくることなしに、特定の性質を選択できそうもないため、これらの短所を交配方法によって完全に除去することはできない。さらに、シンシチウム特異的なプロモーターをもつ「自殺遺伝子」を組み合わせることによって、植物の中で、人工的な線虫抵抗性を誘導するための多くの試みがなされてきた。しかし、これまでのところ、これから抵抗性植物を育成できていない。さらに、天然の抵抗性遺伝子を分子レベルで同定して、作物植物の中に抵抗性を作出するために、それらを使用することが、今までにできていない。このため、線虫に対する抵抗性を植物に付与する核酸を提供することが、本発明の技術的課題の一つであった。この遺伝子のもととなるＤＮＡ配列を提供することが、さらなる課題であった。また、定住性線虫に対する抵抗性を誘導するために、このような遺伝子の利用を可能にすることも、本発明に係るさらなる課題であった。これとは別に、このような抵抗性を付与する核酸を含む遺伝子導入植物、および、この核酸を含む細胞、種子、または植物の一部を提供することが、本発明に係る課題であった。最後に、線虫に対する抵抗性を付与するための遺伝子が、効果的に植物に取り込まれ、その中に含まれているベクターを提供することが、本発明の課題であった。さらに、この核酸によってコードされているタンパク質と、この核酸を含むテスト用キットを提供することが、本発明に係る課題であった。最後に、遺伝子導入植物を作出するための処理法と、線虫に対する抵抗性を作出するための処理法を提供することが、本発明に係る課題であった。前記の抵抗性遺伝子の発現を調節するプロモーターを提供することも、本発明に係る課題であった。これらの課題は、請求の範囲に含まれる、本発明の主題によって解決される。図１は、葉と根から採った全ＲＮＡのノザン解析を示している。（１）感染しているか、（２）感染していない、６週齢の植物の葉と根から全ＲＮＡを単離した。全長ｃＤＮＡ１８３２をプローブとして用いた。１．３％アガロースで、２０μｇの全ＲＮＡを分離して、ナイロン膜に移行させた。このフィルターを、６０℃で、放射活性標識したプローブと、一晩ハイブリダイズさせ、６０℃で、２ ×３０分間、０．２×ＳＳＣで洗浄した。本発明の請求項１によると、好ましくは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、および／またはアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科、および／またはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）科、特に好ましくは、ベータ属（Ｂｅｔａ）、および／またはブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、および／またはソラナム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物の中で、定住性線虫に対する抵抗性を誘導する核酸が提供される。このような遺伝子を提供すると、定住性線虫に対する抵抗性を示す作物植物を育成することが可能になる。このような抵抗性作物植物は、線虫による攻撃を受ける可能性がなく、そのため、病気に対する感受性が低いため、当然、それらの非抵抗性の類縁種よりはずっと優れている。植物に定住する線虫に対する抵抗性をもつ核酸を提供することによって、それにもかかわらず、非抵抗性の別の作物植物の品質と生産性に等しい品質と生産性を示す抵抗性植物を得ることが、さらに可能になる。これは、一つの核酸、すなわち、定住性線虫に対する抵抗性を付与する核酸が植物の中に移行させられるが、従来の交配方法では、望ましい遺伝子に加えて、望ましくない特質をコードする別のＤＮＡ配列も移行させられるという事実による。特に好ましくは、定住性線虫に対する抵抗性を誘導する核酸は、ベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）のＨＳ１^pro-1遺伝子に、少なくとも６０％相同な、翻訳される領域を含んでいる。これらには、とりわけ、ベータ・ウェビアナ（Ｂ．ｗｅｂｂｉａｎａ）とベータ・パテラリス（Ｂ．ｐａｔｅｌｌａｒｉｓ）に由来する相同遺伝子が含まれる。ベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）のＨＳ１^pro-1遺伝子は、植物に定住する線虫に対する抵抗性をもつ。上記のＤＮＡ配列と６０％の相同性があれば、この核酸をもつ植物の中で、定住性線虫に対する望ましい抵抗性特性を誘導するのに充分である。以下のようにして、ハイブリダイゼーション条件を選択することができる配列１８３２で遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明に係る遺伝子を得ることもできる。例えば、ハイブリダイゼーション温度は５０℃、好ましくは６０℃、また、フィルターの洗浄は、０．５×ＳＳＣ、好ましくは、０．２×ＳＳＣの中で３０分間。特に好ましいのは、植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する核酸で、以下のＤＮＡ配列を含んでいる。この配列を、以下では、Ｎｏ．１８３２という。上記のＮｏ．１８３２の核酸によってコードされている遺伝子産物として、同じ線虫抵抗性を付与するタンパク質をコードする核酸で、これらの遺伝子がすべて、同じアミノ酸配列を含む核酸が本発明に含まれる。好ましくは、この核酸は、ｃＤＮＡである。さらなる態様において、植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する核酸はゲノムＤＮＡで、次のＤＮＡ配列を含む。（？）という印が付いているところは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであるかもしれないし、あるいは、何もないかもしれない。翻訳開始点には、下線を付した。太字で印字されている文字は、ｃＤＮＡ部分を示している。添付した配列プロトコールでは、（？）は、Ｎという文字に相当する。この配列を、以下では、Ｎｏ．１８３２．１という。図２に記載されているように、もとの５４０７ヌクレオチドの配列は、配列エラーを含んでいたが、タンパク質をコードする領域には影響を及ぼさない。最後に、本発明は、配列番号：３（１８３２Ａ１ともいう）に記載された配列を含む。クローン１８３２について明らかになったように、上記したようなＤＮＡ配列でスクリーニングをして得ることができ、また、線虫抵抗性をコードする核酸も含まれる。好ましくは、この核酸は、属Ｂｅｔａのプロクムベンテス（Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｔｅｓ）亜属の野生種から得られる。特に好ましくは、上記した核酸は、メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属、および／またはグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属の定住性線虫に対する抵抗性を誘導する。特に、ヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）に対する抵抗性を誘導するものが好ましい。特に好ましくは、この抵抗性は、サトウダイコン（Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ）種の植物に定住する線虫に対して誘導される。修飾されることになる植物中へのこのような遺伝子の組込みの際、一般的に線虫抵抗特性のみが影響を受ける。多面遺伝子発現作用は予測することができない。従って繁殖群体（ｂｒｅｅｄｉｎｇｓｔｏｃｋ）の生産性は、依然として影響を受けない。前記遺伝子を発現する遺伝子導入植物は、シスト線虫に対する不和合性反応を示す。その結果これらの植物は、抵抗性品種の繁殖に用いることができる。これは、属Ｂｅｔａの節Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｔｅｓの野生種から来る自然抵抗核酸であるので、遺伝修飾された植物に関して受入れの問題があるとは考えられない。前記遺伝子を有する線虫抵抗性品種は、輪作での宿主作物の割合における増加を生じうる。テンサイの場合、このことは理論的に次のことを意味する。すなわち高い収益率のある作物を、向上した程度まで栽培することができるということである。さらにＨＳ１^pro-1配列は、属Ｂｅｔａの植物において活性であるだけでなく、その他の属の植物、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａにおいても線虫抵抗性を生じうる。配置された配列が、植物に線虫抵抗性を与える潜在能力を有するかどうかは、例えば次にさらに詳しく説明されているような通常のテストによってチェックすることができる。本発明のさらに好ましい実施形態によって、植物に定着（ｓｅｄｅｎｔａｒｙ）線虫に対する抵抗性を与え、かつ前記のような核酸を含んでいるベクター、特に好ましくはイースト人工染色体（ＹＡＣ）が提供される。ＹＡＣは例えば、次のＤＮＡ配列を含んでいる：１．（Ｎｏ．１８３２）２．（Ｎｏ．１８３２．１）ＹＡＣに含まれる核酸との６０％相同性があれば、植物における抵抗性の誘発には十分である。好ましいＹＡＣは次のとおりである：好ましい実施形態において、属Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ及び／又はＧｌｏｂｏｄｅｒａの線虫に対する抵抗性が、植物に誘発される。特に好ましくは、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｈａｃｈｔｉｉに対する抵抗性が標的とされる。好ましくは種Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓの植物における定着線虫に対する抵抗性が誘発される。さらにこの発明は、植物における定着線虫に対する抵抗性の誘発のための、前記のような核酸又はベクターの使用に関する。これとは別にこの発明は、前記のような核酸又はベクターを含む遺伝子導入植物に関する。この遺伝子は、構成的プロモーターの制御下、あるいは翻訳配列の上流にある内部プロモーターの制御下のどちらかにおいて、標準的方法による形質転換によって植物に発現されうる。この結果、定着線虫、特にシスト線虫Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｈａｃｈｔｉｉとの不和合性反応が引起こされる。約１５００のヌクレオチドを含む、遺伝子の上流に位置するプロモーター部位は、あらゆる植物におけるあらゆる遺伝子の根特異的発現のために用いることができる。ＨＳ１^pro-1遺伝子の５’非翻訳部位に由来し、ＨＳ１^pro-1遺伝子プロモーターと同じプロモーター活性を示すプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターは、ＸｂａＩ断片内の配列１８３２．１におけるヌクレオチド１位と１５２１位との間に位置している。例えば挿入、欠失、置換、及び／又は逆位による前記プロモーターに由来し、かつ同じプロモーター活性を有するか、あるいはより強力なプロモーター活性を示しさえするプロモーターがさらに好ましい。プロモーター活性の存在は、例えば実施例によって以下に記載されているような通常の手順によって確認することができる。このプロモーター強度の少なくとも１０％を示す前記１８３２−プロモーターの誘導体は、本発明によるものと見做される。従って例えば１８３２プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａにおいて活性化され、その結果、前記プロモーターの制御下にある配列１８３２は、この宿主におけるＨｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｈａｃｈｔｉｉに対する抵抗性を引き起こす。好ましい実施形態において、この遺伝子導入植物は、属Ｂｅｔａ又は属Ｂｒａｓｓｉｃａに属する。特に好ましくはこの遺伝子導入植物は、Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ種に属する。この発明はまた、前記のような核酸又はベクターを含む細胞、種子、又は植物部分に関する。さらにはこの発明は、核酸によってコード化されたタンパク質を標的とし、同様に、同じ抵抗性付与特性を備えたこれの誘導体を標的とする。本発明によるタンパク質は、適切な宿主、例えば細菌、イースト、哺乳類細胞、及び植物細胞における本発明による核酸の発現によって得ることができる。これとは別にこの発明は、前記のような核酸又はベクター、あるいは前記のようなタンパク質を含むテストキットにも関する。さらにはこの発明は、前記のような核酸が植物細胞中に導入されて、植物が植物細胞から再生されることを特徴とする、植物の生産方法にも関する。さらに本発明は、前記のような核酸が、線虫感受性植物中に導入されることを特徴とする、植物に線虫抵抗性を生じる方法にも関する。これとは別にこの発明は、前記核酸の発現をも制御し、かつ根特異的に活性であることを特徴とするプロモーターに関する。遺伝子の５’−側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ）部位、すなわち約１．５ｋｂのＸｂａＩ断片は、真核プロモーター、例えばＴＡＴＡボックスの典型的な要素を含んでいる。このプロモーターは根特異的であるように見える。これは、葉−及び根 −ＲＮＡでのノーザン分析後、シグナルは根−ＲＮＡのみに見られたからである。これはまた、遺伝子導入ポテトでの実験によっても確認される。これらのポテトは、１８３２プロモーター及びＧＵＳ遺伝子からの融合産物で形質転換されたものである。ここで根は、透明色（ｃｌｅａｒｃｏｌｏｕｒ）反応を示した。これは、１８３２プロモーターの活性を示すものであった。従って１８３２遺伝子及び同様なプロモーター活性を備えたこれの誘導体の１５２１ヌクレオチド含有５’部位は、様々な植物の特に根組織におけるあらゆる遺伝子の発現に用いることができる。適切な誘導体は、１８３２．１配列のプロモーター活性の少なくとも１０％を示すものである。使用例には、線虫に対する抵抗性、及び同様にその他の根が運ぶ（ｒｏｏｔ−ｂｏｒｎｅ）害虫に対する抵抗性のための遺伝子の発現、スクロース転座に関わる遺伝子、及び一般にスクロース又はイヌリン貯蔵に関わる遺伝子の発現がある。この発明によるプロモーターの誘導体は、例えば欠失、挿入、塩基交換等による１８３２遺伝子のプロモーターに由来する配列である。ここにおいて１８３２遺伝子プロモーターのプロモーター特性が保持されている。最後に本発明は、配列Ｎｏ．１８３２．１から入手しうるＰＣＲ用プライマーに関する。以下において、この発明が実施例に基づいて詳細に記載されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するためのものではない。実施例１ＨＳ１^pro1遺伝子のクローニングＨＳ１^pro1遺伝子のクローニングのために、密接に連結されたマーカーが同定された。断片付加系統（ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｄｄｉｔｉｏｎｌｉｎｅｓ）の１つから、Ｂ．ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ特異的サテライト（ｐＲＫ６４３）がクローンされた。サザン分析は、テストされたすべての抵抗性系統がこのサテライトを含んでいることを示した。このことが示したことは、この遺伝子が位置する野生種Ｂ．ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓのゲノムの部位にこれが分散されていることであった。このマーカーは、多数の染色体突然変異体のうち最小野生ビートセグメントでの転座系統の同定において役立つことが分かった。この系統は、遺伝子のポジショナルクローニングのために選択された。このマーカーｐＲＫ６４３は、２４１の個体の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）Ｆ２集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における抵抗性で完全に共分離した（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ）。このサテライトマーカーをプローブとして用いて、ＨＳ１^pro-1遺伝子部位を含んでいる３つのクローンは、系統Ａ９０６００１のＹＡＣライブラリーから抽出された。実施例２ＹＡＣの転写配列の同定ＹＡＣの転写配列を同定するために、線虫感染されたＡ９０６００１植物の根からｃＤＮＡライブラリーが作られ、３つのＹＡＣでスクリーニングされた。これは３つのｃＤＮＡクローン、すなわちＮｏｓ．１８３２、１８４５、及び１８５９の単離を生じる。クローン１８４５は、テンサイＤＮＡでのクロスハイブリダイゼーションを示した。一方クローン１８５９は、感受性がある（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）と同時に抵抗性もあるビートのＤＮＡを含む多バンドパターンを生じた。このほかの研究は、ｃＤＮＡ１８３２に対して集中的に行なわれた。その理由は次のようなものである：すなわち、１．このｃＤＮＡが、抵抗性系統のＤＮＡで単一コピーシグナルを生じる一方、感受性テンサイからのＤＮＡではシグナルが見えなかった。このことによって、この遺伝子は栽培された根の塊茎に存在しないと仮定することができる。ＨＳ１^pro-1 遺伝子を含むモノソーム付加系統はすべて、このプローブでシグナルを生じた。２．これは、分離Ｆ２集団における抵抗特性で完全な共分離を示した。３．ノーザン分析によって示されたように、約１．６ｋｂ転写は、抵抗性植物の根のみに存在した。非感染根と比べて顕著に強いハイブリダイゼーションシグナルが、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ感染された根からのＲＮＡの場合に見られた。４．前記ポリペプチドの配列分析は、最近クローンされた抵抗遺伝子産物に特有なモチーフを示した。これらの結果を総合すると、クローン１８３２は、野生ビート特異的遺伝子を表わしていた。この遺伝子は根に発現するだけであり、線虫感染後に刺激される。実施例３遺伝相補分析Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓでの誘発によって、毛根培養物が得られ、これを遺伝相補分析に用いた。テンサイからのこれらの毛根培養物は、根病原体に適した基質であることが分かった。感受性の高いものの和合性反応、及びまたシスト線虫に対して抵抗性のある根の不和合性反応は、テンサイの毛根培養物中に維持される。感受性の高いテンサイ系統（Ｎｏ．９３１６１ｐ）は、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ−媒介遺伝子トランスファーを用いて、１４５０塩基対（ｂｐ）ｃＤＮＡ１８３２で形質転換された。形質転換体の遺伝子工学的修飾（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＧＵＳアッセイ及びＤＮＡブロット分析によって確認された。Ｊ２幼形（ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ）での接種後、６つの互いに独立して形質転換された根が見られた。これらは１８３２遺伝子を発現し、抵抗性系統Ａ９０６００１と同じ不和合性反応を示した。一方線虫は、感受性の高い対照において、及びこの遺伝子を含まない毛根において、規則的に発育した。ｃＤＮＡ１８３２のアンチセンス構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）での抵抗性根培養物の形質転換後、感受性を回復することができた。これらの実験データは、９３１６１ｐ系統からの毛根における抵抗性が、１８３２遺伝子の発現に依存するものであることを確認している。この単離遺伝子は、ＨＳ１^pro-1遺伝子と呼ばれる。その理由は、これが、系統Ａ９０６００１における抵抗性と完全に合うように、感受性の高いテンサイ系統に線虫抵抗性を転移するからである。実施例４ｃＤＮＡの配列ｃＤＮＡ全体及び対応するゲノムクローンの配列は、イントロンを含まない８４６ｂｐのオープンリーディングフレームを示した。これは２８２アミノ酸の前記遺伝子産物をコード化したが、このことはＲＮＡブロットから得られたデータと一致する。実施例５アミノ酸配列の構造分析前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、４つの異なるサブドメインに細分することができる。推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）シグナルペプチド（ドメインＡ）は、Ｎ末端において規定することができ、これはおそらくタンパク質を細胞質膜へ導く役割を有する。不完全なロイシンリッチ反復単位として整列されたロイシンリッチ部位（ドメインＣ）は、ＨＳ１^pro-1ポリペプチドのＮ末端において明白に識別されうる。このロイシンリッチ反復単位（ＬＲＲ）は、タンパク質−タンパク質相互作用の一部であり、これらは、植物からの以前にクローンされた抵抗遺伝子、例えばＡ．ｔｈａｌｉａｎａからのＲＰＳ２遺伝子に見られた。これらの機能は、細胞外に位置する受容体様分子における突然変異認識部位から、細胞質において活性な酵素の触媒ドメインまでの様々なものである。植物抵抗遺伝子において同定された他のＬＲＲと同様、ＨＳ１^pro-1ポリペプチドのＬＲＲは、ＬＲＲコンセンサススーパーファミリーのコンセンサス配列よりも少なく保存されている。ＨＳ１^pro-1ポリペプチドのＬＲＲは、２０ａａコンセンサスモチーフを特徴とする（ｘＬｘｘａｘｘａｘＬｘｘＬｘｘａｘｘｘＬ；Ｌ＝ロイシン又はイソロイシン、ａ＝脂肪族又は芳香族ａａ、ｘ＝あらゆるａａ）。２位、５位、及び１６位におけるロイシン及び脂肪族残留物は、ＬＲＲスーパーファミリーのコンセンサスにおけるのと同じ場所に位置する。Ｃ位における高度に保存されたアスパラギンは、ロイシン／イソロイシンによって置換される。このアスパラギンはまた、ＲＰＳ２ポリププチドのコンセンサスＬＲＲを欠いている。ＨＳ１^pro-1遺伝子における１７ａａの疎水性ドメイン（ドメインＦ）は、トランス膜セグメントを示している。Ｃ末端ドメインは、正電荷残留物及び推定Ｎ−グリコシル化サイトと共にａａを含んでいる。植物−病原体相互作用の誘発体（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）−受容体モデルは次のことを示唆する。すなわち、抵抗遺伝子の産物は、遺伝子対遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ）仮説に従って発病トリガー（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｒｉｇｇｅｒｓ）に対する特異的受容体として作用するということである。ＨＳ１^pro- ¹ の配列分析は、これが防御反応のカスケードの一部として、遺伝子対遺伝子抵抗に関わっていることを示唆している。前記ポリペプチドは、不完全ＬＲＲ（これらは追加シグナルペプチド、推定トランス膜−延長ドメイン、正電荷Ｃ末端と共に、Ｎ末端に位置している）から構成されており、従って植物抵抗遺伝子の第二群に組込まれる。ＨＳ１^pro-1とトマトからの抵抗遺伝子Ｃｆ−９との間にある同様なタンパク質構造も予測されうる。但し有意の配列相同性は確認されなかった。抵抗反応の可能性のある方法として、細胞質外ＬＲＲは、受容体認識推定トリガーとして作用することもあろう。線虫が、膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）植物受容体と相互作用しうる分泌物を生産することは知られている。正電荷Ｃ末端はおそらくは、シグナルトランスファーのための細胞質成分と相互作用する。あるいはまた、細胞質に位置するタンパク質として、線虫の口突起を経て細胞内に注入されたトリガーのための受容体として作用することもあろう。線虫抵抗に関わる第一植物遺伝子のクローニングを通じて、線虫に対する宿主特異的防御プロセスを理解することがさらに可能になろう。さらにはＨＳ１^pro- ¹ 遺伝子の単離は、農業的重要性を有する宿主種に抵抗性を転移する可能性をも与える。ここにおいて、遺伝子の対立遺伝子形態は存在しない。実施例６ＨＳ１^pro-1プロモーターの同定及び特徴付け遺伝子の５’−側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ）部位及びＮｏ．１８３２．１の配列に対応する約１．５ｋｂのＸｂａＩ断片が、ＨＳ１^pro-1遺伝子の５’部位からのＰＣＲ断片を用いて、ｌａｍｂｄａ−ＤＡＳＨＩＩライブラリーから単離された。この単離されたプロモーター配列は、真核プロモーターの典型的な要素、例えば転写開始サイト又はｃＤＮＡの５’−末端の前の２３位において、配列ＴＡＣＡＴＡＡＡを有するＴＡＴＡボックスを含んでいる。同定されたプロモーターは、根特異的である。これは、ノーザンブロットにおいて、１８３２遺伝子の５’−部位からのプローブで、シグナルは根組織においてのみ見られるからである。さらにはこの発明によるプロモーターとＧＵＳレポーター遺伝子とを含む構成は、形質転換されたポテト又はタバコの根においてのみカラー反応を示す。さらにはこのプロモーターは、線虫による誘導性がある。このことは、Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ感染したテンサイ根と非感染根の転写活性の比較によって証明される。このことから、この発明によるプロモーターが、線虫に由来するか、あるいは感染の結果として形成された転写因子と結合すると結論付けることができる。前記実験は、ＨＳ１^pro-1プロモーターの根特異性を証明する。実施例７Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける配列１８３２の発現ｃＤＮＡ１８３２が、ＧＵＳイントロン遺伝子と融合され（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら、（１９９０年）ＭＧＧ、２４５頁）、３５Ｓプロモーターの制御下に置かれた。ベクターｐＡＭ１９４（下記）を用いて、この構成は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる標準的手順によって、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ中に導入された。３世代の自家受粉後、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉに対する完全な抵抗性を示す系統が得られた。すなわちシスト又は生育したメスは、まったく観察されなかった。抵抗テストは感染幼虫を用いてペトリ皿で実施された。ＧＵＳ活性も測定された。実施例８１８３２プロモーターの組織特異的調節研究のため、ＸｂａＩ制限断片（１８３２．１配列の１位及び１５２１位におけるＸｂａＩサイト）が、ＧＵＳイントロン遺伝子と融合され、これはベクターｐＢＩＮ１９及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ／Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ共形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて、テンサイとポテトの根に導入された。テンサイでは、「毛根栽培」において、ＧＵＳ活性はシンシチウムにおいてのみ検出しうるものであることが観察された。非感染根において、又は線虫が存在しない部位において、対応するＧＵＳ活性は識別できなかった。このことは、用いられたプロモーターが、線虫攻撃後にさらに強く活性化される１つ又は複数の「病原体応答」要素を有することを示している。従って１８３２プロモーターは、宿主植物、例えばテンサイにおけるあらゆる遺伝子の組織特異的発現を可能にする。実施例９ＢｒａｓｓｉｃａにおけるｃＤＮＡ１８３２の発現セイヨウアブラナの子葉は、実施例７において前記されているように、配列１８３２を含む構成で形質転換された。これらの子葉は、ＭＳ栄養媒質で培養された。ＭＳ栄養媒質上の選択は、カーベニシリンの添加によって実施された。形質転換体を調べたら、ＧＵＳテストとＰＣＲ分析の両方においてプラスの結果が示された。実施例１０クローン１８３２．１の変異体（Ｖａｒｉａｎｔ）、すなわち以下で１８３２Ａ１と呼ばれるものの同定クローン１８３２の変異体が同定された。これはオープンリーディングフレームを含むものであり、ここにおいて開始コドンは、１８３２．１配列の９２４位におけるＡＴＧに対応する。停止コドンは、配列１８３２．１の２３９７位に対応する。変異体１８３２Ａ１は、配列の比較から見られるように、配列１８３２．１と比べてさらにわずかな差を含んでいる。驚くべきことに、宿主細胞における発現後、すべての配列、すなわち１８３２．１、１８３２、及び１８３２Ａ１は、線虫攻撃への抵抗性を生じる。１つの理論に結び付けられるわけではないが、このことから、配列のうちの短い方、すなわち１８３２が、線虫に対する抵抗性を誘発する能力をコード化タンパク質に与えるようなすべての要素をコード化すると推論できる。図３は、３つのクローン１８３２．１、１８３２、及び１８３２Ａ１の互いに対するコード化能力を概略的に示している。セクション１８３２はすべてのクローンに共通である。実施例１１発現ベクターｐＡＭ１９４の調製調製されたバイナリーベクターｐＡＭ１９４は、クローニングベクターと植物の形質転換ベクター（Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄ）の特性を併せたものである。形質転換ベクターとしてのその適性が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共に、及びまた共形質転換実験のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと組合わせてテストされた。このベクターは、ＰＢＩ１２１の誘導体であり（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７年）（クロンテックラボラトリーズ）；ｐＢＩ１２１のバックボーンは、ｐＢＩＮ１９によって与えられる（Ｂｅｖａｎら、１９８４年）。ｐＡＭ１９４は次の要素を含んでいる ● 境界配列（ＬＢ；ＲＢ）とは別に、この断片は選択マーカーとしてＮＰＴＩＩを含んでいる； ● 左右境界配列（ＬＢ，ＲＢ）； ● 植物における選択のためのＴｎ５からのＮＰＴＩＩ遺伝子； ● ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列を伴なうＥ．ｃｏｌｉからのＧＵＳ遺伝子（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔら、１９９０年）； ● クローニングを目的とする単一制限分裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）サイトを伴なう３５Ｓプロモーター−ターミネーターカセット。調製：プラスミドｐＢＩ１２１が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｓｔＩで分裂（ｃｌｅａｖｅｄ）された。この分裂ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｓｔＩ−３５Ｓ−ＧＵＳ断片は、サブクローン３５Ｓ−ＧＵＳイントロン断片により置換された。ＥｃｏＲＩ制限分裂サイトは、ＥｃｏＲＩで分裂させること、及び重なり合った末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩからの「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片」で満たすことによって破壊された。次に、新たなライゲーションが実施されて、ｐＢＩＮ−ＧＵＳＩＮＴを生じた。プラスミドｐＲＴ１０４からの単−ＥｃｏＲＩクローニングサイトを伴なう３５Ｓ− プロモーター−３５Ｓ−ターミネーターカセット（Ｔｏｐｆｅｒら、１９８７年）が、ｐＢＩＮ−ＧＵＳ−ＩＮＴのＨｉｎｄＩＩＩサイトへとクローンされ、これはｐＡＭ１９４を生じた。前記引用文献は次のとおりである： ● ＢｅｖａｎＭ，（１９８４年）：植物の形質転換用のバイナリー癌腫菌ベクター．核酸研究第１２巻，２２号，８７１１頁． ● ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＲＡ，ＫａｖａｎａｕｇｈＴＡ，ＢｅｖａｎＭＷ，（１９８７年）．ＥＭＢＯジャーナル第６巻，３９０１頁． ● ＴｏｐｆｅｒＲ，ＭａｔｚｅｉｔＶ，ＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎＢ，ＳｃｈｅｌｌＪ，ＳｔｅｉｎｂｉｓｓＨＨ，（１９８７年）：転写及び翻訳融合のための一組の植物発現ベクター．核酸研究第１５，１４号，５８９０頁 ● ＶａｎｃａｎｎｅｙｔＧ，ＳｃｈｍｉｄｔＲ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ− ＳａｎｃｈｅｓＡ，ＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒＬ，Ｒｏｃｈａ−ＳｏｓａＭ，（１９９０年）：イントロンを含むマーカー遺伝子の構成．分子総合遺伝学，２４５−２５０頁．プラスミドの構成を図４に概略的に示す。実施例１２テンサイの形質転換凍結溶解法（Ｈｏｌｔｅｒｓら、１９７８年）により、プラスミドＬＤ１０／１８３２−１３またはベクターＬＤ１０で形質転換した１８３２ｃＤＮＡ欠損プラスミドであるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株（ＨｏｏｄＥ．Ｅ．ら、１９８６年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６８巻、１２９１〜１３０１頁）（図５ａ〜ｄ）を形質転換に用いた。テンサイの形質転換用のため、滅菌したタイプＥｌｉｔｅＯ−２７２テンサイ種子を２．０ｇ／ｌのスクロースおよび４．０ｇ／ｌのアガロースを含む培地上で発芽させた。胚芽を切り取り、子葉を注意深く取り出し移植組織として用いた。プラスミドＬＤ１０／１８３２−１３を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株、またはプラスミドＬＤ１０を有するコントロール（図５Ｃ）をロータリーシェーカー（３４０ＲＰＭ）上、２７℃ で５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、７５ｍｇ／ｌのスペシノマイシン、１５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｌのアセトシリゴンを加えたＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年）上でＯＤ約１．０（６６０ｎｍ）まで培養した。次いでバクテリア件濁液をＬＢでＯＤ０．１に希釈し、移植組織を接種し２２℃で２〜４日間共培養した。マンノース選択系の変法を用いて遺伝子導入シュート（苗条）を選別した。この方法で遺伝子導入テンサイシュートを選別した。共培養後、０．０５ｍｇ／ｌのα−ナフチル酢酸、０．２５ｍｇ／ｍｌの６−ベンジルアデニン、５００ｍｇ／ｌのカルベニシリン。２０ｇ／ｌのスクロースおよびＤ−マンノースを添加したＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２年）で構成される選択培地に移植組織を移した。選択期間中はＤ−マンノースの濃度を最初の２回の継代培養期間中は１．２５ｇ／ｌの濃度から出発し、次の２回の継代培養期間中は５．０ｇ／ｌに増加し、最後の継代培養期間中は１０ｇ／ｌに段階的に増加させた。各継代培養期間を３週間続けた。マンノース耐性シュートをさらに、０．２５ｍｇ／ｌの６−ベンジルアデニンを添加したＭＳ培地上で培養したが、基本的にはＭｉｅｄｅｍａ（１９８２年）に従って根の生成が見られた。マンノース耐性シュートの解析を以下のように行った。選択を生き残ったマンノース耐性シュートは遺伝子導入の性質を有することを確認するため、全てのシュートをのＰＭＩ活性を調べた。遺伝子導入されないテンサイシュートはＰＭＩ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）活性を示さない。寸法約３ｍｍの２〜３枚の葉片からの抽出物を調製し、Ｆｅｒａｍｉｓｃｏら（１９７３年）およびＧｉｌｌら（１９８６年）により改良された組み合せＰＭＩ酵素分析に供した。約８０〜９０％のシュートは有為のＰＭＩ活性を示した。残りの１０〜２０％を廃棄した。線虫試験のため、ＰＭＩ活性を有し根が良く発達した（４〜６齢）シュートを寒天プレートから取り出し、根を注意深く水道水で洗浄した。４×２×１２ｃｍの砂柱に穴を開け、その側壁をプラスチックで包み、シュートをこの中に植えた。砂を根の回りに注意深く加え、注意して潅水し、砂柱中の植物を２５℃で１０日間、プラスチックテントの下に置いた。この期間中時々、植物を鍛えるためテントを外した。これらの植物に注射器を用いて線虫を接種したが、個々の植物にできるだけ近くにそれぞれ２００匹の幼生線虫（Ｊ２）を注入した。接種後３週間で雌嚢胞が現れ、それらを立体顕微鏡で定量的に算定した。個々の植物の根全体を調べ、その結果を表１に示す。この表は非遺伝子導入感染株Ｃ１、遺伝子導入コントロール株（ＣＬＤ１０）、種子から発育した非遺伝子導入感染コントロール（Ｃ２）、およびＬＤ１０／１８３２−１３生成物（Ｔ１−Ｔ９）を含む遺伝子導入植物で得られた結果を示す。ＬＤ１０／１８３２−１３生成物を有する９個の独立の遺伝子導入株をこの試験で解析した。２個（Ｔ₁およびＴ₂）ではコントロールＣ１、Ｃ２およびＣＬＤ１０とほぼ同数の嚢胞が生成した。遺伝子導入植物の３個（Ｔ₃、Ｔ₄およびＴ₈ ）ではコントロールの約半分の嚢胞が生成し、これらの植物では遺伝子がある程度働いていることを示している。遺伝子導入株のひとつであるＴ₅は、先に発表された結果（Ｃａｉら、１９９７年）に対応する嚢胞が発生した。Ｔ₅株では平均で植物あたりわずか２．５個の嚢胞が発生したが、これは様々なコントロールにおける平均約１０個である嚢胞数よりかなり少ない。このことは１８３２遺伝子がテンサイの根で作用することを明らかに示しており、産業上興味のあることである。上記の文献は以下の通りである。 ● ＣａｉＤ．，ＫｌｅｉｎｅＭ．，ＫｉｆｌｅＳ．，ＨａｒｌｏｆｆＨ−Ｊ．，ＳａｎｄａｌＮ．Ｎ．，ＭａｒｃｋｅｒＫ．Ａ．，Ｋｌｅｉｎ−ＬａｎｋｈｏｒｓｔＲ．Ｍ．，ＳａｌｅｎｔｉｊｉｎＥ．Ｍ．Ｊ．，ＬａｎｇｅＷ．，ＳｔｉｅｋｅｍａＷ．Ｊ．，ＷｙｓｓＵＧｒｕｎｄｌｅｒＭ．Ｗ．およびＪｕｎｇＣ．（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５，８３２−８３４ ● ＦｅｒａｍｉｓｃｏＲ．，ＴｉｌｌｅｙＢ．Ｅ．，ＣｏｎｎＷ．Ｒ．，ＧｒａｃｙＲ．ｗ．，ＮｏｌｔｍａｎＥ．Ａ．（１９７３年），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５５，６３６−６４１ ● ＧｉｌｌＪ．Ｆ．，ＤｅｒｅｔｉｃＶ．，ＣｈａｋｒａｂａｒｔｙＡ．Ｍ．（１９８６年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７，６１１−６１５ ● Ｈｏｌｔｅｒら（１９７８年）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６３，１８１−１８７ ● ＭａｎｉａｔｉｓＴ，ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．，ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．（１９８２年）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．実験室マニュアル，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ ● ＭｉｅｄｅｍａＰ（１９８２年）、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ３１、６３５−６４３ ● ＭｕｒａｓｈｉｇｅＴ．，ＳｋｏｏｇＦ．（１９６２年）、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１５、４７３−４９７実施例１３プラスミドＬＤ１０／１８３２−１３の調製上記プラスミドの調整法を図５ａ〜ｄに示す。ＳＥＱＩＤＮｏ．１からの核酸部位１５２１〜２９０４由来のＸｂａＩフラグメントをＫｌｅｎｏｗ酵素を用いてブルント末端にはめ込んだ。このフラグメントをブラント末端を備えたプラスミドｐＰＳ４８のＢａｍＨＩ部位に導入した。ｐＰＳ４８／ＢａｍＨＩ−１５と名付けられたこの新規プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで開裂した。塩基対０〜２４０３由来のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをプラスミドｐＬＤ１０のＨｉｎｄＩＩＩ部位に導入し、プラスミドＬＤ１０／１８３２−１３を作成した。実施例１４線虫耐性を生成するための配列１８３２によるＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓの形質転換および耐性試験線虫耐性に対する遺伝子を含むＴｉプラスミドｐＡＭ１９４を転換ベクターとして使用した。（配列１８３２）このベクターは実施例１１でより詳細に述べられる。カナマイシン耐性のないヘルパープラスミドｐＥＨＡ１０１を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株由来のＣ５８Ｃ１ＡＴＨＶＲｉｆをバクテリア株として使用した。ＡＴＭ株はプラスミドｐＡＭ１９４−１８２３を含む上記Ｃ５８Ｃ１ＡＴＨＶＲｉｆに相当する。形質転換のためのバクテリア培養をＡＴＭ培養として、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのリファムピシンを含むＬＢ寒天上で行い、使用するまで冷蔵庫に保管した。予定の形質転換を行う２日前に３０ｍｌのＬＢ栄養培地に適当量の培養バクテリアを接種した。バクテリアを選択するため、ＬＢ寒天等の液体培地は５０ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍｇ／ｌのリファムピシンを含有する。２８℃の１９０ＲＰＭのシェーカー上、暗室でバクテリアを２４時間インキュベートした。２日めに抗生物質を含まない３０ｍｌのＬＢ培地に、２０ｍｌの２４時間後に収穫し同じ条件で２４時間インキュベートした前記培養バクテリアを接種した。試験管内でセイヨウアブラナ（ｓｕｍｍｅｒｒａｐｅ：Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｓｓｐ．ｏｌｅｉｆｅｒａ）を培養するため、種子を滅菌コニカルフラスコ中でＮａＯＣｌ（３％活性塩素）で１０分間滅菌し、滅菌蒸留水で３回すすぎ洗いした。次いで種子をＢ５微量元素とビタミンを含むＭＳ−Ｎ培地上に散布した。５０ｍｌの栄養培地を含むコンテナーに１０粒の種子を散布した。種子を約２０００ルックス、昼／夜リズム１６時間／８時間で４日インキュベートした。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる遺伝形質変換（子葉遺伝形質変換）のため、４日齢子葉を分裂組織のすぐ上でメスを用いて分離した。このためには二本の子葉を鉗子で掴み、真っ直ぐに切って同時に分離した。分離後直ちに子葉の葉柄を未希釈のバクテリア懸濁液（終夜培養）に１０秒間浸した。そして子葉を培地に戻した。４８時間の共培養を２５℃で薄暗い光の下で行った。共培養終了後、子葉を５０ｍｌのＭＳＭ培地の入った容器に入れたが、その培地にはバクテリアを殺すために７５０ｍｌ／リッターのカルベニシリンが含まれ、培養を２５℃で７日間、毎日２０００ルックスの光を１６時間照射して行った。７５０ｍｌのカルベニシリンの入ったＭＳＭ上に７日間置いた後、子葉を同じ栄養培地に移植したが、この場合も開始時には２０ｍｇ／ｌのカナマイシンがシュートを選択するため含まれていた。時間が経つとカナマイシンの濃度を２５ｍｇ／リッターに増やした。非遺伝子導入カルスを規則的に除去した。さらに選択を進めるため、または遺伝形質転換を検出するため、分離したシュートを５０ｍｇ／リッターのカナマイシンと４００ｍｇ／リッターのベータバクチルを含むＢ５培地に移植した。共移転ＧＵＳ遺伝子により、遺伝子導入シュートを可能な限り早い時間で同定することができる。遺伝子導入シュートの発根はホルモンのないＢ５栄養培地上で行われた。遺伝子導入を分子生物学的に検出するため、ＧＵＳ試験をβ−グルクロニダーゼ活性の組織化学的検出法として行った。この酵素は合成基質からインドールを開裂させ、ＧＵＳ陽性葉片は青色になる。試験法はＪｅｆｆｅｒｓｏｎＲ．Ａ．「植物におけるキメラ遺伝子の分析：ＧＵＳ遺伝子融合システム」（１９８７年）、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５、３８７−４０５に従った。更に進んだ遺伝子導入の分子生物学的検出法はＮＰＴＩＩ−ＥＬＩＳＡ試験であるが、その方法では遺伝子導入植物にカナマイシン耐性を与える酵素ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼの生成を定性的および定量的に測定することができる。この試験はＣＰＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．製のＮＰＴＩＩ−ＥＬＩＳＡキット（ＣａｔＮｏ．５３０７−６１０１０１）を用いて行った。Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉを用いる耐性試験で接種するために使用できる適当量の幼生を定常的に得るため、線虫をホスト植物であるカラシ（"アルバトロス（アホウドリ）"種、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−Ｓａａｔｚｕｃｈｔ）および塊茎上で増殖した。種子を３％Ｃａ（ＯＣｌ）₂溶液中で３分間「滅菌」し、次いで滅菌蒸留水で３〜４回すすぎ洗いする。次に種子を滅菌濾紙上で乾燥し、８％寒天を含む水−寒天上に植える。２５℃でこの寒天を３〜４日間暗所に置いた後、若い新芽を０．２倍濃縮液Ｋｎｏｏｐ培地に移植する。この時、根は約３〜４ｃｍの長さになっている。２個の新芽をお互いに向かい合わせに置いた取っ手付きの直径１５ｃｍのペトリ皿を使用する。２５℃の暗所で１４日間生長させた後、Ｌ２期の線虫幼生１０００匹を接種する。２５℃で暗所に４週間置いた後、成熟した嚢胞が生成し、収穫することができる。嚢胞を収穫する場合、スプリング付きスチール鉗子を用い、塩化亜鉛溶液（３ｍＭ）を満たしたガラスロートに立てた５０〜２００μｍメッシュの篩中に２００個の嚢胞を採集する。ロートの出口にシリコンチューブを固定し、スチール製のホースクランプでクランプする。この装置をアルミ箔で覆った背の高い２５０ｍｌビーカー中に立てる。インキュベーター中に２５℃で３日間置いた後、孵化した幼生をスチールクランプ前のシリコンチューブ中に集め、短い時間クランプを開いて１５μｍメッシュの篩中に収穫することができる。幼生を滅菌水で３回すすぎ洗いし、パスチュールピペットを用いて滅菌したシャーレの中に移す。幼生が底へ沈むまで約３分間待って余分な水をできるだけ吸引除去し、０．５％Ｇｅｌｒｉｔｅ溶液で置換し幼生が均等に分布するようにする。注意深く混ぜた後、幼生の濃度を立体顕微鏡を用いてチェックし、液滴１０μｌ中の幼生数を数える。インビトロ試験のため、根を遺伝子導入出発クローンのシュートから分離し、３００ｍｇ／ｌのベータバクチルと８ｇ／ｌのＤａｉｓｈｉｎ寒天を含む¹／₂Ｂ５培地上に置く。５個の根それぞれに遺伝子導入出発クローンを接種する。感染性コントロールとして上記と同様に根を作成したオイルラディッシュを用いる。皿毎に約１００匹のＨｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉのＬ２幼生を上記の通り作成した根の上に落とす。０．５ｍｌＣｏｍｂｉｔｉｐ付きＭｕｌｔｉｐｉｐｅｔｔｅを接種用に用いる。Ｐａｒａｆｉｌｍでシールした皿を２５℃ の暗所でインキュベートした。生成した嚢胞を１４日後に最初に計数し、嚢胞が淡褐色になり白根がより容易に持ち上げられるようになる２０日後に２回目と最後の計数を行う。インシチュー試験のため、各出発クローン用の５個のシュートをまず温室に移す。このためには根がある程度伸びて数本の根がある必要がある。根を鉢植えの土に挿し、１．５週間置き根の塊をもっと生長させる。さらにこれにより根を温室の条件に順応させる機会を与える。１．５週間後、Ｓｔｅｉｎｅｒの栄養液で前もって湿らせた粒径０．１〜０．５ｃｍのシリカ砂に植物を挿し変える。この砂中に接種を行うが、その理由は腐食土や塵の粒子があれば嚢胞の計数が極めて困難になるからである。砂は箱に立てたチューブに入れる。箱の縁の部分では植物により多くの光が当たり、従ってより良い生育条件になるので、試験植物に隣り合わせになるように試験植物を他の植物で囲む。２回目の挿し変え日から１週間後、新たに町化したＬ２期のＨ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ幼生（６００匹）を接種する。約６週間後に評定を行ったが、その時嚢胞は褐色になり、根を容易に洗い落とすことができる。強力な水流で台所用篩を通してすすぎ洗いすることで嚢胞から植物の根を分離し、１００μｍの篩中に捕捉し遠心分離で砂を分離する。得られた嚢胞、細かい根および水の混合物を濾過し、１０倍の双眼顕微鏡で嚢胞を数える。植物の遺伝子導入をＰＣＲ分析、ＮＰＴＩＩ−ＥＬＩＳＡおよびＧＵＴ試験で測定した。非遺伝子導入感染性種Ｔ₀および遺伝子１８３２を含む遺伝子導入植物Ｔ₇〜Ｔ₁₅ の結果を表に示す。遺伝子１８３２を含む１０個の独立の遺伝子導入株をこの試験で評価した。６株（Ｔ₈、Ｔ₉、Ｔ₁₀、Ｔ₁₁、Ｔ₁₃およびＴ₁₄）は感染性株に匹敵する嚢胞数を有していた。３株（Ｔ₇、Ｔ₈₁およびＴ₁₅）はコントロールおよび嚢胞が４７％減少した株（Ｔ₁₁）に比較して嚢胞が２７％減少していた。このことは、遺伝子が植物中で作用し、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓで嚢胞感染がかなり減少することを示す。実施例１５Ｂｉｎｔｊｅ種のジャガイモをＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの３５Ｓプロモーターで制御される挿入部１８３２を含むプラスミドｐＡＭ１９４で形質転換した。４０個の独立の毛状根それぞれに２５０匹のＧｌｏｂｏｄｅｒａｐａｌｌｉｄａ幼生を接種した。５６日後、線虫の出現を調べた。３５個の培養体は平均でペトリ皿あたり４０匹の成熟雌があり、正常な専務死の発育を示した。５個の根の培養体では雌の発生は妨げられ、それぞれ１０匹の成熟雌が見られただけであった。このことはジャガイモでは１８３２配列が線虫感染に対する耐性を改善し得ることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月１７日（１９９８．１１．１７）【補正内容】請求項１を以下のように補正する。１．好ましくは、ナス科(Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ)、および／またはアカザ(Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ)科、および／またはアブラナ(Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ)科、特に好ましくは、ベータ属(Ｂｅｔａ)、および／またはブラシカ属(Ｂｒａｓｓｉｃａ)、および／またはソラナム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する単離された核酸。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＺ，ＥＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＬＴ，ＬＶ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＩ，ＵＡ，ＵＳ (71)出願人ディークマン，ヨハネスドイツデー―31684 ニーンステットポストファッハ 1165 ズィールベック（番地なし）アー．ディークマンハイムブルクザーツツホト (71)出願人プランタアンゲヴァンテプフランツェンゲネティックウントビオテクノロジーゲーエムベーハードイツデー―37555 アインベックポストファッハ 1464 (71)出願人ダニスコバイオテクノロジーデンマークデーカー―1001 コペンハーゲンカーペー．オー．ボックス 17 ランゲブロガーデ１ (71)出願人ディーエルオー―セントラムフォープランテンフェレデリングス―エンリプロダクティエオンダーゾーク（シピーアールオー―ディーエルオー) オランダエヌエル―6700 エーエーヴァーゲンインゲンポストバス 16 ドローヴェンダールセステッグ１ (72)発明者クライネ，ミカエルドイツデー―24159 キールフォールリープ 25 (72)発明者チャイ，タクァンドイツデー―24105 キールコルディングストラッサ 11 (72)発明者ユング，クリスチャンドイツデー−24229 デニッシェンハーゲンツムアムト 15

Claims

【特許請求の範囲】１．好ましくは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、および／またはアカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）科、および／またはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）科、特に好ましくは、ベータ属（Ｂｅｔａ）、および／またはブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、および／またはソラナム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導する核酸。２．ベータ・プロクムベンス（Ｂｅｔａｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）のＨＳ１^pro- ¹ 遺伝子のタンパク質コード配列に、少なくとも６０％相同な翻訳領域を含むという特徴をもつ、請求項１記載の核酸。３．ＨＳ１^pro-1遺伝子が、以下の配列を含むという特徴をもつ、請求項１または２記載の核酸。４．ＤＮＡ、好ましくは、ｃＤＮＡであるという特徴をもつ、請求項１から３のいずれか記載の核酸。５．以下の配列を含むゲノムＤＮＡであるという特徴をもつ、請求項１または２記載の核酸。６．請求項３および／または５に記載されているようなＤＮＡ配列によって、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができるという特徴をもつ、請求項１から５のいずれか記載の核酸。７．ベータ（Ｂｅｔａ）属のプロクムベンテス（Ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｔｅｓ）亜属の野生種から得られるという特徴をもつ、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸。８．メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属、および／またはグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属の定住性線虫に対する抵抗性を誘導するという特徴をもつ、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸。９．ヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）に対する抵抗性を誘導するという特徴をもつ、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸。９．ヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）に対する抵抗性を誘導するという特徴をもつ、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸。１０．サトウダイコン（Ｂｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓ）種の植物に定住する線虫に対して抵抗性を誘導するという特徴をもつ、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸。１１．請求項１から１０のいずれか記載の核酸を含むベクター。１２．ＹＡＣベクターであるという特徴をもつ、請求項１１記載のベクター。１３．植物に定住する線虫に対する抵抗性を誘導するための、前記の請求項の一つ以上に記載された核酸、および／またはベクターの使用。１４．前記の請求項の一つ以上に記載された核酸、および／またはベクターを含む遺伝子導入植物。１５．ベータ（Ｂｅｔａ）属またはブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属するという特徴をもつ、請求項１４記載の遺伝子導入植物。１６．サトウダイコン（Ｂｅｔａｖｕｌｇａｉｓ）に属するという特徴をもつ、請求項１４記載の遺伝子導入植物。１７．請求項１から１０のいずれか記載の核酸、および／または請求項１１または１２のいずれか記載のベクターを含む細胞、種子、または植物の一部。１８．請求項１から１０のいずれか記載の核酸によってコードされるタンパク質。１９．請求項１から１０のいずれか記載の核酸を適当な宿主の中で発現させて得ることができるタンパク質において、植物に定住する線虫に対する抵抗性をもたらすことができるタンパク質。２０．請求項１から１０のいずれか記載の核酸、および／または請求項１１または１２のいずれか記載のベクター、および／または請求項１８または１９記載のタンパク質を含むテスト用キット。２１．請求項１から１０のいずれか記載の核酸を、植物細胞の中に導入して、この植物細胞から植物体を再生するという特徴をもつ、植物を作出するための方法。２２．請求項１から１０のいずれか記載の核酸を、線虫感受性の植物に導入するという特徴をもつ、植物に線虫抵抗性をもたらすための方法。２３．請求項５に記載されているような配列によって、遺伝子ライブラリーをスクリーニングして得ることができる根特異的なプロモーター、および同じ活性をもつ、その派生配列。２４．ＨＳ１^pro-1遺伝子の発現を調節するという特徴をもつ、請求項２３記載のプロモーター。２５．配列１８３２．１の約１．５ｋｂのＸｂａＩ断片上に存在し、１５５１番目の開始コドンから５’側に位置しているという特徴をもつプロモーター、および、それに由来する派生配列。２６．アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において、ヘテロデラ・シャキチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｓｃｈａｃｈｔｉｉ）に対する抵抗性を誘導することができるという特徴をもつ、請求項２３から２５のいずれか記載のプロモーター。２７．遺伝子を発現させるための、請求項２３から２６のいずれか記載の使用。２８．線虫抵抗性植物を作出するための、請求項１から１０のいずれか記載の核酸、および／または請求項２３から２６のいずれか記載のプロモーターの使用。２９．配列番号：１８３２．１から得ることができる、ＰＣＲ用プライマー。