CZ88199A3 - Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím) - Google Patents
Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím) Download PDFInfo
- Publication number
- CZ88199A3 CZ88199A3 CZ99881A CZ88199A CZ88199A3 CZ 88199 A3 CZ88199 A3 CZ 88199A3 CZ 99881 A CZ99881 A CZ 99881A CZ 88199 A CZ88199 A CZ 88199A CZ 88199 A3 CZ88199 A3 CZ 88199A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- plants
- gene
- resistance
- nematodes
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 62
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 124
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 68
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000871189 Chenopodiaceae Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 241000379510 Heterodera schachtii Species 0.000 claims description 15
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 241000219198 Brassica Species 0.000 claims description 7
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 claims description 4
- 241001143352 Meloidogyne Species 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 241000207763 Solanum Species 0.000 claims description 3
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 2
- ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZDSRFXVZVHSYMA-CMOCDZPBSA-N 0.000 claims 1
- JEOQACOXAOEPLX-WCCKRBBISA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CSCN1.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JEOQACOXAOEPLX-WCCKRBBISA-N 0.000 claims 1
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000967485 Brassica procumbens Species 0.000 claims 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 claims 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 claims 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 claims 1
- 101100258315 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) crc-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 claims 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 claims 1
- 108010068794 tyrosyl-tyrosyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 abstract description 12
- 241000792395 Patellifolia procumbens Species 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 abstract 3
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 15
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 6
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 6
- 102000048193 Mannose-6-phosphate isomerases Human genes 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241001442498 Globodera Species 0.000 description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 3
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000005972 6-Benzyladenine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000291 Nematode infections Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037563 40S ribosomal protein S2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000237956 Amaranthus retroflexus Species 0.000 description 1
- 235000013479 Amaranthus retroflexus Nutrition 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 102100039305 CPX chromosomal region candidate gene 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241001501852 Diomedeidae Species 0.000 description 1
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 235000000292 Gouania lupuloides Nutrition 0.000 description 1
- 244000299452 Gouania lupuloides Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001098029 Homo sapiens 40S ribosomal protein S2 Proteins 0.000 description 1
- 101000745609 Homo sapiens CPX chromosomal region candidate gene 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229910019093 NaOCl Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006004 Quartz sand Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N Rohrzucker Natural products OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005687 plant receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 101150060482 rps2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8227—Root-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Gen indukující odolnost proti nematodám (hlíštičím)
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nukleové kyseliny, která indukuje odolnost proti přisedlým nematodám (hlísticím) v rostlinách, výhodně čeledí Solanaceae a/nebo Chenopodiaceae a/nebo Brassicaceae, zvláště výhodně rodu Beta a/nebo Brassica a/nebo Solanum.
.Vynález se dále týká sekvence DNA klonu ' cDNA a genomového klonu této nukleové kyseliny. Dále se také týká vektoru, kterým může být např. umělý kvasinkový chromosom, YAC, který obsahuje nukleovou kyselinu s genem odolnosti proti přisedlým nematodám v rostlinách. A nakonec se vynález také týká použití nukleové kyseliny nebo vektoru pro indukci odolnosti proti přisedlým nematodám v rostlinách, a také se týká transgenní rostliny, která obsahuje nukleovou kyselinu nebo vektor.
Předkládaný vynález se týká dále proteinu, který je kódován nukleovou kyselinou, testovací soupravy obsahující nukleovou kyselinu a/nebo vektor a způsobu přípravy transgenní rostliny a také způsobu navození odolnosti proti nematodám v rostlinách.
A nakonec se vynález týká i promotoru genu odolnosti.
Dosavadní stav techniky
Je dobře známo, že rostliny jsou napadány mnohdy různými druhy patogenů a parazitů. Je také dobře známo, že kulturní rostliny jsou většinou více náchylné k napadení parazitem než jim příbuzné plané rostliny. Velmi často se lze setkat s rostlinnými parazity třídy Nematoda, tj. hlísticemi, • · · s pseudocoelomovou dutinou obklopenou muskulokutánní pochvou. Nematody jsou důležitými parazity, které způsobuji ztráty na úrodě v celosvětovém měřítku v hodnotě asi 150 milionů DM za rok. Zvláště škodlivé rody nematod jsou Meloidogyne, Heterodera a Globodera, které se trvale usazují v kořenech napadených rostlin, poté co indukovaly určité vyživující struktury. Hlístice Heterodera schachtii má široké hostitelské spektrum, zahrnující mnoho rostlinných čeledí, např. Chenopodiaceae a Brassicaceae.
,Životní cyklus nematod je rozdělen do čtyřech larválních stadií (JI až J4) . Kořeny jsou napadány larvami juvenilního stadia J2, které migrují do středního válce, kde indukují rozvoj syncytia (soubuní). Tato rozsáhlá vyživovací struktura vzniká v.důsledku částečné degradace buněčných stěn mezi buňkami xylémového parenchymu. Po třech obdobích končí nematody svůj životní cyklus dospělým stadiem. Samice nematod nabobtnají a nakonec zcela zničí kůru kořene, přičemž jsou stále vyživovány ze syncytia. Samci po ukončení třetího stadia již nejsou nadále vyživováni a dospělá stadia se přesouvají směrem k samicím, které je přitahují sexuálními feromony. Samice ve zralém stadiu jsou naplněny vajíčky. Po smrti vytvářejí cystu, ve které mohou infekční larvy (ve stadiu J2) přežít v půdě až po dobu 10 let.
Předpokládá se, že gen odolnosti proti nematodám spouští reakci inkompatibility mezi hostitelem a parazitem, která již byla popsána na buněčné úrovni. Kořeny rostlin, které nesou takový gen (případně geny) jsou sice napadeny juvenilními stadii J2, ale většina nematod zahyne v pozdním stadiu J2, neboť degraduje již iniciované syncytium. Jen zřídka se stihne plně vyvinout samičí stadium, které je průsvitné a zastavuje růst. V důsledku toho nematody nejsou schopny uzavřít celý životní cyklus.
• ·
Vzhledem k politice ochrany životního prostředí je možné používat namatocidní prostředky pouze v omezeném rozsahu, je proto zvláště žádoucí implementovat do rostlin takový gen odolnosti.
Zvláště plodiny rodu Beta (např. cukrová řepa, krmná řepa, krmná řepa - mangold, červená řepa) jsou vysoce citlivé k napadení hlísticí Heterodera schachtii způsobující kořenové cysty. Již dávná je snaha vytvořit odolnost proti Heterodera schachtii a jiným fytopatogenním namatodám (např. také rod Globodera) v rostlinách, ale odpovídající geny dosud chyběly. Jediným zdrojem odolnosti je planý druh Beta procumbens a jemu blízce příbuzné B. webbiana a B. patellaris.
Geny odolnosti proti namatodám různých druhů se užívají ve šlechtění druhů kulturních rostlin (např. brambory, rajčata, pšenice, řepka). Gen odolnosti z planého druhu Beta procumbens byl přenesen do cukrové řepy křížením. Z tohoto křížení mohla být selektována odolná cukrová řepa, avšak ta měla nevýhodu špatné kvality a nedostatečných produkčních vlastností. Odolné linie cukrové řepy, odvozené z křížení s Beta ' procumbens mají translokace různých velikostí z planých řep sekce Procumbentes. Nízká produktivita a spatná kvalita těchto linií cukrové řepy jsou zřejmě důsledkem toho, že jsou v těchto liniích přítomny kromě genů odolnosti i jiné geny snižující produktivitu. Také přenos vlastností odolnosti na další generace je neúplný. Tyto nevýhody není možné odstranit pouze šlechtitelskými metodami, neboť je velmi nepravděpodobné, že by se křížením daly selektovat určité vlastnosti bez jiných, neboť někdy jsou nevýhodné vlastnosti přenášeny současně.
Bylo podniknuto mnoho pokusů indukovat umělou odolnost proti namatodám v rostlinách tím, že se kombinovaly sebevražedné geny s promotorem specifickým pro syncytium.
• · · · » · · ·
I · · · • · · · · · • · «· · · · • · · · fl · · • · · · · ··· • · · · · · · ··· • · · * · · · • · I· flfl ·
- 4 Avšak dosud nebylo možné takto vyšlechtit žádnou odolnou rostlinu.
Také dosud nebylo možné identifikovat přirozený gen odolnosti na molekulové úrovni a použit takový gen pro vneseni odolnosti do kulturních rostlin.
Tyto problémy řeší předkládaný vynález.
Podstata vynálezu _Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout nukléovou kyselinu, která přenáší odolnost proti' namatodám v rostlinách. Dalším cílem vynálezu je poskytnout také sekvenci DNA, která tvoří takový gen.
Dalším cílem vynálezu je umožnit použití takového genu pro indukci odolnosti pro přisedlým namatodám.
Kromě toho předkládaný vynález poskytuje transgenní rostlinu, která obsahuje nukléovou kyselinu nesoucí takovou odolnost, a také buňky, semena nebo části rostlin, které obsahují takovou nukléovou kyselinu.
Předkládaný vynález také poskytuje vektory, ve kterých je vložen gen poskytující odolnost proti namatodám, který pomocí těchto vektorů může být účinně přenesen do rostlin.
Vynález dále poskytuje protein kódovaný nukléovou kyselinou a také testovací soupravu obsahující nukléovou kyselinu.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro přípravu transgenní rostliny a způsob pro vyvolání odolnosti k namatodám.
Vynález poskytuje i promotor, který řídí expresi výše uvedeného genu odolnosti.
Obr. 1 ukazuje northernovou analýzu celkové RNA z listů a kořenů. Celková RNA byla izolována z listů a kořenů • · • · « · · · · · • · • 9 ·· rostlin starých 6 týdnů, které buďto byly (1) nebo nebyly (2) infikovány. Jako sonda byla použita cDNA 1832 úplné délky. 20 pg celkové RNA bylo separováno elektroforézou na 1,3% agarózovém gelu a pak přeneseno na nylonovou membránu. Filtr byl hybridizován přes noc v 60 °C s radioaktivně značenou sondou a pak promýván 2x30 minut v 60 °C v 0,2x SSC.
Nárok 1 předkládaného vynálezu poskytuje nukleovou kyselinu, která indukuje odolnost proti přisedlým namatodám v rostlinách, výhodně v rostlinách čeledi Solanaceae a/nebo Chenppodiaceae a/nebo Brassicaceae, zvláště výhodně pak v rostlinách rodu Beta a/nebo Brassica a/nebo Solanum. Poskytnuti takového genu umožňuje nadále šlechtit plodiny, které vykazuji odolnost proti přisedlým namatodám. Takové odolné plodiny jsou mnohem lepši než jim příbuzné neodolné rostliny, neboť nemohou být napadeny nematodami-a jsou tudíž mnohem méně náchylné k onemocnění. Pomocí nukleové kyseliny nesoucí gen odolnosti proti namatodám v rostlinách je možné získat odolné rostliny, které vykazují stejnou ^kvalitu a produktivitu jako jiné, neodolné rostliny. To je dáno tím, že do rostlin se vnese sama taková nukleová kyselina, konkrétně nukleová kyselina pro odolnost proti namatodám, zatímco při konvenčním šlechtění se kromě požadovaných genů přenesou i jiné sekvence DNA, které mohou kódovat nežádoucí vlastnosti.
Zvláště výhodně obsahuje nukleová kyselina, která indukuje odolnost proti namatodám, translatovaný úsek, který je alespoň z 60 % homologní s genem HSlprc_1 z Beta procumbens. Sem patří, kromě jiných, také homologní geny z Beta webbiana a Beta patellaris. Gen HSlpr0_1 z Beta procumbens nese odolnost proti namatodám v rostlinách. 60% homologie se sekvencí DNA uvedenou výše je dostatečná k tomu, aby se indukovala požadovaná vlastnost odolnosti proti namatodám • · · 9 · · · * · 9 · · 999
99 9·· 9999
9 9 · 99 9 ·9 99 » u rostlin, které ponesou tuto nukleovou kyselinu. Geny podle předkládaného vynálezu je možné získat screeningem genových knihoven pomocí sekvence 1832, za následujících hybridizačních podmínek: Teplota hybridizace 50°C, výhodně 60 °C, promývání filtrů v 0,5xSSC, výhodně 0,2x SSC po dobu 30 minut.
Zvláště výhodná nukleová kyselina, která indukuje odolnost proti přisedlým nematodám v rostlinách, obsahuje následující sekvenci DNA:
Tato sekvence bude nadále nazývána sekvence č. 1832.
Předmětem předkládaného vynálezu jsou také nukleové kyseliny, které kódují protein udělující stejnou odolnost k nematodům jako genový produkt kódovaný výše uvedenou nukleovou kyselinou č. 1832, přičemž výhodně všechny takové genové produkty obsahují stejnou sekvenci aminokyselin.
Výhodně je nukleová kyselina cDNA.
• · • · • · · · ··· «··· • · · · · · · · · ·· * • · · · · · · ···· · ··· ··· ····«·· · · •« «· · · · · · · *
V dalším provedení vynálezu je nukleová kyselina, která indukuje odolnost proti přisedlým nematodám v rostlinách, genomová DNA, která obsahuje následující sekvenci:
TCTAC-AGCTG TCGACGCGGC CGCGGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAA.CGA ATTCGGATCT TCTTTCTTGG TGCTT.AATTT TTTGACACTA ATCCGA7TC7 TA.GCA.TTAA.G TTGAA.GCA.CA. CTCTTGAT.AA. ACTA.TGTTAC TATGTATCA.T
TAA.TA.CTTTC CTAAA.CTAC-7 AA_AA_ACT A77CCA7CCG 7CCCA7AA7A
TC-AC-TCCCCT 77C7A7777A C-GAC-TC.AAAA. 777TAAAA7T T7TGACC.AAA.
.C7A7A7A7A AAAACA7ATT CA7G7C-GGA7 C77G77AC-A7 (^'prpirprprp^rp^-T''
-irprprp > Q'' **>
ATACC-AAA.T7 C-.AAGATA7AC AA.TGTCTT.AA AGAC7A7GCA A_AA.GTAA.GCA C-AA.CCTATA7 777GGGACGG AGGGAGT.AA.T A_AGTAA.TA.TT C-ATTGAC
Τ'i 17 > p Λ :
y <~r· > λ *
- •'•GG - ct - - τ 2 2 qt 2 2 2 r > x > •rp/-· rp ^rp (^<Pí’7~'rp 7 > y
*. V-..-.
Λ C i AATGC77A7A AA.TA-AC-CCTA .AA.C-ACTGTC-A. Á7A.GCAA.C-AT CGTTAAAAA.T >ryp 2 C (2 2 T1 2. Τ' C 2 i 2 T T CQ 2 2. 2 rP 2; CZrT^ í_^t .222TTT-C 2 2 22^2'
AGC7TC7CC-G GAA.TC7TATA CCGCTA.CATC TA.TA_ATAA_AA. ATTCCTCA.T
Λ Λ * rpr-prprpp' £ Q Q Λ f rpi rp rp. λ a
AA.CA CACGAAAl
TCCACACGTC TTT.AA_AA.TTT A-AA-AACCTCC ATATATACAC GTCCCCCCTT C7C7ACTTCC A_ATCC.AC.AAA. C77CCA7C77 ATCCA_ACTT'l· CAA.TTTTC.AA. AA.C^CA - - - G - - --tqct i r
C-TCCTTTTAC C-CGAGCCCTT 7CTTTACTC7 CCCCACCTAT CA7C7CACA7 ACACA7ACCC CTCTCACCTA 7C7CC77C77 * ,-prprp (-«> p^rp^ Q 2 2 2 í* Λ x Λ
| ATC-C-TACAA.T | C.AACAC CAA.A | CCTCACA AAA | i 2 ιτςτςς: 2. | A A7CACAAC |
| CÁAA.CGCACA | ATATCAACAC | yppr-p | -CGAG7ACGA | G7AA.T7TCCG |
| r.rr.i ittitc | .-i r- p r« r· P r> i u - c d c s-: | <p * 2 | G77CAC-C7TA | Q rp yp Q r P > pn |
| L_. i v~ Α.--Λ i i V— | CGG.AGC7CCG | Γ-V (·* y y Q«“p rp | .“G. í Λ-.-—--Ti tr | AA77CCCCGG |
| — -C | C-A_-.CCC-AT.-_-. | i“P Ρ» λ A λ Q Q rp £ | 7T7GCAA.C-C.A | 77AGAGATAA |
| CA77CCGG77 | CA7C7CAC7C | ^-nrprprn λ rp z- p- | ACGC7AGACC | |
| CGGCC-AGAAT | GGAACCGC-AA | > rp m > p· > r-· 'Pr— z-> í _ n tr -ntr i C o | 7TAGCGAGAG | A7CAAG7CCG |
| AAACTCATC7 | CAGT^CTCTG | CGGAAGACGA | TGAGACACGT | GGATCAGCTC |
| CGAA.TCGTTG | ATCTGACGTC | ·> ppprp^ rpp /-•'η 1 <r i λ — tr <r « | GAGGTGATGT | CACAAACAGA |
| AGTTČAGCGG | AGGTATGGAA | GC7TGCGA.A7 | GGAGAACATG | A7AC7ACCG7 |
| GGTCTGTCGT | AGTAGCGAA.T | rpirpi-^^p-i^rp$r-»^rri | TCCGAGGTTA | GCCACGTGGC |
| AGAAGTCGGA | GGA.GATTGCT | rp £ rp g 2^*!^ρ P P | 7CTACGCGGT | TGAATCTGCT |
| ATGAGAAGGT | tr i sj tr k3 i λ — tr | TTTGGGCCTT | GGTGAGCCCA | ATTTGGACGG |
| AAAGCCCAA.T | ACGCCG7TTG | TCGTCCTTCT | GAGCTTCACG | |
| CGCTTAAA-AA | GC-GCGCGTTG | GA'TT “ ^ΆΤ'71 C | AGAATTCGGA | AAATCAGATA |
| TTGTTTACAA | TTCATCAGAT | 7.7CGAGTCG | rpfpfp^rprprprprprp | CCTCGAAAAA |
| ATTGTTGGAT | CGAATAAG7G | AGAGGATCAG | TAAAGAAGAG | TTTACCAAAG |
| CAGCAGA.TGA | TTGTTGGATA | CTGGAGAAAA | TA7GGAAGTT | ATTGGAGGAA |
| ATCGA-GAATT | /p>Q^rprprp> rp r-i | AATGGATCCT | GACGATTTCC | TGCATCTGAA |
| GACGCAACTG | AGGATGAAAA | CAGTC-GCGGA | p-> σ’ q φ <3 AAA C T | rprprprp^rprprpm^ |
| GATCAAAAGG | ACTGATCGAG | GTAACAAAAT | TAAGCAAGGA | TCTACGGCAC |
| AAGGTGCCGA | AGATCCTTGG | TGTAGAGGTG | GACCCTATGG | GAGGACCGGT |
| GATACAAGAG | TCGGCAATGG | AGTTGTACCG | AGAAAAAAGA | AGATACGAGA |
| AGATACATCT | GTTACAAGCG | TTTCAAGGGG | TGGAATCCGC | TGTTAAAGGG |
| TTTTTCTTTA | ATTATAAACA | GTTGTTGGTG | ATCATGATGG | GTAGTTTGGA |
| AGCGAAAGCG | AATTTTGCTG | TGATTGGTGG | TTCTACTGAG | TCTTCGGATT |
| TGTTGGCTCA | GTTGTTTTTA | GAACCTACTT | ATTATCCGAG | TTTGGATGGT |
| GCCAAGACTT | TTATTGGTGA | 7TGTTGGGAG | CATGATCAGG | CTGTTGGTAG |
• · · · • · · · • · · « • · · · • ·· · · • · · · · · · ···· ···· • ······ ··· · · · • · · · · • a · · · · ·
CGGCCTCGAT
GGTTTCGAÁG
GTAATGGGCG
TGGCCTTGTT
ACTTATATTT
ATTAATTGTT
ATGAATTTTT
TGTCGTCATC
TTAGTTTTGG
GCGATAGGGA
AGTGAGACGT
AGTGGGAATA
ACACTTGTAT
TGTTGTGACT
Γ Γ Γ > a /- P a -- - 2. (j k? Αλ
ATTGAGTTTG GGTTATGGAG AACGTGGGGC GGAAA.GTGGG GCA.AACTTTG GTTA.CTA.TTA CATGTGATAT TTGCTTTGGT GTATATAGAT AAATTTTTGA TGTATCATGA TGATTATAAC 77TA7GCTCC TTUTrrTTi
TCGGACTGCG AAACAATGAT G7TTGATCTG ACTCGGCTGA
T AG — A-A O
Η1 φ P A A ·—’ >
- 2 ΛΛΛ - C
TTTCACTGAT ATTATTTTTT TGTAC-TCTGA GTATAAGTGC C-GAGTTTAAT
CAAGCAAC-AG AAAAT.AAT.AG AAC-G7GA *“P2.C£C2 2 2 2 C — Czp ,77 'T1' ' A z—r—i > z—
AACACCACAC ACGTATGACT GTGTACC AAATCTAC-AT G.AGTTTTG.AT A7C-.:
Λ Λ rprp 2 2 Ύ Τ' :—.r-ir- Χ-» z— X* z-., ' ^2 Q'_'pT 2 2 ”* rp/-Ap<—. rpiT-rpp-z
CT z— A p· A
AA_AC.-_ATC-C-T
C?CCGG? C77 7C.-_-.7.-_- ’
CA7AC77GGA TTGGAGATCA C-AATAACGGA C-TACATGTCC
777A C AAA G A C- A777A C A ““rp zp rp. z—rp ^rp a \ 7·,^^ z- A q \ >
C- ?7C77CCGA ATAAAATAAG AATTGGCAAA GTGGCACAAG
A -A A A A A Q A A. f .pAfpAAAATV.pAA^ £ TA
C C? ACTTAAi 77A
Z—TA A p· z— Z^PPPTl ΙΤ'ΓΗΓΡ
- J. 2 2 i · « 2 Τ'Ρ'φρ^ ΓΑΓΦ
Z— z— Z“ Z— A A —. ,
C Aí S-J . L. P—“ OOOTT.---.TT A
TG- -2 2 AOTTOOOACO CGGTTCTGAA G^' - - TTTCC^ * z—rprp
GAATATCTT.A TT i ^7 i tgc^ -2172£T-Tt
7rpp> a rprprprp rprprp a 1 2/TTC 2
CG - - TG 2 a t1 a 2 G — T 2 2 T cΛ cλ τc^ CAAA-.C777C GCAC7AAACG A-. 7 G AG AA-. C AAA-.7C-CG7A
A “A pA /—· r—i rp rp /-71
A.AGTTGAGTT
GGAATG.AAGA
2 2^2 TT^T 2 T T g - g T 2 “ •t 2 c - - O - r 'TT TT
AAGC.ACCCC
777CAAC7r
Q pA Z*p z— z— Λ, λ p r-rp. ρ«·—iz—z*>-»z~ ’ - _ 2: a v-' 2: N- .* a -r A rp a z- A A .CTA.C??GTT TAGTTGGACC ρ» p.rArprp,— 7Ί * -pr—? .p-tAQ<,TTTrr’Τ1 T z*· A A — r—IA -A > TA ^7 γ 777^7^7 A A A—řAA— A-Z“> Z—iZ-Ap-.p rpz-pTTGC^^C^
A^AA.-pz— A A rp A ' — _ A <_?1 — .
-κ —ζ-Λ Λ A pAp^pAp» A z·*. 2. ~ .-» 2. . CC- AACTTTGGTC
A z— z— a .-ta /“*·. r—i aa << z' 7 .r' r· A /“* a rp . 2. .7. - - - 2 2. — . 2. 2Γ J.
''.TTr“ .-.r-ι ΤΤ^Τ'^Τ 2 2 2 T £· zp rp a ,“p. z— rp ipA z— z-<
.-.GGG7.-_-.7AC
77.A.AC-77.AC7 rp A A p p 7*. A A A rp T 2 2 TTQT 2_2 2
A A “pz— A Z—<T1Z“ Α» zp X Z*.
GGCAGTGTAC τηT 2 2^^2 2 2 ^p-ip-rpr—. z^A a — ta a a /p rp a “7 r—i a z-. z-«
C7AA.ACCC7C
C.AAAC.ACC-7.A
GG.A-AG.A7CC-.A
CA A a z- z— ΤΑΓ7 Z- A .AGG.A7.-_A7C-7 .A7.A7G.AC77.A
G^t2'g*~2g r- A 'z— z—·. a A ·7ΡΡ z—a Arprp^A^ rprprp
-00^^----0 -20---0^-,·— .''Z-ir A rp A A P* A
C .A C- 7 A_A 7 C- ,-_A .AA.AA-A 7 A_A C- G q zp p* zp a rp ρ» — zp a 7212-Q71-7
A_A77.-_-_AC.A7 .AG7 C7A_AC.A.A C77.A7.AC.A.A7 CC7C7.AC.A7G τ A .'-•'“r-i a -prp A zp a a rp Q00 TTC Q
C- C- A7777C- C- A_A C- C- G .AA.A G .A
7.AC-.AC777.A7
7C.A7GC.AC7.A
C-7C777GG.AG (--Γ^Ρ· Τ'/— o “ΓΆ
AJ i AJ . .U· .AC7.A77C7G7
C.AC77T7777 .AG.AGG.-_-_-_AC7.AC-CG.AC7.-_A
G a G O — A r-, P“i
C7C-C-CC-7C-CC C-.ACCC7C7C-7 itt?τ1-=
Gz— /— r- a Z-Z7Z-Z-A ooo - θ’”1 rp a A rp A A p* A —'
2 2 2 TT 2 2 GT
TTTOOTACAO
TCAOCTOCOC
GGTTAGTCGG rp.rp z- tt a z—Pr z— z— z— T /- * i . k- - A- A. i _ <·
AAA z*/—pn ζ·ρ zp.p^zp p*rpzprprp p rp z— P1 £ = - CG - G - ~- G ” ^C^-GG - G -7 A_-_A 7 A_A C- A_A .-_A77 C CT77 CΔ T Λ Λ ’Τ <— 2: Q τ’ r— γ- rp q j z1'71
C-7C7G.A.AC7.A ř7*.rp rprprp r—rp<7?rp
T 2 2 2 2 2 2 0^0 2 T 2 tpt ρ A a A .-η 7 7 i 7 ' P1 rp —*11-7
CC.A777C7.AC777CC7.AC-7.A
A A p* A rp a Azpz-zTrr'GTT2T> Τ' ,-prpp-ir-r7r“PAz— z— z—
- i _ - - C.
TTT2 2 2 T 2 2 G rp A rpi rp > ,-p A Arp^
C-A_A7CC.AG77
G7C.A7C-G.A.A7
A pn A A rprp a rprp a rprpp- a a TArp a z- « AJ Pi-.—. «. «. 'sj
GzprTim a a z- z— z- ta
1 . Λ.-Χ·^·« . 2 2 2 2 A A Pl z— £ zC.AACCC7.A.A.A
CG.-_A7GGG.AG
7GC7.AG77.AG rp rp g > A A -p rp a a
CCC.AC.A77.AC rpmz— zppArprp^,— a
CGC77GG7C7 C-7CGC7G.A77 77.AT.A7G C7.A CG.AG.AG.A7.AG GGAA.A.AGCC.A .A7GG.-_A.AG7G G οττ'ττ i G£p
| TTGCAATCTC | ςττφτ-’ν L ~“T | ςχ γτ· r* χ /-χ x —x | ACTGGATTAG | GTTGGATTTA |
| T C AA C A C AAA | ATGAGTTGGA | CTATATCACT | ACATTACTGT | GGTCCTGTGG |
| XX X X χ x x χ — | x ·- x <x /— X | οχ -'/χχ x-n/-^/— i i - - xJ | TTAGCGTGGA | |
| γ-’γπ x -pz- Τ' ~ . Λ i C ί Λ L .“i | X' 'Τ'Τ C f~\ Λ τ Τ T ~ | iixs?3ATCT | GAAAA.GGGCG | |
| * z-* Γ* Τ T pxrx 1 1 i Λ « U | TT 2; TT 1 '“.Q* Λ | r-.qxr-' 171 i | GACTTTGATC | AAGCCCAAA.T |
| CCACCCGCAA | Xf x X fprpx p | CCTTTATTTT | CAA.C-C-CACCA | TCACTGCATA |
| x x x x x rp i/-* | XXX ςχζ- <-*/- X —> X | x x x n1TT | GTCCAA.TA.7G | C7CACAC-CCA |
| A X A X .-r·. x X · T | £ i/TT i TTC“T | TGGTAAG.AAA | AGGT.AA.TAGG | CTAGATCAA.T |
| TTGCTGCCAA. | TTGCCAC-GCC | <—·. /— rx <· » . s_' | TCACCTC-TGG | > TTT > > T |
| ATG? CTCAAA. | r* - xj SJ \-·χ- | TGTTAAGTAC | ACCAA.CATGA | Z* ™ i £ z—px |
V polohách označených ? může být kterákoliv z baží A, G, C nebo T, nebo nemusí být žádný nukleotid. Translační počátek je podtržen. Tučná písmena představují frakci cDNA. V přiloženém protokolu o sekvencování je místo ? uvedeno N.
Tato sekvence bude nadále označována jako 1832.1. Původní sekvence o délce 5407 nukleotidů, jak je uvedena na obr. 2, obsahuje sekvenční chyby, které však neovlivňují úsek kódující protein.
Předkládaný vynález se dále týká sekvence -uvěďené zde jako sekvence id. č. 3 (dále nazývaná 1332A1).
Také se týká nukleové kyseliny, kterou lze , získat screeningem knihovny DNA. pomocí sekvence DNA., např. výše popsané sekvence, která kóduje odolnost proti nematodám jak bylo demonstrováno např. pro klon 1832.
Výhodně nukleová kyselina pochází z planých druhů sekce Procumbentes rodu Beta.
Zvláště výhodně nukleová kyselina, jak byla popsána výše, indukuje odolnost proti přisedlým nematodám rodu Meloidogyne, Heterodera a/nebo Globodera. Zvláště výhodná je indukve odolnosti 'proti Heterodera schachtii v rostlinách. Zvláště výhodně je rezistence proti přisedlým nematodám indukována u rostlin druhu Beta vulgaris.
Vnesením takového genu do rostliny, která má být modifikována, se ovlivní pouze vlastnost odolnosti proti nematodám Nelze čekat, že dojde k jakémukoliv pleiotropnímu • · · » · · · ···· ···· · · · · · · · · • ·· · » · ······ ··· · · · ······· · · • · ·· ·· · ·· ··
- 10 účinku. Takže produktivita původního šlechtitelského materiálu zůstane neovlivněna. Transgenní rostliny, které exprimuji výše uvedený gen, projevují reakci inkompatibility proti cystickým namatodám. Lze je tudíž využít pro další šlechtění odolných kultivarů. Vzhledem k tomu, že se jedná o přirozenou nukleovou kyselinu nesoucí gen odolnosti z planých druhů sekce Procumbentes rodu Beta, lze čekat, že nebudou žádné problémy s přijetím, co se týče geneticky modifikovaných rostlin. Kultivary odolné k namatodám, které budou obsahovat výše uvedený gen, umožní zvýšit podíl hostitelských plodin v osevních plánech. V případě cukrové řepy, to teoreticky znamená, že plodina s vysokou rychlostí obratu se může pěstovat ve zvýšeném rozsahu. Navíc sekvence HSlpr°-1 je aktivní nejen v rostlinách rodu Beta, ale je schopna vyvolat odolnost k namatodám také v rostlinách jiných rodů, např. v Arabidopsis thaliana.
Zda má sekvence schopnost vyvolat odolnost proti namatodám v rostlině je možné zkontrolovat standardními 'testy, jaké jsou pro příklad uvedeny podrobně dále.
Podle výhodného provedení předkládaného vynálezu je předmětem vynálezu vektor, zvláště výhodně kvasinkový umělý chromosom (yeast artificial chromosome, YAC), který přenáší odolnost k namatodám v rostlině a obsahuje nukleovou kyselinu popsanou výše.
YAC může obsahovat např. následující sekvence DNA:
1. Sekvenci č. 1832
2. Sekvenci č. 1832.1
Přitom 60% homologie s nukleovou kyselinou obsaženou v YAC je dostatečná pro indukci odolnosti v rostlině.
Výhodné YAC jsou uvedeny v následující tabulce:
- 11 Tabulka 1
| YAC | Velikost v kbp | Specifita | Klonované sekvence konců YAC | |
| levý | pravý | |||
| YAC42D12 | 50 | 643 | - | + |
| YAC112G9 | 60 | 643 | + | + |
| YAC120E7 | 150 | 643 | + | + |
| YAC31G11 | 70 | D13 | + | + |
| YAC80G3 | 200 | YAC31L | - | + |
| YAC116C5 | 50 | YAC31R | - | - |
| YAC114H8 | 120 | YAC104L | - | - |
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se v rostlinách indukuje odolnost proti namatodám rodu Meloidogyne, Heterodera a/nebo Globodera. Zvláště výhodná je odolnost namířená proti Heterodera schachtii.
Zvláště výhodně je rezistence proti namatodám indukována u rostlin druhu Beta vulgaris.
Dále je předmětem vynálezu použití nukleové kyseliny nebo vektoru,jak jsou popsány výše, pro indukci odolnosti proti přisedlým namatodám v rostlinách.
Kromě toho je předmětem vynálezu transgenní rostlina, která obsahuje nukleovou kyselinu nebo vektor podle předkládaného vynálezu.
Gen může být exprimován v rostlině po transformaci standardním způsobem buďto z konstitutivního promotoru nebo z vnitřního promotoru, který leží upstream (proti směru transkripce) od translatovaného úseku sekvence. Tím se způsobí, že se spustí reakce inkompatibility proti namatodám, zvláště proti cystické hlístici Heterodera schachtii .
Promotorový úsek genu velikosti asi 1500 nukleotidů, lokalizovaný upstream se může využít pro expresi, a to • 9 ·
• · · · ·
- 12 specifickou pro kořeny, jakéhokoliv genu v kterékoliv rostlině. To se týká promotorů, které pocházejí z netranslatovaného úseku 5'-konce genu HSlpro_1 a mají stejnou promotorovou aktivitu jako promotor genu HSlpro-1.
Výhodný promotor leží v Xbal fragmentu mezi pozicemi 1 až 1521 v sekvenci 1832. Dalšími výhodnými promotory jsou promotory odvozené z uvedeného promotor např. inzercemi, delecemi, substitucemi a/nebo inverzemi, které přitom mají stejnou promotorovu aktivitu nebo dokonce mají vyšší promotorovou aktivitu. Přítomnost promotorové aktivity může být identifikována standardními způsoby, jaké jsou popsány dále v příkladech.
Deriváty výše uvedeného promotoru 1832, které vykazují alespoň 10 % aktivity (síly) promotoru, se považují za promotory podle předkládaného vynálezu.
- Tak např.- promotor 1832 je v Arabidopsis thaliana aktivován tak, že sekvence 1832 řízená příslušným promotorem indukuje odolnost proti Heterodera schachtii v hostiteli.
Ve výhodném provedení transgenní rostlina patří do rodu Beta nebo Brassica. Zvláště výhodně patří transgenní rostlina ke druhu Beta vulgaris. Předmětem vynálezu jsou dále buňky, semena nebo části rostlin, které obsahují nukleovou kyselinu nebo vektor podle předkládaného vynálezu.
Dále je předmětem vynálezu protein kódovaný nukleovou kyselinou a také jeho deriváty se stejnými vlastnostmi poskytovat odolnost' odolnosti.
Protein podle předkládaného vynálezu je možné získat expresí nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve vhodném hostiteli jako jsou např. bakterie, kvasinky, savčí a rostlinné buňky.
• · « • · · · ·
- 13 Předmětem vynálezu je kromě toho také testovací souprava, která obsahuje nukleovou kyselinu nebo vektor podle předkládaného vynálezu nebo protein podle vynálezu. Dále se vynález také týká způsobu přípravy rostlin, který spočívá v tom, že nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu,popsaná výše, se vnese do rostlinné buňky a z této rostlinné buňky se regeneruje rostlina.
Vynález se dále týká způsobu vyvolání odolnosti proti namatodám v rostlinách, který spočívá v tom, že nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu, popsaná výše, se vnese do rostliny citlivé k napadení nematody.
Kromě toho je předmětem předkládaného vynálezu také promotor, který řídí expresi nukleové kyseliny podle vynálezu, popsané výše, a který je specificky aktivní v kořenech.
Úsek přilehlý 5'-konci genu, tj . XbaT fragment přibližně velikosti 1,5 kb, obsahuje typické prvky eukaryotického promotoru, jako je např. TATA box. Promotor je, zjevně specifický pro kořeny, neboť po northernovéanalýze s RNA listů a kořenů byl nalezen signál pouze v kořenové RNA. To je také potvrzeno pokusy s transgenními brambory, které' byly transformovány fúzním produktem promotoru 1832 a genu GUS. V tomto pokusu kořeny jasně ukázaly barevnou reakci, což dokazuje aktivitu promotor 1832.
Tudíž se úsek 5'-konce velikosti 1532 nukleotidů z genu 1832 a jeho deriváty s podobnou promotorovou aktivitou mohou použít pro expresi jakéhokoliv genu, zvláště v pletivu kořenů, v různých rostlinách. Vhodné deriváty jsou takové, které mají alespoň 10 % promotorové aktivity sekvence 1832.1. Příklady použití takové sekvence jsou exprese genů odolnosti proti namatodám a také odolnosti proti jiným škůdcům v kořenech, a také exprese genů, které se účastní • · · ···· · · · · · · · · • · · · · · · ···· · ··· ··· «······ · · • · ·· ·· · ·· ··
- 14 translokace sacharózy nebo genů, které se podílejí na ukládání sacharózy nebo inulinu. Deriváty promotorů podle předkládaného vynálezu jsou sekvence, které jsou odvozeny ze sekvence promotoru genu 1832 např. pomocí deleci, inzercí, záměnami baží apod., přičemž jsou zachovány vlastnosti promotoru genu 1832.
Nakonec předmětem vynálezu jsou také primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), které lze získat ze sekvence č. 1832.1.
Předmět vynálezu je dále podrobněji popsán formou příkladů, které vsak předmět vynálezu nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování genu HSlFro_1
Pro klonování genu KSlFro_1 byly identifikovány markéry se silnou vazbou. Satelit (pRK643) specifický pro B. procumbens byl klonován z jedné linie s adičním fragmentem. Southernova analýza ukázala, že všechny testované odolné linie * nesly tento satelit, což ukazuje, že leží v úseku genomu planých druhů B. procumbens, kde je lokalizován také gen odolnosti. Markér byl shledán velmi užitečným pro identifikaci translokační linie s nejmenším segmentem z plané řepy ve velkém počtu chromosomových mutantů. tato linie pak byla vybrána pro požiční klonování genu. Markér pRK643 kosegregoval perfektně s odolností v segregující populaci F2 obsahující 241 jedinců. S využitím satelitního markéru jako sondy byly z YAC knihovny z linie A906001 izolovány 3 klony obsahujíc! úsek genu HSl^0'1.
4· ·· • ·
• · · · ·
- 15 Příklad 2
Identifikace transkribovaných sekvencí z YAC
Aby bylo možné identifikovat transkribované sekvence z YAC, byla připravena cDNA knihovna z kořenů rostlin A906001 infikovaných nematody. Knihovna pak byla screenována se třemi YAC, což vedlo k izolaci 3 klonů cDNA označených č. 1832, 1845 a 1859. Klon 1845 jevil křížovou hybridizaci s DNA z cukrové řepy, zatímco klon 1859 poskytoval vzorec několika pásů jak s DNA z citlivých tak i odolných rostlin. Další práce pokračovala s cDNA 1832, protože:
1. Tato cDNA vedla k signálu odpovídajícímu jediné kopii genu v případě analýzy DNA z odolných linií, zatímco v případě citlivých rostlin cukrové řepy nebyl získán žádný signál, což vede 1 předpokladu, že tento gen není přítomen v bulvách kultivovaných rostlin. Každá monosomální aditivní linie, která nesla gen poskytla signál při testu s touto sondou.
2. ·- Projevovala úplnou kosegergaci s vlastností odolnosti ' v segregující poulaci F2.
3. Transkript velikosti 1,6 kb byl přítomen pouze v kořenech odolných rostlin, jak ukázala northrenová analýza.
Výrazně silnější hybridizční signál ve srovnání s neinfikovanými kořeny byl nalezen při analýze RNA z kořenů, které byly infikovány Heterodera schachtii .
4. Sekvenční analýza výše uvedeného polypeptidu vedla k objevení motivů, které jsou typické pro produkty genů odolnosti v současné době známé.
Takže vezmeme-li v úvahu všechny uvedené výsledky, klon 1832 představuje gen specifický pro planou řepu, který je exprimován pouze v kořenech a je stimulován po infekci nematody.
·· ··
4 4 9 9
4 94 4
4 4 9 4 4
9 9 4 9
44
444 • · ··
- 16 Příklad 3
Genetická komplementární analýza
Pomocí indukce s Agrobacterium rhozogenes byly získány kultury kořenového vlášení, které byly užity pro genetickou komplementační analýzu. Bylo zjištěno, že kultury kořenového vláčení cukrové řepy jsou vhodným substrátem pro kořenové patogeny. Kompatibilní reakce u citlivých a také inkompatibilní reakce u kořenů odolných proti cystickým namatodám se udržuje v kultuře kořenového vlášení cukrové řepy. Citlivá linie cukrové řepy (č. 93161p) byla transformována cDNA 1832 velikosti 1450 bp využitím genového přenosu prostřednictvím A. rhizogenes. Genové modifikace vnesené do transformant metodami genové inženýrství byly ověřeny pomocí testu s GUS a Southernovým přenosem DNA. Po inokulaci juvenilním stadiem J2 bylo nalezeno šest nezávisle transformovaných kořenů, které exprimovaly gen 1832 a projevovaly stejnou- inkompatibilní reakci jako odolná linie A906001, zatímco v citlivé kontrole a také v kultuře kořenového vlášení, která neobsahovala gen odolnosti, se nematoda normálně vyvinula. Citlivost k infekci nematody se může obnovit transformací odolné kořenové kultury s antisense konstruktem (konstrukt s orientací proti směru normální transkripce) genu 1832.
Tyto výsledky z pokusů potvrzují, že odolnost kořenových vlásků z linie 93161p je závislá na expresi genu 1832. Izolovaný gen byl nazván HSl^0'1, neboť přenáší odolnost proti namatodám na citlivou linii cukrové řepy takovým způsobem, který se plně shoduje s odolností linie A906001.
·· ·· ·· • · · · · • · ·· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· φ ·· ·* • · · · · • · · · · · ···· · ··· ··· • · · • ·· ··
Příklad 4
Sekvencování cDNA
Sekvencování celé cDNA a také odpovídajícího genomového klonu vedlo k odhalení otevřeného čtecího rámce velikosti 846 bp bez intronů, který kóduje výše uvedený genový produkt složený z 282 aminokyselin, což plně souhlasí s údaji získanými z northernové analýzy RNA.
Příklad 5
Strukturní analýza sekvence aminokyselin
Sekvence aminokyselin výše uvedeného polypeptidu se může rozdělit na čtyři různé subdomény. Předpokládaný signální peptid (doména A) může být vymezen na N-konci, jeho funkcí je zřejmě vést protein k cytoplasmatičké ' membráně. Na N-konci polypeptidu HSlprc_1 lze také rozeznat úsek bohatý na leucin (doména C), který je uspřádán v podobě nedokonalých, na leucin bohatých, opakujících se jednotek. ” Opakující se' na leucin bohaté jednotky (leucine rich repeats) se podílejí na interakcích typu protein-protein a byly nalezeny také v již dříve klonovaných genech odolnosti z rostlin, např. genu RPS2 z A. thaliana. jejich funkce je různá, od míst pro vzájemné rozpoznávání v molekulách podobných receptorům, které jsou lokalizovány extracelulárně až po katalytické domény, které jsou aktivní v cytoplasmě. Podobně jako u LRR identifikovaných u'jiných genů odolnosti v rostlinách, úseky LRR polypeptidu KSl- jsou značně méně konzervativní než odpovídající konsenzní (souhlasné) sekvence LRR nadřazené konsenzní rodiny. Úsek LRR polypeptidu HSP”'1 je charakterizován konsenzním motivem 20 aminokyselin (xLxxaxxaxLxxLxxaxxxL, kde L je leucin nebo isoleucin, a je • · * ·
- 18 alifatická nebo aromatická aminokyselina a x je jakákoliv aminokyselina). Leuciny a zbytky alifatických aminokyselin v pozicích 2, 5 a 16 jsou lokalizovány ve stejných pozicích jako v konsenzní sekvenci LRR superrodiny. Vysoce konzervativní asparagin v poloze C je nahrazen leucinem/isoleucinem. Tento asparagin chybí také v konsenzní sekvenci LRR polypeptidu RPS2. Hydrofobní doména 17 aminokyselin v HSl?r°‘1 genu (doména F) je zřejmě transmembránovým segmentem. Doména C-konce obsahuje zbytky pozitivně nabitých aminokyselin a předpokládané N-glykosylační místo.
Model interakce mezi rostlinou a patogenem typu elicitor-receptor předpokládá, že produkt genu odolnosti působí jako specifický receptor pro patogenní spouštěče v souladu s hypotézou gen za gen. Analýza sekvence HS1?~: vede k domněnce, že se této gen podílí na odolnosti tím, že se tvoří část kaskády obranné reakce. Uvedený polypeptid obsahuje nedokonalé LRR, které leží na N-konci s dalším signálním peptidem, předpokládanou transmembránovou doménu a pozitivně nabitý C-konec, čímž dobře zapadá do druhé skupiny genů odolnosti rostlin.
Lze predikovat podobnou proteinovou strukturu a genu odolnosti Cf-9 z rajčat, ačkoliv nebyla zjištěna žádná významná sekvenční homologie. Vysvětlení způsobu reakce odolnosti je takové, že extracytoplasmatické LRR působí jako domnělé spouštěče rozpoznávající receptor. Je známo, že nematoda produkují' sekret, který intěraguje s rostlinnými receptory vázanými na membránu. Pozitivně nabitý C-konec pravděpodobně reaguje s cytoplasmatickou složkou přenosu signálů. Alternativně může, jelikož se jedná o protein lokalizovaný v cytoplasmě, působit jako receptor pro • · • *
- 19 spouštěče, které byly vneseny do buněk prostřednictvím ústního bodce nematod.
Tím, že byl klonován první rostlinný gen, který se podílí na odolnosti proti namatodám, bude možné lépe porozumět obranným procesům proti namatodám, které jsou hostitelsky specifické. Kromě toho izolace genu HSlpro_1 nabízí možnost přenést odolnost do zemědělsky významného hostitele, který neobsahuje žádné alelické formy takového genu.
Příklad 6
Identifikace a charakterizace promotoru genu HSlpr0_1
Fragment Xbal velikosti asi 1,5 kb, který odpovídá přilehlému úseku 5'-konce genu a sekvenci 1832.1, byl izolován z knihovny lambda-DASH II pomocí pCR fragmentu z úseku 5'-konce genu HSlpro_1. Izolovaná sekvence promotoru obsahuje typické prvky eukaryotického promotoru jako je TATA box se sekvencí TACATAAA v pozici 23 před počátkem transkripce na 5'-konci cDNA.
Identifikovaný promotor je kořenově specifický, neboť v northernové analýze se sondou z 5'-konce genu 1332 byl nalezen signál pouze v pletivu kořenů.
A navíc konstrukty obsahující promotor podle předkládaného vynálezu a reportérovy gen GUS vykazují barevnou reakci výlučně v kořenech transformovaného bramboru nebo tabáku.
Dále bylo zjištěno, že promotor je indukovatelný nematody. To ukazuje srovnání transkripční aktivity kořenů cukrové řepy infikovaných hlísticí Heterodera schachtii a neinfikovaných. Z těchto výsledků je možné usoudit, že promotor podle předkládaného vynálezu váže transkripční • ·
- 20 faktory, které pocházejí z nematod nebo které se vytvářejí v rostlině v důsledku infekce.
Uvedené pokusy ukázaly, že promotor HSlpro_1 je kořenově specifický.
Příklad 7
Exprese sekvence 1832 v Arabidopsis cDNA genu 1832 byla fúzována s genem GUS (Vancanneyt et al., 1990, MGG, 245) a umístěna pod kontrolu promotor 35S. Pomocí vektoru pAM194 (popsaného dále) byl konstrukt vnesen do Arabidopsis thaliana standardním způsobem pomocí Agrobacterium tumefaciens. Po 3 generacích samosprášení byly získány linie, které projevovaly úplnou odolnost proti Heterodera schachtii, tj . nebyly na nich pozorovány vůbec žádné cysty ani vyvíjející se samice. Testy odolnosti byly provedeny na Petriho miskách s infekčními larvami. Byla také stanovována aktivita GUS.
Příklad 8
Tkáňově specifická regulace promotoru 1832
Pro tyto pokusy byl restrikční fragment Xbal (Xbal místa v pozicích 1 a 1521 sekvence 1832.1) fúzován genem GUS a vnesen do kořenů cukrové řepy a bramboru prostřednictvím vektoru pBIN19 pomocí kotransformace s Agrobacterium tumefaciens/Agrobacterium rhizogenes. V případě kultury kořenového vlášení cukrové řepy byla pozorována aktivita GUS pouze v syncytiu. V neinfikovaných kořenech a nebo tam, kde nebyly žádné nematody, nebyla detekovatelná žádná aktivita GUS. To ukazuje, že použitý promotor má prvek (nebo prvky) odpovídající na patogen (pathogen-responsive), který je • · • · • to toto · ··· · ·· · • ·· * * · ····· · ··· ··· ·»····· · .. ·· ·· ·· · ·· **
- 21 aktivován až po napadení patogenem. Takže promotor 1832 umožňuje tkáňově specifickou expresi jakéhokoliv genu v hostitelské rostlině jako je např. cukrová řepa.
Příklad 9
Exprese cDNA 1832 v řepce
Děložní lístky řepky (Brassica) byly transformovány konstruktem obsahujícím sekvenci 1832 obdobně jak bylo popsáno v příkladu 7. Děložní lístky byly kultivovány na živném médiu MS, selekce se prováděla na MS médiu s přídavkem antibiotika carbenicilinu. Ověření transformantů bylo pozitivní jak v testu s GUS tak v PCR analýze.
Příklad 10
Identifikace varianty klonu 1832.1 označené jako 1832A1
Byla identifikována varianta klonu 1832,která obsahuje otevřený čtecí rámec, kde startovací kodon ' odpovídá ATG v pozici 924 v sekvenci 1832.1. Stop kodon odpovídá pozici 2397 sekvence 1832.1. Varianta 1832A1 obsahuje i další malé rozdíly ve srovnání se sekvencí 1832.1, jak je patrné ze srovnání těchto sekvencí. Překvapivě, po expresi v hostitelských buňkách, všechny sekvence, tj. 1832.1, 1832 i 1832A1, vedly ke vzniku odolnosti proti napadení nematody. Pokud nebudeme lpět na jediné teorii, dalo by se předpokládat, že nejkratší sekvence, tj. 1832, kóduje všechny nutné prvky, které zajišťují, že výsledný protein má schopnost indukovat odolnost proti namatodám. Obr. 3 ukazuje schematicky vzájemné srovnání kódovací kapacity 3 klonů 1832.1, 1832 a 1832A1. Je patrné, že úsek 1832 je společný všem klonům.
• * · ·
I · · · » · · · • · · · · · * · ·· ··
- 22 Příklad 11
Příprava expresního vektoru pAM194
Binární vektor pAM194 kombinuje vlastnosti klonovacího vektoru a rostlinného transformačního vektoru (Ti-plazmid). Jeho vhodnost jako transformačního vektoru byla ověřována společně s Agrobacterium tumefaciens a také v kombinaci s Agrobacterium rhizogenes v kotransformačních pokusech. Vektor je derivátem plazmidu pBI121 (Jefferson et al. 1987) (Clontech Laboratories), kostru pro pBI121 poskytl pBIN19 (Bevan et al. 1984).
Plazmid pAM194 obsahuje následující prvky:
• fragment obsahující gen NPTII jako slekeční markér, kromě hraničních sekvencí (LB, LR) , • levou a pravou hraniční sekvenci (LB, RB), • gen NPTII z Tn5 pro selekci v rostlinách, • gen GUS z E. coli s intronovou sekvencí ST-LS1 (Vancanneyt et al. 1990), • kazetu obsahující promotor 35 S a terminátor s jedinečnými restrikčními místy pro účely klonování.
Příprava plazmidu:
Plazmid pBI121 byl naštěpen HindlII/Sstl. Naštěpený fragment HindIII/SstI-35S-GUS byl nahrazen subklonovaným fragmentem 35S-GUS s intronem. Restrikční místo pro EcoRI bylo odstraněno tím, že se naštěpilo EcoRI a přesahující konce se zaplnily pomoc Klenowova fragmentu polymerázy I z E. coli. Pak byla provedena ligace a vznikl tak plazmid pBIN-GUSINT. Kazeta obsahující 35S promotor - 35S terminátor s jediným klonovacím místemm EcoRI z plazmidu pRT104 (Topfer et al. 1987) byla klonována do místa HindlII konstruktu pBIN• » • ·
- 23 GUSINT, čímž vznikl pAM194. Byla využita (a je citována) následující literatura:
• BevanM, 1984: Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Research Vol. 12, No.22, 8711.
• Jefferson R A, Kavanaugh T A, Bevan M W, 1987. EMBO Journal Vol.6, 3901.
• Tópfer R, Matzeit V, Gronenborn B, Schell J, Steinbiss Η H, 1987: A set of plant expression vectors for transcriptional and translational íusions. Nucleic Acids Research Vol. 15, No. 14, 5890.
• Vancanneyt G, Schmiot R, 0’Connor-Sanches A, Willmitzer L, Rocha-Sosa M, 1990: Construction of an intron-containing markér gene. Molecular General Genetics, 245-250.
Konstrukce plazmidu je schematicky znázorněna na obr. 4.
Příklad 12
Transformace cukrové řepy
Pro transformaci byl použit Agrobacterium tumefaciens kmen EHA101 (Hood E.E. et al., 1986,J. Bacteriology 168, 1291-1301), který byl transformován plazmidem LD10/1832-13 (voz obr. 5a až 5d) nebo vektorem LD10, což je plazmid postrádající cDNA 1832, a transformace byla provedena metodou mražení-tání (Holters et al. 1978).
Pro transformaci byla sterilní semena cukrové řepy Elitě 0-272 naklíčena na médiu obsahujícím 2,0 g/1 sacharózy a 4,0 g/1 agarózy. Embrya byla odříznuta a děložní lístky byly opatrně odstraněny a použity jako explantáty. Kmena Agrobacterium tumefaciens EHA101 s plazmidem LD10/1832-13 nebo kontrola s plazmidem LD10 (viz obr. 5c) byl kultivován v médiu LB (Maniatis et al., 1982), ke kterému byl přidán: 50 mg/1 kanamycin, 75 mg/1 spectinomycin, 150 mg/1 streptomycin, 50 mg/1 acetosyringon, na rotačním zařízení (340 RPM) při 27 °C až do OD (při 660 nm) kolem 1.
• * • ·
- 24 Bakteriální suspenze pak byla nařéděna médiem LB na OD 0,1 a pak použita pro inokulaci explantátů, které byly pak kokultivovány 2 až 4 dny při teplotě 22 °C.
Selekce transgenních výhonků se prováděla pomocí modifikovaného manéžového systému. Tak byly vybrány transgenní výhony cukrové řepy. Po kokultivaci byly explantáty přeneseny na médium obsahující jako základ médium MS (Murashige a Skoog 1962), ke kterému bylo přidáno: 0,05 mg/1 kyselina α-naftyloctová, 0,25 mg/ml 6-benzyladenin, 500 mg/1 karbenicilin, 20 g/1 sacharóza a D-manóza, přičemž koncentrace D-manózy rostla postupně během selekce od počáteční koncentrace 1,25 g/1 po první dvě subkultivační období pře 5,0 g/1 po dvě následující subkultivace až po konečnou koncentraci 10 mg/1 po poslední období kultivace. Každé subkultivační období trvalo 3 týdny. Výhonky odolné manéže byly nadále kultivovány na médiu MS s 0,25 mg/1 6-benzyladeninu a kořeny se objevovaly v podstatě ve shodě s tím,.co publikoval Miedema (1982).
Analýza výhonků rezistentních manéže byla provedena následujícím způsobem. Alsy bylo jisté, že všechny manéže rezistentní výhonky, které přežily selekci, byly transgenní, byly všechny podrobeny testu na aktivitu PMI. Výhonky, které nejsou transgenní, nemají žádnou aktivitu PMI (fosfomanózoizomeráza) . Extrakty ze 2 až 3 špiček listů velikosti asi 3 mm byly použity v enzymovém testu na PMI, který byl modifikován podle Feramisco et al. (1973) a Gill et al. (1986). Přibližně 80 až 90 % výhonků projevilo významnou aktivitu PMI. Zbývajících 10 až 20 % bylo odstraněno.
Pro test s nematody byly vybrány rostlinky vykazující aktivitu PMI a s dobrým rozvojem kořenů (staré 4 až 6 týdnů), byly vyjmuty z agarových ploten a kořínky byly opatrně opláchnuty vodovodní vodou. Rostlinky byly zasazeny do jamky • ·
- 25 v pískovém sloupci 4x2x12 cm obaleném plastem. Písek byl opatrně doplněn kolem kořínků a rostlinka byla umístěna pod plastový kryt na 10 dní při 25 °C. Během tohoto období byl kryt občas sejmut, aby se rostliny otužovaly. Rostliny pak byly inokulovány pomocí injekční stříkačky tak, že ke každé rostlince bylo do písku inokulováno 200 juvenilních stadií (J2), pokud možno co nejblíže k rostlině. 3 týdny po inokulaci se vyvinuly samičí cysty a byly kvantitativně vyhodnoceny pomocí stereoskopického mikroskopu. Celý kořen každé jednotlivé rostliny byl vyšetřen. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Výsledky v tabulce býly získány s normálními (tj. netransgenními) k infekci citlivými rostlinami linie Cx, transgenní kontrolní linií CLD10, normální (tj. netransgenní) k infekci citlivou kontrolou, která se vyvinula ze semen (C2) a transgenními rostlinami, které obsahovaly-konstrukt LD10/1832-13 (Ti až T9) .
| Rostlina | Počet - rostlin | Průměrný počet cyst na rostlinu | ID číslo |
| kontrola Ci | 4 | 9 | lab535 |
| kontrola C2 | 9 | 9,3 | rostliny ze semen |
| kontrola CLD10 | 2 | 9,5 | T9600130 |
| Ti | 2 | 14 | 1458D |
| T2 | 2 | 9,5 | 1468A |
| T3 | 2 | 4 | 143614J |
| T4 | 4 | 4,3 | 14479K |
| T5 | 2 | 2,5 | 144710L |
| T6 | 3 | 5, 3 | 14054D |
| T7 | 4 | 6, 75 | 14261H |
| T8 | 5 | 5 | 14052B |
| T5 | 4 | 7,5 | 14053C |
• ···· · • · ·
- 26 Devět nezávislých linií s konstruktem LD10/1832-13 bylo analyzováno v tomto testu. U dvou z nich (Ti a T2)se vyvinul přibližně stejný počet cyst jako u kontrol C2, C2 a CLD10. Tři transgenní rostliny (T3, T4 a T8)vyvinuly asi polovinu cyst ve srovnání s kontrolami, což ukazuje, že gen je do jisté míry aktivní v těchto rostlinách. U jedné transgenní linie, a sice T5, byl vývoj cyst v souladu s dříve publikovanými výsledky (Cai et al. 1997). V linii T5 se vyvinulo v průměru je 2,5 cyst na jednu rostlinu, což je podstatně méně než počet cyst, který byl pozorován u různých kontrol, kde byl v průměru 10. To jasně ukazuje, že gen 1832 je aktivní v kořenech této linie cukrové řepy, což je komerčně využitelné.
Byla použita následující literatura:
• Cai D, Kleine M, Kifle S, Harloff H-J, Sandal Ν N, Marcker K A, Klein-Lankhorst R M, Salentijn EMJ, Lange W, Stiekema W Jj Wyss U, Grundler M W and Jung C (1997). Science 275, 832-834.
• Feramisco R, Tilley Β E, Conn W R, Gracy R W, Noltman E A (1973). Biochem. Biophys. Res. Comm. 55, 636-641.
• Gill J F, Deretic V, Chakrabarty A M (1986). J. Bacteriol. 167,-611-615.
• Holters et al. (1978). Mol. Gen. Genet. 163, 181-187.
• Maniaus T, Fritscn E F, Sambrook J (1982). Molecular Cloning. A laboratorv manual. Cold Spring Harbor Laboratorv, New York, USA.
• Miedema P (1982). Euphytica 31, 635-643.
• Murashige T, Skoog F (1962). Plant Physiol. 15, 473-497.
Příklad 13
Příprava plazmidu LD10/1832-13
Příprava uvedeného plazmidu je schematicky znázorněna na obr. 5a az 5d. Konce fragmentu Xbal obsahujícího pozice nukleotidů 1521 až 2904 podle sekvence id. č. 1 byly
- 27 zaplněny Klenowovým enzymem. Fragment byl pak vložen do místa BamHI piazmidu pPS48, který byl také opatřen tupými konci. Nový plazmid pojmenovaný pPP48/BamHI-15 byl pak naštěpen HindlII. Fragment HindlII obsahující baze 0 až 2403 byl vložen do místa HindlII piazmidu pLDIO, čímž vznikl plazmid LD10/1832-13 .
Příklad 14
Transformace řepky Brassica napus sekvencí 1832 pro získání odolnosti k nematodám a test odolnosti
Ti-plazmid pAM194, obsahující gen odolnosti proti nematodům (sekvence 1832), byl použit jako transformační vektor. Tento vektor byl již podrobněji popsán v příkladu 11.
Jako bakteriální kmen byl použit kmen Agrobacterium tumefaciens C58C1 ATHV Rif odvozený z kmene EHA101, který nese pomocný plazmid pEHAlOl bez kanamycinové rezistence.
Kmen AMT odpovídal výše uvednému kmenu C58C1 ATHV Rif, který obsahoval plazmid pAM194-1832.
Kultivace bakterií po kulturu AMT probíhla na LB agaru s 50 mg/L kanamycinu a 100 mg/1 rifampicinu a až do použití byla kultura skladována v lednici. Dva dny před zamýšlenou transformací bylo 30 ml LB média inokulováno příslušnou bakteriální kulturou. Pro selekci bakterií tekuté médium jako např. LB agar, obsahovalo 50 mg/L kanamycinu a 100 mg/1 rifampicinu. bakterie byly inkubovány 24 hodin ve tmě při teplotě 28 °C na třepačce s 190 RPM. Druhý den bylo inokulováno 30 ml média bez antibiotik 20 ml výše uvedené bakteriální kultury odebrané po 24 hodinách a inkubace probíhala dalších 24 hodin za stejných podmínek.
Pro in vitro kultivaci řepky (Brassica napus ssp. oleifera, jarní kultivar) byla semena sterilizována NaOCl3
(3 % aktivního chlorínu) ve sterilních konických baňkách po dobu 10 minut a pak byly propláchnuty 3x sterilní destilovanou vodou. Semena se pak přenesla na médium MS-N obsahující mikrolementy B5 a vitaminy. 10 semen bylo umístěno v 1 kultivační nádobce obsahující 50 ml živného média. Semena se inkubovala 4 dny při osvětlení přibližně 2000 lx a rytmu den/noc 16hodin/8hodin při teplotě 25 °C.
Pro transformaci prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens (metoda transformace děložních lístků) byly děložní lístky skalpelem odděleny od 4 denních embryí právě nad meristemem tak, že oba lístky se uchopily do pinzety a simultánně byly odděleny přímým řezem. Bezprostředně po oddělení byly řapíky děložních lístků ponořeny na 10 sekund do neředěné bakteriální suspenze (z kultivace přes noc). Pak byly děložní lístky vráceny zpět na kultivační médium. Kokultivace probíhalal 48 hodin při 25 °C a tlumeném světle. Po ukončení kokultivace byly děložní lístky přeneseny do kultivačních nádobek s 50 ml média MSM obsahujícího 750 mg/1 karbenicilínu k usmrcení bakterí, a kultivovaly se nadále po 7 dnů v 25 °V s lShodinovým dnem při 2000 lx. Po 7 dnech na MSM se 750 mg/1 karbenicilínu byly děložní lístky přeneseny na stejné živné médium, které na počátku obsahovalo také 20 mg/1 kanamycinu pro selekci výhonků. V dalších pasážích byla koncentrace kanamycinu zvýšena na 25 mg/1. Pravidelně byly odstraňovány netransgenní kalusy. Pro další selekci a detekci transgenu byly jednotlivé výhonky přesazeny na médium B5 obsahující 50 mg/L kanamycinu a 400 mg/1 přípravku betabactyl. Gen GUS přenesený současně transformací umožnil další identifikaci transgenních výhonků v nej kratším možném čase. Zakořeňování' transgenních výhonků probíhalo v živném médiu B5 bez hormonů.
- 29 Pro molekulárně-biologickou detekci přenosu genu byl poveden test GUS histochemickou detekcí aktivity β-glukuronidázy. Tento enzym odštěpuje indol ze syntetického substrátu, takže listy pozitivní na GUS modrají. Test byl proveden postupem který popsal Jefferson R.A., 1987, Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion systém, Plant Mol. Biol. Rep, 5: 387-405.
Další molekulárně-biologickou metodou pro detekci přenosu genu je NPTII ELISA test, ve které se kvalitativně i kvantitativně stanovuje vytváření enzymu neomycinfosfotransferázy, který transgenní rostlině poskytuje rezistenci ke kanamvcinu. Test byl proveden pomocí soupravy NPTII-ELISA (katalog, č. 5307-610101) firmy CP Instruments Co. Ltd.
Aby bylo stále k dispozici dostatečné množství larev pro inokulaci v testech odolnosti s Heterodera schachtii, byla hlíštice- množena na hostitelských rostlinách, což byly hořčice (kultivar Albatross, Šlechtitelská a semenářská stanice Petersen) a bulvy. Semena byla sterilizována 10 minut v 3% roztoku Ca(OCl)2 a pak 3 až 4x opláchnuty sterilní destilovanou vodou, semena pak byla osušena na filtračním papíru a pak vyseta na vodná agar s obsahem 8 % agaru. Po 3 až 4 dnech na tomto agaru ve 25 °C a ve tmě byla mladá embrya přenesena na 0,2x ředěný Knopův živný roztok. V této době byly kořeny asi 3 až 4 cm dlouhé. Pro další kultivaci byly použity Petriho misky s 15cm průměrem s výstupky, kde byla umístěna dvě embrya proti sobě navzájem. Po 14 dnech růstu ve tmě v 25 °C byla provedena inokulace 1000 larvami nematod ve stadiu L2. Asi po 4 týdnech ve 25 °C ve tmě byly vytvořeny zralé cysty, které bylo možné sbírat.
Když se sbíraly cysty, sebralo se jich asi 200, bylo použito pružinové pinzety a cysty se sbíraly do malého sítka, s velikostí ok 50 až 200 pm, které bylo umístěno ve skleněné • · ·
- 30 nálevce naplněné roztokem chloridu zinečnatého (3 mM) . Na výtok nálevky byla připevněna silikonová hadička, uzavřená ocelovou svorkou. toto zařízení bylo umístěno ve 250ml kádince, která byla zakryta aluminiovou folií.
Po 3 dnech v 25 °C v inkubátoru byly líhnoucí se larvy sebrány do silikonové hadičky nad svorkou a mohly být sebrány pomocí sítka s 15 p otvory po otevření svorky na hadičce, zatímco byla nálevka přidržována pinzetou. Larvy pak byla opláchnuty sterilní vodou a pak přeneseny Pasteurovou pipetou do sterilní dělené misky. Asi po 3 minutách, kdy larvy klesly ke dnu, byl nadbytečný roztok odsát co nejvíce to bylo možné, a nahrazen roztokem 0,5% Gelritu, který zajistil rovnoměrnou distribuci larev. Po šetrném promíchání byla kontrolována koncentrace larev pomocí strereoskopického mikroskopu tak, že se počítaly larvy v 10 μί- kapce.
Pro testy in vitro byly ú počátečních transgenních klonů odděleny kořeny od nadzemní části a přeneseny na poloviční médium B5 obsahující 300 mg/1 betabactylu a 8 g/1 agaru Daishm. Každá inokulace počátečních transgenních klonů byla provedena s 5 kořeny. Jako citlivá kontrola byl použita řepka, jejíž kořeny byly získány jak bylo popsáno výše. Na každé misce bylo na kořeny, získané způsobem popsaným výše, naneseno 100 larev Heterodera schachtii stadia L2. Pro inokulaci byla použita pipeta Multipette s 0,5 ml špičkou Combitip. Misky uzavřené Parafilmem byly inkubovány při 25 °C ve tmě. První počítání vytvořených cyst proběhlo 14 dní po inokulaci, druhé' a poslední počítání po dalších 20 dnech, kdy cysty změnily barvu na světle hnědou a byly lépe viditelné na bílých kořenech.
Pro testy in šitu bylo 5 výhonků každého počátečního transgenního klonu přeneseno do skleníku. Pro tento účel bylo potřeba, aby už byly výhonky poněkud rozvinutější a měly • ·
• · · · * • · · · · · • ···· · ··· ·· • · ·· ·· alespoň několik kořínků. Byly pak přepíchány do substrátu pro hrnkové rostliny, kde zůstaly 1,5 týdne, aby se vyvinul větší objem kořenů. Navíc tím dostaly příležitost se aklimatizovat na skleníkové podmínky. Po 1,5 týdnu byly rostliny přesazeny do křemenného písku s velikostí zrn 0,1 až 0,5 cm, který byl předtím zvlhčen Steinerovým živným roztokem. Inokulace byla provedena v těchto pískových kulturách, protože jinak je díky humusu a nečistotám očištění kořenů a počítání cyst nemožné. Písek byl ve válcích a ty byly umístěny v bedně. Jelikož válce stojící při krajích bedny měly více světla a tudíž lepší růstové podmínky, byly rostliny použité po testování obklopeny dalšími rostlinami, takže každá testovaná rostlina měla souseda. Jeden týden po druhém přesazení byla provedena inokulace se 600 čerstvě vylíhnutými larvami Heterodera schachtii ve stádiu L2. Vyhodnocení proběhlo po 6 týdnech, kdy larvy zhnědly a bylo možné je snadno -spláchnout z kořenů, cysty byly odděleny z kořenů opláchnutím kořenů v kuchyňském cedníku tlakovým proudem vody a pak byly zachyceny do 100 pm sítka a odděleny od zbytků písku centrifugováním. takto získaná směs cyst, jemných kořínků a vody byla přefiltrována a získané cysty se počítaly pod binokulárním mikroskopem s lOx zvětšením.
Přítomnost transgenu v rostlinách byla potvrzena pomocí PCR, NPTII-ELISA a GUS testu.
Následující tabulka ukazuje výsledky testu odolnosti in vivo s citlivou, tj . netransgenní variantou To a transgenními rostlinami T7 až Τχ5 obsahujícími gen 1832.
·· ·· • « ·· • · · ·· ·· · * · * • · · · • · ···· · • · · ·· · ·· ·9 • · · · • · · · ··· ··· • · • 9 ♦·
| Identifikační číslo | Počet kořenů | Průměrný počet cyst na 1 kořen |
| T7 | 10 | 14,4 |
| Tg | 9 | 19, 0 |
| Tgi | 2 | 14,5 |
| T9 | 7 | 21,3 |
| Tio | 6 | 18,8 |
| Tu | 6 | 10, 2 |
| Tl2 | 5 | 23,6 |
| Tl3 | 5 | 18,4 |
| Tl4 | 9 | 19, 2 |
| Ti5 | 3 | - 14,7 |
| To | 9 | 19/1 |
nezávislých transgenních linií obsahujících gen 1832 bylo vyhodnoceno v tomto testu. Z toho 6 linií (T8, T5, T10,
Tii/ Tis a Ti4) mělo srovnatelný počet cyst jako citlivá linie, 3 linie (T7, TSi a Tis) měla počet cyst snížený o 27 % ve srovnání s kontrolou a 1 linie (Tu) snížila počet cyst -o 47%. To ukazuje, že gen je aktivní v těchto rostlinách a jeho prostřednictvím je možné značně snížit zamoření Brasica napus larvami.
Příklad 15
Rostliny bramboru kultivaru Bintje byly transformovány plazmidem pAM194 obsahujícím inzert 1832 řízený promotorem 35S prostřednictvím Agrobacteri um rhizogenes. 40 nezávislých kultur kořenového vlášení bylo inokulováno, každá 250 larvami Globodera palida. Po 56 dnech byl vyhodnocen vývoj nematod. Ve 35 kulturách se nematody vyvinuly normálně • · • · • · • · • ·«
- 33 s přibližně 40 samicemi na každé Petriho misce. V 5 kořenových kulturách byl vývoj samic narušen, bylo v každé z nich nalezeno pouze 10 zralých samic. To ukazuje, že u brambor může sekvence 1832 zlepšit jejich odolnost proti napadení nematody.
- 34 Seznam sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5401 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris (B) KMEN: A906001 (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: lambda DASHII (B) KLON: 1332.1 .(viii) POLOHA v GENOMU:
’ (G) JEDNOTKY: 5401 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
• · · · · • · ·« · • · · · · · • · · · · • · · ·
| GAA7C77A7A | CCGC7ACA7C | 7A7AA7AAAA | A..GG7GA7A | AA—A - 2 x 7 G C C | CA7777AACA | 720 |
| CACGaAA- * c | gtccttttac | GCGAGCGG77 | i-~ — — | —Τ'—X ' X X X— - X X ΛΛΛΛ X 1 - | AAAAACC7CG | 780 |
| TC777ACTC7 | CCCCACC7A7 | A7A7A7ACAC | G x CCGCCG77 | C7C7ACT7CC | CA7C7CACA7 | 3 4 0 |
| acacataccc | AA i G C ACA-AA | C77CCA7C77 | A7CCAAC777 | C7C7CACCTA. | 7C7CC77C77 | 900 |
| CA-A7777CAA | aactcaaaag | AAAA7GGi AG | A777CGA77G | CAAAACAAAA | A7GG7ACAA7 | 950 |
| CAA CAC v-AAA | CCTCACAAAA | - 2 | AAA7CACAAC | CAAACGCACA | A7A7CAACAG | 1020 |
| CA77AA777C | ACCAG7ACCA | G7AAT77CCG | GCGAA77A7G | 7CGGGGG7GG | GAA7CA7CC7 | 1030 |
| C-77CAGC77A | CGAA7CGTAT | CTCAAA77AC | CC-GAGC7CCG | 7CAAC7A.7GC- | AG77CAAAAG | 1140 |
| AA7TCCCCGG | C7C-GGA7AAC | GAACCGA7AA | -7CAAACCGGC | 777GCAAGCA | 77AGAGA7AA | 1200 |
| CA77CCGG77 | CA.7CTCAC7C | G7777A7CCG | ACGC7AGACC | 2^2. *“* | CGGCGAGAA7 | 12 5 0 |
| C-GAACCGGAA | A77AGAGTCG | i xA.GC — AájAG | A7CAAC-7CCG | AAAC7CA7C7 | CAG77C7C7G | 1320 |
| CGGAAGACGA | 7GAGACACG7 | GGA7CAGC7G | CGAA7CG77G | A7C7GACG7G | A7CG7A7GG7 | 1330 |
| GAGG7GA7G7 | CACAAACAGA | AG77CAC-CGC- | AGG _ A - GGAA | GC77GCGAA7 | C-GAGAACA7G | 1440 |
| A7AC7ACCG7 | C-G7C7G7CC-7 | AG7AGGGAA7 | 77AC-7C7CC7 | 7CCGAGGT7A | GCCACG7C-GC | 15C0 |
| AGAAC-7CGGA | GGAGA77GC7 | 7C7ACGCGG7 | 7GAA7CTGCT | A7GAC-AAGG7 | 1550 | |
| ACC-CCC-777G | - i 1 ΟΟΟΟ n, i . 7CG7CC77C7 | GAg<. i j. C.-.gG | CGC77AAAAA | újGGGííGGT ikj | 1530 | |
| > A -y > | ________ _ | - — | ||||
| Λ'ν.ΙΛ. . ůG^.”. | **'------- * | |||||
| CC7CC-AAAAA | A77C-77GGA7 | CGA A7AAC-7G | AGAC-GA7CAG | CAA AGA AGA.G | T T T1 r* f* — Λ z /z | 1300 |
| _________ — — | —. — —, . — -X — — — | |||||
| -.G'—λ^Λ - 'Ό-“- | G j. \jn?.-.G.- ------ | - - | 13 60 | |||
| . _________ | ___ _ _____ _ _ | '___ __( | ||||
| *· —“ - - - | ΛΛ 1 ««Λ. A- _ | G.-.u<j.-ti. - - '-o. | w sjN-.-.i v---7ΛΛ | - 7 z 0 | ||
| TTCTGAA.AGT | 7777G7777C | GA7GAAAAGG | AG7GA7CGAG | G7AACAAAA7 | 1930 | |
| 7AAGCAAGGA | 7CTACGGCAC | AAGG7GCCGA | AGA7CC77GG | 7G7AGAGG7C- | GACCC7A7GG - | 2040 |
| G^C-ACCGC-7 | C-A7ACAAGAG | 7CGGCAA7GG | AG7TC-7ACCG | AGAAAAAAGA | AGATACGAGA | 210 0 |
| AC-A7ACA.7C7 | G - ί.Λυ.1Λ\5\-Ιϊ | i«(—i ftf r -r iii Λ.— | 7GGAA7CCGC | 7G77AAAGGG | 77777C777A | 2150 |
| ATTA7AAACA | GTiGiiGGiG | AxCAxG.AxGG | G7AC-7T7GGA | AGCGAAAGCG | AA7777GC7G | 2220 |
| TG A i ToG i GG | T7C7AC7GAG | TGTTGGGATT | TGTTGGGTGA | GTTGTTTTTA | C-AACC7AC77 | 2230 |
| A77A7CCGAG | 777GC-A7GG7 | GCCAAGAC77 | 77A77GG7GA | TTGTTGGGAG | CA7GA7CAGG | 2 340 |
| GTG i TGGT.-.G | CC-GGC7CGA7 | TGTGGTGATC | — ^'“GG - ů | 7CGGAC7GCG | AAACAA7GA7 | 2400 |
| C-G777CGAAG | 77AG7777GG | ni i os---nj - i - | C-777GA7C7G | AC7CGGCTGA | G7AA7GGGCG | 2 4 5 0 |
| C-CGA7AGGGA | GG77A7GGAG | AACGTGGG^G | G G AAA.GTGGG | 7GGCC77GT7 | AG i GAljACGT | 2 3 2 0 |
| GCAAAC777G | GTTACTATTA | C.A7G7GA7A7 | AC77A7A777 | AC-7GGGAA7A | 77GC777C-G7 | 2 5 30 |
| G7ATA7AGA7 | AAAT7T7TGA | AT7AA77G7T | ACAC77G7A7 | 7AG7AAA77C | 7G7A7CA7GA | 2540 |
| 7GA77A7AAC | ATGAAT7T77 | 7G77G7GAC7 | 77AAATGAGA | 777A7GC7CC | TT AA.T C C TT A | 2700 |
| T77CAC7GA7 | A7TA77T777 | 7G7AG7C7GA | G7A7AAG7GC | GGAG77TAAT | CAAGCAAC-AG | 2750 |
• ·
GA7GG77A7
GTG7ACC7C'
77G7C7C7A.
232 3
| AAAA7AA7AG | AAC-G7GATTG | CA7AG77GGA | i - v.?<3_ GG. |
| AAAGiλΤí G - | GAATAACGGA | G7ACA7GiGG | AACACGAGAG |
| AATT7ACAAA | GAGAT7TACA | AAATCTAGA7 | GAC-7777GA7 |
| A7GGGAGAiA | Λ«ΛΛ i i ΛΛΛ. X | CGTGAGGC7C | i i _ ^^.'jGC i A |
| AAACAATGGT | T7ACTCTAA7 | 7CAN777TCC | AA77GGCAAA |
| 7NGGC7CT7C | ACAA7TGAG7 | ATAAAAGAA7 | GGG77AA77A |
| 7AA7CC7A77 | 7AA77G7777 | 7GAAA7A77C | 77AAAAA7AN |
| AGTTGGGACC | L 'JkS 1 - k. - *«?ΛΛ | CCNAC77AAA | 7 7 AA7 G G G G 7 |
| C77G77A777 | 77AGCCTTT7 | 7777CC7777 | 777CCC777A |
| C-AA7A7C77A | AAA7ACC-7GT | CTA7CNNC77 | 7AG77GGACC |
| A7GCACTA7T | CC77TGTAT7 | 7ACC7T7T7C | 77777CC777 |
| CAA77A7A7T | C7A77777G7 | 7AAAAAACGG | ΤΓΤ73* 777? |
| T~7TCCTTCT | A7A77AAAA7 | TTC-AAAGTC-A | |
| TTATA77GTT | CGA77AA7GA | TGATAAAAGG | ATTTTAC7CA |
| A7AAC-A7AAG | AC-GAAC7TCC | ACC7AG7TAA | CA7G7C7CAC |
| ΛΛ i i G<- G X - G | C7GGA777AG | AAC777GG7C | AAGA7AA7GG |
| ΛύΛ.^ν.-.. i i | 7CCNCGACA7 | 77G7GAGAGA | 7· Ti ·> -1 /-» <· i ΛΛΛ\. sJ |
| rr,? -Λ | 77777G7GGC | * -η /» λ > ,/- ΛΛ i ν.Ι^ΛΛΛ^ | G 77 G G AAG77 |
| TTQ2. ^*7 Λ Q | AAAA.7GCG7A | 7TG7CGC-CAA | CTGA77GTAG |
| A7AG7C7777 | A7A7AGAA7 7 | CA777AA77C | 7AA77CA777 |
2333
| 7AG777AG7C | AGCCTAAAAC- | AACAAAG7AA | G7CA7GGAA7 |
| 7AGAC-GAC-GG | C-CTGATAACA | ATAATTATTA | CTTATGTTGC |
| AAAAA7AAGG | 77GAA77AGG | AGGG7AA.7AC | ATTATTACC |
| j. í | TTAAGTTACT | CTAAACCCTC | z - tt i -^A,c - |
| T^AT£~AA-T | CAAACACGTA | CT7A.7A.C.AA7 | CCTCTACATG |
| GGAAGA7CGA | TACTTATTAG | AATCCGT7TC | CAACCC7AAA |
| 7GGA7777C-G | AAGGGAAAGA | CGAATGCGAG | C-GCAGTGTAC |
| GCAAGGGTCA | TGCTAGTTAG | “ — 3 T^ T | ANATGACTTA |
| ^GC ~ · -tti a, | 7AGAC777A7 | TGGAGTCATC- | AAG7G7AC7G |
| TCA7GCAC7A | CACCTAATTT | GTCACAGCAT | TCAGC7GCCC |
| C7GGCGTGCC | 7G77G77GG7 | GGTTAGTCGG | CGC77GC-7C7 |
| 7777TTT^7T | 7777AAAA7G | GTCGCTC-ATT | ACTATNCTGT |
| TCGTATCCAA | TTATATGCTA | CAC7777777 | GCGGACTCCA |
| CGAGAGA7AG | AGAGGAAAAG | CCCATGTTGT | TAGGAGAGAG |
| aataaagaag | TAATAACATC | TAAATAAGAA | AATTCCTTTG |
2340
| GN7CTTCCGA | A7AAAA7AAG | 3000 |
| GTGGCACAAG | CTTCAATAAS | 3 0 6 0 |
| CNCCGGNCTT | 7GAA7AAAA7 | 3120 |
| CC-77C-TC7AA | 7AC777C777 | 313 0 |
| CAA-GGGGGG | CT.AATTTCCT | 3 24 3 |
| AAA7AAC7A7 | 77G77C7777 | 3 3 03 |
| C-TCTGAACTA | 'Τ'τι ™G- ~GC~' | 3 3 6 0 |
| AAATACTATT | GTTCTCAT77 | 3420 |
| ιΤΤϋ | 24 3 0 | |
| > ΛΛΛ --- - | ATA7GAA7A7 | 3340 |
| TT2. - £ T Τ'3 | 3 6 0 0 | |
| TTTCCTA.GTA | C-ACGAATCTA | 3 6 6 0 |
| CAAAACTTTC | AAGCACCCC-T | 3720 |
| TTTCAACTTC | —— | 3 732 |
| GA7C777C-CG | TTTCC-ACC-A7 | 3 34 3 |
| 7AG77GCNG7 | 7A77A7AA7G | 3 3 3 0 |
| GAATCCAC-TT | AAG77GAG'—' | ' 3 ? 6 0 |
| GGAA7GAAGA | 7 G i λ_Α 7 C AAA | 4 0 3 0 |
| G7GT7CAATT | CAGTAATC-AA | 403 0 |
| GG7GA7G7C-A | 7AAAAC7AA7 ' | 4140 |
| AC-TCTAACAA | 2. i ijitt^tqi | 42 00 |
| i-^CCC^GC | T^^^TQTA-'' | 42 = 0 |
| AATGACTGAT | CAAAGGTTCA | 4320 |
| AGG A7 AA.7 G 7 | GCA7GAGA7G | 4 3 5 0 |
| L tt£ z. z. l AAG | TACCTACTA7 | 4 4 4 0 |
| TTTGGTACAC | CCCACATTAC | 4 3 00 |
| 77C-7777GCA | G7C77TGGAG | 4 5 6 0 |
| GTTGTGNNGT | GACCCTCTC-T | 4 = 20 |
| GTATTNCATT | TTGTACTCCC | 4 = 30 |
| AAACGTTTTT | ΤΤΤΤΤΧΓΤΓΖΤΓ | 4 7 4 0 |
N7CGGGAGAA GGAAAAGCCA 43 03
ATGGAAAGTG 7AGCGAC7AA 4 3 5 0 • · · • · · ·
| «AAAc gaagg | ACAATA.TG7A | c-ttttcatat | GGGTTTAGGT | T - GC AA. - s- - <. | C777777A77 | 4 | 92 3 |
| gtttacccat | ACTGGATTAG | GTTGGATTTA | TCAACAGAAA | ATGAG- i | CTATATCACT | 4 | SS 0 |
| ACATTACTC-T | GG7CC7GTGG | 2^***'T'/*· * o | AGTTGGACCA | 7A.7CAA7G7G | 5 | C 4 C | |
| TTA.GCG _ GGA | 77A.TG7ACAC | A77GGACTGG | Λ'·α L i | 1 2^2^2 2,~C^ | GAAAAGGGCG | 5 | 100 |
| ATGGGiíAGG | TCATGAGGTA | TTTAGAATAA | GAC777GA7C | AAGCCCAAAT | CCACCCGCAA | = | ISO |
| AGAA77A7AC | CC777ATT77 | CAAGGCACCA | 7CAC7GCA7A | .-_-_-.7--_-.TG7G | AAA7GCCACA | = | 220 |
| AAAGA77AAC | GTGGAATA.TG | CTGAG.AGCCA | AAAA T C AA. T C | CA.TTATTGTT | TGG 7.AAG AAA | = | 230 |
| AGG7AA7AGG | CTAGA.TCAA.T | 77GC7GCC.AA | TTGCC.AGGGG | TGTGGGCC7G | TC.ACCTGTGG | 5 | 34 0 |
| G 7AA TT 7 AA.T | ATGNCTCAAA | • <?G\j l TGG*— C | 7G77AAG7AC | ACTT AAA.G C T | 3 | 4 0 C |
5401 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 849 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (viii) POLOHA v GENOMU:
(C)JEDNOTKY:5401 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2
| 2^32322. | GTGGGTATAG | TTTGGGCCTT | GG7G.-.GGGGA | A.TTTGGA.CGG AAA.GCCCAA | |
| 77AGA77ACG | ACGCCG777G | 7CG7CCT7C7 | GAC-C77CACG | CGC77AAAAA GGGGGCGTTG _ | 120 |
| í72~T2T2~Tr | AGAATTCGGA. | A a A7C.AG.A7.A | AC-AGGA7CAG 7AAAGAAGAG | * 9 0 | |
| TGGATTTTTT | C G AA. T AA. G T G | *? i | |||
| TkA.CCAAA.G | CAGCAGA7GA | 77G77GGA7A | TATGGAAC-TT A77GGAGGAA | 300 | |
| A.TCGAGAA7T | TACATTT.ATT | 2 2 ''T1 | GACG.-.7T7GG | TC-CATCTGAA. GACC-CAACTG | 3S0 |
| -^ΛΛΛΛ | CAG7GGCGGA | T7C7GAAAC7 | 7777G7777G | G.-.7CAAAAGG AC7GA7CGAG | 4x3 |
| ACAAA AT | 7AAGCAAGGA | TCTACGC-CAC | AAC-GTGGGGA | AGA7CG77GG TG7AGAGG7G | 4 S 3 |
| GACCC7A7GG | C-AGGACCGG7 | C-.A7ACAAGAG | 7CGGCAA.7C-G | AGTTGTA.CCG A.GAAAAAAGA | 3 4 3 |
| Λ\ίΛ » νΛ<ίΛ | A.GATACATCT | GTTACAAGCG | 777CAAGGGG | 7GGAA7 C C G G 7 G 77AAAGGG | £ 3 3 |
| '“'TTTTCTTT - | í-TTAT.AAACA | C-TTGTTGGTG | A7CATGATGG | GTAGTTTGsaA A-GCGAAA-GCG | 6 c 3 |
| A.AT777GCTG | 7GA7TGG7C-G | TTCTAC7GAG | 7C77CGGA77 | TGTTGGCTCA C-77G77777A | 720 |
| C-AACCTACT7 | AT7ATCCGAG | TTTGGATGGT | GCCAAGAC77 | TTATTGGTGA 77G77GGGAG | 7 5 3 |
| CATGAxCAGG | C7G77GG7AG | CGGCC7CGAT | TGTCG^C-^C | A.TCGGAAGAA TCGGACTGCG | Λ A O 0·: J |
.CAAi GA = 4 9
- 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1744 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Beta vulgaris (B) KMEN: B883 (vii
PRIMY ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: lambda ZAPII (B) KLON: extl832-16c (viii) POLOHA v GENOMU:
(C) JEDNOTKY:±744 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
CCACAAAC77 »' Γ-\ Λ *
CACAAAAAAA
AG - A<- GAG _ A
A7CG7A7C7C
A7GG7AGÁ77
7C7CCAAAAA
A777CCGGCG
AAA77ACCGG
GGA7AACGAA CCGA7AA7CA AACCGGC777 GGA.AGCAT
C7CA.C7CG77 TTA.7CCGACG C7AGACCG7A CA7AAA.C2
AGAG7CGTT.A C-CGAG.-.GATC AAG7CGAAC7 CA.TCTCA.G
AGG7GGA7CA GCTCGGATCG TTGATCTGAC GTCATCGT
C-AC-ATAACAT £ Q L Q* *
CTCTGCGAAG
GGTGAC-GTGA
120
ISO ί n
00
50
| AGGAAGTTGA | GCGGAGGTA.T | GGAA.GCTTGC | GAA.TGGA.GAA. | CA.7GA.TA.C 7 A | CCG7GG7C7G | 500 |
| TCGTAC-TAC-C | GA_-.7TTA.GTC | TCCTTCCGA.G | GT7AGCCACG | TC-GCAGA.AGT | CGC-AGGAGA.T | 5 5 0 |
| Z PTCTAGA | A.TCTTCTA.CG | CGG77GAA.TC | TGCTATGAC-A | AGG7G7GGG7 | ATAGTTTC-GG | 720 |
| CCTTGGTGAC- | CCCAATTTGG | ACGGAAAC-GC | CAA.TTTAC-A.T | TACGACGCCG | TTTGTCGTCC | 750 |
| TTCTGAGGTT | CACC-CGCTTA | AAAAGGGCGC | G77GGA77A7 | A.77CAC-AA.TT | CGC-AAAA.TCA. | 85 0 |
| GATATTGTTT | ACAATTCATC | A.GATTTTCGA | G7CG7GGA77 | 7777CC7CGA | 7* | SCO |
| GGATCGAATA | AGTGAGAGGA | TCAG7AAAGA | AGAGTTTACC | AAAGCAGCAG | ATGATTGT7G | = 50 |
| GATACTGC-AC- | AAAA.TATGGA | AGTTATTGGA. | GGAAA7CC-AG | AA.TTTACA.TT | TATGAATGGA | 1020 |
• · · ·· • ·
• · ·« · · · • a · · a a · • · · · · · ·
- 39 TCC7GACGAT TTCC7GCATC TGAAGACGCA ACTGAGGATG AAAACAGTGG CGGATTCTGA AAC7TTTTG7 TTTCGATCAA AAGGACTGAT CGAGGTAACA AAATTAAGCA AGC-ATCTACCGCACAAGG7G CCGAAGATCC TTGGTGTAGA GGTGGACCCT A7GGGAGGAC CGC-TGATACA AGAGTCGGCA ATGGAGTTGT ACCGAGAAAA AAGAAGATAC GAGAAGATAC ATC7GTTACA AGCGiTTCAA GGGGiGGAAT CCGCTGiTAA AGGGTTTTTC TTTAATTAiA AACAGííG-x GG7GA7CATG ATGGGTAGTT TGGAAGCGAA AGCGAAT777 GCTGTGATTG GTGG7TCTAC TGAGTCTTCG GATTTGTTGG CTCAGTTGTT TT7AGAACCT AC7TATTA7C CGAGTTTGGA TGGTGCCAAG ACTTTTATTG GTGATTGTTG GGAGCATGAT CAGGCTGTTG GTAGCGGCCT v ·
CGATTGTCGT CATCATCGGA AGAATCGGAC TGCGAAACAA TGATGGTTTC GAAGTTAGTT TTGGATTGAG TTTGGTTTGA TCTGACTCGG CTGAGTAATG GGCGGCGATA GGGAGGTTAT GGAGAACGTG GGGCGGAAAG TGGGTGGCCT TGTTAGTGAG ACGTGCAAAC TTTGGTTACT ATTACATGTG ATATACTTAT ATTTAGTGGG AATATTGCTT TGTGTATATA GATAAATTTT TGAATTAATT GTTACACTTG TATTAGTAAA TTCT
1030
-.-.-.O
0 0
12S0
1320
1330
4 0
1500
15S0
1S20
1SS0
1740
1774
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaná nukleová kyselina, která indukuje odolnost proti přisedlým nematodám v rostlinách čeledí a/nebo Brassicaceae, (hlísticím)Solanaceae v rostlinách, výhodně a/nebo Chenopodiaceae zvláště výhodně v rostlinách roduBeta a/nebo Brassica a/nebo Solanum,
- 2. Nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje translatovanou sekvenci, která je alespoň ze 60 % homologní s protein-kódující sekvencí genu HSl-crc_1 z B. procumbens.
- 3. Nukleová kyselina podle nároku 1 nebo 2, kde gen HSlFro_1 obsahuje následující sekvenci:
Λ T z— Λ <· > r- s- »—i J.λ L·κ-; i GTGGGTA.TAG ΤΤ'—'ζ'“· _ _ _ ^3 'sj1 _ <: <3 i G A. G G C G A A.TTT G G A G G G AAAC-CCCAA? ΤΠ > A -r-*T Λ z* z- i. i. -I 1 - Λ 'w <3 Λ Γ~ —' z·? r·* r* /-» /-> *γ*ι«-ρ z'·*'^' GAGCTTCACG 222- <2 G G C G G G G \ > 2, T'T1 ^2 * AAATCAC-ATA ζγ» zp ry rp p* \ * T 7 C A T C A G A T Τ'ΊζΖ 2. CCTCGAAAAA T 2, 2. ·Τ L 2 τ τ 7* AGAGGATGAG 77TACCAAAG CAGCAGATGA Q i CTGGAGAAAA. 7A7GGAAG7T ATTC-C-AC-GAA λ - s- e λλ J. ί TACATTTATT GAGGATTTGG TGCATCTGAA GACGCAACTC- AGC-A.7GAAAA. Λ -Τ' > U Λ L· - ’ 'sJ v- c 77C7GAAAC7 TTTTGTTTTC C-ATCAAAAGC- ACTC-ATCGAG TAAGCAAGGA TCTACGGCAC AAGGTC-CCC-A AGATCCTTGG TGTAGAGGTG GACGGTATGG C-AGGACCGGT C-ATACAAGAG TCC-C-CAATGG AC-TTC-TACCG iGiim^Gi AGATACGAC-A 2> (Z 2. T £ Γ TC? GTTACAA.GCG TTTCAAGGGG TGGAATCCGC TGTTAAAGGG VTTTTCTTTi ATTATAAACA z— ct z— <r->r-i s- r- t> z— C-i :C-i i-G ATCATGATC-G GTAGTTTGGA AC-CGAAAC-CG .-ATTTTGCTG - <7 <-? - C <3 TTCTACTGAG TCTTGGGATT TGTTGGCTCA C-AACCTAC77 — T T 2 'Τ' C* 'T. 2t Π TTTC-GATGC-T GCCAAC-ACTT TTATTC-GTGA Τ'τ1 q “•‘T G G GG CATGATCAGG- CTGTTGGTAG CGGCCTCGA.T 7GTCGTCA7C ATCGGAAGAA i C G A k_ i G G G AAAC.AATGA - 4. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde DNA je výhodně cDNA.
- 5. Nukleová kyselina podle nároků 1 nebo 2, která je genomová DNA obsahující následující sekvenci:TCTAGAC-CTGATTCGGATGTTAGGATTAACTGTCAATATGTGAGTCCCGTTATTCTTATTTGGT'C'T''TATACGAAATTGAACCTATATT.-A.TTTG TATAATGCTTATAAAAA. 7 T T G AA.AGCTTCTCGGAAA.TTTTGCCTCGACACGTCATATATACACAATCCACAAACAA.TTTTCAA.ATGGTACAATCAAA.CGCACAC-CGAA.TTATCCTC.-AA.TTACTTGGGATAACCATTCCGGTTCGGCGAGAATAAACTCATCTCGAATCGTTGAC-TTCAGCGGGGTCTGTCGTAGAAGTCGGAATGAGAAGGTAAAGCCCAATCGCTTAAAAATTGTTTACAAATTGTTGGATCAGCAGATGAATCGAGAATTGACGCAACTGGATCAAAAGGAAGGTGCCGAGATACAAGAGAGATACATCT řpfjirnrprpQrpiTirp·^X- i V.CAACACC.-AA. AT ATC.-A.C A C r' r* ~rC G G A G C_ GGGGAACGGATAA c 2 TQTQ2 G^GGGAACCGGAACAGTTCTCTGATCTGACGTGAGGTATGGAAA G T A G C G AA TGGAGATTGCTGTC-GGTATAGTTAGATTACGGGGCGCGTTGTTCATCAC-ATCGAATAAGTGTTGTTC-GATATACATTTATTAG GAT G AAAAACTGATCC-ACAGATCCTTGGTCGGCAATGGGTTACAAC-CGA T T A T AAA. C A • v '«J Λ v - J v. O m rp m rn /—»n-zi \_jTTGAAGCACACTAAGAATTTCTAAACTAG7 ,-prp ί > rp rp r- rACTATATATAATGTATTTTGGAAGATATAC .«pirprp z» r* s* λ /*» z— ~ í i í L· c C L 'CA7AAA.TA7T7 .-_-.TA--.GC CTAG7 C 7 7 A 7 A. C A.7777AA. C A rpmrp > λ λ A.T-rprpGTCCCCCCTT rprp > pt p m -n '2 2 1 2/2 r- z- z·* z- z- > a .-n m A CTGCTTAATTT CTCTTC-ATAA C-TCTTGACCT AAAAA C AAA.TZ“* z- » ,— r-. >iAAAACA7A7T y?; 2 = 2 T· 2 2 AATGTCTTAA AGGGAGTAA.T CAAATTGATA ·» 5 /- A rp z-, ρ» λ . —“- '«-TATGGA7AA7GCCGC7ACATCAAAAACCTCG p'r— ·— —I s-* r—I rp í“*CCTCACAAAA (22 1 Τ' Ι-^ΓΓ’Λ s— m > —’ <- jTCAAACCGGCGTTTTATCGGATTAGAGTCGCGGAAGACGAATCGTATGGTGCTTGCGAATTTAGTCTCCTTCTAGAATCTTTTGGGCCTTACGGGGTTTGC-ATTATATTCTTTCGAGTCGAGAGGATCAGCTGGAG AAAAAATC-C-ATCCTCAGTGGCGGAGTAACAAAATTGTAGAGGTGAGTTGTACGGTTTCAAC-GGGGTTGTTGGTGACGGTCACTA TTŤC-ACACTA ACTATC-TTAC CATCGCTATG ATTCGATCGG T T T T .-AAA. T T CATC-TC-GGAT ^rprprprprp > y ,-pAC-ACTATGGA AAC-T.AATATT CTACTTTAAA AT AG CGA. GAT AAATTGC-AAA T A T AA T .-AAA. GTCCTTTTAC ppnpp, λ ^rp ^rpGATGTCACAT CTCTCA.CCTA. ATTTCGATTG AAA.TC7CCAA ACCAGTACGA GTTCAGGTTA A C-TT C.AAAA. G TTTGCAA.GCA ACGCTAGACC TTAGCGAGAG TGAGACACGT GAGGTGATGT C-GAGAACATG TCCGAGGTTA TCTACGCC-GT GC-TGAGCCCA TCGTCCTTCT AGAATTCGGATAAAGAAGAGTATGGAAGTTGACGATTTCCTTCTGAAACTTAAGCAAGGAGACCCTATGGAGAAAAAAGATGGAATCCGCATCATGATGGAA GGG AA. C G A ATCCGATTCT TATGTATCAT TATAAC-CATC TCCCATAATA TTTGACCAAA CTTGTTAGAT TTTTTTACTA .AAA.GTAAGCA C-ATTGACGCA TAA.TATAGTT ^p“ rpm λ > > > > pTGGCATGCTTA.TTC C- G - ~ tGCGAC-CCCTTCCCCACCTATACACATACGC = cc c C~^ ===C.AAAA. C.-AAA.AAATCACAAGGTAATTTCGGCG.-ATCGTATAATTCGGCGGTTAC-AC-ATAAC-TACATAAACATCAAC-TCCGGGATCAGCTCCACAAACAGAATACTACCGTGCCACGTGGCTGAATCTGCTATTTGGACGGGAGCTTCACGAAATCAC-ATACCTCGAAAAATTTACCAAAGATTGGAGGAATGCATCTGAATTTTGT^TTCTCTACGGCAGGAGGACCGGTAGATACGAGATGTTAAAGGG z— rnÍTTTGGJ • 9 • 99 9 99 9- 42 AGCGAAAGCG AATTTTGCTG TGATTGGTGG TTCTACTGAG TCTTCGGATT TGTTGGCTCA GTTGTTTTTA GAACCTACTT ATTATCCGAG TTTGGATGGT GCCAAGACTT TTATTGGTGA TTGTTGGGAG CATGATCAGG CTGTTGGTAGCGGCCTCGATGGTTTCGAAGGTAATGGGCGTGGCCTTGTTACTTATATTTATTAATTGTTATGAATTTTTTTTCACTC-ATCV.C-CV.C-AGATATCT.W.AACACCACACVATCTAGATAC-.V.TTVATAAACAATGG?CTTCV.TV.7C?CCGG?CTTTT. V_V.AT A 7 CC7ACTTAAA TTAGCCTTTT C-V.TATCTTA TTAT'7’ i.TGC^VA. TA.CTATT1 i rprpmrpTTG.AV.GTGACGATTAATGAATV.GATV.GGACGAATCTAC.W.CT-TTCGCACTVACCV.TGAC-.VACVV.TGCC-TAATAGTCTTTTAAGTTC-AGTTGGV.TGV.GACTTATGTTGCAGGGTAATACTTAAGTTACTTV. TCTVAT TVCTCTVA AATGACTC-AT C-GCAGTGTAC AGCVAATAT TAC-ACTTTAT TCATC-CACTA C-TCTTTGC-AG GTTGTG77GT ACTAT7CTGT CACTTTTTTT AGAGGW.G AATAAAGAAG TAGCGACT.V.TGTCGTCATC TTAGTTTTGG GCGATAGGGA AGTGAGACGT AGTGGGAATA ACACTTGTAT TGTTC-TGACT ~ 'ΤΓΓΤ,'ΤΓΓ,'Τ’V_V.TV.TAG C-ATGGTTATG ACC-TATGACT C-AGTTTTGAT CC-TGAGGCTC TTACTCTAAT T7GGCTCTTC T G AA T V_V. T CGTTGTCTV. TTAATGGGCT fp rp rp r“* rp. rp. rr rpVATACGTGT ATGGACTATT GTTCTCATTT TACAACAGTA ATGTAITTCG TGATAAAAGG AGGV.CTTCC V.TT:VC-CACC TTTC AA.CTTG GTTCGAAGTT TT G T CGC- C AA AT AT AG V.TT TAGTTTAGTG T G T V. T C AAA gtc-ttcaatt AATTATTACC CT.VACCCTC CAAACACGTA GGAAGATCGA CVAGGTTCA AGGATV.TG7 A7ATC-ACTTA TC-GAGTCATG CACCTAATTT CTGC-CGTGCC GACCCTCTGT C-TATT7CATT GCGGAGTCGA CCCATC-TTGT TV.T.V.CATC AAAA CG V. GGA.TCGGAAGA-A ATTGAGTTTG GGTTATGGAG GCAAACTTTG TTGCTTTGGT TAGTAAATTC TTAAATC-AC-A TC-TAGTCTGA AAGGTGATTG VA.CTATTGT C-TGTACCTCT ATGATCGACA TTTGCGC-CTA TCA7TTTTCC ACV.7TGAC-T T.V.^CC^ i rp > r>p-irprpi rprpCV.TC-C-CCGC TTTCvi CTATC77CTTQ r—. z— i ·. .Τ''Τ' (2 1 i Τ' i TTA V T T A T T G A AAATTTAGGT1 TTTTIQTQlACCTAGTTAACTGGA77TACT AGATGGATTT řp r* rp rri rp rp: > rp rpGATCTTTGCG CTGATTGTAG CATTTAATTC ACCCTVAA.G TAGAGGAGGG CAC-TV.TGV. GGTGATGTGA V.TT.VA.CAT CTTATACV.T TACTTATTAG TGGATTTTGG C-CATC-AC-ATCi. T T C VW. C AAGTGTACTG GTCACAC-CAT TCTTGTTGCT rp rp rp rp rp rp rp rp rp rpTTGTACTCCCAAACGTTTTTTAGGAGAGAGT.VATVGVACV.TATGTATCGGACTGCG GTTTGATCTG AACGTGGGGC GTTACTATTA GTATATAGAT TGTATCATGA TTTATGCTCC C-TATV.GTC-C CATACTTGGA GAATAACGGA AATTTACAAA TTGTCTCTAA C-7TCTTCCGA V.TTC-GCVA AT.V_V.C-VT rp λ > τφιρφ'ΤΤ'ΤAGTTGGGACG CT.V.TTT CCT .lAAT.AACTAT TAGTTGGACC TACCTTTTTG CTA. TTTTTGT r-' rp rp rp s~> rp rp p rpA7ATGVTA7 TT.i-i. C CT VA.CiTQTfTQlQV.CTTTGGTCTCC7CGAGATTTCTTGAAATTTTCGACGATTAGTTC-C7GTTVTTCATTT i_AC.i_i_AGT.i_i.GCTG.AT.AAC.A i_AA.AATi_AGG τ c τ a_a ·τAGTCT.i_AC.i_ACCTCTACATGAATCCGTTTCV.GGG.VAGAC-C.V.GC-C-TCATACCTACTATTTTGC-TACACTC.AGCTGCCCGGTTAGTCGCTTTTAA_AATGTCGTATCCA.A rprprprprp p rp q rp7TCGGG.AG.AAAATTCCTTTGGTTTTCATATAAA C AA T G A TACTCGGCTGAGGAAAGTGGGCATGTGATATAAATTTTTGATGATTATAACTTV.TCCTTAC-GAGTTTAATTTGG.i.G.ATCAGTAC.ATGTCCG.AGATTT.AC.AATC-C-C-AC-ATAAT.AAAAT.AAGGTGGC.AC.AAG gggtt.aatt.aTGAAATATTCCGGTTCTGVCTTGTT.ATTTTTGTTCTCTTGTCTGAACT.ATTTTTCCTTTTAA_A.i_AACGG .A T .A Τ T .AAAA. TTTAT.ATTGTTCCATTTCTAGTTTCCTAC-TAV.C-ATV.TC-CTTCTCATACATTTTTGTGGCTTG.i_i_AT.i_AGT.ATTAT.AATGC-i_i.TCC.iGTTGTCATGGAATATV.TTATTATTG.l_ATT.AGGC-TTT.i_AGGGTV-AATTCTCAAATCCC-TTTCCAACCCTAAACGi_ATGCC-.ACTC-CTAGTTACTTC.i_i_ATT.i_ACCCACATTACTTGTTTTGCACC-CTTGGTCTGTCGCTGATTTTATATGCTACC-AG.AG.ATAGGC-VAAGCCAATGGV_AGTGGCGTTTACCT • to · ··· «• ·
77GCAA7C7C Qfprprprprrr-» > G7TTACCCA7 AC7GC-A77AG GTTGGATTTA TCAACACAAA ATC-AGTTGGA CTATATCACT ACATTACTGT GG7CC7GTGG A7ACATCAAC AC-TTC-C-ACCA TATCAATGTC- 77AGCG7GGA C - C £ λ z-»/—' /— <· AC-TTC-AAGCA AATATAATCT C-AAAAGGGCG ATC-C-GTTAC-G TCATGAC-GTA :tí ς * ^TT^Q AAGCCCAAA7 CCACCCGCAA AC-AATTA7AC CCTTTATTTT CAAC-GCACCA TCACTGCATA Λ Λ > Τ» > T(2T*C Λ Λ Λ z— > \ - c .n 11ÍCÍTT1IT G7CCAA.7A7G C7CACAGCCA A.-AATCAA.7C q > .•po > γίγ-,- i— rn rr··> λ r > > > i \í AC-G7AA7AC-G CTAGA7CAA7 TTGCTGCCAA r-'. ~— /— /-» i <- J. ··— J. 7CACC7G7GG (TT* Δ u TTT ATG?CTCAAA 'Τ' r·' /- i ·»-' C T G 7 T AA G 7 A G ACCAACA7GA ACT7AAAGC7 - 6. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kterou lze získat screeningem knihovny DNA pomocí sekvence DNA podle nároku 3 a/nebo 5.
7. Nukleová kyselina z předchozích nároků, rostlin sekce Procumbei podle která rtes rodu j ednoho pochází Beta. nebo několika z planých druhů 8. Nukleová kyselina podle j ednoho nebo několika z předchozích nároků, která indukuj e odolnost proti přisedlým nematodám (h!ístí cím) rodů Meloidogyne, Heterodera a/nebo Glcbodera. 9. Nukleová kyselina podle j ednoho nebo několika z předchozích nároků, která indukuj e odolnost proti Heterodera schachtii. 10.Nukleová kyselina podle j ednoho nebo několika z předchozích nároků, která indukuj e odolnost proti přisedlým nematodám (hlísticím) v rostlinách druhu Beta vulgaris. - 11. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.• · • 0 ··· ·· ·· • · · · · · · ···· ···· · · · · ···· • ·· ··· ······ · · · ··· ······· · · • · · · · · · · · · 0- 44
- 12. Vektor podle nároku 11, který je vektor YAC.
- 13. Použití nukleové kyseliny a/nebo vektoru podle jednoho nebo několika z předchozích nároků pro indukci odolnosti proti přisedlým namatodám (hlísticím) v rostlinách.
- 14. Transgenní rostlina, která obsahuje nukleovou kyselinu a/nebo vektor podle jednoho nebo několika z předchozích nároků.
- 15. Transgenní rostlina podle nároku 14, která patří do rodu Beta nebo do rodu Brassica.
- 16. Transgenní rostlina podle nároku 14, která patří k druhuBeta vulgaris. - / “
- 17. Buňky, semena nebo části rostlin, které obsahují nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a/nebc vektor podle kteréhokoliv z nároků 11 a 12.
- 18. Protein, který je kódován nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
- 19. Protein, který lze získat expresí nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 ve vhodném hostiteli, přičemž tento p'rotein je schopen navodit odolnost proti přisedlým namatodám (hlísticím) v rostlinách.• F ·- 45
- 20. Testovací souprava vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a/nebo vektor podle nároku 11 nebo 12 a/nebo protein podle nároku 18 nebo 19.
- 21. Způsob přípravy rostliny vyznačující se tím, že nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 se vnese do rostlinné buňky, a z této rostlinné buňky se regeneruje rostlina.
- 22. Způsob navození odolnosti proti namatodám (hlísticím) v rostlinách vyznačující se tím, že nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 se vnese do rostliny citlivé k napadení -namatody.
- 23. Kořenově specifický promotor, který lze získat screeningěm genové knihovny pomocí sekvence podle nároku 5, a jeho deriváty se stejnou promotorovou aktivitou.
- 24. Promotor podle nároku 23, který řídí expresi genu HSlFr3_1.
- 25. Promotor, který se nachází v Xbal fragmentu velikosti přibližně 1,5 kb ze sekvence 1832.1 a je lokalizován směrem k 5'-konci od počátečního kodonu v pozici 1551, a deriváty z něho odvozené.
- 26. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 23 až 25, který může indukovat odolnost proti Heterodera schachtii u Arabidopsis.
- 27. Použití promotoru podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26 pro expresi genů.44 44 4 44 44 • 444 444 4444 • 4 44 4444 44444 44 444 4 4444 4 444 4444444444 4 44444 44 4 4444- 46
- 28.Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a/nebo promotoru podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26 pro přípravu rostlin odolných k namatodám (hlísticím).
- 29.Primer pro PCR, který lze získat ze sekvence č. 1832.1.List Kořen
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19637974 | 1996-09-18 | ||
| DE19700844A DE19700844A1 (de) | 1996-09-18 | 1997-01-13 | Nematodenresistenzgen |
| PCT/EP1997/005130 WO1998012335A1 (de) | 1996-09-18 | 1997-09-18 | Nematodenresistenzgen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ88199A3 true CZ88199A3 (cs) | 1999-08-11 |
Family
ID=26029470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ99881A CZ88199A3 (cs) | 1996-09-18 | 1997-09-18 | Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím) |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6294712B1 (cs) |
| EP (1) | EP0927262A1 (cs) |
| JP (1) | JP2001503972A (cs) |
| CZ (1) | CZ88199A3 (cs) |
| PL (1) | PL332311A1 (cs) |
| WO (1) | WO1998012335A1 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6271437B1 (en) * | 1998-05-18 | 2001-08-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean gene promoters |
| US6284948B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-09-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes and methods for control of nematodes in plants |
| GB9827152D0 (en) * | 1998-07-03 | 1999-02-03 | Devgen Nv | Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition |
| EP1207204A1 (de) * | 2000-11-16 | 2002-05-22 | KWS Saat AG | Gewebespezifische Promotoren aus der Zuckerrübe |
| DE10204910A1 (de) * | 2002-02-06 | 2004-03-04 | Kws Saat Ag | Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen |
| ES2679282T3 (es) | 2004-10-22 | 2018-08-23 | Revivicor Inc. | Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena |
| ES2548377T3 (es) | 2008-10-27 | 2015-10-16 | Revivicor, Inc. | Ungulados inmunodeprimidos |
| NZ601341A (en) | 2010-01-22 | 2014-02-28 | Bayer Ip Gmbh | Acaricide and/or insecticide active substance combinations |
| CA2815117A1 (en) | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Bayer Intellectual Property Gmbh | N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides |
| MX2013005258A (es) | 2010-11-15 | 2013-07-05 | Bayer Ip Gmbh | N-aril pirazol(tio)carboxamidas. |
| BR112013016755A2 (pt) | 2010-12-29 | 2016-07-12 | Bayer Intelectual Property Gmbh | derivado de tetrazoiloxima de fórmula (i), composto e método para controlar fungos fitopatogênicos de culturas |
| AU2012293636B2 (en) | 2011-08-10 | 2015-12-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| MX360582B (es) | 2012-12-13 | 2018-11-07 | Inst De Ecologia A C Star | Biocontrol de nemátodos fitoparásitos mediante paecilomyces. |
| WO2014127835A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Plant-derived resistance gene |
| MX2018001408A (es) | 2015-08-07 | 2018-03-15 | Bayer Cropscience Nv | Uso de anexina para para mejorar el rendimiento en condiciones de estres en plantas. |
| EP3913059A1 (en) * | 2020-05-19 | 2021-11-24 | Christian-Albrechts-Universität zu Kiel | Nematode resistance in plants |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9104617D0 (en) * | 1991-03-05 | 1991-04-17 | Nickerson Int Seed | Pest control |
| ZA927576B (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-16 | Univ North Carolina State | Pathogen-resistant transgenic plants. |
| DK39692D0 (da) * | 1992-03-25 | 1992-03-25 | Danisco | Biologisk materiale |
| US5994627A (en) * | 1995-03-31 | 1999-11-30 | Common Wealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genetic sequences conferring nematode resistance in plants and uses therefor |
-
1997
- 1997-09-18 PL PL97332311A patent/PL332311A1/xx unknown
- 1997-09-18 JP JP51429898A patent/JP2001503972A/ja active Pending
- 1997-09-18 CZ CZ99881A patent/CZ88199A3/cs unknown
- 1997-09-18 US US09/269,040 patent/US6294712B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-18 WO PCT/EP1997/005130 patent/WO1998012335A1/de not_active Application Discontinuation
- 1997-09-18 EP EP97910308A patent/EP0927262A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0927262A1 (de) | 1999-07-07 |
| PL332311A1 (en) | 1999-08-30 |
| US6294712B1 (en) | 2001-09-25 |
| JP2001503972A (ja) | 2001-03-27 |
| WO1998012335A1 (de) | 1998-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2140985C1 (ru) | Выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, не встречающаяся в природе молекула нуклеиновой кислоты и способ придания растению устойчивости к вирусу табачной мозаики (варианты) | |
| AU708035B2 (en) | Transgenic plants expressing dna constructs containing a plurality of genes to impart virus resistance | |
| KR100212691B1 (ko) | 질병내성인 트랜스제닉 식물을 제조하는데 유용한 키메라 dna 구조물 및 이를 함유하는 트랜스제닉 식물 그리고 이들의 제조방법 | |
| JP4030582B2 (ja) | 植物における鱗翅目制御のための修飾バチルス・サーリンジェンシス遺伝子 | |
| EP0340197B1 (en) | Insect-resistant lettuce plants | |
| US7795398B2 (en) | Isolated fungal resistant proteins from potato | |
| CZ88199A3 (cs) | Gen indukující odolnost proti nematodům (hlísticím) | |
| JP2003529353A (ja) | ケストルムイエローリーフカーリングウイルスプロモーター | |
| JPH07500012A (ja) | メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列 | |
| JP2017504332A (ja) | 植物におけるタンパク質発現増加 | |
| US6638766B2 (en) | Promoter of the sugarcane UBI4 gene | |
| CN108192920B (zh) | 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法 | |
| BRPI0616222A2 (pt) | gene, proteÍna recombinante, vetor recombinante, mÉtodos para preparar uma planta transgÊnica e para aperfeiÇoar a tolerÂncia a estresse de uma planta | |
| WO2016184397A1 (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| JPH05276951A (ja) | 新規植物プロモーター | |
| CN108432760B (zh) | 杀虫蛋白的用途 | |
| JP4320399B2 (ja) | 新規ネコブセンチュウ抵抗性遺伝子とその利用 | |
| CN111704659A (zh) | 根结线虫ralf蛋白质、编码基因及其应用 | |
| CN102367439B (zh) | 植物气孔特异性启动子及其应用 | |
| CN113528538B (zh) | 黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用 | |
| Kiernan et al. | Transformation and regeneration of Nicotiana edwardsonii | |
| CA2299615A1 (en) | Expression of antimicrobial peptide genes in plants, and their use in creating resistance to multiple plant pathogens | |
| CN108727480B (zh) | 一种转录抑制结构域、其编码基因及其应用 | |
| US6686513B1 (en) | Sugarcane ubi9 gene promoter sequence and methods of use thereof | |
| CN102433338A (zh) | 一种植物气孔特异性启动子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |