JPH07500012A - メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成りＮＡ配列本出願は、１ ９９１年１０月４日に出願された米国の第７７２．０２７号の一部係属出願であ り、その開示を全体として本明細書中に取り込む。 発明の分野 本発明は、殺虫性蛋白をコードしているＤＮＡ配列、及び植物内でのこれらの配 列の発現に関する。 発明の背景 植物内でのバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）から得られる殺虫性蛋白（ＩＰ）遺伝子の発現は、非常に 困難であることが証明されている。植物内でキメラ・プロモーター／ａｔ　ＩＰ 遺伝子組み合わせ物を発現させるための試みが行われてきた。典型的には、低い レベルの蛋白のみがトランスジェニック植物内で得ら低い発現の原因についての ｌっの仮定された説明は、偶然の転写プロセシング部位（ｆｏｒｔｕｉｔｉｏｕ ｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　５ｉｔｅｓ）がＢｔ 　［Ｐ　ｍＲＮＡ転写の異常型の（ａｂｅｒｒａｎｔ）形態を作り出すというも のである。これらの異常にプロセシングされた転写は、殺虫性蛋白を生産すると いう意味において、植物内で非機能的である。可能なプロセシング部位は、ポリ アゾニレ−ジョン部位、イントロン・スプライシング部位、転写終止シグナル及 びトランスポート・シグナルを含む。大部分の遺伝子は、その遺伝子が正常な宿 主生物における遺伝子発現に有害に作用するであろう部位を含んでぃない。しか しながら、コード領域におけるこのようなプロセシング部位の偶然の発生は、ト ランスジェニック宿主内のその遺伝子の発現を複雑にし生性結晶蛋白をコードし ている領域は、この遺伝子が植物内で適当にプロセシングされることを防ぐ部位 を含むがもじれない。 存在する。生来のＢｔ　ＩＰ遺伝子のコドンの用い方が植物遺伝子の典型である ものから有意に異なっていることが発見されている。特に、生来のＢｔ　［Ｐ遺 伝子のコドンの用い方は、ノイズ遺伝子のものと非常に異なっている。その結果 として、この遺伝子からのｍＲＮＡを、有効に使用することはてきない。コドン の用い方は、翻訳又は転写又はｍＲＮＡプロセシングのレベルにおいて遺伝子の 発現に影響を与えることかできる。植物内での発現のための殺虫性遺伝子を最適 化するために、その遺伝子を、可能な限り、形質転換されるへき宿主植物内に天 然に含まれる遺伝子に似せるように変更するための試みが行われてきた。 Ａｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰ　０３５９４７２　（１９９０）は、合成バ チルス・スリンギエンシス・テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）（Ｂｉｔ）遺伝子であって生来のＢ ｔｔ遺伝子に８５％の相同性をもち、そして一般的にその植物内に見いだされる ものとはとんと同しＡ＋Ｔ含量をもつように設計されているものに関する。Ａｄ ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、の表１は、双子葉（ｄｉｃｏｔ）遺伝子の正常コドン分散 により近く似るように作られた合成りｔｔ遺伝子のコドン配列について示してい る。Ａｄａｎｇｅｔ　ａｌ、は、類似の方法を通して単子葉植物内での強化発現 にために、ＩＰのための合成遺伝子を最適化することができることを述へており 、表１中に、より高く発現された単子葉蛋白のコドンの用い方の頻度を表してい る。９ページにおいて、Ａｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、は、その合成りｉｔ遺伝子を ５５％のＡ十Ｔ含量（そして、暗に、４５％のＧ＋Ｃ含量）をもつように設計す ることを述べている。２０ページにおいて、Ａｄａｎｇｅｔ　ａｌ、は、その合 成遺伝子を、その遺伝子のコード領域内でそれぞれのアミノ酸のための双子葉遺 伝子により好まれるコドンの全体分散を反映させるように、生来のＢｔ遺伝子内 で個々のアミノ酸のコドンを変更させることにより、設計することを述へている 。Ａｄａｎｇ　ｅｔａｌ、は、さらに、生来のＢｉｔ遺伝子コドンのほんのいく つかが、双子葉蛋白において使用されるコドンの全体分散が保存されるように、 それぞれのアミノ酸のための最も好ましい植物コドンにより、置き換えられるで あろうということを述へている。 Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＰ　０３８５９６２　（１９９０）は、 バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）の結晶蛋白毒素をコードしている植物遺伝子に関する。表Ｖにおいて、Ｆｉｓ ｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、は、それぞれのアミノ酸のためのコドンについてのパ ーセント用い方について開示している。８ページにおいて、Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　 ｅｔ　ａｌ、は、推定ポリアゾニレ−ジョン・シグナル及びＡＴＴＴＡ配列の除 去による生来のＢｔ遺伝子の修飾について示唆している。Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ｅ ｔ　ａ［、は、さらに、推定の植物ポリアゾニレ−ジョン・シグナルを同定する ために、４以上の連続したアデニン又はチミン分子をもつ領域について生来のＢ ｔ遺伝子配列を走査すること示唆している。 Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、は、このヌクレオチド配列が、１以上の推定ポ リアデニレーノヨン・シグナルが互いのｌＯヌクレオチド内で同定される場合に 、変更されるへきであることを述へている。９ページにおいては、Ｆｉｓｃｈｏ ｆｆ　ｅｔ　ａｌ、は、そのＧ＋Ｃ含量を約５０％に好ましくは調整するように コドンを選択する努力か行われるへきであることる。表１中の３３２５ページに おいて示されるように、Ｐｅｒｌａｋ　ｅｔ　ａｌ。 の部分的に修飾されたｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子は、生来のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝 子（１７４３ヌクレオチドの中の１６８１）に約９６％の相同性をもち、４１％ のＧ＋Ｃ含量、１８から７まて減少された植物ポリアゾニレ−ジョン・シグナル 配列（ＰＰＳＳ）数、及び１３から７まで減少されたＡＴＴＴＡ配列数をもって いる。Ｐｅｒｌａｋ　ｅｔ　ａｌ、の全体として修飾されたｃｒｙｌＡ（ｂ）遺 伝子は、全体が合成的なものとして開示されている（　３３２５ページ、カラム １）。この遺伝子は、生来のＣｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子（＋８４５ヌクレオチドの 中の１４５５）に約７９％の相同性をもち、４９％のＧ＋Ｃ含量、ｌまで減少さ れた植物ボリアデニレーンヨン・シグナル配列（ＰＰＳＳ）数、及び全ＡＴＴＴ Ａ配列が除去されているものをもつ。 Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＰ　０４３１８２９　（１９９１）は、植物 内の殺虫性毒素の発現に関する。カラムｌＯにおいて、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａ ｌ、は、その書類の図１中に示されたチャートに従うそれぞれのアミノ酸のため の最も好ましいコドンを使用したサソリ毒素をコードしている合成ＡａｌＴ昆虫 毒素遺伝子の構築について記載している。 本発明を、植物細胞内での異種遺伝子の発現を強化するための方法に対して得た 。一般的には、問題の遺伝子又はコード領域を植物に特異的な好ましいコドン配 列を提供するために構築する。このやり方において、特定の蛋白のためのコドン の用い方を、特定の植物内で発現を増加させるために変更する。このような植物 最適化コード配列は、植物細胞内てそのコード配列の発現に向けることができる プロモーターに作用可能な状態で結合されることができる。 特に、本発明の１つの目的は、植物内での発現について最適化されている合成殺 虫性蛋白遺伝子を提供することである。 本発明の他の目的は、植物、好ましくはメイズ植物内でのＢｔ蛋白の発現を最適 化するための、合成りｔ殺虫性蛋白遺伝子を提供することである。本発明の１つ の特徴は、合成りｔ　ＩＰ遺伝子を、その全合成遺伝子の構築のための結合部位 を提供するのに必要な変更を除き、最も好ましいメイズ・コドンを使用して構築 することである。 上記の目的に従って、我々は、合成りｔ殺虫性結晶蛋白遺伝子であってその中で そのコドンの用い方が植物、特にメイズ内での発現を増加させるように変更され ているものを、合成した。しかしながら、全体的なコドン分散の意味において、 メイズ遺伝子に似るようにそのコドンの用い方を変更するよりはむしろ、我々は 、その合成遺伝子の合成においてメイズ内で最も好ましいコドン（ノイズ好適コ ドン（ｍａｉｚｅ　ｐｒｅｆｅｒｒｅｓ　ｃｏｄｏｎｓ））を使用することによ り、そのコドンの用い方（ｕｓａｇｅ）を最適化した。その最適化されたノイズ 好適コドンの用い方は、高いレベルのＢｔ殺虫性蛋白の発現に有効である。これ は、メツセンジャーＲＮＡ５の与えられた集団から翻訳されるＢｔ殺虫性蛋白の 量を最大化する結果となることができた。また、ノイズ好適コドンを使用したＢ ｔ　ＩＰ遺伝子の合成は、生来のコード配列内で生しることができる偶然のプロ セシング部位を取り除く傾向がある。 この合成遺伝子の発現は、生来のＩＰ旧遺伝子のものよりもノイズ細胞内で有意 に高い。 好ましい合成の、本発明のメイズ最適化ＤＮＡ配列は、バチルス・スリンギエン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔ ａｋｉ、　ＨＤ−１内のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子によりコードされている蛋白か ら得られ：Ｇｅ１ｓｅ２３　（＋９８８）により記載されている。生来のｋｕｒ ｓｔａｋｉ　ＨＤ−１ｃｒｙｌＡ（ｂ）コシ穿孔性動物）を含む様々な鱗翅目（ Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫に対して活性がある。本発明は、メイズ最適化 旧蛋白遺伝子の合成により例示されるけれども、その方法を植物内でいかなる蛋 白の発現をも最適化するために使用することができることが認識される。 本最適化遺伝子を、様々なプロモーターであって構成的な、誘導性の、一時的に 調節された、発展的に調節された、組織好適（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅ ｄ）の、そして組織特異的な（ｔ　１ｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆ　ｉｃ）プロモー ターと融合させ、組換えＤＮＡ分子、すなわち、キメラ遺伝子を作ることかでき る。このノイズ最適化遺伝子（コード配列）は、非−メイズ最適化遺伝子と比へ て、形質転換植物内で、実質的に高いレベルの発現を提供する。したがって、鞘 翅目の（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）害虫又は鱗翅目の害虫、例えば、欧州トウモ ロコシ穿孔性動物及びサトウキビ穿孔性動物（ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｂｏａｒｅ ｒ）に対して抵抗性の植物を、作ることができる。 本発明の他の目的は、組織好適の及び組織特異的なプロモーターであって、他の 部分の実質的な排除に対する植物の１つの特異的な部分又は複数の部分内での、 問題の作用関連構造遺伝子の発現を促進するものを提供する。 本発明の他の目的は、髄（ｐｉｔｈ）−好適プロモーターを提供することである 。”髄−好適（ｐｉ　ｔｈ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）”は、そのプロモーターが、 その根（ｒｏｏｔｓ）　、外鞘（ｏｕｔｅｒ　５ｈｅａｔｈ）、及び支詩板（ｂ ｒａｃｅ　ｒｏｏｔｓ）内よりも植物の靴内での多量の作用関連構造遺伝子の発 現に向けられることができ、そして実質的に種（ｓｅｅｄ）内で全く発現されな いということを意図している。 本発明のさらに他の目的は、花粉（ｐｏｌｌｅｎ）−特異的プロモーターを提供 することである。“花粉−特異的（ｐｏｌｌｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）”は、そ のプロモーターが、植物の花粉内で実質的に限定的に問題の作用関連構造遺伝子 の発現に向けられることができ、他の植物の部分のいずれかにおいてはご（わず かに発現するということを意図している。 ”ごくわずかに（ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ）“は、機能的に有意差がないことを意 味する。 本発明のさらに他の目的は、問題の構造遺伝子、特に殺虫性蛋白をコードしてい る構造遺伝子、に作用可能な状態で会合した又は結合した組織好適プロモーター 又は組織特異的プロモーターを含んで成る組換えＤＮＡ分子、並びに植物内での その組換え分子の発現を提供する。 本発明のさらなる目的は、組織好適又は組織特異的発現パターンにおいて作用可 能な状態で少な（とも１つの問題の構造遺伝子を発現するトランスジェニック植 物を提供することである。 本明細書中で開示されそして請求された本発明の１つの特定の態様においては、 この組織好適又は組織特異的なプロモーターを、殺虫性蛋白をコードしている構 造遺伝子に作用可能な状態で結合さあせ、そして植物を、少なくとも１つの上記 のような組換え分子により安定的に形質転換させる。得られた植物は、その中で その遺伝子が発現されるところの植物の部分を食へる特定の昆虫に対して抵抗性 となるであろう。好ましい構造遺伝子は、Ｂ、ｔ、殺虫性蛋白をコードしている 。より好ましくは、ノイズの最適化されたＢ、　ｔ、　ＩＰＰ伝子である。 図面の簡単な説明 図１は、完全長の生来のＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子［ＢＴＨＫＵＲＨＤ　］ 、完全長の合成ノイズ最適化層ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子［ｆ　１１ｓｙｎｂｔ、 　ｆ　ｉｎ］及び切り詰められた合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝 子［ｂｓｓｙｎＪの比較である。この図は、完全長の合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃ ｒＹ［Ａ（ｂ）遺伝子の配列が、３４６８ヌクレオチドからの約２３５４におい て（約６８％の相同性）その生来のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のものと適合してい ることを示している。 図２は、切り詰められた生来のＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子［ＢＴＨＫＵＲＨ Ｄ　］及び切り詰められた合成ノイズ最適化Ｂｔ遺伝子［ｂｓｓｙｎｌの比較で ある。 この図は、切り詰められた合成メイズ最適化ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の配列が、 １９４７ヌクレオチドからの約１２７８において（約６６％の相同性）その生来 のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のものと適合していることを示している。 図３は、純粋なメイズ最適化層遺伝子配列［５ｙｎｌＴ、　ｍｚｅ］　と、切り 詰められた合成メイズ最適化Ｂｔ遺伝子［ｂｓｓｙｎｌ及びその遺伝子の構築を 容易にするための制限部位を含むように修飾されている完全長の合成ノイズ最適 化層遺伝子［５ｙｎｆｕ１．ｍｏｄ］との比較である。この図は、切り詰められ た合成メイズ最適化ｃｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子の配列が、１９４７ヌクレオチドか らの約１９１３において（約９８％の相同性）その純粋なメイズ最適化ｃｒｙｌ Ａ（ｂ）遺伝子のものとマツチしていることを示している。 図４は、生来の切り詰められたＢｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子［ＢＴＨＫｔＪＲ ＨＤ　］と、されている切り詰められた合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子及び切り詰 められた合成ノイズ最適化Ｂｔ遺伝子［ｂｓｓｙｎｌ　との比較である。この図 は、ＰＭＯＮＢＴ遺伝子配列が、１８４５ヌクレオチドからの約１４５３におい て（約７９％の相同性）その生来のｃｒｙ　ＩＡ（ｂ）遺伝子のものと適合して おり、一方、切り詰められた合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子か 、１８４５ヌクレオチドからの約１２０９において（約６６％の相同性）その生 来のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子と適合していることを示している。 図５は、Ｐｅｒｌａｋ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　ＩＪｓＡ、　８８：３３２ ４−３３２８　（１９９１）［Ｐ＾１ＯＮＢＴ１中に記載されている切り詰めら れた合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子及び切り詰められた合成ノイズ最適化層ｃｒｙ ｌＡ（ｂ）遺伝子［ｂｓｓｙｎｌの比較である。この図は、ＰＭＯＮＢＴ遺伝子 配列が、１８４５ヌクレオチドからの約１４１０において（約７７％の相同性） その切り詰められた合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のものと適 合していることを示している。 図６は、完全長のメイズ最適化Ｃｒｙ　ＩＢ遺伝子である。 図７は、完全長のハイブリッドの、Ｃｒｙ［Ａ（ｂ）の部分的なメイズ最適化Ｄ ＮＡ配列であってｐｃＩＢ４４３４中に含まれるものである。この合成領域は、 ヌクレオチド１−１９３８（アミノ酸１−６４６）からのものであり、そしてそ の生来の領域は、ヌクレオチド１９３９−４３６８（アミノ酸６４７−１１５５ ）からのものである。合成と生来コード配列との融合点を、配列中スラッシュ（ １）により示す。 図８は、ｐｃＩＢ４４３４のマツプである。 図９は、完全長のハイブリットの、熱安定性のＣｒｙｒＡ（ｂ）の蛋白をコード しているメイズ最適化ＤＮＡ配列であってｐｃＩ８５５１１中に含まれるもので ある。 図１Ｏは、ｐＣＩＢ５５１１のマツプである。 図１１は、完全長のハイブリッドの、熱安定性のＣｒｙｌＡ（ｂ）の蛋白をコー ドしているノイズ最適化ＤＮＡ配列であってｐｃｉ８５５１２中に含まれるもの である。 図１２は、ｐｃｉ８５５１２のマツプである。 図１３は、完全長の、熱安定性のＣｒｙｌＡ（ｂ）の蛋白をコードしているノイ ズ最適化ＤＮＡ配列であってｐｃＩ８５５１３中に含まれるものである。 図１４は、ｐｃＩＢ５５１３のマツプである。 図１５は、完全長の、熱安定性のＣｒｙｌＡ（ｂ）の蛋白をコートしているノイ ズ最適化ＤＮＡ配列てあってｐｃｉ８５５１４中に含まれるものである。 図１６は、ｐｃＩ８５５１４のマツプである。 図１７は、ｐｃ［８４４１８のマツプである。 図１８は、ｐｃｒＢ４４２０のマツプである。 図１９は、ｐＣ［Ｂ４４２９のマツプである。 図２０は、ｐｃｌＢ４４３１のマツプである。 図２■は、ｐｃＩ８４４２８のマツプである。 図２２は、１）ＣＩ８４４３０のマツプである。 図２３Ａは、トランスジェニック・メイズ内のｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白レベルのデ ータを含む表である。 図２３Ｂは、メイズ最適化ＣｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子を含むメイズ子孫からの葉材 材に対する０ｓｔｒｉｎｉａ及びＤｉａｔｒａｅａの生物検定の結果を要約した 表である。 ［ｍ　２３Ｃは、トランスジェニック・メイズ内のｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白レベル のデータを含む表である。 図２３０は、髄プロモーターに作用可能な状態で結合された合成層図２３Ｅは、 髄好適プロモーターを使用したトランスジェニック・メイズ内のｃｒｙ［Ａ（ｂ ）遺伝子の発現の対するデータを含む表である。 図２４は、ノイズのトリプトファン・シンターゼ−アルファ・サブユニット遺伝 子の完全なゲノムＤＮＡ配列である。イントロン、エクソン、転写開始及び翻訳 開始、ｃＤＮＡの開始及び終止を、示す。＄・ｃＤＮＡの開始及び終止：＋１＝ 転写開始；７３３本本本本本本本ニプライマー長プライマー、＋１・翻訳の開始 ：＋＋＋＝終止コドン；塩基対１４９５−９９＝ＣＣＡＡＴホックス：塩基対１ ５９３−１５９８＝ＴＡＴＡＡボックス；塩基対３７２０−３７２５・ポリＡ付 加部位：＃上記の下線配列は、ＰＣＲプライマーである。 図２５Ａ　、２５Ｂ　、２５Ｃ及び２５Ｄは、ノーザン・プロット分析であって 、それぞれ、２時間、４時間、１８時間、及び４８時間の間隔における、ＤｕＰ ｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンによる一８０°Ｃにおける、ノイズ組織内 のメイズＴｒｐＡサブユニット遺伝子の分化発現を示すものである。Ｐ＝髄：Ｃ ＝穂軸（ｃｏｂ）　；ＢＲ＝支持根；ＥＳ＝穂の葉柄（ｅａｒ　５ｈａｎｋ）： ＬＰ＝髄下部下部ｏｗｅｒ　ｐｉｔｈ）　：ＭＰ髄空中央部ＵＰ−髄上部、Ｓ＝ 種：Ｌ＝葉：Ｒ−根：そしてＰ（左上戸全髄。 図２６は、ノーザン・プロット検定であり、その中の２つの左のレーンが、Ｆｕ ｎｋ同系２１１Ｄ及び５Ｎ９８４の葉（い及び髄（Ｐ）内てメイズＴｒρＡ遺伝 子発現を示す。右の５つのレーンは、Ｆｕｎｋ　２１１Ｄ種の全ＲＮＡの不在を 示している。Ｓ（１，２，３，４及び５戸受粉後１，２．３．４及び５週目にお ける種。し＝葉、Ｐ＝髄：Ｓ＃＝種＃種籾受粉後。 図２７は、メイズＴｒｐＡ　ｃＤＮＡ　８−２（ｐｃ［Ｂ５６００）によりプロ ーブした、ゲノムＤＮＡ　Ｆｕｎｋ系２１１Ｄのサザン・プロット検定であり、 図中、ＢはＢａｍＨＩを表し、ＥはＥｃｏＲｌを表し、ＥＶはＥｃｏＲＶを表し 、Ｈは旧ＮＤ１１１を表し、そしてＳはＳａｃ　［を表す。ＩＸ、５ｘ及びＩＯ Ｘは、再構築遺伝子のコピー当量である。 図２８Ａは、メイズＴｒｐＡサブユニット遺伝子の転写開始及び配列決定ラダー を示すプライマー伸長分析である。レーン＋１及び＋２は、プライマー伸長反応 のＩＸ　＋　０．５Ｘサンプルである。 図２８Ｂは、Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンによる一８０°Ｃにお けるフィルムに対する１６時間露出における４２°Ｃ１４８°Ｃ及び５４°Ｃの アニーリング温度における＋２塩基対から＋３８７塩基対までのＲＮａｓｅ保護 の分析である。 図２９は、元のタイプ１１花粉特異的ｃＤＮＡクローンのマツプである。 ３つのＥｃｏＲ［断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にサブクローニング し、ｐｃＩ８３１６８、ｐｃＩ８３１６９及び１１−．６を作り出すことを説明 している。 図３０は、元のタイプＩＩ　ｃＤＮＡクローンの１．　Ｏｋｂ及び０．５ｋｂ断 片内に含まれるような、ノイズの花粉特異的カルシウム依存性蛋白キナーゼ遺伝 子ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を示している。この１．　Ｏｋｂと０．５ｋｂ断片を分 けるＥｃｏＲ１部位を、示す。このｃＤＮＡは、そのｍＲＮＡ開始部位かそのｃ ＤＮＡクローンの末端の上流の４９０塩基対にマツピングしているのて完全長で ない。 図３１は、花粉ＣＤＰＫ　ｍＲＮＡの組織好適発現について説明している。 示されたメイズ２１１１）組織からのＲＮＡを、変性させ、アガロース・ゲル上 で電気泳動し、ニトロセルロースに移し、そして花粉ＣＤＰＫ　ｃＤＮＡｏ、５ ｋｂ断片によりプローブした。二のｍＲＮＡは、花粉内においてのみ検出され、 強いシグナルが見られる。 図３２は、花粉ＣＤＰＫ誘導蛋白配列及びＴｏｂｉｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、　２６３：１６０８２−１６０８６　（１９８８）中に開示されたラ ット蛋白キナーゼ２蛋白配列のアミノ酸配列比較である。ＤＮＡ５ｔａｒソフト ウェア−・パッケージの整列プログラム（ＡＩｌｉｇｎ　ｐｒｏｇｒａｍ）を、 この配列を評価するために使用した。蛋白キナーゼに対する相同性は、この遺伝 子の５゛の２／３内で１、すなわち、１．　Ｏｋｂ断片内で、生じている。 ｈｅｍ、　２６３：１７０５５−１７０６２（１９８８）中に開示されたヒト・ カルモジュリン蛋白配列のアミノ酸配列比較である。カルモジュリンに対するそ う相同性は、その遺伝子の３゛の１７３内で、すなわち、０．５ｋｂ断片内て生 じている。 図３４は、花粉ＣＤＰＫ誘導蛋白配列及び大豆ＣＤＰＫのアミノ酸配列比較であ る。相同性は、遺伝子全体にわたり生じている。 図３５は、メイズ花粉特異的ＣＤＰＫ遺伝子の配列について説明している。その ｍＲＮＡ開始部位に先立つ１．４ｋｂの配列を示す。７つのエクソン（ｅｘｏｎ ｓ）及び６つのイントロン（ｉｎｔｒｏｎｓ）の部分を、その対応するＤＮＡ配 列の下に表す。このｃＤＮＡ内のポリアゾニレ−ジョンの部位を示す。 図３６は、ｐｃｉ８４４３３のマツプである。 図３７は、完全長のハイブリッドの、熱安定性ｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白をコードし ているノイズ最適化ＤＮＡ配列である。 図３８は、ｐｃｉ８５５１５のマツプである。 配列の説明。 配列番号ｌは、完全長の生来のＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のＤＮＡ配列であ る。 配列番号２は、完全長の純粋メイズ最適化合成りｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の １）ＮＡ配列である。 配列番号３は、約２Ｋｂの切り詰められた合成メイズ最適化Ｂｔ　Ｃｒｙ’ＩＡ （ｂ）遺伝子のＤＮＡ配列である。 配列番号４は、完全長の合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子のＤＮ Ａ配列である。 配列番号５は、Ｐｅｒｌａｋ　ｅｔ　ａｌ、に記載の約２Ｋｂの合成りｔ遺伝子 のＤＮＡ配列である。 発明の詳細な説明 本発明を記載するために明細書及び請求の範囲の中でそれらを使用するとき、そ の用諸に関して明瞭性を提供するために以下の定義を与える。 ノイズ好適コドン（Ｍａｉｚｅ　ｐｒｅｆｆｅｒｅｄ　ｃｏｄｏｎ）　好ましい コドンとは、与えられたアミノ酸を特定するためのヌクレオチド・コドンの用い 方において特定の宿主細胞により示される好ましさをいう。特定の宿主について のアミノ酸のための好ましいコドンは、その宿主内でそのアミノ酸を最も頻繁に コードしている単一のコドンである。特定のアミノ酸のためのメイズ好適コドン は、メイズ由来の知られた遺伝子配列から得られる。例えば、ノイズ植物からの ２８遺伝子のた引用により本明細書中に取り込む。例えば、アラニンのためのメ イズ好適コドンは、ＧＣＣである。なせなら、λ１ｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、 唾ｙ中の、２６のメイズ遺伝子のプールされた配列に従って、そのコドンか、Ｇ ＣＧ（２４％）、ＧＣＡ（１３％）、及びＧＣＴ（２７％）に比へてアラニンを 同時期（こ３６％コードしているからである。 純粋なメイズ最適化配列（ｐｕｒｅ　ｍａｉｚｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅ）：最適化遺伝子又はＤＮＡ配列とは、その中て生来の遺伝子のヌク レオチド配列がメイズのための好ましいコドンを使用するために修飾されている ところの遺伝子をいう。例えば、合成メイズ最適化層ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子は 、その中で、その生来のＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のヌクレオチド配列が、 使用されるコドンが先に記載したようなメイズ好適コドンであるように修飾され ている遺伝子である。純粋なノイズ最適化遺伝子は、その中で、そのヌクレオチ ド配列が特定のポリペプチドのためのメイズ好適コドン配列の１００パーセント を含んで成る遺伝子である。例えば、純粋なメイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ ）遺伝子は、その中で、そのヌクレオチド配列が１００パーセントのメイズ好適 コドン配列のを含んで成り、そしてその生来のＢｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子に より作られるものと同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしている遺 伝子である。最適化遺伝子の純粋なヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチド を変更し制限部位を創出又は削除することにより、その遺伝子の操作を許容する ように変動されてもよい。また、最適化遺伝子の純粋なヌクレオチド配列は、潜 在的に有害なプロセシング部位、例えば、潜在的なポリアゾニレ−ジョン部位又 はイントロン認識部位を削除するように変動されてもよい。 ”部分的なメイズ最適化（ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｍａｉｚｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｄ）”配列を使用することができることも認識される。部分的なノイズ最適化と は、その遺伝子のコード領域が、生来の殺虫性遺伝子から得られる配列及びメイ ズ内での発現のための最適化されている配列を含んで成る、キメラ（ハイブリッ ド）であることを意味している。部分的な最適化遺伝子は、昆虫の害虫を制御す るのに十分なレベルにおいて殺虫性蛋白を発現し、そしてこのような発現が、生 来の配列のみを使用して達成されるよりも高いレベルにある。部分的なメイズ最 適化配列は、少なくとも約５％の最適化配列を含むものである。 完全長Ｂｔ遺伝子ことは、生来のＢｔ遺伝子により作られるポリペプチドをコー ドするのに必要なヌクレオチド配列の全体を含んで成るＤＮＡ配列をいう。例え ば、この生来のＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子は、長さ約３、５ｋｂてあり、そ して長さ約１１５０アミノ酸であるポリペプチドをコードしている。完全長の合 成ｃｒｙｌＡ（ｂ）　Ｂｔ遺伝子は、少な（とも約３、５ｋｂの長さをてあろう 。 切り詰められたＢ

【遺伝子（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　Ｂｔ　Ｇｅｎｅ）とは、生来 のＢｔ遺伝子により作られるポリペプチドをコードするのに必要なヌクレオチド 配列の全てよりも少ないものを含んで成るＤＮＡ配列であるが、そのポリペプチ ドの活性な毒素部分をコートしているものをいう。例えば、約１．９ＫｂＯ切り 詰められた合成りｔ遺伝子は、その蛋白か殺虫活性を示すようにポリペプチドの 活性毒素部分をコードしている。 組織好適プロモーター（Ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ ）：用語”組織好適プロモーター”は、与えられた調節ＤＮＡ配列が、慣用のＲ ＮＡ又は蛋白検定のいずれかにより示されるように、より高いレベルの関連構造 遺伝子又はＤＮＡコード配列の転写を、又は関連遺伝子の生成物の発現を、促進 するであろうし、又は与えられたＤＮＡ配列がいくつかの特異な効果（ｄｉｆｆ ｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ）を現すてあろうということを示すために使用 され：すなわち、その関連ＤＮＡ配列の転写又は遺伝子生成物の発現がその植物 の他の組織のすべての内においてよりも幾つかの組織内でより大きなものである ということを示すために使用される。 ”組織特異的プロモーター（Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅ ｒ）″は、与えられた調節ＤＮＡ配列が、植物の１以上の組織内、又は１つのタ イプの組織、例えば、紗組織（ｇｒｅｅｎ　ｔｉｓｓｕｅ）内で、関連コードＤ ＮＡ配列を本質的に完全に転写することを促進するであろうし、一方、その関連 コードＤＮＡ配列の転写がその植物の組織の他のすべての組織又はタイプにおい て本質的に全く生じないということを示すために使用される。 本発明は、植物内、特にノイズ植物内での発現のために最適化されたＤＮＡ配列 を提供する。本発明の好ましい態様においては、そのＤＮＡ配列は、殺虫性毒素 、好ましくは、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）により正常に生産される殺虫性結晶蛋白毒素のアミノ酸配列と 実質的に分かち合うポリペプチドの生産をコードしている。この合成遺伝子は、 切り詰められた又は完全長の殺虫性蛋白をコートすることができる。特に好まし いものは、合成りＮＡ配列であって鱗翅目及び鞘翅目の昆虫に対して有効なポリ ペプチドをコートしているもの、並びに合成りＮＡ配列であってバチルス・スリ ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）変種ｋｕｒｓ ｔａｋｉ、　ＨＤ−１の結晶蛋白毒素の中の１つと本質的に同しアミノ酸配列を もつポリペプチドをコードしているものである。 本発明は、植物、好ましくはメイズのプロトプラスト、植物細胞及び植物内の活 性な殺虫性蛋白の高い発現を作り出すのに有効な合成りＮＡ配列を提供する。本 発明の合成りＮＡ配列を修飾し、コドンの用い方及びＧ＋Ｃ含量の意味において ノイズ遺伝子に似せた。これらの修飾の結果として、本発明の合成りＮＡ配列は 、その生来の遺伝子内に存在する潜在的なプロセシング部位を含まない。得られ た合成りＮＡ配列（合成旧ＩＰコード配列）及びこの合成りＮＡ配列（合成りｔ ＩＰ遺伝子）を含む植物の形質転換ベクターは、驚くへきことに、植物、特にノ イズ内の殺虫性蛋白に生産の意味において、その生来のＢｔ　［Ｐ遺伝子に比較 して、その合成りｔ　ＩＰ遺伝子の増加された発現をもたらす。高いレベルの発 現は、鱗翅目昆虫、好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動物及びＤｉａｔｒｅａ 　５ａｃｃｈａｒａｌｉｓ　、サトウキビ穿孔性動物に対する抵抗性を示すメイ ズ細胞及び植物をもたらす。 いるが、Ｇ＋Ｃ含量及びコドンの用い方の意味において、ノイズ内の記載されて いるメイズのコドンの用い方を、最も好ましいノイズのれる毒素のアミノ酸配列 を逆翻訳するために使用する。この逆翻訳されたＤＮＡ配列を、純粋なメイズ最 適化配列として表し、そして配列番号４として示す。この配列は、不所望の制限 エンドヌクレアーゼ部位を取り除くように、そして所望の制限エンドヌクレアー ゼ部位を作り出すように修飾されている。これらの修飾は、そのコドンの用い方 又はそのメイズ最適化配列を相当に変更することなくその遺伝子のクローニング を容易にするように設計されている。このクローニング手順の間に、この遺伝子 のクローニングを容易にするために、他の修飾を、そのポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）によるクローニングの間に誘導されるエラ一対して特に感受性であるよ うな領域内で行う。このノイズ最適化合成旧ＩＰ遺伝子の最後の配列を、配列番 号２中に示す。このメイズ最適化合成りｔ　［Ｐ遺伝子とその生来のｋｕｒｓｔ ａｋｉ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）　Ｂｔ遺伝子との比較を、図１中に示す。 本発明の好ましい態様においては、この合成りＮＡ配列により生産される蛋白は 、その他の鱗翅目又は鞘翅目の昆虫に対して有効である。より好ましい態様にお いては、この合成りＮＡ配列によりコード性蛋白の完全長の又は切り詰められた アミノ酸配列から本質的に成る。特定の態様においては、この合成りＮＡ配列は 、上記のＢｔ　ＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白の切り詰められたアミノ酸配列から本質的 に成るポリペプチドをコードしている。 本発明の殺虫性蛋白は、昆虫害虫を制御するのに十分な量において、すなわち、 昆虫制御量において植物内で発現される。昆虫を制御するのに必要な殺虫性蛋白 の発現の量は、植物の種、昆虫のタイプ、環境因子等に依存して変動することが できる。一般的に、その昆虫集団は、植物から植物へ変動する経済的な閾値より 低く保たれるであろう。　例えば、メイズにおいて欧州トウモロコシ穿孔性動物 を制御するためには、その経済的な閾値は、約１０幼虫（ｌａｒｖａｅ）／植物 （ｐｌａｎｔ）に翻訳されるｏ、　５ｅｇｇｍａｓｓ（卵の塊）／植物である。 本発明の方法は、植物の根を食う昆虫の幼虫（ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ）　、ネキリ ムシ（ｃｕｔｗｏｒｍｓ）、アワヨトウの幼虫（ａｒｍｙｗｏｒｍｓ）　、特に 秋のヒート（ｂｅｅｔ）のアワヨトウの幼虫、コメツキムシの幼虫（ｗｉｒｅｗ ｏｒｍｓ）、アブラムシ（ａｐｈｉｄｓ）、トウモロコシ穿孔性動物（ｃｏｒｎ 　ｂｏｒｅｒｓ）　、特に欧州トウモロコシ穿孔性動物（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｃ ｏｒｎ　ｂｏｒｅｒｓ）、サトウキビ穿孔性動物（ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｂｏｒ ｅｒｓ）、マダラメイガ（ｌｅｓｓｅｒ　ｃｏｒｎ　５ｔａｌｋ　ｂｏｒｅｒ） 　、南西部トウモロコシ穿孔性動物（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　ｃｏｒｎ　ｂ ｏｒｅｒｓ）等を含むがこれに限定されない多種多様な昆虫を制御ｉｔ（ｃｏｎ ｔｒｏｌｌｉｎｇ）するために有用である。 本発明の好ましい態様においては、メイズ内での発現のために最適化された合成 コードＤＮＡ配列は、その生来のｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子のものより大きなＧ十 〇パーセンテージを含んで成る。このＧ＋Ｃパーセンテージが少なくとも約５０ パーセント、そしてより好ましくは少なくとも約６０パーセントであることが好 ましい。このＧ＋Ｃ含量が約６４パーセントであることが特に好ましい。 本発明の他の好ましい態様においては、ノイズ内での発現のために最適化された 合成コード開Ａ配列は、その生来のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白の“純粋な（ｐｕ ｒｅ）”ノイズ最適化ヌクレオチド配列と少なくとも約９０パーセントの相同性 を、より好ましくは少なくとも約９５パーセントの相同性を、そしてより好まし くは少なくとも約９８パーセントの相同性をもっヌクレオチド配列を含んで成る 。 本発明の他の好ましい態様は、本質的に配列番号４のＤＮＡ配列をもつ合成りＮ Ａ配列、並びにそれらの突然変異体又は変異体；本質的に配列番号４のＤＮＡ配 列を含んで成る形質転換ベクター：及び、プラスミド１１ｃＩＢ４４０６、ｐｃ ［Ｂ４４０７、ｐｃＩ８４４１３、ｐｃＩＢ４４１４、ｐｃ［Ｂ４４１６、ｐＣ ［Ｂ４４１７、ｐＣ（Ｂ４４１Ｂ、ｐｃｉ８４４１９、ｐｃＩＢ４４２０、ｐＣ （Ｂ４４２１．　ｐｃＩＢ４４２３、ｐｃ［８４４３４、ｐＣＩ８４４２９、ｐ ｃｉ８４４３１．　ｐｃＩ８４４３３から得られた単離されたＤＮＡ配列を含む 。最も好ましいものは、プラスミドｐｃＩ８４４１８並びにｐＣ１８４４２０、 ｐｃＩ８４４３４、ｐｃｉ８４４２９、ｐｃＩ８４４３１及びｐｃ［Ｂ４４３３ である。 本発明のノイズ最適化ＤＮＡ配列の中の１つを構築するために、約８０ヌクレオ チドの平均長さをもつ合成りＮＡオリゴヌクレオチドを、作る。これらのオリゴ ヌクレオチドは、ハイブリダイズされ、その切り詰められた毒素遺伝子の様々な （クォーター（ｑｕａｒｔｅｒ））を含んで成る断片を作るように設計されてい る。与えられたクォーターのためのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイズし、 そしてＰＣＲを使用して増幅する。次にそのクォーターをクローン化し、そして このクローン化クォーターを所望の配列を含むものを見つけるために配列決定す る。１つの場合、第四クォーターにおいては、ハイブリダイズされたオリゴヌク レオチドをＰＣＲ増幅なしに直接クローン化する。４つのクォーターのすべての クローンがオーブン・リーディング・フレームを含んでいることが一旦見つかれ ば、活性な殺虫性蛋白をコードしている無傷の遺伝子を集合させる。この集めら れた遺伝子を次に欧州トウモロコシ穿孔性動物（ＥＣＢ）及びサトウキビ穿孔性 動物を含む問題の昆虫のいくつかに対する殺虫活性についてテストすることがで きる（それぞれ、例５Ａ及び５Ｂ）。完全に作用する遺伝子を得たとき、その− 次構造を確認するために再びそれを配列決定する。完全に作用する遺伝子は、Ｅ ＣＢに対して生物検定したとき１００％死亡率を与えることが分かった。また、 この完全に作用する遺伝子をメイズ内の発現のために修飾する。 ノイズ最適化遺伝子を過渡的発現検定において、例えば、ノイズ発現検定におい てテストする。活性殺虫性毒素のための生来のＢｔ　Ｃｒｙ［Ａ（ｂ）コード配 列は、ノイズ過渡的発現系においては検出可能なレベルにおいて発現されない。 したがって、合成遺伝子の発現のレベルを、測定することができる。本方法によ り、形質転換植物内の蛋白の発現は、少なくとも約１００倍〜約５０．０００倍 、より特に少なくとも約１．０００倍〜少なくとも約２０．０００倍、増加され ることができる。 有効レベルまでの殺虫性遺伝子の発現の増加は、その完全配列に沿った生来の遺 伝子の操作を必要としない。有効な発現は、増加した発現を得るために必要な配 列の一部だけを操作することにより達成されることができる。その生来のＣｒｙ ｌＡ（ｂ）配列の蛋白を含む、完全長のメイズ最適化ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子を 、調製することができる。例えば、図７は、合成−生来のハイブリッドである完 全長のメイズ最適化ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子について説明している。すなわち、 約２ｋｂの遺伝子（ヌクレオチド１−１９３８）は、メイズ最適化された、すな わち、合成のものである。その残りの、Ｃ−末端のヌクレオチド６４７−１１５ ５は、そのＣｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子の対応する生来の配列と同一である。 本明細書中に記載した方法の使用により、様々な合成／生来ハイブリッドを構築 し、そして発現についてテストすることができることが認められている。ハイブ リッド構築物の重要な態様は、その蛋白が昆虫害虫を制御するのに十分な量にお いて生産されるということである。このやり方においては、その遺伝子の決定的 な領域を、同定し、そしてこのような領域を好ましいコドンを使用して合成する ことができる。この合成配列を、以下の例中に表すような生来の配列と結合させ ることができる。一般的に、Ｎ−末端の部分又はプロセシング部位を、合成し、 そして植物内の発現を増強するためにその生来のコート配列内で置換させること ができる。 本発明の他の態様においては、ｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白をコードしているメイズ最 適化遺伝子を、そのコート蛋白をその生来のｃｒｙｒＡ（ｂ）蛋白に比べてより 熱安定性又は温度安定性にするために操作することができる。バチルス・スリン ギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｋｕｒｓｔａｋ ｉ　ＨＤ−１内にあるｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子か、そのｃｒｙｌＡ（ａ）及びｃ ｒｙｌＡ（ｃ）蛋白と比へたとき、その蛋白の−ＣＯＯＨ半分内で、２６アミノ 酸の欠失を含むことが示されている。この欠失は、温度感受性ｃｒｙ［Ａ（ｂ） 蛋白を導く。Ｍ、　Ｇｅ１ｓｅｒ、　ＥＰ　Ｏ４４０５８１，名称’Ｔｅｍｐｅ ｒａｔｕｒｓｔａｂｉｌｅｓ　ＢａｃｉＡ（ｃ）蛋白からのその対応領域の上記 の欠失の修復は、その修復された蛋白の温度安定性を改善する。完全長修飾ｃｒ ｙｌＡ（ｂ）合成遺伝子の構築物を、その読み取り枠を変更することなく、そし てその蛋白配列の残りを変更することなく、その配列内の適切な場所に失ったア ミノ酸をコードする配列を挿入するように設計する。その遺伝子の完全長の合成 変異体を、一連の２本鎖ＤＮＡカセットであってそれぞれサイズ約３００塩基対 であるものを、ＤＮＡ合成及び酵素反応の標準的な技術を使用して、合成するこ とにより、組み立てる。この修復された遺伝子は、”熱安定性”又は”温度安定 性“ｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白をコードしていることを表している。なぜなら、それ は、高い温度に晒されたときその生来の片割れよりもより生物活性を保持してい るからである。温度安定蛋白をコードしているメイズ最適化熱安定性ｃｒｙｌＡ （ｂ）遺伝子の特異的な配列を、図９．１１．１３、及び１５中に記載し、そし てまた、以下の例７中にも記載する。 本発明は、他のポリペプチドをコードしているメイズ最適化コー含むものを包含 する。例えば、ｃｒｙ［Ｂ遺伝子は、ノイズ最適化され、そして次に、植物、特 にメイズ中に安定的に導入されることができる。本発明に従って構築されたメイ ズ最適化ｃｒｙｌＢ遺伝子の配列を、図６中に記載する。 本発明に記載のメイズ好適コドンの用い方を使用したメ・ｒズ内の発現のための Ｂｔ　［Ｐ遺伝子を最適化することは、その殺虫性遺伝子の発現における有意な 増加をもたらす。他の遺伝子は、メイズ又は他の植物内でのそれらの発現を改善 するための植物コドン選択物（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を使用して合成されるこ とができる。メイズ・コドン選択物の使用は、メイズ内の外来遺伝子の発現を最 適化し、そして最大化する有望な方法である。このような遺伝子は、メイズ形質 転換における選択性（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）又は獲得性（ｓｃｏｒｅａｂｌｅ ）マーカーとして使用される遺伝子、除草剤耐性を与える遺伝子、疾患抵抗性を 与える遺伝子、そして昆虫抵抗性を与える他の遺伝子を含む。 合成ｃｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子を、広い範囲の双子葉植物の種の形質転換のために 作用であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター中に挿 入することもてきる（例４４）。合成（ｒｙｌＡ（ｂ）アグロバクテリウム（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクターにより安定的に形質転換された植物は、殺 虫活性を示す。 生来のＢｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子は、非常にＡ＋Ｔが豊富である。完全長の 生来のＢｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子のＧ＋Ｃ含量は、約３９％である。長さ約 ２ｋｂの切り詰められたＢｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のＧ＋Ｃ含量は、約３７ ％である。一般的には、メイズのコート領域は、優勢的にＧ＋Ｃ豊富である。こ のＢｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子に対して行われた修飾は、５０％より大きなＧ ＋Ｃ含量をもつ合成［Ｐコード領域をもたらし、そしてその生来のｃｒｙｌＡ（ ｂ）遺伝子とそのＤＮＡレベルにおいて約６５％の相同性をもつ。 この合成ＣｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子によりコートされている蛋白は、その生来の蛋 白と１００％の相同性をもち、そしてそれ故、殺虫活性の意味において完全な機 能を保持している。この切り詰められた合成ＣｒｙｌＡ（ｂ）ＩＰ遺伝子は、長 さ約２ｋｂてあり、そしてその遺伝子は、その生来のＢｔ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　 ＣｒｙｌＡ（ｂ）殺虫性蛋白の活性毒素領域をコードしている。この切り詰めら れた合成ＣｒｙｌＡ（ｂ）　ＩＰ遺伝子によりコートされている蛋白の長は、６ ４８アミノ酸である。 本発明の合成遺伝子は、トランスジェニック植物における最も好ましくは形質転 換されたノイズにおける発現強化に有用である。本発明のトランスジェニック植 物は、高レベルにおける殺虫性ＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白であって、昆虫害虫、好ま しくは鱗翅目又は鞘翅目昆虫、そして最も好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動 物（ＰＣＢ）及びサトウキビ穿孔性動物に対する抵抗性をもたらすものを発現さ せるために使用されることかできる。 本発明においては、合成メイズ最適化遺伝子のＤＮＡコード配列は調節要素、例 えば、そのコード配列の発現に向けられるプロモーターの制御下にあることがで きる。このような調節要素は、そのノイズ植物の様々な部分内でその遺伝子の発 現を提供するために、例えば、単子葉又はメイズ及び他の単子葉の機能的プロモ ーターを含む。 この調節要素は、構成的であることができる。すなわち、それは、そおの遺伝子 の連続的なそして安定的な発現を促進させることができる。このようなプロモー ターは、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター：ＣａＭＶ　１９Ｓプロモーター；　Ａ 、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓプロモーター、例えば、オクトビン・シンターゼ（ ｏｃｔｏｐｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、マンノピン・シンターゼ （ｍａｎｎｏｐｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、ツバリン・シンター ゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター、又は他のオパイン・ シンターゼ（ｏｐｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）プロモーター；ユビキチン（ｕｂ ｉｑｕｉｔｉｎ）プロモーター、アクチン・プロモーター、ヒストン・プロモー ター及びチュブリン・プロモーターを含むがこれに限定されない。この調節要素 は、組織優先（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ）プロモーターである ことがてき、すなわち、それは、他の中においてよりも植物のいくつかの組織内 において高い発現を促進する。好ましくは、組織優先プロモーターは、種の中よ りも葉、茎、根及び／又は花粉の中においてその合成遺伝子の高い発現に向けら れることができる。また、その調節要素は、例えば、熱ストレス、水ストレス、 昆虫摂食又は化学誘導により誘導されることもでき、又は　発展的に調節される こともできる。その発現が組織特異的なやり方において変動することが知られて いる多数のプロモーターが、当業者に知られてりう。このような例の１つは、メ イズのホスホエノール・ピルベート・カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）であって縁 組織特異的（ｇｒｅｅｎ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ織特異的プロモータ ーは、クロロフィルａ／ｂ結合性蛋白プロモーター及びＲｕｂｉｓＣＯ小サブユ ニット・プロモーターを含む。 また、本発明は、単離されたそして精製された髄（ｐｉｔｈ）−好適プロモータ ーを提供する。好ましい髄好適プロモーターは、イネ科（ｇｒａｍｉｎａｃｅｏ ｕｓ）の単子葉植物、例えば、サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ）　、米、小麦 、サトウモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）　、大麦、ライ麦（ｒｙｅ）及びノイズ（ ｍａｉｚｅ）から単離され；より好ましいものは、メイズ植物から単離されたも のである。 好ましい態様においては、髄好適プロモーターは、植物ＴｒｐＡ遺伝子から単離 され：最も好ましい態様においては、それは、メイズＴｒｐＡ遺伝子から単離さ れる。すなわち、その生来の状態におけるプロモーターは、メイズのトリプトフ ァン・シンターゼ−アルファ・サブユニット遺伝子（以下、”ＴｒｐＡ”）と作 用的に関連している。コードされた蛋白は、約３８ｋＤの分子質量をもっている 。他のアルファ・サブユニット及び２つのベータ・サブユニットと一緒になって 、ＴｒｐＡは、多量体酵素、トリプトファン・シンターゼを形成する。それぞれ のサブユニットは、別々に働くことかできるが、それらは、−緒になってより効 果的に機能する。ＴｒｐＡは、インドール・グリセロール・ホスフェートのイン ドールへの変換を触媒する。メイズＴｒｐＡ遺伝子又はそのコードされた蛋白の いずれも全く、出願人の発明のｈａｌｉｎａのトリプトファン・シンターゼ・ベ ータ・サブユニット遺伝子を、Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｐｌａ ｎｔ　Ｃｅ１１．４ニア１ｌ−７１９（１９９２）中に記載されているようにク ローン化した。このメイズＴｒｐＡ遺伝子は、そのベータ・サブユニット・コー ド遺伝子に全く相同性をもっていない本発明は、植物カルシウム依存性ホスフェ ート・キナーゼ（ＣＤＰＫ）遺伝子から得られる精製花粉特異的プロモーターを も提供する。すなわち、その生来の状態においては、そのプロモーターは、植物 のＣＤＰＫ遺伝子に作用可能な状態で結合されている。好ましい態様においては 、そのプロモーターを、メイズＣＤＰＫ遺伝子から単離する。”花粉特異的（ｐ ｏｌ　ｆｅｎ−ｓｐｅｃｉｆ　ｉｃ）”は、問題の作用関連構造遺伝子の発現が 植物の花粉内に実質的に限定されており（すなわち、本質的に全部であり）、そ して他の植物部分のすへて内でほとんどないことを意味している。”ＣＤＰＫ“ は、カルモジュリンでなくカルシウムについて高いアフィニティーをもち、その 触媒活性のために、カルモジュリンでなくカルシウムを必要とする植物蛋白キナ ーゼを意味している。 組織好適又は組織特異的プロモーターを得るために、組織特異的メツセンジャー ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコートしている遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーの差異ス クリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）により得るこ とができる。例えば、髄好適ｃＤＮＡを、髄から得られたｃＤＮＡプローブ及び 種ｍＲＮＡを使用する差異スクリーニングに髄ｃＤＮＡライブラリーを供するこ とにより得ることがてきる。助１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　（１９８９）を参照のこと。 あるいは、組織特異的プロモーターを、組織特異的蛋白を得て、そのＮ−末端を 配列決定し、オリゴヌクレオチド・プローブを合成し、モしてｃＤＮＡライブラ リーをスクリーニングするためにそのプローブを使用することにより、得ること ができる。このような手順を、花粉特異的プロモーターの単離のための本実験セ クション中に例示する。髄特異的及び花粉特異的プロモーターに関しての本発明 の範囲は、完全長プロモーターの機能的に活性な断片であって、関連構造遺伝子 のそれぞれ髄好適又は花粉特異的転写に向けることもできるものを包含する。プ ロモーターＤＮＡ配列の機能的に活性な断片は、幾つかの当分野において認めら れた手順により、例えば、制限酵素を使用したプロモーターＤＮＡ配列の解裂、 その配列に従ったそのプロモーターＤＮＡ配列の合成により、プロモーターＤＮ Ａ配列から得ることができ、又はＰＣＲ技術の使用を通して得ることができる。 例えば、Ｍｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、λＩｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５ ５：３３５−３５０　（１９８７）＋　Ｅｒｌｉｃｈ本発明の範囲内にさらに含 まれるものは、完全長プロモーターに“等価な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）”髄好 適及び花粉特異的プロモーターである。 すなわち、異なるヌクレオチド、又はヌクレオチドの群を、公知の手順に従って プロモーター活性を破壊しないやり方で、修飾、付加又は欠失させることかでき る。 メイズＴｒｐＡ遺伝子から得られる髄好適プロモーターを、図２４中に示す。当 業者は、手に入れた本配列情報により、メイズＴｒｐＡ構造遺伝子から得られる プローブによりこれらの植物からの髄ライブラリーをプロービングすることによ り、本発明の範囲内に含まれる髄好適プロモーターを他の植物から得ることかで きることを、認識するであろう。例１７中に一般的に討議するように、様々な種 のＴｒｐＡサブユニット遺伝子の中に高く保存される配列から設計されたプロー ブが、好ましい。他の、花粉特異的プロモーターであってそおれらの生来の状態 においてメイズ以外の植物ＣＤＰＫ遺伝子に結合するものを、花粉ライブラリー をプローブするために、メイズＣＤＰＫ遺伝子の保存領域から得られたプローブ を使用して、類似の方法で、単離することができる。 本発明の他の態様においては、髄好適又は花粉特異的なプロモーターを、ＤＮＡ 配列、すなわち、問題の蛋白をコードしている構造遺伝子に作用可能な状態で結 合し、組換えＤＮＡ分子又はキメラ遺伝子を形成させる。語句”に作用可能な状 態で結合する（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１ｉｎｋｅｄ　ｔｏ）”は、本分野で認めら れる意味をもち；それは、”と作用関連の（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ａｓｓｏ ｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ）”、”に結合した（ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ）”又は”に 融合した（ｆｕｓｅｄ　ｔｏ）”と互いに交換可能なものとして使用されてもよ い。 構造遺伝子は、プロモーターの起点（ｏｒｉｇｉｎ）及び／又はその中にそれが 形質転換されるところの標的植物に関して、同種のものであり又は異種性のもの であってもよい。相対的な起点にかかわらず、その関連ＤＮＡ配列は、それが結 合するところのプロモーターの発現の性質に従って形質転換植物内で発現される であろう。それ故、関連ＤＮＡ配列の選択は、上記の方法により発現される配列 をもつ必要性から開放されるべきである。異種ＤＮＡ配列の例は、殺虫性蛋白、 例えば、昆虫又は他の植物寄生性の節足動物（ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ）、あるい は植物病因原、例えば、菌類、バクテリア及び線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）に 対して毒性又は阻害的な蛋白又はポリペプチドをコードしているものを含む。こ れらの異種ＤＮＡ配列は、蛋白、例えば、マガイニン−５７６（１９８３）：メ リチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、グラミシジンＳ（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ　Ｓ）。 ラム・チャンネル蛋白及び合成断片、　０ｉｋｉ　ｅｔ　ａｔ、　ＰＮＡＳ　Ｕ ＳＡ、　８５：２ｍｅｔｈｉｃｉｎ）及び各種の合成両親媒性（ａｍｐｈｉｐａ ｔｈｉｃ）ペプチド、　Ｋａｉｓ−６８（１９８６）＋プロテアーゼ及びアミラ ーゼ阻害剤；及びバチルス・バクテリア又は菌類（ｆｕｎｇｉ）からのデルタ− エンドトキシン（ｄｅｌｔａ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ）を、コードしている。 本発明の好ましい態様においては、メイズＴｒｐＡサブユニット遺伝子から得ら れた髄好適プロモーター又はノイズＣＤＰＫ遺伝子から得られた花粉特異的プロ モーターを、バチルス・スリンギエンシス迩１１１ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ）（”Ｂ、ビ）殺虫性蛋白をコードしている異種ＤＮＡ配列に作用可能な 状態で結合させる。これらの蛋白及びその対応する構造遺伝子は、当技術分野に おいてよく知られている。Ｈｏｆｔｅａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　５３：２４２−２５５　（１９８９）を参照の こと。 発現に向けられることかできるいずれかのプロモーターを利用することができる ことは認められているが、問題の蛋白の生来のプロモーターよりもむしろ異種の プロモーターを使用することが好ましいてあろう。このやり方において、形質転 換されるへき植物並びに昆虫害虫に基つき決定されるっこおとかてきる、キメラ のヌクレオチド配列を構築することができる。例えば、ノイズにおける昆虫害虫 を制御するために、単子葉又はノイズのプロモーターを、作用可能な状態て旧蛋 白に結合することができる。このノイズのプロモーターを、組織好適及び組織特 異的プロモーター、例えば、それぞれ本明細書中に開示するような、髄好適及び 花粉特異的プロモーターから選択することができる。 いくつかの場合には、１以上のキメラ遺伝子構築物によりその植物細胞を形質転 換することが好ましいかもしれない。それ故、例えば、単一植物を、Ｂｔ蛋白に 作用可能な状態で結合された髄好適プロモーター並びにＢｔ蛋白に作用可能な状 態で結合された花粉特異的プロモーターにより、形質転換することができるであ ろう。 形質転換された植物は、その植物の髄及び花粉内で、そしてより少ない程度にお いて根、外鞘及び支持根内で、Ｂｔ蛋白を発現するであろう。 様々な他の理由のために、特に潜在的な昆虫抵抗性を殺虫性蛋白発現植物に発達 させるのために、同一の植物内で１以上の殺虫性蛋白（ＩＰ）を発現させること が有利である。ある者は、同一の組織内に２つの異なる遺伝子（例えば、標的昆 虫の牛腸（ｍｉｄｇｕｔ）内の異なるることができたし、又はある者は、組織特 異的プロモーターを使用して同一植物の異なる組織内で２つの毒素を選択的に発 現させることができている。３つの異なる組織特異的プロモーターを使用して同 −植物内で２つのＢｔ遺伝子（又はいずれかの２つの殺虫性遺伝子）を発現させ ることは、所望の発現型を発現する植物の生産についての問題を現す。２つの異 なる遺伝子を動かす３つの異なるプロモーターは、同時にその植物内に導入され ることが必要な６つの異なる殺虫性遺伝子を作り出す。また、この形質転換に必 要なものは、形質転換植物の同定において助けとなる選択マーカーである。この ことは、同時に、７つの異なる遺伝子をその植物中に導入することを意味する。 全ての遺伝子、特に殺虫性遺伝子が、単一遺伝子の習性（ｔｒａｉｔ）として、 そしてそれらが商業的なハイブリッドの栽培の間に追跡することがより難しくな るであろう且つ多遺伝子の習性としててはなく振る舞うように、同一の座におい てその植物ゲノム中に組み込まれることが最も要求される。遺伝子の全数を、異 なる殺虫性蛋白の差異に基づ＜　（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）組織特異的な発 現を使用することにより、減少させることができる。 例えば、ｃｒｙｌＡ（ｂ）を、その花粉及びＰＥＰカルボキシラーゼ・プロモー ターと融合させることにより、ある者は、縁組織及び花粉内でこの遺伝子の発現 を得ることができるであろう。髄好適プロモーターをバチルス・スリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ口５ｉｓ）からのｃｒｙｌＢデルタ ・エンドトキシンと融合することは、形質転換植物の種組織内ではなく髄内て最 も豊富な上記の殺虫性蛋白の発現を生じさせるであろう。３つの遺伝子、すなわ ち、ＰＥＰカルボキシラーターｃｒｙ［Ａ（ｂ）　、花粉／ｃｒｙｌＡ（ｂ）　 、及び髄／ｃｒｙｌＢによる植物の形質転換は、同一の植物の異なる組織内で２ つの異なるＢｔ殺虫性エンドトキシンを発現する植物を作り出す。ＣｒｙｌＡ（ ｂ）は、植物の“外側（ｏｕｔｓｉｄｅ）”の組織内で、すなわち、欧州トウモ ロコシ穿孔性動物が鼾化（ｈａｔｃｈｉｎｇ）後最初に食へるような組織内で、 発現されるであろう。ＥＣＢがｃｒｙｌＡ（ｂ）に抵抗性であり、そして葉組織 及び／又は花粉を食へた後その植物の葉柄（ｓｔａｌｋ）中に穴を掘る（ｂｕｒ ｒｏｗ）ことができる場合には、その時は、それは、ｃｒｙｌＢデルタ−エンド トキシンに遭遇し、そして第二の殺虫性成分に晒されることができる。このよう なやり方で、ある者は、同一の植物内に２つの異なる殺虫性成分を差異に基づい て発現させ、単一殺虫性成分への抵抗性の発展に対する保護を同時に提供しなが ら単一の遺伝的単位として導入される必要がある遺伝子の全体数を減少させるこ とができる。 同様に、植物を、様々な昆虫を制御するために、１以上のタイプの殺虫性蛋白を コードしている構築物により形質転換することができる。このように、多数の変 種が当業者によって構築されることができる。 本発明の組換えＤＮＡ分子は、適当な方向でそれらを配置するための様々な要素 を操作することにより調製することができる。したがって、アダプター（ａｄａ ｐｔｅｒｓ）及びリンカ−（ｔｉｎｋｅｒｓ）をＤＮＡ断片を結合するために使 用することができる。その他の操作を、慣用の制限部位の提供、制限部位又は余 分のＤＮＡの除去、のために行うことができる。これらの操作を、当分野で認め られる方法により行うこ１９８９を参照のこと。例えば、方法、例えば、制限酵 素処理、平滑末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｓ）を提供するための突出（ｏｖｅｒｈ ａｎｇｓ）のチューイング・バック（ｃｈｅｗｉｎｇ　ｂａｃｋ）又はフィル・ イン（ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ）、リンカ−の結合（ｌｉｉｇａｔｉｏｎ）　、Ｄ ＮＡ断片の相補的末端を、連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）及び結合のために提供するこ とができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、帆Ｅを参照のこと。 他の機能的なりＮＡ配列は、その分子がその標的植物ゲノム中に取り込まれるで あろう方法に依存して、その組換えＤＮＡ分子内に含まれることができる。例え ば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌ仲介形質転換の場合に おいては、Ｔｉ−又はＲドブラスミドを植物細胞を形質転換するために使用場合 には、そのＴ１−又はＲｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの右及び左の縁（ｂｏｒｄ ｅｒ）をその発現カセットのフランキング領域として連結することができる。植 物のアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）−仲介形質転換は、　Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：１２２９　（１９８５）：　Ｍａｒｔｏｎ、Ｃｅ１１ 　Ｃｕｎｔｅｒｓ　Ｂ、Ｖ、、　Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ、　１９８５．　Ｃ ｈａｐｔｅｒ　Ｖ　Ｆｒａｌｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　 Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、、　４：１−４６＋及びＡｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯ Ｊ、、　４：２７７−２８４　（１９８５）中に記載されている。 本発明の組換えＤＮＡ分子は、組換え植物細胞における選択を容易にするために マーカー遺伝子を含む。マーカーの例は、殺生剤、例えば、抗生物質、例えば、 カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）　、／％イグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙ ｃ　ｉ　ｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、パ ラモマインン（ｐａｒａｍｏｍｙｃｉｎ）　、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔ ｒｅｘａｔｅ）及びプレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）　、又は除草剤、例 えば、イミダシロン（ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅｓ）、スルホニルウレア（ｓｕｌ ｆｏｎｕｌｕｒｅａｓ）　、グリフォセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、ホスフ ィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）、又はバイアラフオス（ｂ ｉａｌａｐｈｓ）に対する抵抗性を含む。マーカー遺伝子は、当業者によく知ら れている。 本発明の他の態様においては、本明細書中で先に記載したような組換えＤＮＡ分 子又はキメラ遺伝子により安定的に形質転換された植物を提供する。得られたト ランスジェニック植物は、そのゲノム中に安定的に取り込まれた形質転換された 遺伝子を含み、そしてそれぞれの流儀でそのプロモーターに作用可能な状態て結 合した構造遺伝子を発現するであろう。 本発明により包含されるトランスジェニック植物は、単子葉及び双子葉植物の両 方を含む。代表的な例は、ノイズ、タバコ、トマト、綿、ナタネ（ｒａｐｅ　５ ｅｅｄ）　、大豆、小麦、米、アルファルファ、ポテト及びヒマワリを含む。［ 他は？１°好ましい植物は、メイズ、特に同系のメイズ植物（ｉｎｂｒｅｄ　ｍ ａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ）を含む。 本発明により包含される形質転換植物のすべては、当業者に知られた幾つかの方 法により生産される。Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−仲介形質転換は、先に開 示されている。他の方法は、プロトプラスト中への直接遺伝子伝達（ｄｉｒｅｃ ｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）、　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、 　ＥＭＢＯＪ、、　１２：２７１７　（１９８４）；　Ｌｏｅｒｚ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　＆　Ｇｅｎｅｔ、、　１１９９：１７８　（１９８ ５）；　Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１９ニア１９　（１９ ８６）；マイクロプロジェクタイル・ホンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅ ｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）。 Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：５５９−５６ ３　（１９８８）＋プロトプラスト、培養細胞及び組織中へのインジェクション 、　Ｒｅ１ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂ４３−５０　（１９８６）：　Ｈｏｏｙｋａ ａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１１ ニア６３−７６４　（１９８４）：　Ｇｒｉｍｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：１８５　（１９８８）；及びＧｒｉｍｓｌｅ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２５：１７７　（１９８８）により記 載されているような分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ）又は 苗木（ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）及び植物中へのインジェクション：及びエレクトロ ポレーション。 Ｗ０９２１０９６９６を含む。 本組織好適又は組織特異的プロモーターと作用可能な状態で結合した構造遺伝子 のそれを含む形質転換植物内での発現ノくターンは、その構造遺伝子が殺虫性蛋 白をコードしている場合においては決定的である。例えば、今般開示する髄好適 発現、＜ターンは、そのトランスジェニック植物か、その植物の主として髄、そ してまたその支持根、外鞘及び葉を攻撃する病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）及び 草食動物（ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ）に耐えそして阻止することを可能にするであ ろう。何故なら、その蛋白が、より少ない程度であるが、これらの植物部分内て 昆虫を制御する量において発現されるであろうからであり、そしてさらに両方の タイプのプロモーターの場合においては、その蛋白が影響を受けていない植物の 種に残されるであろうからである。 例 以下の例は、本発明の実施において使用される材料及び方法についてさらに記載 している。それらは、説明により提供されているものであり、限定によるもので はない。 例１：　一般的方法 ＤＮＡ操作は、本分野において標準的な手順を使用して行った。これらの手順は 、その結果を実質的に変更することなくしばしば修正及び／又は置き換えられる ことができる。他の文献を示さない限り、これらの手順のほとんとは、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。 ５ｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　１９８９中に記載されている。 ＤＮＡオリゴマーの合成： 約２０から約９０までの、好ましくは約６０から約８０までの長さのヌクレイチ ドである開Ａオリゴマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅ ｌ　３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザー及び標準的な手順を使用して合成する。こ のオリゴマーは、０．２μモル、床孔、小規模ＡＢＩカラム上で最新５ＳＣＡＦ ３サイクルを使用して作る。最終手順を、トリチルを除き行い、そしてそのオリ ゴマーを３８０Ｂの自動解裂サイクルを使用してそのカラムから解裂させる。次 にこのオリゴマーを、５５℃で８−１２時間において過剰の水酸化アンモニウム （ＮＨ４０Ｈ）中で脱ブロックする。次にこのオリゴマーを、窒素ガスを使用し てエバポレーター内で乾燥させる。終了後、このオリゴマーを、０．２５−０． ５ｍｌの脱イオン水中に再懸濁させる。 合成オリゴマーの精製： それぞれのオリゴマーの部分を、０．０５％ブロモフェノール・ブルー、０．０ ５％キシレン・シアツールＦＦ、及び２５％ホルムアミドを含む最終溶液との等 容量のブルー染料／ホルムアミドと混合する。この混合物を、９５°Ｃで１０分 間加熱し、このオリゴマーを変性させる。次にサンプルを、７Ｍウレアを含む１ ２％のポリアクリルアミド−ウレア・ゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、） に供給する。ｏ　Ｖｅｒｔｉｃａｌ　５ｔａｂ　Ｇｅｌ　Ｕｎｉｔ（Ｈｏｅｆｅ ｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉ ｓｃｏ、　ＣＡ）を使用して３００−４００ボルトで３−４時間の電気泳動の後 、Ｕｖ影付けを、そのゲル中の正確なサイズの断片を位置決めするために使用し 、次にゲルを、レーザー・ブレードを使用して切断した。精製された断片を、細 かく刻みそして３７°Ｃで一夜、０．４Ｍ　ＬｉＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ Ｈ８）バッファー中てインキュベートした。 ２つの方法の中のいずれかを、そのポリアクリルアミド・ゲル残存物からそのオ リゴマーを分離するために使用する：Ｇｅｎｅ／Ｘ２５μＭ小孔性ポリエチレン ・フィルター装置又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ’ｓ　ｕｌｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ０ ，４５μ＾（フィルター装置。精製されたオリゴマーをエタノール沈殿させ、４ °Ｃで２０分間マイクロフユージ内で遠心分離により回収し、そして最後にＴＥ （１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）中で再懸濁させる 。濃度を、２６０ｎｍにおける吸収の読みに基づき５０Ｐｇ／μｌに調整する。 サイズ決定のためのオリゴマーのキナーゼ分解：配列決定ゲル上でオリゴマーの いくつかのサイズをチェックするために、キナーゼ標識付は反応を、それぞれの 代表的なサイズ：４゜マー（４０ｍｅｒｓ）、６０マー、７０マー、８０マー、 及び９０マーの精製合成オリゴマーを使用して行う。それぞれ２０μＩのキナー ゼ分解反応において、１ピコモルの精製オリゴマーを、７．０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　 ｐＨ７，５，１０ｍＭＫＣｌ、　１ｍＭ　ＭｇＣＬ　、０．５ｍＭ　ＤＴＴ　、 ５０Ｐｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、３０００μＣ１（３ピコモル）の３２Ｐ−ガンマＡＴ Ｐ　、及び８ユニツトの１４ポリヌクレオチド・キナーゼのバッファー中で使用 する。このキナーゼ反応を、３７°Ｃて１時間インキュベートし、その後、フェ ノール／クロロホルム抽出及び担体としてのグリコーゲンによる３回のエタノー ル沈殿（Ｔｒａｃｙ。 Ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＩＩ：２５１−２６８　（１９８１））を行う。 それぞれの反応の２つのゲル充填材（ｌｏａｄｉｎｇＸｌ　ツはＩＯｏｏｃｐｍ を含み、他方は２０００ｃｐｍを含む）を、２５％ホルムアミド、０．０５％ブ ロモフェノール・ブルー、及び０．０５％キシレン・シアツールＦＦにより調製 した。キナーゼ分解（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴマーを、６％ポリアクリルアミド 、７Ｍウレア配列決定ゲル（ＢＲＬ　Ｇｅｌ　Ｍｉｘ　ＴＭ６．　ＢＲＬ、　Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）上への供給の前、５分間沸騰させた。プラス ミドｐＵｃＩ８の配列決定反応を、同一ゲル上で行いサイズマーカーを提供した 。 電気泳動の後、ゲルを乾燥させ、そして診断Ｘ−線フィルム（Ｋｏｄａｋ。 Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲ）に露出させた。得られたオートラジオグラフは、正確なサ イズを有すへくテストされた精製オリゴマーのすへてを示す。 配列決定ゲル上で直接サイズ分画されたオリゴマーを、６％ポリアクリルアミド 、７八１ウレア・ゲル（ＢＲＬ　Ｇｅｌ　Ｍｉｘ　ＴＭ６）上で、サイズ・マー カーとしてサイズ分画されたオリゴマーを使用して、走らせた。 オリゴマーのすべてを、ゲル上への供給前に１００°Ｃて５分間、２５％ホルム アミドにより最初に変性させる。このポリアクリルアミド・ゲルの臭化エチジウ ム染色は、そのオリゴマーのすへてかサイズ決定のために可視化されることを可 能にする。 直接クローニングのためのオリゴマーのハイプリダイジング：ハイブリダイズさ れるへきオリゴマーを、−緒にプールしくｌμｇから２０Ｐｇ全ＤＮＡまで）、 そして３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８，１０ｍλｌ　ＭｇＣ１１，１ ０ｍＭ　ＤＴＴ、及びｌ　ｍＭ　ｄＡＴＰを含むＩＸ　Ｐｒｏｍｅｇａ結合バッ ファー中で３７℃で１時間、キナーゼ分解する。２０ユニツトの中のｌのＴ４ポ リヌクレオチド・キナーゼを、存在する全ＤＮＡの量に依存して、その反応中で 使用する。このキナーゼ反応を、５分間沸騰水浴内にその反応を置くことにより 終了させる。ハイブリダイズした分子の５′末端を形成するためのオリゴマーを 、キナーゼ分解せず、加熱後の追加のハイブリダイゼーション・バッファーと一 緒のキナーゼ分解オリゴマーに添加する。このプールされたオリゴマーは、最終 塩濃度を１００ｍＭ　ＮａＣ１，１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５、及び１０ ｍＭ　ＭｇＣｌ　２に調整するために使用される添加されたハイブリダイゼーシ ョン・バッファーを含み５０−１００μｌの容量にある。このキナーゼ分解及び 非−キナーゼ分解すリボマーを、−緒にプールし、そして５分間沸騰水浴内で加 熱し、そして約４時間にわたり室温までゆっくりと冷却する。 次にハイブリダイズされたオリゴマーを、フェノール／クロロホルム抽出し、エ タノール沈殿させ、そして１７μｌのＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、　ｐＨ８，０）中に再懸濁させる。この１７μｌを使用して、最終容量 ２０μｍをもつ結合反応物を結合させる（最終濃度＝３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｅ ｌ　ｐＨ７，８、１０ｍλ（ＭｇＣ１２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ　 、及び３ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ 　Ｗｌ））。この結合物を、室温において約２時間インキュベートする。ハイブ リダイズ／結合断片を、ベクター中へのクローニングに先立って制限酵素による 切断の前及び／又は後に２％Ｎｕｓ　１ｅｖｅゲル上で一般的に精製する。２０ μｍ容量の結合反応物（ｌｅｇａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、３０＋ｎＭ 　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ　ｐ）ｌ　７．８．１０ｍλ１ＭｇＣ１２，１０ｍＭ　Ｄ ＴＴ、　ＩｍＭ　ＡＴＰ　、及び３ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーセ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ、　１ｉｌａｄｉｓｏｎ　Ｗｌ）中のおおよそ等モル量のＤＮＡをもツ１ １００ｎ〜５００ｎｇのそれぞれの断片を使用して結合させる。この結合物を、 室温において約２時間インキュベートする。結合後、ＤＮＡを、標準的な手順（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用して、凍結コンピテント大腸菌ｍ１ア ンピシリンを含むしＢ−寒天上で選択する（以下参照）。 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内のクローンのスクリーニングのためのＰＣＲ反応正確 なりＮＡ挿入物を含む大腸菌コロニーを、ＰＣＲを使用して同定する（一般的に 、５ａｎｄｈｕ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：６８９− ６９０　（１９８９）を参照のこと。）。つまようじを使用して、コロニーを、 −夜プレートからこそげ取り、そして約５０ピコモルのそれぞれのハイブリダイ ズジング・プライマー（ｐＨＹＢ２＃６中のＳａｃ　Ｉ　ｌ断片の方向を選択す るためにプライマーＭＫ２３Ａ２８及びＭＫ２５Ａ２８を使用する例を参照のこ と）　、　２００μｍ〜４００μｍのそれぞれのｄＮＴＰ、及びＩＸ反応バッフ −ｒ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ） を含む２０μｍ〜４５μｌのＰＣＲ反応混合物に添加する。１０分間沸騰水浴内 で大腸菌／ＰＣＲ混合物全金物全金物後、ＩＸ反応バッファー中の５μｍのＴａ ｑポリメラーゼ（０，５ユニツト）（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、 　Ｎｏｒｗａｌｋ、　Ｃｏｎｎ、）を添加する。 このＰＣＲ反応のパラメーターは、一般的に、３０〜３６サイクルにわたる、９ ４°Ｃ３０秒間の変性段階、５５°Ｃ４５秒間のアニーリング、及び７２°Ｃ４ ５秒間の伸長、により設定される。ＰＣＲ反応生成物を、アガロース又はＮｕｓ ｉｅｖｅアガロース（ＦＭＣ）ゲル上て走らせ、増幅された正確な断片サイズを 検出する。 結合（Ｌｉｇａｔ　１ｏｎｓ）　： 制限酵素消化断片を、本分野において標準的な技術を使用して１％ＬＧＴ（低ゲ ル化温度アガロース、ＦＭＣ）、２％Ｎｕｓ　ｉｅｖｅ（ＦＭＣ）、又は０．７ ５％アガロース中でいずれかの精製を行う。ＤＮＡバンドを臭化エチジウムによ り可視化し、そしてバンドを、レーザー・ブレードによる切除によりゲルから回 収する。ＬＧＴから単離された断片を、ＬＧＴ中で直接結合させる。それぞれの 回収されたＤＮＡ断片の１０マイクロリツターを、その結合反応物と結合させる ために使用し、約２３μｌの最終結合反応物容量を作り出す。レーサー・ブレー ドによる切除の後、所望のＤＮＡ断片を含む回収されたゲル・バンドを溶融させ 、そしてｌｘリガーセ・バッファーにもっていき、そして３ユニットのＴ４　Ｄ ＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を先に記載したように添加する。普通のアガロ ース又はＮｕｓ　１ｅｖｅアガロースのいずれががら単離した断片を、ｕｌｔｒ ａｆｒｅｅ−ＭＣＯ，４５ｕＭフィルター装置Ｑｌｉ　１１ｉｐｏｒｅ）を使用 してそのアガロースから精製し、そしてその断片を、先に記載したように結合さ せる。結合反応物を、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用 し形質転換 株ＤＨ５アルファ又はＨＢＩＯ＋の凍結コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細 胞を、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用して調製し、そ して形質転換させる。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）“５ＵＲＥ（確かな）”コンピテ ント細胞を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）から得る。 ＬＧＴアガロース中て行われる結合のために、結合反応が終了した後、５０ｍＭ 　ＣａＣ１２を、約１５０μｌの最終容量に添加し、そしてその溶液を、そのア ガロースを完全に溶融するために約６５°Ｃて約１０分間加熱する。次に、この 溶液を、約２００μｌのコンピテント細胞であって氷上で解凍されているものの 添加の前に、約１０分間、氷上で混合し、そして冷凍する。 この混合物を、氷上で３０分間インキュベートする。次にこの混合物を、２分間 氷上で冷凍する前に４２°Ｃて６０秒間、熱ショックを与える。。次に、８００ μｍのＳＯＣ培地（２０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ　ＮａＣ １，２，５ｍＭ　ＫＣＩであってによりｐＨ８に調整されているもの、５　Ｎ　 Ｎａ０ｔ（、２０ｍＭ　ＭｇＣ１□＋Ｍｇ５Ｏ、混合物、及び２０ｍλ１　グル コース：　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）を、添加し、そしてその細胞を振 とうしなから３７°Ｃにおいて、選択培地プレート上へのブレーティング前約１ 時間、インキュベートする。プレートは、典型的には、１００μｇ／ｍｌアンピ シリンを含むＬ−寒天（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）である。 結合がアガロースを含まない溶液中で行われるとき、典型的には、２００μｌの 凍結コンピテント大腸菌（ｌＥ、ｃｏｌｉ）細胞（株ＤＨ５アルファ（ＢＲＬ、 　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ｈ山）又は確かな細胞、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。 ＣＡ）を、氷上で解凍し、そして５μｌの結合混合物を添加する。この反応物を 、約４０〜６０分間氷上てインキュベートし、次にこの細胞を、約９０秒間４２ °Ｃで熱ショックを与える。約１０分間室温において回収した後、８００μｌの ＳＯＣ培地を添加し、そしてその細胞を、次に、振とうしなから３７°Ｃて１時 間インキュベートし、そして上記のようにブレーティングする。 使用される標準的なベクターのいくつかのにおいてベーターガラクトノダーゼ遺 伝子中への挿入についてスクリーニングするとき、２００μｌの回収した形質転 換混合物を、０．００８％Ｘ−ｇａｌ、８０μ！ｔｌ　ＩＰＴＧ、及び１００　 μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を含むＬＢ−寒天 プレート上にブレーティングする。このプレートを、３７°Ｃて一夜インキュベ ートし、形質転換細胞の選択及び培養に供する。 ＤＮＡのミニスクリーニング： 選択培地プレートからの形質転換細胞を、培養し、そしてそれらのプラスミド構 造を、標準的なプラスミド・ミニ−スクリーニング手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅ ｔ　ａｌ、）を使用して検査及び確認する。典型的には、”沸騰（ｂｏｉｌｉｎ ｇ）”手順を、分析のための少量のプラスミドＤＮＡを作るために使用する（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）。あるいは、酢酸アンモニウム手順を、いくつ かの場合において使用する。この手順は、Ｓｈｉｎｇ−ｙｉ　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　９：６７６−６７９　（１９９０）によ り報告されたものを修正したものである。 ｌ）−夜選択プレートからの単一バクテリア・コロニーを、５ｍ１（踊ｌまでの スケール・ダウンが可能）のＴＢ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）培地中に 接種し、そして適当な抗生物質の存在中で増殖させる。 ２）ローラー上て３７°Ｃにおいて一夜インキユベートする。 ３）プラスチックのＯａｋｒｉｄｇｅチューブ内に５ｍｌのバクテリア細胞を回 収し、そして５ｏｒｖａｌｌ　ＳＳローター内て５０００ｒｐｍにおいて４°Ｃ において５分間回転させる。 ４）その上澄液を除去する。 ５）ＩｍＭの溶菌バッファ　（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ［ｐＨ８，０］　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍｇ／ｍｌのりゾチーム）中に 上記のペレットを再懸濁させ、５秒間混合し、そして室温において５分間インキ ュベートする。 ６）２ｍｌの新たに調製したアルカリ溶液（０，２Ｎ　ＮａＣ１，１％ドデシル 硫酸ナトリウム）を添加し、きつく蓋を締め、５回引っ繰り返すことにより混合 し、そして５分間水浴内のチューブ内に入れる。 ７）　１．５ｍｌの水冷７．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，６）を上記溶液に 添加し、穏やかに５回そのチューブを引っ繰り返すことにより混合し、そして５ 分間氷水浴上に置く。 ８）室温において９０００ｒｐｍて１０分間遠心分離する。 ９）透明の上澄液を１５ｍ１　Ｃｏｒｅｘチューブに移し、そして０．６容量の イソプロパツール（約２．５ｍ１）を添加する。室温において１０分間放置する 。 １０）室温において９０００ｒｐｍて１ｏ分間遠心分離し、その上澄液を捨てる 。 ＋１）そのペレットを３００μｍのＴＥバッファー中に再懸濁させる。 ６μｌのＲＮａｓｅ　Ａ　＆　ＴＩのストック（１８ｏμｌのＲＮａｓｅ　Ａ［ ３２５４−Ｌニット／ｍｇ蛋白、５．６ｍｇ蛋白／ｍｌ　］及び２０μｌのＲＮ ａｓｅ　Ｔｌ　［４８１ユ＝　ット／ｍｇ蛋白、１．２ｍｇ蛋白／ｍｌ　］を添 加することにより２００μｌとして作ったもの）を添加する。これらのストック を、ＵＳＢ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）がら購入することができる。マイ クロ遠心分離チューブに移し、そして３７°Ｃで１５分間インキュベートする。 ＋２）７５μｍの蒸留水及び１００μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、 そして１０分間氷水浴内てインキュベートする。 １３）その混合物をＢｅｃｋｍａｎメイクロフユージ内て１４．　ＯＯＯｒｐｍ において１０分間４°Ｃて遠心分離する。 ＋４）２．５容量の１００％ＥｔＯＨ（約１１）を添加することにより沈殿させ 、そして１０分間氷水浴内でインキュベートする。 １５）マイクロフユーシ内て１４．００Ｏｒｐｍにおいて１０分間回転させる。 １６）（０，５ｍ１−１ｍ１を使用して）　７０％　エタノールによりペレット を洗浄する。そのペレットを乾燥させ、そして１００μｌのＩＸ　Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ制限酵素バッフｙ　−４［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，９）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍ Ｍ　ＤＴＴ］中に再懸濁させる。 濃度を測定し、そして吸光度２６０及び２８０ｎｍにおける分光光度計により精 製度をチェックする。 組換えプラスミドを宿す特定のバクテリアのコロニーであるか否かについてのよ り迅速な決定のために、ＰＣＲミニスクリーン手順を、（Ｓａｎｄｈｕ、　Ｇ、 Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、　７：６８９ −６９０）により記載された方法を修正したものを使用して行う。簡単に言えば 、以下の混合物； １００μｍの先のプライマー混合物、２０μＭのそれぞれのプライマー、 １００μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）、ｌＯＯμｌのＩＯＸ　Ａ ｍｐｌｉＴａｑバッファ　−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、ＩＸバ ッファ　−＝１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ　 、　１．５ｏ１口１ｇｃ１．、及び０．０１％ゼラチン）、 ７００μｌの脱イオン水、 を調製する。 ２０μｌの上記の混合物を、０．５ｍｌのポリプロピレンＰＣＲチューブ内に入 れる。形質転換されたバクテリアのコロニーを、つまようじで拾い上げ、そして その混合物中に再懸濁させる。このチューブを、沸騰水浴内に１０分間置き、そ して次に、以下に記載する５μｌの混合物： ２６５μｍの脱イオン水、 ３０μｌのＩＯＸ　ＡｍｐｌｉＴａｑバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　 Ｃｅｔｕｓ、ＩＸバッフｙ　−＝１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，３，５ ０ｍＭ　ＫＣＩ　、　１．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、及び０．０１％ゼラチン）、 ７．５μｌのＴａｑポリメラーゼ、 を添加する前に室温まで冷却する。 このサンプルを５０μｍの鉱油により重層し、そしてＰＣＲを、以下のパラメー ター二 変性、９４°Ｃ，１分間 アニーリング＝５５°Ｃ，１分間 伸長、７２°Ｃ１４５秒間、 を使用して、３０サイクルにわたり行う。 ＰＣＲ増幅後、ｌμｌの充填染料（３０％グリセロール、０．２５％ブロムフェ ノール・ブルー、０．２５％キシレン・ンアノール）を、その反応物全体に添加 し、そして２０μｌの混合物を、所望のサイズのＰＣＲ生成物か在るかどうかを 見るために、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ　、１％アガロース・ゲル上に装填する。 この手順を、最初のスクリーンとして使用する。ミニ調製（１旧ｐｒｅｐｓ）を 、その後、スクリーニングに先立ってそのプラスミドの構造及びその挿入物を確 認するために行う。 例２：　それぞれのクォーターの増幅及び組み立て合成りｔ　ｃｒｙｌＡ（ｂ） 遺伝子の断片のクローニング：合成遺伝子を、４つの片であってそれぞれがその 遺伝子のたいたいＩクォーターであるものの内において、クローン化されるよう に設計した。それぞれのりオーターのだめのオリゴマーを、ＰＣＲ、ハイブリダ イゼーション、又はハイブリダイゼーションの組み合わせその後の他で記載され るようなＰＣＲ増幅のいずれかにより、組み立てられるようにプールした。合成 りオーターを、第−及び第二、第二及び第三、そして第三及び第四の間において 、それぞれ、制限部位Ａａｔｌｌ　、Ｎｃｏ［、及びＡｐａｌを重複させること により一緒に片とした。 遺伝子のそれぞれのクォーター（約５００塩基対を表す）を、その好適なオリゴ マーとハイブリダイズさせ、そして所望の断片を、そのクォーターの末端に特異 的なＰＣＲプライマーを使用して増幅することにより、結合させた。わずかに異 なるプライマーの２セツトを使用するＰＣＲ反応の２つの異なるセットを使用し た。この２つの反応のＰＣＩＩ生成物は、第一反応においてそのコード領域の５ ゛末端における追加のＡＡＴＴが存在し、そして第二反応において与えられたり オーターめ３゛末端においてＡＧＣＴ配列が存在することを除き、同一のものと して設計された。特定のクォーターのためのこの２つの反応の生成物が（そのポ リメラーゼ、プライマー及び不完全生成物を除去した後に）混合、変性、そして その後の再アニーリングを行われたとき、特定の比（理論的には５０％）のアニ ール生成物は非同種の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）末端をもつはずである。 これらの末端は、その分子の５゛末端におけるＥｃｏＲＩによる、その３′末端 における旧ｎｄ［Ｉ［による制限消化の間に形成される“付着末端（ｓｔｉｃｋ ｙ　ｅｎｄｓ）“に対応するように設計された。得られた分子を、リン酸化し、 ＥｃｏＲ［／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ消化及びホスファターゼ処理Ｂｌｕｓｃｒ ｉｐｔベクター中へ結合し、そして凍結コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株 ＤＨ５アルファ中へ形質転換した。選択後、所望の断片を含む大腸菌（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）コロニーをそのＤＮＡの制限消化パターンにより同定した。その合成遺 伝子の挿入を表す部分を、次に精製し、そして標準的な手順を使用して配列決定 する。 すへての場合において、多数のＰＣＲ反応からのクローンを、作りそして配列決 定する。次に、このクォーターを、その完全な遺伝子を得るためにその連結点（ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）におけるユニーク制限部位を使用して一緒に連結する。 クローン化りオーターを、ミニ−スクリーン手順により同定し、そしてその遺伝 子断片を配列決定する。最も多（はそのＰＣＲ増幅段階の間にその配列中に誤り がしばしば導入されることが見つかっている。このような誤りのほんの少しを含 むクローン内でこのような誤りを正すために、ハイブリダイズされたオリゴマー を使用する。 ハイブリダイズされた断片は、その断片内の制限酵素認識部位において消化され 、そしてその合成遺伝子内でその突然変異した領域を置き換られる。ハイブリダ イズされた断片は、長さ９０塩基対（例えば、第二クォーター内の５ａｃ１１部 位間の断片を置き換える領域）から約３５０塩基対の、第四クォーター断片であ ってその遺伝子の第四クォーター内で２つのＰＣＲ誘導突然変異を置き換えるも の、まての範囲にある。 高い誤り率のＰＣＲのために、オーブン・リーディング・フレームを含むクロー ン化遺伝子断片の選択を可能にするプラスミドを、設計し、そして構築する。こ のプラスミドを、オーブン・リーディング・フレームがそのクローニング部位中 に導入される場合に、その形質転換されたバクテリアがカナマイシンの存在中で 増殖することができるようなやり方で、設計する。このベクターの構築を、以下 、詳細に記載する。この選択系は、多数の独立したクローンの配列決定を行う必 要なくオーブン・リーディング・フレームをもつクローンを迅速に同定すること を可能にすることにより、非常にその進行を速めるものである。合成りオーター を、様々なプラスミドてあって、　ＢＳＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；　Ｌａ　 Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）、　ｐＵｃ１８（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）、及び Ｋｍ−発現ベクターを含むものの中で、組み立てた。ｐＬｌｃペースのプラスミ ドを含む他の好適なプラスミドは、当業者によく知られており、そしてこれも使 用することかできる。 クローン化断片の完全な配列決定、クローン化遺伝子生成物のウェスタン・プロ ット分析、及び完全に作用する合成りｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子をＭ認するテ スト昆虫として欧州トウモロコシ穿孔性動物を使用した昆虫検定を、得た。 オーブン・リーディング・フレームを選択するためのＫｍ−発現ベクターの構築 ： Ｋｍ−発現ベクターを、オーブン・リーディング・フレームを含む合成遺伝子の 断片について選択するために設計した。ヌクレオチド１３におけるＴｎ５開始か らのＮＰＴＩＩ遺伝子（Ｒｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、３゜３３１ ７−３３２２　（＋９８４）をｐＵｃＩ８と融合し、そしてそのＤＮＡセグメン ト間に有用な制限部位を導入することができるＰＣＲオリゴマーを設計した。こ のポリリンカー領域は、フレーム内にＫｍ−遺伝子をもつ様々な合成上ＩＰ断片 をクローニングすることかできる制限部位を含む。 このポリリンカー領域を含む８８塩基対の５°オリゴマーを、オリゴマー　ＰＡ ＧＥ精製のために先に記載したように６％ポリアクリルアミド・ゲル上で精製す る。ＰＣＲ反応物を、Ｔｎ５から得られたＮＰＴ［ｌ遺伝子を含むｌＫｂのＢｇ ｌｌｌ／Ｓｍａ［テンプレート断片と結合させる。このＰＣＲ反応混合物は、１ ００ピコモルのオリゴマーＫＥ７２Ａ２Ｂ及びＫＥ７４Ａ２８（以下の配列を参 照のこと）をもつ１１００ｎのテンプレート、２００ｎＭ　ｄＮＴＰ、及び２， ５ユニツトのＴａｑポリメラーゼを、すへて５０μｌ容量中に含み、等容量の鉱 油で重層される。このプライマーの配列は：ＫＥ７４Ａ２８ ５−ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧ　ＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧ　ＧＣ ＣＣＴＴＣＴＡＧ　ＡＡＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧ ＧＧＡ　ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣ−３’ＫＥ７２Ａ２８ ５’　−ＧＣＧＴＴＡＡＣＡＴ　ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧ　ＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴ 　ＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ−３゜使用するＰＣＲパラメーターは：９４°Ｃ１４５ 秒間、５５°Ｃ１４５秒間、及び７２°Ｃ１５５秒間、てあって、段階３におい て３秒間の伸長、２０サイクルにわたるものである。すべてのＰＣＲ反応を、Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ内で行う。増 幅されたＰＣＲ生成物は８００塩基対てあり、そして翻訳開始部位その後の、そ の翻訳終止因子を通して走る塩基＃１３からのＫｍ遺伝子とフレーム内融合した ユニーク制限部位をもつポリリンカー領域を含む。ｐＵｃ：ＫＭ７４は、にｍ− 発現カセットであってＰ［ＪＣ１８ベクター内でクローン化された８００塩基対 のＢｇ（［１５ａ１１ポリリン力−／Ｋｍ断片から組み立てられたものである。 この１ａｃＺプロモーターは、二〇Ｋｍ遺伝子が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内で発 現されることを可能にする。ｐＵｃ：ＫＭ７４誘導体は、２５μｇ／ｍｌカナマ イシン／［ＰＴＧを含むしＢ−寒天プレート上でその後スクリーニングされるこ とがてきる突然変異細胞を選択されるために、最初に１００　ｕｇ／ｍｌアンピ シリンを含むＬＢ−寒天プレート上にブレーティングされなければならい。合成 りｔ　ＩＰ遺伝子断片を、Ｋｍ−カセット内のそれぞれのクォーターから組み立 て、オーブン・リーディング・フレーム含有断片の片のクローニングについて確 認する。この第一のＰＣＢ活性合成りｔ　［Ｐ遺伝子断片、ｐＢｔ：Ｋｍ＃１６ は、Ｋｍ抵抗性を示すＢｔ　［Ｐ遺伝子である。 この断片は、その後、第三及び第四クォーター内に突然変異を含むことか発見さ れ、それはその後修復されるものである。 以下の手順を、合成旧ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子をコードしている合成りＮＡ配列 の第一クォーターをクローン化するための、手本とする。同一の手順を、他のク ォーターの合成及びクローニングのための手本とする。但し、プライマー及び制 限部位について述へるときを除く。 クォーター１のためのテンプレート　等量の精製オリゴマーＵ＋−Ｕ７とＬ１〜 Ｌ７との混合物 ＰＣＲプライマー・ 前進（Ｆｏｒｗａｒｄ）　： ＰＩ（ａ）　：５’　−ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧ　ＡＴＣＣＡＡＣＡＡＴ　ＧＧ− ３゜ＰＩ（ｂ）　：５’　−ＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡ　ＣＡ ＡＴＧＧ−３’復帰（ｒｅｖｅｒｓｅ）　： Ｐ２（ａ）　：５−ＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＧ−３゜Ｐ ２（ｂ）：５−ＡＧＣＴＡＣＡＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＣＧ　ＣＡＧ−３゜プラ イマー対Ａ１：Ｐｌ（ｂ）　＋　Ｐ２（ａ）プライマー対Ａ２：Ｐ１（ａ）　＋ 　Ｐ２（ｂ）合成メイズ最適化Ｂｔ　ＩＰ遺伝子の第一クォーターを含んで成る オリゴマーを含むＰＣＲ反応物を、以下のように述べる：２００ｎｇのオリゴ混 合物（ｏｌｉｇｏ　ｍ１ｘ）（重量に基づく等量において混合されたりオーター のためのすへてのオリゴ）ｌＯμｌのプライマー混合物（ｐｒｉｍｅｒ　ｍ１ｘ ）（２０μＭにおけるそれぞれの１：ｌの混合物；プライマーは先に記載のもの と同じである）５μｌのＩＯＸ　ＰＣＲバッファー。 使用するＰＣＲバッファーは、 （ａ）ＩＸ　ａ度＝　１０ｍＭ　ＫＣＩＳｌｏｍＭ　（ＮＨｍ　）　２　ＳＯ４ ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　。 ｐＨ８，０，２ｍＭ　１１１ｇ５Ｏ４、及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 、又は、（ｂ）ＩＸ濃度＝　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐｆ（８，３， ５０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭλＩｇｃｌｚ、０、Ｏ１％ｗｔ／ｖｏｌセラチン 、 のいずれかであることがてきる。 成分を混合し、５分間沸騰水浴内で加熱し、そして６５°Ｃて１０分間インキュ ベートする。 次に、以下の試薬・ ８μｌのｄＮＴＰｓ混合物（反応における最終濃度＝それぞれ０．２ｍＭ）、 ５ユニツトのポリメラーゼ、 を添加する。 最終反応容量は、５０マイクロリツターである。 次に、オリゴマーを、７２°Ｃにおいて３分間インキュベートし、そして次に、 ＰＣＲサイクルを走らせる。このＰＣＲ反応を、以下のような段階サイクル手順 に基づきＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ内て走らせる： 変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔ　１ｏｎ）サイクル・９４°Ｃ１１分間、アニーリン グ・サイクル：６０”Ｃ１１分間、伸長サイクル（ｅｘｔｅｎｓｓｉｏｎ　ｃｙ ｃｌｅ）ニア２°Ｃ１４５秒間（ｌサイクル当たり＋３秒間）、 サイクル数：１５゜ 反応終了後、ｌＯμｌのＰＣＲ反応物を、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ−ＧＴＧ（ＦＭＣ ）　、Ｉ％アガロース分析ゲル上に供給し、その反応物を監視した。残りの４０ μｌを、以下に記載するように、遺伝子断片をクローン化するために使用する。 ＰＣＲ生成物 様々なプライマー対に対応する２本領ＰＣＲ生成物の末端を示す（上側の鎖のみ ）・ Ａ２　ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＧＴＡＧＣＴ（５５４塩基対）第一クォーター。 ハイブリダイゼーション 先に記載したようなＰＣＲ反応物のそれぞれの４０μｌを、製造者の指示に従っ てクロマスピン（ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）４００カラム（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ、 　Ｐａｔｏ　ＡＩｔｏ、　ＣＡ）を使用して精製する。担体ＤＮＡの５μｇをそ のカラムに供給する前に反応物に添加した。（このことは、はとんどのクローニ ングについて行われる。しかしながら、い（っかの反応物においては、ＰＣＲ反 応物は、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用して、フェノ ール：クロロホルム抽出され、Ｔａｑポリメラーゼを除去され、そしてＰＣＲ生 成りＮＡを、標準的なエタノール沈降を使用してその水相から回収する。この担 体ＤＮＡは、ＰＣＲ生成断片と共には溶出しない。それぞれのクォーターのため のＡＩ及びＡ２反応の片割れ（Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）を混合し、１０分間 、沸騰水浴内で加熱し、そして次に、６５°Ｃて一夜インキユベートする。次に 、その反応物を、６５°Ｃの浴から取り出し、そして担体としてのｌμｌ（２ｏ ｎｇ）のヌクレアーゼ不含存グリコーゲン（Ｔｒａｃｙ、　ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　１１：２５１−２６８　（１９８１）によりエタノール沈降させた 。このペレットを、４０μｍの脱イオン水中に再懸濁させる。 リン酸化反応 リン酸化反応を、以下のように行う： ４０μｌ　ＤＮＡ ２．５　μｌ　２０ｍλｉ　ＡＴＰ Ｏ，５ｕ　ｌ　ＩＯＸ　ＢＳＡ／ＤＴＴ　（ＩＸ＝５ｍＭ　ＤＴＴ　、０．５ｍ ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）１．０μｌ　ＩＯＸポリヌクレオチド・キナーゼ・バッファ ー（ｌＸ＝７０Ｍｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＳｐＨ７，６，０，１Ｍ　ＫＣＩ　、 　１０ｍＭ　ＭｇＣ１２）２．０μ＋ポリヌクレオチド・キナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、２０ユニツト）。 インキュベーションは、３７°Ｃて２時間である。 次にこの反応を、ｌ：１フェノール：クロロホルムで１回、次にクロロホルムで １回抽出し、そして標準的な手順を使用してその水相をエタノール沈降させる。 このペレットを１０μｌのＴＨ中に再懸濁させる。 制限消化 ２ｏｎｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ＢＳＳＫ＋、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。 ＣＡ） １０μｌ　ＩＯＸ制限バッフ−ｒ　−（ＩＸ＝２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ ８，０、ｌＯｍλ口１ｇｃｌ　２．１００ｍＭ　ＮａＣＩ） ５　μｌ　ＥｃｏＲｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　１００ユ −ット５　ｕＩ　Ｈｉｎｄｌｌｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ） 　Ｉ００ユニット最終反応物容量は、１００μｌである。 インキュベーションは、３７°Ｃで３時間である。 終了時、こん反応物を、等容量のＴＥ飽和フェノール（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ　ｐＨ８，０及びＥＤＴＡ）により抽出する。遠心分離後、この水相を、等 容量の（ＴＥ飽和）フェノール：クロロホルムのｌ：ｌ混合物（この“クロロホ ルム”は、２４・ｌの比のクロロホルム：イソアミル・アルコール中で混合され ている。）により抽出し、最後に、この抽出物からの水相を、等容量のクロロホ ルムにより抽出する。最後の水相を、（１０μｍの３Ｍ酢酸ナトリウム及び２５ ０μｌの無水エタノールを添加することにより）エタノール沈降し、４°Ｃで１ ０分間放置し、そして最大速度でｌＯ分間マイクロフユージ内で遠心分離する。 このペレットを、７０％エタノール中で濯ぎ、そして室温で５−１Ｏ分間乾燥さ せ、そして１００μｍのｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）中に再懸濁 させる。 ホスファターゼ反応 ベクターＤＮＡを、ホスファターゼにより定例的に処理し、挿入物をもたずに得 られたコロニーの数を減少させる。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを、典型的 に使用するが（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）　、他のホスファターゼ酵素 も本段階のために使用することができる。 典型的なホスファターゼ反応を、以下のように設定する：９０μｌの先に記載し た消化ＤＮＡ １０μｌのＩＯＸウシ腸アルカリ性ホスファターゼ・バッファー（ｌＸ＝５０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２，１ｍＭ　Ｚｎ ＣＩｚ　、　１０ｍＭスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）） ｌμｌ　（ｌユニット）のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡＰ。 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ） インキュベーションは、３７°Ｃで１時間である。 次にこのＤＮＡを、（１％低ゲル化温度（ＬＧＴ）のアガロース・ゲル上で）ゲ ル精製し、そしてそのペレットを、５０μＩ　ＴＨ中で再懸濁させた。電気泳動 後、適当なバンドを、レーザー・ブレードを使用してそのゲルから切除し、６５ °Ｃで５分間融解し、そしてＴＨによりｌ：１に希釈した。この溶液を、フェノ ールにより２回、上記のフェノール：クロロホルム混合物により１回、そしてク ロロホルムにより１回抽出する。最終水相をエタノール沈降させ、そしてＴＥバ ッファー中で再懸濁させる。 結合： 合成遺伝子の断片をベクター中に結合させるために、以下の条件を典型的に使用 する。 ５μｌのリン酸化挿入ＤＮＡ　。 ２μｌのホスファターゼ処理ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ消化Ｂｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔベクターであって６５°Ｃて５分間加熱し、そして次に冷却したもの、１　 μｌ　ＩＯＸリガーゼ・バッフｙ　（ＩＸバッファ　−＝３０ｍλｌ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ　（ｐＨ７，８）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ　ＤＴＴ、　 １ｍＭ　ＡＴＰ）、１　μｌ　ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、 ｌμｌ　リガーゼ（３ユニツト、Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓ ｃ、）、リガーゼ反応を、典型的に、１６°Ｃで一夜、又は２時間室温において インキュベートする。 形質転換。 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中への結合ＤＮＡ断片の形質転換を、先に記載したよう な標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）を使用して行う。 組換細胞の同定 形質転換プレートの一夜のインキュベーションから生じた白色又は明るい青色の コロニーを選択した。この形質転換細胞内のプラスミドを標準的なミニ−スクリ ーン手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）又は先に記載したようなものを使 用して特徴ずけする。以下に列記する３つの手順の中の１つは、典型的に、 （１）沸騰ＤＮＡ　ミニ調製方法（ｂｏｉｌｉｎｇ　ＤＮＡ　ｍ１ｎｉｐｒｅｐ 　ｍｅｔｈｏｄ）（２）ＰＣＲミニスクリーン （３）酢酸アンモニウムミニ調製 を使用している。 第一りオーターを含むと信じられている組換えプラスミドの制限消化は、以下の ように設定される： （ａ）Ｂａｍ　Ｈ１／Ａａｔ　ＩＩｌ消化ｌＯμｌ　ＤＮＡ　＋　１０μｌ　Ｉ Ｘ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ１ａｂｓ制限酵素バッファー４゜ ０．５　μｌ　Ｂａｍ　Ｈｌ　（１０ユ＝ツト）、０．５　μｌ　Ａａｔ　Ｈｌ 　（１０−Ｌ−ット）、インキュベーションは、３７°Ｃて２時間である。 所望の制限パターンをもつものとして同定されたクローンを、別々の反応におい てＰｖｕ　Ｉ　Ｉ及びＢｇｌｌｌにより消化する。３つの酵素消化のすべてによ る所望の制限パターンをもつクローンのみを、さらに配列決定について行う。 クローン化遺伝子断片の配列決定・ 配列決定を、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２キツト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）による２ 本鎖ＤＮＡを使用するＳａｎｇｅｒ’　ｓのジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｎｇｅ ｒ’　ｓ　ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ ｄ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用して行う。すへての中で、６つ の第一りオーター・クローンを配列決定する。この配列決定されたクローンの中 で、２つのクローンてあってｐＱＡＩ及びｐＱＡ５と命名されたもののみが、そ れぞれたった１つの欠失を含むことが見つかっている。これらの欠失は、それぞ れ、ｐＱＡＩ内の４５２位及びｐＱＡＳ内の２９７位において配置された１つの 塩基対のものである。 プラスミドｐＱＡｌを、（以下に記載するような）ｐＰｌ−８と共に使用して。 期待される配列をもつ第一クォーターを得る。 テンプレートオリゴマー［８−ｔＪ１４及びＬａ−Ｌ１４ＰＣＲプライマー二 前進： Ｐ３（ａ）　：５−ＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧＴ　ＴＣＧＧ−３ ’Ｐ３（ｂ）　：５−ＡＡＴＴＧＣＴＧＣＧ　ＣＧＡＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧ−３ ゜復帰： Ｐ４（ａ）：５’−ＧＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＧＴ　ＡＣＡＧＧ− ３’Ｐ４（ｂ）　：５’　−ＡＧＣＴＧＧＣＧＴ　ＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴ　ＧＣ ＣＧ−３’プライマー対Ｂｌ　：Ｐ３（ｂ）＋Ｐ４（ａ）プライマー対Ｂ２：Ｐ ３（ａ）＋Ｐ４（ｂ）ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌにより消化されたＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ内の上記ＤＮＡ断片の、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、スピ ン・カラム・サイズ分画（ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　５ｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏ ｎａｔｉｏｎ）、及びクローニングを、第一クォーターについて先に記載（例２ Ａ）シたように行う。本クォーターのＰＣＲ生成物は、サイズ約５２９塩基対で あって本遺伝子の第二クォーター（ヌクレオチド５３１〜１０５０）を代表する 。形質転換は、先（こ記載した標準的な手順（ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、 ）を使用して凍結コンピテント大腸菌（Ｅ、　ｃａｌ　ｉ）細胞（ＤＨ５アルフ ァ）中へのものである。 ｐＱＢ　クローンのミニスクリーン・ ミニ調製ＤＮＡを、先に記載したように調製し、そして（ａ）Ａａｔｌｌ／Ｎｃ ｏ［、（ｂ）Ｐｖｕｌ［及び（ｃ）Ｂｇｌｌにより消化し、配列決定の前にベク ター内の構造挿入物について確認する。 配列決定を、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）のジデオキシ法 を使用して先に記載したように行う。 本クォーターの１３クローンの全てを、配列決定する。第二クォーターは、８８ ４と８８７位の間に１以上の欠失を一貫して含む。はとんとの場合において、８ ８４位のＧが欠失している。 プラスミドｐＱＢ５は、８８４位においてたった１つの欠失をもってしまた。こ の領域は、２つのＳａｃ　［１部位（８５９と９４９位）の間に横ｔこわつてい る。この欠失を正したものを例３中に記載する。 第一半分（１−１０５０塩基対）のクローン１本領ＤＮＡ断片としての合成りｔ メイズ遺伝子の第一半分（クォーター１及び２）をクローニングするための断片 を、ＰＣＲ反応生成物であって第一クォーター及び第二クォーターを含んで成る ものの制限消化により得る。制限エンドヌクレアーゼＡａｔｌｒを、２０μｌ反 応において（フェノール抽出及びエタノール沈降後に）ＤＮＡを切断するために 使用する。それぞれのＡａｔ［［消化クォーターの１５μｍを混合し、そして室 温において２時間、（５μｍのＩＯＸリガーゼ・バッファー（ＩＸ＝３０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８、ｌｏｍＭλＩｇｃＩ　２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、 １ｍＭ　ＡＴＰ）、１４μｍの脱イオン水及びｌμｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ、 ３ユニツト、Ｐｒｏｇｅｍａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌを添加することにより 、５０μｌ容量中で）結合する。結果物は、標準的な条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　 ｅｔ　ａｌ、）を使用して走らせた１％アガロース・ゲル上の電気泳動により判 断されるような約１ｋｂの断片である。１０μｌの結合生成物を、先に記載した 条件を使用してＰＣＲにより増幅する。但し、５サイクルのみを走らせた。 プライマー対：ＨＡ＝Ｐ１（ａ）＋Ｐ４（ｂ）プライマー対：ＨＢ＝Ｐ１（ｂ） ＋Ｐ４（ａ）。 これらの反応の生成物を、個々のクォーターについて記載するようにＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中にクロー ン化する。 この手順を、１回だけ行い、すなわち、ＤＮＡ挿入物のすへてを、単一のＰＣＲ 反応からの特定の領域内で得る。 ３６のコロニーを、Ｓａｌ［消化及びＰｖｕ　［ｌ消化によりミニスクリーンす る。４つを除くすべてのクローンは、サイズ約１ｋｂの挿入物を含み、その中の 少なくとも２０２０は、正しいＰｖｕｌｌ消化パターンを含む。 このクローン、ＰＩ−８の中の１つは、ＥｃｏＮ１部位（３９６塩基対）とＤｒ ａ　１１１部位（６４０塩基対）との間の所望の配列をもっている。このクロー ンを、ｐＱＡｌ（先に記載した４５２塩基対位における欠失をもつ第一クォータ ー）と共に第二クォーター内の叶ａ（１１部位（６４０塩基対）までの所望の配 列をもつプラスミドを得るために使用する。 テンプレート、オリゴ０１５−［２０及びＬｉ２−Ｌ２１ＰＣＲプライマー二 前進 Ｐ５（ａ）：５’　−ＴＴＣＣＣＣＣＴＧＴ　ＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴ　ＧＧＧＣ ＡＡＣＧＣＣＧＣ−３’Ｐ５（ｂ）　：５−ＡＡＴＴＧＴＡＣＧＧ　ＣＡＣＣＡ ＴＧＧＧＣＡＡＣ−３゜復帰・ Ｐ６（ａ）：５’　−ＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧ　ＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡ　ＣＧＣＴ ＧＧ−３’Ｐ６（ｂ）・５’　−ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡ ＣＣ−３’プライマー対Ｃｌ　：Ｐ５（ｂ）＋Ｐ６（ａ）プライマー対Ｃ２：Ｐ ５（ａ）＋Ｐ６（ｂ）ＰＣＲ反応、正確なサイズのＤＮＡ断片のスピン・カラム 回収、及びベクター中への結合を、ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ［［Ｉにより切断され たＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを使用して先に記載したように（例２Ａ）行う 。約４７９塩基対のＰＣＲ生成物は、合成遺伝子の第三クォーターを現している （ヌクレオチド１０２１〜１５００）。 凍結コンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＨ５アルファ細胞中への形質転換 、形質転換細胞の選択及び同定、ミニ−スクリーン生成物による形質転換細胞の 特徴すけ、及びそのベクター内の合成遺伝子断片の配列決定は、先に記載したも のとすべて同じである。 ｐＱＣクローンのミニスクリーン： 第三クォーターを、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用し てミニスクリーンする。ミニ調製ＤＮＡを、（ａ）Ｎｃｏｌ／Ａｐａ［及び（ｂ ）Ｐｖｕｌ［により切断する。正しい制限消化パターンを含むクローンを、標準 的な手順を使用して配列決定する。第三クォーターの２２クローンの全てを、配 列決定する。第三クォーター内の３つの主要な欠失“ホットスポット”を、（ａ ）　１０８３位、（ｂ）　１２９０−１３９７位の間、及び（ｃ）１３５６−１ ３６２位の間において同定する。１つ、すなわちｐＱＣ８を除いてすべてのクロ ーンにおいて、１３６５位においてＣの挿入がこれもまた一貫しである。これら の突然変異の付加において、この第三クォーターは、多数の他の明らかにランダ ムな欠失を含む。第三クォーター内の３つの突然変異性”ホットスポット”及び 第二りオーター内の１つのものに対する共通要素は、約８０％Ｃ＋Ｇである配列 によるいずれがの剥土にこれらの領域が全て隣接しているとついことである。列 内に５〜９のＣ−Ｇを含む他の領域は、影響されていない。０１５　、［１６， ０１８、［１９、Ｌｉ２　、Ｌｉ２　、Ｌｉ２及びＬｉ２内のオリゴマーは、こ れらの領域内のＣ十Ｇ含量を減少させるように再設計されている。修飾されたオ リゴマーを使用したＰＣＲ反応からのそれぞれの５つのクローンを、配列決定す る。 プラスミドｐＱＣＮ１０３は、１３２６位における変更を除き第三りオーターに ついての正しい配列をもっている。ＧをＣと置換するこの変更は、１つのアミノ 酸（ロイシン）を元のもの（フェニルアラニン）と置き換えることをもたらす。 この遺伝子の第四クォーターを、その遺伝子の第三及び第四りオーターを含んて 成るように元々設計されているクローンから得る。 合成遺伝子の”第二半分”を、ＰＣＲ反応がら得て、第三及び第四クォーターを 融合する。これらの反応を、第三クォーターのために先に記載したＰＣＲプライ マーＰ５（ａ）及びＰ６（ａ）並びにプライマーＰ７（ａ）及びＰ８（ａ）（以 下に記載する）と共に走らせる。復帰プライマーを、５ａｃｌ部位及び終止コド ンを含むように修飾する。それぞれのりオーターのための別個の反応を、先に記 載した条件を使用して３ｏサイクルにわたり走らせる。この２つのクォーターを 、ＰＣＲを重複させることにより一緒に結合し、そしてその後、制限酵素Ｎｃｏ ｌ及び５ａｃｌにより消化する。得られた９５３塩基対断片を、ｐｃＩＢ３０５ ４てあってＮｃｏ１１５ａｃＩにより切断されそしてアルカリ性ホスファターゼ により処理されているものの中に直接的にクローン化する。 ｐｃｉ８３０５４を、ｐｃＩＢ２４６（例４中に詳細に記載する）のユニークＨ ｐａ　１部位内にＰＥＰカルボキシラーターイントロン＃９（ＰＥＰＣｉｖｓ　 ＃９）を挿入することにより構築する。ｐｃＩＢ２４６をＨｐａ　［により切断 し、そして例２Ａ中に記載する標準的な手順を使用してＣＩＰによりホスファタ ーゼ処理する。ＰＥＰＣｉｖｓ　＃９を、テンプレートとしてｐＰＥＰ−１０を 使用したＰＣＲにより得る。ｐＰＥＰ−１０は、Ｃ４光合成酵素をコードしてい るメイズＰＥＰカルボキシラーゼ遺伝子の全体に加え、約２．２Ｋｂの５゜−フ ランキング及び１．８Ｋｂの３′−フランキングＤＮＡを含むゲノムのサブクロ ーンである。この１０Ｋｂ　ＤＮＡを、ｐＵｃ１８のＨｉｎｄ１１１部位内で結 合させる（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１２：５７６−５８９　（１９８９））　、　ＰＥＰＣ ｉｖｓ　＃９を得るために使用される前進ＰＣＲプライマーは、ＧＴＡＣＡＡＡ ＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣてあり、そして復帰プライマーは、ＣＴＧＣＡＣＡＡ ＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴである。ＰＣＲ生成物は、ＰＥＰカルボキシラーゼのイ ントロン＃９配列のみを含む１０８塩基対の断片である。ＰＣＲ反応物を、フェ ノール及びクロロホルムにより抽出し、エタノール沈降させ、ポリヌクレオチド ・キナーゼによりリン酸化し、そしてＴ４ボリメラーセにより処理し、標準的な 手順を使用してＰＣＲ生成物内このキナーゼ断片は、ｐＣ［Ｂ２４６のＨｐａ１ 部位中に、先に記載した標準的な手順を使用して、平滑末端クローン化する。 第四クォーターの増幅及び組み立て テンプレート：　０２１−０２６及びＬ２２−Ｌ２８ＰＣＲプライマー： 前進 Ｐ７（ａ）　＋５−ＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧ　ＣＣＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧ− ３’復帰： Ｐ８（ａ）：５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ　ＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡ　ＣＣＴＧ ＡＴＣＧＡＴ　ＧＴＧＧＴＡ−３’プライマー対４：Ｐ７（ａ）＋Ｐ８（ａ）プ ライマー対３　：Ｐ５（ａ）　十Ｐ６（ａ）重複ＰＣＲのためのプライマー対： Ｐ７（ａ）＋Ｐ８（ａ）ＰＣＲ生成物 第三りオーターＴＴＣＣＣＣＣＴＧＴＡ−−−−−−−−−ＴＴＣＡＣＣＧＧ（ ４８４塩基対）第二半分ＧＧＴＧＡＡ−−−−−−−−−ＣＡＴＧＡＴＧＡＴ（ ９５３塩基対）４つの陽性クローンを、プラスミド・ミニスクリーンにより同定 し、そして次に１！！！的な手順を使用して配列決定する。 プラスミド旧、Ｐ２＃ｌは、２つの突然変異を除きおおよそ正しい第四クォータ ー配列を含んでいる。これらの突然変異は、１５２３位におけるもの（ＡをＧに 置換しており、ＨｉｓをＡｒｇに置換するアミノ酸の変更をもたらすもの）、そ して１６３４位におけるもの（ＴをＣに置換しており、ＳｅｔのＴｈｒへのアミ ノ酸の置換をもたらすもの）である。 プラスミドＢｔ、Ｐ２Ｓ５は、以下に記載するｐｃ１８４４１４の構築において 使用される。（この間違えは、第四クォーターのいすへてのオリゴのハイブリダ イゼーション、Ａｐａｌ／Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩによる消化及びｐｃｌＢ４４１４内 のその領域の置き換えにより最終的に訂正される。それ故、１８４２−１９６０ 位からの配列のみがその最終構築物内のＢｔ、Ｐ２＃ｌを有して残る。） 例３・最後の合成遺伝子の組み立て及び修複合成メイズ最適化Ｂｔ　ｃｒｙｌＡ （ｂ）遺伝子を、クォーター内でクローン化されるへく設計する。しかしながら 、ＰＣＲ技術を使用して、突然変異であって殆との場合にフレーム・シフトをも たらす欠失となるものをもたらす。個々のクォーターを含むプラスミドを、それ 故、配列決定し、そして正しい部分を、標準的な手順を使用して一緒に結合する 。 殆との所望の配列をもつ第−及び第二クォーターを得た後、プラスミドｐＥＢＩ Ｑ＃４及びｐＥＢＩＱ＃５を、構築し、その塩基対６３４においてＤｒａ１１１ 部位までの合成旧遺伝子の所望の配列を得るために構築する（この突然変異は、 この叶ａｌｌＩ部位を破壊する。）。このｐＥＢＩＱ横築物を、ｐＰｌ−８から の３．９ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｎｌ／Ｂａｍ　Ｈ１断片とｐＱＡｌからの４００塩基対 の断片とを結合させることにより、作る。ｐＥＢＩＱ＃５は、Ｄｒａ１１１部位 までの所望の配列をもつが、ｐＥＢＩＱ＃４は、塩基対位３７８における突然変 異をもっている。 プラスミドｐｌＨＩＭ４及び９１８１Ｍ５を構築し、ｐＥＢＩＱ＃４及びｐＥＢ ＩＱ＃５内の叶ａｌＩ［部位を修復する。プラスミドｐＥＢＩＱ＃４及びｐＥＢ ＩＱ＃５を、ｐＨＢＩＱ＃４及びｐＥＢＩＱ＃５のそれぞれからの３．５Ｋｂ　 Ｎｃｏ　Ｉ／Ａａｔ　ＩＩ断片を結合することにより作る。プラスミドｐｌＨ１ λ（５は、合成りｔ遺伝子の第二りオーター内の８８４位におけるＳａｃ　Ｉ　 １部位間の突然変異を含む。プラスミドｐｌＨＩＭ４は、その前駆体構築物ｐＥ ＢＩＱ＃４内に記載したような追加の突然変異を含む。 ９１８１Ｍ４のＢｌｕｅｓｃｒ　ｉ　ｐｔベクター領域内のＳａｃ　［１部位を 、Ｎｏｔ　ｌ及びＳａｃ　Ｉによる９１８１Ｍ４の切断し、そしてこれらの部位 をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを使用して、９１８１Ｍ４　Ｓを作るだめのの３． ９Ｋｂ断片を結合させる前に標準的な条件下で変換させることにより欠失させる 。このベクター領域内の５ａｃｌ１部位の欠失は、９１８１Ｍ４　Ｓの第二クォ ーター内の８８４位における突然変異をもつ９０塩基対の５ａｃｌ［断片が９０ 塩基対のＳａｃ［［断片との置換に先立って除去されることを可能にする。オリ ゴ７−Ｕ／Ｌ１２及び１３を、Ｓａｃ、ｌ　Ｉによる切断及び２％Ｎｕｓｉｅｖ ｅゲル上の９０塩基対断片の単離の前に、（先に記載したように）キナーゼ処理 し、そしてハイブリダイズする。このＳａｃ［Ｉ断片を、約３．８ＫｂのＳａｃ 　［［切断ｐＨ（１Ｍ４　ＳベクターてあっってＣＩＰによりホスファターゼ処 理されているものの中に結合する。この修復されたＳａｃ　ｌ　Ｉ断片を、ｐＨ ＹＢ２＃６という。ｐＨＹＢ２＃６内の５ａｃｌｌ断片の方向を、以下のプライ マーを使用して先に記載したようなＰＣＲスクリーニングにより検出する： ＭＫ２３Ａ２８＝５−ＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴ−３’Ｍに２ ５Ａ２８＝５−ＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴ−３’ＭＫ２６Ａ２ ８＝５’　−ＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡ−３’ブライマ−ＭＫ ２３Ａ２８及び乳１に２５Ａ２８の５０ピコモルによりＰＣＲ反応を走らせるこ とは、約１８０塩基対の断片を作り、ｐＨＹＢ２＃６内の５ａｃｌ［部位により 結合される挿入断片が正しい方向にあることを示している。ＰＣＲスクリーニン グにおけるプライマーλ１に２５Ａ２８及びＭＫ２６Ａ２８は、陰性対照として 作用し、間違った方向のＳａｃ　ｌ　Ｉ結合断片を含む構築物内にのみ約１８０ 塩基対の断片を作る。ｐＨＹＢ２＃６配列を、標準的な手順を使用して決定する 。 ｐＨＹＢ２＃６は、３７８位において１つの突然変異であって所望の配列を含む 第一りオーターを得るために修復される必要があるものをもっている。 プラスミドｌＨＧ＃６は、合成旧遺伝子の完全な第一半分の所望の配列を含んて いる。ｐｌＨＧ＃６を、ｐｉ（ＹＢ２＃６からの５００塩基対のＡａｔ　Ｉｆ／ Ｎｃｏｔ断片に結合されたｐｌＨ１ｔ＋５＃２の３．４Ｋｂ　Ａａｔ［［／Ｎｃ ｏｌ断片から作る。 オーブン・リーディング・フレームを含む合成遺伝子のクローン又は部分クロー ンを同定するために、（先に記載したような）カナマイシン選択ヘクターを使用 する。合成旧遺伝子の第四クォーターを、カナマイシン・カセット中に最初に入 れる。ｐＫＭ７４−４は、Ａｐａｌ／ＣＩａ［により切断されたｐＵｃ：ＫＭ７ ４に結合されている、プラスミドＢｔＰ２からの約５００塩基対のＡｒａｌ／Ｃ １ａｌ断片（これは、Ｃ１ａｌにより切断に形質転換されている）を含む。プラ スミドｐＫＭ７４−４は、カナマイシン抵抗性を示すが、後に１５２３及び１６ ３４位において２つの置換突然変異を含むことか見つかっている（突然変異は、 第四りオーターのクローニングについてのセクション内て先に記載されており： それらは、置換であり、欠失又は挿入ではない。）。 プラスミドｐｌＨＧ＃６からの合成りｔ遺伝子の正しい第一半分を、プラスミド ｐＫＭ７４−４中に挿入する。ｐＫｍ１２４という得られたプラスミドを、ｐｌ ＨＧ＃６からのＩＫｂのＡｐａｌ／Ｂａｍ旧断片に結合されているｐＫＭ７４− ４から得られた約３．９ＫｂのＡｐａ［／Ｂａｍ旧断片から作る。ｐＫｍ１２４ は、カナマイシン抵抗性を示す。このプラスミドは、合成遺伝子の第一、第二、 及び第四りオーターを含み単一のオーブン・リーディング・フレームを形成する 。 合成遺伝子の第三クォーターを、次に、ｐＫＭＩ２４中にクローン化する。 プラスミドｐＢｔ　：Ｋｍ＃６内の第一の機能的クローンは、Ｋｍ−カセットて あってカナマイシン抵抗性を示すが第三と第四クォーターとの間の欠失突然変異 を含むものの中の切り詰められた合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の機能的コピーで ある。プラスミドｐＢｔ：Ｋｍ＃６を、ｐＱｃＮ１０３からの約５００塩基対の Ａｐａｌ／Ｎｃｏ［断片に結合されている約５ＫｂのＡｐａ［／Ｎｅ。 ＋　１２４ベクタ一断片から得る（　ｐＱｃＮ１０３は、その後に修復される１ ３２６位におけるミスマツチ突然変異を含んでいる。）。ヌクレアーゼ活性の汚 染がｐＢｔ：Ｋｍ＃６内の第三と第四りオーターとの間のＡｐａ１部位を欠失さ せたようである。プラスミドｐＢＴ：Ｋｍ＃６内の合成遺伝子によりコードされ ているＢｔ遺伝子は、ＥＣＢに対する生来の蛋白の活性の約５０−６０％をもっ ている。ｐＢＴ：Ｋｍ＃６からの２Ｋｂ　Ｓｍａ［／Ｂａｍ旧断片を、３５Ｓ： Ｂｔ６といわれるプラスミドを作るために３５８９発現カセット中に挿入する。 それぞれ突然変異をもつ、２つの機能的な合成りｔクローンｐＢＴ：ＫＭ＃６及 びｐＣＩ８４４１４を、最初に得る。生来の遺伝子に比へて欧州トウモロコシ穿 孔性動物に対する昆虫生物検定内で１００％の活性をもつｐｃｉ８４４１４は、 １３２３．１５２３、及び１６３４位において第三及び第四クォーター内に置換 突然変異を含む。 ｐｃＩ８４４１４を、先に記載したような２つのプラスミドＭＧ３．Ｇ４＃１８ 及びＩＨＧから構築する。ＭＧ３．　Ｇ４＃１８を、プラスミド旧、　Ｐ２＃　 １内のＡｐａｌ／Ｋｐｎ　ｌ断片をｐＱｃＮ１０３中にクローニングすることに より（上記と同じ制限部位を使用して）得る。この手順は、本遺伝子の第三及び 第四クォーターを含むプラスミドを作り出す。プラスミドＩＨＧからの合成遺伝 子の第一半分を、ＢａｍＨｌ及びＮｃｏ　ｔにより切断し、そして（本遺伝子の 第三及び第四りオーターを含む）ＭＧ、Ｇ４＃］８中に動かす。 得られたプラスミドｐｃｉ８４４１４は、合成遺伝子の機能的変異体を含む。 機能的ではあるけれとも、このプラスミド中の合成遺伝子は、３つの誤り：１３ ２６位（Ｃに置換されたＧ）、１５２３位（Ｇに置換されたＡ）、及び１６３４ 位（Ｃに置換されたＴ）におけるものを含んでいる。 ｐｃＩＢ４４１４内の第四クォーターを、先に記載したように第四クォーターを ハイブリダイズし、結合し、そして制限解裂することから、そして２％アガロー ス・ゲルからその断片を単離することから得られた３５４塩基対の第四クォータ ーのＡｐａｌ／Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩｌ断片置き換える。 ｐｃＩ８４４０８は、１）ＣＩ８４４１４内の第四りオーター断片をハイブリダ イズされた第四クォーター断片と置き換えることにより得られる合成りｔ遺伝子 クローンである。この合成旧遺伝子の前にＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターを挿入 するために、ｐｃＩ８４４０６を、プラスミドｐ３５ＳＢｔ６からの４ＫｂＥｃ ｏＮＩ／Ｋｐｎ　ｌ断片から、そしてｐｃｉ８４４０８からの１．８Ｋｂ　Ｅｃ ｏＮＩ／Ｋｐｎ　ｌ断片から作る。 ｐｃＩ８４４０６は、（その生来の遺伝子からの蛋白と比較して）ＥＣＢに対し て１００％活性であるがロイシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換をもたら す１３２３位における合成遺伝子の第三クォーター内の置換突然変異を含む。プ ラスミドｐＢｓ１２３１１１３を、この突然変異を修復するために使用する。 プラスミドｐＢ３１２３＃１３内の第三断片を、約４７９塩基対のハイブリダイ ズされたオリゴマー生成断片から作る。第三オリゴマーＬ１１５−０２０及びＬ ｉ２−Ｌ２１を、先に記載したようにキナーゼ処理し、ハイブリダイズし、そし て結合させる。ＰＣＲ反応を、プライマーＰ５（ａ）及びＰ６（ｂ）により１５ サイクルのわたり先に記載したように行う。このＰＣＲ生成物を、約９５μｍの 容量中で最終濃度約５０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で３０分間、その後６５°Ｃ でＩＯ分間ブロテイナカーＫにより処理する（Ｃｒｏｂｅ　ｅｊ　ａｌ、、　Ｎ ｕｃｌｅ＋ｃ　ＡＣｌｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９：１８４．１９９１．）　ｏ 次に、この生成物を、フェノール／クロロホルム抽出し、そして制限酵素Ａｐａ １及びＮｃｏ　Ｉによる切断の前に標準的な手順を使用してエタノール沈降させ る。 約４５０塩基対のＡｐａｌ／Ｎｃｏ［ＰＣＲ断片を、ｐｉｔ（Ｇａ４からの３． ８ＫｂのＡｐａ［／Ｎｃｏ［ベクター断片に結合させ、ｐＢｓＩ２３＃１３を作 る。プラスミドｐＢｓ１２３＃１３は、そのＮｓｐ［部位における１３１９位か ら１４９３位におけるＡｐａ［部位まてのメイズ最適化ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子 の第三クォーターのための所望の配列を含む。プラスミドｐＢｓ１２３＃１３か らのこの１７０塩基対のＮ５ｐｌ／Ａｐａｌ断片を、プラスミドｐｃｉ８４４１ ８内の完全に活性な合成ＣｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子内で使用する。 ウェスタン・プロット分析： 様々な形質転換細胞のウェスタン・プロット分析を、選択プレート上で増殖させ た大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から得られた粗抽出物を使用して行う。つまようじ を使用して、集落を、３７°Ｃにおいて一夜増殖させた問題の形質転換細胞を含 む新たなプレートからこそげ取る。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内の旧遺伝子の発現 のための陽性対照は、ｐｃｉ８３０６９という構築物であり、植物発現性ＣａＭ Ｖ　３５Ｓプロモーターと融合された生来のＢｔ−に遺伝子を含む。また、ｐｃ ＩＢ３０６９は、ハイグロマイシン耐性遺伝子に作用可能な状態で結合されてい る３５Ｓプロモーターを含み、この３５Ｓプロモーターは、ＧｔＪＳ遺伝子に作 用可能な状態で結合されているＡｄｈイントロン＃１をもち、そして生来のＢｔ 　ｃｒｙｌＡ（ｂ）　ＩＰの生産をコードしている遺伝子に作用可能な状態で結 合されている。Ｂｔ遺伝子を含まない大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の陰性対照も、こ の分析において含まれる。集落を、６２ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ６，８， １％ＳＤＳ、０．００２５％ブロモフェノール・ブルー、１０％グリセロール及 び７．５％メルカプトメタノールを含む１００μｌの供給バッファ　−（ｌｏａ ｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）中に再懸濁させる。この混合物を、９５°Ｃにおいて １０分間加熱した後、この調製物を、ｌ−３秒間音波破砕する。この死骸を、室 温において約５分間マイクロフユージ内で遠心分離し、そして１０〜１５μｍの それぞれのサンプルを、６％スタッキング・ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ） の下方の１０％ランニング・ゲルをもつアクリルアミド・ゲル上に供給する（Ｌ ａｅｍｍＩｉｕ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７＋６８０−６８５（１９７０））。Ｉ ＯｍＡｍｐＳにおいて一夜、電気泳動の後、蛋白を、そのゲルから踊ｍｏｂｉｌ ｏｎ膜（Ｍｉ　１１ｉｐｏｒｅ）に転移させる。この転移を、電気泳動Ｂｌｏｔ ｔｉｎｇ　Ｌｌｎｉｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＢｉｏＮｕｃｌｅａｒ。 Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）を使用して転移バッフｙ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ、　１５０ｍＭグリシン、及び２０％メタノール）中で１．５時間４５０ｍＡ ｍｐｓにおいて行う。 ウェスタン・プロッティングのためのバッファーはニブロッキング・バッファー ：２％Ｔｗｅｅｎ−２０３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ１０，２１５０ｍＭ 　ＮａＣ１ 洗浄バッフ−ｒ−０，０５％ＴＷｅｅｎ−２０３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ Ｈ１０，２１５０ｍＭ　ＮａＣ１ 展開バッフ−ｒ　−：　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ９，６１００ｍＭ 　ＮａＣ１ １０ｍＭ　ＭｇＣ１を 転移終了後、この膜を、上記のブロッキング・バッファー中で約１０分間インキ ュベートする。洗浄バッファーによる３回の１５分間の洗浄を、第一抗体処理の 前に行う。第一抗体は、抗原としてＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を使用して調製した免 疫アフィニティー精製されたウサギ又はヤギ抗体（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、　Ｒ ＴＰ、　Ｎ、Ｃ，：　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｎｃ、、　Ｇ１１ｂｅｒｔｓｖｉ１ １ｅ、　ＰＡ、　：　ａｎｄ　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＣＯ，、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、）である。 このｃｒｙ［Ａ（ｂ）特異的抗体を、５μｇの抗体を含む１ｍｌ容量中のＢｉｏ −Ｒａｄからの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）溶菌物、その洗浄バッファー溶液中の５ ０μｌの大腸菌（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）溶菌物により、使用直前に処理する。この 混合物を、洗浄バッファーによるｌ　：　６０００の最終希釈のためにそれを１ 〜３０に希釈する前に室温において１時間インキュベートする。第一抗体とのそ の膜のインキュベーションは、室温において１．５時間である。 ３回の１０分間洗浄を、第一と題意に抗体処理の間に行う。第二抗体は、ウサギ 抗−ヤギ又はヤギ抗−ウサギ／アルカリ性ホスファターゼ抱合体（ｃｏｎｊｕｇ ａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、λ（０）のどちらかである。 のアルカリ性ホスファターゼ抱合体とのインキュベーションを、洗浄バッファー 中の１〜６０００希釈を使用して室温において１時間行う。 ６回の１０分間の洗浄を、第二抗体処理とウェスタン・プロット展開との間に行 う。このウェスタン・プロットを、７０％ジメチル・ホルムアミド中の４４０μ ｍのニトロブルー・テトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ ｍ）（７５ｍｇ／ｍｌ）及び１００％ジメチル・ホルムアミド中の３３０μｍの ５−ブロモ−４−クロロ−インドールイル−ホスフェ−）　（５０ｍｇ／ｒａｌ ）を含む１００ｍ１の展開（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）バッファー中で展開させる 。 １５〜３０分間の展開後、この膜を水中で洗浄し、そして風乾させる。 例４．形質転換ベクターの構築 ｐｃＩ８７１０及び誘導体の構築。 Ｃａ、ＭＶ　３５Ｓプロモーター・カセット・プラスミドｐｃＩ８７０９及びｐ ｃＩＢ７１０をＲｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　５３：１５３ −１６１（１９８７）中に示されるように構築する。ｐｃＩＢ７１０は、３５Ｓ 　ＲＮＡ転写のためのＣａＭＶプロモーター及び転写終止配列を含む［Ｃｏｖｅ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、　９：６７３５− ６７４７　（１９８１）］　。ＣａＭＶ　ＤＮＡの１１４９塩基対のＢｇｌｉｌ 制限断片［Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　９６：１９４−２ ２０　ａｎｄ　Ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ　Ａ　ｔｏ　Ｇ　（１９８２）中の塩基対 ６４９４−７６４３１を、先に記載したような分離用アガロース・ゲル電気泳動 によりＣａＭＶ　ＤＮＡから単離する。この断片を、ＢａｍＨ−解裂プラスミド ｐｔＪｃ１９　ＤＮＡと混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより処理し、そして大 腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に形質転換する（得られたプラスミド内のＢａｍＨ［制限 部位がＢｇｌｌ＋付着末端をＢａｍＨｌ付着末端に結合させることにより破壊さ れていることに注意のこと。）。 ｐＵｃ＋９／３５Ｓという、得られたプラスミドを、次にオリゴヌクレオチド− 特異的インヒドロ突然変異誘発において使用し、このＢａｍｔ（［認識配列ＧＧ ＡＴＣＣを、Ｈｏｈｎの文献中のＣａＭＶヌクレオチド７４８３の直後に挿入す る。得られたプラスミドｐｃＩ８７１０は、ＢａｍＨ［制限部位により分けられ たＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター領域及び転写終止領域を含む。このＢａｍ８１ 部位中に挿入されたＤＮＡ配列は、これらのＣａＭＶ転写調節配列により植物内 で発現されるであろう。（ｐｃＩＢ７１０が転写の開始とＢａｍＨ１部位との間 にいずれのＡＴＧ翻訳開始コドンを含んでいないことにも注意のこと。） ｐｃＩＢ７１０を、ＢａｍＨ１部位内にｐＬＧ９０からのハイグロマイシン・ホ スホトランスフェラーゼのためのコード配列を含むＢａｍＨ１断片［Ｒｏｔｈｓ ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、５３：１５３−１６１（１９８７）］を 挿入することにより修飾し、ｐｃＩＢ７０９を作る。 ｐｃＩ８７０９を、標準的な突然変異誘発技術を使用してハイグロマイシン・ホ スホトランスフェラーゼの開始コドンから丁度上流のＡＴＧを除去し、一方この 位置においてＢｇｌｌｌ制限部位を挿入することにより、修飾し、ｐｃＩ８９９ ６を作る。得られたプラスミドｐＣ！８９９６を、さらに修飾し、その開始コド ンのための、その開始コドンの５′に配置された５′未翻訳リーダー領域内のＢ ａｍｔ（［、Ｓｍａｌ及びＢｇ１１１部位を除去する。結果は、−ＴＡＴＡＡＧ ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡ　ＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡ　ＴＡＴＧ−Ｈｙｇから− ＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＴＡＴＧ−）１ｙｇへのＤＮＡ塩基配列の変更 である。 得られたプラスミドは、ｐｃＩ８３０７３として知られている。 あるいは、ｐｃＩ８７１０を、以下のパート４中に記載する６４５アミノ酸Ｂｔ コ一ド配列を含む、ｐｃ［Ｂ１０／３５ＳＢｔのＢａｍｔ（Ｉ−Ｂｃｌ　［断片 を、ｐｃＩＢ７１０のＢａｍＨ１部位中に挿入し、ｐｃ［Ｂ１０／３５ＳＢｔを 作ることにより、修飾し、１１ＣＩ８９００を作る。抗生物質耐性マーカーを導 入するために、ｐｃｉ８７０９を、５ａｉｌにより切断し、Ｋｐｎ１１５ａｌｔ アダプターを結合させ、そして得られた結合生成物をＫｐｎ　Ｉにより切断する 。３５Ｓ／ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐｃ［Ｂ７０９のＫｐｎ断片をｐ ｃＩＢ７１０／３５ＳＢｔのＫｐｎ］部位中に挿入し、ｐｃ［Ｂ９００を作る。 選択マーカー遺伝子として有用な遺伝子は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、 。 Ｇｅｎｅ、５３：１５３−１６１（１９８７）中に記載されたハイグロマイシン 耐性遺伝子を含む。この文献中に記載されたハイグロマイシン遺伝子を。ｐＵＣ プラスミド例えば、ｐｃＩ８７１０又はＩ）ＣＩ８７０９中に移し、そしてこの ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ・コード配列から上流の”余分な （ｅｘｔｒａ）”ＡＴＧを除去し、Ｉ］Ｃ［８９９６を作る。この修飾されたｐ Ｃ［Ｂ９９６遺伝子を、さらに修飾し、分子生物学の標準的な技術を使用してそ の遺伝子の５′領域からＢｇｌｌｌ　、　Ｂａｍ１（Ｉ及びＳｍａ　［部位を除 去し、ｐｃＩＢ３０７３を作る。 ｐｃ［Ｂ９３２は、ｐＵｃ１９−ペースのプラスミドてあってキメラ遺伝子Ｐｅ ｐ−Ｃ・プロモーター／Ｂｔ／Ｐｅｐ−Ｃ：ターミネーターを含むものである。 それは、ｐＰＥＰ−１０、すなわち、ゲノム・クローン、旧−ラムダ−１４，Ｐ ＮＡＳ　ｔＪｓＡ、　８３・２８８４−２８８８（１９８６）の、光合成におけ るＰＥＰカルボキシラーター素活性をコードしているメイズ遺伝子の、Ｈｉｎｄ ｌｌｌサブクローンから、そしてｐＵｃ！８のＢａｍ８１部位内のｃｒｙｌＡｂ エンドトキシン遺伝子の６４５アミノ酸の切り詰められた形態を含むＢａｍＨＩ 断片であるｐｃＩ８９３０から得られる断片から成る。 ＰＥＰカルボキシラーター伝子からのポリＡ付加部位を含むｐＰＥＰ−１０から の２．６ｋｂ　ＥｃｏＲ［−Ｘｈｏ［断片を、単離し、そしてｐｓｔｒ及びｔ（ ｉｎｃｌｌにより消化する。この制限消化物を、Ｐｓｔｌ／Ｈｉｎｃｌｌ消化ｐ Ｕｃ１８により結合させ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換し、そして形質 転換細胞をｐｌＪｃ＋８内に４１２塩基対のＰｓ　ｔ　１−Ｈｌｎｃ　［Ｉ挿入 物を含むものについてスクリーンし、そしてその挿入物を配列決定により確認す る。得られたプラスミドを、ｐｃＩ８９３１　という。 ホスホエノールビルヘート・カルボキシラーゼ・アイソザイム（”Ｐｅｐ−Ｃ” 　）をコードしている核遺伝子は、Ｈｕｄｓｐｅｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａ ｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇＹ、　１２：５７９−５８９　（１９ ｆ３９）中に記載されている。ｐｃＩ８９３２を３つの断片の結合により構築す る。二〇ＰＥＰ−Ｃ転写ターミネータ−を含む第一断片を、Ｈｉｎｄ目１により 、部分的にｓｐｈ＋によりｐＣＩ８９３１を完全に消化することにより作り、そ して３０９８塩基対の断片を単離する。Ｂｔエントトキソフンコート配列を含む 第二断片を、ｐＣ１Ｂ９３０をＮｃｏ　Ｉ及びＳｐｈ［により消化することによ り作り、そして１９５０塩基対の断片を単離する。ＰＥＰ−Ｃプロモーターを含 む第三断片を、Ｈｉｎｄ［［ｌにより、部分的にＮｃｏ　［によりｐＰＥＰ−１ ０を完全に消化することにより作り、そして２．３ｋｂの断片を単離する。この 結合混合物を、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換し、正しい挿入物をもつ形 質転換細胞を同定し、そしてこの挿入物を配列決定により確認する。 ｐｃｒＢ９３２を、Ｐｖｕ［Ｉにより切断し、メイズＰｅｐ−Ｃ：プロモーター ／８ｔ／Ｐｅｐ−Ｃ：ターミネータ−を含む４．９Ｋｂ断片を作り、そしてＩＸ 　ＴＡＥ中の１％しＧＴアガロース・ゲル上で精製する。この線状のｐ（：　［ ８３０７９ベクター及びｐｃ［Ｂ９３２からの４．９Ｋｂ挿入物をＬＧＴ中のＴ ４　ＤＮＡリガーゼを使用して結合し、ｐｃ［Ｂ４４０１を作る。。ｐｃＩＢ４ ４０１は、キメラ遺伝子：３５Ｓ：プロモーター／ＦＡＴ／３５Ｓ　：　ターミ ネータ−１Ｐｅｐ−Ｃ：プロモーター／ａｔ／Ｐｅｐ−Ｃ：ターミネーター、及 び３５Ｓ：プロモーター／Ａｄｈｌ　＃ｌイントロン／ＧＵＳ／３５Ｓ　：　タ ーミネータ−を含むメイズの形質転換ベクターである。 ｐｃＩＢ２４６（３５Ｓ−ＧＬＩＳ−３５Ｓ）の構築ＣａＭＶ　３５Ｓプロモー ター・カセット、ｐｃ［Ｂ２４６を以下のように構築する。 ＣａＭＶゲノムのヌクレオチド位７４８２におけるＤｄｅ　［制限部位［Ｆｒａ ｎｃｋｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．２１：２８５−２９４（１９８０）］を、Ｎ ｅｏ　［（ＣＣＡＴＧＧ）部位、Ｓａ　ｌ　［（ＧＴＣＧＡＣ）部位、及びＳｓ 　ｔ　［（ＧＡＧＣＴＣ）部位を含む幾つかの制限酵素部位を含む４８塩基対の オリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾する。 この変更されたＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターを、そのベクターの５ｓｔｌ及び ５ａｉｌ部位を破壊するように修飾されているｐＵｃ１９ベクター中に挿入する 。したがって、ｌ）Ｃ［Ｂ１５００のＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターは、クロー ニングのためのユニーク５ｓｔｌ及び５ａｉｌ部位を含む。 ｐｃｌＢ１５００を、５ｓｔｌ／Ｎｃｏｌにより消化し、そしてｐＢ［２２１が ら得られるＧＵＳ遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ ｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）と結合する。このＮｅｏ　［部位を、 そのＮｃｏ　１部位のＡＴＧがＧＵＳ遺伝子の翻訳のための開始コドンとして機 能するように、ＧＵｓ遺伝子に融合させる。ＣａＭＶ　３５Ｓポリアゾニレ−ジ ョン及び終止シグナルを、このキメラ遺伝子の３゛末端のために使用する。 ｐｃ［Ｂ５０６９（３５Ｓ−Ａｄｈｌ−ＧＵＳ−３５Ｓ）の構築ｐｃｉ８２４６ を、ノイズ・アルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子Ａｄｈｌイントロン番号１（ Ａｄｈｌ）（Ｄｅｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ。 １２：３９８３−４０００（１９８４））をｐｃＩ８２４６の５ａｉｌ部位中に 付加することにより修飾し、プラスミドｐｃＩ８３００７を作る。Ａｄ旧イント ロンを、Ｂａ１１／Ｐｓｔｌ断片としてメイズＡｄｈｌ遺伝子から切除し、Ｓｍ ａ［／Ｐｓｔｌにより切断されたｐＬｌｃ１８中にサブクローンし、Ａｄｈ　１ ０２６というプラスミドを作る。Ａｄｈ　＋０２６を、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ／Ｓａｃ 　Ｉ　Ｉにより切断し、その断片を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端 とし、５ａｉｌリンカ−を、標準的な手順を使用して添加し、そして約５６０塩 基対の断片を、３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルから回収し、そして５ａｌｌ切断／ホス フアタ一ゼ処理ｐｕｃｔｇ中に結合する。得られたプラスミド内の５ａｉｌ線型 化Ａｄｈイントロン＃ｌを、５ａｉｌにより切り出し、ゲル精製し、そして５ａ ｉｌ切断／ホスフアターゼ処理ｐｃｉ８２４６中に結合させ、プラスミドｐｃｉ ８３００７を作る。 ｐｃｒＢ３００７を、Ｐｓｔｌにより切断し、そしてその末端を供給者の仕様書 に従ってＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ ）を使用して平滑とする。得られた平滑末端分子を、５ｐｈｌにより切断し、そ して１つの平滑末端及び１つのＳｐ旧末端をもつ約５．８Ｋｂ断片を、標準的な 手順を使用して低ゲル化温度（ＬＧＴ）アガロース・ゲル上で精製する。ｐｃＩ Ｂ９００を、Ｓｍａ１１５ｐｈｌにより切断し、そして３５Ｓ／旧遺伝子を含む 断片を、ＬＧＴアガロース・ゲル上で精製する。この２つのゲル精製断片を、標 準的な条件に従ってＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用してＬＧＴアガロース中で結合 する。得られた結合断片を、標準的な手順を使用して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中 に形質転換し、そして得られたプラスミドをｐｃＩ８３０６２という。２つの変 異体のｐｃ１８３０６２が在る。ｐｃｉＢ３０６２＃１は、再生されたＳｍａ１ 部位をもち、ここては、ＳｍａＩ部位及びＴ４ポリメラーゼ平滑末端が結合され ている。この大部分は、たぶん、平滑化反応の間にＰｓｔ１部位からの少ない塩 基対を少しずつかみ取るＴ４ボリメラーセから生じる。ｐＣ１Ｂ５０６２＃３は 、このＳｍａ　１部位をもっていない。 ｐｃｌＢ３０６２＃３を、Ｋｐｎ　Ｉにより切断し、そしてＴ４　ＤＮＡポリメ ラーゼを使用して平滑末端とし、そして次に、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉにより切断し、３ ５Ｓ／ＧＵＳ及び３５Ｓ／Ｂ　を遺伝子を含む平滑末端をもつ６．４にｂの断片 を作る。この平滑末端断片を、Ｓｍａ　Ｉ切断ｐｃＩＢ３０７３中に結合させ、 ｐｃＩＢ３０６３及びｐＣ［Ｂ５０６９を作る。ｐｃＩＢ３０６９は、ｐｃＩＢ ３０６３を作るために使用される同一断片を含むが、ｐｃ［Ｂ５０６９内のキメ ラ遺伝子はすべて、ｐｃｉ８３０６３内のものと異なり、同一の相対的方向にあ る。これらの遺伝子は、先に記載したように、ａ）３５Ｓプロモーターであって ハイグロマイシン耐性遺伝子に作用可能な状態で結合されているもの：ｂ）３５ ＳプロモーターであってＧＵＳ遺伝子に作用可能な状態て結合されているＡｄｈ イントロン＃ｌをもつもの：及びｃ）３５Ｓプロモーターであってバチルス・ス リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの合成 ｃｒｙｌＡ（ｂ）殺虫性蛋白の生産をコードしている遺伝子に作用可能な状態で 結合されているもの、を含む。 ＧＵＳ検定： ＧＬＩＳ検定を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ、　Ｒ ｅｐｏｒｅｔｅｒ、５：３８７−４０５　（１９８７）中に記載されたよう本質 的に行う。先に示したように、プラスミドｐｃＩＢ２４６は、Ｇ［ＪＳ遺伝子と 融合したＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターを含む。このキメラ遺伝子の５°未翻訳 リーダーは、メイズＡｄｈｌイントロン＃１のコピーを含む。これを、ここては 、形質転換対照として使用する。同一量のｐｃＩＢ２４６を、それぞれの形質転 換に添加するけれとも、計算された活性は、テストした８１構築物の中で変動し た。 以下に報告する値は、３回繰り返しの平均である。ｐｃｌＢ４４０７を、２回テ ストした。 ｐｃ［Ｂ５０６９　２８ｎＭ　ＭＵ／　ｕｇ１分間ｐｃｉＢ４４０７　０．７ｏ Ｍ　ＭｔＪ／　μｇ／分間、２．３ｏＭ　ＭＵ／　μｇ／分間。 手順書に従って欧州トウモロコツ穿孔性動物に対する殺虫活性について検定する 。 溶融人工昆虫食物を、６０ｍｍのＧｅｌｌｍａｎのスナップ・キャップのペトリ 皿中に濯ぐ。凝固後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中に懸濁された大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞を、３　Ｘ　１０７細胞／ｃｍ　２の濃度においてその表 面上に拡げる。このプレートを風乾させる。１０の第−令の（ｆｉｒｓｔ　１ｎ ｓｔａｒ）の欧州トウモロコシ穿孔性動物、０ｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌ ｉｓであって生後１２時間未満のものを、次にその食事表面上に置く。テストを 、３０°Ｃにおいて完全な暗闇内で２−５日間インキュベートする。このテスト の最後において、死亡率のパーセントを記録する。陽性クローンを、対照大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞が０−１０％の背景死亡率を与えるとき、５０％以上の 死亡率を与えるものとして定める。 比較のために、ｐｃ１８３０６９内の生来のｃｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子を、上記と 同じ濃度においてテストする。クローンを、３　ｘ　１０７細胞／ｃｍ　’食事 （ｄｉｅｔ）　；　クローン当たり２０昆虫においてテストする。 以下の結果を観察する。 クローン　パーセント死亡率 対照　Ｏ ｐｃ　１８３０６９　１００ ｐｃｒＢ４４１４　１００ これらの結果は、合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子により生産された殺虫性結晶蛋白 がその生来のｃｒｙｌＡ（ｂ）により生産されたＩＰのものに比較しての欧州ト ウモロコシ穿孔性動物に対する活性を証明した。合成ｃｒｙ　ＩＡ（ｂ）遺伝子 を含む他のプラスミドを、同様のやり方で検定した。 たように、欧州トウモロコシ穿孔性動物のために使用したものと同し手順に従っ て、サトウキビ穿孔性動物（Ｄｉａｔｒｅａ　５ａｃｃｈａｒａｌｉｓ）に対す る殺虫活性について検定する。結果を表中に要約する。 蛋白濃度（ｎｇ／ｇ）　パーセント死亡率ｃｒｙｌＡ（ｂ）ＬＣ５０３８０ ９５％ＣＩ　２４９−６４６ 上記の結果は、メイズ最適化Ｂｔ遺伝子により生産された殺虫性蛋白がサトウキ ビ穿孔性動物に対して有効であることを示している。 Ｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白の最高濃度、すなわち、２５０ｎｇ／ｇ−１１０００ｎ／ ｇが、本発明に従ってトランスジェニック・ノイズ植物内で達成可能である。 例６：　ノイズ・プロブラストの単離及び合成旧遺伝子による形質転合成りｔ遺 伝子の発現を、過渡的に形質転換されたメイズ・プロトプラスト内で検定する。 プロトプラスト単離手順： １．１０の２ＢａＣｔｗｏ　ｄａｙ　ｏｌｄ）のメイズ２７１７系６懸濁培養物 の中身を、ピペットて５０ｍ１の無菌チューブ内に入れ、そして沈殿させる。 培養基を次に取り出し、そして捨てる。 ２、　細胞（３−５ｍｌ　Ｐａｃｋｅｄ　Ｃｅ１１　Ｖｏｌｕｍｅ）を、３０ｍ １のプロトプラスト酵素溶液中に再懸濁させる。配合表（ｒｅｃｉｐｅ）は以下 のようである。 ３％セルラーゼＲ３ ＫＭＣバッファー中の１％ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　ＲＩＯＫＭＣバッファー（ｌ リッターのための配合表）ＫＣＩ　８．６５ｇ ＭｇＣ１□−６８２０１６，４７ｇ ＣａＣ１２−２Ｈ２０１２，５０ｇ ＭＥＳ　５．０ｇ ｐＨ５，６、滅菌濾過物 ３、　細胞をよく混合し、そして１００　ｘ　２５ｍｍのペトリ皿中に、プレー ト当たり約１５ｍ１に部分分けする。旋回振どう機上で４時間振とうし、消化さ せる。 ４、　使用のためにそれぞれ１００ミクロン篩を通して１０ｍ１　ＫＭＣをピペ ットで取る。篩を通して皿の内容物を濾過する。等容量のＫＭＣにより篩を洗浄 する。 ５、　篩ったプロトプラストを注意して５０ｍ１のチューブ内にピペットで入れ 、そしてＢｅｃｋｍａｎ　ＴＪ−６遠心分離機内で１０分間１０００ｒｐ１００ ０ｒｐ　ｇ）により回転させる。 ６、　上澄を取り除き、そしてペレットを１０ｍ１　ＫＭＣ中で注意して再懸濁 させる。３つのチューブを合わせて１つにし、モしてＫＭＣにより５０ｍ１まて の容量にする。 ７、　上記の段階を繰り返すことにより再び、回転及び洗浄を行う。 ８、　洗浄したプロトプラストのすべてを５０ｍ１　ＫＭＣ中に再懸濁させる。 血球計数器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）内て計数を行う。プロトプラストを 回転させ、そして再懸濁バッファー（ＲＳバッファー）中で８　ｘ　１０’／ｍ ｌにおいて再懸濁させる。 ＲＳバッファー（５００ｍｌのための配合表）マニトール　２７．３３ｇ ＣａＣＬ　（０，１Ｍストック）　７５ｍ１ＭＥＳ　Ｏ，５ｇ ｐＨ５，８、滅菌濾過物 プロトプラスト形質転換手順： １．５０μｇのプラスミドＤＮＡ（Ｂｔ　ＩＰ構築物、合成（ｐＣ［Ｂ４４０７ ）及び生来（ｐｃＩＢ３０６９）の両方）を１５ｍ１のポリスチレン培養チュー ブ内に部分分けする（Ａｌｉｑｕｏｔ）　ｏ　また、２５μｇＧＵＳ−含有ブラ スミドＤＮＡ（Ｂｔ　ＩＰを含まないもの）（ｐｃ［Ｂ２４６）をすべてのチュ ーブに部分分けする。 ３回の繰り返しを、テストされるへき構築物毎に使用し、１回は、対照としてＤ ＮＡを全く含んでいない。 旧構築物：　Ｇ［ＪＳ構築物・ ｐＣｒＢ３０６９　ｐｃ　［Ｂ２４６ ｐｃ［Ｂ４４０７ ２、　プロトプラストを穏やかによく混合し、そしてチューブ毎に０．５ｍｌを 部分分けする。 ３、　それぞれのチューブに０．５ｍｌ　ＰＥＧ−４０を添加する。 ＰＥＧ−４０： ０．４Ｍ　マニトール ０、　ＩＭ　Ｃａ（ＮＯｘ　）　２−４Ｈ２０ｐＨ８，０、無菌濾過物 ４、穏やかに混合し、プロトプラストとＰＥＧとを一緒にする。３０分間待つ。 ５、　順次、１ｍｌ　、２ｍｌ　、及び５ｍｌのＷ５溶液を、５分間の間隔をあ けて添加する。 Ｗ５溶液： １５４ｍＭ　ＮａＣ１ １２５ｍＭ　ＣａＣＩｚ　−Ｈ２０ ５ｍＭ　ＫＣｌ ５ｍＭグルコース ｐＨ７，０、無菌濾過物 ６、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＴＪ−６遠心分離機内で１０分間約１０００ｒｐｍ１００ ０ｒｐにおいて回転させる。上澄液を取り除く。 ７、１．５ｍｌのＦＷ培地中で穏やかにペレットを再懸濁させ、そして３５　Ｘ 　１０ｍｍベトリ皿内に注意してブレーティングする。 ＦＷ培地（ｌリッターのための配合表）：ＭＳ塩　４．３ｇ ２００Ｘ　８５　ｖｉｅｓ、　５ｍｌ シュクロース　ａｏｇ プロリン　１．５ｇ マニトール　５４ｇ ２．４Ｄ　３ｍｇ ｐＨ５，７、無菌濾過物 ８、　室温において暗室内で一夜インキユベートする。 ９、　以下に記載するように、プロトプラスト抽出物に対して、ＧＯ３検定、昆 虫生物検定、及びＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定を行う。 ズ最適化配列を示している。先に記載した切り詰められた変異体は、第一の、約 ２ｋｂの上記遺伝子を現している。完全長遺伝子の残りを、先に記載したような 手順を使用してクローン化する。簡単に言えば、この手順は、長さ４０〜９ＯＮ ＴのＤＮＡオリゴマーの合成を、典型的には平均サイズとして８０ｍｅｒの使用 を必要とする。このオリゴマーを、ＨＰＬＣの標準的な手順又はポリアクリルア ミド・ゲルからの回収を使用して精製する。精製されたオリゴマーを、キナーゼ 処理し、そしてハイブリダイズさせ、約５００塩基対の断片を作る。このハイブ リダイズしたオリゴマーを、標準的な条件下てＰＣＲを使用して増幅することが できる。ハイブリダイゼーションから直接、ＰＣＲ増幅から、あるいはハイブリ ダイゼーション又はＰＣＲ増幅のいずれかの後のアガロース・ゲルから、のいず れかから回収された５００塩基対の断片を、次に、プラスミド中にクローン化し 、そして標準的な手順を使用して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換させる。 所望の挿入物を含む組換えプラスミドを、ＰＣＲ及び／又は標準的なミニスクリ ーン手順を使用して先に記載したように同定する。それらのＰＣＲ及び／又は制 限酵素のプロフィールに基づき正しいと思われる挿入物を、次に配列決定し、所 望のオープン・リーディング適化合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子であってノイズ内 の高レベルのＣｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白の発現に有用なものを作り出す。 生来及び合成りｔ遺伝子のＧ＋Ｃ含量：完全長生来　３８．８％ 切り詰められた生来　３７．２％ 完全長合成　６４．８％ 切り詰められた合成　６４．６％。 ”純粋な”メイズのコドンの用い方の遺伝子に比較しての、Ｂｔ遺伝子の最終的 な切り詰められた変異体の％相同性：　９８．２５％。 例８：　植物発現性完全長ハイブリッドの、部分的メイズ最適化ｃｒｙ　ＩＡ（ ｂ）遺伝子の構築 ｐｃ１８４４３４は、約２Ｋｂの合成メイズ最適化ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子を含 んで成り、この遺伝子の残り（ＣＯＯ）（末端コード領域）は生来の遺伝子から 得られる。したがって、このコード領域は、合成遺伝子と生来の遺伝子との間の キメラであるが、得られた蛋白は、生来のｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白と同一である。 この合成領域は、ヌクレオチド１−１９３８（アミノ酸ｌ〜６４６）からのもの であり、そしてその生来のコード配列は、ヌクレオチド１−３４６８（アミノ酸 ６４７〜＋１５５）がらのものである。この遺伝子の配列を、図７中に記載する 。ｐｃＵＢ４４３４のマツプを、図８中に示す。 以下のオリゴを、ＩＩＣ［８４４３４を作るために設計した：ＫＥＩ３４Ａ２８ ＝５’　−ＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＧ　ＡＴＣＡＡＧＴＡＴＣ ＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＧＡＧＴ−３’ ＫＥ　ｌ　３５Ａ２８・５−ＡＣＴＣＡＡＣＴＡＡ　ＡＴＴＧＧＡＴＡＣＴ　Ｔ ＧＡＴＣＧＡＴＧＴ　ＧＧＴＡＧＴＣＧＧＴＣＡＣＧ−３’ ＫＥＩ３６Ａ２８・５’　−ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡ　ＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴ　Ａ ＣＣＣＡＡＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧＴ−３゜にＥ１３７Ａ２８＝５−ＧＣＴＧＡＴ ＴＡＴＧ　ＣＡＴＣＡＧＣＣＴＡＴ−３゜にＥ１３８Ａ２８・５−ＧＣＡＧＡＴ ＣＴＧＡ　ＧＣＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＡＧＡ　ＡＧＴＡＡＴＴＣ−３ ゜ＭＫＯ５Ａ２８＝５−ＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＡＴＡＧＣＧＴＡ　ＡＣＧ− ３’ＭＫ３５Ａ２８＝５−ＡＡＣＧＡＧＧＴＧＴ　ＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧ−３゜ ｐｃｉ８４４３４を、ｐｃＩ８４４１８からの５．７ｋｂ断片、３４６塩基対の ｓｓｔ　Ｅ　ＩＩ／Ｋｐｎ　Ｉ　ＰＣＲ生成合成：生来融合断片、ｐｃ［Ｂ１３ １５からの１０８塩基対のＫｐｎ　Ｉ／Ｎｓｉ　［生来ＣｒｙｌＡ（ｂ）断片、 及び２２４塩基対のＮｓｉ　［／Ｂｇｌ　ＩＩ　ＰＣＲ生成断片の、４方結合を 使用して作る。結合及び形質転換のための標準的な条件は、先に記載したような ものと同じである。 合成・生来遺伝子融合断片を、ＰＣＲを使用して２段階で作る。第一の２５３塩 基対のＰＣＲ融合断片を、２００ｎｍのそれぞれのｄＮＴＰ、　Ｉ　ＸＰＣＲバ ッファ　−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）、２０％グリセロール、 及び５ユニツトのＴａｑボリメラーターＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ ）を含む１００μ＋中に約２００ｎｇの生来のｃｒｙｔＡ（ｂ）テンプレートと 共に１００ピコモルのオリゴＫＥ１３４Ａ２８及びＭＫＯ４Ａ２８を使用して作 る。このＰＣＲ反応を、以下のパラメーターにより走らせる：９４°Ｃて１分間 、５５°Ｃで１分間、７２°Ｃて４５秒間、伸長３．３秒間、２５サイクル。こ の第−ＰＣＲ反応の分画（１％）を、２００ｎｇの合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）　ＤＮ Ａと一緒にテンプレートとして使用し、完全な３５１塩基対の合成：生来融合断 片を作る。この第二ＰＣＲ反応においてＰＣＲプライマーとして使用するオリゴ は、５０ピコモルのＭＫ３５Ａ２８．５０ピコモルのＭＫＯ４Ａ２８　、及び２ ５ピコモルのＫＥ１３５Ａ２８である。このＰＣＲ反応混合物及びパラメーター は、先に列記したものと同じである。得られた３５１塩基対の合成：生来融合断 片を、５０ｇｇ／ｍｌの全濃度においてプロフィ−ルＫにより処理し、そして標 準的な手順を使用してＢｓｔ　Ｅ　ＩＩ／Ｋｐｎ　［による切断の前にフェノー ル／クロロホルム抽出、その後のエタノール沈降を行う。 ｐｃＩＢ４４３４の調製において使用された２２４塩基対のＮｐｉ　ｌ／Ｂａｌ 　ＩＩ　ＰＣＲ断片を、上記と同じＰＣＲ反応混合物及び先に列記したようなパ ラメーターを含む１００μｌ容量中でテンプレートとして、１００ピコモルのオ リゴＫＥ１３７Ａ２８及びにＥ１３８Ａ２８及び２００ｎｇの生来のｃｒｙｌＡ （ｂ）遺伝子を使用して作る。２３０塩基対のＰＣＲ生来ｃｒｙｌＡ（ｂ）断片 を、プロティカーゼＫにより処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、そして Ｎｓｉ　［／Ｂａｌ　［１による切断の前に先に記載したようにエタノール沈殿 させる。 ｐＣ４Ｂ４４３４を、先に記載したようにメイズ・プロトプラスト中に形質転換 した。系６２７１７ブロトブラストを、比較のための対照としてｐｃＩＢ４４３ ４及びｐＣ／ＩＢ４４１９と共に使用した。結果を以下に示す：ｎｇ　Ｂｔ／ｍ ｇ蛋白 ４４１９（３５Ｓ）　１４．４００±２．１００４４３４（完全長）２．２００ ±　９００背景・未形質転換プロトプラストについて、１３ｎｇ　Ｂｔ／　ｍｇ 蛋白上記の結果は、ｐｃｌＢ４４３４がｐｃ［Ｂ４４１９の約１５％のレベルに おいて発現していることを示している。 ウェスタン・プロット分析は、本系内のｐｃＩ８４４３４により生産されたｃｒ ｙｌＡ（ｂ）蛋白の少なくとも３分の１がサイズ約１３０ｋＤであることを示す 。それ故、有意な量の完全長ｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白が、ｐｃｉ８４４３４の発現 からノイズ細胞内で生産される。 例７：　温度耐性ｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白をコートしている完全長、ｃｒｙｌＡ（ ｂ）遺伝子の構築 完全長のｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子をそれぞれか含む構築物ｐｃＩＢ５５１１−５ ５１５を、以下に記載する。これらの配列内ては、ｃｒｙ［Ａ（ａ）及びｃｒｙ ｌＡ（ｃ）内には存在するがｃｒｙｌＡ（ｂ）内には存在しないアミノ酸７９３ 及び７９４の間の２６アミノ酸の欠失、ＫＣＧＥＰＮＲＣＡＰＨＬＥＷＮＰＤＬ ＤＣ３ＣＲＤＧＥか修復されていた。ｐｃＩ８５５１３内の遺伝子は、合成のも のであり；たの４つの遺伝子は、ハイブリットてあり、そしてそれ故、部分的に メイズ最適化されている。 ｐｃＩ８５５１１の構築 このプラスミドは、ｐｃｉ８５５１１の誘導体である。ｐｃｉ８５５１１のマツ プを図１Ｏ中に示す。２１６５と２５９０との間のＤＮＡの４３５塩基対のセグ メン１〜を、切り詰められたｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の構築について先に記載し たように、上及び下ストランド（ｕｐｐｅｒ　ａｎｄ　ｌｏｗｅｒ　５ｔｒａｎ ｄ）を現すように設計された合成オリゴマーのハイブリダイゼーションにより構 築した。合成りＮＡのこのセグメントは、当業者に知られた標準的な技ｌｕｓ　 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−１内においてはｃｒ ＹＩＡ（ｂ）蛋白内で天然に生しることか見つかっている上記の２６アミノ酸の 欠失を含んでいる。ＤＮＡの完全な挿入セグメントは、アミノ酸をコードするた めのメイズ最適化コドン選択物を使用している。天然の欠失を修復するために使 用される２６アミノ酸は、上記の断片内に含まれる。それらは、ｐｃＩＢ４４３ ４のｎｔ　２１７０におけるＫｐｎ　［部位とｎｔ　２０５８　（ｐｃＩＢ５５ １１内の２５８６）におけるＸｂａ　１部位との間の２３８７位において開始を 挿入されている。ｐｃｉ８５５１１を、Ｓｐｈ［及びＫｐｎ　［によるｐｃ［８ ４４３４の制限消化により得られた３、　２Ｋｂ断片、５ｐｈｌ及びＸｂａ　ｌ によるｐｃｉ８４４３４の消化により得られた３、　８Ｋｂ断片、及びＫｐｎ　 ｌ及びＸｂａ　ｌにより、先に記載した合成りＮＡの消化により得られた４１６ 塩基対の断片を使用した３方結合を介して構築する。酵素反応を、標準的な条件 下で行う。結合後、ンを含むＬ−寒天上で選択する。形質転換細胞内のプラスミ ドを、標準的なミニ−スクリーン手順を使用して特徴ずける。ｃｒｙ［Ａ（ｂ） 温度（熱）安定性蛋白をコードしている修復ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の配列を、 図９中に記載する。 ｐｃｉ８５５１２の構築 このプラスミド構築物は、ｐｃｉ８４４３４の誘導体である。ｐｃＩ８５５１２ のマツプを、図１２中に示す。２６アミノ酸欠失を修復するためのＤＮＡを、Ｄ ＮＡ合成及び酵素反応の標準的な技術を使用して調製する。３つの２本鎖ＤＮＡ カセット、ｐＧＦｃａｓｌ　、ｐＧＦｃａｓ２及びｐＧＦｃａｓ３であってそれ ぞれ約３００塩基対のサイズのものを、調製する。これらのカセットは、メイズ 最適化コドンを含みながら殺虫性蛋白と１００％同じアミノ酸を維持するように 設計されている。これらのカセットは、１８２４位における制限部位ＢｓｔＥｌ ｌと２０５８位におけるＸｂａ　Ｉとの間の領域を置き換えるために使用され、 そして失われた２６アミノ酸（ｐｃＩ８４４３４中でｐｃＩ８５５１１について 先に記載したもの）をコードしている追加の７８塩基対の挿入を含んでいる。こ れらのカセットのそれぞれを、標準的な技術によりベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位中に部位−ン化する。３つのカセ ットは、重複した制限部位を含むように設計されている。カセットｌは、５′末 端における制限部位ＢｓｔＥＩ［及び３゛末端におけるＥｃｏＲＶをもち；カセ ット２は、５′末端におけるＥｃｏＲＶ及び３゛末端におけるＣ１ａＩをもち、 そしてカセット３は、５゛末端におけるＣ１ａｌ及び３′末端におけるＸｂａ　 Ｉをもつ。ｐＣＩ８５５１２を、この７６２塩基対断片を使用して結合させ、そ してＢｓｔＥＩＩによるｐＣＩＢ４４３４の完全消化及びＸｂａ　Ｉによる部分 消化により得られた６、６５にｂ断片とそれを結合する。あるいは、上記と同じ ベクターを使用した４方結合及び特異的酵素により消化した３つのカセットを使 用することができる。酵素反応を、標準的な条件下て行う。結合後、ＤＮＡ混合 物を、標準的な手順を使用してコンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞中に形 質転換させる。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むし一寒天 上で選択する。形質転換細胞内のプラスミドを、標準的なミニ−スクリーン手順 を使用して特徴ずける。得られたプラスミドは、ｐＣＩ８５５１２である。修復 ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の配列を、図１１中に例示する。 この修復されたｃｒｙｌＡ（ｂ）は、ｐｃｉ８５５１１内で行われたものとは異 なっており、ｐｃ［Ｂ５５１１内ては、ｃｒｙ［Ａ（ｂ）コード領域のより大き な領域がメイズ好適コドンの使用によりノイズの発現のために最適化されている 。 ｐｃｉ８５５１３の構築 このプラスミドは、ｐｃ１８５５１２から得られた修復されたｃｒＹＩＡ（ｂ） 遺伝子を含んでいる。ｐ（４Ｂ５５１３のマツプを、図１４中に示す。２５８６ 位におけるＸｂａ　１部位からこの遺伝子の末端（３５７２位における５ｇ１ｕ 部位）までの３′領域を、メイズ最適化コドンにより完全に置き換える。 この領域を、４つの２本鎖ＤＮＡカセット（カセット＃４．５．６．７）として 、当業者に知られたＤＮＡ合成及び酵素反応の標準的な技術を使用して、合成す る。隣接するカセットは、カセット間の結合を容易にするための重複した制限部 位をもっている。これらは、カセット４の５゛及び３°におけるＸｂａ　［及び Ｘｈｏ［：カセット５の、５゛及び３゛末端におけるそれぞれＸｈｏ［及び５ａ ｃｋ：カセット６の、５′及び３゛末端におけるそれぞれＳａｃ　Ｉ及びＢｓｔ ＸＩ；及び、カセット７の、５′及び３°末端におけるそれぞれＢｓｔＸＩ及び Ｂｇｌｌｌである。ｐｃＩ８５５１２のために記載したように、このカセットを 、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓ　ｔ　ｒａ　ｔａｇｅｎｅ）の平滑末端Ｅ ｃｏＲＶ部位中に部位−ン化し、そして完全長の“修復された”ｃｒｙｌＡ（ｂ ）遺伝子を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内の先のカセットの順次結合、その後の完全 ９６７塩基対合成領域と、ＢｇｌｌｌによるｐｃＩ８５５１２の完全消化及びＸ ｂａ　Ｉによる部分消化により得られた６４４８塩基対の断片との結合のいずれ かにより、クローン化する。あるいは、完全長遺伝子を含むプラスミドを、上記 の４つのカセットのそれぞれ（適当な酵素による解裂の後に）と上記と同じベク ターとの５−力結合により得る。二の完全長の、”修復された”ｃｒｙｌＡ（ｂ ）遺伝子を、図１３中に記載する。様々な合成及び合成／生来コード領域キメラ によりコードされている蛋白は、同一の蛋白をコードしている。この蛋白は、こ の相同的な領域をｃｒｙ［Ａ（ａ）又はｃｒｙ［Ａ（ｃ）バチルス・スリンギエ ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ−エンドトキ シン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（内毒素乃のいずれかと比較したとき、バチルス・ス リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）　からのｃ ｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子内に見つけられる天然の２６アミノ酸欠失を修復すること により作られるｃｒｙｌＡ（ｂ）の熱安定性の変異体である。 ｐｃ［８５５１４の構築 本プラスミドは、ｐｃＩＢ４４３４の誘導体である。ｐｃｉ８５５１４のマツプ を図１６中に示す。これを、２６アミノ酸の熱安定性領域内にあるＣｌａｌ部位 （２３９６位）とｐｃｉ８４４３４内の２５０８位（ｐｃＩＢ５５１１内の２５ ８６）におけるＸｂａ１部位との間の領域のメイズ最適化配列を含む合成りＮＡ カセット＃３（上記参照のこと）を使用して作る。ｐｃＩ８４４３４のｎｔ　２ １１３と上記の熱安定性領域の連結部との間の領域を、以下のプライマーをもつ テンプレートとしてｐｃＩ８４４３４を使用することによりＰＣＲ増幅する。 前進：５’　−ＧＣＡＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＴ ＧＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＡＧ−３゜復帰：５−ＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴＣＧＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＡＡＡＧ −３゛ ＰＣＲ生成物を次に制限酵素ｋｐｎｌ及びＣ１ａｌにより消化し、そしてＣ１ａ ［及びＸｂａ　［によるカセット３の消化により得られた１８９塩基対の断片、 ５ｐｈｌ及びＫｐｎｌにより消化されたｐｃｉ８４４３４の３．２Ｋｂ断片、及 びｓｐ旧及びＸｂａによる消化により得られたｐｃ［８４４３４の３．８にｂ断 片による４部反応において結合する。酵素反応を、標準的な条件の下で行う。 結合生成物を、アンピシリンにより選択されたコンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）中に形質転換し、そして先に記載したような標準的な手順を使用してスクリ ーンする。ｐｃＩ８５５１４内に含まれる修復されたｃｒｙ　［Ａ（ｂ）遺伝子 の配列を、図１５中に示す。 ｐｃｉ８５５１５の構築 ｐｃ［Ｂ４４３４を、先に記載した７８塩基対のＧｅ１ｓｅｒ熱安定性因子（Ｇ ｅｉｓｅｒ　ＴＳＥ）を、生来のＢｔｋ領域内のＫｐｎ　１部位（２１７０塩基 対）とＸｂａ１部位（２５０８塩基対）との間に添加することにより修飾した。 正確な挿入部位は、ヌクレオチド＃２３７９において開始される。Ｇｅ１ｓｅｒ 　ＴＳＥを含む領域を、２セツトのＰＣＲ反応物、すなわち、にｐｎｌ−Ｇｅｉ ｓｅｒ　ＴＳＥ断片及びＧｅ１ｓｅｒ　ＴＳＥ−Ｘｂａｌ断片により増幅した。 ＰＣＲブライｖ　−＃Ｉ：（Ｋｐｎ１部位）５’　−ＡＴＴＡＣＧＴＴＡＣＧＣ ＴＡＴＴＧＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧ−３’ＰＣＲブライ７−＃２：（Ｇｅ ｉｓｅｒ　ＴＳＥボトム）５−ＴＣＣＣＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡ　Ｇ ＴＣＴＡＧＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧＧ　ＡＧＣＧＣＡ ＴＣＧＡ　ＴＴＣＧＧＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴ　 ＧＧＧＧＣＴＧＡ−３゜ＰＣＲブライｖ−＃３：（Ｇｅｉｓｅｒ　ＴＳＥ　）　 ツブ）５’　−ＣＡＡＧＴＧＣＧＧＧ　ＧＡＧＣＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＣＧＣＴ ＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＣＣＧＧ　ＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧ　ＣＡ ＧＣＴＧＣＡＧＧ　ＧＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＣＣＡ　ＴＣＡＴＴＣ ＣＣ−３’ＰＣＲブライ７−＃４：（Ｘｂａ１部位）５°−ＴＧＧＴＴＴＣＴＣ Ｔ　ＴＣＧＡＧＡＡＡＴＴ　ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣ−３’増幅後、ＰＣＲ断片を 、それぞれ（Ｋｐｎｌ　＋　Ｃ１ａｌ）及び（ＣＩａ［＋　ＸｂａＩ）により消 化させた。これらの２つの断片を、Ｋｐｎｌ及びＸｂａ　［消化ｐｃ［Ｂ４４３ ４に結合させた。得られた構築物ｐｃ［Ｂ５５１５は、Ｇｅ１ｓｅｒ　ＴＳＥを もツｐｃ［Ｂ４４３４であり、そして余分なＣｌａｌ部位がＫｐｎ　Ｉ及びＸｂ ａ　［に隣接している。ｐｃＩＢ５５１５のマツプを、図３８中に例示する。本 明細書中に含まれるｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子であって熱安定性の（ｒｙｌＡ（ｂ ）蛋白をコードしているものを、図３７中に示す。 以下に述べる例９−２０は、髄−好適（ｐｉｔｈ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモ ーターの単離及び特徴付けに向けられている。 例９：　ＲＮＡ単離及びノーザン・プロットＲＮＡのすへてを、グリーンｔｚｒ ”ｔス条件下で栽培した植物から単離する。全ＲＮＡを、Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　９０：１２１４−１２２０中に記 載されたように、Ｆｕｎｋメイズ系５Ｎ９８４０以下の組織から単離した・８、 比１５．２５．３５．４０、及び６０日口のグリ−ジノ１ウスの葉、８、比１５ ．２５．３５．３９．４６．６０及び７０日口の髄；Ｆｕｎｋメイズ系５Ｎ９８ ４からの６０及び７０日口の支詩板、６０及び７０日口の５Ｎ９８４鞘及び穂の ストック。また、ＲＮＡを、１４日口の２１１Ｄ根から、そして受粉後１〜５週 間の間、１週間毎の発育種から単離した。ポリＡ　＋　ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄ。 ）、　＋９８９により記載されているようなオリゴ−ｄＴを使用して単離し、そ してまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、により、全ＲＮＡ（３０μｇ）又は ポｌＪＡ＋ＲＮＡ（２−１０μｇ）のいずれかを使用してノーザン・プロ・ソト を行った。 電気泳動の後、ＲＮＡを、Ｎ１ｔｒｏｐｌｕｓ　２０００膜（Ｍｉｃｒｏｎ　５ ｅｐａｒａｔｉｏｎｓＩｎｃ）上にプロットした。このＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａ ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して０．２ｍジュールにおいてそ のフィルターに結合させた。このノーザンを、ＴＢＥバッファー系中の０．８％ の低融点アガロースを使用して単離した１２００塩基対のＥｃｏＲｌ髄（Ｔｒｐ Ａ）８−２　ＣＤＮＡ断片によりプローブした。ノーザンをハイブリダイズさせ 、そして洗浄し、そしてこのフィルターをｃＤＮＡクローンの単離において記載 したようにフィルムに露出させた。 例１０：　ｃＤＮＡクローンの単離 第一ストランドｃＤＮＡ合成を、供給者（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 、　Ｉｎｃ、。 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）により特記された条件を使用してＢＲＬ　 ＡＭＶ逆転写酵素を使用して行った。特に、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ ８，３，２０ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＤＴＴ　、　６ｍＭλＩｇｃ１２．１ｍλ （のそれぞれのｄＮＴＰ、　Ｏ，１ｍＭオリゴ（ｄｔ）１２−１８．２　μｇの 髄ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ　、　１００　μｇ／ｍｌのＢＳＡ　、　５０μｇ／ｍｌ のアクチノマイシンＤ、８ユニツトの胎盤性（ｐｌａｃｅ口ｔａｌ）ＲＮａｓｅ インヒビター、トレーサーとしてのＩ　ｕ　Ｉ　（１０ｍＭ　Ｃｉ／ｍｌ）　” 　Ｐ　ｄＣＴＰ＞３０００　ｍＣｉ／ｍＭ、及び３０ユニツトのＡＭＶ逆転写酵 素を含む２５μｍの反応物を、４２°Ｃにおいて３０分間インキュベートした。 追加のＫＣＩを、５０ｍＭの濃度まで添加し、そしてインキュベーションを４２ °Ｃにおいてさらに３０分間続けた。ＫＣＩを、再び添加し、１００ｍＭの最終 濃度にする。 他の成分に追加のｌＯユニットを加えたものの出発濃度を維持するために追加の ＡＭＶ逆転写酵素反応バッファーを添加し、そしてインキュベーションを、４２ °Ｃてさらに３０分間続けた。第二ストランド合成を、ＥｃｏＲＩ　リンカ−を 含むＲｉｂｏｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ合成系（Ｐｒｏｍｅｇａ、λ１ａｄｉｓ。 ｎ、　Ｗ［）を使用して行う。２本！ＪＩｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ 　ａｌ、、中に開示されたようなＴｒｉｓ−ボレー１−　ＥＤＴＡバッファーを 使用して１％アガロース・ゲル上でサイズ決定され、そして平均サイズ約１．２ Ｋｂを示していた。このｃＤＮＡを、供給者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　 ５ｃｈｕｅｌｌ）により特定された条件を使用して約１０００以上の塩基対のそ れらの分子を保持するようにＮＡ４５　ＤＥＡＥ膜を使用してサイズ分画した。 サイズ分画されたｃＤＮＡを、Ｌａｍｂｄａ　Ｚａｐ［［ベクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中に結合し、そしてＧｉｇａｐａｃ ｋ　ＩＩ　Ｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を 使用してラムダ粒子中にパッケージングした。この未増幅ライブラリーは、３１ ５．０００ｐｆｕのタイターをもち、一方、増幅されたライブラリーは、ＰＬＫ −Ｆ’細胞を使用して３．５ピリオン／ｍｌのタイターをもっていた。 組換えファージを、１５０　ｘ　１５ｍｍ　Ｌ−寒天プレート上に５０００　ｐ ｆｕの密度においてブレーティングした。５０．０００ファージの全部を、それ ぞれのプレートから２連リフトを使用してスクリーンし、そして第一ストランド ＤＮＡのプローブを髄誘導ｍＲＮＡ又は種誘導ｍＲＮＡのいずれかから作った。 このリフトを、ニトロセルロース・フィルターを使用してＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅ ｔ　ａｌ、中に記載したように行った。ＤＮＡを、０．２ｍジュールにおいてＳ ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）を使用してｔＪＶ架橋形成によりこのフィルターに固定した。このフィルター の前ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、１０ＸＤｅｎｈａ ｒｄｔｓ溶液、１５０　μｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ　、１％ＳＤＳ　、５０ ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、６Ｘ　５ＳＣ１０，０５％ピ ロリン酸ナトリウムの溶液中で行った。前ハイブリダイゼーションは、６２°Ｃ において４時間であり、そしてハイブリダイゼーションは、４０ｍ１の容量にお ける１　ミリオンｃｐｍ／ｍｌにより、６２°Ｃにおいて１８時間（−夜）であ った。フィルターを、室温において１５分間、２Ｘ　５ＳＣ１０，５％ＳＤＳの ５００ｍ１中で、次に３０分間、Ｏ，１Ｘ５ＳＣ１０，５％ＳＤＳ中で６３°Ｃ において洗浄した。 放射ラベルされたＤＮＡプローブを、ＢＲＬランダム・プライム標識付は装置を 使用して行い、そして非取り込みカウントを、Ｎ１ｃｋカラム（Ｐｈａｒｍａｃ 　ｉａ）を使用して除去した。フィルターを、−８０°Ｃにおける（Ｄｕｐｏｎ ｔ）Ｃｏｒｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ増感スクリーンにより、Ｋｏ ｄａｋＸ−Ｏｍａｔ　ＡＲＸ−線フィルムに一夜露出させた。種誘導プローブと ではなく髄誘導プローブとのハイブリダイゼーションを示すプラークを、さらに 特徴付けするためにプラーク精製した。 例１１ニゲツム・クローンの単離 Ｆｕｎｋ同系メイズ系２１１ＤからのゲノムＤＮＡを、５ｈｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ ｌ、　Ｃｅ１１゜３５：２２５−２３３（１９８８）により記載されているよう に単離した。このＤＮＡを、Ｓａｕ　３Ａにより部分的に消化し、そして次にＢ ｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４０ローター内て２２．００Ｏｒｐｍにおいて２０時間、２ ０″Ｃにおいて遠心分離した、１゜−４０％シュクロース・グラジェント上でサ イズ分画した。９−２３にｂのレンジ内の両分をプールし、そしてエタノール沈 降させた。ＢａｍＨ［により切断されたしａｍｂｄａ　Ｄａｓｈ　ｌ［（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）を、供給者により記載されているように使用した。このライブ ラリーを、未増輻スクリーンし、そして３００．０００ｐｆｕのすべてを、先に 記載した条件を使用してスクリーンした。このライブラリーを、髄特異的（Ｔｒ ｐＡ）ｃＤＮＡクローン８−２を使用してプローブし、ｐｃＩＢ５６００を、ｃ ＤＮＡライブラリーの差異に基づくスクリーンにおいて同定した。単離されたク ローンを、プラーク精製し、そして大規模ファージ調製を、供給者により記載さ れているようなＬａｍｂｄａｓｏｒｂ（Ｆｒｏｍ＋４ａ）を使用して作った。単 離したゲノム・クローンを、ＥｃｏＲＩにより消化し、そして４．８ｋｂのＥｃ ｏＲＩ断片を、ＢｌｕｅＳＣｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサ ブクローニングした。 例１２：　ＤＮＡ配列及びコンピューター分析ヌクレオチド配列決定を、Ｓａｎ ｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ、７４：５４６３−５４６７（１９７７）中 に開示さあれでいるようなジデオキシ連鎖停止法を使用して行った。配列決定プ ライマーを、標準的な条件を使用してＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍ ｏｄｅｌ　３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザー上で合成した。配列決定反応を、５ ｅｑｕｅｎｃｅ装置（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａａｌ　Ｃｏｒｐ、）を使用し て行った。ゲル分析を、Ｔｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡバッファー中の７Ｍ尿素 を含む６％ポリアクリルアミドの４０ｃｍゲル（ＢＲＬ　Ｇｅｔ−Ｍｉｘ　６） 上で行った。 配列の分析及びＧｅｎｅＢａｎｋ内の配列との比較を、ＷｉＳＣｏｎｓｉｎ大学 のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＵＷＧＣＧ）を使用して行った。 例１３：　転写開始部位のマツプ作成 プライマー伸長を、Ｍｅｔｒａｕｘ　ｅｔ　ａｌｌ、　ＰＮＡＳ、８６：８９６ −９００（１９８８）の手順に従って行った。簡単に言えば、３０μｇのメイズ 髄全ＲＮＡを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７°５．４０ｍ＾ＩＫｃＩ、３ｍＭ　 ＭｇＣ１２（ＲＴバッファー）中で８０°Ｃまて１０分間加熱し、そして４２° Ｃまで冷却することによりプライマーとアニーリングさせた。このＲＮＡ／プラ イマー混合物を、−夜ハイブリダイゼーションに供した。追加のＲＴバッファー 、６ｍＭまでのＤＴＴ　、Ｏ，］ｍｇ／ｍｌまてのＢＳＡ　、　４　Ｕ／ｍｌに おけるＲＮＡ５ｉｎ及び１ｍλ（におけるｄＮＴＰ’　ｓをそれぞれ添加した。 次に、８ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素を、添加し、そして反応物を、３７°Ｃに おいて１時間静置した。使用したプライマーは、５−ＣＣＧＴＴＣＧＴＴＣＣＴ ＣＣＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＧ−３°てあり、これは、上記の転写開始に比較して ＋９０塩基対において開始させる。図２９Ａを参照のこと。プライマー伸長反応 におけるものと同じプライマーを使用した配列決定ラダ一つを、４．８Ｋｂゲノ ム・クローンを使用して作り、その転写開始部位の決定を可能にした。この配列 決定反応を、例１２中に記載したように行った。 ＲＮａｓｅ保護を、＋２から＋３７３塩基対（ｃＤＮＡの開始）までの３７１塩 基対の配列が連続しているか又はそれが１以上のイントロンを含むかどうかを決 定するために使用した。図２９８に見られる転写開始に比較して＋２塩基対〜＋ ３８７塩基対にわたる３８５塩基対の５ｐｈｌ−Ｎｃｏ［断片を、ｐＧＥλｌ− ５Ｚｆ　（＋）　（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化し、そしてＳＰ６プロモー ターからのＲｉｂｏｐｒｏｂｅ　Ｇｅｍ１ｎｉ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を使用して転写し、供給者により記載されているように放射性アンチセンスＲ ＮＡプローブを作った。ＲＮａｓｅ保護を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、中 に記載されているように行った。（Ｈｐａ　［Ｅにより切断され、そして２”Ｐ −ｄＣＴＰにより標識されている）ｐＢＲ３２２及びＫｌｅｎｏｗ断片を、分子 量マーカーとして使用した。ゲルは、６％アクリルアミド／７Ｍウレア（ＢＲＬ 　Ｇｅ１−Ｍｌｘ　６）てあり、そして６０ワツト定電力において走らせた。 例１４ニゲツムのサザン・プロット ゲノムＤＮＡを、５ｈｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ、前記の手順を使用してノイズ系２１ 】Ｄから単離した。８μｇのゲノムＤＮＡを、それぞれの制限酵素消化のために 使用した。以下の酵素を、供給者により提案されたバッファー中で使用した：　 ＢａｍＨｒ、ＥｃｏＲｒ　、　ＥｃｏＲＶ　、　Ｈｉｎｄ［［Ｉ　、及びＳａｃ 　［。髄ｃＤＮＡクローン数８−２を、遺伝子コピー数を推定するために使用し た。 消化したＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ボレート−ＥＤＴＡバッファー系を使用して０゜ ７％アガロース・ゲル上で走らせた。このゲルを、２５０ｍＭ　ＨＣＩにより１ ５分間、前処理し、高分子量ＤＮＡの転写を容易にした。このＤＮＡを、Ｎｉ　 ｔｒｏｐｌｕｓ　２０００Ｍに転写し、そして次に髄ｃＤＮＡ　８−２によりプ ローブした。このプロットを、例１０中に記載したように洗浄した。 例１５：　ＰＣＲの材料及び方法 ＰＣＲ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット及びＡｍｐｌｉＴａｑ組 換えＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を 使用して行った。反応条件は、以下のようなものであった：反応毎に使用する０ 、１〜０．５μＭのそれぞれの上記の２つのプライマー、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 内の２５ｎｇの髄４．８Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片、加えて０．５ｍＬ　ＧｅｎｅＡ ｍｐ反応チューブ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）内の全容量５０μｌ のための供給者により記載されているようなＰＣＲ混合物。ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍ ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）は、９４°Ｃ６ ０秒間の解裂、５５°Ｃ６０秒間のアニール、及び７２°Ｃ４５秒間、その後の 全３０サイクルの間のサイクル当たり３秒間の伸長のために、設定された５ｔｅ ｐ−Ｃｙｃｌｅプログラムを使用していた。以下のプライマーのセットを使用し た：　１．８３１８４．−４２９塩基対〜−２塩基対：１Ｌ４９　Ｘ　７３．− ６９塩基対〜＋９１塩基対：　ＩＩｌ、　３８　ｘ　４１．　＋１３６塩基対〜 ＋２５８塩基対：及びｌＶ、　４０　Ｘ　７５．　＋２３９塩基対〜＋３７２塩 基対。これらを、図２４上にマークした。 例１６：髄好適遺伝子の単離 ｃＤＮＡライブラリーを、Ｌａｍｂｄａ　Ｚａｐ中（−、クローン化された髄ｍ ＲＮＡから得て、そして髄又は種ｍＲＮＡから得られた第一ストランドｃＤＮＡ を使用っしてスクリーンした。髄プローブのみと７％イブリダイズしたクローン をプラーク精製し、そして再びスクリーンした。第ニスクリーンを通過したクロ ーンを、各種ノイズ組織からのＲＮＡを含む、ノーザン・プロットにおけるプロ ーブとして使用した。 例１７：遺伝子構造及び配列分析 ｃＤＮＡクロー：／８−２の１．２Ｋｂ挿入物を、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、前記のジデオキシ法を使用して配列決定した。同様に、Ｉ）ＣＩ８５６０１と して名付けたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内の４．８にｂ　ＥｃｏＲＩ断片上に含まれ るゲノムの等傷物を、配列決定した。この情報は、このコード領域のゲノムのコ ピーがｌ。 ７　Ｋｂにわたり、そして５つのイントロンを含んでいることっを明らかにした 。このｍＲＮＡ転写物は、６つのエクソンを現した。これを、図２４中に示す。 このエクソンは、４３塩基対から３１３塩基対までのサイズ内に範囲にあり、そ してイントロンは、７６塩基対から１３０塩基対までのサイズ内で変動している 。この遺伝子の完全な配列及びその対応する推理アミノ酸配列を、図２４中に示 す。 この遺伝子は、約３８　ｋＤの分子質量をもつ３４６アミノ酸の蛋白をコードし ている。表１中に示すように、予想される蛋白は。シュードモナス・アエルギノ サ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のサブユニット蛋白との ６２％類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）及び４１％同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ） を示しており、そして他の生物からのｔｒｐＡ蛋白と高い相同性をもっている。 メイズＴｒｐＡ遺伝子と他の生物との間のＴｒｐＡ配列の保存比較生物　％アミ ノ酸　％アミノ酸 類似性　同一性 へ０フエラブクス・　ｆランノ （Ｈａｌｏｆｅｒａｘ　ｖｏｌａｎｃｉｉ）　５６．４　３６．１メタノコフカ ス　・　ボルタエ （Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｏｌｔａｅ）　５８．１　３５．１ツユ−ト モナス　・　アウルギノサ サブ力０ミセス　・　セレビシェ 類似性及び同一性は、ｔＪＷＧｃＧからのＧＡＰプログラムを使用して行った。 Ｃｒａｗｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、、　４３：５６７−６００　（１９８９）であって本明細書中に引用により取 り込むものは、バクテリアｔｒｐＡ遺伝子内の変換されたアミノ酸の領域を発見 した。ＴｒｐＢ配列内に見られるよりも大きな変異性（ｖａｒｉａｂｉ　１１ｔ Ｙ）を示す、遺伝子の休止をもつ、アミノ酸４９〜５８、アミノ酸１８１−１８ ４　、及びアミノ酸２１３〜２１６が存在する。メイズＴｒｐＡ蛋白（示されて いない）をもつ知られたｔｒｐＡ蛋白の列は、ノイズ遺伝子と他のけｐＡ蛋白と の間の相同性がかなりのものであることを説明している。また、それは、他のＴ ｒｐＡ蛋白が互いにＣｒａｗｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されたよう に比較されたとき、観察される相同性のレベルに匹敵する。 転写開始部位の位置を、そしてこの領域にイントロンが存在するかどうかを決定 するために、領域−４２９塩基対から＋３７２塩基対までの約１２２塩基対〜４ ２７塩基対の４つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成断片をＪメーザ２分析 のために使用した。ノーザンの結果は、ＰＣＲプローブ１１、＋１１　、［Ｖが 髄の全ＲＮＡにハイブリダイズし、そしてＰＣＲプローブＩがハイブリダイズし ないことを示した。これは、その転写開始が一６９塩基対〜＋９０塩基対の領域 内にあることを示していた。その転写開始部位をより正確に位置決めするために 、プライマー伸長を使用した。図２９Ａは、転写開始に比較して＋９０塩基対に 位置するプライマー（＃７３）がプライマー伸長のために使用されるとき、その てんしゃあ開始部位が＋１１すなわち、そのゲノム配列上の７２６塩基対に位置 していることを示している。 転写開始部位からの第一のＡＴＧは、＋１１４塩基対にある。これは、翻訳開始 のための部位として役立つと予想されるであろうＡＴＧである。このＡＴＧは、 ｃＤＮＡクローン内で見つかったオーブン・リーディング・フレーム中に走り込 むオープン・リーディングを開始させる。 この予言オーブン・リーディング・フレームの第一の６０アミノ酸は、クロロプ ラスト過渡的ペプチドに強く類似している。ＢｅｒＬｙｎ　ｅｔ　ａｔ。 、　５：９−１３　（１９８６）を参照のこと。この結果は、この蛋白がブラス チドに対して標的化されており、そしてたぶん活性蛋白を作るように加工される ということを示唆している。ｔｒｐＡプロモーターにより駆動されたメイズ最適 化Ｂ、　ｔ、遺伝子を使用したメイズ葉肉（ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ）プロトプラス ト系における過渡的発現検定は、＋１１４塩基対におけるＡＴＧがその融合点と して使用されるとき、最も高いレベルの発現が得られるということを示していた 。その配列内の次の２つのＡＴＧのいずれかの使用は、そのリポータ−遺伝子の 発現のレベルを実質的に減少させる。＋３９０塩基対におけるＡＴＧは、いくっ がの活性を与えるが、＋１１４　ＡＴＧよりも非常に低いレベルであり、そして ＋２０１塩基対におけるＡＴＧは、活性を全く与えない。 多数のＴＡＴＡ様ボックスが＋１塩基対における転写開始部位の上流に配置され ているけれども、−１３２塩基対におけるＴＡＴＡＡＴは、ＴＡＴＡＡＡの植物 コンセンサスに非常に類似している。Ｊｏｓｈｉ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、。 １５：６６４３−６６５３　（＋９８７）を参照のこと。仮定のＣＣＡＡＴ様ホ ックスは、−２３１塩基対において発見された。ＡＴＧ開始の周囲のヌクレオチ ド配（１９８３）中に記載されているような他のメイズ翻訳開始に対する相同性 をもつか、植物内のコンセンサス配列と考えられるもの（ＡＮＮＡＴＧＧＣ）と は異なっている。Ｊｏｓｈｉ、上記を参照のこと。仮定のポリ（Ａ）付加シグナ ルは、そのゲノム配列上の３７１９塩基対、ｃＤＮＡの末端から５２２２２９− ２２４０　（＋９８６）を参照のこと。そのｃＤＮＡの３°未翻訳配列は、その ゲノム配列上の３７７５塩基対において終了する。 図２８は、髄遺伝子８−２　ｃＤＮＡを使用して再構築されるときの、おおよそ の遺伝子コピー数をもつメイズ２１１ＤゲノムＤＮＡのサザン・プロットを示し ている。制限消化及び再構築からは、ハブロイド・ゲノム毎に存在するｌ−２コ ピーの遺伝子が存在するよっである。この遺伝子と低いレベルの相同性をもつ他 の遺伝子は存在しないようである。それ故、これは、メイズ内においてユニーク 又は少数の遺伝子ファミリーを現している。 例１８：　ＲＮａｓｅ保護 ｍＲＮＡの５゛末端の構造を、ＲＮａｓｅ保護を使用して決定した。ＲＮａｓｅ 保護を、＋２塩基対から＋３８７塩基対までの３８５ｎｔを現しているプローブ を使用して行った。このゲノム・クローンからの上記領域を、ＲＮＡ転写ベクタ ーｐＧＥＭ−５Ｚｆ　（＋）内に配置し、そしてｊ２ｐ標識ＲＮＡプローブをＳ Ｐ６ポリメラーゼを使用して作った。このプローブ及び多クローニング部位から の余分の塩基は、４６１　ｎｔの転写を作り出す。このプローブを、金儲ＲＮＡ とハイブリダイズし、そしてその後ＲＮａｓｅＡとＴＩとの混合物により消化し 、そして保護断片を、変性ポリアクリルアミド・ゲル上で分析した。このゲルの 分析は、約３５５　ｎｔの保護断片及び約１６０　ｎｔの他の断片を示している 。図２９Ｂを参照のこと。 ＋８０塩基対におけるプライマー（＃７３）を使用したプライマー伸長が長さ９ ０　ｎｔの生成物を作り出すという事実は、その転写の５′末端が＋Ｉ塩基対の 位置にあるということを立証している。この領域内のプライマーからのプライマ ー伸長は、生成物を作り出し、そのように、ある者は、これがまたＲＮａｓｅ保 護検定により検出されることを予想するであろう。このプライマーは、ＲＮａｓ ｅ保護プローブの５′領域内に位置している。このｃＤＮＡクローンは、ＲＮａ ｓｅ保護プローブの３′末端内に存在する配列を含み、そしてこの故にこの検定 において保護されることが予想された。ただ１つのバンドが、これらの配列の両 方を説明することができるであろうゲルの上に存在するので、我々は、保護断片 が実際、より大きなバンドであり、そしてより小さな単一バンドか人工産物であ ることを確信している。この領域内にイントロンがある場合には、それぞれの末 端からの断片は、そのプローブ内に存在するであろうし、そしてこれ故にそのゲ ル上で検出可能であろう。観察された２つのバンドの中で、それらの中の１つは 、完全な５°領域を現しているようであり、それ故、我々は、この領域内に位置 するイントロンがあることを信じていない。 例１９：髄ｃＤＮＡ　８−２による大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＴｒｐＡ突然変異 体の相補性であってＭａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、λｌｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ ｅｔ、、　１３７：１３１−１４２（１９７５）中に記載されているような染色 体マーカーｇｌｎＡ３　、ＴｒｐＡ９８２５、Ｉ−、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ ）　、ｔｈｉ−１をもつものを、髄（ＴｒｐＡ）ｃＤＮＡ　８−２又はＳａｍｂ ｒ。 ｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されているようなり１ｕｅｓｃｒｉｐｔプラ スミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のいずれかにより形質転換した。ＴｒｐＡ　ｃ ＤＮＡ　８−２を含む形質転換細胞は、最小培地上のトリプトファンの存在なし て増殖する能力をもち、一方、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）による形質転換細胞又は非形質転換対照は、トリプトファンなしては 増殖することができなかった。メイズＴｒｐＡ遺伝子により形質転換された細胞 は、非常にゆっくり増殖し、コロニーは、室温において数日間の増殖の後見える ようになった。すべての株を、２０μｇ／ｍｌのグルタミンの有無にかかわらず ２００μｇ／ｍｌグルタミン、０．Ｏ１μｇ／ｍｌチアミンを補われたＭ９最小 培地上で増殖させた。形質転換細胞のすべてを、制限酵素分析により適切なプラ スミドの存在についてチェックした。 トリプトファンの存在中で増殖するコロニーは、すへて、サザン・ハイブリダイ ゼーションにより確認するように（データを示さず）、推定のメイズＴｒｐＡ遺 伝子のためのｃＤＮＡを含むクローン８−２を含んでいた。これらの結果は、こ れがノイズ・トリプトファン・シンターゼ・サブユニットＡ蛋白であるという結 論を支持している。 例２０：遺伝子発現 植物の全体にわたる髄−選択的（ｐｉ　ｔｈ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ）遺伝 子の発現パターンを、調査した。また、異なるノイズ遺伝子型を、この遺伝子の 発現のパターンについて調査した。以下の組織を、これらの研究のためのＲＮＡ 源として使用した：遺伝子型５Ｎ９８４内の、髄の上部、中央、及び下部（ｕｐ ｐｅｒ、　ｍ１ｄｄｌｅ、　ａｎｄ　ｌｏｗｅｒ　ｐｉｔｈ）　、支詩板（ｂｒ ａｃｅ　［ｏａｔｓ）　、穂（ｅａｒ）　、葉柄（ｓｈａｎｋ）　、穂軸（ｃｏ ｂ）　；遺伝子型２１１Ｄ内の、植物全体からの、髄の上部、中部、及び下部、 １０日目の葉（ｌＯｄａｙ　ｏｌｄ　１ｅａｖｅｓ）　、１４日目の根及び髄、 そして受粉後１〜５週間の１週間毎に収穫された遺伝子型２１１０からの種。髄 下部は、支詩板の上方の２つの部間（ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ）から生じており、す なわち、構成されており：髄中部は、次の３つの部間から生じており；髄上部は 、６０及び７０日目の植物の雄穂（ｔａｓｓｅｌ）の前の最後の２つの部間を現 している。２つの部間のみが、３９日目の植物内に存在し、そして４６日目の植 物については３つの部間が在る。ノーザン・プロット分析は、髄ｃＤＮＡから得 られたプローブとハイブリダイズする転写物が若い髄及び若い葉内て急激に蓄積 することを示している。植物の齢が増し、そしてそれが茎（ｓｔａｌｋ）まて成 長したとき、検出される転写の量における存意な減少が在る。図２５Ａ−Ｄを参 照のこと。種誘導体ＲＮＡ内で検出されたの遺伝子からのメツセージ、すなわち 、全ＲＮＡ又はポリＡ　＋　ＲＮＡのいずれかは、全くない。図２６を参照のこ と。また、転写は、根、穂葉柄、及び靴内て検出されたが、髄及び幼葉組織内で 検出されたような高いレベルではなかった。図２５Ｂ　、２５Ｃを参照のこと。 いくつかのメツセージは、支持機内で検出されるが、非常に低いレベルであった 。図２５Ｄを参照のこと。６つのノイズ未分化カルス系を、ノーザン・プロット により分析し、そしていずれのカルス・サンプル内においてもこの遺伝子につい ての発現は全くなかった（データを示さず）。この遺伝子の発現のレベルは、非 常に高い。 なぜなら、ＴｒｐＡ遺伝子８−２からのプローブに対する非常に強いシグナルを 、フィルムに対するこのプロットの露出の後の２時間程の少ない時間の間に髄及 び葉内て検出することができる（図２１Ａ）。作られたｍＲＮＡの量は、Ｈｕｄ ｓｐｅｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２： ５７９−５８９　（＋９８９）、他の高発現ノイズ遺伝子（Ｈｕｄｓｐｅｔｈを 引用により本明細書中に取り込む）中に開示されているようなノイズ・ホスホエ ノールピルベート・カルボキシラーゼ遺伝子から生じたものに匹敵する。 この遺伝子の発現パターンは、一時的に一定ではない。発現は、６０日日目満の 植物の髄下部及び中部内で非常に高く、そしてその植物の頂上付近で急激に減少 している。植物が成熟に達したとき、例えば、７０日ＩＤ超えるとき、この発現 は、髄下部及び穂葉柄を除き、はとんど検出できないレベルまで低下する。幼葉 内の転写物の蓄積は、髄下部内で見られるものとほとんど同じ程高いが、発現は 急激に減少し、そして４０日齢を超える葉内では検出てきない。葉内の発現は、 それが成長するときの季節に依存して変動することが見つけられた。 以下に述へる例２１−３９は、本発明に記載の花粉特異的プロモーターの単離、 特徴付は及び発現に向けたものである。 花粉特異的蛋白の同定 例２１：　メイズ植物の成長 メイズ植物（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｆｕｎｋ　１ｎｂｒｅｄ　２１１Ｄ）を、グリ ーンハウス内でバーミキュライト／砂混合物内で、明１６時間／暗８時間の管理 下で種から栽培した。 例２２：全花粉蛋白の単離 成熟した花粉を、最大花粉はしけ軸ａｘｉｍｕｍ　ｐｏｌｌｅｎ　５ｈｅｄ）の 時間においてメイズ植物から単離した。それを、殻を除去するために篩、液体窒 素内で凍結させ、そして３−４ｍ１容量の凍結花粉を、すり鉢内で粉砕し、そし て等容量の７５−１５０μｍのガラス・ビーズで擦った。 ４０ｍ１の粉砕バッフ−ｒ−（２ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５ｍＭ　ＤＤＴ　、　０ ．１％ＳＤＳ、　１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ８）を添加し、そしてこの混合 物を再び粉砕した。ガラス・ビーズ及び無傷の花粉粒を、低速遠心分離によりペ レット化し、そして混合物を、１０．０００　ｇで１５分間、遠心分離により清 澄化した。蛋白を、９０％までアセトンを添加することによりその上澄液から沈 殿させた。 ９−１７８　（１９８５）中に記載されているようなノイズ２１１０はじけ花粉 から単離した。 例２４：葉蛋白の単離 幼葉（約６０％成長）を、ノイズ植物から切り、その中央脈（ｍｉｄｒｉｂ）を 除去した。全蛋白を、花粉についてと同じように単離した。但し、その材料を、 凍結せず、そして粉砕は、ガラス・ビーズを伴わないＷａｒｉｎｇブレンダー内 でのターであった。 例２５：粒（ｋｅｒｎｅｌ）蛋白の単離穂が十分に成長しているが未だ湿ってい る粒を、その植物から取り除き、そしてその粒を、メス（ｓｃａｌｐｅｌ）で切 断した。全蛋白を、葉についてと同しように単離した。 ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）中に記載されているようにＳＯＳポリアクリルア ミド・ゲル上て分離した。Ｃｏｏｍａｓｉｅブルーによる染色の後、花粉、葉及 び粒からの蛋白バンドを、比較し、そして約１０　ｋＤ　、　１３ｋＤ、２０ｋ Ｄ、４５ｋＤ、５５ｋＤ及び５７ｋＤの大量の蛋白が花粉特異的であることが測 定された。 花粉特異的ｃＤＮＡクローンの同定 例２７　花粉特異的蛋白の部分的配列の決定花粉特異的であることが決定された 蛋白バンドを、ＰＶＤＦ膜上のポリアクリルアミド・ゲルからのエレクトロブロ ッティング（λ１ａｔｓｕｄａｉｒａ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　２６１＋１００３５−１００３８（１９８７））により又は逆相ＨＰＬＣに より精製した。この精製された蛋白のＮ−末端配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ気相シーケンサ−による自動エドマン分解により決定 した。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　１２０Ａ　ＰＴＨアナライザーを使用して同定した。内部配 列を得るために、蛋白を、酵素：基質比１：１０を使用して室温において、０． １Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐ）Ｉ　８．５中で、２４時間、エンドプロティ カーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化した 。得られたペプチドを、０．１％ＴＦＡ中の、線型アセトニトリル／イソプロパ ツール（１：ｌ比）グラジェント（０〜６０％）による溶出させるＡｑｕａｐｏ ｒｅ　Ｃ−８カラムを使用したＨＰＬＣにより単離した。単離したＬｙｓ−Ｃペ プチドの配列を、上記のように決定した。以下の配列を、１３ｋＤの花粉特異的 蛋白について決定した： Ｎ−末端：　ＴＴＰＬＴＦＱＶＧＫＧＳＫＰＧＨＬＩＬＴＰＮＶＡＴｒＬｙｓＣ ６１：　ＫＰＧＨＬＩＬＴＰＮＶＡＴＩＳＤＶＶＩにＬｙｓＣ５４：　５ＧＧＴ Ｒ［ＡＤＤＶＩＰＡＤＦＫＬｙｓＣ４９：　ＥＨＧＧＤＤＦＳＦＴＬＫＬｙｓＣ ４３：　ＥＧＰＴＧＴＷＴＬＤＴＫ合成 低コドン冗長性（ｃｏｄｏｎ　ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）をもツ１３ｋＤ蛋白内の ペプチド配列の領域を、選択し、そしてこれらの領域をコードしている遺伝子の ための好適なオリゴヌクレオチド・プローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　３８０Ａシンセサイザー上で合成した。以下のオリゴヌクレオチドを 、合成した： すりゴ＃５１　５’　−ＡＡ　ＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＴＴＣ−３゜ ＧＧＧＣ 才ＩＪゴ＃５８　５−ＣＣＴＴＴ　ＡＣＣＣＡＣＴＴＧ　ＡＡＡ−３’ＣＧ　Ｃ Ｇ に こで、ヌクレオチドの列は、そのオリゴ内の図示した位置において等しい割合で ランダムに取り込まれている塩基を表している。オリゴ＃５１は、ペプチド１ｙ ｓｃ　４９内て見っがったアミノ酸配列ＥＨＧＧＤＤＥをコードしており、そし てオリゴ＃５８は、ペプチドＮ−末端内で見つかったアミノ酸配列ＰＱＶＧＫＧ をコードしている。花粉特異的遺伝子のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリー ンするためのこれらの混合オリゴヌクレオチドの使用を以下に記載する。 匹η：メイズ花粉ｃＤＮＡライブラリーの構築ノイズ２１＋Ｄはじけ花粉からの 全メイズＲＮＡを、Ｇ１１ｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　１３：２６３３−２６３７　（１９７４）中に記載されているように単離した 。ポリＡ　＋　ｍＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、中に記載されてい るように全ＲＮＡから精製した。このｍＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを、そのキ ットと共に供給された手順書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したｃＤＮＡ合 成キットを使用して調製した。このＥｃｏＲＩ　リンカ−を、このｃＤＮＡに添 加し、そしてそれを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入したクローニング・ベクタ ー・ラムダＺａｐ中に、製造者により供給された手順書に従って結合させた。こ の結合生成物を、これもまたＳｔｒａｔａｇｅｎｅがら購入したｃｏｌ丑ＢＢ４ 細胞に感染させるために使用した。 ノイズ花粉ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、中に記載 されているように、１３ｋＤ蛋白遺伝子に特異的な合成オリゴヌクレオチド・プ ローブを使用してプローブした。簡単に言えば、花粉ｃＤＮＡライブラリーの約 １００．０００のファージ・プラークを、ブレーティングし、そしてニトロセル ロース・フィルターに移す。このフィルターを、ポリヌクレオチド・キナーゼを 使用して２２ｐ末端標識されているオリゴヌクレオチド＃５１及び＃５８を使用 してプローブした。このプローブを、低いストリンジエンシー（ＩＭ　ＮａＣ１ ，１０％硫酸デキストラン。 ０．５％ＳＯ３中、５０°Ｃ）においてそのフィルターにハイブリダイズし、室 温において、そして次に、６Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で４５℃において３ ０分間洗浄し、そして陽性クローンを同定するためにＸ−線フィルムに露出させ た。推定クローンを、４ラウンドのプラーク・ハイブリダイゼーションを通して 精製した。３クラスのｃＤＮＡクローンを、単離した。タイプ１は、０．２ｋｂ 及び１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。 タイプ１１は、０．６ｋｂ、０．５ｋｂ及び１．ｏｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含ん でおり、そしてタイプｌｒ［は、２．３ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を含んでいた。 （Ｍ３１　花粉特異的ｃＤＮＡクローンの特徴付はタイプＩｆ　ｃＤＮＡクロー ンのＥｃｏＲＩ断片を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅがら購入したプラスミド・ベクタ ーｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋中にサブクローン化した。 図３０を参照のこと。ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ内の０．６ｋｂ断片を、１１−． ６と名付け、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ内の０．５ｋｂ断片を、［［−１５と名付 け（その後、ｐＣＩＢ３１６９と名付けた）、そしてｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ内 の１．Ｏｋｂ断片を、ｒｌ−１，０と名付けた（その後、ｐＣ［Ｂ５１６８と名 付けた）。以下に記載するように、この０．５ｋｂ及び０．６ｋｂの断片は、メ イズ花粉特異的ＣＤＰＫ遺伝子をコードしている。Ｆｊ（ａｎｔｈｅｒ）、花粉 、葉、根、毛（ｓｉｌｋ）からのＲＮＡを、グリオキサル（ｇｌｙｏｘａｌ）に より変性させ、１％アガロース・ゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに 転写し、そしてｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　（１９８９）中に記載されておるように、ランダム・プライマー伸長により２ ｘｐにより標識されている３つのＥｃｏＲＩ断片により別々にプローブした。こ のプロットを、Ｘ−線フィルムに露出させ、そして約１．５ｋｂのｍＲＮＡバン ドを、０．６ｋｂ断片プローブにより同定し、一方、０．５ｋｂ及び１．Ｏｋｂ 断片を、約２゜Ｏｋｂ　ｍＲＮＡとハイブリダイズした。すへての場合において 、ハイブリダイゼーションは、花粉ＲＮＡレーン内てのみ見られた。但し、０゜ ６　ｋｌ）断片は、１ｍＲＮＡ内でわずかなシグナルを示した。これらのデータ からの結論は、元のｃＤＮＡクローンは、２つの異なるｍＲＮＡ５から生じた融 合ｃＤＮＡ分子であったということである。この０．６ｋｂ断片は、１．５ｋｂ 花扮特異的ｍＲＮＡの部分的ｃＤＮＡてあり、そしてこのｍＲＮＡは、ペプチド ＬｙｓＣ４９及びＮ−末端をコードしている。１．０及び０．５ｋｂ断片は、そ のペプチド及びプローブとして使用されたオリゴヌクレオチド・プローブに無関 係な２．Ｏｋｂ花粉特異的ｍＲＮＡの部分的ｃＤＮＡを含んて成る。この結論は 、その断片をＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、中に記載されているようなジデオ キシ連鎖停止法を使用して配列決定したときに確認された。このｃＤＮＡを図３ １中に示す。 例３２：　ｍＲＮＡ発現の特異性の測定ｃＤＮＡクローンｐｃｉ８３１６９及び ｐｃｉ８３１６８により表される２、Ｏｋｂ　ＲＮＡか花粉内にたけ存在するか どうかを決定するために。全ＲＮＡを、メイズ２１１Ｄの、根、葉、花粉、朽又 は毛から単離した。このＲＮＡ５を、グリオキサルにより変性させ、１％アガロ ース・ゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写し、そしてすへて、ｓ ａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）中に記載されておるような標準的な 技術を使用して、プラスミドｐｃｔＢ３１６８又はｐｃ［Ｂ５１６９からの１１ １ｐ標識ＥｃｏＲ［挿入物によりプローブした。このプロットを写真フィルムに 露出させることは、これらの２つのクローンにより表された遺伝子が花粉内で転 写についてのみ活性であるということを証明している（図３２）。 花粉特異的プロモーターの同定 例３３：　メイズ・ゲノムＤＮＡライブラリーの構築メイズ系２１１Ｄ幼い苗条 （ｓｈｏｏｔ）からのゲノムＤＮＡを、５ｈｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１１３ ５：２２５−２３３　（１９８３）中に記載されているように単離した。 このＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに提供し、そこで、ゲノムＤＮＡライブラ リーを、５ａｕ３Ａ　Ｉ部分消化ＤＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ　Ｌａｍｂ ｄａ　Ｄａｓｈクローニング・ベクター中にクローニングすることにより構築し た。 メイズ系２１１０からのゲノムＤＮＡを、多数の制限酵素により消化し、個々の 消化物をアガロース・ゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写し。そ してＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、中に記載されているような標準的な技術を 使用してプラスミドｐｃ［Ｂ５１６８（１，ｏｉ＜ｂ断片’）　、ｐｃＩＢ３１ ６９（０，５ｋｂ断片）又はクローンＩｔ−，６からの３２ｐ−標識ＥｃｏＲ［ 挿入物によりプローブした。１０以上のバンドを、最も多い消化物条の［［−。 ６ブローブにより検出し、このｃＤＮＡが大きな多遺伝子ファミリーから生じて いることを示している。１．Ｏｋｂ断片によるブロービングは、３から６までの バンドを検出し、そして０．５ｋｂ断片によるブロービングは、１．Ｏｋｂ断片 により検出されたもののサブセットである１から３までのバンドのみを検出した 。この１．Ｏｋｂ及び０．５ｋｂ断片により検出された、より小さな遺伝子ファ ミリーのサイズのため、それらに対応するゲノム・クローンの単離を試みること を決定した。 例３５・花粉特異的ゲノム・クローンの単離Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅメイズ２１１ Ｄゲノムライブラリーを、そのライブラリーと一緒に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅマ ニュアル中に記載されているような標準的な手順を使用してプラスミドｐｃＩ８ ３１６８（＋、　Ｏｋｂ断片）及びｐｃｌＢ３］６９（０゜５ｋｂ断片）からの ３２ｐ−標識ＥｃｏＲＩ挿入物によりプラーク・リフト（ｐｌａｑｕｅ　１ｉｆ ｔｓ）をブロービングすることにより、スクリーニングした。 この戦略を使用して、ラムダ・クローンＭＧ１４を、単離し、そしてそれを両方 のプローブとハイブリダイズさせた。これもまた両方のプローブにハイブリダイ ズするＭＧ１４の９．Ｏｋｂ　Ｂａｍ旧断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ ＋のＢａｍＨ１部位中にサブクローン化し、プラスミドｐｃｉ８３７９を作った 。ｃＤＮＡ配列に対応する領域内の１８００塩基対のｐｃＩＢ３７９を、先に記 載したように配列決定した。ｃＤＮＡとゲノム配列との比較は、たった９１％の 同一性を示した。ｐｃｉ８３７９挿入物は、関連花粉特異的遺伝子を表している 。 第二ノイズ２＋１Ｄゲノム・ライブラリーを、Ｐｒｏｍｅｇａマニュアル中に記 載せれている手順を使用して、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したベクター・ラムダＧ ＥＭ−１１中に構築した。上記のようにこの未増幅ライブラリーをスクリーニン グすることは、クローンＧＥＭＩＩ−１を作り出し、これを、０．５と１．Ｏｋ ｂとの間のプローブにハイブリダイズさせた。両方のプローブにもハイブリダイ ズするＧＥＭＩＩ−１の２０ｋｂ旧ｎｄｌｌｌ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 　Ｓに＋のＨｉｎｄ［１１部位中にサブクローン化し、ｐｃＩＢ３１６６を作っ た。４．　ｌｋｂのｐｃ１８３１６６のＤＮＡ配列が、決定され（図３６）、そ してそのゲノム・クローン内の６つのイントロンを数えた後、ｐｃｉ８３１６８ 及びｐｃＩＢ３１６９のｃＤＮＡ配列と１００％同じであった。Ｇｅｎｂａｎｋ ／ＫＭＢＬデータベースとｐｃｉ８３１６６との比較は、その５°部分が３つの エクソンを通して、そのアミノ酸レベルにおいてラットのカルモジュリン依存性 蛋白キナーゼ１１に３４．６％同してあったということを（図３３）、一方、第 ７エクソンを通しての第四がラットのカルモジュリンと３９゜４％同じであった ということを明らかにした（図３４を参照のこと）。 他の花粉特異的キナーゼは、全く記載されておらず、そしてこの時、この、キナ ーゼとカルモジュリン・ドメインとを結合する蛋白は、知られていなかった。そ の後、Ｈａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５２；９５１−９５ ４　（１９９１）か、大豆からの類似の蛋白のｃＤＮＡ配列を開示したが、この 遺伝子は、発現において花粉特異的ではない。大豆カルシウム依存性蛋白キナー ゼ（ＣＤＰＫ）とノイズ花粉ＣＤＰＫとの比較は、そのアミノ酸レベルにおいて ３８％同じてあった。図３５を参照のこと。 気凹ニプライマー伸長によるプロモーターの転写開始部位の同定以下の配列をも つオリゴヌクレオチドＰＨ５１を、プライマーとして合成した・ ５’　−ＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＣＧＧ Ｃ−３’。プライマー伸長分析を、Ｍｅｔｒａｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ 　ｔｌｓＡ　８６：８９６−８９０（１９８９）中に記載されているようにポリ Ａ十花粉ｍＲＮＡ上で行った。この転写開始部位は、図３６中に示すｐｃ１８３ １６６の部分配列上の塩基１４１５と１４２５との間にあることが決定された。 トランスジェニック植物内におけるプロモーター機能のテスト花粉ＣＤＰＫプロ モーターがトランスジェニック植物内の結合遺伝子の発現を駆動することがてき るとういことを証明するために、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のヘーターグルクロニ ダーゼ遺伝子への花粉ＣＤＰＫプロモーターの遺伝子融合物を、以下のように構 築した。第一エクソンを含むラムダＧＥＭＩＩＩからの１０ｋｂ　Ｂａｍ旧断片 及び花粉ＣＤＰＫ遺伝子の第一イントロンの部分これに加えてこの遺伝子の９ｋ ｂ上流を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓに＋のＢａｍ８１部位中にサブクローン 化し、プラスミドｐｃｉ８３１６７を作った。ｐｃＩＢ３１６７からの２．３ｋ ｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ［［１部位を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋のＢ ａｍＨＩ及び旧ｎｄｌｌ［部位中にサブクローン化し、プラスミドｐｓＫ１０５ を作った。このｐｓＫＩ０５を、Ａｖａ［及びＨｉｎｄｌ［Ｉにより消化し、そ してこの１．７５ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−Ａｖａ［断片を、アガロース・ゲル上 で単離した。ＰＣＲ反応を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、中に記載せれてい るような標準的な条件下でテンプレートとして無傷のｐｓＫ１０５及び以下のプ ライマーを使用して走らせた：＃４２：　５−ＡＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ ＧＧＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＣＧ−３“＃４３：　５’− ＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＧＧＧ−３’二〇ＰＣＲ反応生成物を、Ａｖａ 　Ｉ及び５ａｌｌにより消化し、そして得られた断片をアガロース・ゲル上で単 離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋を、Ｈｉｎｄｌｌｌ及び５ａｉｌによ り消化した。この１．７５　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｒ−Ａｖａｌ断片、ＰＣＲ誘導 体Ａｖａｌ−５ａｌ［断片、及び旧ｎｄｌｌｌ及び５ａｌｔ末端をもツｐＢｌｕ ｅＳＣｒｉｐｔベクターを、３方において結合し、プラスミドｐｓＫＩＩＯを作 った。 ｐｓＫ１］０内のプロモーター断片とベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝 子との融合を、ｐｓＫＩ　１０をＨｉｎｄ［ＩＩ及び５ａｌｌにより消化し、そ の１、９ｋｂ断片をアガロース・ゲル上で単離し、そしてそれをｐｃＩＢ３０５ ４のＨｉｎｄ［ＩＩ及び５ａｌ１部位中に結合することにより、作りだし、プラ スミドｐＫＬ２を作った。このプラスミドは、ＧＬＩＳ遺伝子その後のメイズＰ ＥＰＣ遺伝子からの植物イントロン及びカリフラワー・モザイク・ウィルス（ｃ ａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ）からのポリＡシグナルを含 むｐＵｃ１９から得られる。このプロモーター融合物は、おそらく、ＧＵＳ遺伝 子ＡＴＧに先行するリーダー配列内のフレームから外れたＡＴＧコドンの存在を 理由として、植物内では不活性であった。 このプロモーターの機能の融合は、先行の融合連結を除去するために、ｐＫＬ２ をＸｂａ［及び５ａｉｌにより消化することにより作られた。新たな融合連結を 、テンプレートとしてのｐｓＫ１０５及び以下のプライマーを使用してＰＣＲ反 応において作った：＃５に５０：　５’−ＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡ ＡＣＣＴ−３’＃５に４９：　５−ＴＡＡＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＣＧＧＣＧＡＧ ＡＧＡＴＧＧＡ−３゜二〇ＰＣＲ生成物を、Ｘｂａ　Ｉ及び５ａｉｌにより消化 し、そしてアガロース・ゲル上で精製した。この精製断片を、ｐＫＬ２のＸｂａ ！及び５ａｌ１部位中に結合し、プラスミドｐｃｉ８３１７１を作った。このプ ラスミドは、花粉ＣＤＰＫプロモーターと、花粉内で限定的にＧｔｌＳ遺伝子を 発現することに向けられているＧＵＳとの機能的融合物を含む。 −タ−ＧＵＳ融合物を含むベクターを作るために、その融合遺伝子を、Ｈｉｎｄ ｌｌｌ及びＳａｌ［による消化によりｐｃ［Ｂ５１７１から単離した。得られた 断片を、ｐＢｌｌｏｌ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈから購入）の旧ｎｄｌｌｌ及び５ａｌ １部位中に結合させ、プラスミドＩ）ＣＩ８３１７５を作った。 例３８・　トランスジェニック植物の生産ｐｃ［Ｂ５１７５を、ヘルパー・プラ スミドｐｃＩＢ５４２を含むアグロバクテリウム・チュームファシエンス（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中に形質転換させ、そして 得られた集落を、Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１ ２２９−１２３１　（＋９８５）により記載されているようにタンくコ苗条先端 培養物からの葉の皿（ｌｅａｆ　ｄｉｓｋｓ）を形質転換するために使用した。 但し、培養集落（ｎｕｒｓｅ　ｃｕｌｔｅｒｅｓ）を無視し、そして選択を１０ ０ｍｇ／ｌカナマイシン上で行った。トランスジェニック植物を、再生し、そし てＰＣＲにより転移遺伝子の存在について確認した。 例３９：　ｃｕｓ遺伝子発現分析 最初の形質転換細胞及びそれらの子孫からの花粉を、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２２４：１６１−１６８　（１ ９９０）により記載されているようなＧＵＳ遺伝子の発現について組織化学的に 分析した。Ｘ−ｇ　ｌｕｃバッファー中での青色染色により示されるような、Ｇ ［ＪＳ遺伝子を発現している花粉粒状物（ｇｒａｉｎｓ）のパーセンテージを、 以下の表中（こ示す。 植物番号　％青色の花粉 ＰＰ１−５１２８％ ＰＰ１−５４５４％ ＰＰ１−５５無し ＰＰ１−６１非常に少ない ＰＰ１−６３５１％ ＰＰ１−６７１５％ ＰＰ１−８０１０％ ＰＰ１−８３１２％ 単一の花粉ＣＤＰＫプロモータ−ＧＵＳ遺伝子が組み込まれている最初の形質転 換細胞は、その単一の遺伝子の分泌により、最大５０％のＧｔＪＳ陽性花粉を生 産するであろう。 蛍光定量法ＧＵＳ検定を、選択植物の花粉、茎、根、葉及びめしへ（ｐｉｓｔｉ ｌ）の組織状で行い、花粉ＣＤＰＫプロモーター発現の特異性について証明した 。検定を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４： ９９５−１００６　（１９９０）中に記載されているように行い、そしてＧｔｌ Ｓ活性値を、ｎモルＭＵ／μｇ蛋白／分間として表した。 植物番号　組織　ＧＵＳ活性　非形質転換　正味ＧＵＳ植物ＧＵＳ活性　活性 ＰＰ１−５１茎　０．０１　０．０２　０葉　ＯＯＯ 根　０．１５　０．１０　０．０５ めしべ　０．０２　０．０１　０．０＋花粉　０．２４　０．０２　０．２２ ＰＰＩ−５４茎　０．０１　０．０２　０葉　０　０　０ 根　０．１３　０．１　０．０３ めしべ　０．０１　０．０１　０ 花粉　０．６０　０．０２　０．５８ ＰＰＩ−６３茎　０．０＋　０．０２　０葉　０　０　０ 根　０．０７　０．１　０ めしへ　０．０１　０．０１　０ 花粉　０．５７　０．０２　０．５５ 例４叶５０は、キメラ構築物、すなわち、組換えＤＮＡ分子であってそれの挿入 、ベクターを含むトランスジエニ・ツク植物の生産、並びにそのトランスジェニ ック植物の」」ユ蛋白の発現レベル（こ、主）こ向けられている。 ｐＣ及び髄特異的プロモーターを、ＰＣＲを使用して合成りｔ　ｃｒｙ［Ａ（ｂ ）遺伝子に融合させる。二〇ＰＣＲ融合のため（こ設計された第１ノコ゛マーは ： （ＰＥＰＣ） ＫＥ９９Ａ２８・５’　−ＴＧＣＧＧＴＴＡＣＣＧＣＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧ−３ ゜ＫＥ９７Ａ２８・５°−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧ　ＡＴＣ ＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧ−３’（髄） ＫＥ１００Ａ２８　＝　５°−ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＡＡＣＡ−３’ＫＥ９ ８Ａ２８　＝　５°−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＴＴＡＡＣＧＣＧＧ　ＡＴＣＣＴ ＧＴＣＣＧ　ＡＣＡＣＣＧＧＡＣ−３゜ＫＥ１０４Ａ２８・５’　−ＧＡＴＧＴ ＣＧＴＣＧ　ＡＣＣＧＣＡＡＣＡＣ−３’ＫＥ１０３Ａ２８　＝　５’　−ＧＣ ＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＡ　ＣＧＧＣＴ−３ ゜である。 ＰＣＲプライマーを、これらの組織特異的遺伝子のそれぞれの５°未翻訳リーダ ー領域内のＮｃｏ　１部位を、ＢａｍＨ［部位により置き換えるように設計し、 その合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子のこのＢａｍ旧部位中へのクローニングを容易 にする。この合成ｃｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子に融合された組織特異的プロモーター を含み、そしてまた３５Ｓ：ＰＡＴ：３５Ｓマーカー遺伝子を含むベクターのそ の後の構築は、幾つかの中間体の構築を含む。 １、　ｐｃＩＢ４４０６（３５Ｓ＋合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）：ｐｅｐＣｉｖｓ＃ ９：３５Ｓ）ｐｃ［Ｂ４４０６は、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター（Ｒｏｔｈｓ ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　５３：１５３−１６１　（１９８７）） と融合した２　Ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｃ１ａ　１合成ｃｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子を含 む。また、この遺伝子は、その遺伝子の３′未翻訳領域内のメイズＰＥＰカルポ キシターセ遺伝子（ｉｖｓ＃９）から得られたイントロン＃６を含み、これは、 ＣａＭＶ　３°末端を使用している。（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　８３：２８８２− ２８８８　（１９８６）、Ｈｕｄｓｐｅｔｈ　ｅｔ　ａｔ、、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。 １２：　５７９−５８９　（１９８９乃。ｐｃｌＢ４４０６を、結合させ、先に 記載したような大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞の”確かな（ＳＵＲＥ）”株（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中に形質転換させる。１つ の突然変異が、アミノ酸＃４３６におけるｐｃＩＢ４４０６のｃｒｙ［Ａ（ｂ） 遺伝子内で見つかり、これは、所望のＰｈｅがしｅｕに変換されていることをも たらしていた。Ｉ）ＣＩＢ４４０６は、昆虫生物検定においてテストしたとき、 欧州トウモロコシ穿孔性動物に対して十分に活性があり、そしてウェスタン・プ ロット分析により決定されるように予想されたサイズのＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を 生産する。 ２、　ｐｃｉ８４４０７　（３５Ｓ：合成−ｃｒｙ［Ａ（ｂ）：ｐｅｐＣｉｖｓ ＃９３５ｓ　＋　３５Ｓ：ｐａｔ：３５Ｓ）ｐｃ［Ｂ４４０７を、３５Ｓ　：　 ＰＡＴ　：　３５Ｓ遺伝子を含む約４　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ［ＩＩ／ＥｃｏＲ［断片 、並びにｐｃｉ８４４０６からの３．Ｉ　Ｋｂ／Ｈｉｎｄ［［［／ＥｃｏＲＩ　 ３５Ｓ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）　：３５３遺伝子から作る。ｐｃ［Ｂ４４０７ を、結合させ、そして標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）を使用 して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）の”確がな”ＤＨ５アルファ、及び８８１０１ 株の中に形質転換させる。この合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子は、その前駆体ｐｃ ｉ８４４０６と同じ性質をもっている。 ３、ｐｃＩＢ４４１６　（３５Ｓ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）＋ｐｅｐＣｉｖｓ＃ ９：３５Ｓ　＋　３５Ｓ：ＰＡＴ：３５Ｓ＋　３５Ｓ：Ａｄｈイントロン：ＧＬ ＩＳ　：　３５Ｓ、　’）ｐｃＩＢ４４０７を、ＥｃｏＲＩにより切断し、そし て標準的な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、）でウシ腸アルカリ性ホス ファターゼ（ＣＩＰ）により処理し、約７．２Ｋｂ断片を作り、これを、３．４ 　Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　３５Ｓ：Ａｄｈ／ＧＬＩＳ：３５Ｓ断片と結合させ、ｐｃ ［８４４１６を作る。結合及び”確かな”細胞への形質転換は、先に記載したも のと同しである。ｐｃｉ８４４１６内の合成ｃｒｙ　ＩＡ（ｂ）遺伝子は、ｐｃ ＩＢ４４０６内の遺伝子と同じ性質をもっている。 ４、　ｐｃＩ８４４１８　（３５Ｓ　合成−ｃｒｙ［Ａ（ｂ）：ｐｅｐＣｉｖｓ ＃９：３５Ｓ）ｐＣＩ８４４０６を、Ａｐａｌ及びＢａｍＨＩにより消化し、そ してＣＡＰにより処理する。ｐｃＩＢ４４０６を、ＢａｍＨＩ及びＮ５ｐｌによ り消化する。ｐＢｓＩ２３＃Ｉ３を、Ｎｓｐ［及びＡｐａ　Ｉにより消化する。 Ｉ］Ｃ［Ｂ１２Ｏ３からの４．３Ｋｂ　Ａｐａｌ／Ｂａｍ旧断片、ｐｃｉ８４４ ０６からの１．３にｂ　Ｂａｍ１（１／Ｎ５ｐｌ断片、及びｐＢｓ１２３＃Ｉ３ からの１７０塩基対のＮ５ｐｌ／Ａｐａｌ断片を含む３方結合を、行い、ｐｃｉ ８４４５、ｐｃｌＢ４４１９　（３５Ｓ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）：ｐｅｐＣｉ ｖｓ＃９：３５Ｓ　＋　３５Ｓ：ＰＡＴ：３５Ｓ＋　３５Ｓ：Ａｄｈイントロン ：ＧＵＳ：３５Ｓ）ｐｃＩ８４４１６及びＩ）ＣＩ８４４１８を、ＢｓｔεＩ＋ 及びＥｃｏ　Ｎｌにより消化し、そしてｐｃＩ８４４１６の断片を、ＣＩＰによ り処理する。Ｉ）ＣＩＢ４４１６からの９．ＩＫｂ断片を、ｐｃｉ８４４１８か らの１．４にｂ断片に結合させ、ｐｃｉ８４４１９を作る。 ＨＢＩＯＩコンピテント大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換されたｐＣ Ｉ８４４１９は、欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する昆虫生物検定における十 分な活性を証明している。 ６、９ｃ［Ｂ４４２０　（髄：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）：ＰＥＰＣｉｖｓ＃９： ３５Ｓ　＋　３５Ｓ：ＦＡＴ：３５３ｐｃｉ８４４２０の調製における中間体構 築物は、ｐＢＴｉｎｌ、　ｐＢｔｉｎ２、ｐ４４２０Ａ及びｐＢｔｉｎ３である 。ｐＢｔｉｎｌ（髄プロモーター：合成りｔ遺伝子の第二半分＋３５Ｓ：ＰＡＴ ：３５Ｓ）を、プラスミド髄（３−１）からの２．　ＩＫｂ　Ｘｂａｌ／Ｎｃａ ｌ髄プロモーター断片とｐｃＩＢ４４０７からの５．２Ｋｂ　Ｘｂａｒ／Ｎｃｏ ［断片とを結合させることにより作る。ｐＢｔｉｎ２は、先に列記したプライマ ーＫＥ１００Ａ２８及びＫＥ９８Ａ２８を使用して作った２１０塩基対のＰＣＲ 断片により修飾された髄プロモーターを含む中間体構築物である。ＰＣＲ反応混 合物は、１００ピコモルのそれぞれのオリゴマー、２００ｎＭのそれぞれのｄＮ ＴＰ、　ＩＸバッファー（Ｃｅｔｕｓ）及び２．５ユニツトの熱安定性ポリメラ ーゼと共に約１１００ｎの２．　］Ｋｂ　ｂａｍ）ＩＩ／Ｎｃｏｌ髄プロモータ ー断片を含む。このＴｍが比較的低い（４０°Ｃと５０°Ｃとの間）ので、ＰＣ Ｒ反応を以下のパラメーターにより走らせた： 解裂サイクル・９４°Ｃ，１分間、 アニーリング・サイクル：３７°Ｃ，１分間、伸長サイクルニア２°Ｃ１４５秒 間（＋サイクル毎３秒間）サイクル数＝２５ ＰＣＲ反応物を、５ａｉｌ／Ｋｐｎ［による切断に先立って先に記載したような プロティカーゼＫにより処理し、その後、フェノール／クロロホルム抽出し、そ して先に記載したようにエタノール沈降させた。 この２１０塩基対の断片を、２％Ｎｕｓｉｅｖｅゲル上で精製し、そしてそのゲ ルからＭｉ１１ｉｐｏｒｅフィルター装置を使用して抽出した。この２１０Ｋｂ 　５ａｉｌ／Ｋｐｎ　Ｉ断片を、髄（１−３）からの４．９　Ｋｂ　５ａｌｌ／ Ｋｐｎｌ断片に結合させ、ｐＢｔｉｎ２を作る。ｐ４４２０Ａ（髄：合成−旧： Ｐｅｐイントロン：３５Ｓ　＋３５Ｓ：ＰＡＴ：３５Ｓ）を、ｐＢｔｉｎ２から の７００塩基対のＮ５ｉｌ／Ｂａｍ旧断片、ｐＣＩ８４４１８からの１．８Ｋｂ のＢａｍＨＩ／Ｂｓｔ　Ｅ　Ｉｔ断片、及びｐＢｔｉｎｌからの５．９ＫｂのＢ ｓｔ　Ｅ　１１／Ｎｓｉ　Ｉ断片から成る３方結合により作る。ｐ４４２０Ａを 作った後、ｐＢｔｉｎ２内で３つの突然変異が発見される。第二ＰＣＲ断片を、 プライマーＫＥ１０４Ａ２８及びＫＥＩ０３Ａ２８を使用して約６５°Ｃの釦値 で髄リーダー内のＮｃｏ１部位を修飾するために作る。のＰＣＲ反応混合物は、 先に列記したものと同じてあり、２０％までグリセロールを添加し、Ｇ＋Ｆｉｌ ｅ　［：　９４°Ｃ：３分間、ｌサイクル、Ｆｉｌｅ　Ｉｔ：　６０°Ｃ：１分 間、９４℃：１分間、 ２５サイクル、 Ｆｉｌｅ　ＩＩＩ：　７２°Ｃ１５分間、ｌサイクル、ＰＣＲ反応物を、上記に ように処理し、そして制限エンドヌクレアーゼＳａ１［及びＫｐｎｌにより切断 する。この２１０Ｋｂの５ａｌｌ／Ｋｐｎ［ＰＣＲ（反応中のグリセロール）断 片を、プラスミド（３−１）からの４．９Ｋｂ　５ａｉｌ／Ｋｐｎ　Ｉ断片に結 合させ、ｐＢｔｉｎ３を作る。ｐＢｔｉｎ３−Ｇ＃１上のデータは、二〇ＰＣＲ 生成断片が正しいものであることを示している。 ｐＢｔ　１ｎ３−Ｇ＃Ｉを、ｐｃｉ８４４２０（ｐ４４２０Ｂ″Ｇ＃６−ともい う）を作るために使用する。ｐＣＩ８４４２０を、ｐＢｔｉｎ３−Ｇ＃Ｉからの ７００塩基対のＮｓｉ［／Ｂａｍ旧断片、Ｉ）ＣＩＢ４４１８からの１．８Ｋｂ のＢａｍＨＩ／Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ断片、及びｐＢｔｉｎｌからの５．９　Ｋｂ　 Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ／Ｎｓｉ　Ｉ断片を使用した３方結合により構築する。 ｐｃＩ８４４２０は、葉肉プロトプラスト実験において使用され、そして欧州ト ウモロコシ穿孔性動物に対する合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の十分な活性を証明 している。 ７、　ｐｃｉ８４４１３　（ＰＥＰＣ：合成−Ｂｔ（Ｐｈｅ突然変異）：ＰＥＰ Ｃイントロン：３５Ｓ、　）融合断片を、ｐＧＬ１３４．５からの２．３　Ｋｂ 　Ｈｉｎｄｌｌ１１５ａｌｌテンプレートと共にプライマーＫＥ９９Ａ２８及び ＫＥ９７Ａ２８を使用したＰＣＲにより作り出した。このＰＣＲ混合物は、先に 記載したものと同じ濃度の、・プライマー、テンプレート、ｄＮＴＰｓ　、塩、 及び熱安定性ポリメラーゼを含む。ＰＣＲパラメーターは： 解裂サイクル＝９４°Ｃ，１分間、 アニーリング・サイクル：５５℃、１分間、伸長サイクル＝７２°Ｃ１４５秒間 （サイクル毎に＋３秒間）サイクル数＝３０ である。 終了後、ＰＣＲ反応物を、先に記載したように、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩ及びＢｓｔ　Ｅ　ＩＩによる切断に先立って、プロティカーゼＫにより処理 し、その後フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈降させた。 ｐｃＩＢ４４１３を、２１０塩基対のＢａｍＨ［／Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ　ＰＣＲ断 片、ｐｃ［８４４０６からの４．７Ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片、及 びｐＧＵ５４．５からの２．２Ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌ［／Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ断片を 使用した３方結合により作る。 ８、ｐｃＩＢ４４２］（ＰＥＰＣ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）：ＰＥＰＣインドＯ ：／　：３５Ｓ）ｐｃＩＢ４４２１を、ｐｃｉ８４４１３内のＰｈｅ突然変異を 含む合成ｃｒＹ［Ａ（ｂ）遺伝子を、ｐｃＩ８４４１９からの合成ｃｒｙ　［Ａ （ｂ）遺伝子と置き換えるために作る。 ｐｃｉ８４４２１を、ｐｃＩ８４４１３からの５．２ＫｂのＢａｍＨＩ／Ｓａｃ ［断片とｐＣＩＢ４４１９がらの１．９ＫｂのＢａｍＨＩ１５ａｃｌ断片と結合 させることにより作る。 ９、ｐｃｌＢ４４２３（ＰＥＰＣ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）　：ｐｅｐＣインド ロン：３５Ｓ　＋　３５Ｓ：ＰＡＴ・３５Ｓ） ｐｃｌＢ４４２１からの２．４ＫｂのＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄ［ｌＩ　ＰＥＰＣプ ロモーター断片を、ｐｃｉ８４４２０内の６．２Ｋｂ　ＢａｍＨ［／Ｈｉｎｄ１ １［断片と結合させ、Ｉ）ＣＩ８４４２３を作る。このＨｉｎｄ１１１部位は、 ｐｃｌＢ４４２３のクローニングにおいてエンドヌクレアーゼにより欠失される 。ｐｃ［Ｂ４４２３は、ＰＥＰＣプロモーターの制御下の合成ｃｒｙ［Ａ（ｂ） 遺伝子を含み、このＦＡＴ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下にある。 １０、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株内の合成ｃｒｙｌ Ａ（ｂ）遺伝子 合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子により作られたアグロバクテリウム株は、双子葉植 物の範囲内でこの遺伝子の伝達を可能にする。アグロバクテリウム・ベクターｐ ｃｉ８４４１７は、ｐＢＩ］ｏＩ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）からの１４Ｋｂ　Ｈｉ ｎｄ［ＩＩ／ＥｃｏＲ［断片に結合されているｐｃ［Ｂ１２０３（Ｐｈｅ突然変 異）からの３，３Ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［［／εｃｏＲ１３５Ｓ：合成−ＣｒｙｌＡ （ｂ）：ｐｅｐＣ：ｉｖｓ＃９：３５Ｓ断片を含む。 ２００ｎｇのｐｃ［Ｂ４４１７及び４０μｍの氷上解凍ＬＢＡ４４０４　：＋ン ピテント細胞を、前冷却０．２ｃｍエレクトロポレーション・キュベツト（Ｂｉ ｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、）内てエレクトロポレーション にかける。Ｐｕ１ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）によるＧ ｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ−ＴＭを使用して、電気パルスを、直ちに、２．５ｋＶに おける電圧設定、及び２５μＦにおける静電容量設定により、加える。パルス後 、細胞を、直ちに、１ｍｌのＹＥＢ培地に移し、そしてＡＢｍｉｎ　：Ｋｍ５０ プレート上に１０μｌをブレーティングする前に、２７°Ｃて３時間、振どうす る。約６０時間２８°Ｃにおいてインキュベートした後、コロニーを、ミニスク リーン調製のために選択し、制限酵素分析を行う。最終的なアグロバクテリウム 株をｐｃＩＢ４４１７：ＬＢＡ４４０４という。 例４１：形質転換メイズ・プロトプラストのＥＬＩＳＡ検定ｃｒｙ［Ａ（ｂ）毒 素蛋白の存在を、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬ［ＳＡ）を利用し て検出する。ＥＬＩＳＡは、非常に感度が良（、抗原物質に特異的な検定である 。ＥＬＩＳＡ検定は、ポリペプチド遺伝子生成物の発現を測定するのに有用であ る。これらの検定のための抗血清を、Ｆデシル硫酸ナトリウムにより可溶化した グラジェント精製旧結晶［Ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉ ｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３６：６２５−６２６（１９７８）］によ るウサギの免疫化に対する応答において作り出す。過渡的形質転換メイズ細胞か らの抽出物のＥＬＩＳＡ検定を、標準的な手順を使用して行う（例えば、Ｈａｒ ｌｏｗ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ｄ、　ｉｎ″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ７２：２４８　（１９７６）中に記載さ れている。したがって、これらの手順は、当業者によく知られている。これらの 文献の開示を、ここで、引用により本明細書中に取り込む。 ＥＬＩＳＡ検定を、メイズ・プロトプラスト内のＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を検出す るために行う。作られた蛋白を、全蛋白ｍｇ当たりのＢｔのｎｇ（ｎｇ　ｅｔ／ ｍｇ）として以下に報告する。それぞれの構築物を、２回テストした。 １）ＣＩＢ３０６９　検出可能な旧無しく両テスト）ｐｃＩＢ４４０７２１．９ ００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ全蛋白、２１．０００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ全蛋白。 上記の形質転換されたメイズ細胞は、ノイズ最適化Ｂｔ遺伝子により形質転換さ れたとき、全可溶化蛋白ｍｇ当たり約２０．０００ｎｇのＢｔ　Ｃｒｙ［Ａ（ｂ ）蛋白のオーダーに基づく、高いレベルのＢｔ　［Ｐを作りだす。 これらのＥＬＩＳＡヘースの検定の検出レベルは、ｍｇ蛋白当たり約１〜５ｎｇ 　ＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白である。それ故、メイズ最適化Ｂｔ遺伝子は、ノイズ細 胞内のこの蛋白の発現において約２０．０００倍と大きな増加を作り出している 。 ウェスタン・プロット検定を、また、メイズ最適化遺伝子を発現させるだめのＤ ＮＡにより過渡的に形質転換されているノイズ細胞から得られた抽出物を使用し て行う。ウェスタン・プロットにより検査するとき、この蛋白は、大腸菌（Ｅ、 　ｃｏｌｉ）内で生産された蛋白と同一のもののよっである。反対に、上記の例 ６中に示したように、検出可能なりｔ　ｃｒｙＩＡ（ｂ）殺虫性蛋白は、生来の Ｂｔ誘導コード領域を発現することを試みられる競合ベクターにより形質転換さ れたノイズ細胞によっては、全く作られていない。 定性的な昆虫毒性テストを、収穫したプロトプラストを使用して行うことができ る。懸濁液を、すべての生物検定においてテストしたそれぞれの複製物について 調製した。複製物は、その対照よりも有意に高い死亡率を引き起こす場合には、 陽性と考えられる。例えば、複製物を、欧州トウモロコシ穿孔性動物、０ｓｔｒ ｉｎｉａ口ｕｂｉｌａｌｉｓを使用して鱗翅目内の昆虫に対するそれらの活性に ついてテストする。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中のｌＯＯμｌのプロト プラスト懸濁液を、５０ｍｍ　ｘ　１０ｍｍスナップ−キャップ・ペトリ皿内の 人より１ａｃｋネキリムシ（ｃｕｔｗｏｒｍ）餌（Ｂｉｏｓｅｒｖ、　Ｉｎｃ、 、　Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、　Ｎに　Ｆ９２４０）の表面上にピペットで移した 。ＩＯの新生の幼虫を、それぞれのプレートに添加する。約４０径死亡率を記録 する。この蛋白が欧州トウモロコシ穿孔性動物に食べられたとき、それは１００ ％の死亡率をもたらす。 トウモロコシ葉肉プロトプラストの単離のための一般的な手順を５ｈｅｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．２：１０２７−１０３８　（１ ９９０）から改良する。 ５ｈｅｎｎ　ｅｔ　ａｌ、中で使用されるプロトプラスト形質転換システムを、 エレクトロポレーションよりもむしろＰＥＧ仲介形質転換を使用して修飾する。 この手順並びにその単離手順において行われる変更を、以下に記載する。 メイズ葉肉プロトプラスト単離／形質転換１、　葉材料のためのトウモロコシの 種（ｃｏｒｎ　５ｅｅｄｓ）を、滅菌し、そして発芽させる。苗木（ｓｅｅｄｌ ｉｎｇ）を、２５°Ｃにおいて明かりの中で生育させる。 ２．５％Ｃ１ｏｒｏｘにより、５分間、１０−１２日口の苗木の葉の片を表面滅 菌し、その後、無菌蒸留水により洗浄する。 ３、　酵素溶液（以下の配合表を参照のこと）を部分分けする：２５ｍ１／皿（ １００ｘ　２５　ｍｍベト９皿）。 ４、業から過剰の水を除去し、そして酵素のそれぞれの皿の中に６−８つの２イ ンチ片を入れる。１４のプレートは、約１００の苗木からの葉材材により普通に は設定させる。 ５、　可能な限り長いストリップにその葉を切断する（２−５ｍｍ）。 ６．２５℃において６．５〜７時間ゆっくり振とうする。インキュベーションが 暗い中で起こるようにプレートを覆う。 ７、　プロトプラストを濾過する前に、１００μｍ篩をＩＯｍＩ　Ｏ，６λ１マ ニトールにより洗浄する。プロトプラストをゆっくりと篩からピペットにとる。 皿内に残ったプロトプラストのいずれをも集めるために０．６Ｍマニトールによ りプレートを洗浄する。 ８、　濾過した液体を注意して５０ｍ１の滅菌チューブ内にピペットで入れる。 ９、　卓上遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　ＴＪ−６）内で１０００ 　ｒｐｍ１５００ｇにおいて１０分間回転させる。 １０、酵素溶液を除去し、そして捨てる。ペレットを注意して５ｍ１ｍ１マート ール中懸濁させる。いくつかのペレットをプールする。 ０．６Ｍマニトールにより５０ｍ１までの容量とし、そして回転させる。 １１、既知容量（５０ｍｌ）に再懸濁させ、そして計数を行う。 １２、計数及びペレット化の後、再懸濁バッファー（以下の配合表）中、２ミリ オン／ｍｌにおいてプロトプラストを再懸濁させる。 形質転換の前に少なくとも３０分間、再懸濁バッファー中で、プロトプラストを インキュベーションに供する。 形質転換： １、　プラスミドをチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄポリスチレン１７　ｘ　 １００ｍｍスナップ・キャップ培養チューブ）に部分分け（Ａｌｉｑｕｏｔ）　 Ｉ、　：処理当たり少なくとも３回繰り返し１等しい遺伝子コピー数が比較され るように等モル量のプラスミドを使用する。 ２、０．５ｍｌのプロトプラストを添加し、そして０．５ｍｌの４０％ＰＥＧを ０．６Ｍマニトールにより調製する。 ３、　ゆるやかに混合するまて振とうし、そして３０分間２５°Ｃにおいてイン キュベートする。 ４．５分間の間隔においてプロトプラスト培養基を添加するｌ：１．２．５ｍｌ 　ａ ５、１０００ｒｐ１０００ｒｐにおいて１０分間回転させる。 ６、　ペレットから液体を除去し、そして１ｍｌの培養基（ＢＭＶ培地）中に再 懸濁させる。 ７、−夜、暗い中て２５°Ｃにおいてインキュベートする。 配合表： 酵素溶液 ０．６Ｍマニトール １０ｍＭ　ＭＥＳＳｐ）１５．７ Ｉ　ｍＭ　ＣａＣ１２ １ｍＭ　ＭｇＣ１２ ０，１％ＢＳＡ 滅菌濾過、 上記の溶液に、以下の酵素を添加する１１％Ｃｅ１１ｕｌａｓｅ　Ｒ３１及び０ ．１％Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　ＲＩＯ洗浄バッファー：０．６Ｍマニトール、滅 菌濾過、再懸濁バッファー・０．６Ｍマニトール、２０ｍＭ　ＫＣＩ、滅菌濾過 、培養基　ＢＭＶ培地であって０ｋｕｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈｙｔｏｐａｔ ｈｏｌｏｇｙ　６７：６１０−６１５（１９７７）からの配合表 ０．６Ｍマニトール ４ｍＭ　ＭＥＳ　、　ｐＨ５，７ ０，２ｍｋｌ　ＫＨ２ＰＯ４ １ｍＭ　ＫＮＯ３ ＩｍＭ　ＭｇＳＯａ １０ｍＭ　ＣａＣ１２ ＩＸ　Ｋ３マイクロニュートリエンド（ｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）滅菌濾 過。 形質転換されたプロトプラストのＥＬＩＳＡ検定を、形質転換後１日目に行う。 ＥＬ　Ｉ　ＳＡを先に記載したように行う。以下の３つの実験を、ノイズ同系２ ］　ＩＤにより行う。もちろん、他の系のメイズを使用してもよい。５０μｇの プラスミドｐｃＩＢ４４１９及び等モル量の他のプラスミドを使用する。全可溶 性蛋白を、ＢｉｏＲａｄ蛋白検定を使用して決定する（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８（１９７６））。 形質転換実験： テスト構築物： １、　ｐｃＩＢ４４１９（ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの制御下の合成りｔ並 びに３５Ｓ／ＰＡＴ及び３５／Ｇ［ＪＳマーカー遺伝子を含む構築物）２、　ｐ ｃＩＢ４４２０（髄プロモーターの制御下の合成りｔ及びＦＡＴマーカー遺伝子 を含む構築物） ３、　ｐｃ１８４４２１（ＰＥＰＣプロモーターの制御下の合成りｔを含む構築 物）４、ＰＣｌ３４４２３（ＰＥＰＣプロモーターの制御下の合成りｔ及びＦＡ Ｔマーカー遺伝子を含む構築物） （ＰＥＰＣ：合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）　：ＰｅｐＣイントロン＋３５Ｓ　＋　３ ５Ｓ：ＰＡＴ：３５Ｓ）以下の実験において、１０又は１１１日目２Ｉ１０苗木 を、Ｂｉｏｒａｄ蛋白検定においてＢｔ　Ｃｒｙ［Ａ（ｂ）の生産について分析 する：実験＋（１１１日目苗木）： ｐｃＩＢ４４１９１５，０００±３．０００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃＩＢ４ ４２０２８０±６５　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃ［Ｂ４４２１９．０００±８０ ０　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白実験２（１００日目苗木）。 ｐｃＩＢ４４１９５．０００±２７０　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐＣＩＢ４４２０ ８０±１４　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白１）Ｃ［Ｂ４４２１１．６００±２２０　ｎ ｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白実験３（１１１日目苗木）。 ｐｃ［Ｂ４４１９２１．５００±１，８００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃ［Ｂ４ ４２０２６０±５０　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃｉ８４４２１１１．９００±４ ．０００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃ［Ｂ４４２３７．２００±３．４００　ｎ ｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白上記の実験は、ＣａＭＶ　３５Ｓ及びＰＥＰＣプロモーター の両方が非常に高いレベルにおいて合成りｔ　ＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を発現する ことを確信させた。より少ない効率であるが髄プロモーターも、合成Ｃｒｙ［Ａ （ｂ）蛋白の発現について有効である。 例４４：　レタス内における合成りｔの安定的な発現アグロバクテリウム・ベク ターｐｃＩＢ４４１７内の合成りｔ遺伝子を、しａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ　 ｃｖ、　Ｒｅｄｐｒｉｚｅ（レタス）中に形質転換させる。使用する形質転換の 手順は、Ｅｎｏｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１　Ｒｅｐｏｒ ｔｓ、　９：６−９（１９９０）中に記載されているものである。 形質転換手順： レタスの種を、５％Ｃ１ｏｒｏｘ中て５分間滅菌し、その後無菌蒸留水中で数回 洗浄する。表面滅菌された種を、半強度ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅａｎｄ 　Ｓｋｏｏｇ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　１５：４７３−４９７　（ １９６２））上にブレーティングする。２５°Ｃにおいて１６時間、３，０００ 　ｌｘの明かりの下で成長させた６日目のｔｉｅｄｐｒｉｚｅ苗木の子葉を、ア グロバクテリウム感染の外植体（ｅｘｐｌａｎｔｓ）として使用する。それぞれ の子葉の基及び先端を、メスで除去する。この外植体を、２８°Ｃにおいて適当 な抗生物質を含むＡＢ最小培地中で４８時間培養したバクテリア溶液中に１０分 間、浸漬した。滅菌フィルター紙上で過剰のバクテリア溶液を吸い取った後、そ の外植体を、ＭＳ培地（０，１ｍｇ／ｍｌ　ＢＡ及び０．１ｍｇ／Ｉ　ＮＡＡ） 上に２日間ブレーティングした。次に外植体を、５００ｍｇ／Ｉカルベニシリン （ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌ　ｉｎ）及び５０ｍｇ／Ｉのカナマイラン（ｋａｎａ ｍｙｃｉｎ）を含む選択培地に移す。外植体を、新たな培地に一週間毎に継代培 養する。培養室条件は、２５°Ｃ，１６時間、２，０００　ｌｘである。約４週 間後、ＥＬＩＳＡを、継代培養されている４つのプレートのそれぞれから健康に 見えるカルスに対して行う。このＥＬＩＳＡ手順は、プロトプラストについて先 に記載したものと同しである：可溶性蛋白を、先に記載したようなり１ｏｒａｄ 検定により再び測定する。 結果。 ｐｃＩ８３０２１（カナマイラン対照）　０ｐｃｉ８４４１７（プレー１−１） Ｏ ｐｃ１８４４１７（プレー）２）　５０５　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃ［Ｂ４４ １７（プレート３）　４５　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白ｐｃ［８４４１７（プレート ４）　１，２００　ｎｇ　Ｂｔ／ｍｇ蛋白本例は、双子葉植物も、最適化された 殺虫性遺伝子の増加された発現を示すことを示している。 例４５：　ｐＣ（８４４２９の構築 ｐｃ［Ｂ４４２９は、メイズ最適化ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子と融合した好ましい メイズ花粉特異的プロモーターを含む。この構築において使用される花粉特異的 ノイズ・プロモーターを、例３７中に記載したプラスミドｐＫＬ２から得た。こ のメイズ最適化ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子を、これもまた例３７中に記載したプラ スミドｐｃｉ８４４１８から得た。 ｐＫＬ２は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のベーターグルクロニダーゼ（ｂｅ　ｔａ −ｇ　１ｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子と融合している好ましいメイズ花粉特 異的プロモーターを含むプラスミドである。これを、プラスミドｐｓＫ１１０及 びｐＣ［Ｂ５０５４から構築した。ｐｓＫｌｌｏは、花粉特異的メイズ・プロモ ーターを含む。ｐｃＩＢ３０５４、ｐＵｃ１９誘導体は、カリフラワー・モザイ ク・ウィルス（ＣａＭＶ）　３５Ｓプロモーターと融合した大腸菌（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）ベーターグルクロニダーゼ（ＧｔＪＳ）遺伝子を含む。その構築を、本明 細書中の他の場所に記載する。このプロモーターを、５ａｌｌ／Ｈｉｎｄ［ｌ［ により切断することにより上記のプラスミドから取り出し、ＧＵＳ遺伝子、バク テリアのアンピシリン耐性遺伝子及びＣｏ１Ｅ［複製起点を含む断片を作ること ができる。この第二断片は、ＣａλＩＶ　３５Ｓプロモーターを含む。 ｐｃ［８３０５４を、標準的な条件を使用して、室温において２時間、制限酵素 ５ａｉｌ及びＨｉｎｄｌ［Ｉにより切断した。次に、この反応物を、標準的な条 件を使用してフェニール／クロロホルムにより抽出し、そしてそのＤＮＡを、標 準的な条件を使用してエタノール沈降により回収した。回収したＤＮＡを、ウシ 腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）を含む反応に適切なバッファー中に再懸 濁させ、そして３７℃において一夜、２．５ユニツトのＣＡＰと反応させた。こ のＣＩＰ反応の後、このＤＮＡを、本明細書中で他の場所に記載したような標準 的な条件を使用してアガロース・ゲル上で精製した。ｐｓＫｌｌｏを、室温にお いて２時間標準的な条件下てＳａ目／Ｈｉｎｄ目Ｉにより切断し、そしてその後 、そのＤＮＡを、標準的な条件下でアガロース・ゲル上で精製した。回収したＤ ＮＡ断片を、室温において２時間標準的な条件を使用して結合させ、そしてその 後、標準的な条件を使用してコンピテント大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株ＨＢＩ ＯＩ細胞中に形質転換させる。形質転換細胞を、１００μｇアンピシリン／ｍｌ を含むＬ−寒天上で選択した。形質転換細胞を、標準的なプラスミドのミニ−ス クリーン手順を使用して所望のプラスミド横築物として特徴付けた。正しい構築 物を、ｐＫＬ２と名付けた。 ｐｃｉ８４４２９を作るために、３方結合を、当業者に知られた標準的な条件を 使用し行った。これらの３つの断片は、以下のものてあった１）　ｃｒｙ［Ａ（ ｂ）遺伝子、バクテリアのアンピシリン耐性遺伝子、及びＣｏ１Ｅ１複製起点を 含むサイズ約４．７Ｋｂの、ｐｃＩＢ４４１８からのＨｉｎｄ１１１／Ｂａｍ旧 断片、 ２）サイズ約１．３ＫｂのｐＫＬ２からのＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｒ断片であっ てメイズからの花粉特異的プロモーターを含むもの、３）転写開始から下流に導 入されたＢａｍＨ１部位をもつ花粉プロモーターから得られたＰＣＲ生成断片。 この断片は、約１２０塩基討てあり、そして制限酵素Ｘｂａｌ／ＢａｍＨ［によ り切断された末端をもっている。 このＰＣＲ断片を、１００μｍ反応容量及び先に記載したような標準的な条件を 使用して作った。使用したプライマーは：５に５０：　５’〜ＣＣＣＴＴＣＡＡ Ａ　ＡＴＣＴＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＴ−３’ＫＥ１２７：　５−ＧＣＧ　ＧＡＴ　 ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＧＡ−３’であった。 上記のプライマーを、ＰＣＲ反応においてプラスミドｐｓＫ１０５てあってメイ ズからの花粉特異的プロモーターを含むものと混合した。 このＰＣＲ反応終了後、１０、μｌの反応物を、標準的な条件を使用してアガロ ース・ゲル上で走らせ、その反応物が予想サイズの生成物を作ることを確認した 。残りの９０μｌを最終濃度５０μｇ／ｍｌにおいて３０分間３７°Ｃにおいて プロティカーゼＫにより処理した、次にこの反応物を、６５°Ｃにおいて１０分 間加熱し、次に標準的な手順を使用してフェノール／クロロホルム抽出した。こ のＤＮＡを、標準的な条件を使用して２容量のエタノールにより沈殿させること によりその上澄液から回収した。沈殿後、このＤＮＡを、マイクロフユージ内て 遠心分離により回収した。このベレットを、７０％エタノールで１回濯ぎ（本技 術分野において標準的である）、すへてのエタノールを除去するために簡単に乾 燥させ、そしてそのペレットを１７μｌ　ＴＥバッファー中に再懸濁させた。２ μｌのＩＯＸ制限酵素バッファーを、０゜５　ａ　ｌ　ＢａｍＨ［及び０．５　 μｌ　Ｘｂａｌとなるように添加した。このＤＮＡを、２時間３７°Ｃにおいて 消化し、Ｘｂａｌ／Ｂａｎ旧により切断されたＤＮＡ断片を作った。制限酵素に よる消化の後、この断片を、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ（ＦＭＣ）７１％アガロース・ ゲルから成るアガロース・ゲル上で精製した。 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター装置を、製造者の指示を使用してそのアガロース ・ゲルからそのＤＮＡを溶出させるために使用した。溶出後、このＤＮＡを、先 に記載したような３方結合において使用した。 結合後、ＤＮＡを、標準的な技術を使用してコンピテント大腸菌（Ｅ。 ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩ細胞中に形質転換させた。形質転換細胞を、アンピッリ ンを１００μｇ／ｍｌて含むＬ−寒天上て選択した。選択条件下で増殖させたコ ロ−ニーを、本技術分野において標準的な技術を使用してプラスミド挿入物につ いて特徴付けた。 ｆＮ４６：　ｐｃ［Ｂ４４３１　、すなわち植物内の合成ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝 子の組織特異的発現のためのベクターの構築 ｐｃＩ８４４３１は、メイズを形質転換させるために設計されたベクターである 。それは、ノイズ内で発現可能な２つのキメラのＢｔエントトキンン遺伝子を含 んでいる。これらの遺伝子は、ＰＥＰ／カルポキンラーセターロモーター／合成 −ｃｒｙｌＡ（ｂ）及び花粉プロモーター／合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）である。こ のベクター内のＰＥＰカルボキシラーターｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子は、先に記載 したｐｃ［８４４２１から得られる。花粉プロモーターも先に記載されている。 図２０は、プラスミドｐｃＩＢ４４３１のマツプである。ｐｃ［８４４３１を、 ｐＣ［８４４２９からの花粉／合成−ｃｒｙ［Ａ（ｂ）を含む約３．５にｂのに ｐｎ［／Ｈ１ｎｄ［［ｌ断片、約４．５ＫｂのＨｉｎｄｌ［ｌ／ＥｃｏＲＩ（Ｐ ＥＰＣ／合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ乃及びベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからの約２ ．６ＫｂのＫｐｎ　［／ＥｃｏＲｌ断片を使用した３部結合を介して構築した。 花粉プロモーター／合成ＣｒｙｌＡ（ｂ）キメラ遺伝子を含む他のベクターは、 ｐｃＩＢ４４２８及びＩ＋Ｃ［８４４３０を含む。図２１及び２２を参照のこと 。ｐＣＩ８４４３０も、先に記載したようなＰＥＰＣ／合成−Ｂｔ遺伝子を含む 。 例４７０合成メイズ最適化Ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子を含むトランスジェニック・ ノイズ植物の生産 以下の例は、そこから形質転換細胞か作られるところの、メイズ細胞中にＤＮＡ 被覆粒子を導入するためにＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓを使用する。 実験ＫＣ−６５ 組織特異的プロモーターを使用した合成ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子を発現するトラ ンスジェニック・ノイズ植物の生産組織 長さ約１．５−２．５ｍｍの、未成熟のメイズ胚（ｅｍｂｒｙｏｓ）を、受粉後 １４−１５日目の遺２子型６Ｎ６１５の穂から切除した。母植物（ｍｏｔｈｅｒ 　ｐｌａｎｔ）を、グリーンハウス内で生育させた。切除前、その穂を、２０％ Ｃ１ｏｒｏｘにより２０分間表面滅菌し、そして滅菌水により３回濯いだ。個々 の胚を、カルス開始培地、すなわち、２ＤＧ４　＋　５クロランベン（ｃｈｌｏ ｒａｍｂｅｎ）培地（５ｍｇ／Ｉクロランベン、２０ｍｇ／　ｌグルコース、及 びオートクレーブ後に添加した１０ｍ１　Ｇ４添加物（表１）を含む、Ｎ６主要 塩、Ｂ５微量塩、ＭＳ鉄、２％シュクロース）上に、２平方ｃｍの面積内に胚盤 （Ｓｃｕｔｅｌｌｕｍ）側を上に向けて、すねわち１つのプレートに対し３６の 胚において、置いた。 カゼイン加水分解産物　０．５　ｇｍ プロリン　１．３８　’ｇｍ ニコチン酸　０．２　ｍｇ ピリドキシン−ＨＣｌ　０．２　ｍｇ チアミン−ＨＣｌ　０．５　ｍｇ コリン−ＨＣｌ　０．１　ｍｇ リポフラヒン　０．０５　ｍｇ ヒオチン　０．１　ｍｇ 葉酸（ｆｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）　０．０５　ｍｇパントテン酸Ｃａ　Ｏ，１ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸　０．０５　ｍｇ ＢＩ２　０．　＋３６μｇ 爆撃 組織を、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ　Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を使用して爆撃（ｂ ｏｍｂａｒｄｅｄ）　した。この組織を、その停止スクリーン棚の下８ｃｍの棚 の上に置いた。この組織を、１回、ＤＮＡ／金マイクロキャリアー溶液により射 ち、１０μｌをそのマイクロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリー ンを、１０　Ｘ　１０ステンレス鋼メツンユ・スクリーンを使用してＡＢＲＵに おいて手で孔を開けた。１５５０ρＳ１値の破裂板を使用した。爆撃後、胚を、 暗い中で２５°Ｃにおいて培養した。 デリバリ−のためのＤＮＡの調製 このマイクロキャリアーを、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ装置と共に提供された指示に本 質的に従って調製した。５０μｌを混合する間、１．０μの金マイクロキャリア ー（ｇｏｌｄ　ｍ１ｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）を、５μｌのｐｃ［Ｂ４４３１（１ ，２３μｇ／μｌ）［＃８９８］　＋　２μｌのｐｃ　１８３０６４　（０，８ ９５μｇ／μｌ）［＃４５６］、その後に、５０μｍの２．５Ｍ　ＣａＣ１２、 次に、２０μｍのＯ，１Ｍスペルミジン（ＳｐｅｒｍｉｄｉｎｅＸ遊離塩基、Ｔ Ｃグレード）を添加した。得られた混合物を３分間攪拌し、そして１０秒間マイ クロフユーシした。この上澄液を、除去し、そのマイクロキャリアーを、手短に 混合し、遠心分離し、そしてその上澄液を除去することにより、２５０μＩの１ ００％ＥｔＯＨ（ＨＰＬＣグレード）により２回洗浄した。このマイクロキャリ アーを６５μＩの１００％ＥｔＯＨ中に再懸濁させた。 カルス形成 胚を、爆撃１日後に３ｍｇ／　ＩのＰＰＴを含むカルス開始培地に移した。 胚を、爆撃後２及び３週間後にカルス開始を獲得した。いくつかの反応物を、カ ルス維持培地、２ＤＧ４　＋　０．５２．４−Ｄ培地であって３ｍｇ／ＬＰＰＴ を含むものに移した。カルス維持培地は、０．５ｍｇ／ｌの２．４−Ｄ、２０ｍ ｇ／　ｌグルコース、及びオートクレーブ後に添加した１０ｍ１　Ｇ４添加物を 含む、Ｎ６主要塩、Ｂ５微量塩、ＭＳ鉄、２％シュクロースである。胚形成カル スを、２週間毎に、３ｍｇ／Ｉ　ＰＰＴを含む新たな維持培地に継代培養した。 全てのカルスを、暗い中で２５℃においてインキュベートした。 タイプＩのカルス形成反応は、１５％であった。個々の事件が個々の系を生しさ せるように、カルスを作るそれぞれの胚を培養した。 再生 選択の間の１２週間後、組織を、ＰＰＴを含むカルス維持培地から取り出し、そ して再生培地上に置いた。再生培地は、２週間の０．２５Ｍ５３Ｓ５ＢＡ（０， ２５ｍｇ／　ｌの２．４０．５ｍｇ／ｌ　ＢＡＰ　、　ＭＳ塩、３％シュクロー ス）であり、その後の植物の再生のためにＭＳ３Ｓ培地に継代培養した。４〜ｌ Ｏ週間後、植物を、取り出し、そしてＧＡ７’Ｓ中に置いた。＃１７６　ＢＴ事 件となった我々の系ＫＣ６５０−６は、３８の植物の全体を作り出した。 検定 それらかＧＡ７’　ｓにおいて確立されるようになったとき、全植物を、１９９ １年９月１３日に出願された米国特許出願第０７／７５９．２４３号（この関連 部分を、ここで、引用により本明細書中に取り込む）中に記載されているように ＰＰＴに対する抵抗性についてクロロフェノール・レット（ＣＲ）によりテスト した。この検定は、細胞かＰＰＴの存在中で増殖していることを示すためにｐＨ 感受性指示染料を使用する。増殖細胞は、その培地中のｐＨの変更を作り出し、 そしてこの指示薬を（赤から）黄色に変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現 する植物は、このテストにより容易に観察される。（＃１７６・８陽性／３０陰 性）。ＣＲテストにより陽性な植物を、合成りｔ遺伝子の存在についてＰＣＲに より検定した。（＃１７６・５陽性／２陰性／１致死）。 合成−ＢＴ遺伝子についてのＰＣＲによる陽性の植物を、フィトトロン（ｐｈｙ ｔｏｔｒｏ口）に送った。一旦、フィトトロン内で確立されれば、それらを、昆 虫生物検定及びＥＬＩＳＡ分析を使用して特徴付けした。 植物を、標準的な欧州トウモロコシ穿孔性検定を使用して昆虫生物検定を行い（ 例５Ａ中に記載している）、ここで、植物から摘み取った葉の小片を、多数のＥ ＣＢ新生幼虫が入った小さいペトリ皿内に置いた。植物を、典型的には、約６イ ンチの高さにおいて検定した。 本検定においてＥＣＢに対し１００％の死亡率を示す植物を、以下に示す。 陽性植物を、グリーンハウス内に移した。 グリーンハウス／結実 植物番号＃１７６−１１を、野性型６Ｎ６１５花粉により受粉させた。１つの雄 穂（ｔａｓｓｅｌ　ｅａｒ）及び１つの穂苗（ｅａｒ　５ｈｏｏｔ）を作った。 雄穂（１１）からの胚の全て及び穂ｌからの５６粒（ｋｅｒｎｅｌｓ）を、救出 した（ｒｅｓｃｕｅｄ）。２９４粒は、その穂の上に残り、そして乾燥して自然 に落下した。 ＃１７６−１１からの花粉を、各種のメイズ遺伝型５Ｎ９８４．５ＮＡ８９　、 及び３Ｎ９６１に対し外部交配させた（ｏｕｔｃｒｏｓｓｅｄ）。胚を、３つの 外部交配の（５Ｎ９８４・４５：　５ＮＡ８９・３０：　３Ｎ９６１・８）のす べてから救出した。その仁の大部分が、グリーンハウス内の植物上の穂の上に残 り、そして乾燥して自然に落下した。ＤＮＡを、標準的な技術を使用して植物＃ １７６−１１から単離し、そしてサザン・プロット検定を使用して分析した。こ れは、合成ｃｒｙ［Ａ（ｂ）遺伝子から作られたプローブ及びＦＡＴ遺伝子から 作られたプローブとハイブリダイズする配列を含むことが発見された。これらの 結果は、これらの遺伝子がメイズのゲノム中に取り込まれていることを示した。 実験ＫＣ−６４ 構成的プロモーターを使用した、合成（ｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子を発現するトラン スジェニック・ノイズ植物の生産 机卓 長さ約１．５−２．５ｍｍの、未成熟のメイズ胚を、受粉後＋４−１５日目の遺 ２子ｆｆ１６Ｎ６１５の穂から切除した。母植物を、グリーンハウス内で生育さ せた。切除前、その穂を、２０％Ｃ１ｏｒｏｘにより２０分間表面滅菌し、そし て滅菌水により３回濯いた。個々の胚を、カルス開始培地、すなわち、２０Ｇ４ 　＋　５クロランヘン培地（５ｍｇ／ｌクロランベン、２０ｍｇ／　］グルコー ス、及びオートクレーブ後に添加した１０ｍ１　Ｇ４添加物（表１）を含む、Ｎ ６主要塩、Ｂ５微量塩、ＭＳ鉄、２％シュクロース）上に、２平方ｃｍの面積内 に胚ｕ（ｓｃｕｔｅｌ　Ｉｕｍ）側を上に向けて、すねゎち１つのプレートに対 し３６の胚において、置いた。 カセイン加水分解産物　０．５　ｇｍ プロリン　１．３８　ｇｍ ニコチン酸　０．２　ｍｇ ビリトキンンーＨＣＩ　０．２　ｍｇ チアミン−ＭＣＩ　０．５　ｍｇ コリン−ＨＣｌ　０．１　ｍｇ リホフラヒン　０．０５　ｍｇ ヒオチン　０．１　ｍｇ 葉酸　０．０５　ｍｇ パントテン酸Ｃａ　Ｏ，１ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸　０．０５　ｍｇ ８１２　０、１３６μｇ 爆撃 組織を、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ　Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を使用して爆撃（ｂ ｏｍｂａｒｄｅｄ）シた。この組織を、その停止スクリーン棚の下８ｃｍの棚の 上に置いた。この組織を、１回、ＤＮＡ／金マイクロキャリアー溶液により射ち 、ｌＯμｌをそのマイクロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリーン を、１０　Ｘ　１０ステンレス鋼メツシユ・スクリーンを使用してＡＢＲＵにお いて手で孔を開けた。１５５０ｐｓｉ値の破裂板を使用した。爆撃後、胚を、暗 い中で２５°Ｃにおいて培養した。 デリバリ−のためのＤＮＡの調製 このマイクロキャリアーを、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ装置と共に提供された指示に本 質的に従って調製した。５０μｌを混合する間、１．０μの金マイクロキャリア ーを、３．２μｌのｐｃｌＢ４４１８（０，８５μｇ／μｍ）［＃９０５］　＋ ２μｍのｐｃＩＢ３０６４（０，８９５μｇ／μｌ）［＃４５６］　＋　１．６ μｌのｐｃＩＢ３００７Ａ（１゜７　μｇ／μｌ［＃＋５２］　、その後に、５ ０μｌの２°５Ｍ　ＣａＣ１２、次に、２０μｌの０．１Ｍスペルミジン（遊離 塩基、ＴＣグレード）を添加した。得られた混合物を３分間攪拌し、そしてｌＯ 秒間マイクロフユージした。 この上澄液を、除去し、そのマイクロキャリアーを、手短に混合し、遠心分離し 、そしてその上澄液を除去することにより、２５０μｌの＋００％ＥｔＯＨ（Ｈ ＰＬＣグレート）により２回洗浄した。このマイクロキャリアーを６５μｍの１ ００％ＥｔＯｌ（中に再懸濁させた。 胚を、爆撃１日後に３ｍｇ／　ＩのＰＰＴを含むカルス開始培地に移した。 胚を、爆撃後２及び３週間後にカルス開始を獲得した。いくつかの反応物を、カ ルス維持培地、２０Ｇ４　＋　ｏ、５２．４−Ｄ培地であって３ｍｇ／ＬＰＰＴ を含むものに移した。カルス維持培地は、ｏ、５ｍｇ／ｌの２．４−Ｄ、２０ｍ ｇ／　Ｉグルコース、及びオート・クレープ後に添加したｌｏｍｌ　Ｇ４添加物 を含む、Ｎ６主要塩、Ｂ５微量塩、ＭＳ鉄、２％シュクロースである。胚形成カ ルスを、２週間毎に、３ｍｇ／ｌ　ＰＰＴを含む新たな維持培地に継代培養した 。全てのカルスを、暗い中で２５°Ｃにおいてオンキュベートした。 タイプＩのカルス形成反応は、１８％であった。個々の事件が個々の系を生じさ せるように、カルスを作るそれぞれの胚を培養した。 再生 選択の間の１２週間後、組織を、Ｉ’ＰＴを含むカルス維持培地から取り出し、 そして再生培地上に置き、１６時間の明かり（５０με・ｍ　−２・ｓ−’）／ ８時間の暗闇の光期間（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ）を使用して２５°Ｃにおいて インキュベートした。再生培地は、２週間の０．２５Ｍ５３Ｓ５ＢＡ（０，２５ ｍｇ／　ｌの２．４０．５ｍｇ／ｌ　ＢＡＰ　、　ＩＡＳ塩、３％シュクロース ）であり、その後の植物の再生のためにＭＳ３Ｓ培地に継代培養した。４〜ｌＯ 週間後、植物を、取り出し、そしてＧＡ７’Ｓ中に置いた。１１１７０　ＢＴ事 件となった我々の系ＫＣ６４０−１は、５５の植物を作り出した。＃１７１　Ｂ Ｔ事件となった我々の系ＫＣ６４０−７系は、全部で３３植物を作り出した。 検定 それらがＧＡ７’　ｓにおいて確立されるようになったとき、１１の植物を、上 記の５ｈｉｌｌｉｔｏ　ｅｔ　ａｌによるＰＰＴに対する抵抗性についてクロロ フェノール・レッド（ＣＲ）によりテストした。この検定は、細胞がＰＰＴの存 在中で増殖していることを示すためにｐＨ感受性指示染料を使用する。増殖細胞 は、その培地中のｐＨの変更を作り出し、そしてこの指示薬を（赤から）黄色に 変える。ＰＰＴに対する耐性遺伝子を発現する植物は、このテストにより容易に 観察される。ＣＲテストにより陽性な植物を、合成りＴ遺伝子の存在についてＰ ＣＲにより検定した。（事件１７０　＝３７陽性／１Ｂ陰性；＃１７１・２５陽 性／８陰性）。 合成−Ｂｔ遺伝子についてのＰＣＲによる陽性の植物を、フィトトロンに送った 。一旦、フィトトロン内で確立されれば、それらを、昆虫生物検定及びＥＬＩＳ Ａ分析を使用して特徴付けした。植物を、標準的な欧州トウモロコシ穿孔性動物 検定（以下を参照のこと）を使用して昆虫生物検定を行い、ここで、植物から摘 み取った葉の小片を、多数のＥＣＢ新生幼虫が入った小さいベトリ皿内に置いた 。植物を、典型的には、約６インチの高さにおいて検定した。本検定においてＥ ＣＢに対し１００％の死亡率を示す植物を、さらに特徴付けする。εＬＩＳＡデ ータを以下に示す。陽性植物を、グリーンハウス内に移す。 Ｂａ５ｔａスクリーニング ＃１７０事件からの成熟植物の中の８つを、Ｂａ５ｔａ（Ｈｏｅｃｈｓｔｌ耐性 の評価について選択した。植物毎に１つの中央の葉上て、約１０−１４　ｃｍ長 さＸ　葉幅の面積を、０．０．４．１．０又は２．０％（脱イオン水により１０ ０ｍ１に希釈された２００ｇ／ｌの１０ｍ１）の水性Ｂａ５ｔａであって２滴の Ｔｗｅｅｎ　２０／ｌｏＯｍｌを含むものを塗布した。２つの植物を、レベル毎 にテストした。同一の概齢の８つの野性型６Ｎ６１５植物を、対照として処理し た。すべての植物を、４及び７日目に観察した。対照植物のすべてが最終的に死 に至った。本研究を通して、＃１７０植物は、その除草剤によるダメージのいず れについても全く示さなかった。 受粉 ＃１７０及び＃１７１植物上の、すべての雄穂（ｔａｓｓｅｌ　ｅａｒ）、第− 穂（ｆｉｒｓｔ　ｅａｒ）　、入手可能な場合には、第二穂（ｓｅｃｏｎｄ　ｅ ａｒ）を、野性型６Ｎ６１５花粉により受粉させた。この植物の少なくとも９０ ％は、雌の結実能力があった。 ＃１７１植物からの花粉を、遺伝型６Ｎ６１５．５Ｎ９８４．５ＮＡ８９．６Ｆ Ｏ１０、５ＮＡ５６．２Ｎ２＋７ＡＰ　、２ＮＤＯ１及び３Ｎ９６１に対し外部 交配させた。この植物の少なくとも９０％は、雄の結実能力があることが示され た。 胚救出（Ｅｍｂｒｙｏ　Ｒｅ５ｃｕｅ）＃１７１事件からの胚を、”救出“した 。受粉後１６６日目日目１４の、２５−５０粒をもつ穂の先端（ｅａｒ　ｔｒｐ ）を、糸のこ（ｃｏｐｉｎｇ　ｓａｗ）によりその穂から切断した。切断に先立 って、皮（ｆｕｓｋｓ）を、穏やかに剥きその穂の上の部分を露出させた。その 植物上の穂の切断端を、Ｃａｐｔａｎ殺菌剤て塗布し、そして皮を被せた。その 植物上に残った種を、自然に乾燥させた。 摘出した穂片を、２０％Ｃ１ｏｒｏｘにより２０分間表面滅菌し、そして無菌水 て３回濯いだ。個々の胚を、摘出し、そして胚盤側を上にして２％シュクロース を含むＢ５培地［Ｇａｍｂｏｒｇ］上に置いた。Ｂ５ビタミンを、オートクレー ブ後にその培地に添加した。４つの胚を、ＧＡ７容器毎に入れ、そしてその容器 を、暗い中でインキュベートした。発芽か生じるとき、この容器を、明るい培養 室に移し、そして１６時間明かり（５０μＥ　−ｍ−”・ｓ　−’）　／８時間 暗い光期間を使用して２５°Ｃにおいてインキュベートした。この発芽の頻度は 、９４％である。＃１７１事件の中の１５Ｍ物及び＃１７６事件の中の２からの 子孫を、標準的な胚救出技術を使用して救出し、そして評価した。すべての植物 を、昆虫検定により評価した。＃１７１事件からの植物を、組織化学的ＧＵＳ検 定においてもテストした。昆虫検定及びＧＵＳ検定の両方において、転移遺伝子 の分離比は、単−座挿入事件について予想されるように、ｌ：ｌてあった。 例４８ニドランスジェニック植物ＥＬＩＳＡ検定の分析トランスジェニック・ノ イズ内でのｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子発現の検出を、欧州トウモロコシ穿孔性動物 （ＥＣＢ）昆虫生物検定並びに得られたｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白レベルの定量的測 定についてのＥＬ［ＳＡ分析を使用して監視した。トランスジェニック植物の葉 内のｃｒｙ［Ａ（ｂ）　ＩＰの定量的測定を、Ｃ１ａｒｋ　Ｍ　Ｆ、　Ｌｉ５ｔ ｅｒ　ＲＭ、　Ｂａｒ−Ｊｏｓｅｐｈ　Ｍ：　ＥＬｒＳＡ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ。 Ｉｎ：　Ｗｅｓｓｂａｃｈ　Ａ、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ　Ｈ（ｅｄｓ）　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１８ニア４２−７６６、　Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｆｌｏｒｉｄａ　（１９８６）中に開示されているよう な酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）を使用して行った。 免疫アフィニティー精製ポリクロナール・ウサギ及びヤギ抗体であ白ｍｇ当たり のＩＰのｎｇを測定するために使用した。この２重すンドイッチＥＬＩＳＡの感 度は、ＥＬＩＳＡマイクロタイター皿ｗｅｌｌ当たりの５０μｇの全蛋白を使用 して可溶性蛋白ｍｇ当たり１ｌ−５ｎ　ＩＰである。 トウモロコシ抽出物を、抽出バッフ　−ｒ　（５０ｍＭ　Ｎａｔ　ＣＯｓ　ｐＨ ９，５゜１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｒｉｔｏｎ、　０．０５％Ｔｗｅ ｅｎ　、　１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１　μＭ　ロイペプチン）の存在中で手でもっ たボール−ベアリング・ホモゲナイザー（ＡＧＤｒＡ、　Ｅｌｋａｒｔ　ＩＮ、 ）を使用して細線プラスチック容器内で葉組織を破砕することにより調製した。 蛋白測定を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）蛋白検定を使用して 行った。 上記の手順を使用して、先に記載したような主要なメイズ形質転換体を、ＥＬＩ ＳＡを使用してｃｒｙ［Ａ（ｂ）蛋白の存在について分析した。 これらの植物を、分析のときに、６インチから約３フイートまでの高さ内でばら ついていた。 植物　Ｂｔ　ｎｇ／ｍｇ可溶性蛋白　５／２７／９１１７１−４Ａ　５９ １７１−１４Ａ　４３ ＋７１−１５　５５ １７１−１６Ａ　１３ １７６−３０　１１６０　・ ＋７１−３１　１６６ ＋７１−３０　３７０ ７］−１４ ＃ｌＯ葉　２６ １葉　１７ 植物１７１−１６ ４９葉　４０ ４１葉　１２０ 欧州トウモロコシ穿孔性動物検定 １、１〜４０４ｃｍセクションを、トウモロコシ植物の広がった葉から切断する 。 ２、　それぞれの葉片を、５０　ｘ　９ｍｍペトリ皿内の湿らせたフィルター・ ディスク上に置く。 ３．５匹の新生欧州トウモロコシ穿孔性動物を、それぞれの葉片の上に置く。（ 植物当たり全部で５−２０幼虫とする）４、　ペトリ皿を、２９．５°Ｃにおい てインキュベートする。 ５、　葉の食べられたダメージ及び死亡率データを、２４．４８、及び７２時間 目において得る。 酔：形質転換メイズ植物の子孫内でのＳｔエンドトキシンの発現形質転換メイズ 植物を、十分に結実させ、そしてい（っかの遺伝子型のノイズと交配させた。こ れらの交配からの子孫を、標準的なＥＣＢ生物検定（直前に記載したもの）にお ける欧州トウモロコシ穿孔性動物（ＥＣＢ）のそれらの殺生能力につい云、並び に先に記載したようなＥＬｒＳＡを使用したｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白の存在につい て分析した。ＰＣＢ殺生能力とｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白生産とは相関があった。こ れらの特性（ｔｒａｉｔｓ）は、その子孫にｌ＝１の比で分離され、その合成遺 伝子の活性コピーについて単一部位の挿入でることを示している。このｌ：ｌの 比は、構成的プロモーター／合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）植物及び組織特異的プロモ ーター／合成−ｃｒｙｌＡ（ｂ）植物（データを示さず）の両方につぃて真実で あった。 図２３Ａは、分析した子孫の全体数の小さなサブセットを含む表である。この表 は、多数の交配の代表である。 昆虫検定を、メイズ最適化ＣｒＹＩＡ（ｂ）遺伝子を含むトランスジエニ果を、 図２３８中に示す。これらは、形質転換メイズ内のメイズ最適ｐｃＩ８４４３１ から得られたキメラ花粉プロモーター／合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子を含む形質 転換メイズ植物の子孫を、畑において成熟まで成長させた。花粉を回収し、そし て他の場所で先に記載したような標準的なＥＬｒＳＡ技術を使用してｃｒｙｌＡ （ｂ）蛋白の存在について分析した。 高いレベルのｃｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を、その花粉内で検出した。３５Ｓプロモ一 ター／合成ｃｒｙｌＡ（ｂ）形質転換植物からの子孫を、グリーンハウス内で成 長させた。これらの植物からの花粉を、ＥＬ［ＳＡを使用して分析し、モしてｃ ｒｙｌＡ（ｂ）蛋白を検出した。 結果を、図２３Ｃ中に示す。 植物系、植物遺伝型、合成配列、等の選択を含む要因も発現に影響することがで きることを認識した。 例５１：髄好適プロモーターに融合されたｃｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子の発現１）Ｃ ［Ｂ４４３３（図３６）は、ノイズから単離された髄好適プロモーターに融合さ れたメイズ最適化Ｃｒｙ　［Ａ（ｂ）遺伝子を含むプラスミドである。 このプラスミドを、以下の。 １）ＢｓｔＥＩＩ及びＢａｍＨＩにより切断されたｐｃ［Ｂ４４１８；　１．８ Ｋｂ断片、２）Ｎｓｉｌ及びＢｓｔＥＩＩにより切断されたｐＢｔｉｎｌ；　５ ．９Ｋｂ断片、（ｐＢｔｉｎｌは、本明細書中で他の場所に記載したものである 。）３）本明細書中で他の場所に記載したような標準的な条件を使用したＰＣＲ 反応において作られたＰＣＲ断片Ｖｌ−１５１゜から成る３方結合を使用して構 築した。 ＰＣＲプライマーは： ＫＥ１５０Ａ２８：　５−ＡＴＴ　ＣＧＣＡＴＧ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　Ｔ ＴＡ　ＴＣ−３゜ＫＥ１５１Ａ２８：　５−ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＣＧ　Ｇ ＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣ−３゛ であった。 ＰＣＲ反応後、このＤＮＡを、アガロース・ゲル上でチェクし、その反応が適切 に進行下かどうかを確認した。ＤＮＡを、他の場所に記載したような標準的な条 件を使用したＰＣＲ反応から最終し、そしてその後標準的な条件を使用して制限 酵素Ｎｓｉ［及びＢａｍＨＩにより切断した。切断後、断片を、２％ＮｕＳｉｅ ｖｅゲル上で走らせ、そして所望のバンドを、他の場所に記載したように回収し た。ＤＮＡを、先に記載したような結合において使用した。 形質転換を、本質的に本明細書中で他の場所に記載したようなマイクロプロジェ クタイル・ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒ ｄｍｅｎｔ）を使用して行った。胚を、マイクロプロジェクタイル・ボンバード メントの２４時間後、１００μｇ／ｍｌのＰＰＴを含む培地に移した。得られた カルスを、４週間後、４０μｇ／ｍｌのＰＰＴを含む培地に移した。植物は、選 択なしに再生された。 植物小サンプル（３−５）を、それぞれの事件についてＰＣＲにより検・定した 。さらなるコートを、上記のマイクロプロジェクタイル・ホンバードメント装置 に関して、胚の異なる位置及び距離を示すために付加した。植物を、以下のコー ドをもつグリーンハウスに送った： ＪＳ２１Ａ　ＴＯＰ　植物Ｂ、ｔ、　ＰＣＲ陽性ＪＳ２＋Ａ　ＭＩＤ　植物Ｂ、 ｔ、　ＰＣＲ陽性ＪＳ２１ＣＢＯＴ　植物Ｂ、ｔ、　ＰＣＲ陽性ＪＳ２２Ｄ　Ｍ ＩＤ　植物Ｂ、ｔ、　ＰＣＲ陽性ＪＳ２３Ｂ　ＭＩＤ　植物Ｂ、ｔ、　ＰＣＲ陰 性（対照のためのもの）再生植物からの葉サンプルを１例４８中に記載したよう に欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する殺虫活性について生物検定した。結果を 、図２３Ｄ中に示す。 葉内て発現されたＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白のレベルを定量するための葉サンプルの ＥＬＩＳＡ分析を、例４８中に記載したように行った。結果を、図２４Ｅ中に示 す。 寄託 以下のプラスミドを、ブタペスト条約の規定の下、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲ ｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）（１８ １８Ｎ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｔ、。 Ｐｅｏｒｉａ、　ｒＬ　６１６０４）に寄託した：ｐＣＩＢ４４１８　、ｐｃＩ Ｂ４４２０、ｐｃＩＢ４４２９、ｐｃ［Ｂ４４３１．　ｐＣ［Ｂ４４３３、ｐｃ ［Ｂ５６０１Ｓｐｃ［Ｂ５１６６及びｐｃｉ８３１７１゜本発明は、それらの特 異的な態様を参照しながら記載してきた；しかしながら、多くの変更、修正、及 び態様が可能であることは明らかであろう。したがって、このような変更、修正 、及び態様のすべてが、本発明の核心及び範囲内にあるものとして認識されるべ きである。 配列表 （い一般情報 （ｉ）出願人： Ｅｖｏｌａ、　５ｔｅｐｈｅｎ　Ｖ。 Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ、　Ｌｙｌｅ　Ｄ。 Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｍａｒｊｈａ　Ｓ。 Ｍｅｒｌｉｎ、　Ｅｌｌｉｓ　Ｊ。 Ｌａｕｎｉｓ、　にａｒｅｎ　Ｌ。 Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　５ｔｅｖｅｎ　Ｊ。 （１、発明の名称・メイズ内において強化された殺虫活性をもつ合成りＮＡ（口 １）配列数５ （ｉｖ）通信住所。 （Ａ）チバーガイギー・コーポレーション（ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）（Ｂ）番地：　７５ｋｙｌｉｎｅ　Ｄｒｉｖｅ（Ｃ）市：　Ｈａ ｗｔｈｏｒｎｅ （Ｄ）州：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （Ｅ）国：　ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　＋１０５３２（Ｖ）コンピューター読込形態： （Ａ）媒体形式　フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティング・システム： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔ［ｎ　Ｒｅ１ ｅａｓｅ　Ｈ，０，ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５（ｖｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号・ＵＳ （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）代理人／ニーツエン）憤報ＣＧＧＧＧＣＣＡＧＡ　ＡＴＴＣＡＣ丁 丁丁τ　ＣＣＧＣＴＡＴＡτＧ　ＧＡＡＣＴＡＴＧＧＧ　入ＡＡＴＧｃＡＧｃＴ 　ＣＣＡＣＡＡＣＭb＋２００ ＣＡＣＴＡＧＣＴＣＧ　ＴＧＴＧＡＡ入ＡＧＡ　ＧＣＧＣ−ＡＣＡＡＡＡ　ＡＡ ＴＧｃＡＣＡＧＡ　ＣＡＡＡＣＧＴＣＡＡ　ＡＡＡＴＴＧＧ`ＡＴ　２７６０ ＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡ　τＡＴτＧτＴＴＡＴ　ＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡ　ＡＡＧ ＡＡＴＣＴＧＴ　ＡＧＡＴＧＣＴ？ＴＡ　ＴＴＴＧＴＡＡＡbＴ　２１２０ ＣＡＴＧＴＡＴＡτＣＣτＧＧＧＴＣＡＧＧ　ＴＧＧ’ｒτＧＴにＣＡ　Ｃ入Ａ ＡＣ丁ＧＣＡＧ　、４３６０（２）配列番号　２ （１）配列の特徴 ＜Ａ）配列の長さ　３４７４塩基対 （Ｂ）配列の梨　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本領 （Ｄ）トポロン−直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル　存り （１ｖ）アンチ−センス　否 （ｖｌ）起源 （Ａ）生物名　純粋なノイズ最適化合成りＴ　ＣｒｙｌＡ（ｂ）遺伝子（ｘｉ） 配列の記載　配列番号２ ＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡ　ＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＧＧ ＣＣＡＧＴ　ＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧ　ＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧ@９４；０ ＡＴＣＡτＧＧＣＣ入　ＧＣＣＣＣＧＴＧＧＧ　ＣττＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣ ＡＧττＣＡ　ＣＣττＣＣＣＣＣＴ　ＧＴＡＣＧＧＣ入Ｃb１０２０ ＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧ　ＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＣ ＧＣＧＴＧＡ　ＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡ　ＣＡＡＣＡＡＧＴＧf　、２５８０ （ｃｃｃＡｃＡＡｃｃ　ＧＣＧＡＧ）ＪｋＧＣＴ　ＧＧＡＧＴＧＧＧ）＋Ｇ　Ａ ＣＣＡＡＣＡＴＣＧ　丁ＧＴＡＣＡＡＧＧＡ　ＧＧＣＣＡ＾fＣＡＧ　２６４０ （２）配列番号　３ （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ　１９６１塩基対 （８）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数・一本領 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （Ｖ蓄）起ｄ１ ＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡ　ＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧ　ＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＧ ＧＣＡＡＣＴ　ＴＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴ（−ＡＧＣＡＧb，１６８０ ＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧ　ＣＡＧＣττＣＣＧＣＡＣＣＧτ ＧＧＧＣＴ　ＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴτＣＡＡＣ丁丁Ｃ１V４０ （２）配列番号　］ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３５０８塩基対 （Ｂ）配列の盟　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本領 （０）トポロジー・直鎖状 （目）配ダクの種類　ＤＮＡ （１ｖ）アノチーセンス　否 （ｖｌ）起源 ＧＴＧ丁ＧＧＧＧ丁Ｃ’ｌ：ｃｃＡｃＡＧｃｃＧ　ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧ 丁ＡＣＡＡＣＣＡＧＴ丁ＣＣＧＣＣＧ　ＣＧＡＧＣ丁ＧＡＣb７２０ ＣＴＧＡＣＣ’；丁Ｇこ　τＧＧＡＣＡＴＣＧＴ　ＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣ ＡＡＣＴＡＣＧ　ＡＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣ入丁b７１１（Ｉ ＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴにＧＡＧＡ丁Ｃ丁ＡＣＣτＧ入ＴＣＣＧＣＴＡＣλＡＣ ＧＣＣ入　ＡＧこＡＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣ；丁Ｇ　Q３４０ ＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧ　ＧＣＡＧＣＣＴＧＴに　ＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＣ ＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡ　ＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣQ＜ｏ。 ＡＴＧＴＧＡＴＡＧＴ　ＡＣにτＡＡＧＣＴＣＣＡＧ（ｓ入子Ｃτ　３５ｏ８（ ２）配列番号　５ （１）配列の特徴 （Ａ）配列Ｉの長さ　１８４５塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本領 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ （１■）アンチ−センス　否 （ｖｌ）起源 （Ａ）生物名　切り詰めｅｍだ合成りＴ遺伝子（Ｐｅｒｌａｋ　ｅ４　ａｌ、） （ｘｉ）配列の記載　配列番号５ ＣＧＴＡＴＴＣＡＧＴ　ττＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣ，υ心τＴＡＣＣττＣＣＡ ＧＧＣτＧＡＧτＡＣ１８４５３７０　：］８０　３９０　４００　４１０　４ ２０４３０　４４０　４５０　４６０　４７０　４Ｂ０１０３０１０４０１０５ ０１０６０１［１７０１０８０１０９０１１００１１１０１１２０１ＤＯ１１４ ０１１５０１１６０１１７０１１［］０　１１９０　＋２００１２７０　１２８ ０　１２９０　１’１００　１３１０　１３２０葺１夏璽蔓棗 ２９４０　２９５０　２９６０　２９７０　２９Ｂ０　２９９０ＦＩＧ、１１ 頁　１　１　１　１　１ 夏　Ｉ　夏　Ｉ　葺　蒐 ３３６０　３：３７０　３３８０　３３９０　３４００　３４１０葺ｌＩ夏葺葺 葺 ＋０　２０　３０　４０　５０　６０ Ｉ　葺　Ｉ　葺　Ｉ　菟 ＢＴＨＫＵＲＨＤ　Ａ丁［１１ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＧＭＣ＾ＴＣ品ＴＧＭＴ ＧＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＭＴＴＧＴＴＴＭＧＴＭ口ＣＣＴＧ`Ａ ｂｓｓｙｎ　、、、　、、Ｃ，、、、、Ｃ，、Ｃ，、、、、、、、Ｃ，、Ｇ、、 、、、Ｃ，、Ｃ，、Ｃ，、Ｃ，、ＣＣ，Ｇ、　、Ｃ，、、、AＣ，、Ｃ ７０８０９０１００１１０１２［Ｉ Ｉ　Ｉｔ　Ｉ　璽　麦　夏 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　ＡｎＭＧＡＣＧＣＡＡＧＡＴ６ＧＣＣＡ　ＴＧＣＭＧＡＣs＾ ＧｌｕＡｓｐＬｅｕ　ＧＩｙＶｃｌＴｒｐ　Ｖ＋１＋１１ｅＰｈｅＬｙｓ　Ｉ　 ＩｅＬｙｓＴｈｒ　ＧＩｎＡｓｐＧｌｙ　Ｈｌｓ＾ｌｃＡｒ■kｅｕ ３５４１ＧＡＡ丁Ａへ Ｇｌｕ−−− ＦＩＧ、３７Ｅ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。 ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ Ｏ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　ルイス、ケリー　ニス。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７２７８　、ヒルズボロー、ラトーニ　ドライブ１５０８ （７２）発明者　クラマー、パンス　シー。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７２７８　、　ヒルズポロー、ダナ　コート　６０８（７２）発明者　ウォー レン、グレゴリ−ダブリュ。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７５１３　、キャリー、ボン〜ド　レイク　ドライブ　３２４ （７２）発明者　エボラ、ステイーブン　ブイ。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７５０２　、アペックス、イースト　ビーチモント　サークル　１０１３ （７２）発明者　クロスランド、ライル　ディー。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７５１４　、チャペル　ヒル、ピンチヨツトレーン　１０８ （７２）発明者　ライト、マーサ　ニス。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７５１１、キャリー、プリンス　ウィリアムレーン　１０６ （７２）発明者　マーリン、エリス　ジェイ。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７６１５　、　ラレイ、ストーンゲイト　ドライブ８６０５ （７２）発明者　ローニス、カレン　エル。 アメリカ合衆国、ノース　カロライナ ２７５２５　、フランクリントン、サドルビューレーン　１０４ （７２）発明者　ロススティン、ステイーブン　ジエイ。 カナダ国、オンタリオ　エフ１ニー　ｌニー５．ギュールフ、フィールドストー ン′　ロード　１５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．昆虫を殺すことができる蛋白をコードしているメイズ最適化コード配列を含 んで成るヌクレオチド配列。 ２．コード配列がＢ．ｔ．蛋白をコードしている、請求項１に記載のヌクレオチ ド配列。 ３．コード配列がＣｒｙＩＡ（ｂ）蛋白をコードしている、請求項２に記載のヌ クレオチド配列。 ４．コード配列が、配列番号３、配列番号４、又は図７中に記載した配列を含ん で成る、請求項３に記載のヌクレオチド配列。 ５．コード配列が生来のＣｒｙＩＡ（ｂ）蛋白と比較して熱安定性であるＣｒｙ ＩＡ（ｂ）蛋白をコードしている、請求項３に記載のヌクレオチド配列。 ６．コード配列が、図９、図１１、図１３及び図１５から成る配列群から選ばれ た配列を含んで成る、請求項５に記載のヌクレオチド配列。 ７．コード配列がＣｒｙＩＢ蛋白又はＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白をコードしている、 請求項２に記載のヌクレオチド配列。 ８．コード配列が図６中に記載したＣｒｙＩＢ蛋白をコードしている配列を含ん で成る、請求項７に記載のヌクレオチド配列。 ９．植物細胞内でヌクレオチド配列を発現させることに向けられることができる 第一プロモーターであってそのコード配列に作用可能な状態で結合されているも のをさらに含んで成る、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 １０．プロモーターをメイズ細胞内でその結合されたコード配列を発現させるこ とに向けることができる、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 １１．プロモーターが誘導性プロモーター、構成的プロモーター、一時的なプロ モーター又は発展的に調節されたプロモーター、組織好適プロモーター、及び組 織特異的プロモーターから成る群から選ばれている、請求項９に記載のヌクレオ チド配列。 １２．ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＰＥＰカル ボキシラーゼ・プロモーター、髄好適プロモーター、及び花粉特異的プロモータ ーから成る群から選ばれている、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 １３．プロモーターが図２４中に記載されたＤＮＡ配列を含んで成る髄特異的プ ロモーターである、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 １４．プロモーターが図３５中に記載されたＤＮＡ配列を含んで成る花粉特異的 プロモーターである、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 １５．植物細胞内で関連コード配列を発現させることに向けられることができる 第二プロモーターであって第二コード配列に作用可能な状態で結合されているも のをさらに含んで成る、請求項９に記載のヌクレオチド配列。 １７．第二プロモーターが誘導性プロモーター、構成的プロモーター、一時的な プロモーター又は発展的に調節されたプロモーター、組織好適プロモーター、及 び組織特異的プロモーターから成る群がら選ばれている、請求項１５に記載のヌ クレオチド配列。 １８．第二プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモ ーター、ＰＥＰカルボキシラーゼ・プロモーター、髄好適プロモーター、及び花 粉特異的プロモーターから成る群から選ばれている、請求項１５に記載のヌクレ オチド配列。 ２１．第二コード配列が昆虫を殺すことができる蛋白をコードしている植物最適 化コード配列である、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。 ２２．第二コード配列がＢ．ｔ．蛋白をコードしている、請求項２１に記載のヌ クレオチド配列。 ２３．第二コード配列がＣｒｙＩＡ（ｂ）蛋白をコードしている、請求項２２に 記載のヌクレオチド配列。 ２９．第二コード配列がマーカー遺伝子である、請求項１５に記載のヌクレオチ ド配列。 ３０．請求項９に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、組換えベクター。 ３１．請求項９に記載のヌクレオチド配列であってそのコード配列がＢ．ｔ．蛋 白をコードしているものを含んで成る、組換えベクター。 ３２．Ｂ．ｔ．蛋白がＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白である、請求項３１に記載の組換え ベクター。 ３３．請求項１５に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、組換えベクター。 ３４．請求項１８に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、組換えベクター。 ３５．請求項２２に記載のヌクレオチド配列を含んで成る、組換えベクター。 ３６．請求項９に記載のヌクレオチド配列により安定的に形質転換された植物。 ３７．請求項１２に記載のヌクレオチド配列により安定的に形質転換された植物 。 ３８．第二コート配列がＢ．ｔ．蛋白をコートしている、請求項３６に記載の植 物。 ３９．蛋白がその植物内で鱗翅目又は鞘翅目の昆虫を制御するのに十分な量で発 現されている、請求項３６に記載の植物。 ４０．Ｂ．ｔ．蛋白がＣｒｙｌＡ（ｂ）蛋白である、請求項３８に記載の植物。 ４１．Ｂ．ｔ．殺虫性蛋白を鱗翅目又は鞘翅目の害虫を制御するのに十分な鼠で 発現している、請求項３８に記載の植物。 ４２．その量が、欧州トウモロコシ穿孔性動物（Ｅｕｒｏｐｅａｎｃｏｒｎｂｏ ｒｅｒ）、サトウキビ穿孔性動物（ｓｕｇａｒｃａｎｅｂｏｒｅｒ）、マダラメ イガ（ｓｔａｌｋｂｏｒｅｒ）、ネキリムシ（ｃｕｔｗｏｒｍｓ）、アワヨトウ の幼虫（ａｒｍｙｗｏｒｍＳ）、植物の根を食う昆虫の幼虫（ｒｏｏｔｗｏｒｍ ｓ）、コメツキムシの幼虫（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）及びアブラムシ（ａｐｈｉｄ ｓ）から成る群から選ばれた昆虫を制御するのに十分なものである、請求項３８ に記載の植物。 ４３．請求項１５に記載のヌクレオチド配列により安定的に形質転換された植物 。 ４４．請求項１８に記載のヌクレオチド配列により安定的に形質転換された植物 。 ４５．第一コード配列及び第二コード配列のそれぞれがＢ．ｔ．蛋白をコードし ている、請求項４３に記載の植物。 ４６．Ｂ．ｔ．殺虫性蛋白を鱗翅目又は鞘翅目の害虫を制御するのに十分な量で 発現している、請求項３８に記載の植物。 ４７．その量が、マダラメイガ（ｓｔａｌｋｂｏｒｅｒ）を制御するのに十分な ものである、請求項４６に記載の植物。 ４８．植物内で結合構造遺伝子の髄好適発現に向けられることがきる単離及び精 製されたプロモーター。 ４９．単子葉から単離された、請求項４８に記載のプロモーター。 ５０．メイズ（ｍａｉｚｅ）植物から単離された、請求項４８に記載のプロモー ター。 ５１．植物のトリプトファン・シンターゼーアルファ（ＴｒｐＡ）サブユニツト 遺伝子から単離された、請求項４８に記載のプロモーター。 ５２．メイズのトリプトファン・シンターゼーアルファ（ＴｒｐＡ）サブユニッ ト遺伝子から単離された、請求項５１に記載のプロモーター５３．図２４中に記 載された配列を含んで成る、請求項４８に記載のプロモーター。 ５４．請求項４８に記載のプロモーターであって問題の蛋白をコードしている構 造遺伝子と作用可能な状態で結合しているものを含んで成る組換えＤＮＡ分子。 ５５．構造遺伝子が殺虫性蛋白をコードしている、請求項５４に記載の組換えＤ ＮＡ分子。 ５６．構造遺伝子がバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）の蛋白をコードしている、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ 分子。 ５７．請求項５４に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成る、ベクター５８．構造 遺伝子が殺虫性蛋白をコードしている、請求項５７に記載の組換えＤＮＡ分子。 ５９．構造遺伝子がバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）の蛋白をコードしている、請求項５７に記載の組換えＤＮＡ 分子。 ６０．少なくとも２つの請求項５４に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成るベク ターであって、その２つの構造遺伝子の中の少なくとも１つが殺虫性蛋白をコー ドしているベクター。 ６１．請求項５４に記載の組換えＤＮＡ分子により安定的に形質転換されている 植物。 ６２．メイズ植物である、請求項６１に記載の植物。 ６３．植物内で結合構造遺伝子の花粉特異的発現に向けられることができる精製 プロモーターであって、植物のカルシウム−依存性ホスフェート・キナーゼ（Ｃ ＤＰＫ）遺伝子から単離されているプロモーター６４．単子葉ＣＤＰＫ遺伝子か ら単離されている、請求項６３に記載のプロモーター。 ６５．メイズＣＤＰＫ遺伝子から単離されている、請求項６３に記載のプロモー ター。 ６６．図３５中に記載された配列を含んで成る、請求項６５に記載のプロモータ ー。 ６７．請求項６３に記載のプロモーターであって問題の蛋白をコードしている構 造遺伝子と作用可能な状態で結合しているものを含んで成る組換えＤＮＡ分子。 ６８．構造遺伝子が殺虫性蛋白をコードしている、請求項６７に記載の組換えＤ ＮＡ分子。 ６９．構造遺伝子がバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）の蛋白をコードしている、請求項６８に記載の組換えＤＮＡ 分子。 ７０．少なくとも１つの請求項６７に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成るベク ター。 ７１．構造遺伝子が殺虫性蛋白をコードしている、請求項７０に記載のベクター 。 ７２．構造遺伝子がバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）の蛋白をコードしている、請求項７１に記載のベクター。 ７３．２つの組換えＤＮＡ分子を含んで成る請求項７０に記載のベクターであっ て、その２つの構造遺伝子の中の少なくとも１つが殺虫性蛋白をコードしている ベクター。 ７４．請求項６７に記載の組換えＤＮＡ分子により安定的に形質転換されている 植物。 ７５．メイズ植物である、請求項７４に記載の植物。 ７６．少なくとも１つの組換えＤＮＡ分子により安定的に形質転換されているメ イズ植物であって； そのＤＮＡ分子が殺虫性蛋白をコードしているヌクレオチド配列に作用可能な状 態で結合されているプロモーターを含んで成り、そのプロモーターがそのメイズ 植物内でその遺伝子の組織好適発現又は組織特異的発現に向けられることができ る、ようなメイズ植物。 ７７．その遺伝子がバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉＩＩｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）の蛋白をコードしている、請求項７６に記載のメイズ植物７ ８．そのプロモーターが単子葉から得られる、請求項７６に記載のメイズ植物。 ７９．その単子葉がメイズである、請求項７８に記載のメイズ植物８０．そのプ ロモーターがそのメイズ植物内でその遺伝子の髄好適発現に向けられることがで きる、請求項７６に記載のメイズ植物。 ８１．そのプロモーターが植物のトリプトファン・シンターゼーアルファ・サブ ユニット遺伝子から得られる、請求項７６に記載の植物８２．そのプロモーター がメイズのトリプトファン・シンターゼーアルファ・サブユニット遺伝子から得 られる、請求項７６に記載の植物。 ８３．そのプロモーターが図２４中に記載した配列を含んで成る、請求項８２に 記載の植物。 ８４．そのプロモーターがそのメイズ植物内でその遺伝子の緑組織特異的発現に 向けられることができる、請求項７６に記載のメイズ植物。 ８５．そのプロモーターがＰＥＰカルボキシラーゼ・プロモーターである、請求 項８４に記載のメイズ植物。 ８６．そのプロモーターがそのメイズ植物内でその遺伝子の花粉特異的発現に向 けられることができる、請求項７６に記載のメイズ植物。 ８７．そのプロモーターが植物のカルシウム依存性ホスフェート・キナーゼ遺伝 子から得られている、請求項７６に記載のメイズ植物８８．そのプロモーターが メイズのカルシウム依存性ホスフェートキナーゼ遺伝子から得られている、請求 項７６に記載のメイズ植物。 ８９．そのプロモーターが図３５中に記載した配列を含んで成る、請求項７６に 記載のメイズ植物。 ９０．殺虫性Ｂ．ｔ．蛋白のためのメイズ最適化コード配列を生産する方法であ って： 所定の殺虫性Ｂ．ｔ．蛋白のアミノ酸配列を決定し、そして、メイズ内で最も好 ましいコドンと対応する生来のコドンとを置き換えることによりその蛋白のコー ド配列を変更する、ことを含んで成る方法。 ９１．少なくとも１つの昆虫害虫に対してメイズ植物を保護する方法であって： メイズ植物を、少なくとも１つの請求項９に記載のヌクレオチド配列であってそ のコード配列が殺虫性蛋白をコードしているものにより安定的に形質転換し；そ れにより、この形質転換されたメイズ植物が、その害虫に対してその植物を保護 するのに十分な量でその殺虫性蛋白を発現する、 ことを含んで成る方法。 ９２．その殺虫性蛋白がＢ．ｔ．蛋白である、請求項９１に記載の方法。 ９３．そのプロモーターが組織特異的プロモーター又は組織好適プロモーターで ある、請求項９１に記載の方法。 ９４．ヌクレオチド配列により安定的に形質転換されている植物であって、その ヌクレオチド配列が、殺虫性蛋白のためのメイズ最適化コード配列を含んで成り 、その蛋白が、生来のコード配列を使用してその蛋白が発現されるよりも少なく とも１００倍の大きさでその形質転換された植物内で発現されているような植物 。