JPS63287488A - 虫害抵抗性植物 - Google Patents

虫害抵抗性植物

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JPS63287488A
JPS63287488A JP63107503A JP10750388A JPS63287488A JP S63287488 A JPS63287488 A JP S63287488A JP 63107503 A JP63107503 A JP 63107503A JP 10750388 A JP10750388 A JP 10750388A JP S63287488 A JPS63287488 A JP S63287488A
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子工学、生化学及び植物形質転換の分野
に関する。更に詳細には、本発明は、甲虫類（ＣＯｌ・
ｏｐｔｅｒａ　）に対して毒性を示す蛋白をコードする
中パラ遺伝子を発現するための植物細胞形質転換に関す
る。
Ｂａａｌｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　（Ｂ
、ｔ、）は胞子形成土壌細菌であって、各種の昆虫に対
して毒性を示すパラ胞子結晶蛋白を産生ずることが知ら
れている。はとんどの株は、鱗翅類（ガ、チョウなど）
に対して活性を示すが、双翅類（力、ハエなど）に対し
ては、わずかの株しか活性を示さないことが報告されて
いる（　Ａｒ０１１ａＯｎら、１９８６）、これら各種
の株から毒素遺伝子がクローン化され、また異種宿主に
おいて毒素が発現されている（　５ｃｈｎｅｐｆら、１
９８１　：　Ｋ１１ｅｒら、１９８２）。
最近、Ｂ、ｔ、ｖａｒ、　ｔｅｎｓｂｒｉｏｎｉａ　（
ｎ、ｔ、ｔ−）及びＢ、ｔ、　ｖａｒ、　ａａｎ　ｄｌ
ｅｇｏ　（Ｂ、ｔ、ａｄ、　）株が、甲虫Ｈｅｒｒｎａ
ｔａｄｔら、１９８６　）　、　ｎ、ｔ、ｓａ、から毒
素蛋白遺伝子がクローン化されているが、この遺伝子な
ｌｉ：、ａｏｌｉで発現せしめて産生される毒素は、Ｂ
、ｔ、ｓａ、の毒素よりそのサイズが大きいことが報告
されており、この組換え］３．ｔ、ｓＬ、毒素の活性は
弱いものと考えられる。
ＢＩＬＯｌｌｌｕｅ　ｔｈｕｒｉｎｇｌｅｎｌｉｉｌｌ
の毒素蛋白に対して感受性の昆虫としては、コロラドポ
テト甲虫（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒａａ　（１１）ｃｅｍ
ｌｎｅａｔａ　）、メキシコワタノミゾウムシ（Ａｎｔ
ｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａｎｄｉａ　）、イｚａ−イミム
シダマシ（’ｌ’ａｎｅｂｒｉｏ　ｍｏｌｉｔｏｒ　）
、ニレ葉甲虫（ｐｙｒｒｈａｌｔａ　１ｕｔａｏｌａ　
）、サウデンコーン根虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎ
ｃＬｅａｉｍｐｕｎａｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ　）な
どがあるがこれらに限定されない。
植物が形質転換されて殺虫効果を示すレベルで甲虫類毒
素を発現することができれば、甲虫類に対して毒性ある
いは耐性を示す遺伝子工学植物が得られる可能性がある
。
甲虫類によって影響を受ける農業的に重要な作物として
は、アルファルファ、ワタ、トウモロコシ、ポテト、ア
ブラナ（ｃａｎｏｌａ　）、米、タバコ、トマト、シュ
ゴービート、サンフラワーなどかあ゛る。
ある種のキメラ遺伝子が形質転換植物細胞及び植物にお
いて発現されてはいるが、これらの発現−は直接的なも
のではない。例えば、鱗翅類Ｂ、ｔ。
毒素蛋白の発現例は特に問題のあるものである。
鱗翅類Ｂ、ｔ、毒素蛋白を植物において発現せしめる際
に用いられた技術ｌそのまま甲虫類Ｂ、ｔ、毒素蛋白の
発現に適用できないことが見出されている。かかる知見
は、形質転換植物においてこのような毒素を発現せしめ
るためには同様の遺伝子増幅技術を用いればよいとする
従来の考え方とは相反するものである。
本発明の１つの局面によれば、甲虫類に対して毒性を発
揮する遺伝子工学的に形質転換された植物の製造法であ
って； （ａ）　　甲虫類の攻撃に対して感受性の植物細胞のゲ
ノムに、 （１）植物細胞においてＲＮＡの産生な誘導するプロモ
ーター。
（９１１３ａｃｉｌｌｕａ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｅの甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生な誘
導するＤＮＡ配列、及び （ｉｌｉ）　　植物細胞において、ＲＮＡ配列の６′末
端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′
非非翻訳ＤＮＡ列。
を含むキメラ遺伝子を挿入し； （ｂ）　　形質転換植物細胞な得；次いで（ｃ）　　該
形質転換植物細胞から、甲虫類に対して抵抗性を示す遺
伝子工学的に形質転換された植物を再生する； 工程を含む上記製造法が提供される。
本発明の他の局面によれば、キメラ植物遺伝子であって
、 ｔａ）　　［ｍ細胞においてＲＮＡの産生を１導する機
能を有するプロモーター。
（ｂ）　　Ｂａａｉｌｌｕａ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉａの甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生な
誘導するＤＮＡ配列、及び （ｃ）　　植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端に
ポリアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する６′非１
１１１訳ＤＮＡ配列。
を含むキメラ植物遺伝子が提供される。
本発明の更に他の局面によれば、上記し７．：、　（ａ
）、Ｔｂ）及び（ｃ）の要素をそれぞれ含むＤＮＡを有
する、バクテリア細胞、形質転換植物細胞及びＷＬ？ｌ
形質転換ベクターが提供される。
本発明の更に他の局面によれば、甲虫類に対して毒性を
発揮する上記した如き形質転換植物細胞を含む変異植物
が提供される。
本発明の更に他の局面によれば、上記した形質転換植＠
を産生ずる種子が提供される。
本発明は、植物が甲虫類に対して毒性を発揮するように
植物を形質転換する方法を提供するものである。更に詳
細には本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓの甲虫類毒素清白を殺虫効果を示すレベルで発
現するトランスジェニック植物を提供するものである。
本発明の一つの局面によれば、植物において機能し、感
受性甲虫類に対して毒性を発揮するトランスジェニック
植物Ｖ産生ずるキメラ遺伝子が提供される。２本鎖ＤＮ
Ａとして存在する植物遺伝子の発現には、ＭＡポリメラ
ーゼによって１本鎖のＤＮＡが転写されてメツセンジャ
ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）が産生ずる工程、及びｍＲＮ
Ａ転写１次産物の核内でのプロセッシング工程が含まれ
る。このプロセッシング工程には、ｍＲＮＡの３′末端
ヘボリアヂニル化ヌクレオチドを付加せしめる３′非翻
訳領域も関係している。
ＤＮＡが転写されてｍＲＮＡが産生される工程は、通常
プロモーターと言われているＤＮＡ領域によって調節さ
れている。このプロモーター領域には、ＭＡポリメラー
ゼに記号を送ってＤＮＡに結合せしめ、プロモーターの
下流のＤＮＡを鋳型として用いてｍＲＮＡの転写を開始
せしめ対応するＲＮＡ鎖を産生せしめるヌクレオチド領
域が含まれている。
植物細胞において作用する多くのプロそ一ターが文献に
記載されている。これらのプロモーターとしては、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫
瘍誘導プラスミドにおいて使用されているツバリンシン
ター（！’　（ＮＯ８）プロモーター、オクトぎンシン
ター（！”　（ＯＣ８）　７’ロモーター及びマンノピ
ンシンターゼ（ＭＡ８　）プロモー；カリフラワーモザ
イクウィルス（ＣａＭＶ）　１９　ｓプロモーター及び
Ｃ＆ＭＶ３５８プロモーター；あるいはυざ−スビスホ
スフエートカルがキシラーゼ（８１３ＲＵＢ工５ＣＯ１
非常に豊富に存在する植物ポリペプチド）の小さなサブ
ユニットから得た光誘導性プロモーターなどがある。こ
れらのプロモーターは、植物において発現する各種のＤ
ＮＡ構築物を創製するために使用されている（　ＰＣＴ
出願Ｗ　Ｏ８４／　０２９１３（ＲＯｇｅｒａら、ＭＯ
ｎｌｉｌＬｎｔＯ）　）。
植物細胞においてｍＲＮＡ転写物の産生を誘導すること
が見出されているあるいは知られているプロモーターを
、本発明では使用することができる。
適当なプロモーターは、植物で発現される天然の遺伝子
から誘導したプロモーター、及び長いあるいは異種のエ
ンハンサ−領域を含んでいてもよい合成プロモーターで
ある。プロモーターは、十分な量の毒素蛋白が産生され
て植物が甲虫類に対して毒性を示すように、遺伝子の発
現を十分に誘導できるものでなければならない。目的と
する毒性を示すに必要な毒素蛋白の−は、対像とする甲
虫類によって変動することは、当業者には容易に理解さ
れよう。従って、ＣａＭＶ　３５　Ｓプロモーター、８
４ＲＵＢＩＳＣＯプロモーター、ＭＡ’Ｊプロモーター
が好ましいものであるが、これらのプロモーターが本発
明の全ての薄様において必ずしも塁適ではない。
キメラ遺伝子によって産生されるｍＲＮＡにに、５′非
翻訳リ一ダー配列が含まれる。この配列は、ｃａＭ′ｖ
！１５　Ｓプｏ−ｅ−ター、１１１１ＲＵＢ工８ＣＯ７
’　０　％　−ター、ＭＡＳプロモーターなどの個々の
プロモーターから誘導されたものでもよい。５′非翻訳
領域は、他の適当な真核細胞の遺伝子または合成遺伝子
から得られるものでもよい。５′非翻訳領域の必要な機
能は、ｍＲＮＡ転写物が植物細胞のりボデームへ結合す
るのを促がして、ｍＲＮＡの翻訳を促進することである
。
キメラ遺伝子には、Ｂａｃｉ’１ｌｕａ　ｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｇの甲虫類毒素蛋白をコードする構造コー
ド配列あるいはその一活性断片が含まれる。この構造コ
ード配列は、例えばＢ、　ｔ、ｔｅｎｅｂｒｏｎｉｓ、
ＩＥｌ、ｔ、ｓａｎ　ｄｉｅｇ。
などから得られる。従って、本発明の１つの態様におい
ては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
　ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得られる構造コード配列及
びそ本明細書に記載した技術的事項に従って使用するこ
とができ、従ってこれらも本発明の範囲内であることは
、当業者に容易に理解されよう。
３′非翻訳領域には、ＲＮＡの３′末端にポリアデニル
化ヌクレオチドの付加を誘導するために機能しているポ
リアゾニレ−ジョンシグナルが含まれる。
適当な３′領域としては、例えば、（１）　Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘導（Ｔ１）プラスミド遺伝子
のポリアゾニレ−ジョンシグナルを含む、ツバリンシン
ターゼ（ＮＯ８）遺伝子などの３′転写非翻訳領蛾、（
２）大豆貯蔵蛋白遺伝子、ｅｓＲＵＢｓＩｃｏなどの植
物遺伝子、などが挙げられる。３′領域の好ましい例と
しては、実施例において詳述する如き、ＮＯ８、５ｓＲ
ＵＢＩ８ｃｏ、貯蔵蛋白遺伝子から得られる領域が挙げ
られる。
本発明の甲虫類毒素蛋白遺伝子は、適当な方法によって
、植物のゲノムに挿入される。適当な植物形質転換ベク
ターとしては、ＥＰＯ公開公報魔１３　Ｌ６２０　（Ｒ
ｏｇｅｒｓら）、Ｈｅｒｒｅｒａ　−Ｅｓｔｒｅ１１ａ
１９８３、Ｂｅｖａｎ　１９８３、Ｋ１ｅｅ１９８５、
ＥＰＯ公開公報４１２０＊５１６　（５ｃｈｉｌｐｅｒ
ｏｏｒｔら）などに記載された如き、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｔｕｍｔｕｍｅｔ’ａｃｉｅｎｓのＴ１プラスミド
から誘導されたベクターが挙げられる。Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｔｕｍのＴ１プラスミドあるいは根誘導（Ｒ１）
プラスミドから得られるｌ１ｉＩ物形質転換ベクターに
加えて、本発明の甲虫類毒素蛋白遺伝子を植物細胞へ導
入するために、他の方法を用いることもできる。このよ
うな方法としては、例えばリボゾーム、エレクトロポレ
ーション、あるいはフリーＤＮＡの取り込みを増進する
化学物質を使用する方法、またはベクターとしてウィル
スもしくは花粉を使用する方法などがある。また必要に
より、形質転換及び形質転換体の選択を繰り返す方法に
より、２個以上の遺伝子を植物のクロモデームに導入し
てもよい。
かくして得られる修正された植物は、例えばノーデンデ
ロツテイング法により、甲虫類毒素蛋白ｍＲＮＡの存在
について分析することができる。毒゛素蛋白ｍＲＮＡが
検出されない、あるいはその力価が低すぎる場合には、
キメラ遺伝子の構築に用いたプロモータータ他のより強
力なプロモーターに代えて新たな構築物を得、これｔ再
分析する。
他の方法として、ウエスタンプロッティンク法などの免
疫分析法により、毒素蛋白のレベルを分析してもよい。
多くの場合、最も感度の高い毒素蛋白分析法は、昆虫を
用いたバイオアッセイである。
このバイオアッセイにおけるモニタリングは、再生され
た植物全体で行なうことができる。いかなる場合におい
ても、毒素蛋白ｍＲＮＡの産生が十分に行なわれ、形質
転換細胞またはプロトプラストが再生されて植物となっ
た時には、植物について甲虫類に対する抵抗性なスクリ
ーニングすることができる。植物の再生工程は臨界的な
ものではなく、次の如き植物から得られる宿主に適用で
きるグロトコールであればよい。即ち、例えばＬｅｇｕ
ｍｉｎｏｓ（１１）　（７／Ｉ／　７７　Ａ／　７７、
大豆、クローバ−など）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒ（１１
）　（二ｙジン、セロリ、ざウフウなど）、Ｃｒｕａｉ
ｆｅｒ（１１）　（キャベツ、ラヂイシュ、ナタネ種子
など）、Ｃｕａｕｒｂｉｔａ（１１）（１１）　（メ０
ン、キラリなど）、Ｇｒａｍｌｎｅａ・（コムザ、米、
コーンなど）、Ｂｏｘａｎａ（１１）（１１）　（ポテ
ト、タバコ、トマト、ペラパーなど）、Ｍａｌｖａ０８
ａ・（ワタなど）、ｃｈｅｎｏｐｏａｌａ（１１）（１
１）　（サトウダイコンなど）、及び各種の作物などで
ある（　Ａｍｍ１ｒａｔＯら、１９８４参照）。
本明細書及び特許請求の範囲において記載されている全
ての蛋白構造は、慣用法によって示されておｆｆ、Ｎ末
端のアミノ基は左側、Ｃ末端のカルざキシル基は右側に
示されている。同様に蛋白のアミノ酸の命名は次の通シ
である。
アラニン（Ａｌａ　；　Ａ　）、アスパラＪＦ”（Ａａ
ｎ；Ｎ）　、７　スハラｊｌｌ’ン酸（Ａａｐ　：　Ｄ
　）　、アルギニン（Ａ’ｇ　ｅ　Ｒ）、システィｙ　
（Ｃ７１’　ｚ　Ｃ）、グｈｐミン酸（Ｇｌｕ　；　Ｅ
　）、グルタミｙ　（Ｇｉｎ　；　Ｑ　）、グリシン（
Ｇｌｙ　；　ｅ　）、ヒスチジン（Ｈ１’　：　Ｈ）、
インロイシン（工ｌｅ　：　ｌ　）、ロイシｙ　（Ｌｅ
ｕ　：　Ｌ）、リシン（Ｌｙ’　；　ｘ　）、メチオニ
ｙ（Ｍｅｔ：Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ：　ｐ’
　）、プロ９ｙ　（ｐｒ。
；Ｐ）、セリｙ　（ｓｅｒ　：　８　）、スレオニｙ　
（’Ｉ’ｈｒｓ　’ｒ　）、トリブトファン（Ｔｒｐ　
；　ｗ　）、ｆ　Ｃ１シン（Ｔｙｒ　：　ｙ　）、パリ
ｙ　（ｖａｌ；　ｙ　）。
甲虫類毒素蛋白をコードするＢ、ｔ、ｔ、遺伝子を以下
の如くにして単離した。
蛋白結晶の単離 蛋白結晶を単離するため、Ｂ、ｔ、ｔ、　ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｔｓで生育せしめた。Ｂ、ｔ、ｔ、からインタク
トの結晶を単離するに際しては、この結晶と鱗翅類型の
結晶との相違に注惹して行なった。鱗翅類型の結晶線、
レノグラフィｙ　（Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ　）、ハイバ
ーク（Ｈｙｐａｑｕａ　）あるいはＮａＢｒから調製し
たグラジェントで単離できるが、Ｂ、ｔ、ｔ、結晶はこ
れらのグラジェントに溶解することが判った。Ｂ、ｔ、
ｔ。
結晶はシュクロースのグラジェント中で安定であること
が判った。従って、Ｂ、ｔ、ｔ、結晶単離のためにシュ
クロースグラジェントを使用した。
結晶からＢ、ｔ、ｔ、毒素の単離 精製した結晶について、８Ｄ８ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によりその蛋白組成を分析した。
この実験結果から、Ｂ、ｔ、ｔ、結晶は分子量が約６８
−７０キロダルトｙ　（ｋｐａ　）、約６ｏｋＤａの２
つの蛋白成分を少なくとも含んでいることが判った。
蛋白成分の相対量な、実験によって変動した。また大き
な分子量の蛋白成分は更に２以上の蛋白からなっている
ことが示唆された。Ｂ、ｔ、ｔ、結晶の蛋白成分として
、約６８　ｋｌ）ａ及び５０ｋＤａの蛋白が報告されて
いる（　Ｂｅｒｎｈａｒａ、１９８６）。
Ｂ、ｔ、ｔ、　ｓａｎ　ａ１θｇｏの結晶は約６４　ｋ
ｐａの蛋白から構成されていることが報告されている（
　Ｈｓｒｒｎｓｔａｄｔ１９８６）。これに対し、Ｂ、
ｔ、　ｋｕｒａｔａｋｉなどの鱗翅類型Ｂ、ｔ、株には
１５０１ＣＤＩ！Ｌ　−１４０ｋｐａの高分子量の蛋白
が含まれている。これらの結果から、鱗翅類毒素蛋白と
甲虫類毒素蛋白とはその構造が有意に相違していること
が判る。
結晶中の個々の蛋白成分を精製するためにいくつかのア
プローチを実施した。等電点電気泳動法゛では、全ての
蛋白が沈澱するため成功しなかった。
モノ（Ｍｏｎｏ　）　ｑカラムを用いたアニオン交換高
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、蛋白成分
を溶解することができなかった。４Ｍ尿素の存在下での
Ｍｏｎｏ　Ｂカラムを°用いたカチオン交換ＨＰＬＣで
はぜ５つのピークを溶解することができた。８Ｄ８ゲル
電気泳動によりピーク成分を分析した所、−一りＡには
高分子量のバンドしか含まれていないことが判った。ビ
ークＢには、低分子量のバンドが少し含まれているもの
の、この高分子Ｏマ 量のバンドｌ豊富に含まれていた。ｆ−りＣには高分子
量の・ぐンドとともに、低分子量のバンドが豊富に含ま
れていた。ｔ−りＥ及びＤは、両者のバンドの混合物で
あった。はとんどの調製法の場合において、ビークＡ及
びＢに対応する高分子量のバンドが結晶中の主要な蛋白
成分であった。
Ｉ（ＰＬＯで分離したものについては、−一りＡとＢが
、得られる蛋白のほとんどを代表していた。
ビークＡ％Ｂ及びＣに対応するＮ末端アミノ酸配列を求
めた。ビークＡとＢは同じＮ末端配列な宵し、ｆ−りＣ
扛異なる配列を有していることが判った。得られた配列
は以下の通りである。
ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ ビークＣ： ＭＱＣＸ　Ｐｒｏ　Ｘ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　　Ｌ
ｅｕＡｌｉｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　　ｌ１ｅ１１．７１１
１　　Ｉ、ｙ８　　Ａｓｐ　Ｖａｎ　　Ｉｃｅ　　Ｇｌ
ｙｎ　　ＬｙｅＸは未決定アミノ酸を表わす。
Ｂ、ｔ、ｔ、蛋白の昆虫毒性 Ｂ、ｔ、ｔ、及びＢ、ｔ、ｔ、蛋白のいくつかの調製物
について、甲虫類、鱗翅類などの昆虫に対する毒性をテ
ストした。鱗翅類（オオタバコガの幼虫、ブラックヨト
ウムシ、タパコイそムシの幼虫、キャベツシャクトリム
シ）Ｋ対しては、何んら活性ン示さなかった。甲虫類の
なかでも、コロラド（Ｃｏ１ｏｒａｄ　）ポテト甲虫（
Ｌｅｐｌｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ　）
、ワタミハナデウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａ
ｎｓｌｉｓ　）に対して活性を示′シタ。
サデンコーン（９ｏａｔｈｅｒｎ　ｃｏｒｎ　）根食い
虫（ｐｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎａ＠ｃ１ｍｐｕｎａｔ
ａｔａ　ｈｏｗａｒｌｉ　）に対しては低い活性を示し
た。殺虫活性は、バクテリア粗培養物においても見られ
、また精製した結晶物、結晶を溶解したもの、及び単離
したビークＣ１Ｄ％Ｅ（貯めたもの）、Ａ及びＢにおい
ても観察された。
コロラドポテト甲虫に対する毒性の分析は、テストすべ
き調製物をトマトの葉に適用し、次いで該昆虫がこの葉
を餌として食べるよ５に４日間放置することによって実
施した。ワタミハナーウムシ及びサデンコーン根食い虫
に対する毒性の分析は、テスト調製物な適当な食物に混
入することによって実施した。
クローニング Ｎ末端蛋白の配列から得られる情報に基づき、合成りＮ
Ａプローデ（第１図）を−？ディンし、これを、Ｂ、ｔ
、ｔ、毒素遺伝子を含むクローンの単離に用いた。プロ
ーブを、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ。
１９８２）により　Ｃｒ−３２ｐ　）　ＡＴＰで末端ラ
ヘル化した。全ＤＮＡを単離するために、０．１　＝４
酵母抽出物及び０．１慢グルコース（ｓｐｙ　）　を添
加した８ｐｉｇ１ｇ１ｅｎ培地（Ｂｐｉｚｉｇｅｎ　、
　１９５８　）で３７℃で６時間、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、ｔ＠ｎ８ｂｒｉ０１１１１１を
生育せしめり。１ｃｒｏｎｓｔａａの方法（Ｋｒｏｎａ
ｔａａ　。
１９８３）により、Ｂ、ｔ、ｔ、から全ＤＮＡ　！単離
した。毒性を調べるのに使用するＢ、ｔ、ｔ、結晶物を
単離するため、１ｕｒｉａアガープレート上で細胞な生
育せしめた。
プラスミドの選択及び維持のために加えたアン−シリン
（Ａｐ、２００μＩ／Ｍｌ）、カナマイシン（Ｋｍ、５
０μｍ１／ＴＲＩ）あるいはデンタマイシン（Ｇｍ、　
１５μＩＩ／Ｗｌｌ）ｖ含むＬｕｒｉａデロース（ＬＢ
　）中で、ｇ、ａｏｌｌ　　及びｐｓｅｕａｏｍｏｎａ
ａ　Ｆ！’生育させた。
ＤＮＡの単離及び増幅 Ｂｉｒ！１ｔｌｏｉｌＥＩとＤＯ１７の方法（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍとｐｏｌｙ　。
１９７９）により、Ｅ、ｃｏｌｌとｐｅｅｕａｏｍｏｎ
ａａの細胞からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＮＡＣ３−
５２樹ｗｔＩ（１３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｉｊｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を用いてこの樹脂製
造業者の指針に従って精製した。制限酵素、牛アルカリ
ホスファターゼ及びＴ４ＤＮＡりが−ゼを、製造業者（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎａ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）の指針に
従って使用した。’ｌ’ｒｉｓ−アセテート緩衝液で０
．８憾アがロースデル上で電気泳動ゼしめて、制限酵素
で消化して得られる生成物を分析した。
凍結融解法により、クローニング用のＤＮＡ断片をアガ
ロースから精製した。組換えＤＮＡ分子の構築は、ＢＱ
ｎｉａｔｉｌｌらの方法（ＭａｎｉａｔｉＢら、１９８
２）に従って行なった。ｇ、　ｃｏｉｌへの形質転換は
、ＭｔｎｉａｔｌＪの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ！、１９
８２）に従って実施した。
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子のクローニング［Ｅ乾燥ゲル法
（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）により、サデンプロツテ
イング法分析（９ｏｕｔｈｅｒｎ　。
１９７５）’＆実施した。Ｂ、ｔ、ｔ、毒素クローンを
検出するために、テトラメチルアンモニウムクロライド
法（Ｗｏｏ（Ｌら、１９８５　）によシコロニーフィル
ターハイプリダイゼーションを行なった。
Ｂ、ｔ、ｔ、全ＤＮＡの１３ａｌｎＨｌ及びＨｌｎａ　
［１による消化ｖＪＶサデンデロツテイング法により分
析した所、合成Ａ１グローブにハイブリダイズする５Ｊ
３　ｋｂ１３ａｍＨｌ断片と３．Ｏｋｂ　Ｈｌｎｄ　［
１断片が同定された。
Ｂ、ｔ、ｔ、　ＤＮＡのＢａｍＨｌ断片（５，４−６−
５ｋｂ　）　Ｙアガ、ロースデルから精製し、ＢａｍＨ
ｌで消化しアルカリホスファターゼで処理しｙ、＝ｐＵ
Ｃ１１９に連結し１こ。ｐＵＣ１１９は、バクテリオフ
ァージの４７６　ｂｐＨｇｉＡ　１　／　Ｄｒａ　１断
片を単離し’ｒ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎａ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）で末端を平滑化すること
によって調製できる。次いでこの断片を、あらかじめＮ
ｄｅ　ｌで消化しクレノーＤＮＡポリメラーゼ（１（ｅ
ｗ　Ｅｎｇ）ａｎｄ　１３１ｏ１ａｂｓ　）で充填した
ｐＵＣ１９に挿入する。次いで連結されたＢ、ｔ、ｔ。
とｐＵＣ１１９ＤＮＡを用いてＢ、ｃｏｌｌＪＭ　１０
１細胞を形質転換する。何回かの試みの後、Ａｐ抵抗性
コロニーがわずかに１５０個得られた。Ｂ−ｔ、ｔ。
ＤＮＡの１（ｉｎｄ　７１断片（２，８−３，５ｋｂ　
）も、ｐＵＣ１１９のＨｌｎａ　ｍ部位にクローン化し
、１１００個のコロニーを得た。全てのコロニーについ
て、Ａ１グローブ（第１図）に対するコロニーノ１イプ
リダイゼーションによるスクリーニングン実施した。１
１個の）ｉｉｎｄ　［１コロニーは強い／’ｉイブリダ
イゼーションを示したが、ＢａｍＨｌコロニーはいずれ
も何んのハイブリダイゼーションも示さなかつた。Ａ１
プローブに対する）＼イデリダイゼーションによ＃）回
定されたコロニーについて、更に合成グローブＡ２（第
１図）を用いてスクリーニングした所、２つのコロニー
が第２のグローブに対してハイブリダイゼーションを示
した。この２つのコロニーの制限酵素消化パターンから
、これらの２つのコロニーには同じ３．Ｏｋｂ　Ｈｌｎ
ｄ　［１断片が含まれておりそしてこれらは両者のコロ
ニーにおいて逆方向で含まれていることが判った。これ
ら（Ｆ）コロニー’Ｙｌ）ＭＯＮ５４２０．Ｉ）ＭＯＮ
５４２１　（第３図）と命名した。Ｂ、ｔ、ｔ、　毒素
蛋白の遺伝子をコロニーが含んでいることを確認するた
めに、プライマーとして縮退プローブＡ１及びＡ２’に
用いてジデオキシ配列決定法（Ｂａｎｇｅｒ、　１９７
７　）により、両者のコロニーから得た１本鎖ＤＮＡの
配列決定を行なった。プライマーとしてＡ１グローブを
用いた配列分析により、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白の精製ビ
ークＡ及びＢについて測定したアミノ酸配列の９−１５
番目のアミノ酸配列と同一の配列を有するオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ　）の存在が判明した。グロ
ーブＡ２を用いた場合には、上記のＯＲＦのアミノ酸配
列の末端以降からスタートするＤＮＡ配列２が産生され
た。しかしながらこのＤＮＡ配列はＡ１グローブにより
産生されるＤＮＡ配列と同じであった。これらの結果か
ら、目的とするＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子がクローン化さ
れたことが確認された。ビークＣのＮ−末端配列に基い
て作成した縮退グローブを用いて全Ｂ、ｔ、ｔ、　ＤＮ
Ａに対するサデンハイプリダイゼーションを行なった所
、ビークＣについて求めたアミノ酸配列は誤りである、
あるいはそれはビークＣを含む２つもしくはそれ以上の
蛋白の混合物から得られたものであるということを示す
特異的バンドは検出されなかったＯ Ｅ、　ｃｏｌｉで産生された蛋白の分析Ｂ、ｔ、ｔ、結
晶蛋白と組換えＢ、ｔ、ｔ、蛋白とを、８Ｄ８−　ＰＡ
ＧＥ　（Ｌ（１１）ｍｍｌｉ、１９７０）により調ベタ
。Ｅ、Ｃ０１１１ｒＩＬｔを遠心し、ペレットを１００
μｌ８Ｄ８−サンプル緩衝液及び１０μｌサンプル中に
再懸濁し、７．５％ポリアクリルアミドデル上で電気泳
動した。ゲルをクーマシーブルーで染色するか、あるい
はＢ、ｔ、ｔ、毒素結晶に対する抗体の交差反応性に基
いてゲルを探査した。セイヨウワサビパーオキシダーゼ
結合抗体法（Ｔｏｗｂｉｎら、１９８４）により、ウェ
スタンプロットを実施した。高分子量のマーカーはＢｉ
ｏＨａａから購入した。
クローンがＢ、ｔ、ｔ、毒素を産生じたことを、Ｅ、Ｃ
０１ｉで産生された蛋白のウェスタンプロット分析によ
って更に確認した。ｐＵＣ１１９，１）ＭＯＮ５４２０
あるいはｐＭＯＮ　５４２１のいずれかを保持するＥ、
ｃｏｉｌ、ＴＭ　１０１細胞を、１ａｃプロモーターの
作用を誘導するためＩＰＴＧ　（ｃ，１ｍＭ　）の存在
下で１晩生育せしめた。コントロールとしての精製Ｂ、
ｔ、ｔ、結晶蛋白とともに、２重のサンプルについてＳ
ＤＳ　−ＰＡＧＥで分析した。１つのゲル上でのウェス
タンプロット分析により　、Ｉ）ＭＯＮ　５４２０また
はｐＭＯＮ５４２１を保持するＥ、ａｏｌｉ　ＩＩＣよ
って、交差反応？する２つの蛋白が産生されることが示
された。これらの蛋白は、Ｂ、ｔ、ｔ、結晶の主要蛋白
及びマイナー蛋白とその大きさが同じであった。
第２のゲル上における分子量スタンダードをクーマシー
ブルーで染色せしめ、これと比較することによって蛋白
の分子量を測定した。主要毒素蛋白のサイズは７４　ｋ
Ｄａでありマイナー毒素蛋白のサイズは６８ｋＤａであ
ることが判った。ＰＭＯＮ５４２０によって産生される
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白のレベルは、ＩＰＴＧの添加によ
って上昇し、他方、Ｉ）ＭＯＮ５４２１による毒素蛋白
の産生は影響を受けなかった。
素の産生 第２図に示しであるように、ＢａｍＨｌで消化したｐＭ
ＯＮ　５４２０を１）ＭＯＮ　７１１１のＢａｍＨ１部
位にクローニングすることによって、広範囲宿主ベクタ
ーｐＭＯＮ　５４３２を構築した。次いで毒素の産生を
分析するため、このベクターを用いて、ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａａ　ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎｓにトリバレンチラル
メーティング（ｔｒｉ　−ｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉ
ｎｇｓ　）を行なった。ウェスタンプロット分析及び昆
虫毒性の研究のために、’ＩＰＴＧの存在下及び不存在
下で生育せしめて１晩培養してサンプルを調製した。
Ｐｅｅｕｄｏｍｏｎａｓによって産生される蛋白は、Ｅ
、　ｃｏｌｉで産生される蛋白とサイズが同じであり、
蛋白発現はＩＰＴ（）の添加によって上昇した。
新たに岬化したコロラドポテト甲虫 （ＬｅｐｔｉｎＯｔａｒｌａ　ｃｌｅｃｅｍｌｉｎｅａ
ｔａ　）　Ｙ用いて、トマトの葉を餌とするアッセイ法
により、甲虫類毒素活性を調べた。Ｌ　ｃｏｉｌ及びｐ
ｅｅｕａｏｍｏｎａｓ培養細胞をＩＰＴＧの存在下で１
晩生育せしめ、遠心分離し次いで１０　ｍＭ　Ｍｇ８０
４中に各種濃度で再懸濁せしめた。次いで超音波処理（
氷上で１５秒パルス処理を３回）によシ、細胞を粉砕し
た。’１’ｗｅｅｎ　−２０（ｃ，１１）χ加えてサン
プルを、湿ったフィルター４−パーを詰めた９ｃｍベト
リ皿の中に入れたトマトの葉に塗付した。それぞれの葉
に、コロラドポテト甲虫の幼虫を置き、修正死亡率係（
（コントロールの生存甲虫数チーサンプル処理の生存甲
虫数係）／コントロールの生存甲虫数幅）を、Ａｂｂｏ
ｔｔの式（Ａｂｂｏｔｔ、　１９２５　）を用いて計算
した。アッセイは２重く行ない、データを重わせて用い
た。ポジティブコントロールトシて、Ｂ、ｔ、ｔ、結晶
／胞子調製物を用いた。
ｐＭＯＮ　５４２０及びｐＭＯＮ　５４２１のＥ、ｃａ
ｄｉ培養細胞について、ＩＰＴＧを添加して異なる濃度
で生育せしめて、甲虫類毒性を評価した。組換え型のＢ
、ｔ、ｔ、毒素と野性型のＢ、ｔ、ｔ、毒素とを比較し
て表１に示した。得られる結果から、組換えＢ、ｔ、ｔ
、蛋白はコロラドポテト甲虫に対して毒性を示すことが
判る。、ＩＰＴＧで誘導された２重濃度のｐＭＯＮ　５
４２０培養細胞は、Ｂ、ｔ、ｔ、胞子／結晶コントロー
ルと同様に１００係甲虫を殺した。これらの毒性データ
の結果から、クローン化されたＢ、ｔ、ｔ、遺伝子に、
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白をコードする遺伝子であることが
判る。
トマトの葉を餌とするアッセイの結果から、Ｐｅｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓによって産生される毒素はコロラドポテト
甲虫に対して毒性を示すことが判る。
Ｐ（１１）ｕｄｏｍｏｎａｓ培養細胞の相対毒性は、Ｅ
、ｃｏｌｉ培養細胞と比較した時、ウェスタンプロット
分析によって測定した毒素蛋白産生量とよく一致した。
表　　１ Ｅ、ｃｏｘｌＪＭｌｏｌ ＰＵＣ１１９２Ｘ　　　Ｏｌ ＩＩＭＯＮ　５４２０　　　１　Ｘ　　　８３慢１）Ｍ
ＯＮ　５４２０　　　２　Ｘ　　１００慢１）ＭＯＮ　
５４２１　　　１　Ｘ　　　４４慢ｐＭＯＮ　５４２１
　　　２　Ｘ　　　（５１４ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓ（１１
）ｎ６７０１　ＫｌｐＭｏＮ　５４！１２　　　３　Ｘ
　　　６０％Ｂ、ｔ−ｔ・調製物　　　　　　　　　　
　　１００優ｌ：培養細胞を、ＩＰＴＧを添加して１晩
生育セしめ、濃縮し、超音波処理し、次いで毒性をテス
トした。
２：１Ｘは、１晩培養した時の細胞濃度に相当する。
Ｂ、ｔ、ｔ、の毒素遺伝子の配列 クローン化断片中のＢ、ｔ、ｔ、遺伝子の位置と方向と
を、以下の手法から得られる情報に基いて決定シＴＳ。
即ち、ＩＬ）　　１本領ｐＭｏＮ５４２１テンプレート
からＤＮＡ配列を得る：ｔ））ＤＮＡ配列分析により同
定された、翻訳開始点近くのｐｓｔ１部位を、ｐＭ□Ｎ
５４２０及びｐＭＯＮ　５４２１中においてマツプ化す
る；Ｃ）他のいくつかの制限酵素部位をマツプ化する：
　ｄ）Ｂｇ１１部位からＢ！ＬＩｎＨ１部位までの１３
０ｂｐを欠いたものを構築し、両者の全長蛋白を産生ず
る。これらの情報をｐＭＯＮ５４２０及び１）ＭＯＮ　
５４２１のマツプ構築に用いた。第４図に示されるよう
に、毒素コード領域は、５′末端Ｈ１ｎ４１部位からｓ
　ｏ　ｏ　ｂｐ　Ｏ所テ、６ツＣ１ｐｓｔ　１部から１
５０　ｂｐ上流の所からスタートしている。
このコード領域は、６′末端Ｈｔｎａ　Ｂ部位から約４
５０　ｂｐの所で終っている。Ｂｇｌ　１部位は、終止
コドンから下流３５０　ｂｐの位置にある。
プラスミド Ｂ、ｔ、ｔ、殺虫毒素遺伝子の配列を決定するために構
築したプラスミドを表ＩＫ挙げた。現プラスミド、］＞
ＭＯＮ　５４２０、ｐＭＯＮ　５４２１は、ｐＵｏｌ　
１９に逆方向でクローン化したＨＬｎａ　［１断片のそ
れぞれ独立した単離物である。
表　　ｌ 配列決定に用いたプラスミド ｐＭｏＮ５１２０　　Ｂ、ｔ、ｔ、　ＤＮＡの３．□　
ｋｂ　Ｈｌｎｄ　ｍ断片（親プラスミド） ｐＭｏＮ５４２１　　Ｂ、ｔ、ｔ、　ＤＮＡの５．Ｏｋ
ｈ　Ｈｌｎａ　ｍ断片（Ｒプラスミド） Ｔ）ＭＯＮ　５３（４７　　ｐＭｏＮ　５４２０のＫＯ
ＯＲ１欠失体ｐＭＯＮ　５３０８　　ｐＭＯＮ　５４２
１０ＥｃｏＲｌ　欠失体ｐＭｏＮ５３０９　　ｐＭｏＮ
　５４２０のｐａｔ　ｌ　　欠失体ｐＭＯＮ　５３１０
　　ｐＭＯＮ５４２１の）（ｔ＋ＩＬ　ｌ　　欠失体Ｉ
）ＭＯＮ　５！１１１　　ｐＭｏＮ５４２１のＲＣＯＲ
Ｖ　−Ｓｍａ　　ｌ欠失体ｐＭＯＮ　５！ｉ１２　　Ｔ
）ＭＯＮ　５４２１の［ｄｅ　ｌ　　−ＢａｍＨｌ欠失
体１１）ＭＯＮ　５り１３１）ＭＯＮ　５４２０のＮｄ
ｅ　ｌ　　−ＢａｍＨｌ欠失体１１）ＭＯＮ　５３１４
　　ｐＭｏＮ５４２１のＡａｕ　ｌ　　−ＢａｍＨｌ欠
失体１ｐＭｏＮ５３１６　　ｐＭＯＮ　５４２１のＡａ
ｕ　ｌ　　−ＢａｍＨ１欠失体＊２ｐＭＯＮ　５４２６
　　ｐＭＯＮ　５４２０のＢｇｌ　ＩＩ　　−ＢＩｌｍ
Ｈｌ欠失体ｐＭＯＮ　５４２７　　Ｉ）ＭＯＮ　５４２
０のＲＣＯＲＶ　−Ｓｍａ　　ｌ　　欠失体ｐＭｏＮ５
１２８　　Ｉ）ＭＯＮ　５４２０のＨ％　ｌ　　−９ｍ
ａ　　ｌ　　欠失体ｐＭＯＮ　５４２９　　ｐＭＯＮ　
５４２０のＦ！ｐａ　ｌ　　−Ｓｍａ　　ｌ　　欠失体
＊：両者の酵素によってＤＮＡを消化し、末端をクレノ
ーポリメラーゼで充填し、連結し、ＪＭｌｏｌの形質転
換に用いた。
＊＊　：　Ａａｕ　！１−ｐａｍＨ１欠失によって、Ａ
ｓｕ　ｌ断片が逆方向となった。この結果、ＮＨ，末端
に向って読む５３１６の配列となった。
以下に示すタクトフールにより、配列決定用１本鎖テン
プレートを再現性よく高収率で得ることができる。
配列決定すべき断片を有するｐＵＣ１１９を保持するシ
ングルコロニーを、アンぎシリン（１Ｗ１１当９２００
μｇ）を含むＬ−寒天（１０９）リプトン、５ｇ酵母抽
出物、５　ｆｌ　Ｎａｃｌ及び１５Ｉ寒天を１１当９含
有）上に塗付した。このプレート上のシングルコロニー
’ｋ、Ｌ−ブロース（１１１１４Ｊりアンピシリン２０
０　ＡＩ金含有　３１ｄＫ接種し、振とうしながら３７
℃で１晩インキユベートした。
この培養液から５０Ａノを取って、これを、サイドアー
ム付き１５０−フラスコ中に入れたアンピシリン２００
μｙを含む２面（ＩＪ当）２０１１トリプトン及び１０
．９酵母抽出物を含む）１０１１ｊＫ接種し、撮とうし
ながら３７℃でインキュベートシタ。２−５時間（５０
のＫｌｅｔｔリーディング）後、ｇ、ｃｏｌｌＪＭ　１
０１中で生育せしめたＭｌ　３ＫＯ７−（ヘルパーファ
ージ）１００μｊ’ａ？加えて、培養細胞を誘導せしめ
た。フラスコ’に１時間振とうし、次、いで２　ＸＹＴ
　２０　ｄを加えて、カナマイシンの終濃度を１１ＲＩ
当９７０μｇ、アンピシリンめ終濃度を１１ｔｔ当ｐ２
００μＩに調整した。培養液を３７℃で１６−１８時間
振と５した。誘導せしめて１晩インキユベートした培養
液３−が、４回の配列決定実験を行なうのに適当な量の
テンプレートを単離するのに十分であることが判った。
この３ｄを１．５＃Ｉｔエツ（ンドルフチューブに入れ
て１分間回転し、次いでデカントして０．２　Ｊｇｍ　
Ｇｅｒｍａｎ　８ｃｉｅｎ（１１）Ａａｒｏａｉｓａｏ
　　で濾過した。この操作は、細胞破片とインタクトｇ
、ｃｏ１１とを除去するのく有効であった。室温下”？
’１０分間、ポリエチレングリコ−ｋ　沈澱（２０４Ｐ
’Ｅ：Ｇ　、　２．５　Ｍ　Ｎａｃｌ、溶解物２ｄ当り
５００μｌ）を実施し、次いで１０分間遠心分離した。
上澄を除き、簡単に回転させて（１５秒間）、残存して
いるＰＥＧ　ン除いた。ＰＥＧが少しでも残存していて
テンプレート単離物中に含まれてしまう場合には、これ
はＤＮＡ配列決定反応に悪い影Ｉ！［を与える。得られ
るぜレツ）”ｋＴＥ（１（）ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ％ｔＪ（８，０）　１００μノに再懸濁し、こ
れらを集めて、緩衝化フェノール（等量の１Ｍ　Ｔｒｉ
ａ−ＭＣＩ、ＤＩ（８，０及び０−Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｍ　
−Ｉ（Ｃ１、ｒＪ（８，０で平衡化し次いで等量のＴＥ
で平衡化して緩衝化した）２００μｌとよく混合した。
５５℃で１０分間インキュベーションｉ、　等１（２０
０μりのフェノール／クロロホルム（１：１）を加えて
渦動せしめ、２分間遠心した。上層部を除去し、クロロ
ホルム２００μ！で抽出し、遠心分離して水層を除去し
た。３Ｍ酢酸ナトリウム（詣５．２　）　２５μ！及び
９５チエタノール６００μノを用いて、１本鎖テンプレ
ートを沈澱せしめ、氷上で５分間インキュベートし、次
いで１０分間遠心した。沈澱物を）Ｉ２ｏ　’１５μ１
ｆｌｃ再懸濁せしめ、その２　ｓｌを用いて、アがロー
スゲル上でその正しいサイズ、相対濃度、ＤＮＡの混入
ケチニックした。
配列決定用試薬及び条件 ＤＮＡ配列配列決定グツトコールＡｍｅｒｓｈａｍ　　
’Ｃ０ｒｐＯｒａｔｔＯｎから入手し得るハンドブック
に詳細に記載されている。試薬（ヌクレオチド、プライ
マー、緩衝液、チェイス（ａｈａ（１１）　）溶液、及
びクレノーポリメラーゼ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｍ　
１５シークエンシングキツト（カタログ＄Ｎ４５０２）
から得た。７１ｚ＠ｒｌｌｈａｍキットに備え付けであ
る配列−決定処方ｔ％Ａ−’Ｉ’を豊富に含むＢ、ｔ、
ｔ、遺伝子の配列決定にふされしいように調整した。＋
ＩＮ’Ｉ’Ｐと（ＬｌｉＮＴＰとの混合比１：１の代わ
りに、次の比率ｄｄＴＴＰ、　　１５μｌ　ａＧ’ｌ’
Ｐ　：　３５μｇ　ａａＧ’ｒｐ及び１０μＪ　ｄｃＴ
Ｐ　：　４０μＪ　ｄｄｃ’Ｉ’Ｐの混合比を用いた。
放射活性硫黄（〔α−３５３″ｌ　（ＬＡＴＰ　）を配
列決定反応（Ａｍａｒｓｈａｍカタログ＃８Ｊ、１３０
４）に用いた。配列決定用ゲル（ＡＪｎｓｒｓ＋ｈａｎ
ｌハンドブックの記載に基いて調製した）を、Ｈｏｅｆ
ｆｅｒ　＠Ｐｏｋｅｒｐａｃｅ”装置上で７０ワツ）（
１２００−１４００メルト）で移動させた。この時に非
常に良好な分離が行なわれることが判った。高い電圧の
場合には、なつきりしないバンドが現われた。
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の配列決定 単離したプラスミド、ｐＭＯＮ　５４２０及びｐＭＯＮ
５４２１には、３−ＯＨｌｎａ　ｍ断片が逆方向テ含マ
れていた（［回診＠）。オリイヌクレオチドグローブを
デデインするためのベースとして用いたＢ、ｔ、ｔ、結
晶の主要蚕白は、分子ｆｋ７３−７６ｋｄａｌを有して
おり、これは約２．Ｏｋｍ）のＤＮＡに相当するもので
ある。Ａ１及びＡ２プライマー（ビークＡのアミノ酸配
列に基いた合成オリゴ９ヌクレオチド２表ｍ参照）から
の最初の配列決定によって、ＤＮＡ配列は予想されるア
ミノ酸配列に対応していることが確認された。
ｐｓｔ１部位は最初の配列部分く位置しており、コノ部
位は、Ｉ）ＭＯＮ　５４２０及びｐＭｏｔ＋　５４２１
内のＢ、ｔ、ｔ、遺伝子の位置及び方向を同定するため
に用いた（第３及び第４図参照）。多くの酵素（Ｈｐａ
　ｌ、　Ｘｂａ　ｌ、　Ｎｄｅ　ｌ、　ＲｃＯＲＶ、　
Ｂｇｌ　ｌ　）を用いた制限酵素部位のマツピング、及
びＰＭＯＮ５４２０とｐＭＯＮ５４２１の９００１１９
部分にある多くの非反復部位のマツピングによって、配
列決定用ユニバーサルプライマーを用いて配列決定を行
なうことができるようになった。ユニバーサルプライマ
ーの相同領域を、遺伝子の内部領域に近づけることによ
って、ｐＭＯＮ　５４２０とＰＭＯＮ５４２１０両者に
ついてＤＮＡの欠失を生ぜしめた。
欠失を生せしめることによって容易に配列決定できない
領域については、コード配列における配列決定領域に対
応する合成オリイヌクレオチド（表ｍ）をプライマーと
して使用して、配列決定された領域を延長せしめた。配
列決定領域（シークエンスコーデイ木−ト；表■）及び
配列決定の方向ン第４図に示した。
Ｂ、ｔ、ｔ、殺虫毒素遺伝子の ｐＭＯＮ　５４２０及びｐＭＯＮ　５４２１より、配列
の全塩基対２（５１５ｂｐを得た。配列をコンピュータ
ー分析した所、２０５から２１３６塩基対に唯一のオー
プンリーディングフレームが見られた。
第５図に示したように、Ｂ、ｔ、ｔ、殺虫毒素遺伝子は
１９３２塩基対の遺伝子であって、分子量７３．０９１
ダルトンを有する６４４個のアミノ酸蛋白をコードして
いる。この蛋白は実効電荷−１７馨有しており、６４チ
のＧ−Ｃ量を有している。
Ｂａｃｉｌｌｕｅ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｅｉｓから、
甲虫類毒素及び鱗翅類毒素が得られるが、両者の毒素遺
伝子及び毒素蛋白には明らかな相違がある。Ｂ！ＬＯ１
ｌｌｕｌｌｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｅｉａから単離される
ように、両者の毒素蛋白はパラ胞子結晶中に見出される
。しかしながら、前記したように、結晶の溶解特性にに
明白な相違がある。更には、溶解した結晶中で見出され
る毒素蛋白の大きさは、両者で完全に異なる。
鱗翅類毒素蛋白は１３０　ｋＤａであり、他方、甲虫類
毒素蛋白は約７０　ｋＤａである。
Ｂ、ｔ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得た甲虫類ＩＩ素
遺伝子の単離及びＤＮＡ配列分析によって、毒素蛋白の
アミノ酸配列が予想される（第５図参照）。甲虫類毒素
遺伝子のヌクレオチド配列とそれから誘導されるアミノ
酸配列とχ、鱗翅類毒素遺伝子のヌクレオチド配列及び
それから誘導されるアミノ酸配列と比較し７．：、　Ｓ
ｍ１ｔｈとｙａｔｅｒｍａｎ　（１９８１）のアルイリ
ズムχ用いｆ、−Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）のコ
ンぎニータープログラムＢＥ８ＴＦＩＴ　７ａｌ−用い
て、この比較を実施した。ＢＥＳＴＦＩＴによって、両
者のヌクレオチド配列あるいはアミノ酸配列のマキシマ
ムアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　）が得られた
。
Ｂ］ｌＣ８’ｒＦＩＴによって２つのパラメーター、即
ち、質及び比が計算され、これらのパラメーターは、異
なるアラインメントを比較する時のアラインメント関数
として使用される。比は０と１．０の間な変動し、大き
な比の場合には、両者の配列間に良好なアラインメント
（より多くの類似性）が存することを示す。
ＢＥ８ＴＦＩＴアラインメントにより、両者の毒素遺伝
子は、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両者の点で関
連性を有していることが示された。しかしながら、また
両者の配列は明白に相違しており、ヌクレオチド配列及
びアミノ酸配列の両者において多くのミスマツチ領域が
あることも、アラインメントによって示された。例えば
、両者のアミノ酸配列を比較するための比はわずかに０
．２２であった。ヌクレオチドレベルでは、両者の配列
に多くのギャップを導入することによって初めてマキシ
マムアラインメントが得られ、その比はわずかに肌（４
７２であった。
、鱗翅類毒素遺伝子について、配列決定された多くの例
がある。これらの遺伝子について同様の比較が行なわれ
、５ｃｈｎｅｐｆら（１９８５）によって報告されｆ；
　Ｂ、ｔ、　ｋｕｒａｔａｋｉ　ＨＤ　−１の遺伝子と
Ａｄａｎｇら（１９８５）によって報告されたＢ、ｔ、
ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ　−７３の遺伝子とは、それぞ
れ最も相違する鱗翅類毒素遺伝子を示すことが明らかに
されている。
甲虫類遺伝子と鱗翅類遺伝子のアラインメントについて
求めた上記した比と比較すると、上記２つの異なる鱗翅
類蛋白のアミノ酸配列についての比は０．８１１であり
、これら２の鱗翅類遺伝子のヌクレオチド配列について
の比は０．７５５であった。このことは、甲虫類毒素遺
伝子と鱗翅類毒素遺伝子とは進化論的には関係している
が、ヌクレオチド配列及アミノ酸配列の両者の点で全く
相違していることを示すものである。
大量の組換えＢ、ｔ、ｔ、毒素を効率よく精製するため
に、Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子なＥ、ｃｏ１１高、発現ベクタ
ー中にクローン化する必要がある。オープンリーディン
グフレームの開始点であるＡＴ（）コドンの所で、１）
ＭＯＮ　５４２０にＮＣｏ　１部位を導入するため特定
部位突然変異誘発を用いた。
特定部位の突然変異誘発 新しい制限酵素部位を導入するために、　１（ｕｎｋ＠
１１（１９８５）の方法に従い、特定部位の突然変異誘
発を実施した。ｌｉｊ、ｃｏ１１株ＢＷ３１３への形質
転換によりプ・ラスミドｐＭｏＮ　５４２０を導入した
。
この株はＤＮＡ　Ｋデオキシウリジンを組込むためにａ
Ｕｔ−突然変異及びｕｎｇ−突然変異を含んでいる。
形質転換シングルコロニー’ｋ、１００μ＃　／ｄ７ン
ぜシリン及び０．２５　ａｌ　／−ウリジンを含む２ｘ
ｙ’ｒ培地で１晩生育せしめた。この培養液の０．５−
アリコートな、同じ培地１０−に加え、激しく損と５し
ながら、０．２５　（Ａ　６００　’）の濃度Ｋまで３
７℃で１時間インキュベートした。ファージ粒子を含む
１本鎖の形成χ誘導するために、ヘルパーファージＭ１
３ｘ（４７Ｙ約１０の多さで加え、１時間インキュベー
トして０−４　（Ａ　６００　）の濃度にした。上記し
た培地３０−を細見て培養液を希釈し、終濃度７０μｆ
ｉ／ｌｉｔでカナマイシン’％：　加Ｌ　Ｔｓ。インキ
ュベーション！１５時間行ない、その後遠心によって細
胞を除いた。２０４　ＰＩＩＧ　／２．５　Ｍ　ＮｅＬ
ＣＩ　１５０μＩ／ゴＲＮＡアーゼＡ３１１１７を加え
次いで氷上で１５分間インキュベーションすることＫよ
って、２５−の上澄からファージ粒子を沈澱せしめた。
遠心してファージを回収し、０．８１ＴＲバツフアーに
溶解した。０．８１Ｒｊフエノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５：２４：１）で３回抽出し次
いでエタノールで沈澱せしめて、粒子からＤＮＡ　’＆
単離した。
ＤＮＡベレットを水１００μ！に溶解し、終濃度約１ダ
／ｍ（アがロースデル電気泳動により評価）とした。
突然変異誘発のため、合成オリイヌクレオチドプライマ
ーｔ、濃度約１０　ｐｍｏｌ　／μノで水に懸濁シタ。
５　Ｑ　ｐｍｏｌオリデヌクレオチド、１ｍＭＡＴＰ。
２５　ｍＭＴｒｔｓ　−ＨＣｌｐＨ８，１０ｍＭｙｔｇ
ｃｌ、、０．２ｍ）Ｊｘベルミジン−ｇＣｌ、１ｍＭ　
ＤＴ’ｌ’及び酵素２単位を含む反応液中でで４ポリヌ
クレオチドキナーゼを利用して、オリデヌクレオ・チド
なリン酸化しに。反応液″’に３７℃で３０分間インキ
ュベートし、次いで７０℃で５分間加熱した。６．（５
１１ＭＴｒｉｇ　−ＨＣｌ、６−６　ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ
、６．６ｍＭ＊ａｃｉ及び５　ｍＭＤＴＴを含む反応液
中でファージＤＮＡ　（２ａ＃）約１ｐｍｏｌｅとプラ
イマー１Ｑ　ｐｍｏｌ・とを混合して、リン酸化プライ
マーをファージＤＮＡ　＠含むデオキシウリジンにアニ
ール化した。混合物を７０℃で７分間加熱し、次いで室
温にゆっくりと冷却した。
１１ＮＴＰを０．５　ｍＭ　、　Ａ’Ｌ’Ｐ　’！　０
．５　ｍＭ加え更にクレノー断片ＤＮＡポリメラーぜ５
単位及びＴ４ＤＮＡ　９ガーゼ（ＮｅＷ　ＩＣｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂａ　）　４００単位を加えて、２本
鎖閉環ＤＮＡ合成用の基質としてアニール化プライマー
／テンプレートを用いた。アニーリングに用いたのと同
様のバッファー塩中で、１５℃で約１５時間反応を実施
した。反応後リガーゼ４００単位を加え、２時間インキ
ュベーションを行なった。反応液の半分を用いて、ｃａ
ｃ１２で処理したＪＭ１０１細胞Ｑ、１５ｓｕｙ形質転
換し、１００μｌ／Ｉｌｌアンぎシリンを含むＬＢプレ
ート上に細胞を広げた。突然変異誘発反応液のそれぞれ
について、３０から数百側のコロニーＶ回収した。アン
ピシリンχ含むＬＢ培地中で１晩シングルコロニーを生
育せしめ、アルカリＢＤＳ法によりプラスきド調製物を
得た。プラスミドについて、新タナ制限酵素部位の存在
を分析し、この部位の存在を前記した配列分析によって
確認した。
Ｂ、ｔ、ｔ、殺虫毒素遺伝子の開始点において、ＮＯｏ
　１部位を含むプラスミド（ＰＭＯＮ　９７５９　）を
部位特異的突然変異誘発によって作成した。ここで使用
したプライマーは次の通りである。
Ｎｅｏ　ｌ　　　ＧＡＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧ
ＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＮ末端におけるＨｃｏ　１
部位の生成により、２番目のアミノ酸がアスパラザンか
らアスパラギン酸に変わった。この変化によっては、昆
虫毒性に影響扛なかった。Ｎａｏ　１部位ン導入した結
果、ＢａｍＦＩ　１部位及びＳｔｙ　１部位も生成゛シ
タ。ＮＣｏ１部位を含むプラスミドχＩ）ＭＯＮ　９７
５９と命名した。ｐＭＯＮ　９７５９から得た、毒素χ
コードするセグメントン含む２．５　ｋｂ　Ｎｅｏ　ｌ
　−Ｈｌｎｄ　［１断片ｔ、１）ＭＯＮ　５４３６　ｋ
構築するためにＮｅｏ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　［１消化ｐＭ
ＯＮ　５６３４　Ｋクローン化した。第１６図に示すよ
うに、ＰＭＯＮ　５６３４はｐＢＲ３２７Ｋ基いたプラ
スミドであり、ｆ１ファージの複製起点を含んでいる。
このベクターは、ナリジキシン酸によって誘導される合
成ｒｅｃ　Ａプロモーターを含んでいる。ファージＴ７
から得た１０リーダー遺伝子（１９８７年２月４日に出
願されたＵ、８゜ｐａｔｅｎｔ出願番号００５８２１の
明細書に記載されており、その記載を本明細書く引用す
る）も、Ｅ、ｃｏｌｉでの発現を増加させるために存在
している。プロモーター及び１０リ一ダー遺伝子配列の
下流に遺伝子を挿入するために、多くのクローニング部
位ン有する合成リンカ−が加えられている。
ｒｅａ　Ａプロモーターχ誘導するために、１晩インキ
ユベートした培養液Ｙ、０．２１カデミノ酸及び０．２
５１グルコースを添加したＭ９最少培地（Ｍｔｌｌｅｒ
、　１９７２　）で、１：５０に希釈した。
１５０　Ｋｌｅｔｃ単位でナリジキシン酸を５０μｍ１
７ｍ１まで加え、誘導３時間後に細胞を採取した。ナリ
ジキシン酸で誘導したｐＭＯＮ　５４５６によって産生
されるＢ、ｔ、ｔ、毒素のレベルを、ＩＰＴＧで誘導し
ｙ、−ｐＭＯＮ　５４２０　Ｋよって産生されるレベル
と、８ＤＳ　−ＰＡＧＥでの分析によって比較した。ク
ーマシープルーによってゲルを染色した所、ｐＭＯＮ５
４２０によって産生されるＢ、ｔ、ｔ、毒素は検出され
なかった。他方、ＰＭＯＮ５４３６によって産生される
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素のレベル線、全蛋白の約５俤であった
。この構築体ｔ、毒性レベル、昆虫特異性及び活性様式
を調べる目的で多量の組換えＢ、ｔ、ｔ、毒素蛋白を単
離するのく使用した。
Ｂ、ｔ、　ｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉａ　Ｋよっ
て多数の甲虫類毒素蛋白が産生され、これらは、胞子形
成とともに産生される蛋白結晶中に存在してやる（第６
図参照）。これらの蛋白結晶線、細胞が自己消化する間
にあるいは胞子形成後に１培地中に放出される。３３．
ｔ、ｔ、　ｖａｒ、　ｔａｎ・ｔ）ｒｉｏ！１１１１に
よって産生される多数の毒素蛋白を測定するために、こ
の微生物の培養液５００１１４１−％２リットルフラス
コ中の１００ｎＭ２１００ｎモルホリノ）エタンスルホ
ｙ酸（ＭＥＳ　）／４７７７−１ｐＨ７，００１５１Ｔ
８Ｂ培地で、３０℃で２時間生育せしめた。生育後、培
、養細胞は胞子形成し、溶解した。４℃で２０，０００
×１で２０分間遠心することＫより、蛍白結晶と胞子と
な採取した。イレン）Ｙ過剰の水で３回洗浄し、次いで
２　Ｍ　ＮａＣ１で３回洗浄した。得られるイレットｔ
、水及び０．０２４ナトリウムアジド中で４℃で保存し
た。イレン）Ｙ１００！ＩＩＭ炭酸ナトリウムバッファ
ー、ＰＨ１０に懸濁し、この懸濁液を室温で２時間撹拌
することによって、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白Ｚ蛋白結晶か
ら溶解せしめた。
２０．００　ｏｘｙで２０分間遠心して不溶物質を除去
した後、上澄７０．２μｍフィルターで濾過して残存し
ている胞子を除いた。このようにして調製し７．ＨＩ３
．ｔ、ｔ、毒素蛋白は、１２５　ｍＭＴｒｔａ−Ｈｃｌ
、４　％　ＢＤＢ、２０％グリセロール及び１０１２−
メルカプトエタノール、ｐＨ６，８（８Ｄ８−　ｐ＊Ｇ
Ｅ分析用のサンプルを調製するために用いた８Ｄ８サン
プルバツフアー）Ｋ溶解した蛋白結晶と同様に、４つの
主要蛋白とこれらと異なる１つの蛋白から構成されてい
ることが８ＤＢ　−ＰＡＧＩ分析によって判った。５つ
のユニークな生成物ｔ％Ｎ末端アミノ酸分析によって同
定した。これら５つの全ての蛋白が同じ遺伝子から産生
されているのか否か、あるいはこれらを合成するためＫ
は２つまたはそれ以上の遺伝子が必要であるのか否かｔ
調べるため、これら蛋白のそれぞれのＮ末端アミノ酸配
列ｔエドマン分解法により測定した。
Ａｐｐ１（５２）　Ｂｉｏｅｙｓｔｅｍ　、　　Ｉｎｃ
、モデ＃４７０Ａガスフエーズシークエンサー（ｐ’ｏ
ｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　　ＣＡ）−を用い１．、、　（
Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、１９８３）。
Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　　２．１　ｔｓ　　１．Ｄ、ＰＴＨ
−Ｃ１８カラムを備えｙ、：　Ａｐｐｌｉｅ４　Ｂｌｏ
ａｙｓｔｅｍｓ　、　　Ｉｎｃ、モデル１２０ＡＰＴＨ
Ｙ：用いて、オンライン法によるＲ　Ｐ　−ＨＰＬＣ分
析によって、それぞれのＰＴＨ−アミノ酸誘導体を同定
した。蛋白のＮ末端アミノ酸配列を決定することによっ
て、これらの蛋白が前記しｙ、ＨＢ、ｔ、ｔ。
毒素遺伝子から誘導されたものであるか否かがはつきす
する。
これら蛋白の配列を決定する手法は、ｇ、０Ｏ１ｉクロ
一ンＪＭ１０１　（ｐＭＯＮ５４３６）からのバンド１
及び３（第６図参照）Ｋ対応するＢ、ｔ、ｔ。
毒素蛋白；及びＢ、ｔ、ｖａｒ、　ｔｓｎｅｂｒｉｏｎ
Ｌ’ｓによって産生される蛋白’Ｙ　ＳＤ８−　ＰＡＧ
Ｅゲルで電気溶出して得られるバンド２．３及び４に対
応するＢ、ｔ、ｔ。
毒素蛋白の配列を決定する方法である。ＪＭｌｏｌ（ｐ
ＭＯＮ　５４３６　）から精製した蛋白な用いて、Ｂ、
ｔ、ｔ、１及び３の配列を決定した。
他のＥ、ｃｏｌを構築体（１）ＭＯＮ　５４５０　、　
５　Ａ　５６及び５４６０）と同様に、Ｊ　Ｍ　１０１
　（ｐＭｏＮ５４３６）も、高レベルの発現を誘導する
ことによって、不溶性で屈折性の形態を有するＢ、ｔ、
ｔ。
χ産生する。改変Ｍ９培地で６７℃でＥ、ｃｏｌｉ構築
体を生育せしめた。１晩生育せしめた培養液を用いて、
２．４４７エルンパツフフラスコ中の改変Ｍ９培地に着
初の濃度１０　Ｋｌｅｔｔ単位で接種した。
０、Ｉ　Ｎ　Ｎａ０ｆ（に溶解したナリジキシン酸を１
００［１１ｉ１ｔｔ単位の培養液に加えて終濃度５０μ
９７ｍ１とし％　Ｂ、ｔ、ｔ、　＠累蛋白の発現を誘導
した。更に４時間インキュベーションｉ、２０．０００
ＸＰテ４°Ｃで２０分間遠心することによって培養細胞
な採取した。細胞４レツトを水に懸濁して、１ｄ当り５
０００　Ｋｌｅｔｔ単位に相当する濃度とし、次いでヒ
ート・システム・ウルトラソニックス・ソニケーターに
よ５９．５０１デユーテイサイクル（ｄｕｔｙ　Ｃ７０
１ｅ　）でトータル５分間、水浴中ニテ超音波処理した
。超音波処理した調製物Ｙ　２０，０００×１で４℃で
２０分間遠心した。屈折性の物質と細胞破片を含むベレ
ットを冷水で２回洗浄し、水及ヒ２５　％　スルホラン
中に、１ｄ当り１０，０００単位に相当する濃度で懸濁
した。室温で２時間撹拌後、溶解した屈折性物質Ｙ　２
０．０００Ｘ５’で４°Ｇで再び遠心し不溶性物質を除
いた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを上澄に加えて終濃度５０　ｍ
Ｍ、　＋１）１７．６とした。
５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、２５％スルホラン
、Ｉ）Ｆ１７．６に溶解した７　５−２００　ｍＭ　Ｎ
ａＣｌグラジェント乞用いて、ＨＲ５／　５　　Ｍｏｎ
０Ｑイオン交換カラムによｇ　Ｂ、ｔ、ｔ、バンド１及
び３’ａ−共に精製しπ。
Ｂ、ｔ、ｔ、バンド１及び３を含むフラクションヲ゛９
％　ＳＤ８−　ＰＡ（）Ｅ分析で同定し、これらを集め
て、１００　ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０バツフアー
に対して透析し、ＡＪｌｉＯＯｎ　０ｅｎｔｒｉＯＯｎ
　：ｌンセントレーターで濃縮した。同様の方法により
、バンド３に対応するＢ、ｔ、ｔ、毒素蛋白’＆ＪＭｉ
　０１　（ｐＭＯＮ５４５６）から精製した。
１００　ｆｆ１Ｍ炭酸ナトリウム、２０ｍｖジチオスレ
イトール（ＤＴＴ　）、ｌ１ＩＨ１０バツフアーに溶解
したＢ、ｔ、ｔ、結晶４０μｇとともに展開した７慢Ｓ
Ｄ８−ＰＡＧＥスラデゲルより、２のみに対応するバン
ド、及びバンド３．３′と４とｔ合わＪｌｔｙ、：もめ
（８ｇ＜５図参照）乞電気溶出した。クーマシープルー
Ｒ２５０で１０分間ゲルケ染色し、次いで５０俤メ！ノ
ール、１０嗟酸で２０分間脱色した。適当なバンドχレ
ーデーカミソリで切り出し、Ｂ、ｔ、ｔ、蛋白χ電気溶
出せしめた。ｇ、ｃｏ：Ｌｉにクローン化したＢ、ｔ、
ｔ、毒素蛋白のＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定して
、これら５つのユニークな蛋白のＮ−末端を同定した（
第７図参照）。
バンド１及び３に対応する蛋白に、それぞれ独立した２
つの翻訳開始点から始まっており、これらの開始点はそ
れぞれ１及び４８の位置からスタートしている（第６及
び７図）。Ｂ、ｔ、ｔ、バンド２．３及び４に対応する
蛋白はＢ、ｔ、ｖｕｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓにのみ見られＥ、ｃｏｌｉ構築
体では見られず、これらの蛋白にバンド１または６のい
ずれかが加水分解によって開裂して生じたものである。
これらの結果により、５つの全ての蛋白は同じ遺伝子か
ら生成していることが明確になった。
昆虫毒性テストのためのＢ、　ｔ、ｔ、バンド１及び３
の精製 バンド６、及びバンド１と６に対応するＢ、ｃｏｌｉで
産生されたＢ、ｔ、ｔ、蛋白ン２５係スルホランに溶解
し、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に用いたＭｏｎｏｑクロ
マトグラフィーによりＮ製しに所、これらはコロラドポ
テト甲虫に対して毒性乞示さなかった。続いての実験で
、スルホラン自身がＢ、ｔ、ｔ。
７不活性化することが証明された。そこで他の精裳法ケ
開発し、これン用いて、Ｅ、Ｃ０１１で産生されるＢ、
ｔ−ｔ、バンド１と６の相対殺虫毒性ｔ１Ｂ、ｔ、　ｖ
ａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶から溶解したＢ、
　ｔ、ｔ、と比較した。
培養細胞を生育せしめて、誘導して採取し、次いで前記
したと同様にして屈折性の物質火単離した。１００　ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム、Ｉ）Ｈｌ　０’ｔ’用いて、各種の
Ｂ、ｔ、ｔ、蛋白を屈折性物質から溶解せしめた。アミ
コンで撹拌した細胞χ用いてＹＭ−ＩＱ膜によって濃縮
シタ溶解３３．ｔ、ｔ、　Ｙ、　ｐｈａｒｍａｏｉａ９
ｕｐｅｒｏｅｅ　１’ｌデル濾過ＦＰＬＣカラムにより
精製してＢ、ｔ、ｔ、バンド１及び３ケ他の混入蛋白よ
り分離した。８ＤＳ　−ＰＡＧＥ分析により適当なフラ
クション乞集め、濃縮してコロラドポテト甲虫に対する
毒性実験に用いた。バンド１　（ｐＭＯＮ　５４３６、
ｐＭＯＮ　５４６０　）及びバンド３　（ｐＭＯＮ　５
４５６　）に対応する蛋白は、ＳＤ８−　ＰＡＧＥ分析
によると９０係以上の純度を有していπ。’ｐＭｏＮ５
４６０によって産生されたバンド１は、４８番目のアミ
ノ酸がメチオニンの代わりにイソロイシであった（下記
参照）。
毒性比較用のＢ、ｔ、　ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ
ｅの本来（ｎａｔＬｖｅ　）の蛋白Ｓ素を得るために、
前記したと同様にしてシュクロースグラジェント遠心に
より蛋白結晶を単離精製した。結晶な１００　ｍＭ炭酸
ナトリウム、２ｎｍＭＤＴＴ、Ｊｌ　０に溶解して昆虫
毒性テストに使用した。
昆虫アッセイ用の全てのＢ、ｔ、ｔ、毒素蛋白調製物及
びコントロールにニ、トマトの葉への結合性χ高めるた
めＫ　Ｏ−３４Ｔｖｅｅｎ　２ｎ界面活性剤が含まれて
いた。３−４週令のトマトの葉を取ジ、この葉の上面及
び下面にＢ、ｔ、ｔ、蛋白ン含むバッファー溶液を十分
に塗付して、昆虫毒性テストン実施した。トマトの葉の
表面を空気乾燥して、１枚の葉と１０匹のコロラドポテ
ト甲虫Ｙ−１’）す皿中に入れ、２２℃で４日間インキ
ュベートした。死亡した昆虫の数を測定して、前記し７
ＣＡｂｂｏｔｔの式によって修正死亡率１（ＩＣＭ）’
に求めて毒性′％：表わした。全ての実験は２重に行な
い、ｐＭｏＮ５４６０から得られたＢ、ｔ、ｔ、バンド
１以外の全ては異なる日に実験を繰り返した。これらの
結果は下記の表に示した。
表　　　■ 溶解Ｂ＊ｔ、ｔ、　　　　　　　　１００　　　１００
精製バンド１　　　　　　　１　（１０８７（ｐＭｏＮ
５４３６）　　　　　　　　２　［１６８情実バンド１
　　　　　　　１０ｎ　　　　　６７（ｐＭｏＮ５４６
０）　　　　　　　　２０　　　　７２精製バンド３　
　　　　　１００　　　　９１（ｐＭＯＮ　５４５６）
　　　　　　　　２１１　　　　６４Ｅ、ｃｏ１ｉ構築
体から得た精製蛋白の相対毒性ン、溶解せしめた本来の
Ｂ、ｔ、ｔ、結晶と比較した。バンド１　（１）ＭＯＮ
　５４３６　）及びバンド３　（１）ＭＯＮ　５４５６
　）を前記したようにして精製し７Ｌ　６パンド１　（
ｐＭＯＮ５　Ａ　６０　）　Ｉａ。
ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。
本来ＯＢ、ｔ、ｔ、−結晶ｎ　１００　ｍＭＮａ２ＣＯ
３、ｐＨ１０に溶解した。
コロラドポテト甲虫を５０チ殺すのに必要なり、ｔ、ｔ
、毒素のａｈ、ｐＭＯＮ　５４３６及びｐＭＯＮ５４６
０から単離Ｌ７．：Ｂ、ｔ、ｔ、バンド１とｐＭＯＮ５
４５６から単離したＢ、ｔ、ｔ、バンド６とでは本質的
に同じであった（表Ｖ）。同様に、］＜、ｃｏｌｉから
得たこれらの精製したＢ、ｔ、ｔ、　ｐ４製物の毒性は
、Ｂ、ｔ、　ｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得
て炭酸ナトリウムに溶解した本来の毒素の毒性と本質的
に同じであることが証明された。
Ｂ、ｔ、ｔ、　　毒素蛋白の毒性断片の決定鱗翅類毒素
のＣ末端乞切りとっても毒性は減少しないことが多くの
グループによって報告されている（　５ａｈｎｅｐｆら
、１９８５　：　ａｏｒｔａら、１９８６：Ｗａｂｉｋ
Ｏら、１９８ｉ（１１５５個のアミノ酸を切りつめて６
（４７個のアミノ酸にしても毒性のロスはなかった）。
従って、蛋白のＣ末端の半分は毒性に不要なものである
。Ｃ末端欠失を有する鱗翅類毒素遺伝子は形質転換植物
においてより高レベルで発現されることが他のグループ
によって報告されている。また、毒性を維持するために
は、Ｎ末端はわずかじか切り捨てることができないこと
も報告されている（　ｇａｈｎｓｐら、１９８５；１ｏ
ｆｔｓら１．１９８６）。これらに反して、甲虫類Ｂ、
ｔ、ｔ、毒素蛋白は実質的に相違する特性を有すること
が見出された。即ち、Ｃ末端部分は毒性に臨界的であり
、従ってこれらｔ切９とること扛できない。しかしなが
らＮ末端ン欠失することはでき、毒性はこの場合維持さ
れる。下記した構築体を用いて、これらの相違を明らか
Ｋした。
１）ＭＯＮ　５　Ａ　２０　ｗ　Ｂｇｌ　ｍと１３ａｍ
Ｈ・１で消化し、連結し、次いで５Ｍ１０１Ｙ形質転換
してｐＭＯＮ５４２６に生成Ｌ　ｒｓ　ｏ　Ｂｇｌ　ｌ
　ｆｆＢ位ｔ！　Ｂ、ｔ、ｔ、　毒素遺伝子のコード領
埴内にないことｔ確認するために、この欠失体を構築し
た。
ｐＭｏＮ　５４５８　（Ｈｐａ　ｌ　％ｃ末端４６３ｂ
ｐｆ）欠失）の構築 ｐＭＯＮ　５４２０をＨＴ）亀１で消化し、以下の合成
ターミネータ−リンカ−に連結した。このリンカ−はそ
れぞれのリーディングクレームにナンセンスコドンを有
しており、またＢｇｌ　１部位が５′末端に突出してい
る。
５’　−ＴＡＧＴＡＧＧ’Ｉ’ＡＧＣＴＡＧＣＣＡ　−
３’３′−ＡＴＣＡＴＣＣＡＴＣ（）ＡＴＣ（）（）Ｔ
ＣＴＡＧ　−５′多数のリンカ−挿入を除くため連結体
ンＢｇｌｎで消化し、再び再連結した。連結体を用いて
ＪＭｌｏｌを形質転換し、１）ＭＯＮ　５４５０を単離
した。切りつめられた遺伝子のスタート部分ＫＮＯＯ１
部位を導入するため、１）ＭＯＮ　５４３０の１．４７
　ｋｂ　Ｐｅｔ　１断片を、１）Ｍｏｌ　９７５９の２
−３２　ｋｂ　Ｐｓｔ　ｌ断片と置換した。この新しい
構築体ｙｔ　ＩＩＭＯＮ　５４３４と命名した。ｐＭＯ
Ｎ　５４３４の１．５７　ｋｔ）　Ｎｅｏ　１　／Ｈ１
ｎｄＬ［３断片’ｙＨ０ａｏ１１高発現ベクターｐＭＯ
Ｎ　５６３４にクローン化して、Ｘ）ＭＯＮ５４３Ｂｔ
ｔ生成せしめたＯ ｐＭＯＮ　５４２０　Ｙ　ＦｉｃｏＲＶ　テ消化し、合
成ターミネータ−リンカ−に連結せしめた。多数のリン
カ−挿入を除くため、連結体Ｙ　Ｂｇｌ　ｍで消化し、
次いで再連結せしめた。連結体を用いて、Ｔ　Ｍ　１０
１−を形質転換し、１）ＭＯＮ５４３１を単離した。切
りつめた遺伝子のスタート部分ＫＮＯＯ１部位を導入す
るために％ｐＭＯＮ　９７５９の２．！１２１ｃｂ　ｐ
ｓｔ　１断片’Ｌ’　ｐＭＯＮ　５４３１の１−（５１
　ｋｂ　Ｐｓｔ断片と置換した。新たな構築体ｋ　ｐＭ
ＯＮ５４３５と命名した。
’ｐＭＯＮ　５４３５の１．７１　ｋｂ　Ｎｅｏ　Ｉ　
／　Ｈｌｎａ　ｍ断片をＥ、ｃｏ１１高発現ベクターｐ
ＭＯＮ　５４３３にクローン化してｐＭＯＮ　５４４１
　’に生成せしめた。
Ｂｇｌ　ｍ　テ消化Ｌｆｌ）ＭＯＮ　９７５９　ＴｔＢ
ａｌ　３１で製造業者の指針に従い５分間処理した。Ｄ
ＮＡ　’１２０．８憾アガロースゲルで電気泳動し、凍
結融解法によってアがロースから精製した。次いで合成
ターミネーターリンカーン精製ＤＮＡに連結してｐＭＯ
Ｎ５４４２’＆単離した。１）ＭＯＮ　９７５９のＮｅ
ｏ　ｌ　／Ｂｇｌ　Ｍ断片ｙ、ｐＭｏＮ５４４２の切り
つめた遺伝子断片で置換して１）ＭＯＮ　５４４５　Ｙ
生成せしめた。
ｐＭＯＮ　５４４５のＮｅｏ　ｌ　／　Ｈｌｎｄ　Ｉｌ
ｌ断片をｇ、ａｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ　５６３
４ヘクローン化してｐＭＯＮ　５４４９１に生成せしめ
−ｒｓｏ　Ｂａ１３１によって作成された欠失体の終点
７！−ＤＮＡ配列分析により′測定した。
１）ＭＯＮ　５４４８　（てｔｍ　１％Ｃ末端１６ｂｐ
の欠失）の構築 ｐＭＯＮ　５４３６　Ｙ：　Ｘｍｍ　ｌで消化し、合成
ターミネータ−リンカ−に連結した。連結体をＮ（！０
１及びＢｇｌ　ｎで消化し、切９つめた遺伝子？含む１
．９２ｋｂ　Ｎｅｏ　ｌ　／　Ｂｇｌ　Ｉｆ断片’！’
Ｎ０ＯＩ及びＢｇｌｌｌで消化しｍ　１）ＭＯＮ　９７
５９にクローン化して、完全な長さの遺伝子を置換し１
）ＭＯＮ　５４４６　ｋ生成せしめた。ｐＭＯＮ５４４
６のＮｃｏ　ｌ　／　Ｈｌｎｄ　ｌ断片ｔＥ、ｅｏ１１
高発現ベクターｐＭＯＮ　５６３４ヘクローン化して’
ｐＭＯＮ５４４８　′％：生成せしめた。
ｐＭＯＮ　５４３６ｔ−Ｎｅｏ　１−Ｃ１化Ｌ、末端Ｖ
／Ｌ／ノー断片Ｄ断片ＤＮＡポリザラ−填し、連結して
ＪＭｌｏｌを形質転換しｐＭＯＮ　５４５０　ｉｔ生成
せしめた。このプラスミドはバンド３蛋白のみｔ発現す
る。
築 Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子は２つの８ｔｙ　１部位（２２７と
１５８７）Ｙ含んでおり、１）ＭＯＮ　９７５９　Ｋ　
Ｎｃｏ　１部位を導入するために突然変異誘発により３
番目の部位χ加えた。５′末端Ｂ、ｔ、ｔ、、　ＤＮＡ
から２２７塩基対までを除去するため次の実験を行なっ
た。
ｐＭＯＮ　５４３４　（前記したＨＰ亀１欠失誘導体）
ｖ８ｔｙ　ｌで消化し、末端ｔクレノーＤＮＡポリフラ
ーぜで充填し、連結して、連結体χ用いてＪＭｌｏｌを
形質転換し、Ｔ）ＭＯＮ　５４４４’を単離した。この
増幅によってＮｅｏ　１及び８ｔ７１開裂部位が破壊さ
れた。この増幅によって、最初のメチオニン（第１番目
のアミノ酸）とロイシン（７７番目のアミノ酸）とのフ
レーム融合が起こった。ｐＭＯＮ　９７５９Ｏ１，９ｋ
ｂ　Ｎ１１ｌｌ　１　／　Ｋｐｎ　ｌ断片Ｙ　１）ＭＯ
Ｎ　５４４４ヘクローニングして遺伝子のＣ末端を加え
、ｐＭＯＮ５４５２Ｙ生成せしめた。
ｐＭＯＮ　５４５６　（バンド３変異体、Ｎ末端１４０
ｂｐの欠失） 以下に示すプライマーを用いて、前記した如き特定部位
突然変異誘発°により％Ｎ”１部位ｔバンド３のＡＴＧ
の位置に相当する、ｐＭＯＮ　５４２０の位置に導入し
てｐＭＯＮ　５４５５　ｋ生成せしめた。
突然変異誘発プライマー−Ｂ’Ｉ”１’ＬＯＯＰＣＧ’
Ｉ’Ａ’Ｉ’ＴＡ’Ｉ’ＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧ
Ｇ’Ｉ’ＴＣ’ｆ’ＴＣＣＴＣＣＣ’Ｉ’この突然変異
誘発によって、バンド１０４８個のに末端アミノ酸ｔコ
ードする上流配列も除去された。　Ｉ）ＭＯＮ　５４５
５のＮｅｏ　ｌ　／　Ｍｉｎｉ　［１断片ｔＬ　Ｃ０１
ｉ高発現ベクターりＭＯＮ　５６５４へクローン化して
、ｐＭＯＮ　５４５６　’ｌｋ生成せしめた。このプラ
スミドはバンド３のみｔ発現する。Ｈｃｏ　１部位の導
入により、２番目のアミノ酸がチオエンからアスパラ炉
ン酸に変わった。
ｐＭＯＮ　９７５９における４８番目のメチオニンをコ
ードするコドンｔ１以下に示すプライマーを用いて前記
した特定部位突然変異誘発により、イソロイシンをコー
ドするコドンに変え、ｐＭＯＮ５４５９を生成せしめた
。ｐＭＯＮ５４５　ＢのＮｅｏ　ｌ　／　Ｈ１ｎｓ１ｍ
断片なｌｉｊ、ｃｏ１１高発現ベクターｐＭＯＮ　５６
３４　Ｋクローン化して、１）ＭＯＮ５４６０’Ｙ生成
せしめた。
バンド３の蛋白の翻訳を開始するＡ’Ｉ’Ｇコドンン除
去することによって、４８番目の位置にイソロイシンＹ
Ｗするバンド１の蛋白のみｔ’ｐＭＯＮ５４６０が産生
ずるようになった。
突然変異誘発プライマー−ＢＴＴＭＥＴＡＴＴＡＴＴＡ
Ｔ’ＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＴＴＡＡ人μＣＴＣＴＴ
ＴＡＴｐＭＯＮ　５４６７　（バンド５変異体、Ｎ末端
２９３９８個のＮ末端アミノ酸を除去するために、以下
に示すプライマーを用いた特定部位突然変異誘発により
　１）ＭＯＮ　５４２０にＮＯｏ　１部位を導入し、Ｉ
ＩＭＯＮ　５４６６　Ｙ生成せしめた。
突然変異誘発プライマー ＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴ
ＴＴＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＴ突然変異誘発によりメチオ
ニン及びアラニンモ挿入せしめたｏ　ｐＭＯＮ　５４６
６のＮｅｏ　ｌ　／　Ｉ（ＬＭ　ｌ断片ｉＦ　３１，０
Ｏ１ｉ高発現ベクターＰＭＯＮ　５６３４ヘクローン化
して、ＰＭＯＮ　５４６７　’＆生成せしめた。　　′
前記した如く、新ＴＳ　Ｋ　１！！化したコロラドポテ
ト甲虫を用いたトマトの葉を餌とするアッセイ法により
、甲虫類毒素活性を調ぺた。Ｃ末端の分析に用いｒ＝　
Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子変異体を第８図と第１０図に示した
。ＰＭＯＮ　５４３８は、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白の４９
０個のアミノ酸と、ベクター構築に用いたすンカーによ
ってコードされる３個のアミノ酸を含んでいる。切りつ
められた蛋白かに、　Ｑｏｌｌ中で高レベルで産生され
たが、コロラドポテト甲虫に対して活性を示さなかった
。ｐＭＯＮ　５　Ａ　４１は、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素の５３
６個のアミノＷＩｔ含む蛋白を産生する。切りつめられ
たこの蛋白がＥ、　ｃｏｌｌ中で高レベルで産生された
が、コロラドポテト甲虫に対して活性を示さなかった。
１）ＭＯＮ　５４４９は、Ｂ、ｔ、ｔ、蛋白の５８２個
のアミノ酸と２、ベクター構築に用いたリンカ−によっ
てコードされる２個のアミノ酸を含んでいる。この切り
つめられた蛋白はＥ、ｃｏｌｌ中で高レベルで産生され
たが、コロラドポテト甲虫に対して活性を示さなかった
。
１）ＭＯＮ　５４４８は、Ｂ、ｔ、ｔ、蛋白の６４０個
のアミノ酸と、ベクター捕集に用いたリンカ−によって
コードされる２個のアミノ酸χ含んでいる。この切りつ
められた蛋白がＥ、００１１で高レベルで発現されたが
、コロラドポテト甲虫に対して活性を示さなかった。
これらの結果から、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白のＣ末端はコ
ロラドポテト甲虫に対して毒性を発揮するのに必要であ
ることが判る。わずかに４個のアミノ酸が欠失しても（
ｐＭＯＮ　５４４８　）、活性は完全に失なわれた。こ
れらの結果は、鱗翅類Ｂ、ｔ、毒素について報告されて
いる文献とは全く対職的である。
Ｎ末端変異体及び欠失体についての結果Ｎ末端分析に用
いた他のＢ、ｔ、ｔ、遺伝子変異体ン第９図及び第１０
図に示した。１）ＭＯＮ　５４５０によって産生される
蛋白の分析結果から、Ｅ、ＱＯｌｉでのバンド３０童生
は、グロテアーゼの開裂によるのではなくむしろ■Ｔ４
Ｂの位置で翻訳が開始されるためであることが判った。
また、毒性研究の結果、バンド３は毒性を示すことが明
らかになった。ｐＭＯＮ　５４５６は、４８番目のアミ
ノ酸から始まり、４９番目のアミノ酸がスレオニンから
アスパラギン酸に変わった蛋白を産生する。この蛋白は
Ｅ、ｃｏｌｉで高レベルに産生され、コロラドポテト甲
虫に対して毒性を示す。ｐＭＯＮ　５４５２は、７７番
目のアミノ酸から始まる蛋白を産生ずる。この蛋白はＢ
、ｃｏｌｌで発現され、コロラドポテト甲虫に対して活
性を示す。Ｉ）ＭＯＮ　５４６７は、９９番目のアミノ
酸から始まり、Ｎ末端に２個のアミノ酸（メチオニンと
アラニン）が加わった蛋白を産生ずる。この蛋白はｌｉ
ｉ：、Ｑｏｌｌで産生されたがコロラドポテト甲虫に対
して検出できる活性？示さなかった。しかしながらこの
欠失体の発現レベルは他の欠失体よりもはるかに低くか
った。これらの結果から、Ｂ、ｔ、ｔ、　ｍ素蛋白のＮ
末端は欠失していてもよいことが示された。７６個のア
ミノ酸が欠失していても毒性ン示した。しかしながら、
９９個のアミノ酸が欠失した場合には、毒性は示さなか
った。ｐＭＯＮ　５４６０は、バンド３の産生ケ抑制す
るために４８番目のメチオニンがイソロイシンに変わっ
ている。ｐＭＯＮ　５４６０　Ｋよって産生されるバン
ド１の毒性は、ｐＭＯＮ　５４５６によって産生される
バント°３の毒性と同じであった。
ｐＭＯＮ５４２０に含まれているＢ、ｔ、　ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ毒素遺伝子ｔ１植物発毒素遺伝
子用１植物 変異誘発法により、完全な長さのＢ．ｔ．ｔ，毒素蛋白
（バンド１．と言う）の翻訳開始を規定するＡＴＧコド
ンの直ぐ上流にＢｇｌ　１１部位を導入した。
Ｂ，ｔ．ｔ，毒Ｘ？を伝子のイニシエーターＡＴＧ領域
のＤＮＡ配列は以下の通りである。
炎 Φ　　　′ Φ ぺ 呂 ヨ Φ ト べ この突然変異誘発（ｂｔｔｂｇｌ　）に用いたプライマ
ーは２７個のヌクレオチドからなり、その配列は以下の
通りである。
ＣＧＧＡＴＴＣＡＴＴ　ＴＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣ
ＣＴＴ突然変異誘発に続いて、新たなりｇｌ　ｍ部位ン
含むプラスミドＹＢａｌｌで消化することによって同定
し、Ｂｇｌ　Ｂ部位の導入Ｙ　ＤＮＡ配列分析によって
証明した。Ｂｇｌ　１部位を有するＢ、ｔ、ｔ、毒素遺
伝子を保持するプラスミドＹ、Ｉ）ＭＯＮ９７５Ｂと命
名した（第１１図）。
ＰＭＯＮ　９７５８０Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子を、発現
カセットベクｌ　−ＰＭＯＮ　３１６　（５ａｎｄｅｒ
ａら、１９８７）に挿入シｒ、：。Ｉ）ＭＯＮ　３１６
は、ＣａＭＶ　３５８プロモーター、ツバリンシンター
ゼ（ＮＯ８）遺伝子の３′末端、及びこれらのエレメン
トの間に挿入用のＢｇｌ　１部位ン有している。プラス
ミドｐＭＯＮ　９７５８ＹＢｇｌ！Ｉで消化し、約２，
３　ｋｂの断片を単離した。
この断片は、ＡＴＧコドンの直ぐ上流のＢｇｌ田部位か
ら、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の終止コドンの約６６０ｂ
ｐ下流のＢｇｌ　１部位まで延びている。しかして、こ
の断片は、Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子の完全なコード配列を含
んでおり、また終止コドンまでの３５０　ｂｐ非コード
３′末端も含んでいる。このＢｇｌ　Ｂ断片ｔ１Ｂｇｌ
…で消化しｘｐＭｏＮ３１６に連結しり。Ｌｃｏｌｉχ
形質転換した後、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の５′末端が
ＣａＭＶ　３５８プロモーターに接丁ルようＫ　Ｂ、ｔ
、ｔ。
毒素遺伝子がｐＭＯＮ　３　ｉ　６に挿入されたコロニ
ーな同定した。このプラスミドＦ！−ｐＭＯＮ９７５３
と命名シタ。Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子ｗ　１）ＭＯＮ　
５１６中に逆方向で保持しているプラスミド？単離しｐ
ＭＯＮ９７５４と命名した（第１１図）。
無害化Ｔ１プラスミドχ含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ１ｕ
ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＳＥに、このＰＭＯＮ　
９７５３及びｐＭＯＮ　９７５４’ｔ　）リパレンテラ
ルメーテイング法により導入した。無害化Ｔ１プラスミ
ドとｐＭＯＮ９７５６あるいはｐＭＯＮ　９７５４　ト
（Ｄコ４　ンｆ’ｆレイトχ、Ｂ’ｒａｌｅｙら（１９
８５）の方法により同定し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍの全ＤＮＡのサデン分析によりその構造を確認した。
Ｂ、ｔ、を毒素遺伝子を含む他の植物発現ベクターも構
築した（第１２図及び第１３図参照）。これらのベクタ
ーにおいては、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子は植物発現ベク
ターＩ）ＭＯＮ　８９３　（第１４図）に挿入されてい
る。第１４図に示したように、発現カセットｐＭＯＮ　
８９３は、エンハンスされたＣａＭｖ３５８７’ロモー
ター、及びベーターコングリシニンのアルファープライ
ムサブユニット（下に″７Ｓ遺伝子“と記されている）
をコードする大豆遺伝子から得たポリアデニル化シグナ
ルＹ含む３′末端ン含んでいる。この２つのエレメント
の間に、遺伝子挿入用の多数の制限酵素部位を有するマ
ルチリンカ−がある。
エンハンスされたＣＡＭＶ　３５　Ｓ　フロモーターは
以下のようにして構築された。−３４６と＋９の間に渡
っているＣａＭＶ　３５　Ｓプロモーターの断片ｆ、　
Ｑｄｅｌｌら（１９８５）の方法に従ってあらかじめｐ
Ｕｃ　１３内に構築した。このセグメントは、Ｑｄｅｌ
ｌら（１９８５）によってＣＩ！ＬＭＶ　３５　Ｓプロ
モーターの最大発現に必要と同定された領域χ含んでい
る。このセグメントＹ　Ｃ１ａ　ｌ　−Ｈｌｎｄ　Ｔｌ
断片として切り出し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断
片）で平滑末端化し、Ｉ）ＵＣ１８の）（ｉｎｏ　１部
位へ挿入した。５５Ｂプロモーターの上流領域を、Ｈｌ
ｎｄ　［１−ＲｃｏＲＶ断片（−３１５から−９０に渡
っている）としてこのプラスミドから切９出し、Ｈｌｎ
ａ　ｌとｐｅｔ　１部位の間の同じプラスミドに挿入し
た。かくして得られるエンハンスされたｃａｗ　５５８
プｏ−ｒ−一ターは、−３４３と−９０との間に２重配
列ン含んでいる（第１８図参照）。
７Ｓ遺伝子の３′末端は、１７．１クローン（Ｂｃｈｕ
ｌｅｒら、１９８２）に含まれている７Ｂ遺伝子から誘
導した。この３′末端は、ポリアデニル化シグナルを含
んでおｐ１クローン１７．１のベーターコングリシニン
の終止コドンの約３０ｂｐ上流にあるＡｖａ　１部位か
ら、この終止コドンの約４５０　ｂｐＴ流の位置にある
ｇｃｏｉ　１部位に渡っている。
ｐＭＯＮ　８９５の残りの領域には、Ｌ　ｃｏｉｌでの
複製起点及びＡｇｒＯｂｌＬＯｔ＠ｒＬｕｍ株ＡＣＯ（
下ｆｆｉ参ｆｆ１ｌｌ　）　ノ無害化Ｔ　−ＤＮＡとの
相同組換えのための領域を付与する１）ＢＲ３２２のセ
グメント：広範囲宿主のプラスミドＲＫ２から得ｙ、、
ｏｒｉ■領域；　’ｌ’ｎ　７から得タストレプトマイ
シン耐性／スプレクチノマイシン耐性遺伝子：及びＣａ
ＭＶ　３５　Ｂプロモーター及びツバリンシンターぜ（
ＮＯ８）　３’末端乞含み、形質転換植物細胞に対して
カナマイシン耐性を付与するキメラＮＰ’Ｉ’　ｌ遺伝
子が含まれている。
ｐＭＯＮ　９７５３　Ｋは、終止コドンの下流にまで至
る約４００　ｂｐの３′末端非コード領域が含まれてい
た。この領域は毒素産生には不必要であったので、ｐＭ
ＯＮ　８９３に挿入したＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子セグメ
ントからこの領域ン除いた。６′フランキング配列を有
しないＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子ン作成するために％ｘｕ
ｎｋｅｘ　（１９８５）Ｏ方法に従ッテ、終止コドンの
直ぐ後にＢｇｌ　１部位を導入した。
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の終止コドンのまわりの配列は
以下の通りであった。
以下の配列を有するプライマー　（ｂｔｔａｔｅｒｍ　
）　′％：用いて突然変異誘発を実施した。
ＣＴＴＴＣＴＡＧＴＴ　ＡＡＡＧＡ’ｌ’ＣＴ’ｌ’Ｔ
　ＡＡＴＴＣＡＣＴＧｌ）ＭＯＮ　９７５８　’ｉ’用
いて、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の突然変異誘発ン行なっ
た。新たなりｇｌ　１部位ン有するプラスミドＹ　Ｉ）
ＭＯＮ　９７８７と命名した（第１２図参照）。Ｉ）Ｍ
ＯＮ　９７８７はＡ’Ｉ’Ｇ開始コドンの直ぐ上流にＢ
ｇｌ　ｌ　１を有しているため、約１９４０　ｂｐのＢ
ｇｌ　ｌ断片上に、５′または３′フランキング配列を
本質的に有しないＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の完全な長さ
のコード配列が保持されている。
この１９４０　ｂｐ断片Ｙ　ｐＭＯＮ　９７８７から単
離−し、Ｂｇｌ　ｍで消化したＩ）ＭＯＮ　８９３に連
結した。
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の５′末端がエンハンスされた
ＣａＭＶ　３５　Ｂブロモ−ターに隣接しているプラス
ミドを同定し、Ｉ）ＭＯＮ　９７９１と命名し−ｒｓ　
（第１２図参照）。
ｇｉ、００１１にて、完全な長さのＢ、ｔ、ｔ、毒素の
変換体が第２のメチオニン開始コドンから産生された。
この蛋白ｖ１バンド３″と命名し、これは完全な長さの
毒素（１バンド１″）と同様の毒性ｔコロラドポテト甲
虫に対して有していることが見出された。Ｂ、ｔ、ｔ、
遺伝子の場合と同様に、Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子の切９つめ
た形態の遺伝子も植物細胞中で発現させることが可能で
ある。従って、バンド３のＡＴＧコドンの上流領埴が除
かれた改良Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子を構築した。この領
域を除去するため、Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８５）の方法
に従い、バンド３のＡＴＧの直ぐ上流にＢｇｌ田部位を
導入した。バンド３のＡＴＧのまわりの配列は次の通り
であった。
ｃ＋＋　　　　　　− 一ノ　　　　　シー 以下に示すプライマー（ｂｔｔｎｔｅｒｍ　）　Ｙ用い
て、突然変異誘発を実施した。
ＡＴＣ’ｒＧＣＡＧ’Ｉ’ＣＡＴＴＧ’ｌ’ＡＧＡＴＣ
ＴＣＴＣＴＴＴＡＴＡ　ＡＴＴＴこのプライマーを用い
た突然変異誘発ｔ％Ｉ）ＭＯＮ５４２０内に含まれるＢ
、ｔ、ｔ、毒素遺伝子に対して行なった。新たなりｇｌ
　１部位を有するプラスはド’ｋ　ＰＭＯＮ　９７８　
Ｂと命名した。バンド６のこのＢｇｌ　１部位から始ま
り、ｐＭｏＮ　９７８７の終止コドンの末端部分のＢｇ
ｌ　１部位まで延びた切りつめられたＢ、ｔ、ｔ、毒素
遺伝子ｔ１以下のようにしてｐＭＯＮ　８９３内に構築
した。１）ＭＯＮ　９７８８　（第１３図参照）　’％
：　Ｂｇｌ　ｌ及び）（ｂｇ　ｌで消化し、約１２５０
　ｂｐの断片を単離した。この断片は、バンド６のＡ’
Ｉ’Ｇから、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の中間にある非反
復）（ｋ）ＩＬ　１部位に渡っている。ｐＭＯＮもＢｇ
ｌ　ＩＩと）（ｂａ　ｌで消化し、約５５０　ｂｐの断
片を単離した。この断片は、毒素遺伝子の中間にある非
反復）（ｂａ　１部位から、終止コドンの末端部分のＢ
ｇｌ　ｎ部位に渡っている。この２つの断片を混合し、
Ｂｇｌ　ｌで消化し７．＝　ＰＭＯＮ　８９３に連結し
た。
毒素遺伝子の５′末端がエンハンスされたＣａＭ７３５
Ｂプロモーターに隣接したプラスミドン同定し、これＹ
　１）ＭＯＮ　９７９２と命名した。ｐＭＯＮ　９７９
２は、バンド３のみなコードする、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺
伝子、のＮ末端Ｙ＋ｇＪりつめた誘導体を含んでいる（
第１３図参照）。
ｐＭＯＮ　９７９１とｐＭＯＮ　９７９２　ノ両者χ、
無害化で１プラスミドを保持するＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎａ株ＡＣＯに導入した。コインヂグレイトしたもの
χ選択し、トマトとポテトの形質転換に用いた。
’ＡＣＯは、ｐｒａｌｅｙら（１９８５）によって報告
されたｐ’Ｘ’１Ｂ　６８Ｒと同様に、無害化された株
である。
ＡＣＯ’＆構築するために、ツバリン型Ｔ１プラスミド
１？［持するＡ２０８株Ｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍの出発味として用いた。Ｔ　−ＤＮＡのレフトざ−グ
ーとレフト？−グー内の２，３百個の塩基対以外は本質
的Ｋｔテ（７）’１’−ＤＮＡｔ’除去するため、Ｆｒ
ａｌｅｙら（１９８５）によって報告されたと同じ方法
に従って、Ｔ１プラスミドン無害化した。Ｔ　−ＤＮＡ
のライトだ−グーの終りまで延びた’ｌ’　−ＤＮＡの
残りの領域Ｙ、ｐＢＲ３２２のセグメント、プラスミド
ＲＫ２から得たｏｒｉ　Ｖ領域及び’ｒｎ　６０１から
得たカナマイシン耐性遺伝子ン含む（左側から右側にか
けて）新たなりＮＡ断片と置換した。ｐＢＲ３２２とｏ
ｒ１Ｖセグメントは、ｐＭＯＮ　８９３のセグメントと
同様であり、コインテグレイトを起こすための相同領域
を与えるものである。ＡＣＯＴｉプラスミドの構造を第
１７図に示した。
ＭＡＳプロモーターを用いたキメラＢ、ｔ、ｔ。
毒素遺伝子 ＭＡＳプロモーターχ、１，５　ｋｂ　ＥＯＯＲｌ　−
Ｃ１ａ　１断片としてｐＴｉＡ　６から単離した。この
ＤＮＡ断片は、Ｂａｒｔｃｅｒら（１９８３）の配列の
２０，１３８番目のヌクレオチドの（Ｊａ　１部位から
、２１，６３１番目のヌクレオチドのＥＣＯＲ１部位に
渡っている。
第１５図に示したように、ＫＯＯＲ１−Ｃ１ａ　Ｉ断片
ｔ１あらかじめＥａｏＲｌと（’ｌａ　ｌで消化したバ
イナリ−ベクターｐＭＯＮ　５０５　（Ｈｏｒｓｃｈら
、１９８６）に連結した。得られるプラスミドｙｘ　ｐ
ＭＯＮ７０６と命名した。ＮＯ８３’末端ン含む断片ｙ
、ｍｓプロモーターの下流に挿入してＭＡＳ　−ＮＯ８
３’発現カセ７　）　ヘ／　！−’ａ’得た。ＮＯ８３
’断片を、３００　ｂｐＢｇｌ　ｌ　−ＢａｍＨｌ断片
としてｐＭＯＮ　５３０から切ジ出し、Ｂｇｌ　ｉｌで
消化したｐＭＯＮ　７０６に挿入した。
得られるプラスミドχ１）ＭＯＮ　７（４７と命名した
。
プラスミドＰＭＯＮ　５３０は、ｐＭＯＮ　２００　ｗ
　Ｎｄｅｌで開裂して９００　ｂｐ　Ｎ（１１）　１断
片を除去して１）ＭＯＮ　５０３ｙｔ作成することによ
って構築される。
プラスミド１）ＭＯＮ　５　Ｑ　３　ｆ　Ｈｌｎｄ　ｍ
及びＳｍａ　ｌで開裂し、あらかじめＨｌｎｄ　［１と
ｓｍａ　ｌで開裂せしめたプラスミドｐＴＪｓ　７５　
（８ａｈｍｌｈａｕ（１１）ｒと）（ｅｌｉｎｅｋｉ、
１９８５）と混合した。ｐＭＯＮ　５０３の８ｋｂ　Ｈ
ｌｎ（Ｌｌｌ　−３ｍａ　ｌ断片に結合したｐＴＪ８７
５の３．８ｋｂ）（１ｎｃｌ　［１−Ｓｍａ　ｌ断片を
含むプラスミドを単離し、ｐＭＯＮ　５　［１５と命名
した。次いで、ｐＭＯＮ　３１６　’１３ｔｕ　ｌとＨ
ｌｎｄ　ｌで開裂して、ＮＯ８−ＮＰＴ　ｎ’−ＮＯＳ
マーカーとＣａＭＶ　３５　Ｂ　−ＮＯ８３’カセツト
とを含む２．５　ｋｂ　８ｔｕ　ｌ　−Ｈｌｎｃｌ　ｌ
断片？単離することによって、ＣａＭＶ　３５８−　Ｎ
Ｏ８３’カセツト’！’　Ｉ）ＭＯＮ５０５に移した。
これな、３ｔｕ　ｌと阻ｎｃＬ［ｌテ開裂したｐＭＯＮ
　５０５に加えた。連結、形質転換に続いて、ｐＭＯＮ
　５０５内にＣａＭＶ３５　Ｓ　−ＮＯ８３’カセツ）
Ｙ保持するプラスミドヲ卑離し、これをｐＭＯＮ　５３
０と命名した。
コインテグレイテイングベクターに比べて、バイナリ−
ベクターはトマトでの形質転換頻度がかなり減少するた
め（）７０ＣＯｒｍｉＣｋら、１９８６）、ＭＡＳ　−
ＮＯ８３’　カセットをＰＭＯＮ　７（４７からコイン
テグレイテイングベクターｐＭＯＮ　２００　（Ｆｒａ
ｌｅｙら、１９８５）に移した。プラスミドｐＭＯＮ２
００’ｙ３ｔｕｌとＨｌｎｄ　ｍで消化し、アザロース
ゲル電気泳動によって７．７　ｋｋ）断片を単離した。
プラスミド１）ＭＯＮ　７（４７　Ｙ同様にして３ｔｕ
　ｌとＨｌｎａ　Ｉｎで消化し、アがロースゲル電気泳
動次いで１Ｍ　ＮａＣ１で溶出することによってＤＥＡ
Ｅ膜上に回収することにより、ＭＡＳ　−ＮＯ８３’　
カセットを含む３．５　ｋｔ）Ｓｔｕ　ｌ　−Ｈｌｎｄ
　■断片ケ単離した。２つのＤＮＡ断片χ連結し、得ら
れるプラスミド’＆　ｐＭＯＮ　９７４１と命名した（
第１５図）。このプラスミドは、ｐＭＯＮ　２００コイ
ンテグレイテイングパツクグランド中にＭＡＳ　−ＮＯ
８３’カセットヲ含んでいる。
１）ＭＯＮ　９７９１あるいはｐＭＯＮ　９７９２　Ｙ
　Ｂｇｌ田で消化し、毒素をコードする断片ケ回収し、
本明細書に記載した方法に従ってこの断片Ｙ　１）ＭＯ
Ｎ９７４１に導入して、ＭＡ８プロモーターによって誘
導されるキメラＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子を構築した。
これらの中間体ベクターを用いて植物ン形質転換し、Ｂ
、ｔ、ｔ、毒素蛋白に対して感受性を示す甲虫類に対し
て毒性乞発揮せしめることもできる。
Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｉ）ＭＯＮ　９７５３−
　Ａ２ＢとｐＭＯＮ９７５７−　Ａｓｇ　ｙｚ用いて、
ＭａＣｏｒｍｉａｋら（１９８６）の方法に従って、ト
マトの葉のディスクを形質転□換した。形質転換トマト
植物χ、Ｍ６（：’ＯｒｍｉＯｋらの方法に従って回収
し、カナマイシン耐性についてアッセイした。
トランスジェニックトマト植物の昆虫毒性コロラドポテ
ト甲虫（Ｉ、ｅｐｔ１ｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎ
＠ａｔａ　）　！用いたバイオアッセイにより、ｐＭＯ
Ｎ　９７５３内に保持されたＢ、ｔ、ｔ・毒素遺伝子で
形質転換されたトマト植物について、毒素遺伝子の発現
ン分析した。分析すべきトマト植物から切り取った葉ヲ
、水を含ませたフィルターペーパーが入つ−ｒ、＝４）
９皿に入れた。１０匹あるいは２０匹の新たに評化した
ポテト甲虫ンこれに入れて、葉ン餌として食べるように
した。４日後に死亡した甲虫ン調べた。更に、成長が遅
れた（気絶した）甲虫についても調べ、また葉について
も、餌として食べた時にダメージケ与える毒性が残って
いるか否かン調ぺた。
それぞれの実験において、コントロールとして多くの非
形質転換植物が含まれていた。５０から１００個の非形
質転換植物ケコントロールとしてアッセイした。これら
のコントロール植物で、８０嗟以上の植物がポテト甲虫
χ殺すことが出来ず、約１５俤の植物がポテト甲虫を１
０嗟殺し、５悌またはそれ以下の植物がポテト甲虫χ２
０憾殺した。２０嗟より多くポテト甲虫な殺すコントロ
ール植物は見当らなかった。
表■に示したように、非形質転換コントロール植物より
も高レベルのコロラドポテト甲虫死亡率′％：有するい
くつかの植物が回収された。これらの結果から、植物を
餌として食べた時に有意に多数の昆虫馨殺すに十分なレ
ベルでＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子が発現されていることが
判る。
ポテトでの甲虫類遺伝子の発現 Ｍ８メジャー及びマイナー塩、０．１７ｇ／ｌリン酸２
水素ナトリウム、０．４　＃　／　ｌチアミン−）ＩＣ
１，０，１１１／ＩＩイノシトール、３１シユクロース
、２．０　＃　／　ｌ　　Ｇ４１ｒｉｔｅ　（ＫｅｌＯ
ＯＣｏ、　）　（ｏＨ５，６）　’＆含む培地で、ポテ
ト変５ｌ（ｅｎｎｅｂｅｃの新芽の先端χ継代培養した
。培養液’に２４℃で１６時間光を照射して４週間生育
せしめた。茎の部間ケ約８ｆｌの長さに切って、切った
表面ンＡｇｒＯｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ｐＭＯＮ　９７５
３−　ＡＧＥで塗り付けた。この株はＬＢ寒天上に塗付
して２乃至３日間生育させたものである。前記した如（
ｐＭＯＮ　　　−９７５３−Ａｓｗは、ＣａＭＶ　３５
　Ｂプロモーターによって誘導されるキメラＢ、ｔ、ｔ
、毒素遺伝子を含んでいる。また他の方法として、キメ
ラＢ、ｔ、ｔ。
毒素遺伝子を保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ１ｕｍ株Ｉ
）ＭＯＮ９７９１−　ＡＣＯまたは１）ＭＯＮ　９７９
２−　ＡＣ’Ｏ’Ｙ用いり。茎の切断部分を、Ｊａｒｒ
ｅｔら（１９８０）の方法と同じように塩と有機＠を含
み更に３憾シユクロース、３＃／ＩＢＡ及び０．１　ｍ
９　／　ｌ　ＮＡＡ（Ｊ（５，６）’＆含む０．８係寒
天で固化した培地上に置いた。４日後、この茎を、同じ
組成ではあるが５００１９／Ｉｔカルベニシリンと形質
転換植物細胞の選択試薬としての１００＃／Ｊカナマイ
シンな含む培地に移した。４週間後、再び、同じ組成で
はあるが唯一のホルモンとして０．３ｐｏ／ｌ　　（）
Ａ３を含む培地に移した。１００＃／ｌカナマイシンの
存在下で発達せしめたカルスは、ポテト細胞が形質転換
されたことな示すドツトプロットアッセイでテストした
所、ＮＰＴＩ酵素な含んでいることが判った。非接種の
コントロール組織線１ｏｏＩＩＩ９／ｌカナマイシンの
存在下では抑制された。形質転換ポテト組織はＢ、ｔ、
ｔ、毒素遺伝子奮発現した。
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素ＩＥＩＲＮＡはノーデン分析によって
検出することができ、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白はウェスタ
ンプロット分析などのイムノアッセイによって検出する
ことができる。しかしながら、多くの場合、Ｂ、ｔ、ｔ
、毒素の存在を分析する最も感度の良いアッセイ法は昆
虫バイオアッセイｔある。形質転換組織Ｙ食べたコロラ
ドポテト甲虫の幼虫線、毒素の効果によるダメージケ受
けた。
カナマイシン耐性形質転換ポテト細胞？作成するこの方
法は、新芽？再生するのくも使用することができた。１
から２儂の長さの新芽を取り、新芽が容易に根付くこと
のできる前記した新芽の先端な維持するのに用いた培地
上に置いた。
この方法で作成された植物について、ＮＰ’Ｉ’ＩＩ酵
素の発現をアッセイしまたカナマイシンな含む培地上で
その茎の部分がカルスン形成することができるか否かχ
調べることによって、形質転換されたかどうかχテスト
した。形質転換した植物はＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子奮発
現しｆ、−０Ｂ、ｔ、ｔ、毒素ｍＲＮＡはノーデン分析
によって検出することができ、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白な
ウェスタンプロット分析などのイムノアッセイによって
検出することができる。
形質転換組織を食べたコロラドポテト甲虫の幼虫は、毒
素の効果によるダメ−シン受けた。
ワタでの甲虫類毒素の発現 ワタの種子ｖ、　５ｐａｒｌｃ１ｅｅｎ　５ｏａｐ　ｖ
加えた洗浄剤水溶液に１０分間浸し、４００ＷＬｔ当９
２滴の′ｒＷｅｅｎ　２０　ｆ含む３０　’１６　Ｃｈ
ｌｏｒｏｘ　＠液中で２０分間攪拌し、次いで滅菌蒸留
水で２回リンスすることによって、ワタの種子の表面を
滅菌した。次いで、種子ｔ’　０．４１ペル−ト（ｂｅ
ｎｏｌａｔｅ　）に１０分間浸した。ペルレートを流出
させ、次％ｒｈｊ寒天を固化した半分の強度のＭＳ＃ｉ
上に無菌的に種子を置いた。暗所中で３２℃で種子ｖ３
−１０日間発茅させ発芽次いで、子葉と胚軸ン無菌的に
取り、切断した。この断片χ、１）５１グルコース、２
Ｗ／ｌす７ｐｖｙ酢＃　（ＮＡＡ　）　及ヒＩ　Ｑ／ｌ
　：／７４ネチンを含む寒天で固化したＭＳ培地（ＭＳ
Ｓ培地）または２）３％グルコース、Ｂ５ビタミン、１
００ｖ／ｌイノシトール、０−７５　ＩＱ　／　ｌ　　
ＭｇＣ１，，０，１ダ／ｌジクロロフ工ノキシ酢Ｍ（１
２），４−Ｄ）及び０．１もしくは０−５　＃　／　Ｊ
カイ木チンを含むＧｅ１ｒｉｔｅで固化したＭＳ培地（
ＭＳ’Ｉ’培地）上に置いた。胚形成が始まるまで、カ
ルスｔこれらいずれかの培地上に２８℃で１６７８光照
射して維持した。グルコースの代わりに３慢シユクロー
スを含む以外は最初に用いたと同じ培地上に、胚形成サ
プカ＃　ｆ　’ｒ　−’ｇ置いｒ。０．７５１　／　ｌ
　　ＭｇＣ１゜扛含むが植物成長調節剤を含まないＧｅ
１ｒｉｔｅ　　で固化したＢｔｅｗａｒｔ培地に移して
、体性圧を発芽させた。発芽した胚ン、成長し続けるこ
とのできる成長チャンバー中の土壌に移した。次いで、
種子を発育させ花ン咲かせるために植ｖＪをグリーンハ
ウスに移した。
ワタ組織の形質転換、及び形質転換カルスと植物の産生
は以下のようにして行なった。ｆＩ物再再生用無菌苗木
を調製した。子葉と胚−断片に、１晩液体培養し７１：
　Ａｇｒｏｂａａ　ｔｅｒｉｕｍ　ｔ＠　養液まタニ栄
養プレート上で生育せしめ７．：　ＡｇｒＯｌ）ａｃｔ
６ｒｉｕｍ　’ｆ：接種−した。ｌ／１Ｇ濃度のＭ８塩
に含むＭ２Ｏま７．−　［ＭＳ’ｌ’培地上で２〜３日
間移植片馨培讐した。移植片？フィルターペーパー上に
プロットして過剰のバクテリアを除き、５００Ｆｎ９／
ｌカルベニシリン及び３０３０−１Ｏ０／Ｊカナマイシ
ンヲ含むＭ８８マフ：はＭＳＮ培地上にプレートした。
形質転換されたカルスなこの培地上で生育し、胚ｖｔｔ
生する。この胚を生育せしめて再生Ｍ物とする。この植
物にっいて、ＮＰＴＩＩの発現をアッセイすることＫよ
り形質転換されたかと）かテテストした。
形質転換に用い７．：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ株
がＰＭＯＮ９７５３．１）ＭＯＮ　９７９１．１）ＭＯ
Ｎ　９７９２などのキメラＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子ン保
持している場合には、形質転換カルス、このカルスから
誘導される胚及びこの胚から誘導される形質転換植物に
おいてＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子が発現される。これらす
べての場合において、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素ｍＲＮＡの発現
はノーデン分析によって検出することができ、Ｂ、ｔ−
ｔ。
毒素蛋白の発現はウェスタンプロット分析などのイムノ
アッセイによって検出することができる。
１１ｍ蛋白の存在な測定する最も感度の良い方法は昆虫
バイオアッセイである。
カルス、胚あるいは植物の昆虫毒性な、ワタミハナゾウ
ムシの幼虫（Ａｎｔｈｏｎｏｍｏｕｓ　ｇｒａｎｌｓ　
）　′％：用いたバイオアッセイにより調べた。Ｂ、ｔ
、ｔ、毒素遺伝子音発現している形質転換ワタの細胞ま
たに植物な食べたワタミハナゾウムシは毒素の効果によ
るダメ−シン受けた。
トウモロコシでの甲虫類毒素遺伝子 の発現 以下に、トウモロコシからのプロトプラストの調製、エ
レクトロポレーションによるキメラＢ、ｔ、ｔ。
毒素遺伝子のプロトプラストへの導入、及びキメラＢ、
ｔ、ｔ、毒素遺伝子を発現するカナマイシン耐性安定形
質転換トウモロコシ細胞の回収についての概略を述べる
。
トウモロコシプロトプラストの調製 ｐｒｏｍｍら（１９８５及び１９８６）Ｏ方法に従い、
ＢｘａａｋＭｅｘｉａａｎ　Ｂｗｅｅｔ　（８Ｍ８　）
　ｌ’つそロコシサスペンシヨン系ＢＭ８１（ＡＴＣ＆
　５４０２２　）からプロトプラストを調製した。ＭＳ
塩、２０１１１１シユクロース、２４／ｌ　（２，４−
ジクロロフェノキシ）酢酸、２００ダ／！イノシトール
、１３０１１９／ｌアスパラゼン、１．３叩／ｊナイア
シン、０．２５１１１ｇ／ｊチアミン、０．２５Ｍｇ／
Ｊピリドキシ７．０．２５ＴＩＩ９／ＩＩＡントテン酸
カルシウム、−５，８を含む１Ｍ８培地でＢＭ８Ｉ懸濁
細胞を生育ゼしめた。１２５１１ｊエルレンマイヤーフ
ラスコ中に培養液４０−を入れて２６℃で１５Ｏｒｐｍ
？振とうした。等量の新たな培地で３日ごとに培養液を
希釈した。新たな培地添加１−２日後の活発に生育する
細胞からプロトプラストを単離した。プロトプラストを
単離するに際しては、振とう容器テーブルトップ遠心機
で２０　ｏｘｙ−で細胞を遠心してベレット化した。上
澄を１プロトプラストを培養するためのならし培地とし
て使用するため取っておいた。１１セルロース、０．５
９６ヘミセルロース及び０．０２１ペクチナーゼを含む
０．２Ｍマエトーに／　５０　ｍＭ　ｃａＣ１２／　１
０　ｍＭ酢酸ナトリウム４０−に細胞６−を再懸濁した
。２６℃で２時間インキュベーショｙ後、プロトプラス
トｔ６０μ落ナイロンメツシュスクリーンで濾過しイ分
離し、２ｏｏｘｙで遠心し、酵素を含まない以外は同様
の溶液で１回洗浄した。
’ｌ　ｍＭリン酸ナナトリウムｐＨ７，１，４ｍＭ塩化
カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２Ｍマ
ニトールを含む溶液中で洗浄して、エレクトロポレーシ
ョン用のプロトプラストを調製した。洗浄後、１ｄ当り
４Ｘ１０’プロトプラストの濃度で、プロトプラストを
同と溶液に再懸濁した。溶液を含むプロトプラストの半
分ｔ、スス−−コイルプラスミド、ベクターＤＮＡ　５
０マイクログラムを含む同じ溶液０．５−と混合し、１
−二しクトロポレーションキュゲエットに入れた。Ｐｒ
ｏｍｍう（１９８６）の方法に従ってエレクトロポレー
ションを実施した。２００ｖに荷電した１２２また゛扛
２４５マイクロｐａｒａａコンデンサーから電気パルス
を出した２４℃で１０分間、室温で１０分間後に、Ｍ８
塩、Ｑ、３Ｍマ＝）　−＃、２４　シュ／　ａ　−ｘ、
２１１１９／Ｉｔ２　、４−　Ｄ、　２０４ｔｘＧ）シ
ＢＭ８培地ＣＭ記参照）及び０．１−低融点アガロース
を含む培地８ＩＩｊでプロトプラス）Ｙ希釈した。暗所
で２６℃で２週間放置後、マニトールに含まないがカナ
マイシンを含む培地を加えて、カナマイシンの終濃度’
ｔ’１００９／ｌとした。更に２週間後、培養液からマ
イクロカルスを取り、１００１９／ｌカナマイシンχ含
むアガロースで固化した培地上のメンプレンフィルター
ディスクの上に置いた。形質転換トウモロコシ細胞で構
成されるカナマイシン耐性カルスカ１−２週間後に現わ
れた。
トウモロコシ細胞でのＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の発町 Ｃ！ＬＭＶ　３５　Ｓプｏ　−ｖ−−ｐ　−１ＮＰ’ｒ
　ＩＩ　：７−ド領塘及びＮＯ８３’末端から構成され
るキメラカナマイシン耐性遺伝子娶含むＤＮＡベクター
でエレクトロポレーション後、カナマイシンを含む培地
で生育した細胞を選択することによって、形質転換トウ
モロコシ細胞を選択することができる（　Ｆｒｏｍｍら
（１９８６）の方法）。ｐＭＯＮ　９７９１とｐＭＯＮ
９７９２がこのようなキメラＮＰ’Ｉ’　ｎ遺伝子を含
み、またキメラＢ、ｔ）、毒素遺伝子を含んでいる。上
記したように、ＰＭＯＮ　９７９１またなｐＭＯＮ９７
９２のベクターを用いて、エレクトロポレーションによ
りトウモロコシプロトプラストを形質転換した。
カナマイシン耐性に基いて選択後、形質転換トウモロコ
シ細胞についてＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の発現をアッセ
イした。ノーデンプロット分析によりＢ、ｔ、ｔ、　１
ｆｌＲＮＡの分析を実施し、ウェスタンプロット分析な
どのイムノアッセイによってＢ、ｔ、ｔ、毒素蛋白？分
析した。
サデーンコーン根食い虫の幼虫（ｐｉａｂｒｏｔｉａｕ
ｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｌｉ　）　
Ｉｃ形質転換トウモＯコシカルスを与えることによって
昆虫毒性のアッセイを実施した。また、形質転換トウモ
ロコシ細胞から、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白を含む蛋白抽出
物を調製し、この抽出物を適当な餌に加えて、サデーン
コーン根食い虫の幼虫に与えることによってアッセイす
ることもできる。形質転換カルスあるいはこのようなカ
ルスの蛋白抽出物を食べた根食い虫の幼虫は、毒素の効
果によジダメージを受けた。
以上に述べた例は、本発明の実施ｔよりよく説明するた
めに述べたものであって、本発明の範囲を限定するため
のものではない。本発明の範囲及び精神ヶ逸脱して、本
発明の改良を行なうことは当業者にとって不可能である
ことが理解されよう。
引　　用　　文　　献 １８　：　２６５−２６７゜ Ａｄａｕｇ、　Ｍ、　Ｊ、、　５ｔａＶｅｒ、　Ｍ、Ｊ
、、　Ｒｏａｈｅｌｅａｕ。
Ｔ、Ａ、　、　　Ｌｅｉ（（ｈｔｏｎ　、　　Ｊ、　、
　　Ｂａｒ＋ｃｅｒ　、　　Ｒ，Ｆ、及び’１’ｈＯｍ
ｐ８０ｎ、　Ｄ、Ｖ、　（１９８５）　Ｇｏｎｅ　！１
６　：　２８９−！１００−、ｍｍ１ｒａｔｏ　、　　
ｐ、ｙ、、　　ら、（ｅｄｓ）　ｔ　　３　ＨＡＮＤＢ
ＯＯＫ　０ＦＰＬＡＮＴ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ　
−ＣＲＯＰ　８ＰＥＣＩＫ８　（ＭａａＭｉｌｌｉａｎ
ｐｕｂｘ、　ｃｏ、　１９８４　）　−Ａｒｏｎｓｏｎ
　、　Ａ、　１．　、　　Ｂｅｃｋｍａｎ　、　Ｗ、及
びｐｕｎｎ　、　　Ｐ、　。
（１９８６）　−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ　
Ｒｅｖｉｅｗａ　５Ｑ　：　１−２４゜ Ｂａｒｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、、　工ａｔｅｒ、　Ｋ、Ｂ、
、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｄ。
■、及びｉｃｅｍｐ、　　Ｊ、Ｄ、（１９８３）　ｐｌ
ａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ。
２　：　３３５−３５０゜ Ｂｅｒｎｈａｒａ　、　Ｋ、　（１９８６）　、　ＦＥ
ＭＳ　ＭｉＯｒｏｂｉＯｌ、Ｌｅｔｔ。
３３、２（５１−２６５゜ ＢｅＷａｎ　、　　Ｍ、　、　　ら、（１９８３）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　　５０４：ＩＢ４゜Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　、
　Ｈ，Ｃ，及びＤ０１７ｙ　Ｌ　（１９７９）　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｌａ　ｕｅａ、　７　：　１５１３−１５
２４゜Ｃｏｎｎ５ｒ、　　Ｂ、Ｊ、ｓ　　Ｒｅｙｅｒｓ
、ＡａＡａ、Ｍｏｒｉｎｅ　　Ｃａ１Ｉｔａｌｃｕｒａ
、　Ｋ、　Ｔｅｐｌｉｔｉ、　ＲｏＬ、及びｙａｘｌａ
ｃｅ、　Ｒ，Ｂ。
（１９８３）　　、　ｐｒｏｃ、　Ｈａｃｘ、　Ａａａ
ａ、　　ｓａｌ、　ＵＳＡ　　８０　　：２７８−２８
２゜ Ｄｅｖａｒｅｕｘ、　Ｊ、、　Ｈ（１１）ｂｅｒｌｉ、
及びＢｍｔｔｈｔｅｓ　（１９８４）ＮｕＣｌ、ＡＣ’
１ｔｉｓｌ　Ｈｓａａａｒｃｈ　　１２　　：　　５８
７−３９５゜Ｄｉｔｔａ、　Ｇ、、　８ｔａｎｆｉｅｌ
ｄ、　８．ｅ　Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、及びＨｅ１ｉｎａ
ｋｉ、Ｄ、Ｒ，、（１９８Ｑ　　）、　　Ｐｒｏａ、Ｎ
ａｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７７　　：　　７３４７−７７５１
゜Ｆ’ｒａｌｅｙ、Ｒ，’Ｉ’、ｅ　　ＲＯｇｅｒｓ、
Ｓ、Ｇ、、Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ、。
１ｉｉ１ｃｈｈｏｌｔｚ、Ｄ、Ａ、、Ｆｌｉｃｋ、Ｊ、
Ｓ、、Ｆｉｎｋ、Ｃ，Ｌ、。
Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｎ、Ｌ、及び　Ｓａｎｇｅｒｓ、
　Ｐ、Ｒ，（１９８５）　−ＢｉＯ／ＴｅａｈｎｏｌＯ
ｇｙ　３ｔ　　６２９−６３５゜Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、、
　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｌ、Ｐ、及びＷａｌｂｏｔ、　Ｖ。
（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、ＡＯａａ、３ｃｉ、Ｕ
、Ｓ、Ａ、８２　　：５８２４−５８２８゜ Ｆ’ｒｏｍｍ、　Ｍ、、　’ｒａｙ１ｏｒ、　Ｉ、、ｐ
、及びＷ’ａｌｂＯｔ、　Ｖ。
（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ　　３１９　　：　　７９
１−７９３−Ｈａｒｒｅｒａ−Ｅａｔｒｅｌｌａ、　Ｌ
ａ＠ら、（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ３０３　　：　　
２０９゜ Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ、Ｃ，，９ｏａｒｅｓ、Ｇ、Ｇ、
、Ｗｉｌｃｏｘ、ｇ、Ｒａ及びＥｄｗａｒｄａ、　Ｄ、
Ｌ、　（１９８６）、　Ｂｉｂ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４．３０５−３０８゜ Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，及びＫｎｅｅ、　Ｈ，、Ｐｒｏｃ
、　１Ｊａｔ１．ＡＣＩＬ（１゜５ｃｉ−ＵＳＡ　　Ｖ
ＯＬ−８３，４４２８−４４３２−７（Ｏｆｔｅ、　Ｈ
，ら、（１９８６）　Ｆｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏａｈｅｍ
１（５１　　：　　２７３−２８０ ゜Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ、Ｍ、Ｗ、Ｈｅｗｎ、Ｒ，Ｍ
、、Ｄｒｅｙｅｒ、Ｗ、Ｊ。
９１．３９９−４１３゜ Ｊａｒｒｅｔ、　Ｒ，Ｌ、ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ
　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　　４９：１７７−１８４　（１
９８０）。
Ｋｌｅｅ、　Ｈ，Ｊ−＊ら、Ｂｔｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１ｏ
ｇｙ　３　：　６３７−６４２（１９８５）。
Ｋ１１ｅｒ、　Ａ、、　Ｆａｒｇａｔｔｅ、　Ｆ、、　
Ｉ（ｉｂｉｅｒ、　Ｊ、　　及びＲａｐｐａｐｏｒｔ、
Ｇ、（１９８２）、　ＴＡｒＢｏ　Ｊ、　　１：　７９
１−７９９−Ｋｒｉｅｇ、Ａａ、Ｈｕｇｅｒ、Ａ、Ｍ、
、Ｌａｎｇｅｒｂｒｕｎａｈ、Ｇ、Ａ。
Ｅｎｔ、　　９６　　：　　５００−５０８゜［ｒｌｅ
ｇ、Ａ、ｔ　　Ｈｕｇｅｒ、Ａ、Ｍ、、Ｌａｎｇｅｒｂ
ｒｕｎｃｈ、ＧａＡ−及び３ｃｈｎｏｔｔｅｒ、　ｗ、
（１９８４）　Ａｎｇ、　Ｓｃｈａｄｌｉｎｇｓｈｄｅ
、。
ｐｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ、　　Ｕｍｗｅｌｔｓｃ
ｈｕｔｇ、５７　　：　　１４５−１５０−Ｋｒｏｎｓ
ｔａａ、　Ｊ、Ｗ、、　５ｃｈｎｅｐｆ、　Ｈ，Ｅ、及
びＷｈｉｔｅｌｅｙ。
ＵＳＡ　　８２．　４８８−４９２゜ Ｌ（１１）ｍｍｌｉ、Ｕ、に、（１９７０）Ｎａｔｕｒ
ｅ　　２２７　　：　６８１−６８５゜ Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔ８Ｃｈ、　Ｒ，
Ｆ、及び８ｄｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ。
（１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
、　Ａ　ＬａｂＯｒａｔＯｒ７Ｍａｎｕａ１．Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ。
ｃｏｌａ　　８ｐｒｉｎｇ　Ｉ’ＩａｒｋｌＯｒ、ＮＹ
。
Ｍｏ（：ＯｒｍｉＯｋ、８−＠　　Ｎｉ８（Ｎｉ１８（
ＩＪｒ＊　　Ｊ−ｓ　　Ｆｒｙｔ　　Ｊ、ｅＢａｒｎａ
ａｏｎ、　Ａ、、　ＨＯｒｓｃｈ、　Ｒ，及びＦｒａｌ
ｌｉ１７＊　Ｒ’（１９Ｂ６　）、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ
ｌ　Ｒｅｐｏｒｔａ　　５．　８１−８４゜（）（１１
）ｌｌ、　Ｊ−Ｔ−ｓ　Ｎ”ｇｌｍ　Ｆ、及びＣｈｕａ
、　Ｎ、Ｈ，（１９８５）−Ｎａｔｕｒｅ　　３１３　
　：　　８１０−８１２゜８ａｎｄｅｒｓ、ら、（１９
８７）　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１（１１）　Ｈｅ５ｅａ
ｒｃｈ１５　　：　　１５４３−１ ５５８゜Ｂａｕｇｓｒ、　ｐ、、　ＭｉＯｋｌｌｉｌｎ
、　Ｓ、及び（Ｈｏｕｌｓｏｎ、　Ａ−Ｒ−（１９７７
）　　ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａａ、ｓａｌ、
ＵＳＡ　　７４　　：５４６３−５４６７゜ ３ｃｈｎｅｐｆ、　Ｈ，ｇ、及びｖｎｈｌｔｏｌａｙ、
　Ｈ，Ｒ，（１９８１）−ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、ＡＯ
ＩＬ（１，Ｓｃｉ、ｔ７８Ａ　　７８　　：　　２８９
３−２８９７−３ｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ、　’ｌ’、
及びＨｅ１ｉｎｓｋｉ、　Ｄ、ｓＪ、１３ａａｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ、１６４，４４６　　（１９８５）−９ｃｈ
ｎｅｐｆ、　Ｈｉ、、　Ｗｏｎｇ、　Ｈ，Ｃ，及びＷｈ
ｉ　ｔｅ　１ｅｙ　。
Ｈ−Ｒ−（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ’ｈｅｍ、２６
０　　：　６２６４−６２５７゜ ３ｃｈｕｌｅｒ、　Ｍ、Ａ、、　Ｓｃｈｍｉｔｔ、　Ｅ
、Ｓ、及びＢｅａｃｈｙ。
Ｒ，Ｎ、　　（１９８２）、　　Ｎｕｃｌｅｌａ　　Ａ
ｃ１ａｓ　　ｕｅｓｅａｒｃｈ。
１０　　：　　８２２５−８２４４゜ ９８　　：　　５ｎ３−５１７゜ ９ｐｉｚｉｚｅｎ、Ｊ、（１９５８）Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔ、　　Ａｅａｄ、８ａ１゜ＵＳＡ　　４４　　：　
　１（４７２−１（４７８゜Ｔｏｗｂｉｎ、　）！、及
び□ｏｒａｏｎ、　Ｊ、　（１９８４）ＷａｂｉｋＯ，
Ｈ，ｅ　Ｒａｙｍｏｎｌ、　Ｋ、Ｃ，及びＢｕｌｌａ、
　Ｌ、Ａ。
（１９８６）２λ　５　：　３０５−３１４゜Ｗｏｏ（
１，Ｗ、１．、　Ｇｉｔａａｈｉｅｒ、　Ｊ、、　Ｌａ
８に７．　Ｌ、Ａ、及びＬａｖｎ、Ｒ，Ｍ、（１９８５
）ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａａａａ、Ｂａｔ。
Ｕ８λ　８２　　：　　１５８５−１５８８゜Ｍ１３　
　Ｃｒａｎｉｎｇ　ａＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ。
Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｃａｔ、
、　　＊Ｎ　４５０２゜
【図面の簡単な説明】 第１図は、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の単離に用いたＤＮ
Ａプローデン示す。Ａは、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素のピークＡ
とＢのＮ末端蛋白配列及び推定ＤＮＡ配列を示す。Ｂは
、アミノ酸１−６に基いた３２倍に縮退′した１７マー
（ｍｅｒ　）の合成Ａ１プローデ？示す。 Ｃは、アミノ酸８−１３に基いた４８倍に縮退した１７
マーの合成Ａ２プローデ乞示す。 第２図は、プラスミドｐＭＯＮ　５４３２の構築工種を
示す。 第３図は、１）ＭＯＮ　５４２０及びｐＭＯＮ　５４２
１における毒素遺伝子χコードする３、Ｑ　ｋｂ　Ｈｌ
ｎｄ　■断片の、ｐＵＣ１１９マルチリンカ−について
の方向χ示す。ＢはＢａｍＨｌ　％Ｓａは５ａｌｔ、Ｅ
はｇａｏＲＬ８Ｃは５ａａｌ、ＨはＨｌｎｄ　［１、ａ
ｍは９ｍａ　ｌ　、　ＫはＫｐｎ１％８ｐは８ｐｈ１％
Ｐはｐｓｔｌ、Ｘは）（ｂａ　１馨表わす。 第４図は、ｐＭＯＮ　５４２０及びｐＭＯＮ　５４２１
に含まれるＢ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子の配列決定に用いた
技術知見ン示す。 第５図は、６４４個のアミノ酸毒素蛋白ンコードするＢ
、ｔ、ｔ、遺伝子の１９５２　ｂｐ　ＯＲＦ　（ｒ）制
限酵素部位の位置及びＤＮＡ配列χ示す。 第６図は、８Ｄ８−　ＰＡＧＥ分析によって観察される
Ｂ、ｔ、ｔ、毒素のバンドを示す。１３ａｏｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒ
ｔｏｎｔａとｇ、ａｏｌｌＪＭ　１０１　（ＰＭＯＮ　
５４３６、Ｉ）ＭＯＮ　５４５６、ｐＭＯＮ５４５０、
Ｉ＞ＭＯＮ　５４６０　）から産生されるＢ、ｔ、ｔ、
蛋白ン９憾８Ｄ８−　ＰＡＧｌｅで分離し、それぞれの
パターンχ示した。 第７図は、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素遺伝子から発現した、ある
いはｉｎ　９１マ０で酵素的加水分解によって産生され
た蛋白のＮ末端な示す。Ｂ、ｔ、ｔ、及び／又はｇ、ｏ
ｏｌｉから産生されるユニークなり、ｔ、ｔ、蛋白のＮ
末端ｔアミノ酸配列決定により測定した。矢印及びそれ
に付いた番号は、第６図に示した蛋白の最初のアミノ酸
に対応している。 第８図は、毒素のＣ末端部分の１界性を分析するために
用いた、Ｂ、ｔ、ｔ、遺伝子の変換体を示す。 図中に挿入した配列は、変化したＢ、ｔ、ｔ、蛋白のア
ミノ酸配列を示す。 第９図は、毒素のＮ末端部分の臨界性χ分析するために
用いＴ−１Ｂ　−ｔ−Ｃ−遺伝子の変換体を示す。 図中に挿入した配列は、変化したＢ、ｔ、ｔ、蛋白のア
ミノ酸配列を示す。 Ｋ１０図は、Ｂ、ｔ、ｔ、毒素蛋白変異体を評価するた
めに作成した欠失体を示す。 第１１図は、プラスミド１）ＭＯＮ　９７５８、ｐＭＯ
Ｎ９７５４及びＩ）ＭＯＮ　９７５３の構築工程を示す
。 第１２図は、プラスミドｐＭＯＮ　９７９１の構築工ｓ
′ｌｋ：示す。 第１３図は、プラスミドｐＭＯＮ　９７９２の構築工５
ｙｐｔ示す。 第１４図は、植物形質転換カセットベクター１）ＭＯＮ
　８９３のプラスミドマツプを示す。 第１５図社、プラスミドＩＩＭＯＮ　９７４１の構築工
程を示す。 第１６図社、プラスミドｐＭＯＮ　５４３６の構築工程
を示す。 第１７図は、無害化Ａｇｒｏｂａａｔｅｒ１ｕｍ　ＡＣ
ＯのＴ−ＤＮＡ領域を構成するニレメンｌ’説明するも
のである。 第１８図は、エンハンスされたＣａＭＩ７３５８プロモ
ーターのＤＮＡ配列を示す。カッコで示した配列は２重
エンハンサ−配列を示す。

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対して毒性を
    発揮する遺伝子工学的に形質転換された植物の製造法で
    あって； （ａ）植物細胞のゲノムに、 （ｉ）植物においてＲＮＡの産生を誘導するプロモータ
    ー、 （ｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
    ｓの甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘
    導するＤＮＡ配列、及び （ｉｉｉ）植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端に
    ポリアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導 する３′非翻訳ＤＮＡ配列、 を含むキメラ遺伝子を挿入し； （ｂ）形質転換植物細胞を得；次いで （ｃ）該形質転換植物細胞から、甲虫類に対して抵抗性
    を示す遺伝子工学的に形質転換された植物を再生する； 工程を含む上記製造法。
  2. （２）プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、
    ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモータ
    ーからなる群より選ばれたプロモーターである請求項１
    記載の製造法。
  3. （３）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂａ
    ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．
    ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得たものである請求項１記
    載の製造法。
  4. （４）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂａ
    ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．
    　ｓａｎ　ｄｉｅｇｏから得たものである請求項１記載
    の製造法。
  5. （５）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであ
    る請求項３記載の製造法。
  6. （６）プロモーターがマンノピンシンターゼプロモータ
    ーである請求項３記載の製造法。
  7. （７）３′非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋白遺伝子か
    ら得たものである請求項５記載の製造法。
  8. （８）植物が、トマト、ポテト及びワタからなる群より
    選ばれるものである請求項１記載の製造法。
  9. （９）（ａ）植物においてＲＮＡの産生を誘導するプロ
    モーター、 （ｂ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
    の甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導
    するＤＮＡ配列、及び （ｃ）植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポリ
    アデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳Ｄ
    ＮＡ配列、 を含むキメラ植物遺伝子。
  10. （１０）プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
    、ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモー
    ターからなる群より選ばれるものである請求項９記載の
    遺伝子。
  11. （１１）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｅｉｓ　ｖａｒ
    ．　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得たものである請求項
    ９記載の遺伝子。
  12. （１２）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ
    ．　ｓａｎ　ｄｉｅｇｏから得たものである請求項９記
    載の遺伝子。
  13. （１３）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
    ある請求項１１記載の遺伝子。
  14. （１４）プロモーターがマンノピンシンターゼプロモー
    ターである請求項１１記載の遺伝子。
  15. （１５）３′非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋白遺伝子
    から得たものである請求項１３記載の遺伝子。
  16. （１６）プロモーターが更にエンハンサー配列を含むも
    のである請求項１３記載の遺伝子。
  17. （１７）（ａ）植物においてＲＮＡの産生を誘導するプ
    ロモーター、 （ｂ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
    の甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導
    するＤＮＡ配列、及び （ｃ）植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポリ
    アデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳Ｄ
    ＮＡ配列、 を含むキメラ遺伝子を保持した形質転換植物細胞。
  18. （１８）プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
    、ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモー
    ターからなる群より選ばれるプロモーターである請求項
    １７記載の細胞。
  19. （１９）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ
    ．　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得たものである請求項
    １７記載の細胞。
  20. （２０）甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列が、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ
    ．　ｓａｎ　ｄｉｅｇｏから得たものである請求項１７
    記載の細胞。
  21. （２１）プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
    ある請求項１９記載の細胞。
  22. （２２）プロモーターがマンノピンシンターゼプロモー
    ターである請求項１９記載の細胞。
  23. （２３）非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋白遺伝子から
    得たものである請求項２１記載の細胞。
  24. （２４）植物が、トマト、ポテト、ワタ及びトウモロコ
    シからなる群より選ばれる植物である請求項１７記載の
    植物。
  25. （２５）請求項１７記載の形質転換植物細胞を含む、感
    受性甲虫類に対して毒性を発揮する変異植物。
  26. （２６）植物がトマトである請求項２５記載の植物。
  27. （２７）植物がポテトである請求項２５記載の植物。
  28. （２８）植物がワタである請求項２５記載の植物。
  29. （２９）請求項９記載のキメラ植物遺伝子を含む植物形
    質転換ベクター。
  30. （３０）請求項１０記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  31. （３１）請求項１１記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  32. （３２）請求項１３記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  33. （３３）請求項１２記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  34. （３４）請求項１３記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  35. （３５）請求項１４記載の遺伝子を含む請求項２９記載
    のベクター。
  36. （３６）エンハンスされたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
    が、−３４３から−９０に対応するエンハンサーＤＮＡ
    配列を含んでおり、第１８図に示す配列を有するもので
    ある請求項１６記載の遺伝子。
  37. （３７）第１０図に示すアミノ酸配列（１−６４４）を
    有する毒素蛋白。
  38. （３８）Ｎ−末端の１５個のアミノ酸が除かれている請
    求項３７記載の毒素蛋白。
  39. （３９）Ｎ−末端の４７個のアミノ酸が除かれている請
    求項３７記載の毒素蛋白。
  40. （４０）Ｎ−末端の４８個のアミノ酸が除かれている請
    求項３７記載の毒素蛋白。
  41. （４１）Ｎ−末端の５７個のアミノ酸が除かれている請
    求項３７記載の毒素蛋白。
  42. （４２）Ｎ−末端の７６個のアミノ酸が除かれている請
    求項３７記載の毒素蛋白。
  43. （４３）請求項３７記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  44. （４４）請求項３８記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  45. （４５）請求項３９記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  46. （４６）請求項４０記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  47. （４７）請求項４１記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  48. （４８）請求項４２記載の毒素蛋白をコードする請求項
    ９記載の遺伝子。
  49. （４９）請求項２５記載の植物から産生される種子。
  50. （５０）植物がトマトである請求項４９記載の種子。
  51. （５１）植物がポテトである請求項４９記載の種子。
  52. （５２）植物がワタである請求項４９記載の種子。
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