CN1026497C - 昆虫抗性植物 - Google Patents

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Abstract

公开了一种生产表现对鞘翅目昆虫有毒性的遗传转化植物的方法。另一方面，本发明包括嵌合的植物基团、遗传转化的细胞及表现对鞘翅目昆虫有毒性的分化的植物。再一方面，本发明包括含有编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌毒素蛋白的嵌合植物基团的细菌细胞和植物转化载体。

Description

本发明涉及遗传工程、生物化学及植物转化领域。更具体地说，本发明旨在转化植物细胞以表达一种编码对鞘翅目昆虫有毒的蛋白质的嵌合基因。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B·t·）是一种形成芽孢的土壤细菌，已知它能产生一种对许多种昆虫有毒的伴孢晶体蛋白。其中大多数菌株有抗鳞翅目昆虫（蛾和蝴蝶）的活性，有几个菌株据报道具有抗双翅目昆虫（蚊和蝇，参见Aronsonetal.1986）的活性。这些菌株中有许多菌株的毒素基因已被克隆，并且这些毒素已在异源宿主中得到表达（Schnepf et al.，1981;Klieretal.，1982。）近年来，苏云金芽孢杆菌黄粉
Figure 88102497X_IMG2
变种（B·t·var·tenebrionis;B·t·t·，Krieg etal.，1983;Kriegetal.，1984）及苏云金芽孢杆菌圣地亚哥变种（B·t·var·san diego;B·t·sd.，Herrnstadt etal.，1986）菌株已鉴定为具有抗鞘翅目昆虫的活性。已克隆了B·t·sd·的毒素基因，但在大肠杆菌（E·coli）中产生的毒素据报道比来自B·t·sd·晶体的毒素体积大，这意味着此重组B·t·sd·毒素的活性较弱。
对鞘翅目型苏云金芽孢杆菌蛋白毒素作用敏感的昆虫包括（但不限于）马铃薯叶甲（Leptinotarsa    decemlineata）、棉铃象（Anthonomus    grandis）、黄粉虫（Tenebrio    molitor），榆黄叶甲（pyrrhalta    luteola）及黄瓜十一星叶甲食根亚种（Diabrotica    undecimpunctata    howardi）。
因此，如果能够转化植物使其以具有杀虫效力的水平表达鞘翅目型毒素，那么就有可能用遗传工程方法改造植物使其表现对鞘翅目昆虫的毒性或耐性。受鞘翅目昆虫影响的重要农作物包括苜蓿、棉花、玉米、马铃薯、油菜（canola）、水稻、烟草、番茄、甜菜及向日葵。
尽管某些嵌合基因已在转化的植物细胞和植株中得到表达，但这种表达决非直截了当。具体地说，鳞翅目型B·t·毒素蛋白的表达特别成问题。现已发现，本领域内关于鳞翅目型B·t·毒素蛋白在植物中表达的技术不能扩展到鞘翅目型B·t·毒素蛋白。这些发现与先有技术截然相反。先有技术认为可用同样的基因操作在转化植物中获得这类毒素的有效表达。
根据本发明的一个方面，提供了一种使植物表现出对鞘翅目昆虫有毒性的遗传转化方法，它包括以下步骤：
（a）在易受鞘翅目昆虫侵袭的植物细胞的基因组中插入一个嵌合基因，该嵌合基因包括：
ⅰ）一个启动子，它在植物细胞中起着引起RNA产生的作用;
ⅱ）一个DNA顺序，它引起编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌素蛋白的RNA顺序的产生。
ⅲ）一个3′非翻译DNA顺序，它在植物细胞中起着使多聚腺苷酸加到RNA顺序3′端的作用;
（b）获得转化的植物细胞;
（c）从已转化的植物细胞再生出对鞘翅目昆虫有抗性的遗传转化植物;
根据本发明的另一方面，提供了一种嵌合植物基因，该嵌合基因包括下列顺序：
（a）一个启动子，它在植物细胞中起着引起RNA产生的作用;
（b）一个DNA顺序，它引起编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌素蛋白的RNA顺序的产生;
（c）一个3′非翻译区，它在植物细胞中起着使多聚腺苷酸加到RNA顺序3′端的作用。
根据本发明的另一方面，还提供了细菌细胞、转化的植物细胞和植物转化载体，分别含有由上述成分（a）、（b）及（c）构成的DNA。
根据本发明的另一方面，还提供了一种含上述转化的植物细胞的分化植物，该植物表现对鞘翅目昆虫的毒性。本发明还期望获得能产生上述转化植株的种子。
图1表示用于分离B·t·t·毒素基因的DNA探针。
图2表示制备质粒pMON5432所用的步骤。
图3表示在pMON5420和pMON5421中编码毒素基因的3.0KbHindⅢ片段相对于pUC119多联接子的定向。
图4表示测定pMON5420和pMON5421中所含的B·t·t·毒素基因顺序所用的方法。
图5表示编码644个氨基酸的毒素蛋白的B·t·t·基因的1932bpORF的DNA顺序以及限制位点的位置。
图6表示用SDS-PAGE分析观察到的B·t·t·毒素的条带。
图7表示由B·t·t·毒素基因表达的蛋白质或在B·t·t·体内蛋白水解产生的蛋白质的N-末端。
图8表示采用改变的B·t·t·基因分析毒素C端区段重要性。
图9表示采用改变的B·t·t·基因分析毒素N端区段重要性。
图10表示在测定B·t·t·毒素蛋白突变体过程中产生的缺失。
图11表示制备质粒pMON9758、pMON9754及pMON9753所用的步骤。
图12表示制备质粒pMON9791所用的步骤。
图13表示制备质粒pMON9792所用的步骤。
图14表示盒式植物转化载体pMON893的质粒图谱。
图15表示制备质粒pMON9741所用的步骤。
图16表示制备质粒pMON5436所用的步骤。
图17说明含无致瘤力的（disarmed）土壤杆菌（Agrobacterium）ACO的T-DNA区的各成分。
图18表示增强的CaMV35S启动子的DNA顺序。
本发明提供了一种转化植物的方法，使植物表现出对易感鞘翅目昆虫有毒性。更具体地说，本发明提供基因转移的植物，该植物能以杀虫水平表达鞘翅目型苏云金芽孢杆菌素蛋白。
一方面，本发明包括嵌合基因，该基因在植物体内有活性，并产生对易感鞘翅目昆虫有毒性的基因转移植物。以双链DNA形式存在的植物基因的表达包括，通过RNA聚合酶转录DNA的一条链产生信使RNA（mRNA），以及在细胞核中对mRNA初级转录本的加工。此加工过程涉及可将多聚腺苷酸加到mRNA3′端的3′非翻译区。
DNA转录产生mRNA由一个通常称为“启动子”的DNA区来调节。启动子区含一个核苷酸顺序，该顺序能指使RNA聚合酶与DNA结合，并利用启动子下游的DNA链作模板起动mRNA转录本的生成，从而制造一条相应的RNA链。
在植物细胞中有活性的许多启动子已在文献中进行了描述。这些启动子包括在根瘤土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）致瘤的质粒上所携带的胭脂碱（nopaline）合酶（NOS）、章鱼碱合酶（OCS）及甘露碱（mannopine）合酶（MAS）启动子、花椰菜镶嵌病毒（CaMV）19S和35S启动子，以及来自2-磷酸核酮糖羧化酶（ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽）小亚基的光诱导启动子。这些类型的启动子已用于建造各种类型的DNA构建体，这些构建体已在植物中得到表达，参见例如，PCT公告WO84/02913（Rogerset    alMonsanto）。
已知或已发现在植物细胞中引起mRNA转录本产生的启动子可用于本发明。合适的启动子既包括那些在植物中自然表达的基因所衍生的启动子，也包括那些含多余的或异源的增强子顺序的合成启动子顺序。所选择的启动子应能引起充分的表达，以致产生有效量的毒素蛋白，从而使植物对鞘翅目昆虫有毒。本领域专业人员应认识到，诱导所期望的毒性所需的毒素蛋白量可能随着所要防治的特定鞘翅目 昆虫而改变。因此，虽然CaMV35S、ssRUBISCO和MAS启动子是优选的，但是应该明白，这些启动子可能不是适于本发明的所有实施方案的最佳启动子。
由嵌合基因所产生的mRNA也含有一个5′非翻译前导顺序。此顺序可由所选的特定启动子，如CaMV35S、ssRUBISCO或MAS启动子衍生而来。5′非翻译区也可从其它合适的真核基因或合成的基因顺序获得。本领域专业人员认为，5′非翻译前导顺序的必不可少的功能是促进mRNA转录本与植物细胞核糖体的结合，以便在产生所编码的蛋白质的过程中促进mRNT的翻译。
嵌合基因还含有一个结构编码顺序，该顺序编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌素蛋白或其中具有杀虫活性的片段。这种结构编码顺序的典型来源是B·t·t·和B·t·sd··因此，在典型的实施方案中，本发明提供了一个来自B·t·t·的结构编码顺序及其中具有杀虫活性的片段。本领域专业人员将认识到，与B·t·t·毒素编码顺序基本同源的其它结构编码顺序可按本文所叙述的技术加以使用，因此属于本发明范围之内。
3′非翻译区含有一个多聚腺苷酸化信号，该信号在植物中的作用是使多聚腺苷酸加到RNA的3′端。合适的3′区的实例有：（1）含土壤杆菌致瘤（Ti）质粒基因[如胭脂碱合酶（NOS）基因]的多聚腺苷酸化信号的3′转录、非翻译区;（2）植物基因，如大豆贮藏蛋白基因和ssRUBISCO。较好的3′区的实例是NOS、ssRUBISCO和贮藏蛋白基因的3′区，在后面的实例中作了更详细的描述。
把本发明的鞘翅目型毒素蛋白基因以任何合适的方法插入植物基因组。合适的植物转化载体包括从根瘤土壤杆菌的Ti质粒衍生的载体，如在EPO公告131，620（Rogers    et    al.）、Herrera-Estrella    1983、Bevan    1983，Klee    1985和EPO公告120，516（Schilperoort    et    al.）中所述的植物转化载体。除了从土壤杆菌的Ti 质粒或诱发毛根（Ri）的质粒衍生的植物转化载体外，还可用另外的方法将本发明的鞘翅目型毒素蛋白基因插入植物细胞。这样的方法可能包括，例如脂质体、电穿孔（electroporation）、可增加游离DNA摄取的化学药品、以及利用病毒或花粉作载体。如果需要，还可采用诸如多次重复转化和选择循环的方法，将一个以上基因插入植物染色体。
如此修饰的植物材料可通过例如Northern吸印检测鞘翅目型毒素蛋白mRNA的存在。如果测不到毒素蛋白mRNA（或效价太低），可用其他的可能更强的启动子取代此嵌合基因构建体中所用的启动子，并重新检测改变的构建体。还可通过免疫测定，如Western吸印法测定毒素蛋白水平。在许多情况下，最灵敏的毒素蛋白测定法是昆虫生物检定法。
这种检测可在完整的再生植株中进行，在任何情况下，当产生了足够的毒素蛋白mRNA，并且转化细胞（或原生质体）已再生为完整植株时，即对后者进行筛选，选出对鞘翅目昆虫的侵袭具有抗性的植株。再生步骤方法的选择并不重要，合适的方法可用于以下受移植植株：豆科（Leguminosae）（苜蓿、大豆、三叶草等），伞形科（Umbelliferae）（胡萝卜、芹菜、欧洲防风）、十字花科（Cruciferae）（甘蓝、萝卜、油菜子等）、葫芦科（Cucurbitaceae）（甜瓜及黄瓜）、禾本科（Gramineae）（小麦、稻子、玉米等）、茄科（Solanaceae）（马铃薯、烟草、番茄、胡椒）、锦葵科（Malvaceae）（棉花等）、藜科（Chenopodiaceae）（甜菜等）及各种有花作物。参见例如Ammirato    et    al.（1984）。
本说明书和权利要求书中所述的所有蛋白质结构都以常规形式表示，其中N末端的氨基位于左边，C末端的羧基位于右边。同样，蛋白质中天然存在的氨基酸的命名如下：丙氨酸（ala;A），天冬酰胺（Asn;N），天冬氨酸（ASP;D），精氨酸（Arg;R）， 半胱氨酸（Cys;C），谷氨酸（Glu;E），谷氨酰胺（Gln;Q），甘氨酸（Gly;G），组氨酸（His;H），异亮氨酸（Ile;I），亮氨酸（Leu;L），赖氨酸（Lys;K），甲硫氨酸（Met;M），苯丙氨酸（Phe;F），脯氨酸（Pro;P），丝氨酸（Ser;S），苏氨酸（Thr;T），色氨酸（Trp;W），酪氨酸（Tyr;Y）及缬氨酸（Val;V）。
B.t.t.毒素基因的分离
编码鞘翅目型毒素蛋白的B.t.t.基因按下述方法分离。
蛋白质晶体的分离
将B.t.t.培养于Trypticase    Soybroth（TSB）培养基中以分离蛋白质晶体。在试图从B.t.t.分离出完整晶体的过程中，观察到这些晶体与鳞翅目型晶体之间有明显差别。鳞翅目型晶体可在由Renografin    Hypaque或NaBr形成的梯度上进行常规分离，而发现B.t.t.晶体溶于这些梯度介质中。据发现，B.t.t.晶体在蔗糖梯度中稳定，因而可用蔗糖梯度分离B.t.t.晶体。
从晶体分离B.t.t.毒素
用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析纯化的晶体的蛋白质组成。试验结果表明，B.t.t.晶体至少含2种分子量分别约为68-70千道尔顿（KDa）和60KDa的蛋白质组分。各组分的相对量随制备物的不同而改变。此外还表明较高分子量组分可能由一个以上的单一蛋白组成。据Bernhard（1986）报道，约68KDa和50KDa蛋白质是B.t.t.晶体的组分。据Herrnstadt等人（1986）报道，B.t.sd.晶体由一种约64KDa的蛋白 质组成。比较起来，鳞翅目型B.t.菌株，如苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种（B.t.Kurstaki）则一般含有130KDa至140KDa的较高分子量蛋白质。此结果表明，在鳞翅目和鞘翅目毒素蛋白结构中有明显差别。
采用了几种方法来提纯晶体的各个蛋白质组分。用等电聚焦不行，因为所有蛋白质都沉淀。用Mono    Q柱进行阴离子交换高压液相色谱（HPLC）不能分辨各个组分。在4M尿素存在下，用Mono    S柱进行阳离子交换HPLC分辨出5个峰。用SDS凝胶电泳分析这些峰表明，峰A仅含有来自整个晶体的较高分子量带。峰B富含此较高分子量带以及少量较低分子量带。峰C富含较低分子量带以及大量的较高分子量带。峰D和E为两种带的混合物。在大多数制备物中，相应于峰A和B的较高分子量带是晶体中的主要蛋白质。就HPLC分离的材料而言，峰A和B代表了大部分所回收的蛋白质。
对相应于峰A、B和C的N-末端氨基酸顺序进行测定，发现峰A和B有同样的N-末端顺序，而峰C顺序则不同。所测定的顺序为：
峰A和B：
1    5    10    15
Met    Asn    Pro    Asn    Asn    Arg    Ser    Glu    His    Asp    Thr    Ile    Lys    Thr    Thr
峰C：
1    5    10    15
Met    X    Pro    X    Thr    Arg    Ala    Leu    Asp    Asp    Thr    Ile    Lys    Lys    Asp
16
Val    Ile    Glyn    Lys
X代表一种未确定的氨基酸。
B.t.t.蛋白的昆虫毒性
测试了几种B.t.t.及B.t.t.蛋白制备物对各种昆虫（包括鳞翅目和鞘翅目）的毒性。没有观察到任何对鳞翅目昆虫（棉铃虫、小地老虎、烟草天蛾及白菜金翅夜蛾）的活性。在鞘翅目昆虫中，观察到了对马铃薯叶甲和棉铃象的活性。对黄瓜十一星叶甲食根亚种表现出低水平的活性。在粗制的细菌培养物、纯化的晶体、溶解的晶体及分离的峰C、D、E（合并的）、A和B中发现有杀虫活性。
通过将待测制备物施于番茄叶上并使昆虫摄食处理过的叶片4天来测定对马铃薯叶甲的毒性。对棉铃象及黄瓜十一星叶甲食根亚种的测定通过将试验材料掺入适当的饲料混合物中进行。
B.t.t.毒素基因在大肠杆菌（E.Coli）和
假单胞菌（Pseudomonas）中的
鉴定和克隆
用此N-末端蛋白质顺序的信息设计合成的DNA探针（图1）。用该探针分离含B.t.t.毒素基因的克隆。根据Maniatis（1982）的方法将该探针用〔γ-32P〕ATP进行末端标记。将B.t.t.在补充了0.1%酵母提取液及0.1%葡萄糖的Spizizen培养基（SPY）（Spizizen，1958）中于37℃培养6小时，供分离全DNA之用。全DNA用Kronstad（1983）方法从B.t.t.中分离。将细胞培养在Luria琼脂平板上，以便分离用于毒性研究的B.t.t.晶体。
将大肠杆菌及假单胞菌培养物按常规培养于Luria    Broth（LB）中，该培养基加入氨苄青霉素（Ap，200μg/ml）、卡那霉素（Km，50μg/ml）、或庆大霉素（15μg/ml）以便质粒的选择和保留。 DNA的分离和操作
用Birnboim及Doly（1979）的方法从大肠杆菌和假单胞菌细胞提取质粒DNA，并按厂商说明用NACS-52树脂（Bethesda Research Laboratories）进行大量纯化。根据厂商说明（New England Biolabs），使用限制性核酸内切酶小牛碱性磷酸酯酶及T4DNA连接酶。限制消化产物在Tris-乙酸缓冲液中用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将用于克隆的DNA片段用冻融法从琼脂糖中提纯出来。重组DNA分子的构建按Maniatis等人（1982）的方法进行。按Maniatis（1982）方法转入大肠杆菌。B.t.t.毒素基因的克隆
用修改的干燥凝胶方法（Conner    et    al.，1983）进行Southern分析（Southern，1975）。用于检测B.t.t.毒素克隆的菌落滤器杂交采用氯化四甲铵法（Wood    et    al.，1985）。
对BamHI及HindⅢ消化的B.t.t.全DNA的Southern分析鉴定出一个5.8kb BamHI片段及一个与合成A1探针杂交的3.0kb HindⅢ片段。用琼脂糖凝胶纯化出B.t.t.DNA的BamHI片段（5.4-6.5kb）并将其连接到经碱性磷酸酯酶处理、BamHI消化的PUC119上。PUC119的制备如下：分离出噬菌体M13的476bp HgiAI/DraI片段，用T4DNA聚合酶（New England Biolabs）使该片段的末端纯化。然后将该片段插入到用NdeI消化并用Klenow DNA聚合酶（New England Biolabs）补齐的pUC19中。然后，用连接的B.t.t.和pUCI19DNA转化大肠杆菌JM101细胞。经几 次试验后，只获得150个Ap抗性菌落。B.t.t.DNA的HindⅢ片段（2.8-3.5kb）也被克隆到pUC119的HindⅢ位点中，获得1100个菌落。通过菌落与A1探针（图1）杂交筛选所有菌落。11个HindⅢ菌落表现强杂交。但是没有一个BamHI菌落表现任何杂交。然后，用合成探针A2（图1）筛选用与A1杂交所鉴定的菌落。有2个菌落与第二探针杂交。这2个菌落的限制性消化图谱表明二者都含同样的3.0kb    HindⅢ片段，但取向相反。这些克隆称为pMON5420和pMON5421（图3）。为证实这些克隆确实含B.t.t.毒素蛋白基因，用简并探针A1和A2作引物进行双脱氧测序（Sanger.1977），测定来自这2个克隆的单链DNA的顺序。用A1探针作引物的顺序分析揭示了一个开放读码（ORF），其顺序与所测的纯化B.t.t.毒素蛋白峰A和B的氨基酸顺序的氨基酸9-15相同。用探针A2产生的DNA顺序起始于所测氨基酸顺序的末端之外，但此DNA顺序与用A1产生的顺序相同。这些结果证实已克隆了所需的B.t.t.毒素基因。
采用以峰C的N-末端为基础的简并探针与B.t.t.全DNA进行Southern杂交，则不能检测出特异的条带，这表明所测的峰C氨基酸顺序是不正确的，或者很可能是得自组成峰C的2种或更多的蛋白质的混合物。
对大肠杆菌所产生的蛋白质的分析
用SDS-PAGE（Laemmli，1970）检查B.t.t.晶体蛋白及重组B.t.t.蛋白。将1ml大肠杆菌离心，沉淀物再悬浮于100μg    SDS样品缓冲液中，取出10μl样品在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。凝胶或用考马斯蓝进行染色，或检测与纯化 B.t.t.毒素晶体的抗体的交叉反应。用辣根过氧化物酶结合抗体法（Towbin    et    al.，1984）进行Western吸印。高分子量标记物购自BioRad。
通过对大肠杆菌所产生的蛋白质进行Western吸印分析，进一步证实这些克隆产生了B.t.t.毒素。将含有pUC119，pMON5420或者pMON5421的大肠杆菌JM101细胞在IPTG（0.1mM）存在下培养过夜以诱导lac启动子。二个重复样品用SDS-PAGE进行分析，并用纯化的B.t.t.晶体蛋白作对照。一片凝胶的Western吸印分析表明，含pMON5420或pMON5421的大肠杆菌产生2种交叉反应的蛋白质。这些蛋白质的大小与B.t.t.晶体的主要蛋白和次要蛋白的大小相同。通过与用考马斯蓝染色的第2块凝胶上的分子量标准进行比较，确定这些蛋白质的分子量。据测定主要毒素蛋白的大小为74KDa，次要毒素蛋白的大小为68KDa。由pMON5420所产生的B.t.t.毒素蛋白的含量随IPTG的加入而增加，而由pMON5421所产生的毒素蛋白则不受影响。
在荧光假单胞菌（Pseudomonas    fluorescens）
中产生B.t.t.毒素
如图2所示，将BamHI消化的pMON5420克隆到pMON7111的BamHI位点中，构建广宿主范围载体pMON5432。然后将此载体接合入荧光假单胞菌701E1中以分析毒素的产生。与荧光假单胞菌的三亲株杂交按前人所述（Ditta    et    al.，1980）进行。制备加IPTG与不加IPTG培养的过夜培养物样品，进行Western吸印分析及昆虫毒性研究。由假单胞菌产生的蛋白质与由大肠杆菌产生 的蛋白质大小相同，并且蛋白质的表达随IPTG的加入而增加。
昆虫毒性测定
在番茄叶饲喂试验中，用刚孵化的马铃薯叶甲虫测定鞘翅目毒素活性。将大肠杆菌及假单胞菌培养物在IPTG存在下培养过夜，离心并以各种浓度再悬浮于10mM MgSO4中。用声处理（在冰上脉冲处理3次，每次15秒）破碎细胞。加入吐温20（0.1%），将该样品涂在置于一个9cm培养皿中的番茄叶上，培养皿中衬有湿润的滤纸。每片叶上放10个马铃薯叶甲幼虫。4天后，用Abbott公式（Abbott，1925）计算校正的死亡百分率（对照组成活昆虫的百分率减去处理样品的成活昆虫的百分率，除以对照组的成活百分率）。重复进行试验并合并数据。用B.t.t.晶体芽孢制备物作阳性对照。
用加IPTG培养的不同浓度的培养物测定大肠杆菌pMON5420和pMON5421培养物的鞘翅目昆虫毒性。重组和野生型B.t.t.毒素活性的比较示于下面表1。结果表明，重组B.t.t.蛋白质对马铃薯叶甲有毒。2倍浓缩的、IPTG诱导的pMON5420培养物与B.t.t.芽孢/晶体对照组一样杀死100%的昆虫。这些毒性结果表明，所克隆的B.t.t.基因是编码B.t.t.毒素蛋白的基因。
昆虫饲喂试验表明，假单胞菌产生的毒素对马铃薯叶甲有毒。与大肠杆菌培养物相比较，假单胞菌培养物的相对毒性与所产生的毒素蛋白由Western吸印分析所测定的量一致。
表1
重组B.t.t.毒素的鞘翅目昆虫毒性
样品1浓度2校正的死亡率
大肠杆菌JM101
pUC119    2x    0%
pMON5420    1x    83%
pMON5420    2x    100%
pMON5421    1x    44%
pMON5421    2x    61%
荧光假单孢菌    701El
pMON5432    3x    60%
B.t.t.制备物    100%
1培养物加IPTG培养过夜，浓缩，声处理并测试毒性。
21×等于过夜培养物的细胞浓度。
B.t.t.毒素基因的顺序
根据以下信息测定克隆片段中的B.t.t.基因的位置及取向：（a）DNA顺序取自单链pMON5421模板;（b）测定在pMON5420和pMON5421上采用DNA顺序分析所鉴定的靠近翻译起始点的一个PstI位点的图谱;（c）测定几个其它限制位点的图谱;（d）构建一个从BglⅡ位点到BamHI位点的缺失（即缺失130bp），产生2种全长蛋白质。用此信息构建pMON5420和pMON5421的图谱。参看图4，毒素编码区起始点离5′HindⅢ位点500bp，位于PstⅠ位点上游150bp处。编码区终止于离3′HindⅢ位点约450bp处。BglⅡ位点大约在终止密码子下游350bp处。
质粒
为测定B.t.t.杀虫毒素基因顺序而建造的质粒列于表Ⅱ。亲本质粒pMON5420及pMON5421是以相反的方向克隆到pUC 119中的HindⅢ片段的两个独立分离物。
表Ⅱ
测定质粒顺序
pMON5420    来自B.t.t.DNA的3.0HindⅢ插入片段
（亲本质粒）
pMON5421    来自B.t.t.DNA的3.0HindⅢ插入片段
（亲本质粒）
pMON5307    pMON5420的EcoRI缺失
pMON5308    pMON5421的EcoRI缺失
pMON5309    pMON5420的PstI缺失
pMON5310    pMON5421的XbaI缺失
pMON5311    pMON5421的EcoRV-SmaI缺失
pMON5312 pMON5421的NdeI-BamHI缺失＊
pMON5313 pMON5420的NdeI-BamHI缺失＊
pMON5314 pMON5421的AsuⅡ-BamHI缺失＊
pMON5315 pMON5421的AsuⅡ（部分）-BamHI缺失＊
pMON5316 pMON5421的AsuⅡ-BamHI缺失＊＊
pMON5426    pMON5420的BglⅡ-BamHI缺失
pMON5427    pMON5420的EcoRV-SmaI缺失
pMON5428    pMON5420的HpaI-SmaI缺失
pMON5429    pMON5420的XbaI缺失
＊DNA用两种酶消化后，末端用Klenow聚合酶补齐，连接起来并用于转化JM101。
＊＊这两种构建体产生AsuⅡ-BamHⅠ的缺失，会引起一个AsuⅡ片 段以与它原来位置相反的方向重新排列。这就造成5316的顺序向着NH2端解读。
用于顺序测定的单链模板的制备
下列方法为测序提供了重复性好的单链模板产率。将含有带有待测序片段的pUC119的单菌落，在含有氨苄青霉素（200μg/ml）的L-琼脂（10g胰胨、5g酵母提取物、5gNaCl、15g琼脂/l）上划线。从该培养皿取出单菌落接种在3mlL-液体培养基内（200μg/ml氨苄青霉素），于37℃振荡培养过夜。从该培养物取出50μl接种于在150ml侧柄瓶中含200μg/ml氨苄青霉素的10ml 2×YT中（20g/l胰胨、10g/l酵母提取物），于37℃振荡培养。2-3小时后（Klett读数为50），加入100μl培养在大肠杆菌JM101中的M13K07（辅助噬菌体）诱导该培养物。培养瓶振荡1小时后，加入20ml 2×YT，将卡那霉素和氨苄青霉素的终浓度分别调至70μg/ml和200μg/ml。培养液于37℃振荡16-18小时。发现，总量为3ml的诱导后的过夜培养液足以分离出适量的模板供4个测序实验之用。将此3ml放在1.5ml eppendorf管中离心1分钟，轻轻倒出上清液并通过一个0.2μm Gelman Sciences Acrodisc
Figure 88102497X_IMG3
进行过滤。发现此步骤对除去细胞碎片和完整大肠杆菌有用。室温下进行聚乙二醇沉淀（20%PEG，2.5M NaCl，500μl/2ml溶解产物）10分钟，然后离心10分钟。弃去上清液，然后短暂离心（15秒）并除去残留的PEG。任何残留的PEG都会被带入模板分离过程中而对DNA测序反应产生不良影响。将沉淀重新悬浮在100μl TE（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0）中，与200 μl缓冲的苯酚（与下列溶液平衡而得到缓冲：等体积的1MTris-HCl，pH8.0，然后是0.1M Tris-HCl，pH8.0，接着是等体积的TE）合并并充分混合。于55℃保温10分钟后，加入等体积（200μl）的苯酚/氯仿（1∶1），搅拌后离心2分钟。取出上层，用200μl氯仿萃取，离心后移出水相。用25μl 3M醋酸钠（pH5.2）和600μl 95%乙醇沉淀单链模板，在干冰上温育5分钟，然后离心10分钟。将沉淀物重新悬浮在25μl H2O中，取2μl在琼脂糖凝胶上检查正确的大小、相对浓度及污染DNA。测序试剂和条件
DNA测序方法在Amersham公司发行的手册中作了详述。试剂（核苷酸、引物、缓冲液、跟踪溶液和Klenow聚合酶）得自Amersham M13测序药盒（产品目录＃N4502）。调整Amersham药盒所提供的测序混合物以便有效地测定富含A-T的B.t.t.基因的顺序。所推荐的dNTP与ddNTP混合比为1∶1，但发现下列比例更合适：40μl dATP∶10μl ddATP，35μl dTTP∶15μl ddTTP，15μl dGTP：35μl ddGTP，10μl dCTP：40μl ddCTP。测序反应中使用了放射性硫（〔α-35S〕dATP，Amersham目录＃SJ.1304）。测序凝胶（按Amersham手册所述制备）在Hoeffer“Poker Face”仪器上以70瓦（1200-1400伏）进行电泳，发现它能给出非常好的分辨率。较高的电压则产生模糊条带。
B.t.t.毒素基因顺序的测定
分离的质粒pMON5420和pMON5421含有相反取向的3.0HindⅢ片段（见图3）。用B.t.t.晶体的主要蛋白作设计寡 核苷酸探针的根据，其分子量估计为73-76KDa，相当于约2.0kb的DNA。从A1和A2引物（根据峰A的氨基酸顺序合成的寡核苷酸，见下表Ⅲ）的起始测序，验证了DNA顺序相应于预定的氨基酸顺序。
表Ⅲ
用于测定B.t.t.杀虫
毒素基因顺序的合成寡核苷酸
引物 模板 顺序 位置1
Btt起始    pMON5420    tgaacatggttagttgg    291-275
Btt延伸    pMON5421    taggtgatctctaggcg    422-439
Btt顺序    pMON5421    ggaacaaccttctctaatat    1156-1175
BttA1＊pMON5421 atgaayccnaayaaycg 205-222
BttA2＊pMON5421 garcaygayacyathaa 227-242
＊y＝t或c.r＝a或g.h＝t，c或a.n＝a，g，c或t.
1引物的位置是以所测的共2615个碱基的顺序为根据的。pMON5420的测序朝氨基端进行。pMON5421的测序朝羧基端进行（见图3）。
有一个PstⅠ位点位于起始顺序中，它可用来鉴定pMON5420和pMON5421内的B.t.t.基因的位置和可能的取向（见图3和图4）。用几种酶（HpaⅠ、XbaⅠ、NdeⅠ、EcoRⅤ和BglⅡ）测定限制位点的图谱，在pMON5420和pMON5421的pUC119部分，都保留有许多独特位点，这些位点提供了采用通用测序引物获得顺序的可能性。在pMON5420和pMON5421中都产生了缺失，使通用引物同源区与基因的内部区域靠得很近。在不易通过产生缺失来测定顺序的区域，则使用对应于编码顺序中已测序区域 的合成寡核苷酸（表Ⅲ）作为引物，使测序区得到延伸。所测序的区域（顺序坐标;表Ⅳ）和测序方向绘于图4。
表Ⅳ
顺序数据的来源
质粒    长度    位置    质粒    长度    位置
（bp）    （bp）
pMON5307    414    797-1211    pMON5316    153    1861-2041
pMON5308    276    1895-2171    pMON5426    300    2220-2520
pMON5309    170    114-284    pMON5427    110    1701-1812
pMON5310    283    1595-1880    pMON5428    129    1548-1677
pMON5311    110    1812-1922    pMON5429    303    1292-1595
pMON5312    248    782-1030    Btt起始    264    1-264
pMON5314    291    2041-2305    Btt延伸    380    440-820
pMON5315    330    1157-1187    BttA2    267    250-517
B.t.t.杀虫毒素基因的计算机分析
从pMON5420和pMON5421获得总共2615碱基对的顺序。该顺序的计算机分析揭示了从碱基对205至2136的单一开放读码。参见图5，B.t.t.杀虫毒素基因为1932碱基对，编码分子量为73，091道尔顿的644个氨基酸的蛋白质。该蛋白的净电荷为-17，G-C含量为34%。
鞘翅目型与鳞翅目型毒素基因之间
及蛋白质之间的比较
鞘翅目型毒素和鳞翅目型毒素都得自苏云金芽孢杆菌，但在这两种毒素基因之间及这两种毒素蛋白之间有着显著差别。由于分离自苏云金芽孢杆菌，这两种类型的毒素都以伴孢晶体存在;但如上所述，这两种晶体的溶解度性质显然不同。另外，存在于溶解的晶体中的毒素蛋白的大小完全不同。鳞翅目型毒素蛋白一般在130KDa数量 级，而鞘翅目型毒素蛋白大约为70KDa。
从B.t.t.分离鞘翅目型毒素基因并进行DNA顺序分析，可预测毒素蛋白的氨基酸顺序（见图5）。鞘翅目型毒素基因的核苷酸顺序和所推出的氨基酸顺序都与典型的鳞翅目型毒素的核苷酸和氨基酸顺序作了比较。这种比较是利用Devereux等人（1984）的计算机程序BESTFIT进行的，它使用的是Smith和Waterman（1981）的算法。BESTFIT可获得两个核苷酸顺序或两个氨基酸顺序的最大重合（alignment）。BESTFIT计算两个参数：质量和比例，在比较不同的重合时，这两个参数可用作重合量度标准。比例在0和1.0之间变化。比例较大表明两个顺序间的重合较好（即相似性较大）。
BESTFIT重合表明，这两种类型的毒素基因在核苷酸顺序和氨基酸顺序水平上都是相关的。然而，这种重合还表明，这两种顺序显然有差别并在核苷酸及氨基酸顺序水平上有许多不重合区。例如，这两种氨基酸顺序进行比较的比例仅为0.22。在核苷酸顺序水平上，只有在两种顺序中引入许多缺口才能获得最大重合，而且比例仅为0.072。
有许多已测序的鳞翅目型毒素基因的例子;在这些基因中进行的相似比较表明，来自Schnepf等人（1985）所描述的苏云金芽孢杆菌戈尔斯德HD-1变种的基因及来自Adang等人（1985）所描述的苏云金芽孢杆菌戈尔斯德HD-73变种的基因代表着两种差别最大的鳞翅目型毒素基因。与上面所计算的鞘翅目型和鳞翅目型基因重合的比例相比，这两种差别最大的鳞翅目型蛋白质的氨基酸顺序进行比较的比例为0.811，在核苷酸顺序水平上，这两种鳞翅目型基因 的比例为0.755。这表明，尽管鞘翅目型和鳞翅目型毒素基因可能在进化上相关，但它们在核苷酸及氨基酸顺序上都极为不同。
重组B.t.t.毒素在大肠杆菌中的高水平生产
为便于重组B.t.t.毒素的大量纯化，需要将B.t.t.基因克隆到大肠杆菌强表达载体中。用位点定向诱变在开放读码起始处的ATG密码子处将一个NcoI限制位点引入pMON5420中。位点定向诱变。
用Kunkel（1985）的方法进行位点定向诱变以引入新的限制位点。质粒pMON5420是通过转化到大肠杆菌BW313菌株中而引入的。BW313含dut-和ung-突变以便将脱氧尿苷掺入DNA中。将单个转化菌落放在含100μg/ml氨苄青霉素和0.25μg/ml尿苷的2×YT培养基中培养过夜。将0.5ml等分的此培养液加入10ml同样的培养基中并于37℃培养1小时，同时剧烈摇动至密度为0.23（A600）。为了诱导含单链的噬菌体颗粒的形成，加入大约10倍的辅助噬菌体M13K07并继续培养1小时至密度为0.4（A600）。加入30ml上述培养基使培养液稀释，并加入卡那霉素至终浓度为70μg/ml。继续培养15小时，此时离心除去细胞。加入5ml 20%PEG/2.5M NaCl/50μg/mlRNA酶A，随后在冰上保温15分钟，使噬菌体颗粒从25ml上清液中沉淀出来。离心回收噬菌体并将其溶于0.8ml TE缓冲液中。用0.8ml苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）提取3次，随后用乙醇沉淀将DNA从噬菌体颗粒中分离出来。将DNA沉淀物溶于100μl水中使终浓度约为1mg/ml（用琼脂糖凝胶电泳测定）。
将用于诱变的合成寡核苷酸引物以大约10pmole/μl的浓度悬浮于水中。用T4多核苷酸激酶在含50pmole寡核苷酸、1mMATP、25mM Tris-HCl pH8、10mM MgCl2、0.2mM亚精胺-HCl、1mM DTT及2单位酶的反应液中使寡核苷酸磷酸化。反应液于37℃保温30分钟，然后于70℃加热5分钟。将约1pmole噬菌体DNA（2μg）与10pmole引物混合在含6.6mM Tris-HCl、6.6mM MgCl2、6.6mM NaCl及5mM DTT的反应液中，使磷酸化的引物与含有脱氧尿苷的噬菌体DNA退火。将混合物加热至70℃7分钟，然后慢慢冷却到室温。加每种dNTP至0.5mM，ATP至5mM，并加5单位Klenow片段DNA聚合酶和400单位T4DNA连接酶（New England Biolabs），用已退火的引物/模板作底物，合成双链闭合环状DNA。反应于15℃下在与退火同样的缓冲盐中进行约15小时。此时，再加400单位连接酶并继续保温2小时。
用一半反应液转化0.15ml经CaCl2处理的JM101细胞，并将细胞铺于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。每次诱变反应回收30至几百个菌落。将单菌落在含氨苄青霉素的LB中培养过夜，并用碱性SDS法制备质粒的微量制备物。分析质粒是否存在新的限制位点，并通过如上所述的顺序分析证实新位点的存在。
通过位点特异性诱变产生一种在B.t.t.杀虫毒素基因起始处含NcoⅠ位点的质粒（pMON9759）。所用的引物如下所示：
所需的位点    引物
NcoI    GATTGTTCGGATCCATGGTTCTTCCTCCCT N端NcoI位点的产生使第2个氨基酸从天冬酰胺变为天冬氨酸。此变化不影响昆虫毒性。BamHⅠ和StyⅠ位点也由于此NcoⅠ位点的引入而产生。含NcoⅠ位点的质粒称为pMON9759。接着，将含pMON9759的毒素编码片段的2.5kb NcoⅠ-HindⅢ片段克隆到NcoⅠ-HindⅢ消化的pMON5634中，产生pMON5436。参见图16，pMON5634是一种以pBR327为基础的质粒，它也含有f1噬菌体复制起点。该载体含有一个可用萘啶酮酸诱导的合成recA启动子。还有来自噬菌体T7的基因10前导顺序〔在共同转让的美国专利申请（申请号005821，1987年2月4日提交，此公开列入本文参考文献中）中作了描述〕，以增强在大肠杆菌中的表达。加入具有多个克隆位点的合成联连子，以便插入启动子下游的基因和基因10前导顺序。
为诱导recA启动子，将过夜培养物在M9基本培养基（Miller，1972）中加0.2%酪蛋白氨基酸和0.25%葡萄糖以1∶50稀释。在150Klett单位时，加入萘啶酮酸至50μg/ml，并在诱导3小时后收集细胞。通过SDS-PAGE分析，将萘啶酮酸诱导的PMON5436所产生的B.t.t.毒素的水平与IPTG诱导的pMON5420作比较。用考马斯蓝染色的凝胶表明，pMON5420没有产生任何可测的B.t.t.，而由pMON5436产生的B.t.t.的水平约为总蛋白的5%。用此构建体分离大量的重组B.t.t.毒素蛋白以研究毒素水平、昆虫特异性及作用方式。
B.t.t.毒素鉴定
B.t.t.蛋白质的数目及来源的鉴定
B.t.t.产生许多鞘翅目型毒素蛋白，这些蛋白存在于伴随着孢子形成而产生的蛋白晶体中（见图6）。这些蛋白晶体在孢子形成期间或孢子形成后随细胞自溶而释放到培养基中。为测定B.t.t.所产生的毒素蛋白的数目，将500ml此有机体的培养物放在装有15%TSB培养基、100mM 2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES）缓冲液，pH7.0的2升培养瓶中，于30℃培养7天。此时，培养物已形成孢子，同时细胞溶解。于4℃以20，000×g离心20分钟收集蛋白质晶体及芽孢。沉淀物用过量的水洗涤3次，随后用2M NaCl洗涤3次。所产生的沉淀于4℃贮存于水加0.02%叠氮钠之中。通过将此沉淀物悬浮于100mM碳酸钠缓冲液，pH10中，并于室温下搅拌此悬浮液2小时，使B.t.t.毒素蛋白从晶体中溶解出来。以20，000×g离心20分钟除去未溶解物质，然后使上清液通过一个0.2μm滤器过滤除去所有残存的芽孢。以此方式制备的B.t.t.毒素蛋白。与溶解在125mM Tris-HCl、4%SDS、20%甘油及10%2-巯基乙醇，pH6.8（SDS样品缓冲液，用于制备样品以进行SDS-PAGE分析）中的晶体一样，是由四种不同的主要蛋白组成的（由SDS-PAGE分析推断）。通过N-末端氨基酸分析，鉴别出五种独特的产物。为了确定所有这五种蛋白质是否都来自同一基因或其合成是否需要2个或更多基因，用自动Edman化学降解法测定每种蛋白质的N-末端氨基酸顺序。
使用了Applied    Biosytems，Inc.470A型气相顺序分析仪（Foster    City，CA）（Hunkapiller，et    al.，1983）。用装有Brownlee    2.1mm    I.D.PTH-C18柱的Applied    Biosystems，Inc.120A型PTH分析仪以联机 方式进行RP-HPLC分析，鉴别各种PTH-氨基酸衍生物。每种蛋白质N-末端氨基酸顺序的测定将确定所有这些蛋白质是否都来自上述B.t.t.毒素基因。
测定这些蛋白质顺序的方案就是测定一些B.t.t.毒素蛋白的顺序，这些毒素蛋白相应于得自大肠杆菌克隆JM101（pMON5436）的条带1和3（见图6），以及B.t.t.所产生的毒素蛋白从SDS-PAGE凝胶中电洗脱得到的条带2、3和4。B.t.t.1和3的顺序用从JM101（pMON5436）纯化的蛋白质进行测定。诱导培养物进行高水平表达后，JM101（pMON5436），以及其它大肠杆菌建体（pMON5450、5456和5460，见下文）产生不溶性折射体形式的B.t.t.。将大肠杆菌构建体在37℃下培养于修改的M9培养基中。用过夜培养的培养物在2.4l费氏烧瓶中接种400ml修改的M9培养基至初始密度为10Klett单位。将0.1N    NaOH中的萘啶酮酸加入100Klett单位的培养物中至终浓度为50μg/ml，诱导B.t.t.毒素蛋白表达。再培养4小时后，于4℃以20，000×g离心20分钟收集培养物。将细胞沉淀物悬浮于水中至密度为每ml5000    Klett单位，并在冰浴中用功率为9，工作循环为50%的Heat    Systems    Ultrasonics超声波破碎器进行超声处理，总共5分钟。声处理后的制备物于4℃以20，000×g离心20分钟。含折射体及细胞碎片的沉淀物用冷水洗涤2次，以每ml10，000Klett单位的当量悬浮于水加25%环丁砜中。在室温下搅拌2小时后，将溶解的折射体制备物于4℃以20，000×g再次离心，除去未溶解物质。将Tris-HCl加入上清液中至终浓度为50mM，pH7.6。B.t.t.条带1和3在HR 5/5MonoQ离子交换柱上用含50mM    Tris-HCl、25%环丁砜，pH7.6的75至200mM    NaCl梯度共纯化。含B.t.t.条带1和3的组分用9%SDS-PAGE分析进行鉴定，合并起来，用100mM碳酸钠，pH10缓冲液透析，并在Amicon    centricon浓缩器中浓缩。以类似方法从JM101（pMON5456）中纯化出相应于条带3的B.t.t.毒素蛋白。
从7%SDS-PAGE板状凝胶上电洗脱相应于单独的条带2以及3，3′和4的混合条带，该板状凝胶系用48μg溶解于100mM碳酸钠、20mM二硫苏糖醇（DTT），pH10缓冲液中的B.t.t.晶体走过电泳。凝胶在考马斯蓝R250中染色10分钟，在50%甲醇、10%乙酸中脱色20分钟。用刮刀切下合适的条带，并电洗脱B.t.t.蛋白。从克隆到大肠杆菌中的B.t.t.毒素基因的DNA顺序推出氨基酸顺序后，即可鉴别出所有这5种独特的蛋白质的N-末端（见图7）。
相应于条带1和3的蛋白质分别起源于两个独立的翻译起始活动。这两个独立的翻译起始活动分别起始于1位和48位的甲硫氨酸（见图6和7）。相应于B.t.t.条带2、3和4的蛋白质，只见于B.t.t.中，在大肠杆菌构建体中则观察不到，它们显然是由条带1或3的蛋白水解断裂而产生的。这些结果证明，所有这五种蛋白质都起源于同一基因。
纯化B.t.t.条带1和3用于昆虫毒性测试
将大肠杆菌所产生的相应于条带3和1加3的B.t.t.蛋白溶于25%环丁砜中，并通过MonoQ层析纯化以进行N-末端氨基酸顺序分析，这些蛋白没有表现任何对马铃薯叶甲虫的昆虫毒性。在 随后的试验中，证明是环丁砜本身使B·t·t·失活。因此，研究和应用另外一种纯化方法来比较大肠杆菌所产生的B·t·t·条带1和3与从B·t·t·天然晶体溶解所产生的B·t·t·的相对杀虫毒性。按上述方法培养、诱导、收集培养物并分离出折射体。用100mm碳酸钠，pH10从折射体中溶解出各种B·t·t·蛋白。溶解的B·t·t·毒素（用Amicon搅拌的细胞以YM-10膜加以浓缩）在Pharmacia    Superose-12凝胶过滤FPLC柱上进行纯化，将B·t·t·条带1和3与其它污染蛋白质分开。将适当的组分（根据SDS-PACE分析）合并、浓缩，并用来以马铃薯叶甲进行昆虫毒性试验。根据SDS-PACE分析，相应于条带1（pMON5456）、条带1（pMON5460）和条带3（pMON5456）的蛋白质的纯度大于90%。pMON5460所产生的条带1在48位氨基酸处由异亮氨酸取代了甲硫氨酸（见下文）。
为了从B·t·t·获得天然的蛋白毒素以进行毒性比较，如上述用蔗糖梯度离心法分离纯化天然晶体，将晶体溶于100mM碳酸钠20mM    DTT，pH10中，用于昆虫毒性试验。
用于昆虫试验的所有B·t·t·毒素蛋白制备物和对照物都含0.3%吐温20，吐温20是一种表面活性剂，可增强这些溶液结合到番茄叶上的能力。将含指定蛋白质浓度的特定B·t·t·蛋白的缓冲溶液涂满3至4周龄的采来的番茄叶的上、下表面，进行昆虫毒性试验。溶液在番茄叶表面风干后，将一片叶子和10个马铃薯叶甲虫放于培养皿中，于22℃保温4天。测定死亡昆虫数并按上述Abbott公式以%校对死亡率（%CM）表示毒性结果。所有试验都重复进行两次。除来自pMON5460的B·t·t·条带1外，所 有试验都在不同日期重复。这些试验的结果示于下表。
表Ⅴ
B.t.t.蛋白对马铃薯叶甲的毒性
样品    浓度    校正的
（μg/ml）    死亡率（%）
溶解的B.t.t.    100    100
20    70
4    10
纯化的条带1    100    87
20    68
（PMON5436）    10    34
纯化的条带1    100    67
20    72
（PMON5460）    10    44
纯化的条带3    100    91
20    64
（PMCN5456）    10    32
将从不同大肠杆菌构建体纯化的蛋白质的相对毒性与溶解的天然B.t.t.晶体作比较。条带1（pMON5436）和条带3（pMON5456）按所述方法纯化。条带1（pMON5460）用凝胶过滤层析纯化。天然B.t.t.晶体溶解于100mM Na2CO3，pH10中。
杀死50%马铃薯叶甲虫所需的B.t.t.毒素的量，对分离自pMON5436和pMON5460的B.t.t.条带1和分离自pMON5456的B.t.t.条带3来说基本相同（表Ⅴ）。同样，所有这些从大肠杆菌纯化的B.t.t.制备物表明，其毒性与碳酸钠溶解的天然B.t.t.毒素的毒性基本相同。
B.t.t.毒素蛋白的毒性片段的测定
据几个研究小组（Schnepf    et    al.，1985，Hofte    et    al.，1986，和Wabiko    et    al.1986）报道，鳞翅目型毒素的C端端截（truncation）不会降低其毒性（在1155个氨基酸中，端截607个氨基酸不会导致毒性丧失）。因此，蛋白质的C端一半不是毒性所必需的。其它人也报道，含C端缺失的鳞翅目型毒素基因在转化植物中表达更强。还有人报道，为保持毒性，N端只能进行小段端截（Schnepf    et    al.1985，和Hofte    et    al.1986）。与这些说法相反，现已发现鞘翅目型B.t.t.毒素具有根本不同的性质，即，C端部分对毒性似乎是必不可少的，因而基本不能端截。然而N端可进行缺失，而仍有毒性。这些差别是用下述构建体揭示的：
pMON5426的构建（BglⅡ/BamHI缺失）
pMON5420用BglⅡ和BamHⅠ进行消化，连接并转化入JM101中，产生pMON5426。构建此缺失是为了证实BglⅡ位点并不在B.t.t.毒素基因编码区之内。
pMON5438的构建（HpaⅠ，C端463bp缺失）
将pMON5420用HpaⅠ进行消化并与以下合成的终止联接子连接。该联结子在每个读码中含无意义密码子，并含有一个BglⅡ5′伸出。
5′-TAGTAGGTAGCTAGCCA-3′
3′-ATCATCCATCGATCGGTCTAG-5′
连接物用BglⅡ消化以除去多重联接子插入片段，然后重新连接。将连接物转化到JM101中，分离出pMON5430。为了在端截基因起始处产生一个NcoⅠ位点，用pMON5430的1.47kb    PstⅠ片段取代pMON9759的2.32kb    PstⅠ片段，新的构建体称为pMON5434。将得自pMON5434的1.57kb    NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5438。
pMON5441的构建（EcoRV，C端327bp缺失）
pMON5420用EcoRV进行消化并合成终止联结子连接。用BglⅡ消化连接物以除去多重联结子插入片段，然后重新连接。将连接物转化到JM101中并分离出pMON5431。为了在端截基因起始处产生一个NcoⅠ位点，用pMON5431的1.61kb    PstⅠ片段取代pMON9759的2.32kb    PstⅠ片段，新构建体称为pMON5435。将得自pMON5435的1.71kb    NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5433中，产生pMON5441。
pMON5449的构建（Bal31，C端190bp缺失）
根据厂商说明，将BglⅡ消化的pMON9759用Bal31核酸酶处理5分钟。该DNA在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，用冻融法将其从琼脂糖中纯化出来。然后将合成终止联接子连接到纯化的DNA上，分离出pMON5442。用得自pMON5442的 端截基因片段取代pMON9759的NcoⅠ/BglⅡ片段，产生pMON5445。将得自pMON5445的NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5449。通过DNA顺序分析测定Bal31所产生的缺失的终点。
pMON5448的构建（XmnⅠ，C端16bp缺失）
pMON5436用XmnⅠ消化并与合成终止联结子连接。然后用NcoⅠ和BglⅡ消化连接物，并将含端截基因的1.92kb    NcoⅠ/BglⅡ片段克隆到NcoⅠ和BglⅡ消化的pMON9759中，以取代全长的基因，产生pMON5446。将得自pMON5446的NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5448。
pMON5450的构建（NcoⅠ补齐末端，从毒素ORF除去第一个ATG）
pMON5436用NcoⅠ消化，用Klenow片段DNA聚合酶补齐末端，连接并转化到JM101中，产生pMON5450。此质粒只表达条带3蛋白质。
pMON5452的构建（N端224bp缺失）
B·t·t基因含两个StyⅠ位点（227和1587），通过诱变加上第3个位点，在pMON9759中产生一个NcoⅠ位点。进行以下试验以将5′B·t·t·DNA切除至第227碱基对。用StyⅠ消化pMON5434（上述HpaⅠ缺失衍生物），末端用Klenow    DNA聚合酶补齐，将其连接并转化入JM101中，以分离pMON5444。此操作破坏了NcoⅠ和StyⅠ二者的切割位点。此操作产生了一个第1个甲硫氨酸（氨基酸1）和亮氨酸（氨基酸77）的读码内融合。通过将得自pMON9759 的1.9kb    NdeⅠ/KpnⅠ片段克隆到pMON5444中，加上该基因的C-末端，产生pMON5452。
pMON5456的构建（条带3突变体，N端140bp缺失）
如上所述，用引物：
诱变引物-BTT环
CGTATTATTATCTGCATCCATGGTTCTTCCTCCCT
通过位点定向诱变在条带3的ATG处将一个NcoⅠ位点引入pMON5420中，产生pMON5455。这种诱变还使编码条带1的N端48个氨基酸的上游顺序缺失。将得自pMON5455的NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5456。此质粒只表达条带3。NcoⅠ位点的产生使第2个氨基酸从苏氨酸变为天冬氨酸。
pMON5460的构建（突变体条带1基因，MET48变为ILE）
如上所述，用引物：
诱变引物-BTTMET
ATTATTATCTGCAGTTATTCTTAAAAACTCTTTAT
通过位点定向诱变使pMON9759中的48位甲硫氨酸密码子变为异亮氨酸密码子，产生pMON5458。将pMON5458的NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5460。由于除去了启动条带3蛋白质翻译的ATG密码子，pMON5460只产生条带1蛋白质，其48位为异亮氨酸残基。
pMON5467的构建（条带5突变体，N端293bp缺失）
用引物：
诱变引物
TCACTTGGCCAAATTGCCATGGTATTTAAAAAGTTTGT
通过位点定向诱变将一个NcoⅠ位点引入pMON5420中，使N端缺失98个氨基酸，产生pMON5466。通过诱变还插入一个甲硫氨酸和丙氨酸。将得自pMON5466的NcoⅠ/HindⅢ片段克隆到大肠杆菌强表达载体pMON5634中，产生pMON5467。
昆虫毒性结果
C端端截
如前所述，在番茄叶饲喂试验中用刚孵化的马铃薯叶甲测定鞘翅目型毒素的活性。用于C端分析的突变B·t·t·基因示于图8和10。pMON5438含B·t·t·毒素蛋白的490个氨基酸加上在载体构建中所用的联结子编码的3个氨基酸。这种端截蛋白在大肠杆菌中以高水平产生，但没有任何抗马铃薯叶甲的活性。pMON5441产生一种含B·t·t·毒素的536个氨基酸的蛋白质。端截蛋白在大肠杆菌中以高水平产生，但无任何抗马铃薯叶甲的活性。pMON5449含B·t·t·蛋白的582个氨基酸加上在载体构建中所用的联结子编码的2个氨基酸。这种端截蛋白在大肠杆菌中以高水平产生，但无任何抗马铃薯叶甲的活性。pMON5448含B·t·t·蛋白的640个氨基酸加上在载体构建中所用的联结子编码的2个氨基酸。这种端截蛋白在大肠杆菌中以高水平产生，但该蛋白无任何抗马铃薯叶甲的活性。这些结果表明，B·t·t·毒素蛋白的C端是马铃薯叶甲毒性所必需的。仅4个氨基酸缺失（pMON5448）就导致活性完全丧失。这些结果与已 报道的关于鳞翅目型B·t·毒素的文献截然相反。
N端突变和缺失的结果
用于N末端分析的其它突变型B·t·t·基因示于图9和10。分析pMON5450所产生的蛋白质揭示出，在大肠杆菌中产生条带3是由于翻译起始位于MET48处，而不是蛋白酶切割的一种产物。毒性研究还表明，条带3是有毒的。pMON5456产生一种蛋白质，该蛋白质起始于氨基酸48处，氨基酸49从苏氨酸变为天冬氨酸。该蛋白质在大肠杆菌中以高水平产生并对马铃薯叶甲有毒。pMON5452产生一种起始于氨基酸77处的蛋白质。此蛋白质在大肠杆菌中表达，并具有抗马铃薯叶甲的活性。pMON5467产生一种蛋白质，该蛋白质起始于氨基酸99处并在N末端加上了2个氨基酸（甲硫氨酸和丙氨酸）。该蛋白质在大肠杆菌中产生，不表现任何可测的抗马铃薯叶甲活性，可是该缺失变异体表达水平比其它变异体低很多。这些结果表明，B·t·t·毒素蛋白的N末端能容许缺失。缺失76个氨基酸仍表现毒性。然而99个氨基酸缺失就会导致活性丧失。pMON5460含一个突变，该突变使48位的甲硫氨酸变为异亮氨酸以防带3产生。由pMON5460产生的条带1的毒性等于由pMON5456产生的条带3的毒性。
植物转化载体的构建
对pMON5420所含的B·t·t·毒素基因进行修饰，使其掺入植物表达载体中。如前所述，用Kunkel（1985）的位点特异性诱变法，在紧接ATG密码子上游处引入一个BglⅡ位点，此ATG密码子确定全长的B·t·t·毒素蛋白（称为条带1）翻译的起始。B·t·t·毒素基因在起始密码子ATG区域的顺序为： ATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGAATCCGAACAATCGAAGTGAACATGATACAATA
MetAsnProAsnAsnArgSerGluHisAspThrIle
该诱变引物（bttbgl）长度为27个核苷酸，其顺序为：
CGGATTCATT    TTAGATCTTC    CTCCCTT
诱变后，用BglⅡ消化鉴别出含新BglⅡ位点的质粒，并用DNA顺序分析证实此变化。所得的含具有新BglⅡ位点的B·t·t·毒素基因的质粒称为pMON9758（图11）。
将pMON9758中的B·t·t·毒素基因插入盒式表达载体pMON316（Sanders    et    al.，1987）中。pMON316含有CaMV35S启动子和胭脂碱合酶（NOS）基因的3′端，并具有一个BglⅡ位点以便基因插入这二个成分之间。用BglⅡ消化质粒pMON9758，并分离出约2.3kb的片段。此片段从ATG密码子上游的BglⅡ位点一直延伸到B·t·t·毒素基因的终止密码子下游约350bp处的BglⅡ位点。因此，此片段含完整的B·t·t·基因编码顺序以及离终止密码子3′端约350bp的非编码顺序。将此BglⅡ片段与BglⅡ消化的pMON316连接。将其转化入大肠杆菌中后，鉴别出一个菌落，其中，B·t·t·毒素基因被插入pMON316中，使毒素基因5′端邻接CaMV35S启动子。此质粒称为pMON9753。分离出一种在pMON316中含相反方向的B·t·t·毒素基因的质粒，称为pMON9754（图11）。
通过三亲株杂交法将pMON9753和pMON9754二者 引入根瘤土壤杆菌ASE菌株中。此ASE菌株含无致瘤力的（disarmed）Ti质粒。按Fraley等人（1985）所述方法鉴别出pMON9753或pMON9754与无致瘤力的Ti质粒之间的共合体，并通过土壤杆菌全DNA的Southern分析证实其结构。
还构建了另一些含B·t·t·毒素基因的植物表达载体（见图12和13）。在这些载体中，B·t·t·毒素基因被插入植物表达载体pMON893中（图14）。参见图14，盒式表达载体pMON893系由增强的CaMV35S启动子及含多聚腺苷酸化作用信号的一种大豆基因的3′端组成。此大豆基因编码β-conglycinin的α′亚基（以下称为“7S基因”）。这两个成分之间为一个含多个限制位点的多联结子，以便基因插入。
增强的CaMV35S启动子按以下方法构建。Odell等人（1985）以前曾在PUC13中构建了一个在-343到+9位之间延伸的CaMV35S启动子片段。此片段含一个区域，该区域经Odell等人（1985）鉴定，对CaMV35S启动子的最大表达是必需的。将它切下成为一个ClaⅠ-HindⅢ片段，用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）使其末端钝化并插入PUC18的HincⅡ位点。将35S启动子上游区域从此质粒上切下成为一个HindⅢ-EcoRV片段（从-343延伸到-90），并将其插入同一质粒的HindⅢ与PstⅠ位点之间。这样，增强的CaMV35S启动子含有1个从-343到-90的重复顺序（参见图18）。
7S基因的3′端系来自称为17.1（Schuler    et    al.，1982）的克隆所含的7S基因。此3′端片段含多聚腺苷酸化作 用信号，其长度从位于克隆17.1中的β-Conglycinin基因终止密码子上游大约30bp处的AvaⅡ位点一直到位于此终止密码子下游大约450bp处的EcoRⅠ位点。
pMON893的其余部分含有一个pBR322片段，此片段提供了在大肠杆菌中的复制起点以及一个用于与土壤杆菌ACO菌株中无致瘤力的T-DNA进行同源重组的区域（如下述）;还含有来自广宿主范围质粒RK2的oriⅤ区;来自Tn7的链霉素抗性/壮观霉素抗性基因;以及一个嵌合的NPTⅡ基因，此基因含有CaMV35S启动子和胭脂碱合酶（NOS）3′端，它在转化的植物细胞中提供卡那霉素抗性。
pMON9753在终止密码子之外含有大约400bp的3′非编码顺序。由于该区域不是毒素产生所必需的，因此将其插入pMON893中的B·t·t·毒素基因片段中去掉。为了产生不含3′相邻顺序的B·t·t·毒素基因，用Kunkel（1985）的方法在紧接终止密码子之后引入一个BglⅡ位点。终止密码子附近的B·t·t·毒素基因的顺序为：
GTTTATATAGACAAAATTGAATTTATTCCAGTGAATTAAATTAACTAGAAAGTAAAGAAG
ValTyrIleAspLysIleGluPheIleProValAsn终止
诱变用如下顺序的引物（btt    C端）进行：
CTTTCTAGTT    AAAGATCTTT    AATTCACTG
B·t·t·毒素基因的诱变在pMON9758中进行。含新BglⅡ位点的质粒称为pMON9787（图12）。由于pMON9787在ATG起始密码子上游处含一个BglⅡ位点，因此，在一个约1940bp的BglⅡ片段上即含有B·t·t·毒素基因的全部编码 顺序，并且基本上无5′或3′相邻顺序。
将此1940bp片段从pMON9787中分离出来，并将它与BglⅡ消化的pMON893相连。鉴别出一种质粒，其中，B·t·t·毒素基因的5′端邻接增强的CaMV35S启动子，此质粒称为pMON9791（图12）。
在大肠杆菌中从第2个甲硫氨酸起始密码子产生一个全长B·t·t·毒素的变异体。已发现此蛋白（称为“条带3”）与全长的毒素（“条带1”）一样对马铃薯叶甲有毒。很可能与B·t·k·基因的情况一样，平截形式的B·t·t·基因可能更容易在植物细胞中表达。因此，构建一个修饰的B·t·t·毒素基因，其中去掉了条带3ATG密码子上游区。为除去此顺序，用Kunkel（1985）方法在条带3ATG上游处插入一个BglⅡ位点。条带3ATG附近顺序为：
CCAAATCCAACACTAGAAGATTTAAATTATAAAGAGTTTTTAAGAATGACTGCAGATAAT
ProAsnProThrLeuGluAspLeuAsnTyrLysGluPheLeuArgMetThrAlaAspAsn
诱变用如下顺序的引物（bttN端）进行：
ATCTGCAGTC    ATTGTAGATC    TCTCTTTATA    ATTT
用此引物进行的诱变在pMON5420所含的B·t·t·毒素基因中进行。含新BglⅡ位点的质粒称为pMON9788。按下法在pMON893中构建一个平截的B·t·t·毒素基因，该基因从条带3BglⅡ位点起始延伸至pMON9787中的远离终止密码子的BglⅡ位点。用BglⅡ和XbaⅠ消化pMON9788（图13），并分离出一个大约1250bp的片段。此片段长度从条带 3ATG延伸到位于B·t·t·基因中间的独特的XbaⅠ位点。pMON9787也用BglⅡ和XbaⅠ消化，并分离出一个大约550bp的片段。此片段长度从毒素基因中间的独特的XbaⅠ位点延伸到远离终止密码子的BglⅡ位点。将这两个片段混合并与BglⅡ消化的pMON893连接。鉴定出一种质粒，其中，毒素基因5′端邻接增强的CaMV35S启动子，此质粒称为pMON9792。pMON9792含B·t·t·毒素基因的N端端截衍生物（图13），它只编码条带3。
将pMON9791和pMON9792引入含有无致瘤力的Ti质粒的根瘤土壤杆菌ACO菌株中，已筛选出共合体并用于转化番茄和马铃薯。
ACO是一种与Fraley等人（1985）所述的pTiB6SE相似的无致瘤力的菌株。为构建ACO，用含胭脂碱型Ti质粒的A208菌株作为起始土壤杆菌菌株。用类似于Fraley等人（1985）所述的方法解除此Ti质粒的致瘤力，这样基本除去了所有天然T-DNA，只剩左边缘和左边缘以内几百个T-DNA碱基对。用一个新DNA片段取代T-DNA的其余部分（该部分延伸至右边缘外的一个点上）。新DNA片段包含（从左到右）一个pBR322片段，来自质粒RK2的oriⅤ区，以及来自Tn601的卡那霉素抗性基因。pBR322和oriⅤ片段与pMON893中的这种片段很相似，为共合体形成提供了一个同源区。ACOTi质粒的结构示于图17。
使用MAS启动子的嵌合B·t·t·毒素基因
将MAS启动子从PTiA6中分离出来作为1.5kb    EcoRI- 胶电泳分离出7.7kb片段。同样，用StuⅠ和HindⅢ消化质粒pMON707，通过琼脂糖凝胶电泳并在DEAE膜上回收，随后用1M    NaCl洗脱，分离出含MAS-NOS3′盒的3.5kb    StuⅠ-HindⅢ片段。连接这两个DNA片段，所产生的质粒称为pMON9741（图15）。此质粒在pMON200共整合背景中含MAS-NOS    3′盒。
根据本文中提供的技术，用BglⅡ消化pMON9791或pMON9792，回收毒素编码片段并将此片段移入pMON9741中，制备由MAS启动子驱动的嵌合B·t·t·毒素基因。
这些中间载体可用于转化植物，使其表现出对B·t·t·毒素蛋白易感的鞘翅目昆虫的毒性。
鞘翅目型毒素基因在植物中的表达
番茄植株的转化
用Mc    Cormick等人（1986）的方法，用根瘤土壤杆菌pMON9753-ASE菌株和pMON9754-ASE菌株转化番茄叶盘。按所述方法获得转化的番茄植株并检测卡那霉素抗性。
基因转移的番茄植株的昆虫毒性
用马铃薯叶甲虫进行生物检定，检测用pMON9753所含的B·t·t·毒素基因转化的番茄植株中毒素基因的表达。将待检测植株的叶插放入培养皿中，培养皿装有饱含水的滤纸。将10或20个刚孵出的马铃薯叶甲虫放到叶插上，使其摄食叶片。4天后，计算昆虫死亡率。此外，检查昆虫生长速度变慢（生长受阻）的迹象。检查剩余的叶组织，测定相对摄食危害。
在每次试验中用许多非转化植株作对照。现已试验了50至100 ClaⅠ片段。此DNA片段从位于核苷酸20，128的ClaⅠ位点一直延伸到Barker等人（1983）的顺序中的21，631位的EcoRI位点。参见图15，将EcoRI-ClaⅠ片段与预先用EcoRI和ClaⅠ消化过的双元载体pMON505（Horsch    et    al.1986）相连。所产生的质粒称为pMON706。将一个含NOS3′端的片段插入MAS启动子下游，获得MAS-NOS    3′盒式表达载体。将NOS3′片段从pMON530中切下成为300bp    BglⅡ-BamHI片段，并将其插入BglⅡ消化的pMON706中。所产生的质粒称为pMON707。
按下法构建pMON530：用NdeⅠ切割pMON200，除去900bpNdeⅠ片段，产生pMON503。用HindⅢ和SmaⅠ切割质粒pMON503，并使其与也用HindⅢ和SmaⅠ切割的质粒pTJS75（Schmidhauser    and    Helinski，1985）混合。分离出一种质粒，此质粒含有与pMON503的8kb    HindⅢ-SmaⅠ片段相连的pTJS75的3.8kb    HindⅢ-SmaⅠ片段，称为pMON505。然后，将CaMV35S-NOS3′盒转移到pMON505中，即用StuⅠ和HindⅢ切割pMON316，并分离出含NOS-NPTⅡ′-NOS标记和CaMV35S-NOS3′盒的2.5kb    StuⅠ-HindⅢ片段。将此片段加到用StuⅠ和HindⅢ切割的pMON505    DNA上。在连接和转化之后，分离出在pMON505中携有CaMV35S-NOS3′盒的质粒，称为pMON530。
与共整合载体相比，某些双元载体在番茄中极大地降低了转化频率（McCormick    et    al.，1986），因此，将MAS-NOS3′盒从pMON707移到共整合载体pMON200中（Fraley    et    al.，1985）。用StuⅠ和HindⅢ消化质粒pMON200，并用琼脂糖凝 个非转化植株作对照。在这些对照植株中，有80%以上的植株不使马铃薯叶甲死亡;大约15%的植株造成10%死亡率;5%或更少的植株给出20%死亡率。在对照植株中还没有观察到高于20%的死亡率。
下面的表Ⅵ总结了用几个PMON9753基因转移番茄植株所获得的毒性结果。
表Ⅵ
含pMON9753的基因转移番茄植株对马铃薯叶甲的毒性
植株 卡那霉素1CPB的死亡率（%）
抗性    试验＃1    试验＃2    试验＃3
794    R    30    20
810    n·d·    50    20    40
871    R    30    10（生长受阻）
886    R    50    40
887    n·d·    20    30    30
1009    n·d·    50
1044    R    20（生长受阻）
1046    R    40（生长受阻）
1n.d.代表无数据。
如表Ⅵ所示，已获得几个植株，这些植株对马铃薯叶甲的致死率水平始终比非转化对照植株高。这些结果表明，B.t.t.毒素基因表达的水平足以杀死大量摄食这些植物的昆虫。
鞘翅目毒素在马铃薯中的表达
将马铃薯栽培品种Kennebec的顶芽在含有MS主要及次要盐，0.17g/l磷酸二氢钠，0.4mg/l盐酸硫胺素、0.1g/l肌醇、3%蔗糖、2.0g/lGelrite（Kelco Co.），pH5.6的培养基上进行继代培养。培养物于24℃以16小时光照周期培养4周。将茎节间部切为约8mm长，将土壤杆菌PMON9753-ASE菌株（已划线接种于LB琼脂平板上并培养了2-3天）涂布于切面上。上述pMON9753-ASE含有由CaMV35S启动子驱动的嵌合B.t.t.毒素基因。此外，还可用含嵌合B.t.t.毒素基因的土壤杆菌pMON9791-ACO菌株或pMON9792-ACO菌株。将茎切段放在含有盐类和有机添加物（如Jarret et al.1980所述）、3%蔗糖、3mg/lBA和0.1mg/l NAA，pH5.6的0.8%琼脂固体培养基上。4天后，将外植体移到同样成分但加有500mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素（作为转化植株细胞的筛选剂）的培养基上。4周后，再将外植体移至同样成分但加有0.3mg/1GA3（作唯一的激素）的培养基中。在100mg/l卡那霉素存在下发育的愈伤组织用点吸印分析测定时，显示出它含有NPTⅡ酶，表明马铃薯细胞已被转化。未接种的对照组织在此浓度的卡那霉素下受到抑制。转化的马铃薯组织可表达B.t.t.毒素基因。B.t.t.毒素mRNA可用Northern分析检测，而B.t.t.毒素蛋白可通过免 疫测定，如Western吸印分析检测。然而，在许多情况下，测定B.t.t.毒素存在的最灵敏检测方法是昆虫生物检定法。摄食转化组织的马铃薯叶甲幼虫受毒素作用之害。
这种产生卡那霉素抗性的转化的马铃薯细胞的方法还被成功地用于再生苗。从外植体取出1-2cm长的芽并放入上述顶芽维持液中，芽在其中很容易生根。
通过检测NPTⅡ酶的表达，并检测并利用茎块在含卡那霉素的培养基上形成愈伤组织的能力，检测以此方式产生的植株的转化情况。转化的植株可表达B.t.t.毒素基因。B.t.t.毒素mRNA可用Northern分析法检测，B.t.t.毒素蛋白可用免疫测定如Western吸印分析进行检测。摄食转化组织的马铃薯叶甲幼虫受毒素作用之害。
鞘翅目型毒素在棉花中的表达
先将棉花种子浸入加了Sparkleen皂的去污剂水溶液中10分钟，然后将它放入含有每400ml2滴吐温20的30%Chlorox溶液中搅拌20分钟，再用无菌蒸馏水洗涤2次，进行表面灭菌。然后，将种子浸于0.4% benolate中10分钟。将benolate倾出后，将种子在无菌条件下放入琼脂固体半加富（half strength）MS盐中。种子于32℃黑暗中萌发3-10天。然后将子叶和胚轴在无菌条件下取出并切成段。将切段放入1）含3%葡萄糖、2mg/l萘乙酸（NAA）和1mg/l激动素的琼脂固体MS培养基（MSS培养基）中，或2）含3%葡萄糖、维生素B5、100mg/l肌醇、0.75mg/lMgCl2、0.1mg/l二氯苯氧乙酸（2，4-D）及0.1或0.5mg/l 激动素的Gelrite固体MS培养基（MST培养基）中。将愈伤组织于28℃以16/8光照周期保持于这二种培养基之一中，直至开始胚胎发生。胚胎发生的愈伤组织的继代培养在与开始时同样的、但用3%蔗糖代替葡萄糖的培养基上进行。将体细胞胚胎移入不含植物生长调节剂但含0.75g/lMgCl2的Gelrite固体Stewart培养基中，使其萌发。将发芽的胚胎移至生长室的土壤中继续生长。此后，将植株移到温室中以便开花结实。
按以下步骤转化棉花组织并产生转化的愈伤组织和植株。无菌籽苗的制备方法与植物再生相同。用土壤杆菌液体过夜培养物或培养于营养平皿上的土壤杆菌接种胚轴和子叶切段。将外植体在含1/10浓度MS盐的MSS或MST培养基中共培养2-3天。用滤纸吸去外植体上多余的细菌，并将外植体铺于含500mg/l羧苄青霉素和30-100mg/l卡那霉素的MSS或MSN培养基上。转化的愈伤组织将在此培养基上生长并产生胚。如对再生步骤所述，将该胚培养成植株。通过检测NPTⅡ的表达测试植株的转化情况。
当用于转化的土壤杆菌菌株含嵌合B.t.t.毒素基因（如pMON9753，pMON9791或pMON9792）时，B.t.t.毒素基因可在转化的愈伤组织、由此愈伤组织衍生的胚以及由此胚衍生的转化植株中进行表达。就所有这些情况而言，B.t.t.毒素mRNA的表达可通过Northern分析来检测，B.t.t.毒素蛋白的表达可通过免疫测定，如Western吸印分析来检测。昆虫生物检定可能是检测毒素蛋白存在最灵敏的手段。
愈伤组织、胚或植株的昆虫毒性通过用棉铃象幼虫进行生物检定来测定。摄食转化的表达B.t.t.毒素基因的棉花细胞或植株的 棉铃象幼虫受毒素作用之害。
鞘翅目型毒素基因在玉米中的表达
下面概述的是，从玉米制备原生质体，利用电穿孔（electroporation）将嵌合B.t.t.毒素基因引入原生质体，并回收稳定转化的、表达嵌合B.t.t.毒素基因的卡那霉素抗性的玉米细胞。
玉米原生质体的制备
按Fromm等人（1985，1986）所述，从Black Mexican Sweet（BMS）玉米悬液系BMSI（ATCC54022）制备原生质体。将BMSI悬浮细胞培养于含MS盐、20g/l蔗糖、2mg/l（2，4-二氯苯氧）乙酸、200mg/l肌醇、130mg/l天冬酰胺、1.3mg/l烟酸、0.25mg/l硫胺、0.25mg/l吡哆醇、0.25mg/l泛酸钙，pH5.8的BMS培养基中。将40ml培养物装在125ml锥形瓶中于26℃以150rpm震荡。培养物每隔3天用等体积的新鲜培养基稀释。加新鲜培养基1至2天后，从生长旺盛的细胞中分离出原生质体。为分离原生质体，将细胞在一个水平离心式（Swinging bucket table top）离心机上以200xg进行沉降。收集上清液作条件培养基以培养原生质体。将6ml压紧的细胞再悬浮于40ml含1%纤维素酶、0.5%半纤维素酶和0.02%果胶酶的0.2M甘露醇/50mMCaCl2/10mM醋酸钠中。于26℃培养2小时后，用一个60μm尼龙网过滤分离出原生质体。原生质体以200×g离心，并用不含酶的同样溶液洗涤一次。
利用电穿孔技术用B.t.t.毒素基
因DNA载体转化玉米原生质体
将原生质体在含2mM磷酸钾，pH7.1、4mM氯化钙、140mM氯化钠和0.2M甘露醇的溶液中洗涤，以便进行电穿孔。洗涤后，将原生质体以每ml4×106个原生质体的浓度再悬浮于同一溶液中。将半ml含原生质体的溶液与0.5ml含50微克超螺旋质粒载体DNA的同一溶液混合，置于1ml电穿孔杯中。电穿孔按Fromm等人（1986）所述方法进行。如所述，电脉冲系由充电至200V的122或245微法拉电容器发出。原生质体于4℃放置10分钟，室温放置10分钟后，用8ml含MS盐、0.3M甘露醇、2%蔗糖、2mg/l2，4-D、20%条件BMS培养基（见上文）和0.1%低熔点琼脂糖的培养基稀释。黑暗中置于26℃2周后，加入含卡那霉素而不含甘露醇的培养基以产生卡那霉素终浓度为100mg/l的液体。再过2周后，从液体中取出小愈伤组织，将其放在一个滤膜片上，滤片置于含100mg/l卡那霉素的琼脂糖固体培养基上。约1-2周后，出现由转化的玉米细胞组成的卡那霉素抗性愈伤组织。
B.t.t.毒素基因在玉米细胞中的表达
如Fromm等人（1986）所述，转化的玉米细胞用含嵌合的卡那霉素抗性基因（由CaMV35S启动子、NPTⅡ编码区和NOS3′端组成）的DNA载体进行电穿孔之后，可通过在含卡那霉素的培养基中生长而筛选出来。pMON9791和pMON9792含有这种嵌合NPTⅡ基因，还含嵌合B.t.t.毒素基因。如上所述，通过将玉米原生质体用DNA载体进行电穿孔来转化玉米原生质体，此处DNA载体为pMON9791或pMON9792。在卡那霉素 抗性筛选之后，测定转化的玉米细胞B.t.t.毒素基因的表达。通过Northern吸印分析测定B.t.t.mRNA，通过免疫测定，如Western吸印分析测定B.t.t.毒素蛋白。
用转化的玉米愈伤组织饲喂黄瓜十一星叶甲食根亚种幼虫，测定昆虫毒性。另外，也可从转化的玉米细胞制备含B.t.t.毒素蛋白的蛋白提取液，并将此提取液掺入适当的昆虫饲料中饲喂黄瓜十一星叶甲食根亚种幼虫。摄食转化的愈伤组织或这种愈伤组织蛋白提取液的黄瓜十一星叶甲食根亚种幼虫受毒素作用之害。
提供以上实例是为了更好地阐明本发明的实施，并不打算以任何方式限定本发明的范围。本领域专业人员应认识到，只要不偏离所述的本发明的要旨和范围就可进行修改。
参考文献
Abbott，W.S.（1925），J.Econ.Entomol.18：265-267.
Adang，M.J.，Staver，M.J.，Rocheleau，T.A.，
Leighton，J.，Barker，R.F.and    Thompson，D.V.
（1985）Gene    36：289-300.
Ammirato，P.V.，et    al.（eds），3    HANDBOOK    OF    PLANT
CELL    CULTURE-CROP    SPECIES（MacMillian    Publ.Co.
1984）.
Aronson，A.I.，Beckman，W.and    Dunn，P.，（1986）.
Microbiological    Reviews    50：1-24.
Barker，R.F.，Idler，K.B.，Thompson，D.V.and
Kemp，J.D.（1983）Plant    Mol.Biol.2：335-350.
Bernhard，K.（1986）.FEMS    Microbiol.Lett.33，
261-265.
Bevan，M.，et    al.（1983）Nature    304：184.
Birnboim，H.C.and    Doly，J.（1979）Nucleic    Acid    Res.
7：1513-1524.
Conner，B.J.，Reyers，A.A.，Morin，C.，Itakura，K.
Teplitz，R.L.and    Wallace，R.B.（1983）.Proc.Natl.
Acad.Sci.USA    80：278-282.
Devereux，J.，Haeberli，and    Smithies（1984）Nucl.
Acids    Research    12：387-395.
Ditta，G.，Stanfield，S.，Corbin，D.and    Helinski，
D.R.，（1980）.Proc.Nat.Acad.Sci.USA    77：7347-7751.
Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B.，
Eichholtz，D.A.，Flick，J.S.，Fink，C.L.，Hoffmann，
N.L.and    Sanders，P.R.（1985）.Bio/Technology    3，
629-635.
Fromm，M.，Taylor，L.P.and    Walbot，V.（1985）Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.A.82：5824-5828.
Fromm，M.，Taylor，L.P.and    Walbot，V.（1986）.
Nature    319：791-793.
Herrera-Estrella，L.，et    al.（1983）Nature    303：209.
Herrnstadt，C.，Soares，G.G.，Wilcox，E.R.and
Edwards，D.L.（1986）.Bio/Technology    4，305-308.
Horsch，R.and    Klee，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.83，4428-4432.
Hofte，H.et    al.（1986）Eur.J.Biochem    161：273-280.
Hunkapiller，M.W.Hewid，R.M.，Dreyer，W.J.and
Hood，L.E.（1983）Methods    in    Enzymology    91，399-413.
Jarret，R.L.et    al.，Physiologia    Plantarum
49：177-184（1980）.
Klee，H.J.，et    al.，Bio/Technology    3：637-642（1985）.
Klier，A.，Fargette，F.，Ribier，J.and    Rappaport，G.
（1982）.EMBO    J.1：791-799.
Krieg，A.，Huger，A.M.，Langerbrunch，G.A.and
Schnetter，W.（1983）Pathotyp.Z.Ang.Ent.
96：500-508.
Krieg，A.，Huger，A.M.，Langerbrunch，G.A.and
Schnetter，W.（1984）Ang.Schadlingshde.，
Pflanzenschutz，Umweltschutz.57：145-150.
Kronstad，J.W.，Schnepf，H.E.and    Whiteley，H.R.
（1983）J.Bacteriol.154：419-428.
Kunkel，T.A.（1985）.Proc.Nat.Acad.Sci.USA    82，
488-492.
Laemmli，U.K.（1970）Nature    227：681-685.
Maniatis，T.，Fritsch，E.F.and    Sambrook，J.（1982）.
Molecular    Cloning，A    Laboratory    Manual.Cold    Spring
Harbor    Laboratories，Cold    Spring    Harbor，NY.
McCormick，S.，Niedermeyer，J.，Fry，J.，Barnason，
A.，Horsch，R.and    Fraley，R.（1986）.
Plant    Cell    Reports    5，81-84.
Odell，J.T.，Nagy，F.and    Chua，N.H.（1985）.
Nature    313：810-812.
Sanders，et    al.（1987）Nucleic    Acids    Research
15：1543-1558.
Sanger，F.，Micklen，S.and    Coulson，A.R.（1977）
Proc.Nat.Acad.Sci.USA    74：5463-5467.
Schnepf，H.E.and    Whiteley，H.R.（1981）.Proc.Nat.
Acad.Sci.USA    78：2893-2897.
Schmidhauser，T.and    Helinski，D.，J.Bacteriology，
164，446（1985）.
Schnepf，H.E.，Wong，H.C.and    Whiteley，H.R.
（1985）J.Biol.Chem.260：6264-6257.
Schuler，M.A.，Schmitt，E.S.and    Beachy，R.N.
（1982）.Nucleic    Acids    Research.10：8225-8244.
Smith    and    Waterman（1981），Adv.in    App.Mathematics，
2：482-489.
Southern，E.M.（1975）J.Mol.Biol.98：503-517.
Spizizen，J.（1958）Proc.Nat.Acad.Sci.USA
44：1072-1078.
Towbin，H.and    Gordon，J.（1984）J.Immunol.Method.
72：313-340.
Wabiko，H.，Raymond，K.C.and    Bulla，L.A.（1986）
DNA    5：305-314.
Wood，W.I.，Gitschier，J.，Lasky，L.A.and    Lawn，R.
M.（1985）Proc.Nat.Acad.Sci.USA    82：1585-1588.
M13    Cloning    and    Sequencing    Handbook，Amersham
Corporation    Cat.＃N4502.

Claims (8)

1、一种生产表现对鞘翅目昆虫有毒性的遗传转化植物的方法，包括以下步骤：
(a)在植物细胞基因组中插入一个嵌合基团，该嵌合基因包括以下顺序：
i)一个启动子，它在植物中起作用，引起RNA产生；
ii)一个DNA顺序，它引起编码鞘翅目型苏云金芽孢杆菌毒素素蛋白的RNA顺序的产生；
iii)一个3′非翻译DNA顺序，它在植物细胞中起作用，使多聚腺苷酸加到RNA顺序的3′端；
(b)获得转化的植物细胞；
(c)从转化的植物细胞再生遗传转化的表现对鞘翅目昆虫抗性的植物。
2、一种权利要求1的方法，其中的启动子选自由CaMV35S启动子、MAS启动子和ssRUBISCO启动子所组成的这组启动子。
3、一种权利要求1的方法，其中，编码鞘翅目型毒素蛋白的DNA顺序来自苏云金芽孢杆菌黄粉
Figure 88102497X_IMG1
变种。
4、一种权利要求1的方法，其中编码鞘翅目型毒素蛋白的DNA顺序来自苏云金芽孢杆菌圣地亚哥变种。
5、一种权利要求3的方法，其中的启动子是CaMV35S启动子。
6、一种权利要求3的方法，其中的启动子是甘露碱合酶启动子。
7、一种权利要求5的方法，其中，3′非翻译DNA顺序来自大豆贮藏蛋白基因。
8、一种权利要求1的方法，其中的植物选自由番茄、马铃薯和棉花所组成的这组植物。
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Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5371003A (en) * 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
NZ224470A (en) * 1987-05-05 1991-06-25 Sandoz Ltd Method of transforming plant cell material; plant cell material and plants
WO1989001515A2 (en) * 1987-08-17 1989-02-23 Plant Genetic Systems N.V. Plants transformed with a dna sequence from bacillus thuringiensis
NZ226442A (en) * 1987-10-13 1991-08-27 Lubrizol Genetics Inc Anti-coleopteran toxin and gene
US6753463B1 (en) 1987-11-18 2004-06-22 Mycogen Corporation Transformed cotton plants
AU708250B2 (en) * 1987-11-18 1999-07-29 Mycogen Corporation Regeneration and transformation of cotton
US5244802A (en) 1987-11-18 1993-09-14 Phytogen Regeneration of cotton
IL88266A (en) * 1987-11-18 1998-03-10 Phytogen A method for regenerating a cotton plant from somatic cotton cells
US5834292A (en) * 1987-11-18 1998-11-10 J. G. Boswell Company Method for producing somaclonal variant cotton plants
EP0317511A3 (de) * 1987-11-18 1991-10-16 Ciba-Geigy Ag Insektizide Baumwollpflanzenzellen
US4996155A (en) * 1988-03-04 1991-02-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
KR910700346A (ko) * 1988-12-16 1991-03-14 제임스 제이. 플라인 트랜스제닉(transgenic)식물내에서 키티나제를 과발현시키는 방법
US5683691A (en) * 1989-02-15 1997-11-04 Plant Genetic Systems, N.V. Bacillus thuringiensis insecticidal toxins
EP0382990A1 (en) * 1989-02-15 1990-08-22 Plant Genetic Systems, N.V. Strains of bacillus thuringiensis
BR9007159A (pt) 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
WO1991010725A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US6777589B1 (en) * 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
US6025545A (en) * 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US5187091A (en) * 1990-03-20 1993-02-16 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects
ES2171391T3 (es) * 1990-04-26 2002-09-16 Aventis Cropscience Nv Nueva cepa de bacillus thuringiensis y su gen de codificado de toxina insecticida.
US6395966B1 (en) * 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US5264364A (en) * 1991-01-31 1993-11-23 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects
DE69230290T2 (de) * 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag, Basel Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
TW261517B (zh) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
CA2092069A1 (en) * 1992-03-27 1993-09-28 Asako Iida An expression plasmid for seeds
US5356623A (en) * 1993-03-17 1994-10-18 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryET1 toxin gene and protein toxic to lepidopteran insects
US5322687A (en) * 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6281411B1 (en) 1993-08-25 2001-08-28 Dekalb Genetics Corporation Transgenic monocots plants with increased glycine-betaine content
ES2330168T3 (es) * 1995-10-13 2009-12-04 Dow Agrosciences Llc Gen mopdificado de bacillus thuringiensis para combatir los lepidopteros en plantas.
US5932783A (en) * 1996-04-01 1999-08-03 J.R. Simplot Co. Potato UDP-glucose pyrophosphorylase gene promoters and their uses
ID25530A (id) 1996-11-20 2000-10-12 Ecogen Inc δ-ENDOTOKSIN BERSPEKTRUM-LEBAR
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6218142B1 (en) * 1997-03-05 2001-04-17 Michael Wassenegger Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP)
AU1593001A (en) 1999-11-12 2001-06-06 Fibrogen, Inc. Recombinant gelatin in vaccines
WO2002074079A2 (en) 2001-03-15 2002-09-26 Clemson University Polynucleotide encoding a gene conferring resistance to bacillus thuringiensis toxins
US20080182796A1 (en) * 2001-08-31 2008-07-31 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
WO2005069986A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Monsanto Technology Llc Chimeric promoters for use in plants
EP2281447B1 (en) * 2004-03-25 2016-07-27 Syngenta Participations AG Corn event MIR604
CN102524294B (zh) 2004-04-09 2018-04-06 孟山都技术有限公司 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法
EP2765189A1 (en) 2004-12-21 2014-08-13 Monsanto Technology LLC Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
WO2006125065A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm
CA2625061A1 (en) 2005-07-08 2007-01-18 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Novel bacterial proteins with pesticidal activity
EP3508582B1 (en) 2005-09-16 2021-01-13 Monsanto Technology LLC Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
US7294768B1 (en) 2005-09-27 2007-11-13 Monsanto Technology Llc Soybean variety 0384279
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
ES2633352T3 (es) 2006-10-12 2017-09-20 Monsanto Technology Llc microARN de plantas y procedimientos de uso de los mismos
CN100473287C (zh) * 2006-10-19 2009-04-01 纪金堂 一种鱼饲料生物添加剂及其制备与应用
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
US9522937B2 (en) 2007-03-28 2016-12-20 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
AU2008232826B2 (en) * 2007-03-28 2011-06-02 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
CA2702084C (en) * 2007-10-09 2017-07-25 Athenix Corp. Computational methods for synthetic gene design
ES2457218T3 (es) 2008-04-07 2014-04-25 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos
US9133475B2 (en) 2008-11-26 2015-09-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Aphid resistant soybean plants
MX2011008246A (es) 2009-02-05 2011-09-06 Athenix Corp Genes de delta endotoxina variante axmi.r1 y metodos de uso de los mismos.
CN102307994A (zh) 2009-02-06 2012-01-04 先正达参股股份有限公司 用于在植物中表达的多结构域酶的修饰
US20120277117A1 (en) 2009-02-27 2012-11-01 Adel Zayed Hydroponic apparatus and methods of use
CN102458099B (zh) 2009-06-05 2015-08-19 佛罗里达大学研究基金公司 甘蔗木质素生物合成基因的分离和靶向抑制
US8937214B2 (en) 2009-10-23 2015-01-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
EP2524045B1 (en) 2010-01-14 2015-12-02 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
EP2611925B1 (en) 2010-08-30 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
WO2012083219A1 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 Dow Agrosciences Llc Combined use of vip3ab and cry1ab for management of resistance insects
CN103534267B (zh) 2011-03-25 2017-07-14 孟山都技术公司 植物调控元件及其用途
CA2997781C (en) 2011-05-13 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
MX344968B (es) 2012-02-01 2017-01-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto.
CN107556389B (zh) 2012-02-02 2021-10-26 陶氏益农公司 植物反式激活互作基序及其用途
WO2013122720A2 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
WO2013130813A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
WO2013134734A2 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
US20150203864A1 (en) 2012-03-13 2015-07-23 University Of Guelph Myb55 promoter and use thereof
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
US9663793B2 (en) 2012-04-20 2017-05-30 Monsanto Technology, Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA2890235A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
CA2881787A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
EP2935586B1 (en) 2012-12-19 2018-07-18 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
CA2836403A1 (en) 2013-01-04 2014-07-04 Board Of Trustees Of Michigan State University New sources of aphid resistance in soybean plants
CN116064536A (zh) 2013-03-14 2023-05-05 孟山都技术公司 植物调控元件和其用途
JP2016514964A (ja) 2013-03-14 2016-05-26 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節エレメントおよびその使用
MX359191B (es) * 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US10920208B2 (en) 2014-10-22 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
WO2016094165A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Syngenta Participations Ag Compositions and methods for controlling plant pests
US10604757B2 (en) 2014-12-23 2020-03-31 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
WO2016154631A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The Texas A&M University System Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels
WO2016168631A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
US11524983B2 (en) 2015-07-23 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Evolution of Bt toxins
US10612011B2 (en) 2015-07-30 2020-04-07 President And Fellows Of Harvard College Evolution of TALENs
US11913166B2 (en) 2015-09-21 2024-02-27 Modern Meadow, Inc. Fiber reinforced tissue composites
IL294014B2 (en) 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
ES2806990T3 (es) 2016-02-15 2021-02-19 Modern Meadow Inc Procedimiento para fabricar un material biofabricado que contiene fibrillas de colágeno
SG10202006261YA (en) 2016-03-11 2020-08-28 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
JP7078551B2 (ja) 2016-05-24 2022-05-31 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節エレメント及びその使用
CA3029271A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
AR109205A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
AR109206A1 (es) 2016-08-05 2018-11-07 Syngenta Participations Ag Control de plagas de coleópteros utilizando moléculas de arn
US11447531B2 (en) 2016-10-21 2022-09-20 Vestaron Corporation Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018136594A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
CA3008850A1 (en) 2017-06-29 2018-12-29 Modern Meadow, Inc. Yeast strains and methods for producing collagen
US11447809B2 (en) 2017-07-06 2022-09-20 President And Fellows Of Harvard College Evolution of tRNA synthetases
WO2019040935A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 President And Fellows Of Harvard College EVOLUTION OF PEPTIDASES BONT
WO2019056002A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 President And Fellows Of Harvard College CONTINUOUS EVOLUTION FOR STABILIZED PROTEINS
CA3076020A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
AU2018253595A1 (en) 2017-11-13 2019-05-30 Modern Meadow, Inc. Biofabricated leather articles having zonal properties
US20200332311A1 (en) 2018-01-12 2020-10-22 The Texas A&M University System Increasing plant bioproduct yield
CA3091431A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Devgen Nv Control of insect pests using rna molecules
EP3784784A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
AU2020209847B2 (en) 2019-01-17 2024-10-17 Modern Meadow, Inc. Layered collagen materials and methods of making the same
AU2020226376A1 (en) 2019-02-20 2021-08-05 Syngenta Crop Protection Ag Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests
EP3942044A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Devgen NV Control of insect pests using rna molecules
WO2022204464A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
TW202305129A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於產生環狀多核糖核苷酸之組成物及方法
TW202305130A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 原核系統中環狀多核糖核苷酸之產生
AU2022375817A1 (en) 2021-11-01 2024-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
IL314307A (en) 2022-01-20 2024-09-01 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Polynucleotides for transforming organisms
WO2023154887A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Northeast Agricultural University Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant
WO2024023578A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Institut Pasteur Hsc70-4 in host-induced and spray-induced gene silencing
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof
WO2024160989A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicide resistant plants

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4517200A (en) * 1982-12-27 1985-05-14 Schering-Plough Corporation Method for treating allergic reactions with forskolin
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
BR8404834A (pt) * 1983-09-26 1985-08-13 Agrigenetics Res Ass Metodo para modificar geneticamente uma celula vegetal
DE3346138A1 (de) * 1983-12-21 1985-07-11 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera
CA1301094C (en) * 1984-08-31 1992-05-19 Helen Riaboff Whiteley Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
US5254799A (en) 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
US4764372A (en) * 1985-03-22 1988-08-16 Mycogen Corporation Compositions containing bacillus thuringiensis toxin toxic to beetles of the order coleoptera, and uses thereof
DE3686452T2 (de) * 1985-06-14 1993-04-15 Repligen Corp Aktiviertes bacillus thuringiensis-delta-endotoxin, hergestellt von einem manipulierten hybrid-gen.
US4771131A (en) * 1985-08-16 1988-09-13 Mycogen Corporation Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera
US5516693A (en) 1987-03-04 1996-05-14 Board Of Trustees Operating Michigan State University Hybrid gene incorporating a DNA fragment containing a gene coding for an insecticidal protein, plasmids, transformed cyanobacteria expressing such protein and method for use as a biocontrol agent
US5338544A (en) * 1987-04-16 1994-08-16 Ecogen Inc. CryIIB protein, insecticidal compositions and methods of use thereof
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
NZ224470A (en) * 1987-05-05 1991-06-25 Sandoz Ltd Method of transforming plant cell material; plant cell material and plants
ES2074999T3 (es) * 1987-05-20 1995-10-01 Ciba Geigy Ag Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
EP0299828B1 (en) 1987-07-01 1994-06-15 Plant Genetic Systems N.V. Bactericidal and/or bacteriostatic peptides, process for their isolation, their production and their applications
WO1989001515A2 (en) * 1987-08-17 1989-02-23 Plant Genetic Systems N.V. Plants transformed with a dna sequence from bacillus thuringiensis
NZ226442A (en) * 1987-10-13 1991-08-27 Lubrizol Genetics Inc Anti-coleopteran toxin and gene
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
BR9007159A (pt) 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
CA1341635C (en) 2013-03-19
RU2025486C1 (ru) 1994-12-30
EP0731170A1 (en) 1996-09-11
NZ224418A (en) 1990-09-26
JP3122642B2 (ja) 2001-01-09
IL86219A0 (en) 1988-11-15
ZA883049B (en) 1989-02-22
EP0289479A3 (en) 1989-06-28
JP2001112490A (ja) 2001-04-24
DE3855644T3 (de) 2004-08-05
US6953835B2 (en) 2005-10-11
US20020152496A1 (en) 2002-10-17
DK234088A (da) 1988-10-31
IE881266L (en) 1988-10-29
IE81100B1 (en) 2000-03-08
JPS63287488A (ja) 1988-11-24
ES2094722T5 (es) 2004-05-01
ATE144995T1 (de) 1996-11-15
AU1527388A (en) 1988-11-03
ES2094722T3 (es) 1997-02-01
DE3855644D1 (de) 1996-12-12
GR3022490T3 (en) 1997-05-31
DE3855644T2 (de) 1997-04-24
DK234088D0 (da) 1988-04-28
US5495071A (en) 1996-02-27
EP0289479B1 (en) 1996-11-06
US6284949B1 (en) 2001-09-04
AU610157B2 (en) 1991-05-16
JPH10323138A (ja) 1998-12-08
CN88102497A (zh) 1988-11-23
JP2815047B2 (ja) 1998-10-27
TR27832A (tr) 1995-08-31
EP0289479B2 (en) 2003-09-10
US5763241A (en) 1998-06-09
EP0289479A2 (en) 1988-11-02

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