CN1062172A

CN1062172A - 核糖体失活蛋白质，其无活性的前体形式，及其制造和使用方法

Info

Publication number: CN1062172A
Application number: CN91104857A
Authority: CN
Inventors: 特伦斯·A·沃尔什; 蒂莫西·D·海伊; 爱丽斯·E·R·摩根
Original assignee: DowElanco LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-11
Publication date: 1992-06-24
Also published as: DE69131589T2; DE69131589D1; AU638133B2; CA2044201A1; US5248606A; ATE184289T1; AU7832991A; EP0466222A1; BR9102418A; HU911944D0; HUT58800A; EP0466222B1; JPH04279599A

Abstract

本发明涉及核糖体失活蛋白质。该蛋白质的特征在于它是单链无活性形式的proRIP，其可被蛋白酶裂解而转化成其活性形式。

Description

核糖体失活蛋白质（RIP）是能够催化失活真核细胞核糖体，并且是真核细胞蛋白质合成之极有潜力之抑制剂的植物蛋白质。已将RIP分为两类，即1型和2型RIP（参见Barbieri and Stirpe（1982），Cancer Surveys，1∶489-520）。1型和2型RIP成员之间，以及与也具有同样作用机理的细菌的Shiga和Shiga样毒素之间有着显著的氨基酸序列同源性（参见Hovde et al.，（1988），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶2568-2572）。

2型RIP由两条多肽链组成;通过二硫键共价结合到凝集素样蛋白质（或B链）上的RIP（或A链）对细胞表面碳水化合物有亲和性。B链与细胞表面结合并有利于继后RIP A链部分的细胞内在化，从而导致蛋白质合成的迅速失活和细胞死亡。因此2型RIP是效力极强的细胞毒素和动物毒剂，其中研究最多的是蓖麻蛋白。

相反，迄今所知道的1型RIP则是由一条活性与A链相当的多肽链构成的，而缺少共价结合的B链。因而，它们对完整细胞几乎没有毒性，而保留其极好的抗无细胞蛋白质翻译系统的能力。一般百分之五十抑制无细胞蛋白质翻译的浓度（IC₅₀）为0.5-10ng/ml（0.16-33pM）。在获得下文详述的发现之前，已报导1型RIP与分子量约30，000的碱性蛋白质有显著的同源性。1型RIP可见于多种双子叶和单子叶植物中，并可能是普遍存在的。如在植物的种子、根和乳胶细胞中存在有丰富的蛋白质。它们的体内功能尚不明了，但已有报导它们可能是抗病毒剂（Stevens et al.，（1981），Experientia，37∶257-259）或抗真菌剂（Roberts and Seltrennikkoff（1986），Bioscience Reports 6∶19-29）。

迄今为止，已有一篇文章讨论了玉米，以及其它谷物中存在有动物无细胞蛋白合成抑制剂（Coleman and Roberts（1982），Bio-chimica et Biophysica Acta，696∶239-244）。玉米抑制剂是通过硫酸铵沉淀和磷酸纤维素柱层析法制备的。据信可从玉米中分离到纯的抑制剂。报导的抑制剂分子量为23千道尔顿（KD），且用腹水无细胞蛋白质合成检测法测知ⅠC₅₀为50-100ng/ml。

已检测了RIP对核糖体的作用，发现1型和2型RIP均具有独特的而且高度特异的N-葡萄苷酶活性，该酶可裂解大鼠肝核糖体28S RNA之腺嘌呤4324的糖苷键（Endo（1988），Immuno-toxins，（ed.）Frankel）。

对RIP的商业兴趣主要集中在将它们与击靶多肽，如最常用的单克隆抗体相结合，用于构建针对特定细胞如肿瘤细胞的治疗性毒素（Immunotoxins（1988），同上）。这一结合产物模拟了2型RIP之B链的结合功能性，但用高度选择的配基置换了它们的非特异性作用。最近发现的另一个潜在应用是用于治疗HIV感染（见美国专利4，869，903号Lifsou等人，（Genelabs Incorporated and Regents of the University of California））。

虽然玉米得到的蛋白质合成抑制剂，同由其他禾本科（panicoi-deae）制得的蛋白质合成抑制剂一样似乎可用于构建细胞毒性结合物物，但迄今还没有那一个研究人员报导已成功地使用了禾本科（pani-coideae）RIP。从使用包括大麦等谷物在内的非禾本科植物RIP获得成功的角度看，这是颇令人惊奇的（参见Lambert et al.，（1988），In∶Immunotoxins，同上）。迄今本领域人员尚未能按Coleman和Roberts所述成功地利用玉米RIP，其部分原因可能由于尚未完全确定蛋白质合成抑制物的特性。

对于在通用宿主真核细胞中表达重组体RIP有兴趣，是因为其具有提供正确的转译后加工的能力。然而，因于RIP会在真核细胞内有效地抑制蛋白质合成，故推断可能存在异源表达RIP会导致宿主细胞死亡的问题。因此，一般不使用真核细胞作为重组体宿主细胞。虽然可在某些条件下使用真核细胞，但构建RIP时必须使其在细胞受到毒性作用之前分泌出来（参见Gelfand等人（Cetus公司）的欧洲专利EP0335476号）。因此，尽管存在不能糖基化并适当地折迭异源表达的蛋白质等缺点，大多仍使用原核宿主细胞作为宿主。

因此本发明的一个目的是提供一种制备无活性形式RIP的方法，其中可由真核宿主细胞表达无活性的RIP，然后将其转化为活性形式。

本发明的另一个目的是提供编码至少一种无活性形式RIP之基因的DNA序列，以及含有这一DNA序列的表达载体、宿主细胞及细胞培养物。

本发明的其他目的和优点将会从下面的叙述中了解到。

本发明所涉及的是这些目的

第一个方面，本发明涉及一种称为proRIP的同源蛋白质，其中该蛋白质不能在实质失活真核细胞核糖体，但它可被转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体的称为αβRIP的蛋白质，所说的proRIP具有可移动的、内部肽接头序列。

第二个方面，本发明涉及来源于禾本科的称为proRIP的同源蛋白质，其中proRIP具有可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但在除去接头后其可被转化成定名为αβRIP、具有α和β片段的能够在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质。

第三个方面，本发明涉及来源于禾本科称为αβRIP的同源蛋白质，其能够在实质上失活真核细胞核糖体、且其中RIP具有α和β片段。

在第四个方面，本发明涉及从玉米得到的称为proRIP的同源蛋白质，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但当除去接头后其可被转化成具有α和β片段的定名为αβRIP的蛋白质后，便能够在实质上失活真核细胞核糖体，所说的α片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

且所说的β片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

第五个方面，本发明涉及将不能在实质上失活真核细胞核糖体之蛋白质转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体之蛋白质的方法，所说的方法包括下列步骤：

a）提供一种来源于禾本科称为proRIP的同源蛋白质，该proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质，它能够在实质上失活真核细胞核糖体;以及

b）使proRIP与一种能删除接头部分的裂解剂接触，以生成能够在实质上失活真核细胞核糖体具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质。

第六个方面，本发明涉及含有击靶载体和来源于禾本科称为proRIP的蛋白质的结合物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质。

第七个方面，本发明涉及包含击靶载体与来源于禾本科称为αβRIP的蛋白质的结合物，其能够在实质上失活真核细胞核糖体，其中αβRIP具有α和β片段。

第八个方面，本发明涉及包含击靶载体和来源于玉米的称为proRIP之蛋白质的结合物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能够在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成能在实质上失活真核细胞核糖体、具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质，所说的α片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

且所说的β片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

第九个方面，本发明涉及能够编码称为proRIP之蛋白质的DNA分离物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质。

第十个方面，本发明涉及编码称为αβRIP的、即能够在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质的DNA分离物，其中αβRIP具有α和β片段。

第十一个方面，本发明涉及编码来源于玉米的称为proRIP之蛋白质的DNA分离物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成具有α和β片段，称为αβRIP，能够在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质，其中所说的α片段具有与下文序列有效同源的氨基酸序列：

且所说的β片段具有与下示序列有效同源的氨基酸序列：

第十二个方面，本发明涉及编码能够在实质上失活真核细胞核糖体之融合蛋白质的DNA分离物，所说的蛋白质具有与下文序列有效同源的氨基酸序列：

在其他方面，本发明涉及能够影响在适当宿主细胞内产生上述蛋白质的表达载体。还包括用这些表达载体转化后所产生的宿主细胞及细胞培养物。

附图中进一步举例说明了本发明的许多方面，其中

图1显示将玉米proRIP加工成活性形式的程序。

图2显示活性玉米αβRIP对哺乳动物无细胞蛋白质合成的影响。

文中列出的所有参考文献的全部教导通过参考被结合。

定义

核苷酸、氨基酸、肽、保护基团、活性基团等，均按IUPACIUB（Commision on biological Normenclature）的规定或相关领域内的惯例给出缩写符号。现举例如下：

以下列出氨基酸的单字母符合：

甘氨酸 G 苯丙氨酸 F

丙氨酸 A 酪氨酸 Y

缬氨酸 V 苏氨酸 T

亮氨酸 L 半胱氨酸 C

异亮氨酸 I 蛋氨酸 M

丝氨酸 S 谷氨酸 E

天冬氨酸 D 色氨酸 W

赖氨酸 K 组氨酸 P

精氨酸 R 天冬酰胺 N

组氨酸 H 谷氨酰胺 Q

未知氨基酸 X

术语“proRIP”是指含有先导和接头序列，且不能失活真核细胞核糖体的前体蛋白质。

术语“先导序列”是指在成熟的αβRIP的活性形式中不必存在的proRIP的N末端氨基酸序列。

术语“接头”是指proRIP内的内部氨基酸序列，借此有一定长度并含有有效残基的接头，可使proRIP不能催化抑制真核细胞核糖体的转译过程。

术语“RIP”是指一种能够失活真核细胞核糖体的蛋白质。术语“αβRIP”是指具有α片段（其可能含有或不含先导）、β片段，且能够在实质上失活真核细胞核糖体的RIP。

术语“IC₅₀”是指在无细胞蛋白质合成试验中，50%抑制蛋白质合成所需的蛋白质浓度。

术语“抑制量”是指RIP引起被它们作为靶所针对的细胞死亡或损伤的特异能力。

术语“靶细胞”是指那些具有本发明的αβRIP能够抑制之核糖体的细胞。靶细胞可以存在于活生物体中或者可于体外保藏或保存。这些细胞可以是单独的或结合成一个器官。例如，靶细胞可包括真核细胞（如哺乳动物、昆虫、真菌及植物细胞）。

术语“击靶载体”是指含有能与特异性细胞或组织之受体结合之配基的载体部分。

“基因”是指参予蛋白质合成的全部DNA部分。基因包括结构或编码部分，该部分在5′端的转译起始密码子开始并延伸到3′端的终止密码子。它还包含通常位于结构编码部分之5′侧或上游，启动并调节结构基因表达的启动子区，以及一个位于转译区下游的3′未转译区。

“表达”是指基因转录和转译两个过程。限定基因的DNA被转录成前体RNA，后者则被加工成其成熟形式，即信使RNA（mRNA）。在转译期间，细胞的核糖体与转移RNA结合，将RNA“信息”转译成蛋白质。

本发明的优选实施方案

已令人惊奇地发现，所研究的禾本科成员含有αβRIP和proRIP。禾本科是禾本科（Gramineae）（目）和禾本科（Graminaceae）（科）的亚科。禾本科亚科包含三个族：Maydeae（如Tripsacum，Coix，Euchlaena和Zea）、Andropogonea（如Sorghum）和Paniceae。有关进一步的分类学资料，可参见Arber（1934），The Gramineae，A study of Cereal，Bamboo and Grass，Cambridge University Press，P410-411。

本发明涉及来源于禾本科亚科植物的蛋白质。如本文所述，由禾本科亚科内各种植物得到的蛋白质显示有抗原交叉反应性（即在禾本科植物中均证明有proRIP及αβRIP之α和β片段）。

由禾本科亚科植物“得到的”是指如下文所限定的蛋白质，不管其产生方式如何，均与禾本科中的proRIP或αβRIP有有效的同源性。基于这一教导，便有可能制备遗传上同源的proRIP和αβRIP，而不存在细胞内环境或细胞外液内的无关蛋白质及与之天然结合的污染物。例如，一种基本上纯的蛋白质的下列参数，可在标准实验误差范围内表现出稳定且可再现的特性：分子量、层析行为及其他参数等。但该术语并不意味着排除蛋白质与其他化合物的人工或合成混合物。该术语也不意味着排除小量不会干扰蛋白质之生物学活性，且可能因纯化不彻底而留存的杂质的存在。

可直接由该亚科植物的成熟和发芽种子中以及发育的核中纯化proRIP和αβRIP。一般说来，可按下述方法纯化禾本科αβRIP和proRIP：

可将禾本科亚科植物的种子和未成熟核制成匀浆，以破碎单个种子或核。可使用任何类型的商品匀浆器进行匀浆处理。

可用任何适当的蛋白质纯化技术从匀浆实物中纯化禾本科proRIP和/或RIP。这些技术例如包括凝胶过滤层析技术，如常规液相层析、离子交换层析、高效液相层析及反相层析。

纯代之后的禾本科proRIP相对于其对应的αβRIP将具有不太明显的核糖体失活能力。例如，玉米proRIP在无细胞蛋白合成检测中，ⅠC₅₀值大于每毫升10微克（μg/ml）;而玉米αβRIP在哺乳动物无细胞蛋白转译检测中，ⅠC₅₀值约为每毫升1微微克（1ng/ml）。

用SDS-PAGE法（参见Laemmli（1970），同上）检测玉米proRIP的分子量约为34KD，且在离子交换层析中作为单一峰迁移。同源玉米αβRIP包含两个相联片段，即α和β片段，用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）（Laemmli（1970），Nature，22∶680-685）检测其分子量，分别为大约16.5KD和8.5KD。该同源蛋白质在反相层析图谱上显现出两个分离的峰，而在离子交换层析图谱中为一个相关峰。抗每个片段的多克隆抗体均与玉米核中分子量约34KD（用SDS-PAGE法检测）的多肽有交叉反应。这一事实证明玉米αβRIP的两个片段是由同一前体（即玉米proRIP）衍生的得到的。

玉米proRIP氨基酸序列（如表1所示）包含四个序列亚片段：（1）一个先导序列，从残基1至16，（2）一个α片段，从残基17至156，（3）一个内在接头序列，从残基157至182，以及（4）β片段，从残基183至301。

表1

玉米proRIP cDNA的核苷酸序列及推测的氨基酸序列

表1（续）

这些多肽的净电荷如下：先导子-3;α，+10;接头，-5;β，+1。除去先导和接头序列后，可使净电荷数从玉米proRIP的+3显著改变为玉米αβRIP的+11。此外，由玉米分离的proRIP的表观pI值为6.5，此与根据推测的氨基酸序列计算的数值（6.1）十分相近。活性玉米αβRIP的pI值为≥9，相比之下，由推测的氨基酸序列计算的值为9.06（即缺失酸性先导序列，及接头序列之后）。实验数据进一步提示，天然玉米αβRIP有少数从羧基末端除去的氨基酸。因此，玉米αβRIP具有与其他RIP之pI一致的碱性pI。

下面表2中给出了玉米proRIP与大麦（单子叶植物）proRIP的比较。上面为玉米αβRIP的序列，下面为Asano等人（1986）（Carlsberg Res.Commun.，51∶129）所述的大麦RIP序列。完全相同的残基用实线标示，保守取代用点线标示，破折线标示达到最大同源性的插入。各行左侧数字为残基的编码号。

表2

玉米RIP与大麦RIP氨基酸序列的比较

如表2中所示，玉米αβRIP和大麦RIP之间总共有28%的同源性（34%包含保守取代）。然而，为保持同源性而已在公开的大麦序列中引入的所得缺口清楚地显示了玉米proRIP之接头区域的独特性质。将玉米proRIP序列与蓖麻蛋白A链的序列比较时，可看出其同源性程度较低，但很有意义（如下列表3所示）。上面为玉米αβRIP的序列，下一列为蓖麻蛋白A的序列（Lamb et al（1985），Eur.J.Biochem.，148∶265）。完全相同的残基用实线标示，保守取代用点线标示，破折线标示达到最大同源性的插入。图中左侧数字为残基的编码号，蓖麻序列的序号相当于成熟蛋白质的序号。

表3

玉米RIP与蓖麻蛋白A链氨基酸序列的比较

如表3中所示，将缺口再次引入已公开的蓖麻蛋白A序列中，以达到相当于玉米proRIP之接头区的最大同源性。

A链（Lamb et al.，（1985），同上）;dodecandrin（Ready et al.，（1985），Biochem.Biophys.Acta，791∶314）;美洲商陆抗病毒蛋白2（AP2）（Bjorn et al.，（1985），Biochim.Biophys.Acta，790∶154）;Shiga样毒素1A（SLT-IA）（Calderwood et al.（1987），Proc.Nat.Acad.Sci.USA，84∶4364），以及α-栝楼素（α-trichosanthin）、苦瓜定、榄香胶素、gelonin、dodecandrin、美洲商陆抗病毒蛋白2、saporin5和saporin4（Montecucchi et al.（1989），Int.J.Peptide Res.，33∶263）。在四个或更多个序列中显示出同源性的位置用实线（显示相同的残基）或点线（显示保守取代的残基）标示。

表4B

玉米RIP与其他RIP之氨基酸序列中的同源性区域

的对应排列

A链（Lamb et al.，（1985），同上）;dodecandrin（Ready et al.，（1985），Biochem.Biophys.Acta，791∶314）;美洲商陆抗病毒蛋白2（AP2）（Bjorn et al.，（1985），Biochim.Biophys.Acta，790∶154）;Shiga样毒素1A（SLT-IA）（Calderwood et al.，（1987），Proc.Nat.Acad.Sci.USA.84∶4364），以及α-栝楼素（α-trichosanthin）、苦瓜定、榄香胶素、gelonin、dodecandrin、美洲商陆抗病毒蛋白2、saporin5和saporin4（Montecucchi et al.（1989），Int.J.Peptide Res.，33∶263）。在四个或更多个序列中显示出同源性的位置用实线（显示相同的残基）或点线（显示保守取代的残基）标示。

表4B

玉米RIP与其他RIP之氨基酸序列中的同源性区域

的对应排列

表4b显示其他三个区域是内部定向的。表4b特异地显示出玉米αβRIP与其他RIP之氨基酸序列中的同源性区域对准排列。这些序列可由下列参考文献中查知：大麦（参见Asano et al.（1986），同上和Leah et al.（1991），J.Biol.Chem.，266∶1564-1573）;蓖麻蛋白A链（参见Lamb et al，（1985），同上）;红豆因A链（参见Funatsu et al.（1988），Agric.Biol.Chem.，52∶1095）;Saporin-6（参见Benatti et al.（1989），Eur.J.Biochem.，183∶465）;Shiga样毒素1A（SLT-1A）（参见Calderwood et al.（1987）同上），以及α-tri-chosanthin（参见Xuejun and Jiahuai（1986），Nature，321∶477;Chow et al.（1990），J.Biol.Chem.，265∶8670-8674和Maragonore et al.（1987），J.Biol.Chem.，262∶11628-11633）。在四个或更多个序列中显示完全相同或保守取代的位置用下加横线标示，破折线表示达到最大同源性的插入。垂直线代表示在所有七个序列中均保留的残基。各序列均标出了起始氨基酸（注意trichosanthin在残基67至76之间含有一个插入序列）。

各种其他1型RIP的序列或部分序列在下列文章中给出：luffin-A，参见Islam et al.（1990），Agric.Biol.Chem.，54∶2967-2978;紫茉莉属抗病毒蛋白，参见Habuka et al.（1989），J.Biol.Chem.，264∶6629-6637;Trichokirin，参见Casellas et al.（1988），Eur.J.Biochem.，176∶581-588;momordins，参见Barbieri et al.（1980），Biochem.J.，186∶443-452;dianthins，参见Reisbig and Bruland（1983），Arch.Biochem.Biophys.，224-700-706;saporins参见Maras et al.（1990），Biochem.Intl.，21∶831-838 and Lappi et al.（1985），Biochem.Biophem.Biophys.Res.Commun.，129∶934-942;及momorcochin-5，参见Bolognesi et al.（1989），Biochim.Bio-phys.Acta，993∶287-292。

另外，已纯化成均质材料的其他1型和2型RIP包括：momor-charins（Yeung et al.（1986），Int.J.Peptide Res.，28∶518-524）;tritin（Roberts and Stewart（1979），Biochem.，18∶2615-2621）;rye（Coleman and Roberts（1982），Biochim.Biophys.Acta，696∶239-244）;agrostins和Hura crepitans（Stirpe et al.（1983），Biochem.J.，216∶617-625）;Asparagus officianalis（Stirpe et al.（1983），Biochem.J.，216∶617-625）;Cucumis melo（Ferreras et al.（1989），Biochem Intl.，19∶201-207）;Cucurbitaceae（Ng et al.，Int.J.Biochem.，21∶1353-1358）;Petrocoptis（Ferreras et al.Cell Molec.Biol.，35∶89-95）;Volkensin-a（Barbieri et al.（1984），FEBS Lett.，171∶277-279）;Viscumin-a（Olsnes et al.（1982），J.Biol.Chem.，257∶13263-123270）;modeccin-a（Gasperi-Campani（1978），Biochem.J.，174∶491-496）;Momordia charantia凝集素a（Lin et al.（1978），Linn.Toxicon.，16∶653-660）;Phorandendron californicum凝集素a（Franz et al.（1989），FEBS Lett.，248∶115-118）。

已证实得自下列其他植物的蛋白质具有核糖体失活活性：Stellarea holostea，Lychnis flos-cuculi，Hordeum murinum，Aegylops geni-culata，Euphorbia serratia，Capsella bursa-pastoris，Muscari comosum（Merino et al.（1990），J.Exp.Botany.，41∶67-70）;以及得自Croton tiglium和Jatropha curcas的蛋白质（Stirpe et al.（1976），Biochem.J.，156∶1-6）。

当除去proRIP的内在接头序列后，αβRIP即得到显著的核糖体失活活性。不管是否除去了先导序列（如用重组方法），发现这一活性均表现得很明显。然而，当也除去先导序列及可能还除去C末端残基时，proRIP即达到最好活性。一般认为接头序列是由发芽种子释放的内源性蛋白酶裂解的。有意义的是，已发现该接头也可在体外被某些蛋白酶如木瓜蛋白酶裂解，从而由前体产生活性玉米αβRIP。虽然这里无意探讨有关理论问题，但一般认为木瓜蛋白酶很可能模拟了发芽期间释放之内源性蛋白内切酶的作用。

显然，在除去内部接头之后，被加工多肽的两个片段是由非共价结合力结合在一起的。即是说，两个多肽链的结合并不依赖于链内二硫键或在两片段间形成肽键。

虽然无意作理论探讨，但据信该接头序列可与对水解作用敏感的暴露的氨基酸残基形成一个外在的环。支持这一看法的理由是可将玉米proRIP的氨基酸序列与蓖麻蛋白A链的序列对齐排列，而后者的三维结构是已知的（Montfort et al.（1987），J.Biol.Chem.，262∶5398）。蓖麻蛋白A链上的Glu 177、Arg 180、Asn 209和Trp 211卷入了分子的活性位点区域（Robertus（1988），Immunotoxins，同上）。

基于这一对应排列，玉米αβRIP的同源残基可被定位在蓖麻蛋白A链的三维结构内。重叠的结构表明，α片段的C末端赖氨酸（162位残基）是与蓖麻蛋白A链之外在定位的苏氨酸（156位残基）对应排列。另外，β片段的N末端丙氨酸（189位残基）与蓖麻蛋白A链之外在定位的甘氨酸（157位残基）对应。

本发明意图于包括αβRIP和proRIP形式之任何RIP的构建。如表4a和4b中所示，已测定了全长序列的RIP含有带显著同源性的区域。同样也已比较了更大数目之RIP的N末端序列相似性（见表4a和4b）。很可能这些区域对于各RIP的功能有特殊影响。

现在可以经插入一接头序列而将具有已知氨基酸序列的RIP改变成无活性的proRIP形式。基于本文中列出的根据玉米系统推断的信息，现在有可能工程化制造具有与蓖麻蛋白A链相似三维结构的任何无活性形式的RIP。裂解接头序列后将产生此前自然界所没有的αβRIP。

文献中已讨论了修饰蛋白质三维结构的方法学（参见如Van Brunt（1986），biotechnology，4∶277-283）。第一个步骤包括选择RIP上有可能在其间插入接头序列合适的位点。这些位点之一是蓖麻蛋白A链之残基156周围暴露的氨基酸残基或其他RIP序列中的等效物。因此，本发明企图包括在这些序列中插入一肽接头，条件是接头的插入可在实质上降低RIP失活核糖体的能力。“实质上降低”是指在活性RIP中插入可裂解的接头使所得蛋白质的IC₅₀值至少降低10倍，较好降低100倍，最好降低1，000倍。

如前所述，已显示蓖麻蛋白A链与许多单链RIP有序列同源性。表4a和4b中列出的RIP只是为了举例说明之目的。特性上符合上述标准的RIP也被认为是本发明的一部分。

一般说来，接头可以是一定长度的，可以是一个氨基酸序列，且可以是内部定位的，从而能在实质上降低RIP的核糖体失活活性。

显然，因为禾本科接头是见于自然界的仅有的已知RIP接头，故可望在逻辑上将这样一个氨基酸序列作为插入其他RIP中的第一候选者。但本发明的意图是包括具有与被选玉米接头有效同源序列的接头。在合成制备αβRIP的有效同源接头时所要考虑的因素，一般是与上述选择被选择之玉米接头的有效同源接头时要考虑的因素是一样的。

可用许多方法中的任何一种克隆编码proRIP的基因序列。一种克隆proRIP基因序列的方法包括测定proRIP分子的氨基酸序列。为此可纯化（如前所述）并分析proRIP或αβRIP蛋白质以确定proRIP或αβRIP的氨基酸序列。可使用任何一种能够阐明这一序列的方法，但最好是使用Edman降解法。特别优选的是使用自动序列分析仪。

有可能从其组成氨基酸在体外合成proRIP和αβRIP。适用的技术包括固相法（参见Merrifield（1963），J.Amer.Chem.Soc.，85∶2149-2154，和Solid Phase Peptide Synthesis（1969），（eds.）Stewart and Young）。也可利用自动合成仪。

可用本领域内已知的方法分离和纯化如此制备的肽（参见Current Protocols in Molecular Biology（1989），（eds.）Ausebel，et al.，Vol.1）and Sambrook et al.（1989），Molecular Cloning∶A Labo-ratory Manual）。

为了克隆编码的proRIP，可使用氨基酸序列资料，检测能够编码该氨基酸序列的DNA序列。因为遗传密码是简并密码，故可用一个以上的密码子编码某特定的氨基酸。

虽然有可能确定proRIP或αβRIP的完整氨基酸序列，但最好是确定分子之肽片段的序列，并用这样的序列资料制备能用以分离完整proRIP基因序列的寡核苷酸探针。可将完整分子与溴化氰或与蛋白酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶原或胰蛋白酶一起保温，以制备proRIP肽片段。

可利用遗传密码来鉴定一个或多个不同的寡核苷酸。事实上，这样一种可能性是存在的，即可根据对异常碱基配对关系及实际使用之特定密码子（编码特定氨基酸）出现频率的考虑，来估计将构成真正proRIP编码序列的特定寡核苷酸。利用这些规律，即可鉴定出含有在理论上“最可能的”编码proRIP或αβRIP肽序列之核苷酸序列的单个寡核苷酸，或一组寡核苷酸。

可用含有理论上“最可能的”编码proRIP基因片段之序列的单个或一组寡核苷酸，来鉴定能与单个或一组“最可能的”序列杂交的单个或一组互补寡核苷酸。然后可用含有这一互补序列的寡核苷酸作探针，鉴定并分离毒素基因（Sambrook et al（1989），由上）。

借助具有互补于“最可能…”基因序列之序列的寡核苷酸，经杂交后即可得到能在功能上作为鉴定和分离proRIP基因之探针的DNA分子（或一组DNA分子）。

本发明还涉及编码重组proRIP和αβRIP的DNA序列。重组产生的proRIP和αβRIP与从自然界分离的并按本文所述方法定性的proRIP和αβRIP共有下列特性：（1）该根据核苷酸序列推断的氨基酸序列部分等价于直接从自然界得到的氨基酸序列;（2）该多肽可被抗RIP抗体识别;（3）被编码的proRIP和αβRIP多肽的分子量与天然存在的蛋白质相符;（4）每种proRIP蛋白质均可转化成αβRIP;以及（5）各proRIP和αβRIP蛋白质均表现有相对等价的核糖失活活性。

可通过克隆能编码proRIP或αβRIP的基因序列，或如下文讨论的其有效同源的变异体，并通过表达这些遗传序列，完成以基因工程手段制备本发明之proRIP或αβRIP的方法。这里使用的术语“基因序列”是指核酸分子（更好是DNA）。可由各种来源得到能编码毒素的基因序列。这些来源包括基因组DNA、cDNA、合成DNA及它们的组合。

可分离含所需要的序列的细胞，并用一种或多种限制酶将基因组DNA切成不同的片段。基因组DNA可含有或不含天然存在的内含子。基因组DNA可含有或不含天然存在的内含子。用选择的限制性核酸内切酶消化基因组DNA，可产生含不同数目碱基对（bp）的片段。

本发明特别包括编码proRIP基因之等位变异体形式的DNA序列，该变异体形式可包括天然存在的内含子。可使用由proRIP基因及其侧翼区域之DNA或RNA制得的杂交探针得到该等位基因。“侧翼区域”是指包括proRIP编码序列的那些5′和3′侧DNA序列。

也可由cDNA文库得到编码proRIP基因的DNA分离物。可使用常规RNA分离技术由适当来源分离mRNA，并使用Oligo-dT纤维素层析法富集poly-A mRNA。然后使用适当引物，最好是有所需cDNA特征的核酸序列由mRNA的混合物制备cDNA文库。使用逆转录酶产生mRNA的单股DNA拷贝。使用逆转录酶或RNA聚合酶由mRNA的单股cDNA拷贝合成双股cDNA分子。

也可以使用引物，经聚合酶链反应（PCR）扩增适当制备之种子及成熟核的细胞DNA。PCR包括使用特异化寡核苷酸序列在体外按指数律扩增DNA（参见Mullis et al.（1987），Meth.Enz.，155∶335-350;Horton et al.（1989），Gene，77∶61;以及PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplifica-tion，（ed.）Erlich（1989））。

可用手工方法，如磷酸三酯和磷酸二酯法（Caruthers（1983），Methodology of DNA and RNA，（ed.）Weissman），或自动合成方法，如使用氨基磷酸二乙酯作为起始材料（Beaucage et al.（1981），Tetrahedron Letters，22∶1859-1962）化学合成编码proRIP或αβRIP的DNA。可用退火及连接各片段的标准技术或其他方法构建DNA。

然后，可用本领域已知的程序分离并纯化所需的序列（参见Current Protocols in Molecular Biology（1989），同上，及Sam-brook et al.（1989），Molecular Cloning:A Laboratory Manual）。

表1中列出了玉米proRIP cDNA的核苷酸序列及推测的相应玉米proRIP的氨基酸序列。

不一定只限于见于自然界的proRIP及αβRIP的氨基酸序列。因此，有可能通过重组DNA技术选择性地产生proRIP和αβRIP。这样反过来即可为产生新形式的蛋白质来生产足够质和量的材料，而不必遭受那些包括从天然来源生产和提取蛋白质之方法中固有的不可避免的限制。

重组方法得以有可能生产具有αβRIP之部分或全部一级结构构象和/或其一种或多种生物学性质的有效同源的蛋白质。为了本发明之目的，如果某氨基酸序列与第二个氨基酸序列至少有70%，较好有80%，更好有90%的活性部分相同或保留其预期功能，则认为它与该氨基酸序列是有效同源的。因此作为更为重要和严格的定义，αβRIP的有效同源序列应保留其与真核细胞糖体反应并失活该核糖体的能力。proRIP的有效同源序列必须保留其可被转化成αβRIP的能力。即是说，有效同源的proRIP必须具有一个接头序列，当该接头被裂解掉时，它将形成生物学功能性αβRIP。

潜在等价氨基酸的通用种类列示如下，其中一组内的氨基酸可这些组中的其他氨基酸取代：（1）谷氨酸和天冬氨酸;（2）赖氨酸、精氨酸和组氨酸;（3）疏水氨基酸和丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;（4）天冬酰胺和谷氨酰胺;（5）苏氨酸和丝氨酸;（6）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;以及（7）甘氨酸和丙氨酸。

可以想象，与对α和β片段的改变相比，在先导和接头区域对proRIP进行的改变更有意义。即是说，因为先导和接头序列是可被裂解掉的，其序列的长度和氨基酸残基可较好地被接受，并认为不重要，因为这不会改变终产物的功能性。

此外，proRIP的接头序列不一定限于上面表1所示的序列。例如，可以改变接头的长度，条件是（1）接头是可以切掉的，以及（2）切掉接头后，所得蛋白质的IC₅₀值比含接头蛋白质的ⅠC₅₀至少低大约10倍。

选择有效同源接头的主要标准包括改变αβRIP的净电荷（如使之具有更大酸性）;在蛋白质中产生构象移位或对蛋白质的活性位点提供空间位阻。

如前面提到的，玉米αβRIP同其他RIP一样，也是碱性的。但玉米proRIP具有稍呈酸性的pI。因此，为玉米proRIP所选择的任何有效同源接头，最好是酸性的。

虽然接头的长度能够改变蛋白质的三维结构，但当接头被切掉时，应使蛋白质保留活性αβRIP分子的三维特征。

为了确保接头能被切掉，一般要求proRIP的构象使接头裂解位点容易接近选择之裂解试剂。

也可以预料，至少可将一个限制性酶切位点用基因工程方法加到编码RIP的基因序列中，从而使编码各种多肽接头的DNA序列插入基因内，并试验它们产生无活性RIP，乃至可失活RIP的能力。

最常用的方法是，可在复制环境之外进行裂解，例如在收获微生物培养物之后进行。这样，当以基因工程方法修饰proRIP时，在某些情况下即可有利于保留或改变proRIP的内部接头区域，以便模拟天然无活性proRIP释出其活性α和β片段的方式。

任何识别特定序列或结构并在选择的位点适当切断切头序列的化学或酶促方法均可用于本发明。例如，可以期望设计接头序列的羧基末端和氨基末端，以使接头序列被适当的裂解剂切掉。如可被胶原酶选择性切断的序列Pro-Xxx-Gly-Pro（其中Xxx是非特定残基）;可被因子Xa选择性切断的序列Ile-Glu-Gly-Arg;以及可被凝血酶选择性切断的序列Gly-Pro-Arg（参见Nilsson et al.（1988），Advances in Gene Tech-nology;Protein Engineering and Production，（ed.）Brew et al.）。

如果其裂解位点存在于α和β片段的活性氨基酸序列内，则可能不适于使用化学或酶促方法。也就是说，在α和β片段的固有氨基酸序列内切割大多更容易对αβRIP的酶促活性造成有害影响。可以选择只有一个氨基酸残基的特异性裂解序列，只要该残基不会进入α和β片段的氨基酸序列即可。但最好是利用含有两个或多个氨基酸残基的特异性裂解序列，即伸长的特异性裂解序列。这种类型的序列具有延伸了各种酶之活性位点的优点。此外，利用延伸的特异性裂解序列，很可能会只在预期位点而不是在蛋白质内的其他位点进行切割。

本文讨论的裂解技术是以实例方式给出的，并代表按照说明书的描述，本领域技术人员将想到的变异体。

某些情况下，可以期望在细胞内裂解proRIP。例如，可以提供一个具有与编码酶的DNA序列相连之适当启动子的表达载体，使之与编码proRIP表达功能的其他DNA序列串联，从而借助所表达的酶将proRIP转化成其活性形式。

再者，如人们所熟知的，可经转译后加工过程，如与糖苷、脂质或作为磷酸盐的这类无机离子相联来修饰蛋白质序列。离子化状态还将依据培养基的pH或对分离形式之蛋白质进行结晶或沉淀处理时的pH而变化。此外，当存在空气时可以引起不稳定基因如-SH的氧化。因此，proRIP和αβRIP及其片段之定义内包括了所有这些特定一级结构的修饰产物，如糖基化和非糖基化形式、中性形式、酸性和碱性盐、脂类或其他分子连接的肽形式、因氧化或衍化而造成的侧链改变，以及对由同一遗传密码子序列编码之氨基酸序列的任何其他修饰产物。

涉及核苷酸置换的技术可包括在保留适当读码之条件下的各种核苷酸的加入、缺失的取代。可举例的技术包括使用多核苷酸介导的、位点特异性诱变，即使用单链作为延伸寡核苷酸的模板，以产生含有突变的链（参见Zoller et al.（1982），Nuc.Acids Res.，10∶6487-6500;Norris et sl.（1983），Nuc.Acids Res.，11∶5103-5112;Zoller et al.（1984），DNA，3∶479-488;及Kramer et al.（1982），Nuc.Acide Res.，10∶6475-6485），以及使用PCR技术，即使用序列特定的寡核苷酸于体外对DNA进行指数扩增，以掺入选择的改变（参见PCR Technology∶Principles and Applicationsfor DNA Amplification，Erlich，（ed.）（1989）;及Horton et al.，文献同上）。

借助适当地选择限制性位点，可将所需的DNA片段定位在可含有不存在于被选择DNA片段中之适当控制序列的生物学功能性载体中。“生物学功能性”是指该载体在适当宿主内提供了复制和/或表达其可作为染色体外元件保留或整合到宿主基因组内。许多载体都可从市场上购得或很容易地制得，而且它们都是本领域技术人员所熟知的。

一般说来，可被宿主生物体用来表达其自身蛋白质的含有适当启动子的载体，也含有控制序列，核糖体结合位点及转录终止位点。一般从与宿主细胞相容的种得到的复制子及控制序列都是与这些宿主结合使用的。

最后，载体应具有一个能够提供表型特征的标志基因，从而可借以鉴定含该载体的宿主细胞。

当表达αβRIP时，可将编码α片段和β片段的DNA片段插入不同的载体中，或插入同一载体中。具体地说，当α和β片段包含在不同载体中时，可通过共转化或击靶的转化技术转化宿主细胞。

含有所需要的密码和控制序列的合适的载体的构建可如下进行。

可使用限制性核酸内切酶作为含proRIP基因或αβRIP基因的DNA片段插入适当表达载体的工具酶。限制性酶的例子包括AatⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、NdeⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、SacⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ和PvuⅡ。

裂解过程是通过用限制性酶处理表达载体来完成的。一般在100μl缓冲溶液中10μg载体或DNA片段加10单位酶。正常情况下，于37℃至65℃的温度范围内，在pH7-9条件下进行核酸内切酶消化。对于特定的限制性酶，所用适当缓冲液及底物量是由酶制剂制造商规定的。反应时间为1至18小时。

限制性酶消化完成之后，可用常规技术除去蛋白质（如用苯酚和氯仿提取）。然后可用常规技术回收核酸。

然后再由消化产物中纯化所需片段。适用的纯化技术包括凝胶电泳或蔗糖梯度离心。然后用DNA连接酶连接载体和外来DNA片段。

使用含有DNA片段、DNA连接酶及适当辅助因子的适当缓冲的培养基。所用温度在4℃至25℃之间。当DNA片段以氢键相联时，DNA连接酶可将共价键引入两片段之间。退火时间将依据所用温度、盐溶液的性质以及钝性末端或粘性末端的性质而异。一般连接所用时间为5至18小时（参见Sambrook et al.（1989），文献同上）。

然后可用该载体构建产物转化适当的宿主细胞。适用的宿主细胞包括得自能在培养基中或发酵生长之单细胞及多细胞生物体的细胞。

可使用多种不同的单细胞微生物进行克隆和表达。原核生物包括肠杆菌科的成员，如大肠杆菌和沙门氏菌的菌株、芽胞杆菌科的成员，如枯草芽胞杆菌、肺炎球菌、链球菌和流感嗜血杆菌。

除原核细胞外，还可使用真核细胞。如前所述，此前还没有使用真核细胞作为表达PIP的重组宿主细胞。由于提供无活性形式的RIP，本发明可使本领域技术人员灵活地使用真核细胞作为重组宿主。用proRIP基因转化真核细胞，可在没有对宿主细胞造成毒性的情况下，以高水平表达蛋白质。因为该蛋白在细胞外裂解之前缺乏生物活性，故可提高本方法的生物安全性。然后即可用化学或酶学方法将proRIP转化成所需的αβRIP。

真核微生物中，最常使用的包括酵母，特别是啤酒酵母或普遍面包酵母，但许多其他宿主也是可以利用的。

除真核微生物外，也可使用得自多细胞生物体的细胞培养物作为宿主。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是Sp2/0、VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵（CHO）细胞系，以及W138、BHK、COS-7和MDCK细胞系。

其他适用的宿主和表达系统是维持在培养的昆虫细胞（如Spo-doptera frugiperda的细胞）中的杆状病毒系统。

最后，已发现可使用较高等植物的细胞和植物部分作为重组宿主，并可得到适于在这些系统中表达的适当控制序列。适用的植物细胞包括菸草、

牵牛、蕃茄、马铃薯、稻米、玉米等的幼苗或细胞。

可用任何适当方法将表达载体插入宿主细胞中。向活细胞内引入生物材料的技术包括电击穿（参见Shigekawa and Dower（1988），Biotechniques，6∶742;l Miller et al.（1988），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶856-860;Powell et al.（1988），Appl.Environ.Microbiol.，54∶655-660）;直接DNA摄入机制（参见Mandel and Higa（1972），J.Mol.Biol.，53∶159-162;Dityatkin，et al.（1972），Biochimica et Biophysica Acta，281∶319-323;Wigler，et al.（1979），Cell，16∶77;及Uchimiya，et al.（1982），Proc.5th Intl.Cong.Plant Tissue and Cell Culture，A.Fujiwara（ed.），Jap.Assoc.for Plant Tissue Culture，Tokyo，pp.507-508）;融合机制（参见Uchidaz，et al.（1980），Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells，Baserga et al.（eds.）Wistar Symposium Series，1∶169-185）;感染剂（参见Fra-ley，et al.（1986），CRC Crit.Rev.Plant Scl.，4∶1-46;Ander-son（1984），Science，226∶401-409）;微量注射机制（参见Crossway，et al.（1986），Mol.Gen.Genet.，202∶179-185）;以及高速射入机制（参见Miller、Schuchardt Skokut和Gould（Dow Chemical Com-pany）的EPO 0405696号专利）。可根据所使用的植物品种选择适当方法。

一般可在转化后，使宿主细胞生长约48小时，以便表达标志基因。然后将细胞置于选择性培养基和/或可筛选培养基中，根据细胞死亡情况或生物化学性质从中区分出来被转化和已转化的细胞。

在适于产生所需蛋白质的条件下培养被转化的细胞，并检测其表达情况。有关检测技术的例子包括酶联免疫吸附试验，或放射免疫试验、或荧光素激活的细胞分类器分析及免疫组织化学分析等。

再克隆经选择的阳性培养物，以便分离纯的转化菌落。得到亚克隆的适用技术是通过有限稀释法完成的。

现有技术中所预想的RIP的所有应用，基本上都适合于本文列出的新的αβRIP和proRIP（参见Immunotoxins（1988），Frankel（ed.）;Lifson等人（Genelabs Incorporated and the Regents of the University of California）的美国专利US 4，869，903号）。

通过提供αβRIP的无活性前体形式，现已有可能提供可在实践中应用并改善了此前不可能达到之使用方式的蛋白质合成抑制剂。αβRIP的无活性形式较活性RIP所多出的优点是，在除去接头序列之前它一直是没有活性的。虽然RIP对大多数哺乳动物细胞都没有毒性，但已知RIP在能够结合并进入靶细胞的击靶载体连接后，即可带特异的细胞毒性。

击靶载体的例子包括任何肽类激素、生长因子、或其他存在有特异性受体的多肽细胞识别蛋白。少数例子包括：抗体加抗体片段、外源凝集素、胰岛素、胰高血糖素、内啡呔、生长激素、黑素细胞刺激激素、铁传递蛋白、bombesin、低密度脂蛋白、黄体生成激素及选择性地结合靶细胞的唾液糖蛋白（参见Immunotoxins（1988），文献同上）。业已证实，只有当从击靶载体中释放出RIP部分时，含有RIP的结合物才表现出最大的细胞毒性。

因为αβRIP和proRIP不含有反应性巯基基团，所以有必要使用化学交联试剂修饰蛋白质，以使proRIP和αβRIP连接到击靶载体上。

可使用不同的双功能蛋白质偶联剂制取单克隆抗体与αβRIP及proRIP的结合物。这类试剂的例子是N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）-丙酸酯，2-亚氨基硫醇、亚氨酸酯的双功能衍生物如己二酰亚胺二甲酯、活性酯如辛二酸二琥珀酸亚胺酯、醛如戊二醛、双叠氮基化合物如双（对位二氮鎓苯甲酰基）乙二胺、二异氰酸酯如2，6-二异氰酸甲苯酯，以及双活性氟化合物如1，5-二氟代-2，4-二硝基苯（如参见WO86/05098）。

另外，可使用重组DNA方法学构建细胞毒性融合蛋白质。有关嵌合毒素的一般性讨论，可参见例如Pastan and FitzGerald（1989），The Journal of Biological Chemistry，264∶15157-15160;以及Pastan等人（The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services）的美国专利US4，892，827号。这些参考文献描述了修饰的假单胞菌外毒素，该毒毒包括一个在受全结合区内的缺失，以形成解使被修饰的毒素对选择的细胞有较小毒性的融合蛋白质。这些参考文献还介绍了与毒素基因融合的、编码人α志化生长因子（α-TGF）或人白细胞介素的DNA序列。

实施例

下列实施例进一步详细地举例阐述本发明。这些实施例旨在进一步说明本发明，而不构成对本发明之范围的限制。除非特别指明，所有温度均为摄氏度，且所有部分和百分比均为重量比。

实施例1：玉米αβRIP的分离

除高效液相层析（HPLC）在室温下进行外，其他步骤均在4℃下进行。500g细粉状成熟玉米核用1500ml，25mM磷酸（pH7.2）（PB）和50mM氯化钠的溶液提取至少2小时，多至24小时（hr）。提取物通过几层粗棉布过滤后，收集在55%和85%硫酸铵之间沉淀的蛋白质并溶解于PB中，然后对同一缓冲液透析过夜。经离心澄清该溶液并加于用PB平衡的2.5×10厘米（cm）DE-52纤维素层析柱上。收集直接通过层析柱的蛋白质并加于用PB平衡过的Mono S 10/10柱（Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ），然后用加在PB中的0至200mM氯化钠线性梯度以2ml/分钟的流速洗脱90分钟。或者也可用85%硫酸铵沉淀蛋白质并透析过夜，然后加于Mono S 10/10柱上。

合并含核糖体失活蛋白活性（按上文所述的兔网织红细胞蛋白质合成检测法检测）的各部分并在Centricon-10装置（Amicon，Danvers，MA）中浓缩至0.5ml，以0.4ml/分钟的流速加到预先在PB中平衡的Superose 12柱（Pharmacia LKB Biotechnology）。合并含核糖体失活蛋白质活性（如上所述通过兔网织红细胞蛋白质合成检测法检测）的各部分（第一主峰）。在此阶段，用SDS-PAGE法（Laemmli（1970），文献同上）鉴定αβRIP一般都相当纯。必要时，可将蛋白质再加到用PB平衡过的Mono S 5/5柱（Pharmacia LKB Biotechnology）上进一步纯化，层析柱用加在PB中的0至50mM氯化钠以1ml/分钟流速洗脱5分钟，然后用加在PB中的50至200mM氯化钠洗脱25分钟。

典型的纯化结果如表5所示。纯化之玉米αβRIP对哺乳动物蛋白质合成的影响如图2所示。

表5

成熟玉米核RIP的纯化

步骤蛋白质总单位数¹产率纯化倍数 IC₅₀

（mg） x10⁶（%）（ng/ml）

粗提物 6816 384 100 1.0 323

85%硫酸铵 1010 115 30 2.0 161

DE52柱处理后 428 144 38 5.9 54

Mono S 10/10柱洗脱物 10.2 58 15 102 3.2

Superose 12柱洗脱物 1.8 33 8.6 327 0.99

Mono S 5/5柱洗脱物 1.32 32.4 8.4 436 0.74

1.1单位活性定义为在兔网织细胞溶胞产物蛋白合成试验中产生50%抑制作用所需的蛋白质量。

A.兔网织红细胞无细胞蛋白质合成检测法

按Pelham和Jackson（1976），Eur.J.Biochem.，67∶247-256）所述方法，在兔网织红细胞溶胞产物系统中检测玉米αβRIP对哺乳动物蛋白质合成的抑制活性。

制备下列试剂的混合物（总体积2.5ml）：125μl 200mM Tris-HCl（pH7.6）+40mM醋酸镁+1.6M氯化钾;12.5μl溶于50%乙二醇中的3mM盐酸血红素;1.0ml未处理的兔网织红细胞溶胞产物（Promega，Madison，WI）;1.0ml H₂O;62.5μl氨基酸混合物;125μl 20mM ATP+4mM GTP;125μl 200mM磷酸肌酸;50μl溶于50%乙二醇中的2.5mg/ml磷酸肌酸激酶。氨基酸混合物中含有100μM甘氨酸、各为10μM的精氨酸、异亮氨酸、蛋白氨酸和色氨酸，以及各50μM除亮氨酸以外的其他氨基酸。所有储备液均在加入之前调到pH7.5。

将等检测的5μl适当样品稀释液加到96小井平板的各小井中，并加入5μl上述混合物。10分钟后，向各小井内加入50毫微居里（nCi）¹⁴C-亮氨酸（10μl）。再过10分钟后，用10μl 1.5M氢氧化钾终止反应并保温45分钟。然后将各25μl样品滴加在各个2.1cm Whatman 3MM园滤纸片上（Whatman，Clifton，NJ），干燥2至3分钟后，在烧瓶内相继用250ml 10%三氯醋酸、250ml 5%三氯醋酸（两次）、125ml乙醇、250ml1∶1乙醇/丙酮，和125ml丙酮旋动洗涤滤纸片。干燥后，将滤纸片加到含10ml闪烁液的小瓶内并计数。

B.抗血清和Western印迹分析

用考马斯亮兰简单染色后，由3mm SDS-PAGE凝胶中切下α和β多肽带，并按制造商推荐的方法使用电洗脱装置（Bio-Rad，Richmond（A）进行电洗脱。然后用该多肽制剂免疫兔，以产生多克隆抗血清（按RIBI Immunochem，Montana所述方法制备）。

从塑料底衬中取出凝胶，制得Phastgels^TM试剂（Pharmacia LKB Biotechnology）的Western印迹，并电吸印到Immobilon滤纸（Mil-lipore Corporation，Bedford，MA）上。用1∶2000倍稀释的玉米αβRIP第一抗血清和碱性磷酸酶连接的羊抗兔第二抗体（Bio-Rad），按制造商推荐的方法显现印迹。

实施例2：玉米proRIP的分离

使用抗α和β片段的多克隆抗血清鉴定玉米核粗提物中的共同34KD前体多肽（玉米proRIP）。在继后的纯化过程中，用上述Western印迹分析法监测玉米proRIP的存在。除HPLC在室温下进行外，所有纯化步骤均于4℃下完成。

250g未成熟的玉米核在600ml含25mM磷酸钠（pH7.2）（PB）和5μg/ml抗木瓜蛋白酶的溶液中制成匀浆。提取物经过几层粗棉布过滤后，收集在45-80%硫酸铵间沉淀的蛋白质并溶解在15ml PB中，然后通过预先用PB平衡过的2.5×15cm Sephadex G-25柱（Pharmacia LKB）。合并含蛋白质的各部分并用水稀释到大约60ml。将该溶液加在预先用PB平衡的Q-Sepharose（快速流动）10/10FPLC柱（Pharmacia LKB Biotechnology）上，并用0至300mM NaCl梯度以2ml/分钟的流速洗脱75分钟。合并含34KD前体的各部分并用Centriprep 10装置（Amicon）浓缩至1.5ml。用水将其稀释4倍并加到在PB中平衡的Mono Q 5/5柱（Pharmacia LKB Biotechnology）上。用0至250mM NaCl梯度洗脱60分钟。合并含34KD多肽的各部分，浓缩至0.5ml并加到在PB中平衡的Superose 12柱（Pharmacia LKB Biotechnology）上。合并该柱洗脱的含34KD玉米PIP前体的主峰部分并于-20℃下保存。

实施例3：玉米αβRIP和proRIP的PAGE分析

按制造商提供的说明并使用20%Phastgels^TM试剂，进行含Phastsystem^TM试剂（Pharmacia LKB Biotechnology）的SDS-PAGE分析。按300号Phastsystem^TM试剂应用说明书，方法1（Pharmacia LKB Biotechnology）所述，于pH4.2条件下进行自然PAGE分析。

于还原和非还原条件下，高度纯化的活性玉米αβRIP的SDS-PAGE图谱均显现出两个多肽，即一个α片段（16.5KD）和一个β片段（8.5KD）。在对纯化的活性玉米αβRIP所作的自然PAGE分析中可见有一条单一的带。因此有关的天然玉米αβRIP的最小分子量为25KD。

在SDS-PAGE中，高度纯化的玉米proRIP以34KD分子量迁移。

实施例4：由木瓜蛋白酶体外激活玉米proRIP

将浓度为0.5mg/ml的纯化的proRIP样品与加在含2mM二硫苏糖醇之醋酸钠缓冲液（pH6）中浓度为0.01mg/ml的木瓜蛋白酶（一种植物硫醇蛋白酶）一起保温。室温下作用1至2小时后，34KD proRIP被消化成一种稳定的产物，该产物表现出几乎与天然活性玉米αβRIP完全相同的多肽图形。保温物中，伴随有核糖体失活活性的增加;未消化的proRIP之核糖体失活活性不高于2μg/ml，而木瓜蛋白酶处理的proRIP之IC₅₀则小于80ng/ml。相反，胰蛋白酶对玉米proRIP没有影响。

实施例5：化学方法测定的氨基酸序列

A.玉米αβRIP之α片段和β片段的N末端氨基酸序列

在1.5mm薄凝胶中按Laemli（（1970），文献同上）的方法电泳分离玉米αβRIP的样品，并使用Transphor^TM装置（Pharmacia LKB Biotechnology）将凝胶电吸印到Immobilon PVDF滤纸（Millipore）上。滤纸经考马斯亮兰简单染色后，切掉相当于16.5和8.5KD多肽的带。使用470A气相序列仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）由PVDF滤纸上直接测出N末端序列。所得数据如下（括号内代表不太确定的残基）：

α片段的N末端序列为：

KRIVPKITEIFPVEDANYPVSAFIA[G]VXKDVI

另一种小种α片段（约占总种的20%）的N末端序列为：

AQTNK[L]VPK

β片段的N末端序列为

AADPQADTKSXLVKLVVMS/CEGLXFNTVS

B.α片段的C末端氨基酸序列

使用得自日本青霉（Penicillium japonicum）的测序级羧肽P（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）测定玉米αβRIP之α片段的羧基末端氨基酸序列。使用Vydac 5μ C4 4.6×30mm RP柱，以反相HPLC法纯化16.5KD多肽的样品。该柱用0.1%三氟醋酸（TFA）平衡，并用0.1% TFA加80%乙腈的0-40%梯度洗脱8分钟，然后用0.1%TFA加80%乙腈的40-60%梯度洗脱20分钟。β片段于21.9分钟后被洗脱，α片段于23.3分钟后被洗脱。

将α片段的冻干样品溶解在20mM醋酸钠（pH5.8）+4M尿素。0.1ml消化混合物中含有：1.6μg羧肽酶P，66μg β片段、0.12M醋酸钠（pH4.2）、0.8M尿素。1、5、15、60、120和480分钟后，将消化反应后得到的双份8μl等分样品加到8μl0.4M硼酸钠（pH10.5）中并在干冰上冷冻。

基本按Jones（1986），Methods of Protein Microcharacteriza-tion（ed.）J.E.Shively所述方法进行氨基酸分析。结果得到下列序列：NH₂-Asp-Leu-Ala-（Lys）n-COOH，其中n＝2-4。这就是α多肽的羧基末端，该序列与β片段的N末端序列限定了包含在前体中的接头区域（参见表1所示来自于cDNA的氨基酸序列）。

C.玉米proRIP的N末端氨基酸序列

由34KD玉米proRIP样品未测得N末端序列，表明该多肽的N末端是被封闭的。

实施例6：玉米proRIP之cDNA的分离和特性分析

A.分离

收获大田生长之Pioneer杂交株3737的未成熟玉米核，由穗轴上剥取颗粒并于-20℃下储存之。10g玉米核在液氮中冷冻几分钟，然后用Waring搅拌器打成粉末。将该粉末悬浮于20ml冰冷的TENS缓冲液（10mM Tris（pH7.4）、1mM EDTA、0.5%SDS、0.3M NaCl）中，并立即用等体积用TENS缓冲液饱和的苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）提取。收集水相，并用新的苯酚混合物提取至少三次。

将水相调到0.3M醋酸钠（pH5.5）并加入2.5体积100%乙醇，从中沉淀出核酸。离心收集核酸并直接悬浮于1ml苯酚-氯仿-异戊醇加1ml TENS中，并涡旋提取。按上述方法用乙醇从水相中沉淀出核酸。离心收集沉淀物并悬浮于TE缓冲液（10mM Tris pH7.4，1mM EDTA）中。调整溶液至2M LiCl沉降出单股核酸并于4℃保温4至12小时。离心产生的沉淀物约含2.2-2.5mg总RNA。

使用Hybond mAP^TMmRNA纯化亲和纸（Amersham Corporation，Arlington Heights，IL）由总RNA样品中富集含poly（A）RNA。可验程序按制造商所述进行。一般每毫克总RNA可回收5-10μg富poly（A）的RNA。

使用cDNA Synthesis^TM试剂盒（Pharmacia LKB Biotech-nology）将5μg富poly（A）RNA转化成双股cDNA。按制造商推荐的方法将cDNA连接到克隆载体λgtl1（Stratagene Inc.，La Jolla CA）中。同样按厂商推荐的方法用Gigapack加包装提取物（Stratagene，Inc.）包装被连接的载体一插入段混合物。

按上文所述，使用兔的抗玉米proRIP多克隆抗血清，用PicoBlue Immunodetection^TM试剂盒（Stratagene，Inc.）筛选λgtl1玉米核cDNA文库。

纯化阳性克隆达到均质状态并用EcoRⅠ限制性酶切分析法确定cDNA插入段的特征。将其中一个最大的EcoRⅠ酶切产生的cDNA插入段（约1，100bp）连接到质粒pUC19（Bethesda Research Labs，Gaithersberg，MD）的EcoRⅠ位点中。用限制性消化法鉴定出在两个方向上携带proRIP cDNA插入段的克隆，并用于大规模质粒纯化。

B.玉米proRIP cDNA的序列分析

使用Sequenase^TMDNA测序试剂盒（United States Bio-chemical Corp.，Cleveland Ohio），以双脱氧链终止序列测定法测定proRIP cDNA的核苷酸序列（见表1）。按厂商推荐的方法将双股pUC19-RIP作为模板。由M13/pUC向测序引物（Bethesda Research Labs）起始第一轮序列测定。由已测序列的玉米proRIP cDNA得出继后的引物序列。两条cDNA链至少作一次全长序列测定。

将cDNA推测的氨基酸序列（如表1所示）与化学测定的蛋白质序列资料相比较，可进一步证实编码αβRIP蛋白质的开放读码。

实施例7：玉米proRIP及衍生物在大肠杆菌内的表达

可在大肠杆菌中表达玉米proRIP的各种基因衍生物，并检测其核糖体失活活性。下面总结了各种构建体及它们的特性。

A.R34（如下面表6所示）代表完整的重组proRIP基团，该基因编码分子量为33，327的蛋白质，而且如所预料的，它并不是一种强有力的蛋白质合成抑制剂。用木瓜蛋白酶处理之后，其可被加工成两个具有很强核糖体失活活性的相联多肽（用SDS Phast-gel^TM分析分子量约为17+9KD）。N34代表了从自然界分离的天然proRIP。

表6

R34DNA序列：在大肠杆菌中表达而工程化改造的玉米proRIP DNA

通过PCR扩增，工程化制备cDNA完成重组体玉米proRIP在大肠杆菌中的表达。合成5′引物，其含有所有三个读码中的终止密码子，以终止玉米proRIP cDNA之载体编码蛋白质上游的转译。该引物还含有ATG起始密码子之几个碱基对上游的Shine-Dalgarno序列，然后是与玉米proRIP cDNA同源的23个碱基。该3′引物跨越3′cDNA末端-pUC19接合点（表6中所示的引物区用下加横线标示）。如所预期的，使用GeneAmp^TM试剂盒（Perkin Elmer-Cetus，Norwalk，CT），以PCR法扩增pUC19中的cDNA，产生了大约1，100碱基对的优势扩增产物。

由琼脂糖凝胶中纯化工程化改造并扩增的产物，将其连接到表达载体pGEMEX-1（Promega Corp.，Madison，WI）的经充填的HindⅢ位点中，得到如下所示的质粒pGR。

将该质粒转化到大肠杆菌DH5α（Bethesda Research Labs）中。使用5′玉米proRIP cDNA探针以菌落杂交法（参见Sambrook et al.，文献同上）分离含玉米proRIP cDNA的质粒并鉴定其特性。试验以相反方向含有玉米proRIP的cDNA探针之质粒的表达能力。将质粒转化到感受态大肠杆菌JM109（DE3）（Promega Corp.，Madison，WI），于氨苄青霉素选择条件下在15ml培养基中使被转化细胞生长到600nm光密度为0.4至1.0。加入异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）至1.3mM，以诱导重组proRIP的产生，并使培养物于37℃下继续生长4小时。离心收集细胞并作为沉淀团块储存于-20℃。

在含有1mg/ml溶菌酶的TE缓冲液中，将被诱导的细胞溶解15分钟，分析由玉米proRIP cDNA产生的蛋白质。分级分离溶胞产物得到粗制上清液，并用微量离心法沉淀之。使用20%Phast-gels^TM试剂（Pharmacia LKB Biotechnology），以SDS-PAGE法分离各部分。经考马斯亮兰染色并用抗玉米proRIP血清对凝胶进行Western印迹分析，鉴定出在用IPTG诱导细胞后大大增加的34KD带。不携带质粒或者含有呈反方向之玉米proRIP cDNA之质粒的细胞则不含34KD免疫反应性带。大部分重组玉米proRIP均含在细胞沉淀团块中，提示该材料在这些条件下是不溶性的。

为了试验是否R34能获得折叠方式的N34，将被诱导之培养物的沉淀团块部分溶解于6M盐酸胍中，并使之于室温下变性3小时。然后将该材料加在冰冷的TE中稀释200倍并于4℃下保温过夜，以使变性的R34重新折叠。再使用Centricon 10装置（Amicon）浓缩被稀释的材料。为了试验重新折叠的R34是否能经受正确的蛋白水解加工，成为被切成片段形式的玉米proRIP，用10μg/ml木瓜蛋白酶将该材料处理几次，并用SDS-Phastgel和Western印迹分析法分析样品。R34材料被加工成与N34木瓜蛋白酶加工的材料共迁移的两条免疫反应性带的稳定混合物，表明已发生了正确的蛋白水解加工过程。

在简化由被诱导的溶胞产物纯化R34多肽的工作中，用XbaⅠ切割含玉米proRIP基因的质粒（pGR）以除去pGEMEX-1载体的基因10编码区，并用凝胶电泳法由基因10编码DNA中纯化出载体/proRIP DNA重新环化pGP，于是减去了基因10编码区，得到如下所示的称为pGR1的质粒。

将质粒pGR1转化到JM109（DE3）中并试验在用IPTG诱导后R34的产生情况。正如pGR的情况一样，经Western印迹分析和考马斯亮兰染色后，在细胞溶胞产物中鉴定出大量R34。与pGR不同，由pGR1产生的R34是可溶性的并且被分离在溶解细胞上清液中。用10μg/ml木瓜蛋白酶处理该可溶性材料并将pGR1产生的R34切割成与木瓜蛋白酶裂解产物（N34）共迁移的产物。木瓜蛋白酶处理的材料在比未处理材料高得多的稀释度时即可抑制网织红细胞溶胞产物的转译，表明可溶性R34被加工成了活性形式。

B.R34-DL代表没有接头的proRIP。编码α和β阶段的序列在没有接入接头DNA的情况下直接连接的，即删除了核苷酸A-520至A-594。P34-DL基因编码可作为蛋白质合成之强抑制剂的30.6KD蛋白质。用木瓜蛋白酶处理R34-DL可产生较未处理的材料有更高核糖体失活活性的28KD多肽。

单独通过基因工程手段可进一步证实，由玉米proRIP除去接头序列激活了该分子。使用PCR扩增技术缺失R34的75bp接头编码区（包括A-520至A-594，表6）。该新的R34-DL构建体直接在读码中连接了编码α和β片段的DNA。

在pGEMEX-1系统中，R34-KL基因指导约30.6KD多肽的合成，后者可由对玉米proRIP特异的抗血清识别。

与含有R34多肽的大肠杆菌溶胞产物明显相反，含R34-DL蛋白质的大肠杆菌溶胞产物在高稀释度情况下即可作为兔网织红细胞溶胞产物的强有力抑制剂。

这些基因缺失数据证实，除去接头后可使R34（proRIP）分子活化。本实验还证明，α和β多肽片段共价连接后形成了活性αβRIP。为产生酶促活性，玉米proRIP不需要破坏多肽骨架除去该接头区就足以使之获得强有力的核糖体失活活性。

另外，当用木瓜蛋白酶处理R34-DL溶胞产物时，可使已提到的P34-DL蛋白质分子量稍为降低（从30.6KD降到大约28KD）。R34-DL多肽仍保持完整，即它没有被裂解成特征性玉米αβRIP的α和β片段。与这种分子量的小小改变相关的是对大肠杆菌溶胞产物之蛋白质合成抑制作用增加。这些数据表明，细菌溶胞产物中除去接头区之后可激活蛋白质的核糖体失活活性使之至少提高250倍，另外从蛋白质两末端加工可进一步增加这种活性。

使用PCR技术制得的另一基因构建体是从R34-DL上除去先导区。该新的构建体称为R30-DL（缺失核苷酸C-40至C-84和A-520至A-594），其编码一种比R34-DL稍小的蛋白质（大约29.5KD）。含有R30-DL的大肠杆菌溶胞产物似乎是比R34-DL溶胞产物更强的蛋白质合成抑制剂。用木瓜蛋白酶处理含有R30-DL的溶胞产物，可进一步提高蛋白质合成抑制活性。经这一处理后，R30-DL蛋白质分子量稍为降低，此代表了对多肽之两末端水解加工的结果。

实施例8：

缺失编码蛋白质羧基末端几个酸性残基的R30-DL基因之小片段。这一缺失是使用PCR工程方法完成的。

使用热循环装置（thermocycler）（Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT）进行指定的构建。一般情况下包括1分钟失活步骤、2分钟退火和3分钟链伸展步骤温度分别为94℃，37℃或50℃，和72℃。在25次循环之后，将反应混合物于72℃下保持7分钟，以延伸未达到足够长度的产物。

扩增工程反应是在各100μl的四个不同试管内进行的。扩增后合并各管内容物。一般每管包含100ng模板样品。在PCR Mate或380A DNA合成仪（Applied Biosystems）上合成DNA引物并在丙烯酰胺凝胶上纯化之。各反应混合物中分别加50pmol引物保温。使用由Perkin Elmer Cetus推荐的扩增反应条件（10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、0.001%白明胶、200μM dNTPs和2.5单位Taq DNA聚合酶或Ampli Taq^TM热稳定性DNA聚合酶）。

可用几种基因工程方法生产下述基因产物。DNA纯化、限制性酶消化、琼脂糖凝胶分析、DNA片段分离、连接和转化的标准方法和现有技术文献所述（参见Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，出处同上;Current Protocols in Molecular Biology（1987），出处同上）。

用于工程化处理的酶得自三个厂商：Pharmacia LKB Biotechno-logy;Bethesda Research Labs;或New England Biolabs，Beverly MA）。所使用的缓冲液和实验程序是厂商提供的。

使用PCR引入的工程化序列，由RIP质粒模板扩增经过修饰的RIP片段，纯化、然后用以取代RIP基因中未修饰的区域。所有片段取代均在已插入pGEMEX表达质粒中的RIP基因内进行。

使用含R30-DL的pGEMEX质粒（该质粒已经用NcoⅠ和StuⅠ消化除去了基因的3′侧半数序列，然后凝胶纯化）作为PCR的模板。用下述PCR修饰的片段取代RIP基因的3′侧半数序列。

合成一个编码近羧基末端之7个氨基酸缺失部分，并引入了新的唯一BamHⅠ位点的3′PCR引物。5′引物则指导αβ接头的缺失并包括一个NcoⅠ位点。下列表7中给出了这些引物的序列。用该引物由pGEMEX R34-DL模板扩增被修饰的DNA片段。用苯酚提取并用乙醇沉淀该被修饰的片段。用NcoⅠ切割DNA插入段并连接到pGEMEX-R30-DL载体中。

表7

RDT的聚合酶链反应引物

该新的RIP基因衍生物称为RDT，可编码推测分子量为28，233道尔顿，等电点（pI）约9.5的蛋白质。RDT基因编码一剪短了先导序列，缺失接头序列并剪短了羧基末端的蛋白质。

RDT的DNA序列如表8中所示。

表8

玉米RIP衍生物RDT的核苷酸序列及推断的氨基酸序列

表8（续）

由细菌溶胞产物中纯化使用上述pGEMEX系统在大肠杆菌内表达的RDT基因，达到表观均质性。RDT蛋白质似乎是比R30-DL更强的蛋白质合成抑制剂。使用网织红细胞溶胞产物蛋白质合成检测法，测得纯化的RDT的IC₅₀值为1ng/ml。

实施例9：

对RDT作进一步工程化改造，产生另一个称为RDT-NP的基因。该构建不同于RDT，在于它有两个独特的、经基因工程引入的限制性位点。使用实施例8中所述的PCR方法引入这位点。设计PCR引物，使之包含所需的改变及玉米RIP DNA序列中独特的限制性位点。99bp引物在引物的3′端引入了NotⅠ和PstⅠ位点，且为克隆目的必须背对独特的NcoⅠ位点构建。用于扩增的引物如表9所示。

表9

RDT-NP的聚合酶链反应引物

限制性位点（NotⅠ和pstⅠ）相当于RIP多肽中α/β接头插入的位点。RDT-NP可使编码各不同多肽接头的DNA小片段被插入基因中并试验它们产生无活性、蛋白酶可激活之RIP的能力。RDT-NP的序列示于表10中。

表10

玉米RIP衍生物RDT-NP的预测核苷酸序列及推断的氨基酸序列

表10（续）

预测的RDT-NP多肽分子量为28，446，等电点（pI）为9.5。由pGEMEX载体表达RDT-NP的大肠杆菌粗制溶胞产物是强有力的真核细胞蛋白质合成抑制剂。

实施例10：

为了产生可与免疫球蛋白IgG结合的RIP分子，使用PCR技术从质粒pR175（Pharmacia LKB Biotechnology）再克隆得自结合蛋白A之金黄色葡萄球菌抗体的单一抗体结合区（Antibody Bind-ing Region，ABR）。该蛋白A的抗体结合区（ABR-A）经PCR工程化处理后，在其5′端具有BamHⅠ位点，且在其3′端具有BglⅡ位点。从而得以将ABR-A区域插入RDT BamHⅠ位点，而保留特有的BamHⅠ位点。RDT-A的序列如图11所示。

表11

RDT-A的预测的核苷酸序列和推断的氨基酸序列

表11（续）

使用pGEMEX系统在大肠杆菌细胞中表达RDT-A。所得多肽的推测的分子量为35，198道尔顿，pI为9.2。其可被抗蛋白A和玉米RIP的抗血清识别，此表明了该蛋白质的嵌合特性。表达RDT-A的细菌粗制溶胞产物具有很强的真核细胞蛋白质合成抑制活性。

按照厂商提供的使用说明书进行分析，显示RDT-A能特异地结合IgG Sepharose（Pharmacia LKB Biotechnology）。在pH7.0条件下结合最好。当于pH5.0洗柱时，能够以小但可检测的量由树脂柱上释放嵌合蛋白质。单单RDT则不能与凝胶结合。

实施例11：

为了提高RDT-A与IgG抗体的结合能力，使用寡核苷酸合成来自链球菌G组蛋白G的抗体结合区（ABR-G）。所合成的序列是Guss等人（（1986），EMBO Journal，5∶1567-1575）描述的天然存在之序列。仅有的改变在于分别在合成之DNA的5′和3′端加入BamHⅠ和BglⅡ位点。

将ABR-G片段插入RDT-A的BamHⅠ位点。已研究了两类克隆。RDT-G-A含有以正确方向插入RDT3′端和ABR-A5′端之间的单一ABR-G区域。第二类克隆含有两个以适当方向插入的ABR-G区域。表12和13中显示了预测的基因DNA序列。

表12

预测的RDT-G-A的核苷酸序列和由之推断的氨基酸序列

表12（续）

表13

预测的RDT-G-G-A的核苷酸序列和由之推断的氨基酸序列

表13（续）

表13（续）

使用pGEMEX系统在大肠杆菌内表达这些基因，可产生预期的嵌合蛋白质。RDT-G-A产生出一种预测分子量为44，576道尔顿的蛋白质（pⅠ＝7.2）。RDT-G-G-A则产生一种稍大的多肽，其预测的分子量为53，955道尔顿，pⅠ为5.4。

在实施例1中所述的兔网织红细胞实验系统中，显示表达RDT-G-A或RDT-G-G-A之细胞的粗制细菌溶胞产物是强有力的真核细胞蛋白质合成抑制剂。用木瓜蛋白酶处理该溶胞产物可进一步提高活性。对木瓜蛋白酶处理的溶胞产物所作分析表明，完整的

-60A-

RDT区域是由ABR区释放的。

RDT-G-A和RDT-G-G-A可紧密地结合IgG Sepharose（Pharmacia LKB Biotechnology）。pH5.0条件下结合最为稳定。可用0.5M醋酸铵（pH3.5）或在SDS中煮沸树脂进行洗脱。

实施例12：

在研钵中仔细研磨下列各种禾木科植物的种子（必要时须在除去颖片后研磨）：Zea mays mays，Z.m.Mexicana，Z.m.parviglumis，Z.luxurians，Z.mexicana，Z.mexicana，Tripsacum dactyloides，Coix lachryma-jobi，Sorghum bicolor。

用下述技术从成熟的干种子中提取可溶性蛋白质。蛋白质用含有25μg/ml leupeptin、25μg/ml antipain、2mM EDTA和4mM苯甲基磺酰氯的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）提取2小时。每克种子组织使用3ml提取缓冲液。离心除去可溶性材料后，使用17-27%梯度凝胶，以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析提取物的等分部分，然后电吸印到PVDF滤纸（Millipore）上。用兔抗玉米PIR α和β片段抗血清（各稀释2000倍）作第一抗体并且羊抗兔IgG抗体作第二抗体探查印迹，然后用NBT/BCIP显色。

除Coix提取物外，所有被试提取物均显示与玉米RIP抗血清有交叉反应性。观察到相当于proRIP的约34KD优势带，还观察到分别相当于α和β片段的约16.5和8.5KD带。此表明相当于玉米proRIP的RIP形式和活化的αβ形式存在于禾木科亚族的许多成员中。

实施例13：

按照Saghai-Maroof等人（PNAS，81∶8014-8018，1984）所述方法由下列品种的禾本科植物中分离总DNA：3个另外的Zea mays ssp.parviglumis、Zea luxurians、Zea mays ssp.mexicana、Coix lachryma-jabi、Sorghum bicolor和Zea mays ssp.mays var.B73。

简单地说，在20μl含有适当反应缓冲液的反应混合物中，37℃下用20单位HindⅢ、EcoRⅠ和SstⅠ经2小时完全消化各样品中提取的约8μg DNA。

然后对由各样品中提取的DNA作Southern杂交（参见Southern（1975），J.Mol.Biol.，98∶503-517）。在0.8%琼脂糖凝胶上基于片段大小用电泳法分离各DNA片段。在碱性溶液中将双股修饰成单股DNA片段;然后将一尼龙滤膜与凝胶紧密接触，以在高盐浓度溶液中将被修饰的DNA片段转移到滤膜上。

使用RIP基因的cDNA克隆作探针进行杂交（探针片段来自表1中位置2至1075的序列）。用³²P放射标记该探针并用放射自显影方法显现Southern转移物中的信号。

Southern印迹与RIP基因的cDNA克隆杂交。除Coix被检样品外，各酶/种结合均观察到与该克隆有强同源性的单一片段。玉米的近亲杂交系具有一个单一的主带和两个小带。除Sorghum外，其他非近亲杂交品种都显示出2至5个小带。根据所用的酶的不同，Coix可有4个或5个这样的小带。

虽然已结合某些优选实施例相当详细地描述了本发明，但应明确的是，在不违背本发明上述精神和范围，以及待批权利要求所限定之技术特征的前提下，可对本发明作出不同的改动。

Claims

1、一种称为proRIP的基本上纯的蛋白质，其中该蛋白不能在实质上失活真核细胞核糖体，但其可被转化成称为RIP，能在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质，所说的proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列。

2、根据权利要求1的基本上纯的蛋白质，其中蛋白质是来自于禾本科（panicoideae）。

3、根据权利要求1的基本上纯的蛋白质，其中proRIP具有一个选择性地插入称为αβRIP的能够在实质上失活真核细胞核糖体之蛋白质氨基酸序列中的可除去的内部肽接头，所说的αβRIP来自于一组包括禾本科（panicoideae）RIP、大麦RIP、蓖麻蛋白A链RIP、saporin RIP、abrin A链RIP、SLT-1 RIP、α-trichosanthin RIP、Luffin-ARIP和Mirabilis抗病毒蛋白RIP的蛋白质。

4、根据权利要求3的基本上纯的蛋白质，其中内部肽接头具有一个有效地同源于如下序列的氨基酸序列：

MATLEEEEVKMQMQMPEAADLAAAA。

5、根据权利要求3的基本上纯的蛋白质，其中玉米proRIP具有一个有效地同源于如下所示序列的氨基酸序列：

6、一种称为RIP的基本上纯的蛋白质，其具有α和β片段并能在实质上失活来源于禾本科植物的真核细胞核糖体。

7、根据权利要求6的基本上纯的蛋白质，其中α片段具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

且β片段具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

DPQADTKSKLVKLVVMVCEGLRFNTVSRTVDAGFNSQHGVTLTVTQGKQVQKWDRI

SKAAFEWADHPTAVIPDMQKLGIKDKNEAARIVAL

VKNQTTAAAATAASADNDDDEA.

8、一种具有α和β片段并能够在实质上失活真核细胞核糖体的称为αβRIP的蛋白质，其中αβRIP衍生于一组包括禾本科植物RIP、大麦RIP、蓖麻蛋白A链RIP、Saporin RIP、abrin A链RIP、SLT-1 RIP、α-trichosanthin RIP、Luffin-A RIP和Mirabilis抗病毒蛋白RIP的蛋白质。

9、一种能够在实质上失活真核细胞核糖体的融合蛋白质，所说的蛋白质具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

10、一种包含击靶载体和称为proRIP之蛋白质的结合物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但在除去该接头后其可被转化成具有α和β片段，称为αβRIP的蛋白质，从而能够在实质上失活真核细胞核糖体。

11、根据权利要求10的结合物，其中蛋白质衍生于一组包括禾本科植物RIP、大麦RIP、蓖麻蛋白A链RIP、saporin RIP、abrin A链RIP、SLT-1 RIP、α-trichosanthin RIP、Luffin-A RIP和Mirabilis抗病毒蛋白RIP的蛋白质。

12、一种包含击靶载体和称为αβRIP之蛋白质的结合物，其中αβRIP能够在实质上失活真核细胞核糖体并含有α和β片段。

13、一种包含击靶载体和来源于玉米的称为proRIP之蛋白质的结合物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但在除去该接头后，其可被转化成具有α和β片段称为RIP的蛋白质，从而能够在实质上失活真核细胞核糖体，其中所说的α片段具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

且β片段具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

14、一种包含击靶载体和能够在实质上失活真核细胞核糖体融合蛋白质的结合物，所说的蛋白质具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

15、根据权利要求10至15之任一项的结合物，其中击靶载体选自于激素、抗体、抗体结合蛋白、生长因子和凝集素或它们的片段。

16、一种将proRIP转化成RIP的方法，所说的方法包括下述步骤：

a）提供衍生于一组包括禾本科植物RIP、大麦RIP、蓖麻蛋白A链RIP、saporin RIP、abrin A链RIP、SLT-1 RIP和α-trichosanthin RIP、Luffin-A RIP及Mirabilis抗病毒蛋白RIP的称为proRIP的同源蛋白质，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但当除去该接头后其可被转化成具有α和β片段，称为RIP的蛋白质，从而能在实质上失活真核细胞核糖体。

b）使proRIP与能够缺失接头序列的裂解剂接触，以形成具有α和β片段称为RIP的蛋白质，从而能在实质上失活真核细胞核糖体。

17、一种能编码称为proRIP之蛋白质的DNA分离物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但在除去该接头后其可被转化成具有α和β片段、称为RIP的蛋白质，段有在裨上失活真核细胞核糖体。

18、根据权利要求17的DNA分离物，其中该DNA分离物编码衍生于一组包括禾本科植物RIP、大麦RIP、蓖麻蛋白A链RIP、saporin RIP、abrin A 链RIP、SLT-1 RIP、和α-trichosanthin RIP、Luffin-A RIP及Mirabilis抗病毒蛋白RIP的蛋白质。

19、根据权利要求17的DNA分离物，其中该DNA分离物编码权利要求5的玉米proRIP。

20、一种编码能在实质上失活真核细胞核糖体之融合蛋白质的DNA分离物，所说的蛋白质具有一个有效地同源于下示序列的氨基酸序列：

21、一种编码其中至少具有一个工程化修饰位点之RIP的DNA分离物，从而可用限制性酶切割该DNA片段，以允许插入一个编码接头的DNA序列。

22、一种含有权利要求17至21之任一项的DNA分离物的生物学功能性表达载体。

23、一种用权利要求22的生物学功能性表达载体转化的宿主细胞。

24、根据权利要求23的被转化之宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞。

25、根据权利要求24的宿主细胞，其中该宿主细胞是玉米细胞。

26、一种产生不能在实质上失活真核细胞核糖体、称为proRIP之蛋白质的方法，所说的方法包括下述步骤：

a）提供编码其中至少有一个工程化修饰之位点的RIP的第一个DNA序列，

b）用限制性酶切割第一个DNA序列，以形成第一个DNA亚序列，

c）提供编码有所需长度和氨基酸残基之多肽的第二个DNA分离物，且所说的DNA分离物具有可与第一个DNA亚序列之被切割末端连接的末端，

d）连接第一个DNA亚序列和第二个DNA，以形成能表达proRIP的第三个DNA序列，

e）表达该proRIP。