CN1143978A - 得自木属和凤仙花属的抗微生物蛋白 - Google Patents

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Abstract

可从木属(Aralia)和凤仙花属(Impatiens)种子分离显示广谱抗真菌活性和一些抗细菌活性的抗微生物蛋白。可分离编码这些蛋白的DNA并掺入到载体中。可以产生用这种DNA转化的植物。这些蛋白可作为抗真菌和抗细菌剂进行商业应用；被转化的植物将显示增加的抗病性。本发明还进一步提供使用基于编码凤仙花属抗微生物蛋白的基因结构的DNA结构在转基因植物中表达多蛋白的方法。

Description

得自楤木属和凤仙花属的抗微生物蛋白
本发明涉及抗微生物蛋白，它们的加工过程和应用，以及编码它们的DNA序列。特别涉及能从楤木属(Aralia)和凤仙花属(Impatiens)的种子分离的抗微生物蛋白。
在本文中，抗微生物蛋白定义为具有至少下列一种活性的蛋白或肽：抗真菌活性(可包括抗酵母菌活性)，抗细菌活性。活性包括一系列的对抗效应如部分抑制或死亡。抗微生物蛋白可为低聚物或可为单肽单位。
楤木属是五茄科的一部分，该科为一中等大小的植物家族，其中最著名的成员是常春藤和人参。一些药物提取物已从一些楤木属的种如土当归中取得。
凤仙花属是凤仙花科植物家族中的一部分。共有500～600凤仙花属物种，其中很多作为温室或盆栽植物被商业栽培。
植物产生很多种抗真菌化合物以对抗潜在的入侵者，并且在最近10年已明确具有抗真菌活性的蛋白形成这些防御的重要部分。几类这样的蛋白已被描述，包括：thionins，β-1，3-葡聚糖酶，核糖体钝化蛋白，zeamatins，几丁质结合植物凝血素和几丁质酶，这些蛋白已得到相当的注意，因这它们可潜在地用作生物防治剂。
具有抗植物致病真菌活化的抗微生物蛋白已从某些植物物种分离。我们以前已描述过数种这样的蛋白的结构和抗真菌特性，包括：
得自紫茉莉(Mirabilis jalapa)种子的Mj-AMP 1和Mj-AMP2(Cammue BPA等，1992，J Biol Chem，267：2228-2233；国际申请公开(International Application Publication)第WO 92/15691号)；
得自尾穗苋(Amaranthus caudatus)的Ac-AMP 1和Ac-AMP2(Broekaert WF等，1992，Biochemistry，37：4308-4314；国际申请公开第WO 92/21699号)；
得自辣椒(Capsicum annuum)的Ca-AMP 1，得自大凌风草(Briza maxima)的Bm-AMP 1，得自飞燕草属(Delphinium)的Da-AFP，得自Catapodium的Cr-AFP，得自野靛属(Baptisia)的Ba-AFP和得自Microsensis的M 1-AFP(国际专利申请公开第WO 94/11511号)；
得自萝卜(Raphanus sativus)种子的Rs-AFP 1和Rs-AFP 2(Tevras FRG等，1992，J Biol Chem，267：15301-13309)和相关蛋白如得自蔓菁(Brassica napus)的Bn-AFP 1和Bn-AFP 2，得自芜菁(Brassica rapa)的Br-AFP 1和Br-AFP 2，得自欧白芥(Sinapis alba)的Sa-AFP 1和Sa-AFP 2，得自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的AT-AFP 1，得自光滑大丽花(Dahlia merkii)的Dm-AMP 1和Dm-AMP 2，得自蓟属benedictus的Cb-AMP 1和Cb-AMP 2，得自扁荚山黧豆(Lathyrus cicera)的Lc-AMP，得自蝶豆(Clitoria ternatea)的Ct-AMP 1和Ct-AMP 2，得自萝卜的Rs-nsLTP(国际专利申请公开第WO 93/05153号)。
这些和其它植物衍生的抗微生物蛋白作为杀真菌剂或抗生素是有用途的，特别是用于农业目的。这些蛋白可应用在植物上或周围或可在植物内表达。
我们现已提纯了新的强有力的抗微生物蛋白。
按照本发明，提供了一种约3KDa的抗微生物蛋白，可从楤木属或凤仙花属的种子分离。
我们已从楤木的种子提纯了两种新的抗微生物蛋白，在下文中称为Arc-AMP 1(楤木-抗微生物蛋白1)和Arc-AMP 2(楤木-抗微生物蛋白2)。
我们还已从凤仙花的种子提纯了4种新的抗微生物蛋白，在下文中称为Ib-AMP 1(凤仙花-抗微生物蛋白1)，Ib-AMP 2(凤仙花-抗微生物蛋白2)，Ib-AMP 3(凤仙花-抗微生物蛋白3)和Ib-AMP 4(凤仙花-抗微生物蛋白4)。
根据本发明的抗微生物蛋白可从楤木属或凤仙花属的种子分离，也可从相关或不相关的物种的种子分离，或还可通过任何适当的方法产生或合成。
按照本发明，进一步提供一种抗微生物蛋白，它的氨基酸序列与从包括SEQ ID NO 10，SEQ ID NO 11，SEQ ID NO 12和SEQID NO 13的组中选出的序列基本同源。如果一个序列与SEQ ID Nos10至13具有至少60％序列一致性并编码一种具有抗微生物活性的蛋白，则它是“基本同源的”。
抗微生物蛋白可从植物材料提取和提纯，从它的已知氨基酸序列使用标准肽合成仪化学合成，或通过重组体DNA的表达在适当的生物体(例如微生物或植物)内产生。该抗微生物蛋白作为杀真菌剂或抗生素是有用的并可用于农业或药物应用。
Ib-AMPs的氨基酸序列测定在实施例7和8中描述。Ib-AMP 1的氨基酸序列显示为SEQ ID NO 10；Ib-AMP 2的氨基酸序列显示为SEQ ID NO 11；Ib-AMP 3的氨基酸序列显示为SEQ ID NO12；Ib-AMP 4的氨基酸序列显示为SEQ ID NO 13。此4种Ib-AMPs互相具有非常紧密的同源性，但与已知蛋白的序列无显著同源性。
知道了此抗微生物蛋白的初级结构，就可使用标准肽合成仪通过化学合成制造这种抗微生物蛋白或它的一部分。也使生产编码此抗微生物蛋白的DNA结构成为可能。
本发明进一步提供编码根据本发明的抗微生物蛋白的DNA序列。此DNA序列可以是cDNA序列或基因组序列，或可从cDNA克隆，基因组DNA克隆或使用标准核酸合成仪制造的DNA取得。
此DNA序列可从已知氨基酸序列推测而编码此蛋白的DNA可使用标准的核酸合成仪制造。替代地，此DNA序列可从植物衍生的DNA文库分离。合适的寡核苷酸探针可从已知氨基酸序列取得并用于筛选cDNA文库以寻找编码蛋白的一部分或全部的cDNA克隆。Ib-AMP cDNA的克隆在实施例8中描述。寡核苷酸探针或cDNA克隆可用于通过筛选基因组DNA文库分离实际的抗微生物蛋白基因。这样的基因组克隆可包括在植物基因组中操纵的控制序列。因此也有可能分离可用于驱动抗微生物(或其它)蛋白表达的启动子序列。这些启动子可特别地对环境条件(如真菌性病原的存在)敏感，并可用于驱动任何靶基因的表达。
编码抗微生物蛋白的DNA序列可与合适的调节序列(启动子，终止子等)组合掺入DNA结构物或载体。该DNA序列可被置于组成的或诱导的启动子(受如环境条件，病原的存在，化学物质的存在等刺激)的控制下。这种DNA结构物可被克隆或转化进入允许表达被编码蛋白或被编码蛋白的活性部分的生物学系统。合适的生物学系统包括微生物(例如，细菌如大肠埃希杆菌，假单胞菌属和内寄生菌如Clavibacter xyli亚种；Cynodontis(CXC)；酵母菌；病毒；噬菌体，等)，培养的细胞(如昆虫细胞，哺乳动物细胞)和植物。在某些情况下，被表达的蛋白可随后被提取和分离以供使用。
按照本发明的抗微生物蛋白可用作杀真菌剂或抗生素。本发明进一步提供一种对抗暴露于本发明的抗微生物蛋白的真菌或细菌的方法。
为药物学应用，抗微生物蛋白可用作杀真菌剂或抗细菌剂以治疗哺乳动物感染(例如，对抗酵母菌如假丝酵母菌)。
根据本发明的抗微生物蛋白也可用作防腐剂(例如，作为食品添加剂)。
为农业应用，抗微生物蛋白可在作物生活期或为收获后作物保护被用于提高作物的疾病抵抗性或疾病耐受性。暴露于此蛋白的病原菌被抑制。抗微生物蛋白可消灭已在作物上建立的病原菌或可保护作物免受未来的病原菌攻击。这种蛋白的根除剂作用特别有效。
作物病原菌的暴露于抗微生物蛋白可通过多种方法取得，例如：
(a)使用标准的农业技术(如喷雾法)将含有分离的蛋白的组合物施用于作物部分或周围土壤；该蛋白可从植物组织提取或化学合成或从被遗传学地改变以表达此蛋白的微生物提取；
(b)一种包含被遗传学地改变以表达抗微生物蛋白的微生物的组合物可被施用于作物或作物生长的土壤；
(c)被遗传学地改变以表达抗微生物蛋白的内寄生菌可被导入植物组织(例如，通过种子处理过程)；
〔内寄生菌定义为具有与植物宿主构成非病原性内共生关系的能力的微生物。内寄生菌增强的作物保护方法已在一系列作物遗传学国际公司(Crop Genetics International Corporation)的专利申请中被描述(例如，国际申请公开第WO 90/13224号，欧洲专利申请第EP-125468-B1号，国际申请公开第WO 91/10363号，国际申请公开第WO 87/03303号)。内寄生菌可被遗传学地改变以产生农业化学物质。国际专利申请公开第WO 94/16076号(ZENECA Limited)描述了经遗传学改变以表达来源于植物的抗微生物蛋白的内寄生菌的应用〕。
(d)编码抗微生物蛋白的DNA可被引入作物基因组以使该蛋白在作物体内被表达(该DNA可为cDNA，基因组DNA或使用标准的核酸合成仪制造的DNA)。
植物细胞可用重组体DNA结构物按照许多公知的方法(土壤杆菌属Ti质粒，电穿孔，微注射，微射枪等)被转化。被转化的细胞可随后在适当的情况下被再生为整株植物，其中新的核物质已被稳定地参入基因组。通过这种方法可得到转化的单子叶和双子叶植物，虽然后者通常更易于再生。这些初代转化体的一些子代将遗传编码抗微生物蛋白的重组体DNA。
本发明进一步提供具有提高的对真菌或细菌病原体的抗性并含有表达本发明的抗微生物蛋白的重组体DNA的植物。这样的植物可用作标准植物育种杂交的亲本以产生具有提高的真菌或细菌抗性的杂种和系。
重组体DNA是通过转化导入植物异源DNA或其祖先。此重组体DNA编码为运送至病原体攻击部位(如叶子)表达的抗微生物蛋白。此DNA可编码抗微生物蛋白的活性亚单位。
病原菌可为在植物上、中，或附近生长的真菌或细菌。在本文中，增强的抗性定义为与野生型植物相比对真菌或细菌性病原菌的增强的耐受性。抗性范围可从轻微增加对病原菌作用的耐性(病原菌被部分抑制)至完全抗性从而使植物完全不受病原菌存在的影响(病原菌严重受抑制或被杀死)。对特定病原菌的抗性的水平增加或针对更广谱的病原菌的抗性均为抗性的增进。表现增加的抗性的转基因植物(或从其衍生的植物)在植物转化或随后的杂交后选择。
在抗微生物蛋白在转基因植物或其后代中表达的情况下，真菌或细菌在病原菌攻击植物的部位被暴露于此蛋白。特别地，通过使用适当的基因调节序列，此蛋白可在最有效的时间和地点在体内产生。例如，此蛋白可在植物中的一些部件(如叶中)产生，在这些部位此蛋白通常不被大量表达而在这些部位疾病抗性是重要的。
可产生的遗传学地改变的植物包括大田作物，谷类作物，水果和蔬菜如：Canola向日葵，烟草，制糖甜菜，棉花，大豆，玉米，小麦，大麦，稻，高粱，番茄，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉，甜瓜，土豆，胡萝卜，莴苣，卷心菜，洋葱。
因为本发明的抗微生物蛋白对一些主要玉米病原菌非常有活性，用编码所述蛋白的结构转化玉米作物特别有利。另外，这些蛋白可通过任何其它适合的方法应用于玉米植物。
本发明的另一方面总的涉及“多蛋白”在转基因植物中的表达。“多蛋白”定义为2或多种肽连接在一起以形成单一的翻译产物。成分肽通过剪切位点被分开，被表达的多蛋白通过翻译后加工为成分分子。这种剪切通过蛋白酶的作用或多蛋白的自加工而获得。
数种导入基因在转基因植物中表达的相对水平公知受“位置效应”的影响，这种位置效应被转基因整合入基因组的特定位点所决定。即使被导入基因连接于相同的T-DNA，被会聚的或发散的启动子驱动，它们通常也不在相似的水平同等地被表达。这在需要高水平表达几种导入的活性时提出了特别的问题，例如当尝试在植物中表达新的生物化学途径时。为试图获得两种蛋白的组织特异的同等表达，研究者们通过共传递(Co-transference)将多个基因连接在同一个T-DNA上，但发现表达水平独立地变化。另一策略是通过邻近的和发散的启动子连接基因，但未取得一致的同等表达。
以多蛋白形式连接蛋白是很多病毒复制中采用的策略。在翻译时，病毒编码的蛋白酶介导多蛋白的极快速分子内(cis)剪切以产生离散的蛋白产物。国际专利申请PCT/GB94/02765号(1994年12月19日提交)描述了一种在转基因植物中表达多种蛋白质的方法。此方法包括向植物的基因组中插入一种基因结构物，这种基因结构物包括：包括能在启动子控制下启动结构基因转录的启动子的5’区，编码一种以上蛋白的一种蛋白编码序列，和包括一个多腺苷酸化信号的3’末端区。所述蛋白编码序列的每一个通过一种DNA序列与邻近的蛋白编码序列分离，此种DNA序列在翻译时提供剪切位点，被表达的多蛋白通过此位点被翻译后加工为成分蛋白分子。优选该编码翻译后剪切位点的DNA序列得自病毒，特别地，细小核糖核酸病毒如口蹄疫(FMD)病毒。这样，多基因以自我加工多蛋白的形式被插入到在单一启动子控制下的一种植物基因组中。在植物转化结构中包含进蛋白酶或剪切序列使之能够在植物细胞和植物中从单一启动子表达多种导入的蛋白，这些蛋白最初连接为一种多蛋白。
在导致本发明的工作中，我们显示了4种Ib-AMP蛋白被单一基因(SEQ ID NO 8，实施例8)编码。此Ib-AMP基因序列具有333氨基酸的开放阅读框(一种多蛋白)含有编码所有4种分离的Ib-AMP的6个同源重复。此基因还含有七个前肽结构域，它们在前体蛋白的加工过程中被去除：这些结构域中的5个(SEQ ID NO 14至SEQ IDNO 18)是位于AMP编码区间的间隔结构域(spacer)；一个结构域(SEQ ID NO 20)位于此蛋白的C末端；一个结构域(SEQ ID NO19)位于此蛋白的N-末端并与一个约25个氨基酸的信号序列(SEQID NO 21)连接。Ib-AMP基因的结构显示于图10并在实施例8中描述。在植物中只有2个实例已知有可剪切为近乎相同的部分的多结构域前体，即聚泛有素(ubiquitin)(Christensen等，Plant Mol Biol，18：675-689)和一种得自花烟草的蛋白酶抑制剂(Arkinson等，Plant Cell，5：203-213)。
按照本发明的另一方面，提供了一种在转基因植物中表达多种蛋白质的方法，该方法包括向植物基因组中插入一种基因结构物，此基因结构物包含一个包括能启动结构基因在其控制下转录的启动子的5’区，至少2个蛋白编码序列和一个包括多腺苷酸化信号的3’末端区。每一所述蛋白编码序列与相邻近的蛋白编码序列通过一个在翻译时提供剪切位点的DNA序列分开。被表达的多蛋白通过此剪切位点被翻译后加工为成分蛋白分子。其中至少一种DNA序列提供编码选自包括SEQ ID NO14，SEQ ID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18的一组氨基酸序列的剪切位点。公知可在氨基酸序列中制造变异而不很大地影响功能，因而所述序列和编码它的核苷酸的变异也意在包括在本发明范围内。提供剪切位点的DNA序列可从SEQ IDNO 8衍生。
插入5个Ib-AMP间隔结构域前肽结构域(SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 18)的任何一个以连接蛋白编码序列容许植物表达载体工程化，使多种完整蛋白或蛋白结构域可作为多蛋白被表达并高效地共翻译并剪切开。植物衍生的间隔结构域序列的使用易化了在转基因植物组织中多蛋白的加工。其它前肽结构域(SEQ ID NO 19，SEQ IDNO 20)和Ib-AMP基因的信号肽(SEQ ID NO 21)也可被参入植物表达载体中。
因此Ib-AMP基因排列可用于通过使用保守间隔结构域前肽结构域以构建编码给定蛋白的多聚体的人工基因而表达其它肽或蛋白(包括其它抗微生物肽)。此多蛋白的蛋白组成可以是相同的，从而通过一种“基因-剂量”效应类型增加所述蛋白的表达。另外，2或多种不同的蛋白成分可连接在一个多蛋白中，使不同蛋白能共表达。例如，这可使整个酶级联放大系统(cascades)快速导入植物中。
现在通过实施方式描述本发明，只参照图，其中：
图1显示提纯Ib-AMPs的阳离子交换色谱图。
图2显示经提纯的Ib-AMP 1的反相色谱图。
图3显示经提纯的Ib-AMP 2的反相色谱图。
图4显示经提纯的Ib-AMP 3的反相色谱图。
图5显示经提纯的Ib-AMP 4的反相色谱图。
图6显示提纯Arc-AMPs的阳离子交换色谱图。
图7显示经提纯的Arc-AMP 1的反相色谱图。
图8显示经提纯的Arc-AMP 2的反相色谱图。
图9显示Ib-AMPs的肽片段的氨基酸序列。
图10显示Ib-AMP cDNA和被编码蛋白的序列。
图11是显示载体pLB6结构的示意图。
图12是显示载体pBinIB6结构的示意图。
本发明也参照序列表被描述，其中：
SEQ ID NO 1是图9中显示的Ib-AMP 1的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 2是图9中显示的Ib-AMP 2的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 3是图9中显示的Ib-AMP 3的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 4是图9中显示的Ib-AMP 4的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 5是Ib-AMP序列的一个区的氨基酸序列；
SEQ ID NO 6是寡核苷酸IbAMP 1-C的核苷酸序列；
SEQ ID NO 7是寡核苷酸IbAMP 1-B的核苷酸序列；
SEQ ID NO 8是如图10中所显示的Ib-AMP cDNA的核苷酸序列；
SEQ ID NO 9由图10中所示Ib-AMP cDNA编码的蛋白的推测的氨基酸序列。
SEQ ID NO 10是Ib-AMP 1的完整氨基酸序列。
SEQ ID NO 11是Ib-AMP 2的完整氨基酸序列。
SEQ ID NO 12是Ib-AMP 3的完整氨基酸序列。
SEQ ID NO 13是Ib-AMP 4的完整氨基酸序列。
SEQ ID NO 14是Ib-AMP前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 15是Ib-AMP前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 16是Ib-AMP前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 17是Ib-AMP前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 18是Ib-AMP前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 19是Ib-AMP N-末端前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 20是Ib-AMP C-末端前肽间隔结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO 21是Ib-AMP信号肽的氨基酸序列。
                        实施例1
               抗真菌和抗细菌活性测定
抗真菌活性按以前的描述(Broekaert，1990，FEMS Microbiol Lett，69：55-60)通过显微分光光度法测定。常规地，用20μl(过滤无菌的)测定溶液和80μl在培养基A(半强度马铃薯右旋糖肉汤或1/2 PDB)或培养基B(1/2 PDB加1nM CaCl2和50mM KCl)中的真菌孢子悬液(2×104孢子/ml)进行测定。对照微生物培养含20μl灭菌的蒸馏水和80μl真菌孢子悬液。
除另外说明外，测定微生物是大刀镰孢IMI 180420，并且温育在25℃进行48小时。生长抑制百分数定义为(对照微生物培养的校正吸收率-测定微生物培养的样正吸收率)÷对照微生物培养的595nm处的校正吸收率×100。校正吸收率值等于48小时后测定的培养物在595nm处的吸收率减去30分钟后在595nm处测定的吸收率。
抗细菌活性按下述用显微分光光度法测定。通过接种软的营养琼脂糖(胰蛋白胨，108/l；Seaplaque琼脂糖(FMC)，5g/l)制备细菌悬液(105菌落形成单位/ml)的等分试样(80μl)被加至平底96孔微滴板中经滤过灭菌的样本(20μl)上。培养物在595nm处的吸收率借助微滴板阅读器在28℃温育30分钟和24小时后被测定。生长抑制百分数按照上文抗真菌活性测定法的描述计算。
                     实施例2
         从凤仙花种子提纯抗微生物蛋白
500克凤仙花种子(购自Chiltern Seeds，Cumbria，英国)在咖啡碾磨机中磨碎，得到的粗粉用2升含有10mM NaH2PO4，15mMNa2HPO4，100mM KCl，2mM EDTA和1mM苄脒的冰冷却的提取缓冲液在4℃提取2小时。产生的匀浆通过干酪包布压榨并通过离心(30分钟，7000×g)澄清。将固体硫酸铵加至上清液中以达到75％相对饱合并通过在4℃保持过夜使沉淀形成。在7000×g离心30分钟后，沉淀物被再溶解于最小量的蒸馏水中，并对蒸馏水充分透析，使用苯甲酰化的纤维素管(Sigma，圣路易斯，MO)。透析后，通过加入10倍浓缩的缓冲液将此溶液调至50mM(NH4)Ac(pH 9)，并随后通过一个用50mM NH4Ac(pH 9)平衡的Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia，Uppsala，瑞典)柱(12×5cm)。通过柱的碱性蛋白级分用乙酸调至pH 6并通过如下所述的阳离子交换色谱法提纯。
约500ml碱性蛋白级分加在预先用50mM NH4Ac缓冲液(pH 6.0)平衡过的S-Sepharose高效(Pharmacia)柱(10×1.6cm)。此柱用50-750mM NH4Ac(pH6)的线性梯度以3ml/分洗脱325分钟以上。通过联机测定280nm处的吸收率监测洗脱液的蛋白并以10ml级分收集。每一级分的样本按照实施例中的描述被测定抗真菌活性。结果显示于图1，活性峰画上黑色阴影。
色谱法后，提取物在400nm至700mM NH4Ac之间洗脱产生4个活性峰。显示抗真菌活性的每个峰的级分被合并并通过反相HPLC进一步提纯。每个峰的约3mg总量被置于用0.1％TFA(三氟乙酸)平衡的Pep-S(多孔硅C2/C18，Pharmecia)柱(25×0.93cm)上。该柱用0.1％TFA至100％乙腈/0.1％TFA的线性梯度以1ml/分处理65分钟。通过联机监测210nm处的吸收率监测洗脱液的蛋白。
峰1，2，3和4的结果分别显示于图2，3，4和5中。收集1ml级分，真空干燥，并最后溶于0.5ml蒸馏水。每一级分取10μl测定抗真菌活性。
峰1，2和3产生单峰的抗真菌活性(画上黑色阴影)，它在约20％乙腈处被洗脱。峰1，2和3的活性级分分别称为Ib-AMP 1，Ib-AMP 2和Ib-AMP 3。峰4产生两个抗真菌活性峰，第二个较大的峰称Ib-AMP 4(在图5中画上黑色阴影)。第一个峰可能代表在FPLC上来自峰3的一些后遗(carry over)物质。
                    实施例3
            从楤木种子提纯抗微生物蛋白
使用实施例2中描述的方法从楤木种子(购自Sandeman Seeds，Pulborough，Sussex，英国)提取碱性蛋白级分。然后使用实施例2中描述的方法进一步提纯这种蛋白级分。
在S-Sepharose高效柱上的色谱法后，楤木提取物产生2个抗真菌活性峰，在约400mM(峰1)和500mM(峰2)NH4Ac处洗脱。结果显示于图6，两个活性峰画上黑色阴影。
合并每一峰的活性级分并在反相HPLC上按照实施例2中所述进一步提纯。峰1的结果显示于图7：它在约20％乙腈处洗脱产生活性因子，被称为Arc-AMP 1。类似地，峰2洗脱为单峰活性，称为Arc-AMP2(结果显示于图8)。
                    实施例4
            经提纯的抗微生物蛋白的分子结构
经提纯的抗微生物蛋白的分子结构通过硫酸十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)被进一步分析。SDS-PAGE在预制的商购凝胶(PhastGel高密度，得自Pharmacia)上使用Phastsystem(Pharmacia)电泳装置进行。样本缓冲液含200mM Tris-HCl(pH8.3)，1％(w/v)SDS，1mM EDTA，0.005％溴酚蓝和，除非另外说明，还含有1％(w/v)二硫赤藓糖醇(DTE)。在扩散印迹至硝酸纤维素后进行银染使蛋白质可见。分子量标记(Phermacia)和经提纯的Mj-AMP 2(得自紫茉莉的种子的4克Da蛋白)共同电泳以供比较。
Ib-AMP 1和Arc-AMP 1通过SDS-PAGA进行分析。两种蛋白均泳动为约3KDa的带，不管是在还原还是在非还原条件下泳动。此结果显示该肽为单链多肽。
                    实施例5
            抗微生物蛋白的抗真菌能力
经提纯的蛋白的抗真菌能力在不同的植物致病真菌上被测定，使用实施例1中描述的测定法。真菌的培养，真菌孢子的收集和收获按以前的描述(Broekaert等，1990，FEMS Mrcrobiol Lett，69：55-60)进行。下列真菌株被使用：交链孢霉属Longipes CBS 62083，Bipolaris mydis HM-10，灰葡萄孢MUCL 30158，花生尾孢霉株K897，禾生刺盘孢CG-17，球孢枝孢KO 791，大刀镰孢IMI 180420，禾木科镰孢FR-12，小串珠镰孢FM-9，指状青霉(KO 879)，丝轴黑粉菌HS，小麦壳针孢(K 1097D)，Stenocarpella maydis，绿色木霉K 1127，黄萎轮枝孢KO 937，大丽花轮枝孢MUCL 19210。
抗真菌蛋白的系列稀释液被用于真菌，使用生长培养基A(半强度马铃薯右旋糖肉汤，1/2 PDB)或培养基B(培养基A＋1mM CaCl2和50mM KCl)。生长抑制百分数通过显微分光光度法测定。48小时温育后50％生长抑制所需的浓度(IC50值)从剂量反应曲线计算。
Ib-AMP 1，Ib-AMP 2，Ib-AMP 3和Ib-AMP 4的结果总结在表1中。Arc-AMP 1和Arc-AMP 2的结果总结在表2中。所有6种肽对被测病原菌显示广谱的活性。在低离子强度培养基(培养基A)中IC50值通常低于10μg/ml。这些肽的活性对测定中使用的离子条件敏感，在高盐培养基(培养基B)中它们的活性减弱。然而，甚至是在培养基B中，最碱性的Ib-AMP肽(Ab-AMP 4)仍对一些被测真菌表现相当强的活性。
                    表1
            Ib-APMs的抗真菌活性真菌                  IC50(μg/ml)
         Ib-AMP1    Ib-AMP2    Ib-AMP3    Ib-AMP4培养基AA longipes      3         12          6          3B 灰葡萄孢      12        25          6          6B mavdis        7         nd          nd         ndC 花生尾孢霉    1.5       3           nd         ndC 禾生刺盘孢    2         nd          nd         ndC 球孢枝孢      1.5       6           3          1F 大刀镰孢      1.5       6           6          1F 禾木科镰孢    3         nd          nd         ndF 小串珠镰孢    20        nd          nd         ndP 指状青霉      3         6           3          3S mavdis        5         nd          nd         ndS 丝轴黑粉菌    4         nd          nd         ndS 小麦壳针孢    1         nd          nd         1T 绿色木霉      6         12          12         6V 黄萎轮枝孢    3         12          6          6V 大丽花轮枝孢  1         nd          nd         nd培养基BA longipess    50        ＞200       ＞200      12B 灰葡萄孢      ＞2O0     ＞200       ＞200      200C 球孢枝孢      50        ＞200       100        6F 大刀镰孢      50        ＞200       100        6P 指状青霉      200       ＞200       100        25S 小麦壳针孢    50        nd          nd         12T 绿色木霉      ＞200     ＞200       ＞200      150V 黄萎轮枝孢    ＞200     ＞200       ＞200      50nd-未测
                                                  表2
                                     Arc-AMP 1和Arc-AMP 2的抗真菌活性
真菌                    IC50(μg/m1)
        培养基A         培养基B
   ArcAMP 1  ArcAMP 2  ArcAMP 1  ArcAMP 2
B灰葡萄孢C球孢枝孢F大刀镰孢P指状青霉V大丽花轮枝孢     101.5121     8113nd    ＞100100100＞10050    ＞100100100＞100nd
nd＝未测
                            实施例6
            Ib-AMP 1和Arc-AMP 1的抗细菌和抗酵母菌活性
经提纯的蛋白被测定对下述细菌生长的作用：巨大芽胞杆菌ATCC13632和大肠埃希杆菌株HB 101。这些蛋白还被测定它们对酿酒酵母JRY 188和白色念珠菌KA-1生长的作用。生物测定按实施例1中描述的进行。结果总结在表3中。两种蛋白强烈抑制巨大芽胞杆菌和酿酒酵母的生长，但对大肠埃希杆菌的生长几乎无或无作用。Ib-AMP 1也强烈抑制白色念珠菌的生长。
                                           表3
                                    对细菌和酵母的活性
真菌     IC50(μg/ml)
    Ib-AMP1    Arc-AMP1
B巨大芽胞杆菌E大肠埃希杆菌S酿酒酵母C白色念珠菌     10＞8002010     15＞50030nd
nd-未测
                    实施例7
            Ib-AMPs的氨基酸序列测定
半胱氨酸使用Fullmer(1984，Anal Biochem，142，336-341)的方法通过S-吡啶基乙基化作用进行修饰。试剂在Pep-S(多孔硅土C2/C18)(Pharmacia)柱(25×0.4cm)上通过HPLC去除。S-吡啶基乙基化的蛋白通过用0.1％三氟乙酸(TFA)至含0.1％TFA的乙腈的线性梯度洗脱此柱而被回收。所产生的蛋白级分在477A蛋白序列仪(Applied Biosystems)中进行氨基酸序列分析，同时在120A分析仪(Applied Biosystems)中进行苯基海硫因氨基酸衍生物的联机测定。
Ib-AMPs序列测定的最初试尝显示所有4种肽均为N-末端封闭的。为取得它们的序列，每一种肽均用胰蛋白酶或糜蛋白酶消化所产生的肽片段通过RP-HPLC提纯并进行序列测定。在每种情况都有一个肽片段(蛋白的N-末端)被发现是封闭的，使Ib-AMP蛋白的完全序列测定不能进行。
Ib-AMP 1用胰蛋白酶消化产生4个片段，从这4个片段可得到Ib-AMP 1(SEQ ID NO 1)的部分序列。片段Ib1T1为16个氨基酸长并包含Ib-AMP 1的主要部分(如图9中所示)。另外3个肽片段代表Ib1T1的进一步剪切。另外，Ib-AMP 1用糜蛋白酶消化产生的肽(Ib1C1)的序列测定允许还有2个氨基酸归于N-末端。
Ib-AMP 2(SEQ ID NO 2)，Ib-AMP 3(SEQ ID NO 3)和Ib-AMP 4(SEQ ID NO 4)的部分序列以与用糜蛋白酶消化产生的肽片段序列类似的方式装配(图9)。只有Ib-AMP 3的两个片段被测序，所以图9中显示的序列(SEQ ID NO 3)只代表此肽C末端的11个氨基酸。
为估算Ib-AMPs的全长，用electrospray mass spectrometry测定Ib-AMP 1的分子量并发现分子量为2466道尔顿。通过氨基酸序列测定得到的18个氨基酸的分子量为2172道尔顿，提示全长肽只更长2或3个氨基酸。
所有4种Ib-AMP肽互相密切同源，它们之间只有几个氨基酸取代。对蛋白质数据库进行搜寻未发现与这些Ib-AMP序列具有显著同源性的任何其它蛋白。然后，Ib-AMP序列的一小部分，GPGRRY区(SEQ ID NO 5)，已在一些蛋白(包括病毒包被蛋白)中发现并显示涉及β-折叠的形成。
                    实施例8
            凤仙花属cDNA的分子克隆
总RNA使用Jepson等(1991，Planet Mol Biol Reporter，9(2))的方法从干凤仙花种子中提取。从30g种子回收5.9mg总RNA。使用PotyAtrack试剂盒(Strategene)约3mg总RNA被用于提纯Poly(A)＋mRNA。按照制造商的指令使用Stratagene的λZAPII噬菌体载体试剂盒将产生约30μg mRNA，其一半用于cDNA合成。合成的cDNA按大小分级为3个级分；最高6Kb，最高4Kb和最高2Kb。
用于筛选文库的DNA探针通过多聚酶链反应(PCR)产生，使用合成的cDNA级分作为模板和两种基于由Ib-AMP 1可获得肽序列的简并寡聚体。PCR引物的序列是：
IbAMP1-C(5′-GITGT/CTGT/CCGITGGGGICC-3′)(SEQ ID NO
6)and
IbAMP1-B(5′-CACCAICT/GIACG/ACAG/ATA-3′)(SEQ ID NO
7).
50bp的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯，随机标记并用于探查文库。从此第一轮筛查约160000个斑被探查并得到15个阳性斑。这15个斑通过使用同样的DNA探针再进行两轮筛查而被提纯。得自经提纯的斑的插入物在辅助噬菌体(VSCMB)的帮助下被切割成pBluscript MB噬菌体质粒。插入物通过用Xho1和EcoR1消化去除，并在琼脂糖凝胶上比较它们的大小。插入物大小从600bp至1300bp不等。对14个克隆进行核苷酸序列测定。克隆Ib22被完全测序并显示包含带有333个氨基酸的开放阅读框的完整基因序列，此基因序列含有编码所有4个分离的Ib-AMPs的6个同源重复。发现其它克隆或与克隆Ib22一致，或为其全长基因的截短文本。
图10显示Ib-AMP cDNA(克隆Ib22)的核苷酸序列(SEQ IDNO 8)和含有重复序列(图10中下面划线者)的编码蛋白的推测氨基酸序列(SEQ ID NO 9)。通过将此推测的序列与通过直接肽测序确定的Ib-AMP序列相对比，完整的Ib-AMP序列被确定。发现第一重复序列编码Ib-AMP 3(SEQ ID NO 12)；第二，三和四重复序列各自编码Ib-AMP 1(SEQ ID NO 10)；第5重复编码Ib-AMP2(SEQ ID NO 11)；和第6重复编码Ib-AMP 4(SEQ ID NO13)。
因此，Ib-AMP基因含有第三份重复的Ib-AMP 1，和各自一份的Ib-AMP 2，Ib-AMP 3和Ib-AMP 4。此基因还包含一个推测的约25个氨基酸的信号区和在前位肽加工过程中被去除的7个前肽结构域。因此，由Ib-AMP基因(图10)编码的多蛋白的结构如下：N-末端--信号肽(SEQ ID NO 21)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 19)--
--Ib-AMP 3编码区(SEQ ID NO 12)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 14)--
--Ib-AMP 1编码区(SEQ ID NO 10)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 15)--
--Ib-AMP 1编码区(SEQ ID NO 10)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 16)--
--Ib-AMP 1编码区(SEQ ID NO 10)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 17)--
--Ib-AMP 2编码区(SEQ ID NO 11)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 18)--
--Ib-AMP 4编码区(SEQ ID NO 13)--
--前肽结构域(SEQ ID NO 20)--C-末端。
前肽结构域中5个(SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 18)是分隔2个Ib-AMP编码区的“间隔结构域(spacers)”，这些间隔结构域在多蛋白的翻译后加工过程中在任意端剪切。N-末端前肽结构域(SEQ ID NO 19)在一端从信号肽(SEQ ID NO 21)上剪切下来，并在另一端从Ib-AMP 3编码区上剪切下来。C-末端前肽结构域(SEQ ID NO 20)在一端从Ib-AMP 4编码区上剪切下来。
                        实施例9
        含有Ib-AMP cDNA的植物表达载体pIB6的构建
植物表达载体pIB6使用基于pUC的载体pMJB1构建，此载体携带增强的35S启动子，TMV前导序列和Nos终止子。使用PCR在Ib-AMP cDNA开放阅读框的起始部位导入NocI位点并在NcoI和SmaI位点随后将Ib-AMP cDNA克隆入pMJB1以产生pIB6(图11)。
                    实施例10
            植物转化载体pBinIB6的构建
表达载体pIB6用HindIII和EcoRI消化并将含有Ib-AMP表达盒的片段亚克隆入pBin 19Ri。pBin19Ri是植物转化载体pBin19(Bevan1984，Nucleic Acids Research 12，8711-8721)的修饰版本，其中单一EcoRI和HindIII位点被转换而且缺陷性nptII表达盒(Yenofsky等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3435-3439)被引入。新的植物转化载体称为pBinIB6(图12)。
                    实施例11
                    植物转化
去除保护的根瘤土壤杆菌株LBA 4404(PAL 4404)(Hoekema等，1983，Nature 303，179-180)用载体pBinLB6使用Framond等人(Biotechnology 1，262-269)的方法转化。烟草转化的进行是通过使用烟草叶盘并与含pBinIB6的土壤杆菌共培养。在共培养时存在100μg/ml卡那霉素的选择压力。用pBinIB6转化的转基因植物在含100μg/ml卡那霉素的培养基上再生。
使用标准的Western印迹技术分析转基因植物的转化基因的表达，并选择能组成型表达的植物进行自花传粉以产生种子。转基因植物的F1幼苗被进行进一步分析并传代以选择Ib-AMP基因纯合的植物。
                    实施例12
            制造编码多蛋白的DNA结构
使用编码抗微生物蛋白Rs-AFP 2(国际专利申请公开第WO 93/05153号)的DNA序列构建人工基因。此人工基因包含通过2个间隔结构域相连的3个拷贝的Rs-AFP 2编码序列，每一间隔结构域编码一段具有SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 18中任意一种序列的前肽连接子。
人工基因通过在成熟蛋白序列的3’端导入适当的限制性酶位点从Rs-AFP 2序列构建，向其中导入编码连接子肽的寡核苷酸和编码51氨基酸Rs-AFP 2肽序列的DNA的其它拷贝。每一Rs-AFP 2肽序列的随后的拷贝使用连接子肽序列与前一个相连。Rs-AFP 2编码序列的最后一个拷贝后接一个终止密码子。Rs-AFP 2编码序列的第一个拷贝前可有一个信号序列。
此人工基因随后被用于构建适合植物转化的植物表达结构。一个植物有效的启动子驱动人工基因的表达，从而使多蛋白产生并随后被加工以释放3个拷贝Rs-AFP 2蛋白。
                        序列表(1)一般信息(i)申请人
(A)姓名：ZENECA Limited
(B)街道：15 Stanhope Gate
(C)城市：伦敦
(D)州：英格兰
(E)国家：英国
(F)邮编：W1Y 6LN(ii)发明名称：抗微生物蛋白(iii)序列数目：21(iv)计算机可读形式
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申请资料：
(A)申请号：GB 9404807.1
(B)提交日：1994年3月11日(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：图9，IB-AMP 1(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Val Arg1               5                   10                  15Trp Cys(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：图9：IB-AMP 2(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Gly Arg Arg Cys Cys Asn Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Lys Arg1               5                   10                  15Trp Cys(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：图9：IB-AMP 3(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Gly Pro Gly Arg Lys Tyr Cys Lys Arg Trp Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性  (ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：图9：IB-AMP 4(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Arg Arg1               5                   10                  15Trp Cys(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Gly Pro Gly Arg Arg Tyr1               5(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 1-C(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GNTGTCTGTC CGNTGGGGNC C(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 1-B(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CACCANCTGN ACGACAGATA(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1230个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)最初来源：
(A)生物：图10(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：ATTTTTAGGT GAGGAAAAAT GGTCCAAAAA GGTGTAGTCT TTGGGGTGCT CCTAATTCTC        60TTCATCTGCT CTACGCTCAC TTCGGCCGAT TCGAAGCCAA ACCCTACGAA AGAGGAAGAA       120CCAGCGAAGA AACCGGATGA GGTCAGCGTA AAGAGCGGTG GACCGGAGGT GTCGGAGGAT       180CAATACCGTC ATCGGTGCTG CGCTTGGGGA CCTGGGCGAA AATATTGCAA GCGGTGGTGT       240GCTAACGCTG AAGAGGCGGC GGCCGCAATC CCCGAGGCAA GTGAAGAATT AGCTCAGGAG       300GAGGCTCCGG TGTACTCGGA GGATCAGTGG GGTCGTCGGT GCTGCGGCTG GGGACCCGGC       360CGAAGATACT GCGTGCGCTG GTGTCAAAAC GCGGAAGAGG CGGCCGCGGC AATCCCCGAG       420GCGACTGAAA AAGCTCAGGA GGCTCCGGTG TACTCGGAGG ATCAGTGGGG TCGTCGATGC       480TGCGGCTGGG GACCCGGCCG ACGGTATTGC GTGCGCTGGT GTCAAAACGC GGAAGAGGCG       540GCCGCGGCGG TGGCAATCCC CGAGGCAAGT GAGAAAGCTC AGGAGGGACC CGTGTACTCG       600GAGGATCAGT GGGGTCGCCG ATGCTGCGGT TGGGGACCTG GCCGTAGGTA TTGCGTGCGG       660TGGTGCAGCA ACGCCGCCGA CGAGGTGGCA ACACCCGAGG ACGTAGAACC GGGTCAGTAC       720GGTCGTCGGT GCTGCAACTG GGGACCTGGG CGAAGGTATT GCAAGCGGTG GTGTCATAAT       780GCGGCTGAAG AGGCAACTCT CAAGGCATTT GAAGAGGAAG CAGCTCGGGA GCAACCGGTG       840TACTCGGAGG ACCAGTGGGG TCGCCGGTGC TGCGGTTGGG GACCCGGCCG TAGGTACTGC       900AGGCGGTGGT GTCAAAGCGC CGAAGAAGCG GCTGCGTTCC AGGCTGGGGA GGTAACTGCT       960TCCTTGATGC TCATCATGTT TAAGGCATGC CCATGCATGG GGCCGGTGCC TTCTGTTTAA      1020GGCCACTCTA GCTAGCTACG TACTCTTAAT AAGGGCACAT GAAAAAGTTT GTCCTTTAGA      1080AATAAGGCAC AGTAAGAAAT AAAATGTCCA ACTTCTTTTA TGAAAGAAGT GAACAATAAG      1140TGTAAGCTGA ATAATATATA TTGTGACACG TTTGTTGTTG TACAAAAATA ACATCTTTTC      1200AGATGAACAA CCTTTAATGG AAAAAAAAAA                                       1230(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：333个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(vi)最初来源：
(A)生物：图10(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Met Val Gln Lys Gly Val Val Phe Gly Val Leu Leu Ile Leu Phe Ile1               5                   10                  15Cys Ser Thr Leu Thr Ser Ala Asp Ser Lys Pro Asn Pro Thr Lys Glu
        20                  25                  30Glu Glu Pro Ala Lys Lys Pro Asp Glu Val Ser Val Lys Ser Gly Gly
    35                  40                  45Pro Glu Val Ser Glu Asp Gln Tyr Arg His Arg Cys Cys Ala Trp Gly
50                  55                  60Pro Gly Arg Lys Tyr Cys Lys Arg Trp Cys Ala Asn Ala Glu Glu Ala65                  70                  75                  80Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Ser Glu Glu Leu Ala Gln Glu Glu Ala
            85                  90                  95Pro Val Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly
        100                 105                 110Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Gln Asn Ala Glu Glu Ala
    115                 120                 125Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Lys Ala Gln Glu Ala Pro Val
130                 135                 140Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly145                 150                 155                 160Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Gln Asn Ala Glu Glu Ala Ala Ala
            165                 170                 175Ala Val Ala Ile Pro Glu Ala Ser Glu Lys Ala Gln Glu Gly Pro Val
        180                 185                 190Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly
    195                 200                 205Arg Arg Tyr Cys Val Arg Trp Cys Ser Asn Ala Ala Asp Glu Val Ala
210                 215                 220Thr Pro Glu Asp Val Glu Pro Gly Gln Tyr Gly Arg Arg Cys Cys Asn225                 230                 235                 240Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Lys Arg Trp Cys His Asn Ala Ala
            245                 250                 255Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ala Phe Glu Glu Glu Ala Ala Arg Glu Gln
        260                 265                 270Pro Val Tyr Ser Glu Asp Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly
    275                 280                 285Pro Gly Arg Arg Tyr Cys Arg Arg Trp Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ala
290                 295                 300Ala Ala Phe Gln Ala Gly Glu Val Thr Ala Ser Leu Met Leu Ile Met305                 310                 315                 320Phe Lys Ala Cys Pro Cys Met Gly Pro Val Pro Ser Val
            325                 330(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性  (ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 1(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys1               5                   10                  15Val Arg Trp Cys(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 2(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Gln Tyr Gly Arg Arg Cys Cys Asn Trp Gly Pro Gly Arg Arg Thr Cys1               5                   10                   15Lys Arg Trp Cys
          20(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 3(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：  Gln Tyr Arg His Arg Cys Cys Ala Trp Gly Pro Gly Arg Lys Tyr Cys1               5                   10                  15Lys Arg Trp Cys
          20(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(vi)最初来源：
(A)生物：IB-AMP 4(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Gln Trp Gly Arg Arg Cys Cys Gly Trp Gly Pro Gly Arg Arg Tyr Cys1               5                   10                  15Arg Arg Trp Cys
          20(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：28个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Ala Asn Ala Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Ser Glu Glu1               5                   10                  15Leu Ala Gln Glu Glu Ala Pro Val Tyr Ser Glu Asp
          20                  25(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Gln Asn Ala Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Lys1               5                   10                  15Ala Gln Glu Ala Pro Val Tyr Ser Glu Asp
          20                  25(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：28个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Gln Asn Ala Glu Glu Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Pro Glu Ala Ser1               5                   10                  15Glu Lys Ala Gln Glu Gly Pro Val Tyr Ser Glu Asp
          20                  25(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Ser Asn Ala Ala Asp Glu Val Ala Thr Pro Glu Asp Val Glu Pro Gly1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：His Asn Ala Ala Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ala Phe Glu Glu Glu Ala1               5                   10                  15Ala Arg Glu Gln Pro Val Tyr Ser Glu Asp
          20                  25(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：
(A)长度：29个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Lys Pro Asn Pro Thr Lys Glu Glu Glu Pro Ala Lys Lys Pro Asp Glu1               5                   10                  15Val Ser Val Lys Ser Gly Gly Pro Glu Val Ser Glu Asp
          20                  25(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽  (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Gln Ser Ala Glu Glu Ala Ala Ala Phe Gln Ala Gly Glu Val Thr Ala1               5                   10                  15Ser Leu Met Leu Ile Met Phe Lys Ala Cys Pro Cys Met Gly Pro Val
          20                  25                   30Pro Ser Val
      35(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Met Val Gln Lys Gly Val Val Phe Gly Val Leu Leu Ile Leu Phe Ile1               5                   10                  15Cys Ser Thr Leu Thr Ser Ala Asp Ser
          20                  25

Claims (15)

1.一种能够从楤木属(Aralia)或凤仙花属(Impatiens)的种子中分离的约3KDa的抗微生物蛋白。
2.权利要求1的抗微生物蛋白，它选自Arc-AMP 1和Arc-AMP2。
3.权利要求1的抗微生物蛋白，它选自Ib-AMP 1，Ib-AMP 2，Ib-AMP 3和Ib-AMP 4。
4.权利要求1的抗微生物蛋白，它具有与选自SEQ ID NO 10，SEQ ID NO 11，SEQ ID NO 12，SEQ ID NO 13的序列基本同源的氨基酸序列。
5.权利要求1至4之任一项的编码抗微生物蛋白的重组体DNA。
6.权利要求5的重组体DNA，它具有与SEQ ID NO 8中包含的一连串碱基同源的核苷酸序列。
7.一种包含权利要求5中的DNA的生物学系统。
8.权利要求7的生物学系统，它是一种微生物学系统。
9.权利要求7的一种生物学系统，它是一种植物系统。
10.一种对真菌性或细菌性病原菌抗性增强并包含一种表达权利要求1的抗微生物蛋白的重组体DNA的植物。
11.一种对抗真菌或细菌的方法，它包括将真菌或细菌暴露给权利要求1的抗微生物蛋白。
12.一种在转基因植物中表达多种蛋白的方法，此方法包括向该植物的基因组中插入一种基因结构物，
该基因结构物包括1个5’区、至少2种蛋白编码序列和一个3’-末端区，
5’区包括，在其控制下可开始结构基因的转录的一个启动子，3’-末端区包括一个多聚腺苷酸化信号，
所说的蛋白编码的每一种序列与相邻的蛋白编码序列通过一段在翻译时提供一个剪切位点的DNA序列分开，借此，被表达的多蛋白被翻译后加工为成分蛋白分子，
其中至少一种提供剪切位点的DNA序列编码选自SEQ ID NO14，SEQ ID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17和SEQID NO 18的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法，其中至少一种提供剪切位点的DNA序列来自SEQ ID NO 8。
14.一种用于植物的遗传修饰的基因结构物，
该结构物依次包括：一个在植物细胞中有活性的基因启动子、多个蛋白编码区、和一个包含多聚腺苷酸化信号的3’非翻译区，
其中多个蛋白编码区的每一个由一个在翻译时提供剪切位点的DNA序列分开，借此，被表达的多蛋白被翻译后加工为成分蛋白分子，并且提供剪切位点的至少一种DNA序列编码选自SEQ ID NO 14，SEQID NO 15，SEQ ID NO 16，SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
15.权利要求14的基因结构物，其中至少一种提供剪切位点的DNA序列来自SEQ ID NO 8。
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